PT94238A - Processo de preparacao de anticorpos monoclonais reactivos com um antigenio presente em celulas humanas de leucemia e linfoma e processo de tratamento de medula ossea - Google Patents

Processo de preparacao de anticorpos monoclonais reactivos com um antigenio presente em celulas humanas de leucemia e linfoma e processo de tratamento de medula ossea Download PDF

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Description

~9
S-IEnúRIfi DESCRITIVA 0 invsnto aqui descrito foi realizado no decorrer de ura tratalho no âmbito cie uma PUS 6RANT CA 19304 concsdida pelo datioisal Can-cer Institute.
Campo Técnico 0 presente invento refere-se, na general idade, a linhas cie células de hibridoma e a anticorpos monoelonais produzidos por· elas, dais especificamente, este invento refere-se a uma nova linha ds células de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal especifico para um antigénio único, associado a uma larca variedade de leucemias e linfornas humanos, ao anticorpo monoclonal gerado pelas linhas de células de hibridoma, ao antigénio isolado das células de leucemia humana e células c!a linforna humana, e aos métodos de utilização do anticorpo concclonal, na sua totalidade ou em par te, para o diagnóstico a terapia de vários leucemia-1infornas humanos.
Descrido da Arte Anterior
Kohlsr e Hilstein apresentaram a primeira utilização com sucesso da tecnologia de hibridação das células gerando linhas de células híbridas de crescimento contínuo (chamadas "hibridosas") que prcduzsiiii anticorpos monoclonais [Nature 256 s 495-497 (1975}], Anticorpos monoclonais (mAbs) são anticorpos homogéneos que exibem ligação selectiva para um único determinante antigéníco.
Os mAbs possuem vantagens significativas sobre os anti-soros convencionais no que diz respeito à especif icidade s disponibi1idade. Isto é particularmente verdadeiro para mAbs :'i rígidos a antigénios de superfície da célula [ver, e.g., Curr,
Top, Dev. Eiol. 14;i~32 (1980)],
Desde 1975, tem sido feito um grande esforço por parte de alguns in vsstigadores, para gerarem hibridomas que produzam mAbs dirigidos a antigénios . de .superfície de células associados â leucemia-iinfoma humanos (HLL). Alguns investigadoras, incluindo o inventor aqui referido, gerara®, com sucesso, tais mAbs anti---HLL, Estes mAbs incluem aqueles que são dirigidos ao antigénio
7 Λ 035 -3- da ALL 'leucemia linfoblásfcica aguda) vulgar, designada por CALL8 (CMO; tiisia endopeptidase neutra), a antigénios da leucemia do timo ' dos humanos (CD1), a antigénios da leucemia T e a um antígerio associado á leucemia linfocítica-mieloeítica- designado por êPléu. í-: maioria, se não todos estes raftbs, com evcepgão daqueles gerados paio inventor aqui referido, fora® produzidos pelo método zonvãncional, i,e., usando células HLL infcactas para imunizar ratinhos proporcionando as células do baço para a fusão celular„ Apesar do sucesso referido anteriormente, continua a ser difícil gerar ®Abs anti-HLL pelo método convencional. Isto sucede, prcvavelmente, porque os antigénios de superfície de célula associados à HLL são, geralmente, componentes da superfície de célula relativamente pouco importantes e fracamenie imunogénicos quando comparadas com outros componentes conhecidos da superfície ds célula rnais importantes, tais como, os antigénios ML.A, classe I s eiassa II. 0 uso de antigénios de membrana celular isoladas e purifieadas, em vez ds células intacfcas, para imunizar ratinhos deve resultar na produção de rnftbs com maior afinidade para imuncgénios ralativamente fracos, e.g», antigénios de superfície ds célula associados a HLL, por causa da ausência de competição antigénica com imunogênios fortes, e.g., antigénios HLA classe i a cl-'.esc II, durante, a resposta imunitária. Além disso, tal utilização pode resultar no desenvolvimento de um novo grupo ds i.iflbs que não se obteve usando células inteiras, i „ e., aqueles dirigidos a -de terminantes antigénicos que são incapazes ds induzir uma resposta imunitária quando estão em células intacfcas.
Sob este ponto de vista, o presente inventor desenvolveu, previaments, um novo processo para isolar quantidades relati vamente grandes (subrni li gramas) ds antigénios ds membrana celular, associados a HLL imunologicamante activos, [Câncer Research 41:2973--2976 (Julho 1981); J. Xmmunol. 127:-2530-2588 (1581)]. Usando tais preparações de antigénios, foram gerados alguns mfibs dirigidos a alguns antigénios associados a HLL, â— US£ íiifersntss [e,g, , Proc. Nati , AcacL Sei» USA 80s645-849(19S5); I&âunol, 132:2089-2095 (1984)? Proc. Natl. Acad, Sei» 33 ='7893--7902 (1936)], No entanto, estes antigánios são diferentes do antigénio único, referido neste Pedido de Patente» fyrants a década passada, fi2eram-se notáveis progressos na olassificação e caracterização da HLL. Gs rAbs tivsrafl um grande cor*tributo nesse progresso» Além disso, os afibs têm sido usados extensiv-amante no diagnóstico e seguimento dos pacienteseom HLL,
Lo entanto, a utilização cora sucesso dos mAbs para terapia de HLL tem sido muito limitada» Um mAb ideal, para tais fins, será um que reaja com 100¾ das células malignas para todos ;.g espécimes de HLL, mas não reaja com nenhuma das células normais *;*u tecidos normais.
0 inventor em questão produziu e csracisriíou muitos mftos qoe mostram vários graus ds reactividade com células de HLL» A rcior parte destes ®Abs anti-HLL foram gerados usando preparações •ds antigánios isoladas ds membranas celulares segundo o processo ants/dormente referido. Alguns dos mAbs gerados mostrara® uma sspecif icidads para tumor, notavelmente alta» Ho entanto, devido à. sua as tr si ta especificidade, alguns destes ®Abs an li-HLL altamente seleetivos, apenas possuem uma utilidade terapêutica licitada. Por exemplo, o mAb, designado per SNI, reage só com células de leucemia linfoblãstica aguda T (T ALL) de entre as rui tas células malignas e não malignas e espécimes de tecido testadas» Embora este anticorpo possa ser adequado para a terapia in____vivo dos pacientes com T ALL, o SNI terá apenas uma utilidade terapêutica limitada, porque a T ALL te® uma incidência baixa ertre a população geral» Por isso, mantém-se a necessidade de mAbs que reajam fortemente com muitos tipos diferentes da HLL, nas que mostrem uma reactividade relativaments baixa com células normais, particularmente, com células progenitoras d® medula óssea, normais.
Breve Descrição das Figuras células humanas A Fia, i mostra os resultados gráficos da análise FAC3 do > riícorpo moncclonal SN7 com espécimes de — 3-
se I scc i o nados =. A Fig, 2 ilustra os resultados da análise SDS/PftGn do antigénio SM7.
Descrição do invento 0 presente invento proporciona um novo a&b, designado por 3fl7, s/ou um fragmento reactivo de SN7 que se liga ou reage cor uma grande variedade de células de leucemia-1 inforna dos humanos incluindo um ou mais, s, de preferência;, uma pluralidade e, de prafsrêneia ainda maior, a maioria dos espécimes da células da 1 inferna leucemia seguintes: células de leucemia linf OCX C ϋ Cõtr crónica B humana: células de leucemia prolinfocítica 3; células de leucemia de célula de Hairyq células de leucemia linfoblástica aguda não-T; células de leucemia mielocitica aguda; células de leucemia mislomonocitica aguda; células de leucemia monocítica aguda: células de leucemia mielocitica crónica ® células de 1i nfoma não-Hodgkin.
Fsts invento também proporciona conjugados cie 3*17 s/ois um fragmento reactivo de SN7, através de ligação directa ou irdirecta ou eompiexação, com um ou mais compostos, incluindo, mas não lhes estando limitados, os seguintes: agentes i to tóxicos, drogas, toxinas ou seus fragmentos, hormonas, enzimas, lipossomas, agentes radioactivos, corantes, agentes feto·:'?,náuticos, anticorpos ou seus fragmentos, anticorpos anti--idioripo ou seus fragmentos, anticorpos quiméricos ou seus fragmentos, e outros anticorpos monoclonais ou seus fragmentos.
Como é hem conhecido na arte, um "'fragmento reactivo" inclui qualquer fragmento de ligação a antigênio de uma molécula IgS incluindo fragmentos Fab, F(abr)2 ou FV. 0 presente invento proporciona, ainda, uma nova linha da células de hibridoma, designada por Τ6-1Θ9, que é gerada pela fusão da células de mieloma de ratinho com células do baço de um ratinho, ou de outro animal adequado, imunizado com aa preparação de antigênio de leucemia não-T dos humanos, isolada de membranas celulares de células de leucemia linfoblástica aguda -6-
humana, Gs hibricèomas assim produzidos são seleccionados ps~a aquelas, com sobrenadastes de culturas contendo anticorpos que tsa ligação sslectiva às células de HLL. Os hibridomas desejados sso , s obseq usn teme n is, clonados e carac ter içados,
Este invento ainda proporciona 01¾ processo para a preparação do sAb 3M7 ou de um fragmento reactivo de 8iif7, que compreende a cultura ds linha de células de hibridoma 16-189 num meio adequado 3 a recuperação do mAb, ou do fragmento reactivo, do sobrsnadante da cultura da referida linha de células de hiferidoma. AI ternativamsnie, o mftb SM7, ou um fragmento reactivo de SN7, podem ser gerados injactando a linha de células cte hibridoma 76--189 num animal apropriado e recuperando o anticorpo ou fragmento reactivo da ascite maligna ou soro do animal assim injectado.
Este invento s; adicion&lmente, dirigido ao novo antigénio definido por mAb SN7 e aos métodos de diagnóstico e terapêutico que empregam mAb SN7 no tratamento de várias leucemias e linfornas humanos, G mAb- SN7, foi testado contra uma variedade de espécimes eis células humanas, cultivadas ou não cultivadas, utilizando um radio-imunoensaio celular s/ou uma análise FACS, Cem base na informação obtida nesta análise, ο 3M7 mostrou ligar-se, ou reagir, com células não cultivadas de leucemia linfccític® crónica B de humanos, células de leucemia prolinfocítica B; células de leucemia de célula de Hairyj células dá leucemia linfoblástica aguda não-T, células de leucemia aisiccítica aguda; células de leucemia mielomonocitica aguda; células ds leucemia monocitica aguda; células de leucemia ííiielocítica crónica e células de linfoma não-Hodgkin. 0 St!7 não r eagi u com quaisquer espécimes ds célula de leucemia linfoblástica aguda Ϊ, testados. Os resultados da reacticida.be com várias linhas de células humanas são, geralmente, concordantes com a reactividade, anteriormente referida, cg® os espécimes de células não cultivados. A reactividade de SM7 com vários espécimes normais (cu quase versais) ds medula óssea, diferentes, foi, ou não significativa, cív somente, fracamente positiva para u®a população menor ds -7- aivuns espécimes de medula óssea. Os espécimes de medula óssea usados foram derivados de vários pacientes com leucemia-linfomas difersvtss, am remissão. De entre as células de sangue periférico, normais,as células 7, granulócitos, sritroeitos s plaquelas mostraram uma rsactividade não significativa com ο 3M7, ("reactivídade não significativa" ê definida como aquela que r-ao é dstsetável usando uma rad i ©-imunoaná1ise (RIA) celular, porque i- nível ds aetiviclade detectado, não pode ser distinguido dos níveis de controlo de fundo, habituais), EM© entanto, o Sf-?7 mostrou vários graus de reacção fraca coe uma subpopulação de células 3, de sangue periférico, normais s monócitos* 0 grau de rsactividade verificado varia com os doadores de sangue po»"if ér ico,
Descobriu-se que o SN7 é um anticorpo Ig*3i-k. 0 peso molecular d© antigénio de superfície de célula, definido por SN7, D aprovimadamerite, 20 000, A descoberta de; um antigénio com tão baixo peso molecular, é considerada invulgar quando comparado com os pesos moleculares de outros antigénios ds superfície de célula, um células hematopoiétieas humanas,conhecidos. Este antigénio foi designado por GP20 s, pensa-ss, que s um antigsnio tofcalmenta novo qua ê expresso na superfície da célula, de uma vasta variedade da célula da HLL.
Adicicnalments, o mfth SN7 mostrou ser sufieien temente vstãvsl para ser submetido a processos de conjugação conhecidos, com outros agentes, tal como a cadeia A da ricins, unia toxina de planta, 0 conjugado demonstrou a capacidade de matar, selectivamente, células de HLL qus expressam 8P20. o antigénio def I rd do por SM7. Tais processos incluem a ligação cova lenis ou complexaça© cio mAb, ou de um seu fragmente;, ao agente ou droga cie interesse, direeta ou incSirectamente, usando um agente de ligação adequado. Outros mfibs, SH1, 8M2, SN5 s SHó também iderrii ficados pelo inventor, quando conjugados com a cadeia A da ricina (RA), demonstraram uma elevada capacidade específica para matar as células de leucemia, como referido em Câncer Research 44;259-264 (1984), Proc, Natl. Aead, Sei, USA 84:3390-3394 (1987), a Cancer rééearch 48s4675-4680 (1988), tais divulgações são aqui
incorporadas como referência. Têm sido utilizados numerosos métodos durante os últimos aros para ligar ou conjugar uma variedade ds moléculas a vários locais dos anticorpos s, em particular, dos anticorpos aor.oclonais dirigidos contra qualquer antigénio alvo, Um desses métodos é descrito na Patente E.LJ.A, 4 671 958, cuja divulgação é aqui incorporada como referência, Mumerosos agentes bioaetivos p-cleo ser conjugados ao mftb ds acordo com o presente invento, incluindo agentes citotóxicos, drogas, toxinas ou fragmentos ds tovinas-, -hormonas, enzimas, lipossomas, radio-isótopos, corantes, agentes votodi nâmicos, ou outros anticorpos incluindo os anticorpos anfci-idiò sipo, anticorpos quiméricos e anticorpos juonoclonais, ou fragmentos ds tais anticorpos. Adicionalmente, os mdbs ou fracções desses mAbs, podem ser incorporadas noutras matrizes para uso em -esquemas de separação que são baseados ~u\ reacções antieorpo-antigénio„ Um grande número ds agentes portadores ou de conjugação conhecidos, é divulgado na Patente l.ltl, 4 671 958 e qualquer um desses agentes será adequado para se ligar aos anticorpos aqui revelados, ou aos fragmentos activos do anticorpo aqui divulgado, Rcmeadamente, os fragmentos r(ab’)2, Fab ou Fv, sem perda significativa da actividads do anticorpo.
Adieionalmente, o anticorpo do presente: invento pode ssr tornado citotóxico numa citólise mediada por complemento, por adição de anticorpos Ig8,anti-ratinho,ds coelho.
As vantagens anteriores adicionais s as principais ..-ar-acterísticas do presente invento ficarão claras, após uma leitura da descrição detalhada seguinte, juntamente com cs axsmpios incluídos,
Descrição Detalhada do Invento Materiais e Métodos
Ds anticorpos monoclonais que exibem utilidade no presente invento foram preparados seguindo geralmsnte os procedim®ntos da f.ohlec e Milstein como referido em Matura, 256s495-97 (1975), -9-
Os pormenores do processo são bem conhecidos na arts, Pseumidaments, o processo envolve a injaeeão de ura antigénio 00¾ ratinho, ratazana, ou outro animal adequado, 0 animal é, sybsequentemente, sacrificado © as células do seu baço são fundidas com células de tumor de raplicação contínua, e.g., células da mieloma ou 1inferna, Após a fusão, três tipos de células ficara na cultura; esplenócitos, células de raieioraa e híbridas, Os esplenócitos e células de raiei oraa morrem s as células híbridas começam a duplicar todas as 24-43 horas, 0 r&eultãdo é a produção de uma linha de células - híbridas, bibride-ms, que se reproduz in vitro. A população de hibridosas 4. testada para identificar classes individuais, cada qual, segregando um anticorpo único, específico para um desejado antigénio. A preparação de antigénio foi isolada das membranas celulares das células de leucemia derivadas de um paciente com ALL do tipo não-T/não-S (linhagem B). Os métodos utilizados foram descritos, recentemente, em Proc. Natl, Acad, Sei, USA, 857S9S--7902 (1986), Os métodos foram baseados numa modificação de um método anterior para isolar preparações de ar* ti génios de leucemia T humana, como referido em J. Xmmunol., 127;2580-2588 (1981); Proc, Matl, Acad, Sei, USA, 80^845-849 (1983)5 e J, Xffimunol,, 152;2089-1095 (1984), tais descrições são aqui incorporadas coso referência. EXEMPLO EXPERIMENTAL Produção ds Anticorpos Honoclonais A - Preparação do Antigénio de Leucemia A preparação do antigénio imunizador foi produzida da seguinte maneira: as membranas celulares das células de leucemia, derivadas de um paciente com ALL do tipo não-T/não-B (linhagem B), foram preparadas por disrupção mecânica das células, seguida por centrifugações diferenciais das células resultantes da disrupção. As proteínas da membrana foram selubilizadas por tratamento com desoxicolato na presença de iodoacetamida recristalizada (concentração final, 5 um'), s fraceionadas por 71 035 -10-
croísatografia de afinidade, em colunas ligadas sm série., de 1setina do Lens colinaris (LcH) e lectina de Rieinus communis (RCA). Os glicoeonjugados ligados a LcH e ligados a RCfi, (na éãiõria glicoprotei nas) foram, individualmente, eluído. combinados e sujeitos a cromatografia da imunoafinidads passiva; as frseções foram passadas através de tris colunas íeunoadsorventes ligadas em série. Os imunoadsorventes consistsm ea anticorpos βρ-microglobul i na &n t i -h umanos de coelho, purificadas por afinidade, acopladas a Sephaross CL-4B, anticorpos de células B normais anti-humanos de coslhoí acopladas r ceptarose CL-4B e anticorpos de linfócito de sangue periférico normal anti-humanos ds coelho acoplados a Sepharose GL-4SAn substâncias resultantes da passagem pelas três colunas foram cãsfuradas, concentradas s repetiu-se, mais uma vsz, a o*ornaiografia de imunoafinidade passiva. c Imunização e Hibri dação de - Células Somáticas 1Imunização L;q ratinho foi imunizado subeutaneamente (s.e.) com 30 vg da preparação de antigénio de merabrana celular em 0,12 ml de tampão Ir is-HCI 10 mm, pH S,0, contendo 0,3 por cento de desoxicolato
ncrdctêlia pertussis. Um reforço c!e imunização foi feito ir, jeetando s.c. 15 wg de preparação ds antigénio misturada occ adjuvante de Frsund incompleto. Fez-se outro refcrço de icunização, injeetando i.p./i.v. (infraperi tonealmarste/iintravenosa»!'.;® n te) 60 íug (sía 0,í ml de tampão Tris-tcC) da preparação ds antigénio misturada cgísi 0,4 ml de solução salina. 0 baço foi tirado para a fusão celular, 3 dias após a última imunização. 2Hibridação da Célula
Pzra a fusão das células, fundíram-se células ds baço derivadas de ratinhos imunizados (í x 1G° células) com a linha de células de . misloma de murino P3/NSÍ/1 -Ag4-1. ( abreviado para NS-1) 7 ( 4 x 1G "células ) f utilizando poliefcileno glicoi [Matur-a 22ó;550-552 (1977)1. A linha de células ds misloma MS-i foi -11- obtida do Csll Disfcribufcion of the Salk Instituis, San Diegc, CS. As células fundidas fora® lavadas e centrifugadas» A pelota de célu las, lavada, foi suspensa em 200 ml de éeio tís hipovanfina--arfi 1 noptsr i na- £ i m i dina (HAT) s 1 ml da suspensão de células foi colocada sm cada alvéolo das oito placas de cultura de tecido da 24 alvéolos (capacidade de 3,5 ml por alvéolo) (Liobro Division, FZo:,v Laboratories, Inc.). Cada alvéolo já continha 2 células, de células de exsudado. peritoneai da ratinhos BALE/e so 0,2 s’fil de meio HAT como células al insen tadcr as * As células foras cultivadas numa incubadora de CO2 (5 per cento), a 37SC, metade do maio de cultura de cada alvéolo foi substituída por meio HAT - rasco duas veies por semana. Após 12 dias de fusão celular, realizou-se o teste de seleccão usando uma radio-imunoanalise P^ra identificar os sobrenadantes de cultura que conta® o anti-
CjfpO 3. Seleccão e Clonação de Hibridoma.
Os anticorpos monoclonais anti-leucemia existentes nos sobrenadantes de cultura foram sslecctonados por uma radie-~imunoanálise (ver abaixo), A clonação de hibridomas foi realiza-da per propagação ds uma só célula por meio de diluição li mi tanto Γgel.eetsdi Hsthods ín Csllular Immunology ( 5. S, Misehsll ® S. Vi. Lhilgi, E-is.) ρρ. 351-372p Freeman e Corpany, São Francisco, 1960], rara assegurar a monoclonalidads cio clons, o clons te hibridosas. resultante da primeira clonação foi sujeito a una r —' Ο J. O ,
Caracterização de Reaci ivida.de Sii27 A. 9 adio-imunoensaio de iiicroescala
Deverá ssr notado que os reeeptores Fc, nas células alvo, são bloqueados com IgQ humana durante o ensaio, 1, Preparação de FfabMç de Anticorpos ϊα6 Anti-Ratinho de Cabra Purificadas por afinidade °ara estabelecer um radio-imunoensaio eficiente s sensível, o fragmento F(ab* )2 de anticorpos IgS, anti-ratinbo} de cabra, purificados por afinidade foi, primeiramente, preparado como se -12-
ssgue: o IgS de aniisoro XgS anfci-raiinho de cabra foi digerido vO!·! pepsina [Arch. Biochem. Biophys, 89 s 250-244 (1960); lííissuiiocheífiistry 13:407-415 (1976)], o digerido foi fraccionado ::u,%s coluna Sephadex 6-150 [IrmTiunochemistry 13:407--415 (1976)], 7 "ragaeriio F(afod ) 2 resultante, passou através de uma coluna munoadsor vente preparada com Seph&rose CL-4B conjugada com IgQ humana, Eshs tratamento fez-se para remover quaisquer componentes F(ab5)2 qus reajam com determinantes antigénicos comuns ao Ig6 de ratinho e Ig6 humano. Este tratamento é importante quando o
F(ab5)o 3 testado na presença de células humanas (ver abaixo), C F(abJ )q não ligado foi aplicado numa coluna imunoadsorver.te vr-parada ecm IgQ de ratinho acoplado a Ssphaross CL-4B s 3 coluna foi lavada, 0 F(ab*)2 de cabra, ligado,,foi eluído com tampso de 0,1M glicina-HCl, pH 2,6, contendo 0,2 H de WaCl, 1 srí •Je EDTfi s 0,03 por/cento de ^£^3, Este F(ab')2 eluído compreende, unicamènts, a forma de monómsro e não contém qualquer quantidade uigrificafiva de agregados de F(ab5)q, como demonstrada peia filtração em gel numa coluna Ssphaross CL-62. Esta preparação -Je fragmento F(ab’ )q de anticorpos de cabra específicos, dirigida ao gS ds ratinho [designado por F(ab5 j^-ScííIgO], foi usada no radio -imursoensaio, após ter sido r adi ornar cada com '“l. isento cie portadoras pelo método I0D0-QEN. [Bicehemistry 17:4807-4317 (1973); Biochem. Eiophys, Rss. Commun. 80s349-357 (1978) 3 -J,
Immunoi 157:2580-2538 (1981)], 0 teste de ligação quantitativo •:pis utiliza este --^I-F(ab5 )2“«3csMIgQ contra o IgC de ratinho, purificado mostrou que abaixo de quantidades ng de IgQ de ratinho-, os anticorpos podiam ser determinados usando este r-;agcs:.te anticorpo rãaiomar cado. vsr i’í?.cc-u—ss que o presSí reagente de anticorpo reagia com JgM ds ratinho quase tão eficientemente como com IgG de ratinho, 2, Radlo-imunoensaio -JsancJo o i2bjf._.pf = )2-8at1Ig6, foi empregue um radio-irounosn-:aiõ ds mier©escala, para determinar a reactividatíe de mAbs com várias células, Num ensaio típico, alíquotas triplicadas de 20 ai Je várias diluições ds fluidos de cultura, ou ascite de
bibr idomas e 2-10 x 10^ células em 10 ul ds tampão Hepas (pH -13- 7,3), contendo 0,1 por cento de IgQ humana, fora® incubadas se alvéolos individuais de placas de rnicrotitulaeão de 96 alvéolos (Cooke Fngineering Co. ), durante 60 min a 42C com agi tacão rc-nfcinua. 0 tampão Hepes consistia em meio RPM1 1640, contendo 25 >1 de Ν-2-h idroxieti1-piperazina-N7-2-etanosulf onato (Hepes), 0-5 -.cr cento ds albumina de soro bovino, Trasylol (50 unidades de calicreína/ml) s 0,1 por cento de NaN3. A Ig8 humano é adicionava ao tampão Hepes para minimizar a ligação não imunoespecif ica (arbcs bíoespscíficos, e„g., receptor Fo, s não-bioespscíf ico) Is anticorpos da ratinho e F(ab* )2-QcsMIgQ-marcad© Α·^Ι às célu.las, lu»ante o radio-imunoensai©. Adicionalmente, os alvéolos de placa :Ia microtitulação foram tratados antes da utilização cora o tampão Hepes. ís misturas foram centrifugadas a 500 x g e 42C durants 10 minutos s as células peletizadas, lavadas três vezes. Aproxiraadamente 2 ng (3-5 x 104 cpm) do “^I-FCab7 )2 em 10 μΐ de tampão Hepes, foram adicionadas a cada pelota lavada, 3 as misturas rsaceionais incubadas com agitação s lavadas como déscrito anteriormerite. A radioactivids.ds nas pelotas lavadas foi determinada num espectrómetro de raio gama. Quando são usadas plaquetas como alvo, o radio-imunoensaio é realizado era tubos cónicos de polipropileno (tamanho 1,5 ml) ©m vez -de placas de raierciitulaeão, porque ê necessário precipitar plaquetas a uva focça centrífuga significativamente mais alta (e.g., 2500 x g).
Foram incluídos três tipos diferentes de controlos pai*a espécimes individuais de células. Ha amostra dle controlo (et triplicado) para o sobrsnadante da cultura de hibridoma, o sc-branadante de cultura foi substituído por ura dos meios de cultura, o meio de cultura que contém IgQ de ratinho (10 yo/ml) ou o meio de cultura que contém Igli de ratinho (10 >4g/ml). Hão se observaram diferenças significativas nas quantidades c!o r&dioaclividade detestadas nos três controlos, s o valor médio desses controlos foi subtraído da radioaetividade das amostras de teste. Tal como a amostra ds controlo (eo triplicado) para as diluições da ascite d© hibridoma, as diluições correspondentes da ascite ds raurino ds controlo, apropriada, contendo Ig de ratinho -14- -14- 71 035 jrm*.....— do vesao isotipo do anticorpo ds hibridoma, fura® incluída* [Pooe, r-Jatl. AcacL Sei. USA 80:845-849 (1933)]. •J® ;'adio-iíMUíioensaio c^s micrõescalã usando uísia placa do .1 crccitulação © preferido uma vez que- é bastante sensível, ; reprodutível e objecfcivo. ftlém disso, um único testa usando esto ensaio permite a: determinação de 100 amostras, 0® triplicado.
3. κί'·£.θ£ί· irfiCS A análise FAC8 foi realizada da seguints maneira. Fora* suspensas células (1,5 a 2 milhões) em 10 a 20 y.1 de meio RPMF ;1540, contendo 25 mM ds Hepes, 0,1¾ de IgS humana, 0,5¾ d© albumina ds soro bovino, 2 mM de EDTA, Trasylol (50 unidades de lalicr-aína/ml), e 0,1¾ ds Maí% (Tampão A) s deixou-se repousar t.:;r:nt5 30min- a 420. Então, as células foras incubadas com 100 pi da sobrenadants ds cultura ds habridoras, ou com uma solução IgO de ratinho de controlo de comparação de isótipo (10 pg/ul) durante 90 min a 42C. ftpós três lavagens com solução salina iarporada cosi fosfato, fria, as células foram incubadas cor fragmento FYab*)2 ds Ig anti-ratinho ds carneiro (SaMIg) conjugado com fluoresesína (Sigma, St. Louis, H0) durante 90 min * 4SC. As células incubadas foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada. com fosfato, fria, e suspensas sm tampão Hspss 25 ίϊιΜ, ρΗ 7,2, em meio RPM! 1640 contendo 2,5 míi de EDTA e 5¾ de soro ie bovino fetal, Para fixar as células, misturou-se 1 *2 da suspensão cslular com um volume igual de uma solução do formaitísído a 16¾ em meio RPí-ίϊ, As células fixadas foram mantidas numa câmara fria, protegidas da luz até serem analisadas por FAC3, utilizando um Becton Diekinson FAC3 440. Cada uma das amostras contendo, pelo menos, 10 000 células foi analisada usando o modo ds amplificação Xogaritísico. Controlos negativos eram células alvo marcadas com IgS ds ratinho de controlo a segundo anticorpo marcado com FITC i«e., F( &b ’ )2-3aH!g, € , Radio-imunopreeipitação e Elsctroforess ds Poliacrilamida cie SuIfato Podscilo de Sódio (SDS-P&6E)
As preparações glicocon3ugadas ds LeH-ligado foram isolarias 2e msobranas celulares ds células malignas não cultivadas, da -15- dnis pacientes com CLL s um paciente com linfoma -de não-Modgki n, coso descrito antsriormente para a preparação do arstigénio ;vsçia Secção A anterior, Preparação de Antigéndo de Leucemia),
Os glicoeonjugados isolados por ssts prc-cssso são, na soa caleria, glicoprotsí nas- As três preparações ds a1i copr ots ínas isoladas, derivadas de três pacientes diferentes, foram radio---mareadas, ssparadaments, com -i2oj utilizando um tubo Minisorp revestido pelo método ΪΟΡΟ-ΘΕΝ. Para reduzir a radioactividadv de fundo durante a radio-imunoprecipitação, as três preparações radio-marcadas foram pré-tratadas por incubação, durante i hora a 320, com Pansorbin (Calbiochem), que foi revestido coa anticorpos IgS anti-ratinho de coelho purificados por afinidade e anticorpos anti-LcH de coelho. Para a imunoprscipi fação específica, as amostras r adi ornar cadas prs-tratadas foram 'roubadas, sm duplicado, durante 1 hora a 02C, com Pansorbir. ^evestido com anticorpos IgQ anti-ratinho de coslhc purificadas ror afinidade (RaMIgG) s mAb SM7 (IgQl), Iiaunopr scipi fados ds controlo foram preparados, usando Pansorbin revestido com SdHIçd e ffiAb de controlo (anti-HLA DR) ou IgGl de ratinho, de controlo (variante MGPC 195), Os imunoprecipi tados específicos s de conií olo foram lavados duas vezes com tampão Tris-MCX (pH 7,2) contendo 0,5% d© taurocolato (um detergente), 0,15 π de NaCl, 2 mM de EDTft, 0,1% de albumina de soro bovino, Trasylol (100 unidades de caliereí na/ml), e 0,05% de Nafiç (Tris/tampão taurocolato). Os Imunoprecipitados foram, ainda, lavadas doce vèfsr-s c-òivj Tris/tampão Renex 30 (tampão Tris contendo 0,5% de vcrcv Tc, um detergente não iónico, em vez de tatrocoiatv *0,5%) ·.? caa ver com 0,0623 d da tampão Tris-HCl (pH 6,8), contendo 0,01— de ciioa omo c= Os aniigénios radio-marcados dos imunoprecioito.-dos lavados foram libertados do Pansorbin por fervura durante 3 %1n na presença de 3D3 2,5% e na presença ou ausência de ditio -tr si foi 0,1 í-i, Os antigénios libertados foram analisados por TvS-PASE, usando processos normalizados, s a auto-radiograf ia foi p.-epar&da usando um filme Kodah X-0MAT AR e um ser a n- i n t e ns i f i c a -ccrT-Oma. tic.. (f » * 33Γ —- J. Ò ~ ~reparaçgo e Teste de Imunocon.jugados Contendo SJT? A, Pr ~acão da Xfaunocon.iugados 0 anticorpo 3M7 purificado foi conjugado covalsniemente. com a cada.ia A da ricina, uma toxina de planta derivada da semente c!~
( a f. r o , A conjugação foi realizada segundo um pr ocsd 1 mento c;us á dcsscdo numa modificação do nosso processo, previamante rslalado [Câncer Research 48:4673-4080 (1988)], Resumidamenfcs, o anticorpo 877 purificado em solução salina tamponada com fosfato (P83, pH fc-i tratado com um excesso molar de 20 vezes de SPDP, uv rsiiculador heterobifuncional, durante 30 min à temperatura ambiente, para introduzir grupos 2-pii idilo dissulfiio na molécula do anticorpo, 0 anticorpo modificado e dialisado foi, união, misturado com um excesso molar ds três vezes de cadeia-A d-n ricina (RA), purificada, recentemente reduzida, em 766 cuvisudo i mil de EDTA e incubada a 42C durante 24 h, e à temperatura ambiente durante 24 h. Os conjugados anticorpo-âA νονοί! separados da RA não ligada por filtração em gel numa coluna calibrada Sephacryl S-300. 0 anticorpo não conjugado restante foi removido da fracção conjugada por cro-.afografia numa coluna 31ue Sspharose [ftnalyiical Eichemistry 160:440-443 (1987)]. d Norte Ssleetiva de Células de Leucemia-Linforna Humanas {HLL) por Imunoconjogados li.:'" teste direeio de cito toxicidade ir« vitro contra as células HLL alvo a células de controlo decorreu da forma, raviarentea descrita [Câncer Research 44:259-264 (1984-)] .
Pssuridaaents. as células foram suspensas em meio ds RPNI 1640 aupla. sentado com 5¾ de soro bovino fatal, penicilina (100 unidades/«I), estreptomicina (100 Mg/ml) e gsntamicina (50 pg/ri) a uma concentração celular de 7,5 x 10^ células/ml, Porções ds um ol de suspensões de células foram colocadas em alvéolos individuais (ele, aproximadamesvfce, 3,5 ml de capacidade) ds placas Ja cultura de tecido Libro, Adicionaram-se isunoconjugados ou P33 (controlo) em triplicado, a alvéolos de culturas individuais s as placas foram colocadas numa incubadora hufiii di ficada, de CGp (5b), a 3720. Nos segundo s terceiro dias, uma porção ds cada
sóbrsrsâdsívte de cultura de células foi substituída por ura rmsio de oulíura de células fresco, Uma porção da cada suspensão ds células foi diariamente removida, para determinar as células aláveis usando azul de tripan.
RESULTADOS
Caract-sricação Inicial do Anticorpo Monoclonal A reactividade dos sobrenadantes da cultura de culturas pri#, árias de hibridoma e clonss de hibridoma derivados dc culturas primárias foi, inieialmente, caractsrizada usando um radio-imunoensaio celular (RIA) com várias células cultivadas 3 não cultivadas, A reactividade do Sí!7 coso várias linhas de células hamatopoiétieas humanas malignas é resumida na tabela 1, TABELA 1 Ráactivi-dade do 8K7 com linhas de células hsaatopoiéticas humanas malignas ã reactividade foi determinada usando 20 yil da uma diluição de 5 vsses de fluido de cultura de hibridoma Tó-lS? e 2 κ 30;-· células sm cada teste por meio de um radio-imunoensaio celular.
Lis.ha de células Origem da linha.de células Srau ds rSÍ.C LlVlíc.:1.:1:· élula 0 rALL~l ALL 3ALL-2 ALL !·. céi.d-3 linfoma linfocitico ç-c BALh’ S linfoma linfocitico -K- 31--"I1*íL-4 linfoma histiocítico .uj.;. Pendi linfoma ds Surkitt 'ir v r áéji linfoma ds Surkitt taros linfoma ds Surkitt ééé
diluía Prá-B MALM--Í CML-BC(-)
ALL LALh-é TABELA 1 (conti nuaçao) ?5£.r':iv?.dads do SN7 com linhas ds células hematopolsticas humanas aalionas
Linha de células Origem da linha de células Crau de r sac ti vi da da Célula dão-T/dão-3 - &LL *«**»*· *»*·'".*· Λ célula τ .01.7.....‘ ALL - U d lí ALL - Η'ν.·.'5.*-Λ.;^ * o "o-o ^ -„-\-Κι—n wo-i ALL - icr, z ksca ALL - :CO-MLT ltlO> - nUT 7S Síndroma de Sezary JL CL d* . d Célula éiaoio/ /nonoci cies LL-2 leucemia aguda misloeíiioa HL-60 leucemia aguda promielocític& - LO >- .?· linfoma de histioeítiea J Célula ílLsioeri- troide LSÓ2 CML--BC - Célula de Plasma •Γ- ·:: r :.ic- j-*0* c é Mieloma Múltiplo -'-é-ié HS Mieloaa Múltiplo PPHI 322é Mieloriiâ Múltiplo
..â^cemia misloeítiea crónica sm crise de expansão "acs ieucéíssica do linfoma celular T -19-
0 8N7 rsagiu fortemente com todas as células cia HLL tipo E ias linhas celulares testadas; estas linhas ds células dsrivaram ds pacientes com ALL, linfoma linfocí tico,. linforna hástioeíiice s 1inferna os Eurkitt, 0 SN7 também reagiu com 2 das 2 linhas Lr células HLL prs-E testadas, 2 das 2 linhas de células HLL nS:--T/nãc-S (linhagem S) testadas, uma linha de células de síndroma •:’c Sara;"'/ T s 2 ds 3 linhas de células HLL mislo/moisoei11 cas testadas. Ad i c i o na1msnte, ο 8M7 reagiu com 3 das 3 linhas dc oélulas ds plasma derivadas da pacientes com misloma múltiplo. Ho entanto_ ο 3H7 não reagiu cosi 5 das 6 linhas de células HLL rociadas, uma linha de células de leucemia promielocitica imatura HL-60.. nem com ima linha de células de leucemia mielosriir óido ”552, Hei observada reacfcividade adicional SH7 com 3 linhas de células 3 transformadas por virus EB, CCRF-SB, RPhil 17S3 e pepr 2057, d 8H7 mostrou reaciividatís menor cu não signifieativa contra 7 ss-pécimas d® células normais (ou quase normais) cte medeia óssea, derivadas de 7 pacientes diferentes oom HLL, *m remissão. A reactividade do 3H7 com espécirsies ete células normais (ou quase normais) de medula óssea foi, depois, estudada por análise FACS -s ca resultados das análises FACS fora® consistentes com aqueles do RI Λ celular (vsr abaixo), 0 SM7 mostrou vários graus -is rsactivickds fraca com 9 espécimes mononucleares produzidos a partir- dr sangue periférico ds 9 dadores sãos, A r-saciívidads dedo? foi, ainda, determinada com fraeções da células diferentes, obtidas de sangue periférico normal. Hão foi observada
reactividade significativa do SN7 com qualquer célula TL grsnulóeito, eritrócit© ou fraeções ca plaquetas,, Ho entanto, feram observados vários graus de uma reaeção fraca do SH7 ccc células 2 s fraeções de monócito. 0 grau da rsactividade variara ici dependência no dador do sangue periférico,, deactlvidãde com Células HLL Mão Cultivadas A recetividade do SN7 com espécimes de células frescos (não oultivseJos) de 76 pacientes com vários HLL, foi determinada pe: uma KIA celular e os resultados são resumidos na Tabela 2, -20-
TftBELfi 2
Peaetlvidade ds 8Í'J7 coffl células de linfoma s Isuesm.ia humanas não cu? uivadas
Os espécimes ds células individuais darivarai») de sanava periférico, de medula óssea ou do nódulo linfático de pacientes ersntes, fio radic-imunoensaio celular, foram incluídos três controlos diferentes com cada espécime celular» Um destes foi IgQI de ratinho, ds controlo (10 vg/mi) no meio de cultura de hitrideoa em vez do fluido de cultura ds hibridoma» Os outros 'ois controlos foram células BfiLL-1 (um controlo positivo-) 2 célulss r-OLT-4 (um controlo negativo) em vez do espécime do células alvo» voerça c’o Paciente R eac t i v i dacls í s-) Leucemia linfocífciea crónica B 23/23 Leucemia prolinfocítica B L/ú Leucemia ds célula Hairy 4/6 ALL não~T/Yíão-BÍb> 7/10 ALL s i/... ALL T 0/5 Leucemia mislocítica aguda 4/á Leucemia fitielomonocitica aguda 2/3 Leucemia wonocítica aguda 1/2 Leucôfisia aíelocítica crónica 2/3 .... inferna nao-Hodgki n 11/11 i--é ilúmsro de espécimes reactivos por número total de espécimes testados dc: Π ALL pré-3 sstá incluído nsste grupo
G 877 reagiu coem todas as 23 leucemias iinfoeítieas cró-nicas Γ (CLL), todas as 6 leucemias prolonfocítieas BL e todas as il espécimes de linfoma não-Hodgkin testadas» Além disso. o 777 reagiu com rnais de 50¾ dos espécimes testados para os LLL -21--
»
seguintes; leucemia de células Hairy, AUL não-T/não-B (incluir,do prs~E), leucemia misloex fcica aguda, leucemia mielomonoci fica aguda e leucemia mielocitica crónica. No entanto, o 8d7 não reagiu com nenhum dos 5 espécimes ds ALL I testados. A reaetividads do SN7 com espécimes HLL não cultivados é, r«:'aImante, consistente com a de linhas de células cultivadas (veja a Tabela 1),
Análise FAC8, A reaetividade do SN7 com espécimes ds células humanas fo-i investigada por análise FAC3. Os resultados da.e análises FAC8 foram, geralmente, consistentes cem as do PIA; celular. Os resultados das análises FACS são mostradas na Pig. i mde as células alvo são deixadas reagir cosi SN7 ou com uoaioS de ratinho de controlo por comparação de isètipo (variante MOPC 195.: IgGI) s corada com o conjugado de fluorescência F(ab’}p de anticorpos Ig anti-ratinho de carneiro. A análise FACS fc-i reclinada usando FACS 440 (Eecton Dickinsón). Os espécimes de medula óssea foram obtidos de dois pacientes oom ALL , diferente», em remissão -s foram isoladas células mononucleares para uso no teste , Gs espécimes CLL B mostrados nos gráficos C s D eram -2a deis pacientes diferentes com CLL. A BALL-i (uma linha de células ALL-3) fe a MGLT-4 (uma linha de células ALL-T) foram usadas ccco um controlo positivo ds negativo, respecti vamertts.
Uma pequena população (menos ds 10¾) de células "•oronucleares de um espécime de medula óssea (N2- 1) dos deis espécimes de medula óssea normais (ou aproximatíamente normais) derivados de pacientes ALL em remissão (gráficos fi e B da. Fig, 1), mostraram uma raacção fraca, mas significativa, com ο 8M7, c-vijjanto que o outro espécime de medula óssea (132, 2) não mostrou qualqu-er reaecão significativa coííi ο 8N7. Para dois espécimes de rs-:!u2a óssea normal (não envolvida), adicionais, tirados de dois pacientes com linfoma não-Hodg k i n, uma pequena população (apr-ávimad&ffients 4 e 7%, respectivamsnte) ds células mononu-oleares, mostrou uma reacção fraca com 3147. É provável que algures das células SM7 reaetivas, nos especímes ds medula óssea anteriores, s-sjam células malignas residuais. Contrastando com as células ds medula óssea normais (ou quase normais), a maioria (Si -22- s 22¾ respactivãísien t e) dos dois espécimes ds células CLL 2 •'S"ç.ridos iia Fig. 1 (lista C e D) reagsí&i fc-r temente / 827 = G 327 reagiu fortemente coí, praticaments, 100¾ (99¾) da SALL-:’ (grá?ico Ξ), roas não mostrou qualquer reactividade significativa coo a LoLT-4 (gráfico F),
Estes resultados cias análises FAC3 de células de medula óssea normal - células CLL e linhas de células cultivadas ccrcoriam bem com os resultados RIA celulares destes cesses espácdoes de célula (ver acima). radio-ir.-uncprecipi tação s SDS-PA6E do Astigénio de SN7
Lure experiência- separada onde os extraetos de detergente "as sset.-unas celulares de células CLL 7 foram fraccicnados? ver-ificou-se ' que o antigénio/sfiT se ligava a uma coluna LcH, Por isso. nesta experiência, as misturas de glicoproteí nas de membranas celulares HLL, aluídas de uma coluna Lcl. foram usadas para ií-àunopr-sciρitação após a radio-marcação. Foram testadas três amostras isoladas de células HLL derivadas de 3 pacientes HLL dois delas eram pacientes CLL e o outro um paciente com linfoma nSo-Hodghi n, Os iífiunoprseipitados obtidos usando as amostras radio-msreadas e 3M7 ou um IgS de ratinho de controle por comparação ds i só tipo (ou controlo mAfo) foram analisados po:* 833-FASE e foram preparadas autoradiografias, Estes resultados são encontrados na Fig, 2 onde os imunoprec i ρ itados das misturas dó glicoprotelnas ds membranas celulares marcadas com --3I; corar ..btidos d.e um paciente CLL a (painel da esquerda), paciente CLL b' (painel do meio) e de um paciente com linfoma não-HodgLin (paire" da direita). 0 processo de imunoprecípi tacão usou uma diluição de 10 vsrss da ascite SN7 _ faixas A s D do painel da esquerda e faixas F e E do painel da direita);. anticorpo SM7 puriviçado (falvas Ξ s E do painel da esquerda, s faixa 3 do pairei dc reicr), Ssftb anti-HLA-PR (Secton Dickinsoní faixa A do pairei do .ceio, e faixa ft e D do painel da direita) s IgS de ratinho d3 ccrtroic (variante riOPC 195; faixas C e F do painel da esquerda, faixa € do-painel' do meio, e faixas 0 e F do painel da direita), ds iaunoprecipitados foram não reclutidos (faixas ft, 5 e C dos -23- paireis asqusrdo e direito) ou reduzidos com ditioirsitol (faixas x„ E s F dos painéis esquerdo a direito e faixas A, B a C do ,;οj n*l do íVsãio) e analisadas usando gsles a 10¾ (painéis da ss-píer da a do meio) ou de geles a 12¾ (pa? rvsis da direita), A-s p-OV-tsinas de Marcação (mostradas em k dal tons) foram a ©valbumino (Afd7)? a anidrase carbónica (31.0), o inibitíor tripsina -da soja (2'1,3) e a lisGzlma (14,4).
Os ."esultados da amostra de CLL a, amostra CLL b s orna aecstra ds linfoma não-Hodgkin, aparecem nos painéis da esquerda, ’o meie a da direita respaetivamsnts, da Fig. 2. Sob condições de ; do redução qusr a ascite SM7 (faixa A do painel da esquerda ·=. ''rira 0 do painel da direita) quer o anticorpo SM7 purificado (faixa 3 do painel da esquerda) imunoprecipitaram um componente radio-parcedo principal único de, aproximatíaments, 2G 000 dal tons. Sob condições idênticas, umalgO ds ratinho ds controlo eu-uparação de isótipo (variante MO PC 195; IgAI) não prsc.! pitou qualquer componente significativo (faixas C coe prinsis esquerdo s direito) enquanto que c mAb antí-HLA-oF (ou oAb ds controlo obtido de Seeton Dickiíison) iMynoprseipitoo s.bunidades α (34 000 daltons) s p (28 OCO daltons) cs xnfigãnios KLA-DR (faixa A do painel da direita). Sob condições de redução, ambos a ascite 3M7 (faixa D do painel da esquerda e faixa E do painel da direita) e o anticorpo 3M7 purificado (faixa E cio painel da esquerda e faixa B do pairei do meio) imunop-rsci-pitaram, mais uma vez, um só componente principal de 20 COO dal tons. Sob as mesmas condições de redução, o Igd de ratinho, do erniredo, não precipitou qualquer componente significativo (faixas F dos painéis da esquerda s direita s faixa C do painel ã mo: o) enquanto que o mAb ar«fci-HLA-DR imunoprecipitou as su’:-unidades a s β dos antigénios HLA-DR (faixa A do painel do msio e faixa D do painel da direi tal. Lstes resultados mostram que c .de__ artic-enio/SU/ compreende uma só cadeia ds polipêptido com ua peso molecular aproximado de 20 000. Mão se observou nenhuma diferença significativa entre os antigénios/^3M7 de três amostras da HLL (duas amostras de CLL e uma amostra ds iinferna não-Hodgkin). Cor 3se no facto do peso molecular ssr 20 COO e no facto de o -24- de glicose te génio/ Sb7 an igénio/SM7 ser' imunoprecipitado de misturas ds lactes por cro«satograria de afinidade Lcbd o anti cros ignavo por ‘ά¥ΑΌ, :a cica 1totóxica específica da imunoconjyga4os Contendo SA7 te imunoconjugados foram preparados por conjugação eovalsr.is àAb pv"7 purificado eo® a subunídads cadeia-A da ricina, aaa toxina de planta-. A ricina é composta por doas 3 ub uni da doa ligadas por dissulfito, i*e„, cadeias A a 5, A cadeia B é u;.=a
Isctino que se liga a galactoss presente na suparfície de 1.00: •‘•esta variedade da células, A cadeia A é um enzima que inibe, cataiicamssits s irreversivelmente, a síntese ds proteína no citoplasma das células, por acção do ASM ribossómieo. A eadsia-A da ricina (RA) não ê, psr _ss, u® agente ri totóxico eficaz contra as células alvo intaotas, por causa da sua incapacidade dê sa ligar eficazmente às superríeies da célula a da atravessar as membranas celulares, Mo entanto * a RA fcorna---se. sfeetivamente , cito tóxica quando levada ao citoplasma das células alvo, por um veículo de distribuição apropriado, tal coso a cadeia-Ξ da ricina e um anticorpo apropriado, Mo entanto, a li atribuição da RA pela eadeia-B da ricina às células alvo, leva ã morta não seleetiva de, eventualment©, quaisquer células c’e .'•a. -avaros, porque a eadeia-S da ricina se 3íga, ever«tualments, a tocas as células de mamíferos, A aciividads citotóxica dos conjugados SM7-RA contra duas linhas ds células de !-ILL expressando ÊR20, SALL-1 s HALK-é (var ”'abõla 1), e uma linha ds células lehikaca não expressando 2R2C, ds controlo, á r©sumida na Tabela 3. SEQUE TABELA 3 -25-
TA3ELA 3
Aotivi:A-;A citotõíílca especifica de imunoc-onjugados pr udjp· ib·: dé--.. cD.'3uc:açâo de mAb 3M7 purificado à cadeia-A da ricina (:ΐΑ) de
Aa cél ulas NftLM-6 e SALL-1 expressando SP20 (anbigénio/ SA‘7] a células lebikaws de controlo não assando SP2Q, forca
cultivadas: s3pa:*adamsnte em alvéolos individuais cl 3 ua& placa ,A ,. 1 ·% . - d. da ^ 5“-1 jfy 'CF* XjGA IC^iCO _ Π£ι í; Cl £. ^C0d-d"-'i:.0_ ·* -o- - presença de conjugados 3N7-RA (2 X 10 ~M;„ Os valores obtid; a cabia dos triplicados ± o desvio padrão. células CJpi7_Ό £·, Número de células viáveis 210““^ Início 1 dia 2 dias 3 dias 7 dias uALL-l f*. 75±0 105±9 200âll 339±21 d -· T’,% d- * U« a wb:u- - .·. 2710~SK 75±0 1,4±0,6 GàO 0±0 G±0 :,vu 75±0 106±6 192±12 2h7±1I 514±3u 2:210-% 75±0 25±4 G,9±0,2 OâG OâC- Icbikaua 0 75±0 120±7 Í93±10 291±21 Λ 2ΑΤ7,·.^Α r pejq-Bp 75±0 156±24 271±15 3d4â21 472*21 depois de cultivadas durante 2 dias na presença d* ;ctcoadas SÍ-.I7-RA, 100¾ e 99,5¾, respaetivamsnés, das células oALd-1 a NALH-Ó, foram mortas enquanto· qua não st observo · :p.'3lc;CiV morte signlf icativa das células Xchikawa da contrai :=-Aspeis da cultivadas durante 3 e 4 dias, na pr esença de 'vviuga;!vS 3N7-RA, ambas as células SALL-1 e MSLM-6. fora-, eo.;:;pietaaeris mortas, enquanto que não se observou qualquer sor Ac itgrv'-:' :-ccvc: das células Ichikaaa (vsr Tabela 3),. Ester r asattuaos castras, claramente, que os conpugados 3N7-RA íaíPu. rilcotbrcjrts, células HLL que expressam QP20, um artigénio -ie’’irdd-v por SK7. Além disso, a aetivida-de eitotóeics de uajogadas ΒΗ7-ΡΆ á extresaments potente. comparada cc a a
-U.O- ar li vida·;! e eito tóxica dos conjugados RA de outros ®Abs, *. g., Câncer Research 42=457-464 (1982) e Câncer Research 40:4675-4688 \1988). Os conjugados RA de mAbs necessita®, geralmente, r esença de uai poteneiador apropriado para matar-s® , ef ioazmsrié, as células alvo s-g,_ Câncer Research 48 = 4675-4680 (1,988), t iíKportarsts notar que os conjugados SM7-RA matam fortam/ente células de tumor na ausência de quaisquer poteneiadorss tais co^n r UI-UCl e a siioneíYsína.
Lfe& aproximação prometedora para o tratamento da KLL, é a transplantação da medula óssea de pacientes que receberas radioterapia s quimioterapia agressivas em dose elevada, ã aplicação desta, aproximação, tem sido, no entanto, limitada, pc--que a maioria dos pacientes não possuem doadores adequados de medula óssea normal. Um msio de ultrapassar esta limitação, seria cear uma transplantação autóloga de medula óssea, com a condição do cus a medula óssea do paciente canceroso possa ficar livre da cá'vias de tumor in vitro. Sob este ponte ds vista, uma vsí que o dt arti-cL.L, 85M7, gerado de acordo com o processo do preserla ir v-nlo, mostra ligação sslectiva a células ds HLL in vitro, ras não reage, ou mostra, apenas, uma reactividada pequena, ccm c - u j. as . d medula óssea normais, pensa-se que, o anticorpo vonoclonal 3H7 ou' 8M7 conjugado com um ou mais dos váriee compostos e agentes citotóxicos anter iorsvente referidos aqui, serão extrsmamsnte úteis para a exterminação in vitro de células de tumor da medula óssea de pacientes com HLL.
Um método apropriado de tratamento para ss obter a exterminação in___vitro das células de tumor nos pacientes com leucsmia/li;ύ?οϊλ&, usando o mfib SH7 ou um fragmento reaetive dv xr-e .-o.^iscr^ na reísíocso de esporados de ®s.xjis óssea -j.o pacienta a ser tratado, que contêm células da leucemia e/ou de 1 inferna, contactando, in vitro, os aspirados de medula óssea cor o ®Ab ou um seu fragmento reactivo para exterminar as células de
IwUcemia e linfomã, ficando, assim, os aspirados essencialmande l:'“ro.ç da células de leucemia s 1inferna. 3 rsintreduzindo cs de aspir ados tratados no paciente através ds técnicas/ trar-spiants oc
*^,—7 OSdLO.a OSSSS: COnheC 2.C;3S. outra aplicação terapêutica ispcrtarte «t;s ««fita anil- ~rth, s o ssu uso na seroterapia, Durarta os últimos anos, vc -úoaro ds investigadores utilizaram qAõs de ffiuriti© par'a e seroisoapia de pacientes oLL por infusão, cu de outra ronca. ir trctUilíido uma quantidade cito tóxica destes mAbs em tais pacientes, como, por exemplo, através do fluido vascular 3/ou, '«2.5" 5c íáíírSn te, ' nos locais do tumor. Em" -ora estas tecrtati vos terapêuticas não fossem, gera Isente, bem sucedidas na iíiduçã·;:· do reoissão completa nos pacientes tratador, elas fornecem ura informação importante para a elaboração dos protocolos futuros de seroterapia. Par ticularmente, pensa-se que a utilização de Ité:noconjogados em vsz dos mfíbs expostos, não conjugados, pode: á ser eficaz paras ultrapassar muitos dos problemas, presente ?: -v, associados â sarctsrapia. Como referido anteriorsente em relação i transplantação de medula óssea, agentes citotóxicos, drogas, toxinas, ra-dio-isótopos 1 ipc-sscmas e muitos outros agentes, podou ser ligados dirsela ou indirectamente a ®Ats anti-HLL apropriados -ca preparação de tais imunoconjugados para seroterapia.
Adieionalments à utilização dos imuncconjugados anteriores, j;Vi n-.a o tipo de anticorpo híbrido, que foi produzido· por resderia genética ou por reformação, chamados "antic :o„, os :p.:ioér icoo", pode, também, ser acoplado a, ou incorporar cAb S07 -c 00 ssu fragmento activo, par-a utilização sm procedírentoo oerotsrapêuticos. Os anticorpos quiméricos que combinam regidos variáveis do íaAb ds roedor com regiões constantes de anticorpo hccoro·, possuam duas vantagens primárias em relação 00- ar. ti corpos convencionais de animais, Primeiro, as funções of se toras podem ser seleccionadas como dsssjadc, a segundo-, teo sido referido o uso de isótipos humanos sr vez de animais pa-a mini mis ar as respostas antI-globul i na durante a terapia ,:or ocítar anticorpos anti-isotípicos. Esta tecnologia envolve a Ouvorporação do sitio de ligação do an ti génio de roedor a : a:d.cor:.cs da humanos, por transplantação do domínio variável -ritciro ee, apenas do sc'Cro de legaçao da οηονοοηζο de O:, entie :>rpo de roedor, A produção de anticorpos quimér icos foi -28- relatada sm Proc. datl, Acad, Sei, USA, 81 s6S51 -6855 (1984 datora 332:323-327 (1988) e BioTechniquss, Volums 4 dSt, 3:214-2 (1°”-·-·)- '"-c . tsMbêm. contemplado coíao fazevdo parte c'o âmbito ,v esseta invento, ia anticorpo epimérico produzido pc-’ eiiganhar genética que incorpora o «sfíb aqui rsferidtq na sua totalidata ua ,ío·teí que pode ser utilizado com sucesso- no tratamento oca vasta variedade de 1 i nfornas e leucemias humanos.
Uea dos aAbs ?""d; de “ tararia oeoaoo -taarr arve: outra aplicação terapêutica, potencialosnte, importar anti-HLL, será a preparação de anticorpos anti-idíóti imagem interna" (designados por Ab2.S) s usos do Ab2.8 de prevenção de HLL. 0 Ab23 que simula o antigén ao tumor original pode ser útil coso una vacina anã r induzir uma imunidade protectora contra a KLL, ou deter®!nants idiotípico, é uma porção antigénica ~po que envolve a região variável da molécula. Dentro 'crpão variável está c sitio onda o antigénio se li especial eamsnts ao anticorpo. 0 idiótipo ê, muitas vros definido por um anticorpo anti-idioiípieo {anii-lEd}, pelo que 1.?!'-i-tipr se comporta como um antigéniG s induz a produção -.rticorpos contra si próprio.
Ab3. G Abc pode sic:j lar Em csr tos caso» onde a nant-es para a indução 0 mecanismo usado para explicar coso ê que ua anti-Id .vager intsrna pode simular um antigênio de tumor s reprsssnt :u; vacina, é coco se segue. Um hospedeiro produz uca resposta v : ticorpo (Abl) contra o tumor. Uma resposta anti-Abl (ou Ab i b se·- induvida. imunizando animais apropriados (i. e varinhas, ratazanas- coelhos, cabras, carneiros, vacas, cavalo ; 1c,; cc£ Abl, Alguns Ab2 que simula® a estrutura do antigénir original, podem ser referidos como um anti-td de iuag b terra (Ab22) e pode® ser usados ccm um substituto do vvbigéu ' · bvvvr originai, o Ab2|8 pode ser ussdo para imunizar u® aria v-spsdeiro adequado para produzir i ''ri s ligar o antigénio do tumor. ,333 330:-los antigéni os multi-deter 'aurbbida de protecção, uma mistura de vários Afo2p pode ser usa :·η:ο vacina, Reeentemente, o ir<vsn tor eu questão, preparou v.t i gér-j c assoei ado a HLL T simuland) Abafl, designado por 223 -29-
defini do por mftb St!2 como referido sra -J. imoyíiol, 141:1509-1403 ·»* q i,pç. ,rp. ,íç, X. “ J s J. Iraraunol. 139:1354-1360 (1 987), as descriçoas doo tos· são aqui incorporadas como ref sreneia, ESCa ?,íÇOdWr f-- d>oo gerou o mAb 3N2 simulando Ab3 (Abl) [7, Iraraur :ol, 141; 139c.-’ (7985)], s anticorpos anti-Id cie iaagem i fito=~ na (:lb20) podem. tnotésv ssr preparades imunizando ura animai hospedeiro apropriado v-:a -a'·;’:·· S?v7 ou fragmentos de Sb?, 0 Ah 2,6 resultante, sssir« produzido, símuls-ia o 8720 e pode ter potencial para induzir tú.:nldãca protacfcot1 contra ”LL em humanos, Adie:.cnal mente, o -:t-2S ou um seu fragmento preparado asando SN7, ou fragmentos de 8517 podeu, também, ser usados para i mu rd. 3 ar animal hospedeiro iJsquade para produzir anticorpos Ab3 simulando a recetividade do -Ç\~ ••i”*/ as nôbs slo, também, conhecidos como bastante úteis para o ai agnóstico de cáries tipos ds tumores malignos, A presença de e ?7 !.d as de linforaa ou leucemia num paciento, pode ser determinada contactando um espécime ds célula de tecido biológico apropriado, raaaoido do paciente, ccm uma quantidade uee"ida de mA-bs, c-u fragmentos rsactivos ds mAbs, s determinando se ocorre qualquou-eaeçSo entre mAbs ou fragmentos e c espécime de célula dc paciente, asando técnicas conhecidas=
Partieularments, os mAbs estão, eorrentemants, a ser usados na localização ds antigénios. Os processos de radicõmageu de 1....cores são bem conhecidos na arte e envolvem a conjugação de n;Ab cu seus fragmentos reaetivos com uma quantidade marcadora ds iv composto de radioimagem conhecido, e a introdução de conjuga In ideniifiçado, assira, formado no fluido vascular ds um hespadaiov· nu uv ciente. Após um intervale de tempo suficiente para permitir ves o conjugado marcado reaja com as células alvo de leucemia/linfoma dc paciente, este paciento é sujeito a processos ds ouculooaoso eintigráfica, para ctetecção da localização doo nótulas de 1 sucsmia/1inf orna ou sítio(s) do tUitor . ‘1 oAb SH7 foi conjugado com radioactivo g dsseoU ia—os
pso o SM7 marcado cora ~^-'I resultante é estável, O conjugado u’C -30- -30-
rormV-? o sua actividads de anticorpo,como ór.ti corpos completos tal 'como os f roxoiertcs recetivos incluindo frag-rae-ntos Fafo, -F(abb )2 3 Fv, poetem sor conjugados mr agonies radioactivos tais como In-111 ou 1-123 para idantif Leamn/ /locsliiam® com sucessoy as lesões de linfcsa ea pacientes cor cancro. Tais conjugados podsm3 também, ser úteis sa terapia por que os agentes raclioactivos são conhecidos coiac senda cbioióxleps para células ete tumor. Estas técnicas permitem a descnderla e trataíiiento de tumores não suspeitados tais como acjjs.lss nus ocorrem nos nódulos linfáticos. ^inalmente. este invento tasmbéia, ccnteínpia a produção de and -rd'7 ctentro de ua conjunto de diagnóstico parai: usar na pesquisa da .'ísorp: da linforsas e leucemias em pacientes. 9sreloenis, tal paesaro dte pesquica snvolvs o contacto:' ds um espécies cte célnln :!o tecido biológico apropriado (i.e„. sangue, nedula óssea, nódulo Z inf ático, etc.) removido do pacienta testado, com una óuantidáde medida cte mAb 3òi7 ou um fragmente- recetivo de 3t"7 a, -'apo-m, a determinação por processos conhecidos da ocorrência de una receção cte ligação entre o mAb ou fragmento, con o espécime de pseienis. Com o objeetivo de visualizar a - receção, egentee nsrcadórss adequados ou corantes são, algumas vezes, conjugada-ao mnb ou fi-agivssnto. 0 reagente d® conjugação pode, também, incluir us ou mais aditivos típicos conhecidos na arte coco, por evsapió, agentes tampão, agentes para reduzirsn i ntsrfsrênci as de fundo e estabilizadores» Túmido empacotadas como parte de un ccnjunto de diagnóstico, neles notemades poetem ser pr-ovld®rociados dentro é-o conjunto para se: matizar o teste diagnóstico. Tal conjunto pode conter un os-si o ;:ara obter o espécime de célula de tecido tal como a seringa? z mb ou fragmento, conjugado ou não conjugado, e/ou um agente .mmader s agentes auxiliares, tais coco lâminas, tubos -"te. T é~scr±ção referida a os dados aqui apresartades dnarsl-vr: cus o novo zteb produzido d® acordo com sste inverto, cte-slgnom- Μ- r Sn?, mostra rsaeiividads sslsctiva para usss variedade IcCas cia leucemia-iin?©í«a cís humanos e define c® antigénio voe®ia único designado por QP20, Os resultados dos testes q >!=; rdío Sdv contra uma larga variedade do espécimes de oélul 'tais s malignas, sugere® a utilidade do 8M7 no 08330031100 atasoento de pacientes com cancro -que serre® de uca lar ric-do.de de leucemia-!infornas, A linha de células designada por 7Ó-1Q9. L- w 2. -dccí^Il trhc jL ^_dd-.'de. c-s halo de 1989 na American Typs Ciílturs Collection. 127 rilavn Drivs, "octville.. Maryland 20G52 llS.t, e fei-l ritod-oh:' ..· nútsro ds acesso ATCC HB 10151... cePvra coneretíoaçees específicas -do invento tenhan si ui descritas para fins ilustrativos, várias sodi^icações pod r aparentes para aqueles peritos na arte, sem desvios pírit·::· 3 âmbito deste invento. Entenda-se que o pressn vente está limitado, somente, pelo âmbito · das rsivirdieaod

Claims (10)

  1. -32- R Ε I V i N D I C Q g £ S Ί ' “ Processo cie preparação cie um anticorpo moncelcnal cu fragmento ds anticorpo monoclonal. que reage com Uffi oy .tais espécimes da células tís leueemia/1inferna salaceionadas tíe encre c-grupo c;c3 consiste de células de leucemia linfocitica crónica 2 de tucano»; células de leucemia prolin 0 Ο*,.-A íílCihA i células de leucemia de células Hairyi células cie leucemia 1 infoblãstica aguda nao T; células da leucemia mieloeíiica aguda; células ds leucemia mielomonocítica agudaI células de leucemia monocítica acuda} células de leucemia mielocitica crónirr ~ células de 1inferna não KodgRin, caracterizad© por compreender, a cultura de uma linha de células de hibridoma, designada por TÓ-1S9, nua meio adequado. e a recuperação do anticorpo monoclonal ou dc seu tragaentc. do sobranaclante da cultura da referida linha de células de hibridorna.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação í? car ac ts;' 12adc por a referida linha de células de hibridorna designada por 7ó--139- ser gerada pela fusão de células de mieiorna de ratinho coe células oo baço de um animal adequado, imunizado com orna preparaçãe de antigênio de leucemia não T, isolada a partir de membranas celulares de células de leucemia iinfoblástiea aguda ; . CfcSs jtdl í iUPÍ * n - Processo de acordo com a reivindicação 2, car ac ter i zado por a referida preparação de antigéni© comprssntísr um aatigénio com um peso molecular de cerca de 20 000, designado per Sí-:20o 3 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterliado gor o anticorpo monoclonal ou o fragmento não reagir ec-m as células de leucemia linfoblástica aguda T.
  3. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1s caracteriçado por o anticorpo monoclonal ou o fragmento não exibir reactividade significativa com células T normais, granulócifos, erítroeitos cu piaçustas, humanos„ 5 ·- Processo de acordo com a reivindicação 1, car ac ts?' i zado per o acricorpo ou fragmento monoclonal ser da subclasse Ig61-k- -33-
    / ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterirado por o anticorpo monocional ssr designado por SM7,
  4. 8 - Processo para determinação da existência de células ds linfoma ou leucemia num paciente, caracterirado por comprsencfer, o contacto de um espécime de tecido biológico, apropriado, removido do referido paciente, com uma quantidade medida de anticorpo monocional ou de fragmento, preparado de acordo com a rsivindicação 1, e a determi nação da ocorrência, ou não, Ge qualquer receção entre os referidos anticorpos monoclonais cu fragmentos s o espécime do paciente.
  5. 9 - Processo para. tratamento de medula óssea de pacientes cós leucemia - linfoma utilizando o anticorpo monocional ou fragmento preparado de acordo com a reivindicação 1, raraeisri zado por compreender o contacto in vitro de aspirados do medula óssea, obtidos de um paciente a ssr tratado, contendo células de linfoma e leucemia, separadas ou combinadas, com o r*.;'ar ido anticorpo monocional ou fragmento para eliminar as células ds leucemia e linfoma,tornando-se assim os aspirados ííseneialmente isentos de células de leucemia e linfoma.
  6. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9 , caracterisa-do por o referido anticorpo monocional ou fragmento ser, em primeiro lugar, conjugado com um composto ssleccionado de entre o grupo consistindo ds agentes citotóxicos, drogas, toxinas ou seus fragmentos^ hormonas, enzimas, lipossomas, agentes radioacfivos, ccrantes, agentes fotodinâmicos, anticorpos ou seus fragmentes, anticorpos anti—idiotipo ou seus fragmentos, anticorpos quimár >1-cos ou seus fragmentos, e outros anticorpos raoncclonais ou seus fragmentos.
  7. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 9, csracterica~ -ã:> por o referido fragmento ser ss1ecciona-do de entre o grupo consistindo ds fragmentos Fab, F(a!bG)2 ou Fv.
  8. 12 - Processo para a produção de uma linha ds células de di*v-idofsa designada por Tó-lâ9, caracterizado por compreender a fusão de células de misloma da ratinho com células do baço da um animei adequado, imunizado com uma preparação ds antigénio de —0*5-- leuceraia células de não ΤΙ encerai a isolada a partir de membranas linfoblástica aguda Iiuraana, celulares '-r- i5 - Processo de preparação de conjugados de anticorpo coiioclonsl ou de fragmento de anticorpo monoclonal preparado de acordo com a reivindicação 1 e 7, caracterizado por o referido anticorpo ou fragmento ser direeta ou indirectaraenie ligado ou oorapleoado cora ura composto seleccionado de snirs o grupo consistindo de agentes citotóxicos, drogas5 toxinas ou seus fragmentos, hormonas, enzimas, iipossomas, agentes radioactivos, corantes, agentes fotodinâmicos, anticorpos ou seus fragmentos, anticorpos Cãti-ídiotipo ou seus fragmentos, anticorpos quiméricos ou seus fragmentos s outros anticorpos monocionaís ou seus fragmentos..
  9. 14 - Processo de acordo com a rei vi ndicação id, caracter i z&~ -0:0' r'I^Jd “ o fragmento ser seleccionado da entra o grupo consistindo dcs fragmentos Fab, F(abp)2 ou Fv. 1.5 - Processo de preparação de ura anticorpo monoclonal ou fragmento do referido anticorpo monoclonal que: a) reage cora células de leucemia liníocitica crónica 3 humanas; células de leucemia prolinfocítica Ei células de leucemia de célula hairy; células de leucemia linfoblástica aguda não-T1 células os leucemia mielocítica aguda; células de leucemia mielomonocítica aguda; células de leucemia monocítica aguda; células de leucemia mielocítica crónica e células da linforaa não-Hodgkín; b) rSo reage com células de leucemia linfoblástica, e c) não reage signifieativaments com células I normais humanas, graoulocitos, eri troei tos ou plaquetas, caracier í zo-õc por ecHiÇ-reeisder, a cultura de uma linha d® células da hibridoraa, num meio adequado, e a recuperação do anticorpo monoclonal ou do se a fragmento, cio sobre nada n te da cultura cia referida linha de células -cie hibridoma. té - Processo de acordo cora a reivindicação 15, caracterizado per a referida linha ds células d® hibridoma ser a linha de células da hibridoma, designada por 16-165, gerada pela fusão de -35- células de misloma da ratinho com células do baço de um anisai adequado, imunizado corn uma preparação de aniig-énio de leucemia são T, isolada a partir de membranas celulares de células is .·,éucéííáa linvoblásticâ aguda humana,
  10. 17 - Processo de preparação de conjugados de anticorpo sc-roclonai ou de fragmento de anticorpo monoclonal preparado de acordo com a reivindicação 15 s caracterizado por o rever ido anticorpo cu fragmento ser dirscta ou indir ee tafisente ligado cu ccsplavadc com um composto ssleceionado de entre o grupo consistindo de agentes citotóxicos, drogas, toxinas ou seus fragmentos, hormonas, enzimas, iipossomas, agentes radiosotivos, corantes, agentes fotodinâm 1 cos, anticorpos ou seus fragmentos, anticorpos anti-idiõiipo ou seus fragmentos, anticorpos quiméricos ou seus fragmentos e outros anticorpos monoclonais ou seus fragmentos. Ϊ5 - -recesso de acordo com a reivindicação 17, caracterira-lo por o fragmento ser seleccionado de entre o grupo consistindo dos fragmentos Fab, ou Fv. t JUN. 1^90 Por HEALTH RESEARCH, INC.
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