PL166041B1 - Sposób wytwarzania nowych pochodnych taksolu - Google Patents

Abstract

. Sposób wytwarzania nowych pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym R i R1 każdy oznacza atom wodoru albo resztę aminokwasu wybranego spośród alaniny, leucyny, izoleucyny, waliny, fenyloalaniny, proliny, lizyny i argininy albo grupę o wzorze 3, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1do 3 oraz R1 2 i R3 każdy oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy, zawierający od jednego do trzech atomów węgla, lub R2 i r3, łącznie z połączonym z nimi atomem azotu, oznaczają nasycony pierścień heterocykliczny zawierający od czterech do pięciu atomów węgla z tym, że co najmniej jeden z podstawników R i R1 jest różny od atomu wodoru i że wytwarzany związek o wzorze 2 jest od 2'-($-alanilo)taksolu, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że poddaje się reakcji taksol z alaniną, leucyną, izoleucyną, waliną, fenyloalaniną, proliną, lizyną, argininą lub ze związkiem o wzorze 4, w którym n, R2 i R3 mają wyżej podane znaczenie.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym podstawniki mają poniżej podane znaczenie. Związki te są nie tylko nowe, ale i całkowicie nieoczywiste w świetle znanego stanu techniki, a mianowicie w świetle następujących publikacji: J. of Natural Products, t.51,1988, s.298-306; (Dokument D1) J. Medicial Chemistry, t. 32,nr4,str. 788-792; (Dokument D2) oraz w świetle danych na temat rozpuszczalności pochodnych taksolu w wodzie, przedstawionych w tabeli 1.

Tabela 1

Rozpuszczalność taksolu w wodzie

Związek Rozpuszczalność mg/ml

2'-(N)N-dietyloaminopropionylo)taksol-metanosulfonian	>	10)0
2'-(N>N-dietyloaminopropionylc^)taksol-chlorowodorek	<	1.0
2'-(N)N-dimetyloglicylo)taksol-metanosulfonian	>	5)0
2'-(alanilo)taksol-metanosulfonian	>	2,0
7-(N,N-dimetyloglicylo)taksol-nietanosulfonian	>	2,0
7-(alanilo)taksol-metanosulfonian	>	2,0
2',7-di(N,N-dimetyloglicylo)taksol-dimetanosulfonian	>	10,0

Poniżej podano uzasadnienie nowości i nieoczywistości związków wytwarzanych sposobem według wynalazku.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania pochodnych taksolu, wykazujących lepszą rozpuszczalność w wodzie niż taksol, a jednocześnie wykazujących wciąż doskonałą aktywność przeciwnowotworową.

Na podstawie znanego stanu techniki nie było absolutnie oczywiste, które pochodne mogłyby skutecznie poprawić rozpuszczalność taksolu; ponadto, nie było absolutnie oczywiste, które pochodne mogłyby poprawić charakterystykę rozpuszczalności i jednocześnie zapewnić doskonałą aktywność przeciwnowotworową.

Przede wszystkim, nieoczywistość otrzymywanych obecnie związków wynika z faktu, że związki te dotychczas nie zostały ani wytworzone ani opisane i że wytworzenie z dobrym skutkiem pochodnych taksolu nie jest sprawą łatwą ani możliwą do przewidzenia. Tak np. w Dokumencie D1 opisano różne pochodne taksolu, ale stwierdzono poważne problemy występujące przy wytwarzaniu pochodnych taksolu i opracowywaniu poszczególnych pochodnych jako prekursorów leków, spowodowane trudnościami w syntezie i problemami ze stabilnością (patrz Dok. D1 str. 302, trzeci do piątego paragrafu). W późniejszej jeszcze publikacji autorzy Deutsch et al. (Dokument D2)

166 041 usiłowali wytworzyć pochodne estrowe taksolu, ale nie udało im się to do tego stopnia, że Deutsch et al. stwierdzili, że: „wszystkie próby wytworzenia podstawowych prekursorów leków z taksolu z estrami aminokwasów zawiodły. Jak widać, związki te są zupełnie nietrwałe i łatwo powracają do taksolu (p. str. 790 drugi i ostatni paragraf).

Wreszcie, mrówczan 2'-(^-alanilo)taksolu poddany w Dokumencie D1 jest tam opisany jako „zbyt łatwo hydrolizujący, aby nadawał się jako prekursorowa forma taksolu (p. str. 302, pierwsze zdanie w piątym paragrafie). Wszystkie te problemy występujące w znanym stanie techniki świadczą o tym, że skuteczne wytwarzanie pochodnych taksolu nie jest przewidywalnym lub oczywistym przedsięwzięciem.

W celu dalszego wyjaśnienia trudności w dokładnym przewidywaniu użyteczności pochodnych taksolu, przedstawiamy dane zestawione w tabeli 1. Dane te dotyczą testów na rozpuszczalność różnych pochodnych z niniejszego zgłoszenia. Jak widać z tych danych, różne sole pochodnych nawet mogą mieć zmienną rozpuszczalność. NP. chlorowodorek pochodnej dietyloaminopropionianowej jest mało rozpuszczalny w wodzie, podczas gdy jego sól metanosulfonianowa jest znacznie bardziej rozpuszczalna.

Jak wspomniano powyżej, użyteczność potencjalnych pochodnych taksolu musi być rozważana nie tylko pod kątem charakterystyki rozpuszczalności w wodzie, lecz także ich aktywności in vivo. Ta właśnie ważna kombinacja charakterystyk jest konieczna dla opracowania skutecznych nowych pochodnych taksolu.

Przede wszystkim trzeba stwierdzić, że pewne pochodne taksolu ujawnione w znanym stanie techniki, chociaż są rozpuszczalne w wodzie, to jednak nie są aktywne jako prekursory leków.

Na przykład Dokument D1 opisuje na str. 302 mrówczan 2'-(^-alanilo)taksolu i otrzymywanie pochodnej sukcynilowej. Mrówczan 2'-($-alanilo)taksolu był pochodną rozpuszczalną w wodzie, ale określono go jako nie nadający się jako prekursor taksolu, gdyż zbyt łatwo hydrolizował. Z drugiej strony 2'-sukcynilowa pochodna taksolu, choć rozpuszczalna w wodzie, była nieaktywna jako prekursor leku (patrz ostatni cały pragraf na str. 302).

Tak więc, dotychczasowe niepowodzenia w uzyskiwaniu użytecznych pochodnych taksolu stanowią same w sobie dowód, że obecnie wytwarzane pochodne taksolu nie są oczywiste nawet na pierwszy rzut oka.

Reasumując, chociaż problemy związane z rozpuszczalnością taksolu w wodzie mogły być wcześniej znane, to skuteczne rozwiązanie tego problemu nie było dotychczas ani znane ani ujawnione. Skuteczne rozwiązanie problemów z rozpuszczalnością taksolu w wodzie obejmuje więcej, niż proste opracowanie pochodnych o zwiększonej rozpuszczalności w wodzie, ponieważ użyteczna pochodna taksolu musi mieć zarówno dobrą rozpuszczalność wodzie, jak i wystarczającą aktywność biologiczną. Związki, posiadające odpowiednią kombinację obu tych charakterystyk nie były absolutnie oczywiste w świetle znanego stanu techniki. W rzeczywistości, jak wspomniano powyżej, pewne związki opracowane wcześniej, o zwiększonej rozpuszczalności w wodzie, okazały się, jak stwierdzono, biologicznie nieaktywne.

W związku z powyższym wynalazek niniejszy w obecnej formie dotyczy sposobu wytwarzania nowych, dotychczas nigdzie nie opisanych związków, których wyjątkowa użyteczność, polegająca na kombinacji rozpuszczalności w wodzie, aktywności przeciwnowotworowej i odpowiedniej trwałości, wyraźnie odróżnia je od taksolu i jego pochodnych ujawnionych wcześniej, a ponadto na podstawie znanego stanu techniki absolutnie nie można było przewidzieć, że te związki będą takie właściwości posiadały. Sposób według wynalazku stanowi więc znaczny, nieoczywisty postęp w tej dziedzinie techniki, która z uwagi na trudności w syntezie i nietrwałość związków jest wyjątkowo skomplikowana i nieprzewidywalna.

Nowe pochodne taksolu wytwarzane sposobem według wynalazku stanowią, ogólnie biorąc, estry taksolu podstawione w położeniu 2' i/lub 7; ich budowę przedstawia wzór 2, w którym R i Ri każdy oznacza atom wodoru lub resztę aminokwasu wybranego z grupy obejmującej alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, fenyloalaninę, prolinę, lizynę i argininę, albo grupę o wzorze 3, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3 oraz R² i R³ każdy oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy zawierający od jednego do trzech atomów węgla lub R² i R³ łącznie z połączonym z nimi atomem azotu oznaczają nasycony pierścień heterocykliczny zawierający od czterech do pięciu atomów węgla z tym, że co najmniej jeden z podstawników R i R1 jest różny od atomu wodoru, zaś otrzymywany związek o wzorze 2 jest różny od 2'-(^-alanilo)taksolu.

166 041

3

Wówczas, gdy we wzorze 3, R ι/lub R nie oznacza atomu wodoru, omawiane związki mogą być traktowane jako „alkilowane aminokwsy“ i są niekiedy tak nazywane w dalszym ciągu niniejszego opisu. Tak więc związki o wzorze I można w szerokim znaczeniu uważać za estry taksolu zestryfikowanego w położeniu 2' i/lub 7 aminokwasami lub alkilowanymi aminokwasami.

Sposób według wynalazku obejmuje więc wytwarzanie:

a) pochodnych taksolu estryfikownych kosztem grupy hydroksylowej taksolu w położeniu 2',

b) pochodnych taksolu estryfikowanych kosztem grupy hydroksylowej taksolu w położeniu 7 i

c) pochodnych estryfikowanych kosztem grupy hydroksylowej taksolu zarówno w położeniu 2' jak i 7.

Spośród związków objętych powyższym wzorem ogólnym I, następujące konkretne związki można uważać za korzystne związki wytwarzane sposobem według wynalazku:

1. 2'-/N,N-dietyloaminopropionylo/taksol

2. 2'-/Ni,N-dimetyloglicylo/taksol

3. 7-/N,N-dimetyloglicylo/taksol

4. 2',7-di-/N,N-dimetyloglicylo/taksol

5. 7-/N,N-dietyloaminopropionylo/taksol

6. 2',7-di-/N,N-dietyloaminopropionyIo/taksol

7. 2'-/S-glicylo/taksol

8. 7-/S-glicylo/taksol

9. 2',7-di/S-glicylo/taksol

10. 2'-/S-alanilo/taksol

11. 7-/S-alanilo/taksol

12. 2',7-di/S-alanilo/taksol

13. 2'-/S-leucylo/taksol

14. 7-/S-leucylo/taksol

15. 2',7-di-/S-leucylo/taksol

16. 2'-/L-izoleucylo/taksol

17. 7-/S-izoleucylo/taksol

18. 2',7-di-/S-izoleucylo/taksol

19. 2'/S-walilo/taksol

20. 7-/S-walilo/taksol

21. 2',7-di-/S-walilo/taksol

22. 2'-/S-fenyloalanilo/taksol

23. 7-/S-fanyloalanilo/taksol

24. 2',7-di-/S-fenyloalanilo/taksol

25. 2'-/S-prolilo/taksol

26. 7-/S-prolilo/taksol

27. 2',7-di-/S-prolilo/taksol

28. 2'-/S-lizylo/taksol

29. 7-/S-lizylo/taksol

30. 2'-7-di-/S-lizylo/taksol

31. 2'-/S-glutamilo/taksol

32. 7-/S-glutamilo/taksol

33. 2',7-di/S-glutamilo/taksol

34. 2'-/S-arginilo/taksol

35. 7-/S-arginilo/taksol

36. 2',7-di/S-arginilo/taksol

W dalszym ciągu opisu powyższe numery będą powoływane jako numery kodowe związków.

Sposób według wynalazku obejmuje trzy warianty postępowania.

Pierwszy wariant dotyczy sposobu wytwarzania nowych pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym R i R¹ każdy oznacza atom wodoru albo resztę aminokwasu wybranego spośród alaniny, leucyny, izoleucyny, waliny, fenyloalaniny, proliny, lizyny i argininy albo grupę o wzorze 3, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3 oraz R² i R³ każdy oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy zawierający od jednego do trzech atomów węgla, lub R2 i R³ łącznie z połączonym z nimi

166 041 atomem azotu oznaczają nasycony pierścień heterocykliczny zawierający od czterech do pięciu atomów węgla z tym, że co najmniej jeden z podstawników R i R¹ jest różny od atomu wodoru i że wytwarzany związek o wzorze 2 jest różny od 2'-(^-alanilo)taksolu, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli i polega na tym, że poddaje się reakcji taksol z alaniną, leucyną, izoleucyną, waliną, fenyloalaniną, proliną, lizyną, argininą lub ze związkiem o wzorze 4, w którym n, R² i R³ mają wyżej podane znaczenie.

W przypadku wytwarzania związku podstawionego w położeniu 2', o wzorze 2, w którym R oznacza grupę o wzorze 3 i R1 oznacza H, taksol i związek o wzorze 4 poddaje się reakcji w stosunku równoważnikowym 1:1.

W przypadku wytwarzania dwupodstawionego związku z podstawnikami w położeniach 2' i 7, o wzorze 2, w którym R i R1 każdy oznacza grupę o wzorze 3, dwa równoważniki związku o wzorze 4 poddaje się reakcji z jednym równoważnikiem taksolu.

W przypadku wytwarzania związku podstawionego w położeniu 7, o wzorze 2, w którym R oznacza atom wodoru i R1 oznacza grupę o wzorze 3, dwupodstawiony związek z podstawnikami w położeniach 2' i 7 poddaje się reakcji odszczepiania podstawnika w położeniu 2'.

Korzystnie reakcję prowadzi się w obecności środka kondensującego oraz w obecności lub nieobecności katalizatora.

Ponadto, korzystnie reakcję odszczepiania prowadzi się za pomocą doprowadzenia pH dwupodstawionego związku z podstawnikami w położeniach 2' i 7 do wartości pH = 7-7,4.

W przypadku wytwarzania 2'-(N,N-dimetyloglicylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i R3 oznaczają grupy metylowe, a n oznacza 1.

W przypadku wytwarzania 2'-(N,N-dietyloaminopropionylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i r3 oznaczają grupy etylowe, a n oznacza 3, w stosunku równoważnikowym 1:1 do taksolu.

W przypadku wytwarzania 7-(N,N-dimetyloglicylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R² i R3 oznaczają grupy metylowe, a n oznacza 1 w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu, po czym odszczepia się podstawniki w położeniu 2'.

W przypadku wytwarzania 2'-7-di(N,N-dimetyloglicylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w który R2 i r3 oznaczają grupy metylowe, a n oznacza 1, w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu.

W przypadku wytwarzania 7-(alanilo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, jako aminokwas stosuje się alaninę w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu, po czym odszczepia się resztę alaniny w położeniu 2'.

Drugi wariant sposobu według wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym R i R1 każdy oznacza atom wodoru albo resztę aminokwasu wybranego spośród alaniny, leucyny, izoleucyny, waliny, fenyloalaniny, proliny, lizyny i argininy, z tym, że co najmniej jeden z podstawników R i R1 jest różny od atomu wodoru i że wytwarzany związek jest różny od 2'-(^-alanilo)taksolu, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, i polega na tym, że poddaje się reakcji taksol z aminokwasem z chronionym atomem azotu i następnie odszczepia się grupę ochronną z aminokwasem, przy czym jako grupę ochronną korzystnie stosuje się grupę t-butylokarbonyloksylową, fluorenometylenokarbonyloksylową lub karbobenzyloksylową.

W przypadku wytwarzania pochodnej taksolu podstawionej w położeniu 2', taksol i aminokwas z chronionym atomem azotu poddaje się reakcji w stosunku równoważnikowym 1:1.

W przypadku wytwarzania dwupodstawionej pochodnej taksolu z podstawnikami w położeniach 2' i 7, taksol i aminokwas z chronionym atomem azotu poddaje się reakcji w stosunku równoważnikowym 1:2.

W przypadku wytwarzania pochodnej taksolu z aminokwasem w położeniu 7, dwupodstawiony związek o wzorze 2, poddaje się reakcji odszczepiania aminokwasu w położeniu 2'. etap odszczepiania grupy ochronnej prowadzi się w łagodnych warunkach kwasowych.

Ponadto, korzystnie jako aminokwas stosuje się L-alaninę, L-leucynę, L-izoleucynę, L-walinę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-lizynę lub L-argininę.

W przypadku wytwarzania 7-(alanilo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem jako aminokwas stosuje się alaninę w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu, po czym odszczepia się resztę alaniny w położeniu 2'.

166 041

Trzeci wariant sposobu według wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym R¹ oznacza resztę aminokwasu wybranego spośród alaniny, leucyny, izoleucyny, waliny, fenyloalaniny, proliny, lizyny lub argininy albo grupę o wzorze 3, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3 oraz R2 i R³ każdy oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy, zawierający od jednego do trzech atomów węgla lub R2 i r3, łącznie z połączonym z nimi atomem azotu, oznaczają nasycony pierścień heterocykliczny, zawiarający od czterech do pięciu atomów węgla, zaś R oznacza atom wodoru, z tym, że wytwarzany związek jest różny do 2'-(j3alanilo)taksolu, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli i polega na tym, że poddaje się reakcji taksol ze związkiem chroniącym grupę hydroksylową, korzystnie takim, jak chloromrówczan 2,2,2-trichloroetyIowy, po czym otrzymany taksol chroniony w położeniu 2' poddaje się reakcji z alaniną, leucyną, izoleucyną, waliną, fenyloalaniną, proliną, lizyną, argininą lub ze związkiem o wzorze 4, w którym R², R3 i n mają wyżej podane znaczenie, a następnie od chronionego w położeniu 2' taksolu podstawionego w położeniu 7, odszczepia się grupę ochronną w położeniu 2'.

Korzystnie w etapie odszczepiania grupy ochronnej, chroniony w położeniu 2' taksol, podstawiony w położeniu 7, poddaje się rakcji z mieszaniną cynku i kwasu octowego.

Korzystnie taksol chroniony w położeniu 2' poddaje się reakcji z L-alaniną, L-leucyną, L-izoleucyną, L-waliną, L-fenyloalaniną, L-proliną, L-lizyną lub L-argininą.

W przypadku wytwarzania 7-(N,N-dimetloglicylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i r3 oznaczają grupy metylowe i n oznacza 1.

W przypadku wytwarzania 7-(alanilo)taksolu, jako aminokwas w reakcji stosuje się alaninę.

Poniżej podano bliższe wyjaśnienia na temat sposobu według wynalazku oraz szczegółowo przedstawiono mechanizmy zachodzących reakcji.

Stwierdzono, że pod względem reaktywności chemicznej grup hydroksylowych taksolu w położeniu 2' i 7, grupa w położeniu 2'jest bardzie aktywna od grupy w położeniu 7. To stwierdzenie wykorzystano w ukierunkowaniu podstawienia w toku wytwarzania pochodnych.

A. Wytwarzanie estrów podstawionych w położeniu 2'

Pochodne estrowe podstawione w położeniu 2' mogą być wytwarzane jednym z dwu sposobów w zależności od tego, czy stanowią one pochodne aminokwasów, czy też alkilowanych aminokwasów.

Reakcja I: alkilowany aminokwas + taksol-- pochodna estrowa taksolu podstawiona w położeniu 2'. Reakcja ta jest przedstawiona na schemacie 1, w którym n, R2 i r3 mają wyżej podane znaczenia.

Wytwarzanie estrów aminokwasów przebiega według następującej reakcji:

Reakcja II: aminokwas z grupę ochronną przy atomie azotu + taksol-- pochodna aminokwasu z grupą ochronną przy atomie azotu oraz taksolu, podstawionego w położeniu 2'

- odszczepienie grupy ochronnej->pochodna estrowa aminokwasu i taksolu podstawiona w położeniu 2'.

W obydwu powyższych reakcjach (I i II) reakcję alkilowanego aminokwasu lub aminokwasu z grupą ochronną przy atomie azotu prowadzi się w obecności środka kondensującego, w nieobecności lub w obecności dodatkowego katalizatora, korzystnie w temperaturze pokojowej.

Dogodne środki kondensujące obejmują karbodiimidy, takie jak karbodiimid dicykloheksylowy (DCC). Dogodne katalizatory obemują 4-dimetyloaminopirydynę (DMAP) i pirydynę.

W reakcji II można stosować różne znane grupy ochronne amin, a jako substratów używać dostępnych handlowo chronionych aminokwasów. Można wykorzystać aminokwasy chronione przez grupę t-butylokarbonyloksylową (t-BOC), fluorenometylenokarbonyloksylową (FMOC) lub karbobenzyloksylową (CBZ). Korzystne są aminokwasy chronione przez grupę t-BOC lub FMOC. Odszczepianie ochronnej grupy t-BOC w estrach podstawionych w położeniu 2' przy użyciu wodnego roztworu kwasu mrówkowego i innych kwasów organicznych powoduje degradację produktu, jak również jego stereochemiczną medyfikację; zastosowanie 99-procentowego kwasu mrówkowego daje lepsze wyniki. W przypadku estrów aminokwasów z grupą ochronną FMOC odzyskanie produktu zależy do warunków procesu. Tak więc w końcowym etapie odszczepiania grupy ochronnej warunki, w których przebiega usuwanie grupy ochronnej t-BOC mogą spowodować niekorzystne modyfikacje cząsteczek taksolu w położeniu 7, w którym występuje wolna grupa hydroksylowa. Te niekorzystne modyfikacje polegają na stereochemicznej modyfikacji cząsteczki.

166 041 9

Przykładowo, związki alaninowe z chronionym atomem azotu są przedsta wione wzorem 5 (grupa ochronna t-BOC) i 6 (grupa ochronna FMOC).

Jak już wspomniano uprzednio, stwierdzono, że grupa hydroksylowa, znajdująca się w taksolu w położeniu 2'jest bardziej reaktywna chemicznie niż grupa hydroksylowa w położeniu 7. Zatem w obydwu powyższych reakcjach I i II podstawienie lub estryfikacja w wyniku reagowania aminokwasu alkilowanego lub o chronionym atomie azotu z taksolem w stosunku molowym 1:1 lub nieco większym niż 1:1 przebiegają w położeniu 2'. Taka reakcja równomolowych ilości substratów prowadzi do wytworzenia dużego nadmiaru pochodnej estrowej taksolu podstawionej w położeniu 2', aczkolwiek jako produkt uboczny może też powstać niewielka ilość estrowej pochodnej taksolu podstawionej w położeniu 7.

B. Wytwarzanie estrów podstawionych w położeniu 7

R e a k cja III. Ponieważ grupa hydroksylowa taksolu w położeniu 2'jest bardziej reaktywna niż grupa hydroksylowa w położeniu 7, ta estryfikacja wymaga sposobu postępowania odmiennego od sposobu wytwarzania pochodnych podstawionych w położeniu 2'. Tak więc, aby wytworzyć estry podstawione w położeniu 7 stosuje się sposób, według którego najpierw chroni się lub blokuje grupę hydroksylową w położeniu 2', następnie estryfikuje się grupę hydroksylową w położeniu 7 i wreszcie usuwa się grupę chroniącą lub blokującą położenie 2' taksol + związek ochronny-> taksol z grupą ochronną w położeniu 2^,alk^lowany aminokwas * taksol podstawiony w położeniu 7 alkilowanym aminokwasem, zawierający grupę ochronną w położeniu 2'-- odszczepianie grupy ochronnej z położenia 2'-- taksol estryfikowany w położeniu 7.

Do blokowania położenia 2' w taksolu można stosować różne grupy blokujące znane fachowcom. Stosując dla przykładu jeden rodzaj grupy ochronnej oraz alkilowany aminokwas można reakcję III przedstawić jak następuje: taksol + chloromrówczan 2,2,2-trichloroetylowy (ten ostatni związek został oznaczony w dalszym tekście symbolem troć)-- 2'-(troc)-taksol

Ν,Ν-dirnety.pgHcyna + Środek kondensujyy + Katalizator^ ₂'^-(trG^c)-7-(N^,N-dime^tyłogłic^yl^o/taksol-> od^- szczepienie grupy ochronnej w położeniu 2'-> ^^(iN,^-^<^^i^<^1^;^ll^^ll<^;^ll^//taksol.

Według powyższego zapisu, reakcję 2'-troc-taksolu z alkilowanym aminokwasem prowadzi się w obecności środka kondensującego i katalizatora. Odpowiednimi środkami kondensującymi i katalizatorami są te, o których wspomniano już powyżej, przy okazji reakcji I i II. Odszczepienie grupy ochronnej z 2'-/troc/taksolu można prowadzić np. za pomocą mieszaniny cynku i kwasu octowego.

Reakcja IV. Alternatywnie, pochodne taksolu podstawione w położeniu 7 można też wytwarzać według sposobu, w którym najpierw taksol poddaje się reakcji z 2-3 równoważnikami aminokwasu o zablokowanym atomie azotu z utworzeniem 2',7-dwupodstawionej pochodnej taksolu, następnie odszczepia się grupy ochronne z aminokwasów w położeniu zarówno 2', jak i 7 i wreszcie odszczepia się aminokwas w pozycji 2'. Przy użyciu alaniny z grupą ochronną t-BOC jako przykładu blokowanego aminokwasu ten sposób postępowania można przedstawić jak następuje:

taksol + 2 równoważniki N-t-BOC-alaniny-- 2',7-di/t-BOC-L-alaniiootaksol-> odszczepianie grup ochronnych aminokwasu-► odszczepianie grupy alanilowej w położeniu 2' z 2',7-di/Lalanilo/taksolu-> 7-/L-alanilo/taksol.

Według tego sposobu postępowania, podobnie jak w rakcji III, reakcję taksolu z zablokowanym aminokwasem prowadzi się w obecności środka kondensującego i katalizatora. Odszczepianie grupy ochronnej z aminokwasów prowadzi się według znanych sposobów odszczepiania grup ochronnych z aminokwasu, takich jak łagodne oddziaływanie kwasem, np. kwasem mrówkowym.

Odszczepianie aminokwasu w położeniu 2' realizuje się przez doprowadzenie pH roztworu taksolu podstawionego aminokwasem w położeniach 2' i 7 do wartości pH = 7-7,4, np. na drodze zmieszania taksolu podstawionego aminokwasem w położeniach 2' i 7 z buforem fosforanowym przy pH = 7-7,4. Taki sposób uregulowania pH powoduje odszczepienie aminokwasu z położenia 2' z utworzeniem pożądanego taksolu podstawionego aminokwasem w położeniu 7.

Tak np. taksol poddaje się w chlorku metylenu reakcji z 2-3 molowymi równoważnikami aminokwasu z chronionym atomem azotu (grupami t-BOC, CBZ lub FMOC) wobec DCC i katalitycznych ilości 4-dimeityl(oaminopirydyny. W ten sposób wprowadza się chroniony aminokwas w położenia 2' i 7 taksolu. Grupy ochronne usuwa się za pomocą odpowiedniego do tego celu środka (np. kwasu, słabej zasady lub na drodze hydrogenolizy). Dwupodstawioną pochodną taksolu zawierającą ugrupowania aminokwasu w położeniach 2' i 7 pozostawia się na 24-48 godzin

166 041 w buforze fosforanowym w warunkach odczynu obojętnego; następuje wówczas selektywne odszczepienie grupy ochronnej z położenia 2' z utworzeniem pochodnej taksolu podstawionej w położeniu 7.

Podobną reakcję można wykorzystać do wytworzenia pochodnych taksolu podstawionych w położeniu 7 przy użyciu alkilowanych aminokwasów. Taka reakcja przebiega w sposób zbliżony do wyżej opisanego z tą różnicą, że zastępuje się aminokwas z chronionym atomem azotu przez pożądany alkilowany aminokwas i eliminuje się etap odszczepiania grupy ochronnej. Reakcja ta przebiega w następujący sposób: taksol + 2 równoważniki alkilowanego aminokwasu -* dwupodstawiona pochodna taksolu zawierająca podstawniki w położeniach 2' i 7 -> odszczepianie alkilowanego aminokwasu z położenia 2' — takso 1 podstawiony w położeniu 7.

C. Wywarzanie 2', 7-dwupodstawionych pochodnych taksolu.

Dwupodstawionę pochodne można wytwarzać z wykorzystaniem powyższych sposobów lub z częściowym ich wykorzystaniem. Sposoby te można przedstawić w następujący sposób:

Reakcja VI: podstawienie alkilowanymi aminokwasami taksol + 2-3 równoważniki alkilowanego aminokwasu dwupodstawiona pochodna taksolu zawierająca alkilowany aminokwas w położeniach 2' i 7.

Reakcja VII: podstawienie aminokwasami taksol + 2-3 równoważniki aminokwasu z chronionym atomem azotu-- dwupodstawiona pochodna laksolu zawiieaaąca chroniony amii nokwas w położeniu 2' i 7-- odszczepianie grup ochronnych z aminokwasu-1 dwupodstawiona pochodna taksolu zawierająca aminokwas w położeniu 2' i 7

Reakcja VI jest w zasadzie taka sama, jak przytoczona powyżej reakcja I z tą różnicą, że biorą w niej udział 2 równoważniki alkilowanego aminokwasu. Ponadto, aczkolwiek reakcję I można prowadzić w obecności lub w nieobecności katalizatora, to sposób według reakcji VI wymaga obecności katalizatora ze względu na zmniejszoną chemiczną reaktywność grup hydroksylowych taksolu występujących w położeniu 7.

Reakcja VII jest w zasadzie taka sama, jak przytoczona powyżej reakcja II. Podkreślono tam jednak, że w reakcji II korzystną grupę ochronną stanowi FMLC, a to ze względu na wyeliminowanie sterycznej modyfikacji w położeniu 7 podczas etapu odszczepiania grupy ochronnej. Natomiast problem ten nie występuje w wypadku reakcji VII, ponieważ grupa hydroksylowa w położeniu 7 nie jest tu wolna. Tak więc można tu stosować znane grupy ochronne, obejmujące zarówno t-BLC, jak i FMLC.

Jest oczywiste, że niniejszy opis umożliwia fachowcom wytwarzanie pełnego asortymentu związków sposobem według wynalazku. Poniższe przykłady przedstawiają jednak korzystne postaci ilustrujące sposób według wynalazku.

Przykład I- 2' /N,N-dimetyiggilicyio/takso 1 htb eego oole , p^ed^w^ne wzoeem 2 , w którym R oznacza -CO-CH2-N/CH3/2 i R1 oznacza H lub R oznacza -CO-CH2-N/CH 3/2 :CH 3SL 3H i R1 oznacza H.

(a) Związek 1 - 2'-/N,N-dimetyloglicylo/taksol

Do roztworu 0,21 g (0,246 mmola) taksolu i 0,0254 g (0,246 mmola) N,N-dimtyloglicyny w 12 ml bezwodnego chlorku metylenu dodawano 0,15 g (0,72 mmola) 1,^^<^^t^c^!^l<^^^l^^^^^l^^^l<arbodiimidu (DCC) i 0,025 g (0,02 mmola) 4-dimetylgamingpirydyny. Mieszaninę reakcyjną mieszano w warunkach bezwodnych w ciągu jednego dnia, dodano jeszcze 50 mg DCC i kontynuowano mieszanie przez następne sześć godzin. Mieszaninę poreakcyjną sączono i przesącz odparowano w atmosferze azotu. Pozostałość rozdzielono chromatograficznie przy użyciu kolumny (26 cm), zawierającej 35 g silanlzgwanegg żelu krzemionkowego, eluując kolejno układem octan etylu: eter naftowy (1:1) i octanem etylu. W wyniku powolnego odparowania frakcji octan etylu - eter naftowy powstawał osad, który odsączano. Ciecz macierzystą zatężano i dodawano do niej eteru naftowego aż do pojawienia się zmętnienia; wówczas odstawiano ją w celu otrzymania większej ilości związku. Łącznie uzyskano 0,14g (wydajność 61%) produktu o temperaturze topnienia 168-171°C (z rozkładem). W widmie NMR związku 2 (300 MHz, CDC3) sygnał protonu 2' był przesunięty z 4,71 ppm w wypadku taksolu do 5,59 ppm. Świadczy to o estryfikacji w położeniu 2'. Położenie wszystkich innych sygnałów w widmie było zgodne z założoną strukturą. Czystość określana metodą wysoce sprawnej chromatografii cieczowej (HPSC) wynosiła 98-99,5%. Widmo masowe (FAB) m/e 939. (M + H)⁺.

166 041

Analiza elementarna obliczona w odniesieniu do C51HsaN2015: C 65,26, H 6,22 N 2,98 ;

znaleziono C 65,16, H 6,28, N 3,13%.

(b) Związek 2 - sól kwasu metanosulfonowego i 2'-/N,N-dimetylogli^cylo/tyksolu

0,06 g (0,064 mmylu) 2'-(N,N-dim-tyloglicyio/taksolu rozpuszczano w mieszaninie 2 ml tbutanolu i 1,5 ml wody. Roztwór chłodzono do temperatury ykyło 5°C i w^aplano do ni-2y 3,1 ml (2 mg/ml, 0,0645 mmylu) kwasu metanosulfonowegy, po czym mieszaninę mieszano w temperaturze 0-5°C przez jedną minutę i sączono przez mikroporowaSy filtr (20 pm) do kolby chłodzonej w układzie suchy lód - izypropunyl. Roztwór suszono w stanie zamrożenia, otrzymując 0,058 g produktu (wydajność 88%) o temperaturze typnienia 170-173°C.

Analiza elementarna obliczona w odniesieniu do C52H62N2SOia · 2H2O: C 57,83, H 6,27 N 2,6;

znaleziono C 57,49, H 6,06, N 2,73%.

Masa cząsteczkowa Temperatura topnienia Rozpuszczalność

Właściwości fizyczne:

- 1035

- 170-173°C (z oczkiem)

- 15 mg/ml (roztwór tekko mętay)

- 2 mg/ml (roztwór przezroczysty)

Badanie stabilności chemicznej

Stabilność chemiczną związku badano w następujący sposób: Stabilność pochodnych w warunkch różnych wartości pH określano w temperaturze 25°C i 37°C. Oddziaływanie plazmy badano w temperaturze 37°C przy użyciu plazmy szczurzej i ludzkiej. Plazmę ludzką otrzymano ze szpitala Watkinsa, a plazmę szczurzą z Oddziału Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kansas. Stężenie pochodnej wynosiło około 20-25 pg/ml. Otrzymywano roztwór podstawowy związku o stężeniu 0,8-1,0 mg/ml i dodawano go do plazmy tak, aby uzyskać pożądane stężenie (2025 pg/ml). Przygotowano sto próbek mikrylisrowych, zadano je 250pl ac-toniS(ylu i poddano ult(awi(ywaniu w celu wytrącenia protein plazmy. Kinetykę degradacji badano metodą HPLC, sporządzając wykres powierzchni piku w funkcji czasu. Obliczano wartości t90 i tso. Zarówno badania chemiczne, jak i plazmowe prowadzono metodą HPLC, przy użyciu kolumny RP-8 (15 cm) i kolumny wstępnej (5 cm). Detektor nastawiono na 227 nm. Fazę ruchomą etunywiła mieszanina 0,02 M octan (pH = 5): acetonitryl w stosuku 50:50 lub 35:65, przy czym szybkość przepływu wynosiła 1-1,5 ml/min; można też stosować te same rozpuszczalniki zawierując0,001 M wydosiarczanu t-trabutylyumoniowego w warunkach szybkości przepływu 1 ml/min.

W badaniach stabilności zanikowi piku badanego związku towarzyszy pojawienie się piku z czasem retencji równym czasowi retencji taksolu. Identyfikację tego piku potwierdzono później w wyniku badania degradacji nowych pochodnych. Tak więc 2'-/N,N-dimetyly2licylo/Saksyl inkubowano wodą w temperaturze 37°C, zatężano produkt i oczyszczano go metodą prepurutywnej chromatografii cienkowarstwowej. Oczyszczony produkt analizowano metodą HPLC i spektroskopową. Produkt wykazywał pik jonu cząsteczkowego o m/e 860 (M + L)+, co wskazywało, że produkt ten stanowił taksol.

Kolumna Faza ruchoma Detektor

Szybkość przepływu Objętość retencji

Warunki badania metodą HPLC

- RP-8, dhigość 150 mm, średnica wewnętrzna 4,6 mm

- 0,02 M octan (pH = 5) , acetonitryl = 50:50

- Kratos Spectryflyw 757

- 1 mUmin.

- związek 2 11,2 ml taksol 5,5 ml

Wyniki badania stabilności chemicznej: Warunki t1/2 (godziny)

0,02 M octan (0,1 mg/ml)
pH = 3,5, 25°C	96,2
pH = 4,5, 25°C	55,4
woda (2 mg/ml)
pH = 3,8, 37°C	89,8

166 041

Stabilność pod wpływem plazmy w temperaturze 37°C Warunki t1/2 (minuty) plazma szczurza (20 pg/ml) 3,05 plazma psia (20 pg/ml) 121,6 plazma ludzka (20 pg/ml) 118,6

Przykład I I. - Sole 2' Νί,Ν-dietyloaminopropionylo/taksolu przedstawione wzorem 2, w którym R ornacra -CO-CH2-CH2N (C2H₅)2 · HCL i R1 ornacra H, lub R ornacra -CO-CH2CH2N/C2H5/2 · CH3SO3H iR1 ornacra H.

(a) Związek 3 e sól 2'-[3-/N,N-dietyloamlno/-propionyio] taos olu i HCi

Do roztworu 0,12 g (0,14 mmola) taksolu w 12 ml CH 2O2 zawierającego 0,025 g (0,145 mmola) chlorowodorku kwasu N,N-dietyloaminnprnpinnnwegn dodano 0,08 g (0,38 mmola) 1,3-dicykloheksylokarbndπmidu i 0,01 g (0,081 mmola) 4-dimetyloaminopirydyny. Całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin, przesączano i przesącz odparowano w atmosferze azotu. Surowy produkt rozdzielano chromatograficznie przy użyciu kolumny (22 cm) zawierającej 18 g silanizowanego żelu krzemionkowego, eluując kolejno mieszaniną octan etylu : eter naftowy = 1:2, octan etylu : eter naftowy = 1:1 i octanem etylu. Frakcje octan etylu : eter naftowy w warunkach powolnego odparowywania tworzyły stały osad, który odsączano. Zawierające produkt ciecze macierzyste połączono, zatężono, dodano eteru naftowego do pojawienia się zmętnienia i odstawiono. Po przesączeniu otrzymano 0,068 g produktu (wydajność 48%) o temperaturze topnienia 188-191°C. Jego widmo masowe (FAB) m/e 981 (M + )+. Widmo NmR (300 MHz, CDCh) wskazywało, że sygnał protonu 2' jest przesunięty z 4,71 ppm w wypadku taksolu do 5,53 ppm. Grupy N-etylowe wykazywały rezonans metylowy przy 1,0 ppm i rezonans CH2 przy 2,52 ppm. Występowały też wszystkie sygnały charakterystyczne dla oczekiwanej struktury związku.

Analiza elementarna obliczona w odniesieniu do C54H65CIN2015: C 6N ,23, H 6,43 N 2,75 ;

znaleziono C 64,89, H 6,84, N 2,89%.

Masa cząsteczkowa Temperatura topnienia Rozpuszczalność

Kolumna Fozo ruchoma Detektor

Szybkość przepływu Objętość retencji

Właściwości fizyczne związku 3:

- 1017556

- i_z lozzkadem)

- około 0,8 mg/ml

Warunki badania metodą HPLC

- RP-81 dhigość 150 mm , średnica wewnętrzna 4,6 mm

- 0,02 M octan (pH — 5) : acetonitiylł = 35:65

- Kratos Speceroflow wi7

- hIml/min.

- 16,7Im I (związek 3)

Stabilność chemiczna:

Warunki t1/ (godziny)

0,02 M octan (0,01 mg/ml, pH = 3,5; 25°C 438,6

0,02 M fosforan (0,02 mg/ml, pH = 7,4; 25°C 0,25

Stabilność pod wpływem plazmy w temperaturze 37°C

Warunki t1/2 (minuty) plazma ludzka

4,2

166 041

Związek 4 - Sól 2'/N,N-dietyloaminopropionylo/taksolu z kwasem metanosulfonowym

W celu wytworzenia soli kwasu metanosulfonowego z kwasem N,N-dietyloaminopropionowym, 10 g sephadexu QAE („Pharmacia) nawilżano w ciągu 75 godzin 0,1 M roztworem NaCl i 75% tego materiału zastosowano jako wypełnienie kolumny. Kolumnę przemyto za pomocą 700 ml destylowanej wody i poddano równoważnemu nasyceniu przy użyciu 500 ml CHeSO3Na (otrzymanego z 0,5 M kwasu metanosulfonowego i 0,5 M wodorotlenku sodowego oraz zmiareczkowanego do pH = 6). Całkowity zanik jonów Cl” stwierdzono zbierając eluat i badają go na obecność jonów Cl” na drodze wprowadzenia paru kropel 1% azotanu srebrowego w paru kroplach kwasu azotowego. Następnie kolumnę przemywano wodą destylowaną aż do odczynu obojętnego.

2,5 g soli kwasu N,N-dietyloaminopropionowego i HCl w 15 ml wody wprowadzono do kolumny i wymyto wodą, odbierając cztery frakcje po 50 ml. Parę pierwszych frakcji zawierało produkt; połączono je i usunięto z nich rozpuszczalnik. Pozostałość rozpuszczono w mieszaninie chlorek etylenu-etanol, roztwór wysuszono nad siarczanem magnezowym i usunięto rozpuszczalnik, uzyskując 3,1 g produktu. Po wytręceniu z etanolu i eteru dietylowego otrzymano 2,6 g soli kwasu metanosulfonowego z kwasem N,N-dietyloaminopropionowym.

Do roztworu zawierającego 0,05 g (0,058 mmola) taksolu i 0,014 (0,058 mmola) soli kwasu metanosulfonowego z kwasem N,N-dietyloaminopropionowym w 10 ml chlorku metylenu dodano 0,061 g (0,3 mmola) 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu i całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin. Następnie mieszaninę przesączono i przesącz odparowano w atmosferze azotu. Pozostałość rozdzielono chromatograficznie, przy użyciu kolumny wypełnionej silanizowanym żelem krzemionkowym. Środkiem eluującym była mieszanina octan etylu: eter naftowy = 1:1 i octan etylu. Z frakcji octan etylu - eter naftowy po powolnym odparowaniu otrzymano 0,048 g produktu (wydajność 74%) o temperaturze topnienia 170-174°C.

Właściwości fizyczne:

Masa cząsteczkowa - 1077,12

Temperatura topnienia - 170-174°C

Rozpuszczalność - >110 mg/ml

Czystość metodą HPLC - > 99%

Stabilność chemiczna:

Warunki t-1/2 (godziny)

0,02 M octan (pH = 4,5; 25°C) 305

0,02 M octan (pH = 5,5; 25°C) 22,7

Przykład III - Wytwarzanie 7-/N,N-dimetyloglicylo/taksolu lub jego soli, przedstawionym wzorem 2, w którym w poszczególnych związkach R i R1 mają następujące znaczenie:

Numer kodowy związku	R	R1
5	-CO-O-CH2-CCI3	H
6	-CO-O-CH2CCL3	-CO-CH2-N/CH3/2
7	H	-CO-CH2-N/CH3/2
8	H	-CO-CH2-N/CH3/2 · CH3SO3H

(a) 2'-/troc/taksol (związek 5)

0,27 g (0,316 mmola) taksolu rozpuszczono w 10 ml CH2O2 i 1,5 ml pirydyny. Roztwór ochłodzono do temperatury - 20 - -25°C, dodano 80 μΐ chloromrówczanu 2,2,2-trichloroetylowego i całość mieszano w tej temperaturze w ciągu 3 godzin. Następnie dodano jeszcze 25 μΐ chloromrówczanu i mieszano przez noc. Mieszaninę rozcieńczono 50 ml CH 2Cl2 i przemyto kolejno dwoma porcjami po 25 ml 0,1 N HCl, jedną porcją 25 ml 0,05 M zimnego roztworu NaHCO 3 i wodą. Ekstrakt organiczny wysuszono nad bezwodnym MgSOą, usunięto rozpuszczalnik i surowy produkt oczyszczono metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstowej (TLC); stosowano przy tym płytki z silanizowanego żelu krzemionkowego, a układ rozwijający stanowiła mieszanina octan etylu : eter naftowy = 1:3. Odcięto pasmo powyżej taksolu, eluowano octanem etylu i usunięto rozpuszczalnik, otrzymując 0,32 g (wydajność 97%) produktu o temperaturze topnienia 221-226°C (z rozkładem, temperatura mięknienia 160°C).

166 041 (b) 2'-/trgc/-7-/N,N-dimetylggllcylo/taksol (związek 6)

Mieszaninę 0,27 g (0,262 mmola) 2'-/troc/taksolu i 0,054 g (0,524 mmola) N,N-dimetyloglicyny rozpuszczono w 15 ml CH 2O2. Do roztworu dodano 0,215 g (1,04 mmola) 1,3-dicyklgheksylskarbodumidu i 0,025 g (0,2 mmola) 4-dlmetylgamlngpirydyny. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 2 dni, przesączono ją i usunięto rozpuszczlanik. Surowy produkt oczyszczano metodą preparatywnej TLC; stosowano przy tym płytki z sllanlzgwanngo żelu krzemionkowego, a układ rozwijający stanowiła mieszanina octan etylu: eter naftowy = 1:1. Ldcięto pasmo poniżej taksolu (Rf = 0,47; octan etylu : eter naftowy = 1:1), elugwang octanem etylu i usunięto rozpuszczalnik otrzymując 0,26 g (wydajność 89%) produktu o temperaturze topnienia 176-182°C (z rozkładem).

Analiza elementarna obliczona w odniesieniu do C54H60O3N2L17: 2 58,12, H 5,42 N 2,51 ;

znaleziono C 38,68, H 6,00, N 3,18%.

(c) 7-/C,N-dimetylogllcylo/taksgl (związek 7)

Do roztworu 0,335 g (0,3 mmola) 2'-/trgc/-7-Ce,N-dimetyloglicylo/taktolu w 12 ml mieszaniny metanol : kwas octowy = 9:1 dodano 0,275 g pyłu cynkowego, mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 25 minut i przesączono. Przesącz zatężono do objętości około 1 ml, rozcieńczono 35 ml CH2CI2 i przemywano kolejno dwoma porcjami po 20 ml 0,01 M HCl, 0,01 M zimnym roztworem NaHCL3 oraz wodą. Ekstrakt organiczny wysuszono nad bezwodnym Na2SL4 i usunięto rozpuszczalnik, otrzymując 0,24 g produktu. Związek oczyszczono metodą preparatywnej TLC, stosując płytki silanizowanego żelu krzemionkowego (20 X 20,3nr) i rozwijając w mieszaninie CH2CI2: octan etylu = 7:1. Gdcinane pasmo odpawiadające 7-/C,C-dimetylgglicylo/tak^lowi (Rf = 0,35) oraz elugwang octanem etylu i etanolem. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano 0,19 g (wydajność 60%) produktu o temperaturze topnienia 180-185°C (z rozkładem; temperatura mięknienia około 140°C) i widmie masowym (FAB) m/e 939 (M + H)⁺. W widmie NMR (300 MHz, CDCI3) sygnał 7-H przy 4,33 ppm w taksolu występuje jako dublet dubletu przy 5,65 ppm. Sygnał N-(CH 3)2 ma postać singletu przy 2,35 ppm. Grupa metylenowa glicynianu daje sygnał przy 3,16 ppm.

(d) Sól 7-/dimetyloglicylo/taktglu i kwasu metangsulfonowegg (związek 8)

0,065 g (0,069 mmola) 7-/dlmntylggllcylo/taksolu rozpuszczano w mieszaninie 2,5 ml tbutanolu i 1 ml wody, roztwór ochłodzono do temperatury 5-10°C i dodano 3,36 ml (2 mg/ml, 0,0697 mmola) kwasu metanosulfgngwngo. Mieszaninę mieszano w ciągu dwu minut i przesączano przez mikroporowaty filtr do kolby chłodzonej w lodzie. Przesącz wysuszono w stanie zamrożenia uzyskując 0,066 g (wydajność 94%) produktu o temperaturze topnienia 164-168°C (z rozkładem).

Analiza elementarna obliczona w odniesieniu do C 52H 62N 2L ieS · 2H2L: C 58,29, H 6,19 N 2,6;

znaleziono C 58,05, H 6,00, N 1,72%.

Masa cząsteczkowa Temperatura topnienia Rozpuszczalność

Kolumna Faza ruchoma Detektor

Szybkość przepływu Lbjętość retencji

Właściwości fizyczne:

- 1035

- 164-168°C

- > 2 mg/ml

Warunki badania metodą HPLC:

- RP-8, dhigość 150 mm, średnica wewnętrzna 4,6 mm

- 0,02 M octan (pH = 5): acetonitiyl = 35:65

- Kratos Spectroflow 757

- 15 ml/mńn.

- 15,07 ml (związek 8)

Stabilność chemiczna:

Warunki t1/2 (godziny)

0,02 M octan (pH = 3,5; 25°C) 0,02 M octan (pH = 4,5; 25°C) 0,02 M fosforan (pH = 7,-4; 25°C)

3337

1111

3331

166 041
Stabilność pod wpływem plazmy w	temperaturze 37°C
Warunki	t1/2 (godziny)
plazma szczurza (20 pg/ml)	17,3
plazma ludzka (20 pg/ml)	22,7
plazma ludzka (10 pg/ml)	24,4

Przykład IV. Wytwarzanie 2', 7-/dimetyloglicylo/taksolu (związku 9), przedstawionego wzorem 2, w którym R = R¹ i oznacza -60-CH 2-N/CH 3/2

0,06 g (0,0702 mmola) taksolu rozpuszczono w 5 ml bezwodnego chlorku metylenu i dodano 0,015 g (0,145 mmola) N,N-dimetyloglicyny. Następnie do tej mieszaniny dodano jeszcze 0,08 g (0,388 mmola) 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu i 0,008 g (0,065 mmola) 4-dimetyloaminopirydyny. Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny i przesączano. Z przesączu usunięto rozpuszczalnik, a pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej TLC, stosując płytki z silanizowanego żelu krzemionkowego i rozwijając w mieszaninie octan etylu : eter naftowy = 1: 1. Wyskrobywano pasmo powyżej dimetyloaminopirydyna (Rf = 0,17), eluowano mieszaniną octanu etylu z etanolem i usuwano rozpuszczalnik. Pozostałość rekrystalizowano z mieszaniny octan etylu - eter naftowy, otrzymując 0,046 g (wydajność 64%) produktu o temperaturze topnienia 194- 198°C i widmie masowym m/e 1024 (M+). W widmie NMR (300 MHz, CDCU) sygnały protonu C2 (4,71 ppm) i protonu C7 (4,33 ppm) były przesunięte odpowiednio do 5,5 ppm i 5,6ppm, co wskazuje na estryfikację w położeniach 2' i 7. Sygnał protonu N-CH 3 miał postać singletu przy 2,3 ppm. Analiza elementarna - obliczona w odniesieniu do C55H ssN 3016: C 63,39, H 6,48, N 4,03; znaleziono: C 63,00, H 6,98, N 3,98%.

Wytwarzanie soli 2', 7-/N,N-dimetyloglicylo/taksolu i kwasu dimetanosulfonowego

Do roztworu 60 mg (0,0585 mmola) 2',7-/dimetyloglicylo/taksolu w mieszaninie 2 ml tbutanolu i 1 ml wody, ochłodzonego do temperatury 0-5°C dodawano 11,37 mg (3,79 ml, 3 mg/ml, 0,117 mmola) kwasu metanosulfonowego i całość mieszano w temperaturze 0-5°C w ciągu 2 minut. Następnie sączono przez mikroporowaty filtr (0,2 pm) i przesącz wysuszano w stanie zamrożenia, otrzymując 62 mg produktu o temperaturze topnienia 160-163°C.

Masa cząsteczkowa Temperatura topnienia Rozpuszczalność Czystość metodą HPLC

Kolumna Faza ruchoma

Detektor

Szybkość przepływu Objętość retencji

Właściwości fizyczne:

- 1217

- 160- 163°C (z rozkładem)

- >10 mg/ml

- około 96%

Warunki badania metodą HPLC:

- RP-8, d-uigość 150 mm, średnica wewnętrzna 41,6 mm

- Mieszanina 0,02 M octan (pH = 5) : acetonitiyl = 50:50; zawierająca 0,005 M wodorosiarczanu tetrabutyloamoniowego

- Kratos Spectroflow 7^7

- 1 ml/min.

- 6,64 ml

5,8 ml (taksol)

PrzykładV - Wytwarzanie 7-/L-alanilo/taksolu lub jego soli (a) 2', 7-Di/t.BOC-L-alanilo/taksol

Do roztworu mieszaniny 0,31 g (0,246 mmola) taksolu i 0,14 g (0,739 mmola) N-t.BOC-Lalaniny w 15 ml chlorku metylenu dodano 0,25 g (1,21 mmola) i

0,25 g (0,20 mmola) dimetyloaminopirydny. Całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin i przesączono. Z przesączu usunięto rozpuszczalnik i pozostałość rozdzielono chromatograficznie za pomocą kolumny wypełnionej silanizowanym żelem krzemionkowy (20 g, 14 cm), eluując mieszaniną octan etylu : eter naftowy 1:1 i octanem etylu. Frakcje mieszaniny octan etylu -eter naftowy, zawierające dwupodstawioną pochodną, łączono i usuwano z nich rozpuszczalnik, otrzymując 0,27 g (wydajność 92%) produktu o temperaturze topnienia 158-161°C (z rozkładem).

166 041 (b) 7-/L-Alanilo/taksol

0,29 g (0,242 mmola) 2', 7-Di-/t.BOC-L-alanilo/taksolu i 2 ml kwasu mrówkowego mieszano wspólnie w temperaturze pokojowej w ciągu 40 minut, a następnie usuwano nadmiar kwasu mrówkowego w atmosferze azotu. Pozostałość rozpuszczono w etanolu i dodano eteru naftowego. Wytrącony stały osad odsączono, uzyskując 0,27 g 2',7-di/alanilo/taksolu.

Otrzymaną w ten sposób surową pochodną dialanilową wprowadzono do mieszaniny złożonej z 4 ml acetonitrylu i 50 ml buforu fosforanowego (0,02 M, pH = 7,4). Całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 12 godzin, a następnie spowodowano wzrost pH roztworu do wartości 6,8, dodając kilka mililitrów 5% NaHPO4. Mętny roztwór mieszano jeszcze przez 8 godzin w temperaturze pokojowej, rozcieńczono 50 ml chlorku metylenu i dodano 50 ml zimnego 0,05 M NaHCO3. Natychmiast potem mieszaninę reakcyjną ekstrahowano trzema porcjami po 50 ml chlorku metylenu, ekstrakt organiczny przemyto jednokrotnie wodą i wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym. Po usunięciu rozpuszczalnika uzyskano 0,24 g produktu, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej, stosując kolumnę wypełnioną silanizowanym żelem krzemionkowym. Otrzymano 0,135 g produktu (wydajność 63%) o czystości >95%, temperaturze topnienia 159-163°C i widmie masowym (FAB) m/e 925 (M + H)+. W widmie NMR (300 MHz, CDCb) sygnał 7-H taksolu przy 4,33 ppm występował jako dublet dubletu przy 5,65 ppm. Sygnał grupy CH 3 we fragmencie alaniny miał postać dubletu, przy 1,27 ppm.

Analiza elementarna obliczona w odniesieniu do CsoHseN2016 · 2,5H2O: C 61,91, N 6,54, N 2,89, znaleziono: C 61,41, H 6,59, N 2,78% (c) Sól 7-/alanilo/taksolu i kwasu metanosulfonowego

Do roztworu 62 mg (0,0658 mmola) 7-/alanilo/taksolu w mieszaninie 2 ml t-butanolu i 1 ml wody, ochłodzonego do temperatury 0-5°C, dodano 6,39 mg (2,13 ml, 3 mg/ml) kwasu metanosulfonowego i całość mieszano w tej temperaturze w ciągu 2 minut, a następnie przesączono przez mikroporowaty filtr (0,2pM). Przesącz wysuszono w stanie zamrożenia, uzyskując 66 mg produktu o temperaturze topnienia 180-184°C.

Masa cząsteczkowa Temperatura topnienia Rozpuszczalność

Kolumna Faza ruchoma

Detektor

Szybkość przepływu Objętość retencji

Właściwości fizyczne:

- 1021

- 180-184°C (3 rozkładem)

- > 2 mg/ml

Warunki badania metodą HPLC:

- RP-8 , dhigość 1i>0 mm , średmca wewnętrzna 4,6 mm

- Mieszanina 0,02 M octan (pH = 5) : acetonitryl = 50:50, zawierająca 0,221 M wodorosiarczanu tetrabutyloamoniowego

- Kraoos Spectroflow 757

- 1 mUmin.

- 8,7 ml

- 7,3 ml (taksol)

Stabilność pod wpływem plazmy w temperaturze 37°C:

Warunki t1/2 (godziny) plazma ludzka (20 pg/ml)

11,9

Przykład VI. Wytwarzanie 2'-/alanilo/taksolu (a) Wytwarzanie 2'/CBZ-L-alanilo/taksolu

Do roztworu 30 mg (0,0036 mmola) taksolu i 8,5 mg (0,036 mmola) CBZ-L-alaniny w 5 ml chlorku metylenu dodano 45 mg DCC i 4 mg 4-dimetyloaminopirydyny i mieszano całość w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Następnie mieszaninę reakcyjną przesączono i usunięto rozpuszczalnik z przesączu. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej TLC, stosując przy tym płytki z silanizowanego żelu krzemionkowego i mieszaninę octan etylu : eter naftowy = 1:1 jako układ rozwijający. Odcięto pasmo powyżej taksolu, eluowano octanem etylu i usuwano rozpuszcalnik, uzyskując 28 mg 2'-/CBZ-L-alanilo/taksolu.

166 041 17 (b) Wytwarzanir 2'i/alanilo/taksolu pozez odezczep(cnle grue gchronnrch 2'-/CBZ-L-aI-silo/taksolu

2'-/CBZ-L-alanilo/taksgl rozpuszczono w etahgle w obecności kwasu organicznego jak np. kwas octowy lub mrówkowy, i mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 2 godzin wobec 5% p/ll/de gt/dzohegg na węglu. Mieszaninę reakcyjną przesączono w celu oddzielenia katalizatora i usunięto rozpuszcz^nik. Surowy produkt rozpuszczono w etanolu i do roztworu dodahg eteru haftgwegg. Uzyskano w ten sposób z małą lub umiarkowaną wydajnością 2'-//lamlg/taksgl w pgst/ci tgli mrówczanowej lub gct/ngwej.

Przykład VII - Wytwarzanie 2'-/llzylo/t/ksole (a) Wytwarzanie 2'-/C-di-t.BLC-lizyIg/t/ksolu

Do mieszaniny 30 mg (0,035 mmola) taksolu i 19 mg (0,0368 mmola) N-di-t .BLC-L-lizyny w 10 ml chlorku metylenu dgdang 100 mg DCC i 10 mg 4-dimetylgamihopirydrhr. Całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu dwu dni, przesączono i usunięto rozpuszczalnik z przesączu. Pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej TLC, stosując płytki z sll/hizgw/negg żelu krzemionkowego i mieszaninę octan etylu: eter naftowy =1:1 jako układ rozwijający. Ldcięto pasmo powyżej taksolu, elugwang octanem etylu i usunięto rozpuszczalnik, otrzymując 20 mg produktu.

(b) Wytwarzanie 2'-/lizylo/t/ksolu przez oeszczepiame grup ochronnych t.BLC

Pochodną t/ksolu i aminokwasu z atomem azotu chronionym przez grupę t.BLC pode/wang reakcji z 99% kwasem mrówkowym (Sigma) w temperaturze pokojowej w ciągu 30-40 minut. Nadmiar kwasu mrówkowego etew/ng przez odpargwahln w atmosferze azotu. Surowy produkt oczyszczono na drodze krystalizacji lub metodą chromatograficzną, otrzymując pozbawioną grup chroniących atom azotu pochodną taksolu i aminokwasu, w postaci soli mrówczanowej.

Przykład VIII - Wytwarzanie 2'-/L-al/hilo/t/ksglu (a) Wytw/rz/nie 2'-/FMLC-L-al/nilo/t/ksglu

Do roztworu mieszaniny 60 mg (0,072 mola) i 22,4 mg C-FMLC-L-alahihr w 6 ml chlorku metylenu egd/ho 60 mg DCC i 2 mg 4-dimetrlg/mihoplrydyny. Całość mietz/ho w temperaturze pokojowej w ciągu dwu dni, przesączono i usunięto rozpuszczalnik z przesączu. Surowy produkt oczyszczono metodą preparatywhej TLC, stosując płytki z sllanlzgwahego żelu krzemionkowego oraz mieszaninę octan etylu: eter naftowy = 1:2 jako układ rozwijający. Ldcihaho pasmo powyżej taksolu, eluow/hg chlorkiem metylenu, usuwano rozpuszczalnik, otrzymując 48 mg produktu stanowiącego 2'-/FMGC-L-alanilo/taktol o temperaturze topnienia 162-164°C (z rozkł/eem).

(b) Gdt(nzepi/nle grup FMLC z pochodnej t/ktglu i chronionego aminokwasu

Pochodną taksolu i aminokwasu z atomem azotu chronionym przez grupę FMLC podd/wang reakcji z piperydyną w chlorku metylenu w ciągu dwu godzin, usuw/hg rozpuszczalnik i oczyszczano pozostałość metodą chromatograficzną, otrzymując w ten sposób pozbawioną grup gcnrghhrnn pochodną taksolu i aminokwasu.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można stosować do preparatów f/rm/ceutycznych jako takie, lub w pgtt/ni ich farm/nnutynznin dopuszczalnych pgli, zwłaszcza nietoksycznych, farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami lub dopuszczalnych soli z/tadowrnn. Sole te można wytwarzać ze związków wytwarzanych konwencjonalnymi sposobami chemicznymi.

Zazwyczaj sole wytwarza się przez reakcję wolnej zasady lub kwasu ze ttechiometryczną ilością lub z nadmiarem żądanego tworzącego sól nieorganicznego lub organicznego kwasu w odpowiednim rozpuszczalniku lub w różnych kombihacjann rozpuszczalników. Np. wolną zasadę można rozpuszczać w wodnym roztworze odpowiedniego kwasu i odzyskiwać sól standardowym sposobem, np. przez odparowanie roztworu. Alternatywnie, wolną zasadę można rozpuszczać w rozpuszczalniku organicznym, takim jak niższy /^/μΙ, eter, ester alkilowy lub ich mieszanmy, np. metanol, et/nol, eter etylowy, octan etylu, roztwór octanu etylu w eterze itp., a następnie traktować odpowiednim kwasem z wytworzeniem odpowiedniej soli. Sól odzyskuje się typowymi sposobami, np. przez odsączenie soli lub spontaniczne oddzielenie od roztworu, lub też można ją wytrącić przez dgd/hie rozpuszczalnika, w którym sól się nie rozpuszcza i odzyskanie jej z niego.

Pochodne t/ksolu wytwarzane sposobem według wynalazku można stosować do leczeni/ nowotworów dzięki ich aktywności komórkobójczej i przeclwhowotwgrgwej. Związki te można pge/wać w pgttaci tabletek, pigułek, proszków, kapsułek, iniekcji, roztworów, czopków, emulsji,

166 041 dyspersji, crzedmie-zek paszowych lub w innej dogodnej postaci. Korzystnie preparaty farmaceutyczne zawierające te związki miesza się z nietoksycznymi farmaceutycznymi nośnikami organicznymi lub nietoksycznymi farmaceutycznymi nośnikami nieorganicznymi, zwykle w ilości około 0,01 mg do 2500 mg lub więcej ]o dawkę jednostkową, o korzystnie 50-500 mg. Typowymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami są np. mannit, mocznik, dekstrany, laktoza, skrobia ziemniaczana, stearynian magnezu, oleje roślinne, polig^ote alkilenowe, etyloceluloza, cirolidnn, węglan wapnia, oleinian etylu, mirysSynian izopropylu, benzoesan benzylu, węglan sodu, żelatyna, węglan poSasu, Swos krzemowy i inne zwykle stosowane dopuszczalne nośniki. Preparaty farmaceutyczne mogą też zawierać nietoksyczne pomocnicze substancje, takie jak środki emulgujące, konserwujące, zwilżające itd., jak np. mnnolaurynion sorbisylu, oleinian trieSannlnaminy, mnnostaorynion pnlinksyeSylenu, tripalmisynian glicerylu, sulfobur-zSynian dioktyln-ndowy isd.

Typowym przykładem sposobu wytwarzania tabletek zawierających substancję czynną jest zmie-zanie najpierw tej substancji z nietoksycznym środkiem więżącym, takim jak żelatyna, śluz akacjowy, etyloceluloza itp. Mieszanie korzystnie prowadzi się w standardowym mieszalniku V i zwykle w bezwodnych warunkach. Następnie otrzymaną mieszaninę można przerabiać na zwykłych tabletkarkach na półfabrykaty, które następnie przeprowadza się w tabletki. Świeżo przygotowane tabletki można powlekać lub pozostawiać bez powłok. Jako powłoki można stosować nietoksyczne powłoki jak szelak, metyloceluloza, wosk karnauba, kopolimery styrenu i kwasu maleinowego itp. Do podawania doustnego wytwarza się prasowane tabletki zawierające 0,01 mg, 5 mg, 25 mg, 50 mg, 500 mg isd, do 2500 mg, sposobami dobrze znanymi i oci-anymi w Remington^ Phormocausicol Science, rozdz. 39, Mack Publishing Co., 1965.

W celu wytworzenia tabletek miesza się równomiernie substancję czynną, skrobię kukurydzianą, laktozę, fosforan diwopninwy i węglan wapnia, w warunkach suchych, w konwencjonalnej mieszarce V, do uzyskania jednolitego zmie-zania wszystkich składników. Następnie wytwarza się pastę ze skrobi kukurydzianej w postaci pasty 10% i miesza się ze świeżo przygotowaną mieszanką do uzyskania jednolitej mieszaniny. Mieszaninę tę przepuszcza się następnie przez standardowe sito, suszy w bezwodnej atmosferze i następnie miesza ze stearynianem wapnia, po czym prasuje się na tabletki i ewentualnie powleka. Inne tabletki zawierające 10,50,100,150 mg itd. wytwarza się w podobny sposób.

Poniżej podano przykładowy skład preparatu, zawierającego związek wytwarzany scosnbem według wynalazku.

Preparat I

Składniki mg, na tabletkę

Substancja czynna 50,0

Skrobia kukurydziana 11,0

Pasta ze skrobi kukurydzianej 4,5

Węglan wapnia 11,0

Laktoza 66,0

Stearynian wapnia 2,0

Fosforan diwocninwy 55),0

Wytwarzanie kapsułek zawierających 10-2500 mg do stosowonio doustnego polega zasadniczo na mieszaniu substancji czynnej z nietoksycznym nośnikiem i zamykaniu mieszaniny w otoczce Cnlimarowaj, zwykle z żelatyny itp. Kapsułki mogą mieć znaną, miękką postać, otrzymywaną przez zamykanie związku - dokładnie dyspergowanego z jadalnym, kompatybilnym nośnikiem albo twardą postać, składającą się zasadniczo z nowego związku, zmieszanego z nietoksyczną stałą substancją, taką jak talk, stearynian wapnia, węglan wapnia itd. Kapsułki zawierające 25, 75, 125 mg itd. nowego związku lub mieszaniny dwóch lub więcej nowych związków wytwarza się, np. następująco:

Preparat II

Składniki mg, na kapsułkę

Substancja czynna 5<00

Węglan wapnia 110,0

Laktoza U.S.P. 220),0

Skrobia 110,0

Stearynian magnezu 4,5

166 041

Powyższe składniki miesza się razem w typowej mieszarce i wsypuje do handlowo dostępnych kapsułek. Gdy stosuje się wyższe stężenia substancji czynnej, odpowiednio zmniejsza się ilość laktozy.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można też liofilizować i ewentualnie łączyć z innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi zarobkami, dla wytworzenia preparatów nadających się do podawania pozajelitowego, do wstrzykiwań. Przy takim podawaniu można preparaty rekonstytuować w wodzie (normalnej, solance) lub w mieszaninie wody i rozpuszczalnika organicznego,takiego jak glikol propylenowy, etanol itp.

Podawana dawka, tak pojedyncza, wielokrotna, jak dzienna może się oczywiście wahać, zależnie od związku, ze względu na jego moc, sposób podawania, wielkość otrzymującego ją oraz rodzaj stanu chorego. Podawana ilość nie podlega określonym ograniczeniom, ale zwykle stanowi ona dawkę skuteczną lub jej molowy równoważnik farmakologicznie czynnej wolnej postaci, wydzielanej z dawkowanego preparatu przy metabolicznym wydzielaniu aktywnego leku, tak aby osiągnąć pożądane efekty farmakologiczne i fizjologiczne. Na ogół podaje się 0,8-8 mg/kg ciężaru ciał lub około 50-275 mg/m2 chorego, zwykle około 230-275 mg/m².

Aktywność biologiczna

Jak już wspomniano, pochodne taksolu otrzymywane sposobem według wynalazku są użyteczne dzięki ich aktywności przeciwnowotworowej. Są one szczególnie przydatne do traktowania tych raków, w których aktywny okazał się taksol, między innymi w nowotworach płuc u człowieka, w czerniaku, białaczce, nowotworach sutka i okrężnicy.

Aktywność biologiczną pochodnych taksolu testowano za pomocą (A) badań in vitro w celu pomiaru kinetyki łączenia się mikrorurek oraz (B) badań in vitro kinetyki hodowli komórek czerniaka B16, a także (C) badań in vivo ksenograftu MX-1 na SRC torebce podnerkowej.

(A) Badania in vitro dotyczące kinetyki łączenia się mikrorurek

Mikrorurki stanowią integralną część eukariotycznych komórek i łączenie się mikrorurek jest bardzo ważne i związane z podziałem i mnożeniem się komórek. Wykazano, że polimeryzacja mikrorurek jest bardzo wrażliwa na wpływ wapnia: wapń może hamować łączenie się tubuliny i depolimeryzować uprzednio złączone mikrorurki. Badano wpływ znanych związków przeciwnowotworowych na łączenie się mikrorurek.

Alkaloidy winka, takie jak winblastyna i winkristyna, jak wykazano, rozrywają mikrorurki komórkowe, to jest wykazano in vitro, że hamują łączenie się mikrorurek i powodują depolimeryzajcę mikrorurek znajdujących się w stałym układzie.

Podobnie, wykazano że kolchicyna powoduje depolimeryzację mikrorurek w komórkach.

Z drugiej strony, stwierdzono, że taksol wykazuje bardzo wyjątkowy mechanizm działania, gdyż promuje łączenie się mikrorurek, ale hamuje ich rozdzielanie się, przez co koliduje z fazami G2 i M cykli komórkowych i podziału. Badania in vitro wykazały, że mikrorurki raz spolimeryzowane w obecności taksolu opierają się depolimeryzacji pod działaniem innych środków, np. CaCfe lub niskiej temperatury, która normalnie depolimeryzuje mikrorurki.

Prowadzono badania wpływu pochodnych taksolu na łączenie się mikrorurek. Badania te prowadzono stosując zarówno pochodną 2', jak i 7, zgodnie ze sposobami in vitro, opisanymi w Mellado i in. Biochemical and Biophysical Research Communications, t. 124, nr 2 (1984), str. 329-336; Magri i in., J. Org. Chem., 51, 797-802 (1986) oraz Parness i in., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1.105, nr 3 str. 1082-1091 (1982). Zdolności tych związków do łączenia mikrorurek można było uszeregować następująco: taksol>7-/N,N-dimetyloglicylo/taksol (11)>2-/Ni,N-dietyloaminopropionylo/taksol (8)>2'-/N,N-dimetyloglieylo/taksol (2). Badanie to wykazuje, że sprawą zasadniczą dla łączenia się mikrorurek jest wolna grupa 2'-hydroksylowa. Pochodne podstawione w pozycji 2' są aktywne tylko, jeżeli grupa 2'hydroksylowa zostaje uwolniona w toku doświadczenia. Pochodne podstawione w pozycji 7 mają wolną grupę 2'-hydroksylową i są, wobec tego, aktywne. Wyniki te są zgodne z aktywnościami 2'- i 7-acetylotaksolu, opisanymi w literaturze, Mellado i in., Biochemical and Biophysical Research Communications t. 124, nr 2(1984) str. 324-336.

166 041 (B) Badania hodowli komórek B16 in vitro

W celu potwierdzenia aktywności pochodnych taksolu wytwarzanych sposobem według wynalazku prowadzono badania in vitro hodowli komórek, stosując komórki czerniaka B-16. Badania te prowadzono standardowymi sposobami opisanymi przez Donoso i Himes, Cancer Biochem. Biophysics, t. 7, (1984), str. 133.

Badając rozmnażanie się komórek czerniaka B-16 stwierdzono, że badane substancje można uszeregować zależnie do ich skuteczności następująco: taksol>2'-/N,N-dimetyloglicylo/taksol>2'/N,N-dietyloaminopropionylo/taksol>7-/N,N-dimelyloglicylo/taksoł. To badanie i inne badania kinetyki wykazały, że pochodne podstawione w pozycji 2' powracają do struktury taksolu i wykazują aktywność. Tak więc, pochodne podstawione w pozycji 2' przypuszczalnie działają jako prekursory leków. Z drugiej strony, pochodne podstawione w pozycji 7 wykazują swoją własną aktywność i nie wydaje się, aby miały działać jako prekursory leków.

(C) Badania in vivo

Trzeci typ doświadczeń prowadzonych w celu potwierdzenia biologicznej aktywności pochodnych taksolu obejmował badania in vivo na myszach, dotyczące ksenograftu MX-1 nowotworu sutka człowieka wszczepionego do torebki podnerkowej. Stosowano sposoby opisane na str. 23-24 NIH Publication No. 84-2635, in Vivo Cancer Model (luty 1984).

W sposobie tym stosowano grupy myszy poddawane testom (6 myszy na testowaną grupę) oraz grupy kontrolne po 12 myszy na grupę. Fragment nowotworu (ksenograft MX-1 raka sutka człowieka) wszczepia się pod błoniastą powłokę nerki każdej myszy.

Postępowano według następującego programu badawczego:

Dzień 0; Uśpić zwierzęta. Zarejestrować ciężar ciała /Ciężar

Dzień 1: Wszczepić nowotwór, zmierzyć, zarejestrować. Bezładnie pomieszać zwierzęta po powrocie do świadomości po uśpieniu. Nastawić kultury bakteryjne. Oznaczyć rozpuszczalność środków testujących. Zapisywać codziennie zgony.

Dzień 1: Sprawdzić kultury. Wyrzucić, jeżeli są zanieczyszczone. Przygotować materiały do testów. Rozpocząć wstrzykiwanie testowanych środków (w tylną część szyi), zależnie od indywidualnego ciężaru ciała. Podaje się 04D w Dniach 1,5 i 9. Przygotować środek testowany każdego dnia, w którym się wstrzykuje i podawać w zależności od ciężaru ciała w tym dniu.

Dzień 2: Sprawdzić ponownie kultury. Przerwać testowanie, jeżeli są zanieczyszczone i odpowiednio zarejestrować.

Dzień 5 i 9: Przygotować świeże środki testowane każdego dnia, w którym się wstrzykuje i podawać zależnie od indywidualnego ciężaru ciała w tym dniu.

Dzień 11: Zakończyć i ocenić doświadczenie. Zarejestrować ciężary ciała (Ciężar Dzień 2). Zmierzyć nowotwór w jednostkach OMU (Ocular Micrometer Unit - 10 OMU = 1 mm) i zarejestrować.

Ocena: Mierzonym parametrem jest średnia zmiana ciężaru nowotworu (delta) oparta na pomiarach długości i szerokości w milimetrach. Średnie ciężary ciała zwierząt oblicza się komputerowo dla Dnia 1 i Dnia 11, oblicza się komputerowo T/C dla wszystkich testowanych grup z > 65% zwierząt, które przeżyły w Dniu 11. Nadmierna różnica w zmianie ciężaru ciała (testowane minus kontrolowane) może być również stosowane dla oceny toksyczności. Wymiary mierzy się i rejestruje w jednostkach OMU (Ocular Micrometer Units). Do następujących obliczeń stosuje się komputer:

1/ Przekształcenie OMU w milimetry (mm)

2/ Obliczenie ciężarów nowotworów (mg) z wymiarów nowotworów (mm X mm), według wzoru na objętość wydłużonej elipsoidy:

L X W² 2 w którym L oznacza dłuższy z dwóch wymiarów 3/ Obliczenie zmiany (delta) w średnim ciężarze nowotworu dla każdej grupy myszy:

Zmiana w średnim ciężarze nowotworu = średni ciężar nowotworu (końcowy) - średni ciężar nowotworu (początkowy)

166 041 21

4/ Obliczenie zmiany (delta) w średnim ciężarze nowotworu dla grup testowanych (T) i grup kontrolnych (C)

5/ Obliczenie T/C% dla wszystkich testowanych grup, w których >65% zwierząt przeżyło w Końcowym Dniu Oceny:

T/C% = _^Δ_rigżaru x 100 jeżeli Δ ż^żaru T test ^dodaania

A ciężaru C

T/C% δ uT_T_ .jeżeii Δ ^żaru T jeut ujemna średni ciężar nowotworu w grupie testowanej (początkowy)

Kryteria aktywności:

Uważa się, że konieczne jest początkowe T/C<20% dla wykazania umiarkowanej aktywności.

Powtarzalne T/C^10% uważa się za znaczną aktywność.

Wyniki:

Wyniki testów prowadzonych dla kilku pochodnych taksolu przedstawiono w tabelach 2 i 3.

Tabela 2

Testy dotyczące raka sutka u człowieka

Leczenie Wyniki - średnie ciężary nowotworu

Grupa nr	Związek NSC	Dawka mg/kg	%T/C	mg	Począt- kowy błąd STD	mg	Końcowy błąd STD	Zmiana ciężaru (DELTA)	Liczba żywych zwierząt Obl/całko- wita	Zmiana ciężaru ciała Testowane	Różnica w ciężarze ciała zwierząt
0001	kontrola	0,00	CNTL	0,75	0,1	12,79	2,4	12,04	11/12
0102	Taksol	22,40	TOX“	0,60	0,1	0,00	0,0		3/6	-2,6	-0,9
0103	Taksol	15,00	CRc	0,81	0,1	0,00	0,0	-0,81	6/6	4,2	-2,5
0104	Taksol	10,00	-84	0,58	0,1	0,09	0,1	-0,49	6/6	-2,0	-0,3
0103	Taksol	6,67	CR	0,74	0,1	0,00	0,0	-0,74	5/5	-1,5	0,2
0106	Taksol	4,45	CR	0,79	0,1	0,00	0,0	-0,79	5/5	-1,2	0,5
0207	związek
	r	30,00	TOX	0,68	0,1	0,00			1/6	-3,8	-2,1
0208	r	20,00	CR	0,56	0,0	0,00	0,0	-0,56	4/6	-2,2	-0,5
0209	r	13,30	CR	0,64	0,1	0,00	0,0	-0,64	4/6	-2,3	-0,6
0210	r	8,90	-53	0,77	0,1	0,36	0,4	-0,41	5/6	-0,9	-0,8
0211	Γ	5,90	-78	0,61	0,1	0,13	0,1	-0,48	6/6	-2,2	-0,5

a Związek 1 = 2'-/N,N-dimetyloglicylo/taksol ^b TOX oznacza poziom toksyczny ^c CR oznacza całkowitą remisję nowotworu

166 041

Tabela 3

Testy dotyczące raka sutka u człowieka

Leczenie Wyniki - średnie ciężary nowotworu

Grupa nr	Związek NSC	Dawka mg/kg	%T/C	mg	Począt- kowy błąd STD	mg	Końcowy błąd STD	Zmiana ciężaru (DELTA)	Liczba żywych zwierząt Obl/całko- wita	Zmiana ciężaru ciała T-^sowui-	Różnica w ciężarze ciała zwierząt
0310	Taksol	15,00	TOXc	0,80	0,1				0/5
0311	Takso!	7,50	TOX	0,82	0,1	0,00	0,0		3/5	-1,7	2,3
0312	Taksol	3,75	CRd	0,71	0,1	0,00	0,0	-0,71	4/5	-2,9	1.1
0313	Taksol	1,88	5	0,80	0,1	1,51	1.5	0,71	4/5	-1,0	3,0
0001	Kontrola	0,00	CNTL	0,77	0,1	15,38	2,2	14,61	10/11
0102	związek 7*	33,00	CR	0,74	0,1	0,00	0,0	-0,74	4/5	-2,7	1.3
0103	związek 7	16,50	-93	0,59	0,1	0,04	0,0	-0,55	3/4	-5,7	-1.7
0104	związek 7	8,25	23	0,81	0,1	4,19	1.5	3,38	4/4	-3,9	0,1
0105	związek 7	4,13	34	0,74	0,1	5,66	1,3	4,92	4/5	-4,5	-0,5
0206	związek 3*	36,00	TOX	0,75	0,1				0/5
0207	związek 3b	18,00	CR	0,82	0,1	0,00	0.0	-0,82	3/4	-3,3	0,7
0208	związek 3“	9,00	CR	0,87	0,1	0,00	0,0	-0,87	5/5	-2,7	1,3
0209	związek 3“	4,50	CR	0,78	0,1	0,00	0,0	-0,78	5/5	-2,8	1,2

“ Związek 7 = 7-/N,N-dimetyloglicylo/taksol ^b Związek 3 = chlorowodorek 2-/3-Nł,Ndiietyloamino/propionylo/taksolu ^e TOX oznacza poziom toksyczny ^d CR oznacza całkowitą remisję nowotworu

Z powyższych wyników widać, że pochodne taksylu wykazują dyekynałą aktywność przeciwnowotworową. Związki te są więc użytecznymi środkami p(z-ciwnywotworowymi dzięki ich aktywności biologicznej i ich zwiększonej rozpuszczalności w wodzie w porównaniu do taksolu.

Oczywiste jest, że powyższy opis ilustruje wynalazek bez ograniczania jego zakresu i że możliwe jest wprowadzanie różnych modyfikacji bez wykraczania poza zakres wynalazku, określony w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

Wzór 1

Wzór 2 ι

C=O ł2^/N^R3

Wzór 3

OH i

C=O ięn₂)_n r2^/N^_R3 Wzór 4

ΪΠ3 9

CH3-C-O-C-NH-CH-COOH ^J 1 1 ch₃

CH3 Wzór 5

O

II ch₂-o-c-nh-ch-cooh Ćh₃

Wzór 6

Schemat 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym R i R¹ każdy oznacza atom wodoru albo resztę aminokwasu wybranego spośród alaniny, leucyny, izoleucyny, waliny, fenyloalaniny, proliny, lizyny i argininy albo grupę o wzorze 3, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1do 3 oraz R² i R3 każdy oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy, zawierający od jednego do trzech atomów węgla, lub R2 i r3, łącznie z połączonym z nimi atomem azotu, oznaczają nasycony pierścień heterocykliczny zawierający od czterech do pięciu atomów węgla z tym, że co najmniej jeden z podstawników R i R1 jest różny od atomu wodoru i że wytwarzany związek o wzorze 2 jest od 2'-(0-alanilo)taksoIu, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że poddaje się reakcji taksol z alaniną, leucyną, izoleucyną, waliną, fenyloalaniną, proliną, lizyną, argininą lub ze związkiem o wzorze 4, w którym n, R2 i r3 mają wyżej podane znaczenie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku podstawionego w położeniu 2', o wzorze 2, w którym R oznacza grupę o wzorze 3 i R1 oznacza H, taksol i związek o wzorze 4 poddaje się reakcji w stosunku równoważnikowym 1:1.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania dwupodstawionego związku z podstawnikami w położeniach 2' i 7, o wzorze 2, w którym R i R¹ każdy oznacza grupę o wzorze 3, dwa równoważniki związku o wzorze 4 poddaje się reakcji z jednym równoważnikiem taksolu.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku podstawionego w położeniu 7, o wzorze 2, w którym R oznacza atom wodoru i R¹ oznacza grupę o wzorze 3, dwupodstawiony związek z podstawnikami w położeniach 2' i 7 poddaje się reakcji odszczepiania podstawnika w położeniu 2'.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w obecności środka kondensującego oraz ewentualnie w obecności katalizatora.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że reakcję odszczepiania prowadzi się za pomocą doprowadzenia pH dwupodstawionego związku z podstawnikami w położeniach 2' i 7 do wartości pH = 7-7,4.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania 2'-(N,Ndimetyloglicylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i R³ oznaczają grupy metylowe, a n oznacza 1.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania 2'-(N,Ndietyloaminopropionylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i R³ oznaczają grupy etylowe, a n oznacza 3, w stosunku równoważnikowym 1:1 do taksolu.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania 7-(N,Ndimetyloglicylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i r3 oznaczają grupy metylowe, a n oznacza 1, w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu, po czym odszczepia się podstawniki w położeniu 2'.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny, tym, że w przypadku wytwarzania 2',7--di(N,Ndimetyloglicylo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i r3 oznaczają grupy metylowe, a n oznacza 1, w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania 7-(alanilo)taksolu lub soli addycyjnej z kwasem, jako aminokwas stosuje się alaninę w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu, po czym odszczepia się resztę alaniny w położeniu 2'.
12. 12. Sposób wytwarzania pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym R i R1 każdy oznacza atom wodoru albo resztę aminokwasu wybranego spośród alaniny, leucyny, izoleucyny, waliny, fenyloalaniny, proliny, lizyny i argininy, z tym, że co najmniej jeden z postawników R i R1 jest różny

    166 041 od atomu wodoru i że wytwarzany związek jest różny od 2'-(β-alanilo)taksolu, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że poddaje się reakcji taksol z aminokwasem z chronionym atomem azotu i następnie odszczepia się grupę ochronną z aminokwasu, przy czym jako grupę ochroną korzystnie stosuje się grupę t-butylokarbonyloksylową, fluorenometylenokarbonyloksylową lub karobenzyloksylową.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania pochodnej taksolu podstawionej w położeniu 2', taksol i aminokwas z chronionym atomem azotu poddaje się reakcji w stosunku równoważnikowym 1:1.
14. 14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania dwupodstawionej pochodnej taksolu z podstawnikami w położeniach 2' i 7, taksol i aminokwas z chronionym atomem azotu poddaje się reakcji w stosunku równoważnikowym 1:2.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania pochodnej taksolu z aminokwasem w położeniu 7, dwupodstawiony związek o wzorze 2 poddaje się reakcji odszczepienia aminokwasu w położeniu 2'.
16. 16. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że etap odszczepiania grupy ochronnej prowadzi się w łagodnych warunkach kwasowych.
17. 17. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako aminokwas stosuje się L-alaninę, L-leucynę, L-izoleucynę, L-walinę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-lizynę lub L-argininę.
18. 18. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania 7-(alanilo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, jako aminokwas stosuje się alaninę w stosunku równoważnikowym 2:1 do taksolu, po czym odszczepia się resztę alaniny w położeniu 2'.
19. 19. Sposób wytwarzania pochodnych taksolu o wzorze 2, w którym R¹ oznacza resztę aminokwasu wybranego spośród alaniny, leucyny, izoleucyny, waliny, fenyloalaniny, proliny, lizyny lub argininy albo grupę o wzorze 3, w którym n oznacza liczbę całkowitą od 1do 3 oraz R² i R3 każdy oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy, zawierający od jednego do trzech atomów węgla lub R² i R³, łącznie z połączonym z nimi atomem azotu, oznaczają nasycony pierścień heterocykliczny, zawierający od czterech do pięciu atomów węgla, zaś R oznacza atom wodoru z tym, że wytwarzany związek jest różny od od 2'(3-alanilo)taksolu, ewentualnie w postaci ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że poddaje się reakcji taksol ze związkiem chroniącym grupę hydroksylową, korzystnie takim, jak chloromrówczan 2,2,2-trichloroetylowy, po czym otrzymany taksol chroniony w położeniu 2' poddaje się reakcji z alaniną, leucyną, izoleucyną, waliną, fenyloalaniną, proliną, lizyną, argininą lub ze związkiem o wzorze 4, w którym R2, r3 i n mają wyżej podane znaczenie, a następnie od chronionego w położeniu 2' taksolu podstawionego w położeniu 7, odszczepia się grupę ochronną w położeniu 2'.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że w etapie odszczepiania grupy ochronnej chroniony w płożeniu 2' taksol, podstawiony w położeniu 7, poddaje się reakcji z mieszaniną cynku i kwasu octowego.
21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że taksol chroniony w położeniu 2' poddaje się reakcji z L-alaniną, L-leucyną, L-izoleucyną, L-waliną, L-fenyloalaniną, L-proliną, L-lizyną lub L-argininą.
22. 22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania 7-(N,Ndimetyloglicylojtaksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, stosuje się związek o wzorze 4, w którym R2 i R3 oznaczają grupy metylowe, a n oznacza 1.
23. 23. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania 7-(alanilo)taksolu lub jego soli addycyjnej z kwasem, jako aminokwas stosuje się alaninę.

    Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowych pochodnych taksolu o zwiększonej rozpuszczalności w wodzie w porównaniu z taksolem oraz charakteryzujących się doskonałą aktywnością przeciwnowotworową. Związki te są szczególnie korzystne w zwalczaniu niektórych rodzajów nowotworów, w stosunku do których aktywny jest taksol, obejmujących białaczkę, czerniaka oraz nowotwory płuc, sutka i okrężnicy, występujących u ludzi.

    166 041

    Takso! stanowi znany diterpenoid - seskwiterpen, który został pierwotnie wyodrębniony z kory pnia cisa zachodniego Taxus brevifolia, o budowie przedstawionej wzorem 1. Stwierdzono, że taksol charakteryzuje się silnym działaniem przeciwnowotworowym w stosunku do licznych odmian nowotworów. Związek ten jednak bardzo słabo rozpuszcza się w wodzie, co znacznie utrudniło opracowanie odpowiednich preparatów farmaceutycznych, użytecznych w leczeniu ludzi. Opracowano pewne oparte na taksolu preparaty farmaceutyczne do iniekcji lub wlewki dożylne, stosując przy tym cremophore EL^R jako nośnik leku, w celu wyeliminowania trudności wynikających z małej rozpuszczalności taksolu w wodzie. Cremophore jednak jest sam nieco toksyczny i wywołuje uwalnianie histaminy, wskutek nadwrażliwości oraz reakcji typu alergicznego. Zatem stosowanie tego nośnika nie stanowi korzystnego rozwiązania zagadnienia opracowania właściwych preparatów farmaceutycznych na podstawie taksolu.

    Prowadzono więc badania w celu opracowania pochodnych taksolu o większej rozpuszczalności w wodzie niż taksol, a równocześnie wykazujących taką samą lub zbliżoną, doskonałą aktywność przeciwnowotworową i komórkobójczą, które to pochodne taksolu nadawałyby się do wytwarzania preparatów farmaceutycznych z wykorzystaniem nietoksycznych nośników, dzięki czemu można by wyeliminować toksyczne nośniki takie, jak np. cremophore.

    Celem wynalazku było też opracowanie pochodnych taksolu odznaczających się dobrą stabilnością w zakresie pH, odpowiednim do sporządzania preparatów farmaceutycznych (pH = 3-4), lecz szybko rozpadających się in vivo w warunkach ustrojowego pH (pH = 7,4); w ten sposób działałyby one potencjalnie jako oparte na taksolu leki pierwotne.