PT94352A - Processo para a preparacao de antagonistas de bombesina irreversiveis - Google Patents

Description

FARMITALIA CARLO ERBA S.R.L., "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTAGONISTAS DE BOMBESINA IRREVERSÍVEIS" A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de derivados peptTdicos.

Nesta memória descritiva os símbolos e abreviaturas são os vulgarmente utilizados na química dos pêptidos (ver "Eur. J. Biochem."; 138 (1 984) p.. 9-37 . Em consequência, os símbolos de três letras dos aminoãcidos representam a configuração L dos aminoãcidos quirãlicos. Os aminoãcidos de configuração D são representados por letras maiusculas: por exemplo, ala = D -Ala . Os outros símbolos e abreviaturas utilizadas são: AA, aminoaci-do; AcOEt, acetato de etilo; BBC, bombesina; Boc, t-butoxicarbc) nilo; BuOH, ãlcool ji-butllico; BOP, hexaf 1 uorofosfato de benzo-triazoliloxi-tris[dimetil-amino]fosfÓnio; DCC, Ν,Ν'-diciclo-he-xi1carbodiimida; DMF, dimeti1formamida; DMSO, dimeti1 sulfÕxido; Dnp, 2,4-dinitrofenilo; EGF, factor de crescimento epidérmico ; EtOH, ãlcool etílico; BRA (ou DÇ)-EM, espectrometria de massa por bombardeamento rápido do átomo (ou desabsorção de campo) ; ECC, clorocarbonato de etilo; Et^O, eter dietllíco; Glp, ácido L-pirogl utãmico; h-GRP (ou p-GRP), peptido de libertação de gajs trina humana (ou porcina); HOBt, 1-hidroxibenzotriazol; D.I., diâmetro interno; MeOH, ãlcool metllico; p. f., ponto de fusão; n. d., não determinado; Nle, L-norleucina; NMM, N-meti1morfoli-na; RMN, ressonância magnética nuclear; OSu, N-hidroxi-succini-

midilo; EP, éter de petróleo 40°-70°C; CLER-FI, cromatografia liquida de elevado rendimento de fase inversa; CPCP, carcinoma do pulmão de células pequenas; ATA, ácido trif1uoroacetico; THF, tetra-hidrofurano; CCF, cromatografia de camada fina; Tos, p-to luenossulfonilo. A presente invenção proporciona um processo para a preparação de um peptido de fórmula geral I: R — A — B — C—Trp.— Ala — Vai — X —. Y — T — W (I) na qual R representa um grupo de formula 4-(cich2ch2)2n-c6h4-co-, 3-(cich2ch2)2n-c6h4-co-, C1CH2CH2NHC0-, Cl CH = CH-C0-, BrCH = CH-C0-, CH2=CC1.C0-, CH2 = CBrC0- (isómeros eis ou trans), ch2-ch-ch2-co-, CH= c-co-, cich2ch2n(no)co-, \/ ou C1CH2C0-CH(R1 )NHC0(CH2)2C0-; A representa uma ligação de valência ou um resíduo Gly, Leu-Gly, Arg-Leu-Gly, G1n-Arg-Leu-Gly, B representa uma ligação de valência ou um resTduo Asn ou Thr; C representa um resíduo Gin ou-His; X representa um resíduo Gly ou ala5 Y representa uma ligação de valência ou um resíduo His(R2), his(R2), Phe, phe, Ser, ser, Ala ou ala; T representa uma ligação de valência .ou um resíduo Leu, leu, Phe ou phe; W representa um grupo de formula OH, NH^, NH(CH2)^CH2j NH(CH2)2C6H5, Met-R3, Leu-R3, 11e-R3, ou Nle-R3, R^ representa um ãtomo de hidrogénio ou uma cadeia alifã tica linear ou ramificada possuindo entre 1 e 11 átomos de carbono, um grupo benzilo ou fenilo, R2 representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo Tos ,

Dnp ou Bzl e R3 representa um grupo amino, hidroxi, metoxi ou hidra_ z i η o, _ consistindo esse processo em efectuar sucessivas condensações aprc) priadas de pêptidos ou de aminoãcidos protegidos. As condensações são efectuadas de tal modo que os pêptidos resultantes possuam a desejada sequência de resíduos aminoãcidos.

Esses aminoãcidos e pêptidos, os quais podem ser condensados utilizando métodos conhecidos na química dos pêptidos, po_s suem os grupos amino e carboxilo não envolvidos na formação da -4- / ligação peptTdica, bloqueados por grupos de protecção adequados susceptTveis de serem eliminados por tratamento ácido ou alcal_i_ no ou por hidrogenolise.

Para a protecção do grupo amino e possTvel utilizar, por exemplo, os seguintes grupos de protecção: benzi 1-oxircarbonilo,. t-butoxi-carboni1 o, tritilo, formilo, trif1uoro-aceti1 o , o-nitro--f en i 1 - sul f eni 1 o, 4-meti 1-oxi-benzil-oxi- carboni lo, 9-fluorenil.·? -metoxi-carbonilo, 3,5-dimetoxi-QC-^' -dimetíl -benzi 1-carboni 1 o ou metil-sulfonil-etoxi-carboni lo.

Para a protecção do grupo carboxilo e possTvel utilizar, por exemplo, os seguintes grupos, de protecção: metilo, etilo , t-butilo, benzilo, p-nitrobenzilo ou f1uoreni1 meti 1 o, amida, hi-drazida, t-butoxicarboni1-hidrazida ou benziloxicarboniT-hidraz^ da.

As funções hidroxi dos hidroxi-aminoãcidos e a função iraino da. his_ tidina podem ser protegidas utilizando grupos de protecção adequados (durante toda a sTntese ou apenas durante alguns passos) ou podem ser desprotegidas. Para a protecção da função hidroxi pode utilizar-se, por exemplo, os seguintes grupos de protecção: t-butilo, benzilo, acetilo. Para a protecção da função imino do grupo imidazol pode utilizar-se, por exemplo,tos grupos seguintes: 2,4-dinitrofenilo, tosilo ou benzilo. As reacções de des_ protecção são efectuadas de acordo com métodos conhecidos de per si na química dos péptidos. A condensação entre um grupo amino e uma molécula e um

grupo carboxilo e outra molécula, para proporcionar uma união peptidica, pode ser efectuada através de um derivado de acilo activado tal como um anidrido misto, uma azida ou um éster actj[ vado, ou por condensação directa entre um grupo amino livre e um grupo carboxilo livre, na presença de um agente de condensação tal como diciclo-hexil-carbo-di-imida, isoladamente ou um conjuji to com um agente para evitar· a racemização, tal como N-hidroxi--succinimida ou 1-hidroxi-benzotriazol , ou em conjunto com um agente activador tal como 4-dimeti1-amino-piridina . Pode efec-tuar-se a condensação num solvente tal como a dimeti1-formamida, a dimeti1-acetamida, a pirfdina, o acetonitri1 o, o tetra-hidro-furano ou a N-meti1-2-pirrolidona. A temperatura de reacção pode setar compreendida entre -30°C e a temperatura ambiente. Geralmente o tempo de reacção estã compreendido entre 1 e 120 horas. 0 esquema de síntese, os grupos de protecção e os agentes de condensação são sei eccionados de modo a evitar-se o risco de racemização.

Os sais desses péptidos com ácidos aceitãveis sob o ponto de vista farmacêutico consideram-se englobados no âmbito da presente invenção. Esses sais de adição de acido podem ser deri_ vados a partir de uma diversidade de ácidos inorgânicos e orgânj[ cos tais como os ácidos sulfórico, fosfórico, clorídrico aquoso, bromTdrico aquoso, iodidrico aquoso, nítrico, sulfâmico, cTtrico, láctico, pirúvico, oxãlico, maleico, succTnico, tartãrico, cinã-mico, acético, trif1uoro-acético, benzõico, salicTlico, glucõni- -6-

co, ascÓrbico e ácidos afins.

Os grupos de cadeia a.lifãtica preferenciais que o símbolo R-j pode representar englobam os grupos metilo, etilo, n-pro-pilo, iso-propilo, n-butilo e iso-butilo.

Actividade Biologica

Os péptidos da presente invenção são dotados de poderosas propriedades antagonistas contra os efeitos tanto 11 i n vitro" como "in vivo" induzidos pela bombesina, tais como a contracção da musculatura lisa, a modificação do compartimento de origem central e a mitogénese. A bombesina (BBS) é um tetradecapiptido de formula Glp--Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Hi s-Leu-Met-Nf^, i sol a da originalmente a partir da pele duma rã. A actividade biológica reside na parte do terminal C da molécula: BBS (6-14) nona-péptido é tão activo como o composto original. 0 equivalente hu^ mano da bombesina Ó um peptido com 27 aminoacidos, conhecido como peptido da libertação da gastrina (h-GRP). A bombesina e os péptidos idênticos ã bombesina desempenham diversas actividades biológicas (J. H. Walsh (1983) em "Brain Peptides", D. T. Krie-ger, M. J. Brownstein.e J. B. Martin (ed), Wiley Interscience Publ., pp. 941-960), incluindo os efeitos promotores do desenvoJ_ vimento autócrino no carcinoma do pulmão de células pequenas (C. P.C.P.) em seres humanos (F. Cuttitta e outros "Câncer Survey" , 4, 1 985, p. 707-727), estTmulo autócrino e/ou paracrino da proli_ -7-

.% feração das células cancerígenas prostãticas em seres humanos (M. Bologna e outros; "Câncer11 no prelo) e modulação do receptor de EGF (I. Zachary e E..Rozengurt "Câncer Surveys"', 4, 1 985; p. 729--765).

Um antagonista da bombesina, devido ao facto de competir com o ligando natural dos receptores, inibira o inicio de um conjunto de acontecimentos em cascata que originem a proliferação anormal de., células. Há conhecimento de abordagens diferentes desenvolvidas por diversos grupos de investigação, no que respeita a este assunto . Uma anterior patente do actual requerente (Pedido de patente eur£ peia nQ 891 02283.2) teve como objectivo uma série de nona-je deca--peptidos de bombesina de terminal C caratcerizadas pela supressão, inversão ou substituição de aminoãcidos. Todavia,, esses pe£ tidos tal como sucede com outros antagonistas da BBS, apresentam normalmente apenas uma afinidade moderada com o receptor da BBS.

Os compostos da presente invenção, os quais possuem um r_a dica! de alquilação, comportam-se como antagonistas do receptor quando administrados em combinação com a bombesina ou quando administrados 24 horas antes do estTmulo com bombesina.

Resultados dos ensaios biológicos

Determinou-se a afinidade de ligação dos compostos da pre sente invenção com o receptor de bombesina utilizando fibroblas-tos de murganhos da estirpe Swiss 3T3 (I. Zachary e E. Rozengurt -8- "Proc. Natl. Acad. Sei."; USA, 82, 1985; p. 7616t7620) ( quadro 1).

Determinou-se o efeito sobre a mitogenese em células qui^ escentes e confluentes de murg.anhos da estirpe Swiss 3T3 mantidas em meio livre de soro. (A. N. Corps e outros; "Biochem. J; 231 , 1 985 ; p. 781 -785). Num primeiro conjunto de experiências,· fez--se a administração de compostos anal ogos · i sol ados ou em combina_ ção com bombesina. Num segundo conjunto de experiência efectuou--se o tratamento prévio das células utilizando peptidos de alqui-lação, lavou-se, deixou-se em repouso a temperatura de 37°C durajn te 24 horas e depois aplicou-se o estTmulo com bombesina. Em ambos os casos fez-se a avaliação da sTntese de AON pela incorpora-çao da [H jtimidina (quadro 2).

Avaliou-se também o efeito mttogênico da bombesina e dos seus analogos como sendo a activação da proteína-tirosina-quina-se que fosforila uma proteína de 115 KD (p115) associada com o complexo receptor da bombesina (D. Cirillo e outros; "Mol, Cell . Biol." 6, 1986; p. 4641-4649) (quadro 3).

Por outro lado, a exposição a esses peptidos, no interv£ lo de concentrações O,l-50^iM foi associada com uma redução significativa no desenvolvimento das linhas celulares CPCP (tais co mo NCI-H345, NCI-N592, NCI-H128), e bem assim com as linhas cel£ lares do carcinoma prostatico (tais como DU145 e PC3). A administração parentérica deste peptido variando entre 1 ng/kg e 100 mg/kg, a murganhos pelados, foi associada com uma -9- redução significativa do desenvolvimento das linhas celulares do carcinoma prostático e das CPCP dos seres humanos, transplantados, referidas antes. QUADRO 1 AFINIDADE DE LIGAÇÃO A BOMBESINA ANALOGOS DE ALQUILAÇAO'EM FIBROBLASTOS DE MURGANHO "SUÍÇO-3T3"

COMPOSTO DI50(nM) I 1363 + 266 II 438 + m III 1815 + 330 IV 0,7 + 0,2 V 1336 + 199 VI 648 + 290 Péptidos de referência: BBS Espantido ? [pro ]Espantido [Leu13^(CH2-NH)Leu14 Jbbs- 12,6 + 3,8 11100 14000 214 + 30 -10- # % QUADRO 2

INCORPORAÇÃO DE [H3]TIMIDINA EM FIBROBLASTOS 3T3 DO

MURGANHO SUTÇO COMPOSTO ACRÉSCIMO mOltiplo DO % DE INIBIÇÃO NA PRESENÇA VALOR BASE DE BBS 25NM A B 5nM 50nM 0,5jiM 5 jiM 0,5juM 5 JáM 0,5jjM 5 ^JuM I N.D. N.D. 0,6 0,6 9 + 6 12+3 • 0 II N.D. N.D. 1,0 1,0 0 50+10 0 III N.D. N.D. 2,3 3,4 0 0 51+11 53+8 IV N.D. N.D. 3,2 2,2 1 3±8 32+9 0 20+12 V N.D. 1.8. 1,8 2,5 0 0 0 0 VI N.D. 1.0 1,0 1,0 0 0 39+14 29+10

Piptidos de referência: BBS 3,0+1 [Leu13 ^ (CH2-NH)Leu14]BBS 1 1 29+10 56+4 0 0

A= analogos administrados em combinação com BBS

B= células pre-tratadas com analogos, lavadas, deixadas em repouso a 37°C durante 24 horas e estimuladas depois com BBS QUADRO 3

.¾

FOSFORILAÇftO DA PROTEÍNA pΠ5 ASSOCIADA COM O RECEPTOR DA BOMBESINA

COMPOSTO DOSE ACTIVA MÍNIMA (nM) I > 4000 II >1000 III 500 IV 500 V > 2000 VI > 1000 Péptidos de refeencia: BBS 3

Espantido >10000 [pro^]Espantido >10000 [LEU13 γ (CH2-NH)Leu14]BBS >200 -12

Os peptidos de fórmula I, consequentemente, encontram apH cação na terapia de neoplasmas humanos em que a sua progressão e desenvolvimento são modulados por peptidos da família GRP (ou PRD) quer directamente quer em combinação com outros factores de crescimento .

Além disso, i possível utilizar esses análogos de alquila^ ção no manuseamento de sintomas clínicos associados com estas doenças e originados pel a-hi persecreção de peptidos idênticos ao GRP (ou PRD).

Os compostos da presente invenção podem ser administrados pelas vias habituais, por exemplo, parentericamente, por injecção intravenosa ou por infusão, ou por via intramuscular, subcutânea, e por administração intracavidade e intranasal. A dosagem depende da idade, peso e estado de saúde do doeji te e da via de administração.

Tomando como base os dados "in vitro"‘e "in vivo" relativos aos murganhos, i possível avaliar as doses terapêuticas para os seres humanos, as quais estão compreendidas entre 1 ng/kg e 100 mg/kg, administradas 1 a 6 vezes por dia, A presente invenção proporciona também composições farma cêuticas que incorporam um composto de formula (I) como ingredien te activo, em associação com um ou vários excipientes farmaceuti-camente aceitáveis. -13- -13-

As composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção, preparam-se habitualmente utilizando métodos convencio^ nais e administram-se numa forma adequada sob o ponto de vista farmacêutico.

Por exemplo, as soluções para infusão ou para injecção ijn travenosa podem conter um veiculo, por exemplo, água esterilizada ou, de preferência, podem'estar sob a forma de soluções salinas isotõnicas aquosas esterilizadas.

As suspensões ou soluções para injecções intramusculares podem conter, em conjunto com um composto activo, um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, por exemplo, água esterilizada, azeite, oleato de etilo, glicois, (por exemplo, o propi 1 eno-gl icol) e, se desejado, uma quantidade adequada de clo> ridrato de TidocaTna.

Alem disso, de acordo com a presente invenção, proporei^ na-se um método para o tratamento de neoplasmas neuroendõcrinos (tais como o carcinoma de células pequenas do pulmão e o carcino^ ma prostãtico) ou os sintomas clínicos associados com estas doeji ças em doentes que necessitem desse tratamento, o qual consiste na administração a esses doentes de uma composição de acordo com a presente invenção.

Quími ca Métodos: -14 /

a) - Efectuou-se a cromatograffa de camada fina (C.C.F.) sobre placas pré-revestidas com gel de sílica 60 (Merck), sendo a espessura da camada 0,25 mm, comprimento 20 cm , com os eluentes seguintes:

Sistema A: n-butanol/acido acetico/agua= 600/150/150, em volume,

Sistema B: Sistema C: Sistema D: Sistema E: clorofÕrmio/metanol/NH^OH a 30% =500/346/1 54 * em volume clorofõrmio/metanol= 90/10 em volume diclorometanoyiter dieti1ico=90/10 em volume acetonitrilo/ãgua/ãcido fÕrmico= 80/20/10. b} - A cromatografia liquida de elevado rendimento de fase inversa (CLER-FI\ (ou RP-HPLC), de tipo analttfco, efectuou--se num aparelPio de tipo Helwett Packard Mod, 1084, numa coluna Lichrosorb Hibar RP-18 (Merck) 250 x 4 mm D. I., diâmetro das partículas 5 . Utilizaram-se os seguintes eluentes: A = KH^PO^ 20mM, pH 3,5/acatonitri1 o 9/1 em volume B = ΚΗ,,ΡΟ^ 20mM, pH 3,5/acetoni tri 1 o 3/7 em volume,

Proiramou-se a eluição com um gradiente linear variável en tre 60¾ a 90¾ de B durante um período de 20 minutos (Sistema A) ou variável desde 30 a 70¾ de B durante um perTodo de 15 minutos (Sistema BJ, e depois isocraticamente durante 15 minutos, com um / -15-

Τ’” débito de 1 ml/minuto.

Caracterizaram-se os péDtidos pelo seu tempo de retenção (TR). c) - Efectuou-se a CLER-F-j , de tipo preliminar, utilizando um aparelho Delta Prep 3000 (Waters) numa coluna Deltapak (Waters), 300 x 10 mm D.I. lO^jm.

Utilizaram-se os seguintes eluentes; A = 0,05¾ de TFA em agua B = 0,05¾ de TFA em acetonttrilo/ãgua, 7/3 em volume.

Debito = 24 ml/min; comprimento de onda de detecção = : : = 220 nm.

Os métodos de elutção encontram-se referidos nos exemplos.

Em qualquer dos casos, fez-se a confirmação das fracções por CLER-FI, de tipo analítico e procedeu-se ã recolha e combina çao das que possuíam uma pureza superior a 93%, Após a eliminação do acetonitrilo liofilizou-se a solução. d) - Efectuou-se a anãlise de aninoãcidos em hidrol isatos-de; acido (quer ã temperatura de 110°C durante 22 horas em HCl. 6 N + 0,1% fenol, quer a temperatura de 1000C durante 1G horas em acido mercapto-etano-sulfõnico 3N, em ambos os casos em atmosfera de azoto). Determinou-se apenas os resíduos dos aminoãcidos naturais. Devido ã composição par- -16

"S ciai em condições normais de hidrólise, determinou-se a Trp apenas nos hidrolisatos com acido mercapto-etano-sul_ fónico.

Exemplo 1

Preparação de 4-(ClCH2CH2)2NC6H4C0-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2 (I).

Dissolveu-se 25,2 mg (Q,096 mmole} de acido C p-bis(2--cloroetiT]-amino _7-5enzõico em 5 ml de DMF destilada e adicionou-se 60 mg (0,064 mmolel de H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2. HC1 (Pedido de oatente europeia n989102283.2}; arrefeceu--se a solução para a temperatura de 5°C e adicionou-se 0,0176 ml de NMM (0,16 mmolel e 0,0425 g de B0P (0,096 mmole). Agitou-se a mistura reaccional a temperatura ambiente durante a noite e d£ pois verteu-se gota a gota em 100 ml de uma solução a 10% de ãci^ do cítrico a temperatura de 5°C, Agitou-se a mistura durante uma hora a uma temperatura inferior a 10°C e depois filtrou-se e lavou-se com agua até se obter a neutralidade; obteve-se 66,1 mg de produto impuro (90% de rendimento), Purificou-se o produto por CLER-FI de tipo preliminar, tendo-se feito a experiência com ingrediente variável entre 60% até 90% de eluente B em elueji te A durante 30 minutos (débito, 35 ml/min): obteve-se 33 mg do produto I (50% de rendimento): Rf^ 0,61; RT^ = 8.66; BAR-EM; m/z 1147 (MH+); proporções AA: Thr 0,98 (1), Glu 1, Ala 0,97 (1 ) , Vai 0,95 (J), Gly 1,04 (1), Leu 1,02 (1), Met 0,90 (1) (Trp n. d.).

Exemplo 2

Preparação de 4-(ClC2CH2)2NC6H4C0-Tftr-Gln-Trp-Ala-Val-G1y-Leu-Nle-NH2 (II)

Fez-se reagir 0,2 g (0,216 mmole) de H-Thr-Gln-Trp-Ala--Val-Gly-Leu-Nle-NH2. HC1 (preparado de acordo com a metodologia descrita no pedido de patente de invenção europeia n? 89102283.2, da autoria do requerente, para a preparação de H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2·HC1), com 0,085 g (0,324 mmole) de acido £p-bi s~( 2-cl oroeti 1 )~aminã]—-benzoi co, 0,143 g (0,324 mmole) de BOP e 0,059 ml de NMM (0,537mmole) em 17 ml de DMF destilada, conforme descrito no exemplo 1, Purificou-se o produto bruto por CLER-FI, de tipo preliminar, tendo-se efectuji do a experiência com um gradiente variável desde 45% ate 90% de eluente B em eluente A, durante 20 minutos; obteve-se Q,122 g (50% de rendimento) de produto II; Rf^ 0,75; RTA 10,39; BRA-EM: m/z 1129 (MH+); proporçoes AA: Thr 0,97 (1), Glu 1, Ala 0,94 (1), Vai 0,.96 (1), Gly (1)., Leu 0,92 (1), Nle 0,87 (1) Trp n.d.).

Exemplo 3

Preparação de 4-( ClCHgCHg)gNC^H^CO-Thr-Gl n-Trp-Al a-Va! - G1 y-Hi s(Dnp)-Leu-Met-NH2(III) A partir de 63 mg (0,24 mmole) de ácido ^p-bis-(2-cloro eti 1 )-ami naj -benzoico e de 200 mg (0,16 mmole) de HC1 , H-TFir-Gl n-Trp-Ala-Val-Gly-His-(Dnp]-Leu-Met-NH2 preparado a partir de Boc--Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-OH (pedido de patente de invenção europeia n9 89102283.2 da autoria do requerente} e de HC1, H-His(Dnp)--Leu-Met-NI^ [f Angelucci e R, de Castiglione; "Experientia"; 1975; p. 507-508}, utilizando o procedimento descrito no mesmo pedido de patente para a preparação de compostos análogos^ e pro cedendo conforme descrito no exemplo 1, obteve-se 161 mg (70¾ de rendimento) de composto IIΓ impuro. Purificou-se o produto por CLER-FI, de tipo preliminar, efectuando-se a experiência com um gradiente variável desde 60% atê 90% de eluente B em eluente A, durante 20 minutos: obteve-se 60 mg (26% de rendimento} do produto III; RfA 0,70; RTft 14,45; RTg 24,82; BAR — EH: m/z 1451 (MH4"); proporçoes AA: Thr 1,05 (1}, Glu 1, Gly 1,03 (l.),Ala 0,99 (1), Vai 0,95 (!}, Met 0,90 (!}, Leu 0,97 (1), (Trp e His n, d.).

Exemplo 4

Preparação de 4-(Cl C^CF^^NCgH^CG-Thr-Gl n-Trp-Al a-Val -Gly-His-Leu-Met-Ni^IV)

Preparou-se uma suspensão de 65 mg (Q,Q5mmole) de compo£. to de formula (III} em 3 ml de tampão de fosfato 0,02 M, pH 8, e tratou-se com 2-mercapto-etanol. Deixou-se a solução límpida r£ sultante reagir durante 20 minutos e depois verteu-se, sob agita ção em 300 ml de Et^G, Filtrou-se o precipitado, lavou-se muito -19-

bem com Et20 e depois repartiu-se entre Bu-OH e água, Concentrou--se a fase orgânica até se obter um volume pequeno tendo-se precipitado o péptido por diluição com Ac0Et/Et20: obteve-se 50 mg de composto de formula (IV] impuro (71% de rendimento], Purificou-se o produto por CLER-FI de tipo preliminar, efectuando-se a experiência com um gradiente variável desde 40% ate 90% de elueji te B em eluente A, durante 3Q minutos: 25 mg (36% de rendimento) de composto de formula IV: Rf^ 0,39; RT^ 9,26 RT^ 9,26; RTb 19,41; BAR-EM: m/z 1284 (MH+1; proporções AA: Thr 1,05 (1); Gin (1], Gly 1,03 (1}; Ala 0,99 (1], Vai 0,95 (1], Met 0,88 (1), His 0,9.1 (1] (Trp n.d.]-.

Exemplo 5

Preparação de C1CH2CH2N(N0]C0-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Nle-Ntí2 (V)

Passo 1 C1CH2CH2NHCO-OSu (Va]

Dissolveu-se 5,75 g ((0,05 mole ] de N-Fiidroxi-succinimi da em 125 ml de AcOEt e fez-se reagir ã temperatura de 0°C, com 12,92 ml (Q,Q75 mole] de N-eti1-di-isopropil-amina e com 5,2.ml (0,060 mole] de isocianato de 2-cloroeti 1 o, cuja adição foi fei_ ta gota a gota, consecutivamente. Agitou-se vigorosamente a mi£ tura reaccional durante 48 fioras e depois evaporou-se o solvente e repartiu-se o resíduo entre AcOEt e agua, Secou-se a camada organica sobre e evaporou-se para se obter um volume pe- /20-

queno. 0 produto cristalizou em repouso e a frio: obteve-se 7,68 g (70% de rendimento) de composto de formula (Va): p. f. 1 040-1 07°C; Rf 0,43; BAR-EM:_ m/z 220 (M+); RMN ]H ( 200 MHz , DMSO-dg) (ppm) : 8,57 (t, 1,;, CHgNHCO), 3,64 (t, 2 H, Cl C_H2CH2) 3,39 (m, 2 H, CH^CH^NH), 2,75 (s, 4 H, succi n imi da); análise elje mentar (CyHgN^Cl): C 38,1 0 (38,1 1 ), H 4,10 (4,11), N T 2,67 (12,70), Cl 1 6,00 (1 6,07). C1CH2CH2N(N0)C0-0Su (Vb)

Dissolveu-se 1,100 g (0,005 mole) de composto de fórmula (Va) em 12 ml de CH2C1 ^ e fez-se· reagir, ã temperatura de 0°C , com 0,800 ml (0,010 mole) de piridina e com 14,0 ml (0,020 mole) de N0C1 1,4N em CH2C12. Agitou-se vigorosamente a mistura rea_c cional durante 5 horas e depois lavou-se com água fria, secou-se sobre NaSO^ e evaporou-se para se obter um volume pequeno. A cristalização teve inicio a temperatura ambiente-e ficou completa a frio. Obteve-se 0,80 g (63%) de. composto, de formula (Vb) : p. f.: 101°-l03°C; RFC 0,87; BAR-EM: m/z 249 (M+); RMN ]H (200 MHz, DMSO-dg) b (ppm): 4,13 (t, 2 H, C1£H2CH2), 3,69 (t, 2 H , CH2ÇH2NN0), 2,89 (s, 4 H, succinimida); análise elementar (C7HgN305Cl): C 33,70 (33,68), H, 3,25 (3,23), N 16,82 (16,83), Cl 14,80 (14,20).

ClCH2CH2N(N0)C0-Thr-6ln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Nle-NH2 (V)

Preparou-se uma -suspensão de 0,185 g (0,2 mmole) de HCl... H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Nle-NH2(ver exemplo 2) numa mistu- ra de 0,5 ml de hexametil-fosfori1-amida e 0,5 ml de N-metil-pir rolidona e fez-se reagir à temperatura ambiente com 0,028 ml (0,2 mmole) de trieti1amina, adicionando-se depois 0,100 g (0,4 mmole) de composto de fórmula (Vb). ApÕs duas horas de agitação diluTu-se com água a mistura reaccional: obteve-se 0,150 g (73% de rendimento) de composto de fórmula (V) impuro. Purificou-se uma amostra de 50 mg por .CLER-FI de tipo preliminar, efectuando--se a experiência com um gradiente variável desde 10% até 90% de eluente A em eluente B durante 30 minutos: Rf^ 0,59; RT^ 16,10; BAR-EM: m/z 1 020 (MH+); RMN-^ H (200 MHz, DMSO-dg) £>(ppm) i.a.: 3,60 (t, 2H, C1CJH i proporções AA: Thr 0,91 (1), Glu 1,07 (1), Ala 1,03 (1), Vai 1, Gly 1,02 (1), Leu 1,01 (1), Nle 0,90 (1) (Trp n.d.).

Exemplo 6

Preparação de CH3(CH2)3CH(C0CH2C1)NHC0(CH2)2C0-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met--nh2 (VI)

Passo 1

Boc-Nle-CH=N2 (Via) Â temperatura de -12°C fez-se reagir 4,60 g (0,02 mole) de Boc-Nle-OH em 40 ml de THF anidra com 2,20 ml (0,02 mole) de NMM e com 2,62 ml (0,02 mole) de cloro-carbonato de isobutilo . Decorrido 1 minuto temperou-se a mistura reaccional por adição -22, de 50 ml de Et^O e arrefeceu-se a solução para a temperatura de -35°C. Procedeu-se a filtração dos sais e arrefeceu-se o filtra_ do para a temperatura de -70°C.

Num recipiente separado dissolveu-se 3,96 g (0,06 mole] de KOH em 20 ml de uma solução de EtOH a 50%, adicionando-se de pois esta mistura, gota a gota, durante 10 minutos e à temperatura de 0°C, a uma solução de 6,43 g (0,03 mole] de N-meti 1 -N-nj_ troso-p-tolueno-sulfonamida em 100 ml de Et^O com 10 ml de ester monometTlico de etilenoglicol. 0 diazometano assim obtido foi destilado directasnte para o recipiente de reacção contendo o an2 drido misto pré-formado e arrefecido. Depois de se ter agitado a mistura reaccional ã temperatura de 0°C durante 20 fioras evapoi rou-se o solvente a pressão reduzida e repartiu-se o resíduo entre AcOEt e uma solução aquosa 0,5 M de KHCO^, Lavou-se a camada orgânica com uma solução salina ate se obter a neutralidade , secou-se sobre Nà^SO^ e evaporou-se no vãcuo para se obter um Õleo que cristalizou em repouso, a frio: obteve-se 2,9 g (57% de rendimento) de composto de formula (Via): p. f. 83°-85°C;

Rfd 0,51; RMN-1H (200 MHz, DMSO-dg) b (ppm) i.a. : 6,00 (s, 1 H, _CH=N2); DC-EM: m/z 255 (M+); análise elementar: (C-j 2H21N3O3): C 56,50 (56,45), H 8,30 (8,29), N 16,47 (16,46).

Passo 2 HC1 . H-N1e-CHpOl (VIb)

Dissolveu-se 2,4 g (0,01 mole) de Boc-Nle-CH=N2 de fõrmu la (Via) em 20 ml de uma solução 4,4 N de HC1 em dioxano. Decor^ -2

ridos 5 minutos ã temperatura ambiente fez-se precipitar o prod£ to utilizando E12O- obteve-se 1,56 g [78¾ de rendimento) de composto de fórmula (VIb): p. f. 153°-154°C; Rf£ 0,63; RMN-]H (200 MHz, DMS0-D6) k (ppm) i.a: 4,84, 4,74 (dois d, 2 H, CH2-C1}; DC--EM: m/z 199 (M+); analise elementar (CyH-jgNOCl); C 42,02 (42,01 ), H 7,54 (7,55), N 6,96 (6,99), Cl 35,42 (35,43). HOOC-CH2CH2-CO-Nle-CH2Cl (VIc)

Dissolveu-se 0,60 g (3 mmole] de FfC1 .H-Nle-CH2CL (VIb) e 0,33 ml (3 mmole) de NMM em 1Q ml de DMF e fez-se reagir ã tempe? ratura de 0°C com 0,30 g (3 mmole) de anidrido succinico em 5 ml de DMF, cuja adição foi feita gota a gota durante 10 minutos. D(2 corridos 30 minutos deixou-se a mistura reaccional atingir a tem peratura ambiente e manteve-se em agitação durante mais 4 horas. Evaporou-se 0 solvente ã pressão reduzida e recolheu-se 0 resTduo com AcOEt e, apos filtração das substâncias insolúveis, lavou-se com HC1 Q,02 M, e com uma solução salina e finalmente secou-se sobre’ Na2S0^. A evaporação do solvente e a trituração no seio de Et20/PE proporcionaram 0,35 g (44¾ de rendimento) de composto de fórmula (VIc); p. f. Π4°-Π6°0; Rfg 0,33; RMN-^H (200 MHz, DMS0--Dg) (ppm) i.a.: 4,57 (s, 2H, CH_2-C1 ) ; analise: elementar (C-j-j H18N04C1): C 49,74 (50,10), H 5,34 (5,31), C 13,16 (13,44). CH3(CH2).3CH(C0CH2C1 )NHCO(CH2)2CO-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met--nh2 (VI) A temperatura de 0o C fez-se reagir 100 mg (0,106 mmole)

de HC1 . H-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2 (Pedido de Pa~ tente de invenção europeia n9 89102283.2) e 0,006ml (0,106 rrtnole) de NMM em 2 ml de DMF com 31 mg (0,120 mmole) de H00C-(CH2)2C0- -Nle-CH2C1 (VIc), 19 mg (0,143 mmole) de HOBT e 27 mg (0,133 mmc) 1 e) de DCC. Depois agitou-se a mistura reaccional durante 4 dias à temperatura ambiente. Evaporou-se o solvente a pressão reduzi da, triturou-se o resíduo no seio de álcool isopropilico quente e isolou-se por filtração as substâncias insolúveis; obteve-se 50 mg (40¾ de rendimento) do composto de formula (yj^ rf q

A RTg 15,10; BAR-EM: m/z 1149 (MH4); proporções AA: fhr 0 95 (1 )

Glu 1, Ala 1,08 (1), Vai 0,97 (.1), Gly 1,01 (1), Leu 1,Q0 (1),

Met 0,93 (1) (Trp n.d,).

Claims (1)

1. -25-

   REIVINDICAgÃO Processo para a preparaçao de um péptido de formula geral r: R—A—B—C—Trp—Ala—Vai—X—Y—T—W (I) na qual R representa um grupo .de fórmula 4- (C1CH2CH,) 2N-CgH4-CO-r 3- (C1CH2CH2) ^'-Cgí^-CO-, C1CH2CH2N5C0-, C1CH=CE-C0-, 3rCE=CH-C0-, CE2=CC1C0-, CH2=C3rC0- (isõmeros cis ou trans) , CH2-CH-CH2~CO-, HC = C-CQ- ou ClCH2CH9CB_N(NC5CC— \ / O ou um grupo de fórmula geral C1CH2C0-CH(R^)NHCO(CH2)2C0-; A representa uma ligaçao de valência ou um radical Gly, Leu-Gly, Arc-Leu-Glv ou Gln-Arg-Leu-Gly; B representa uma ligação da valência ou um radical Asn cu Thr; C representa um radical Gin ou His; -26-

   X representa um radical Gl-y ou ala; Y representa uma ligação de valência ou um radical His(R2), hisí?^), Phe, phe, Ser, ser, Ala ou ala; T representa uma ligação de valência ou um radical Leu, leu, Phe ou phe; W representa um grupo de fórmula OH, NH2, NH(CH2)4CH3, NH(CH2)2CgH , Met-R3, Leu-R3, Ile-R3 ou Nle-R^; •R-l representa um átomo de hidrogénio, uma cadeia alifática linear ou ramificada possuindo entre 1 a 11 átomos de carbono, um grupo benzilo ou fenilo; R2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo Tos, • Dnp ou Bzl e r3 representa um grupo amino, hidroxi, metoxi ou hidrazino, e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, ca-racterizado pelo facto de se condensarem aminoácidos ou/e derivados de aminoácidos na sequência desejada e/ou fragmentos-peotídi-cos contendo estes aminoácidos ou os seus derivados na sequência çiesejad.a para se obter o pêptido desejado, sendo o grupo ácido carboxílico terminal activado para a ligação peptícica e estando os grupos remanescentes protegidos e por se desproteger o composto resultante e/ou se converter o piptido resultante num seu sal aceitável sob o nonto de vista rarmaceutrco. Lisboa, 12 de Junho de 199G