PT94145B - Processo para descontaminacao de culturas de celulas que contem micoplasmas - Google Patents

Description

DESCONTAMINAÇÃO DE CULTURAS DE

CÉLULAS QUE CONTÉM MICOPLASMAS.

A presente invenção refere-se a um processo para a descontaminaçâo de culturas de células que contêm micoplasmas. De acordo com o presente processo, as culturas de células infectadas com micoplasmas são, numa primeira fase, submetidas a um tratamento com antibióticos e em seguida, numa segunda fase, são eliminadas as células ainda infectadas com por meio de uma solução de 6-metilpurina-desoxirribose.

Os micoplasmas são microorganismos semelhantes a bactérias que não sintetizam uma membrana celular nem uma cápsula mucosa. Estes microorganismos multiplicam-se quer em culturas de células (citoadsorvidas) quer em meios isentos de células, e uma característica dos micoplasmas a necessidade de colesterol ou de outros compostos de esteroides.

A contaminação de culturas de células através de micoplasmas é um problema largamente divulgado na tecnologia célular. Foi documentado pela primeira vez por Robinson (L.B. Robinson et al., (1956), Science, 124, 1147). Entretanto descobriu-se em escala de laboratório em culturas de células em crescimento permanente uma taxa de contaminação média de cerca

E.I

de 15?. Nas fermentações em escala técnica podem ser atacadas por micoplasmas até 90? das culturas. Isto coloca um grande problema para a produção de proteínas recombinantes em biotecnologia, uma vez que os produtos farmacêuticos sintetizados em células animais têm de ser absolutamente isentos de antigenes de micoplasma.

As principais origens de infecçâo são constituídas por soros contaminados e culturas de células infectadas. 0 contágio realiza-se normalmente por infecçâo de goticulas ou aero, 6 9 sois. Uma cultura infectada contem entre 10 e 10 unidades de formação de colónias (colony forming units = CFU) por mililitro de meio condicionado sem que se registasse qualquer turvação do meio ou um cheiro característico.

A presença de determinadas estirpes de micoplasmas conduz, devido a uma intensa produção de ácido, a efeitos degenerativos em culturas de células. As estirpes de micoplasmas que ocorrem com mais frequência como M. arginini, M. oral, M. hyorhinis e A. laidlawii proliferam sem que se observem modificações morfológicas da linha de células contaminada. No entanto descobre-se frequente nas culturas contaminadas por micoplasmas aberrações de cromossomas e um metabolismo celular modificado.

Na prática existe entretanto uma série de sistemas de ensaios com a ajuda dos quais se pode comprovar uma contaminação de micoplasmas. Uma prova fácil e sensível, também para micoplasmas não citoadsorvidos, depende da citotoxicidade mediada através dos micoplasmas de derivados de 6-metilpurina.

Esta citotoxicidade encontra-se na base da enzima fosforilase de adenosina, a qual é sintetizada nos micoplasmas mas não em células animais. Em presença desta enzima a 6-metilpurina-desoxirribose (6-MPDR) ou a 6-metilpurina-ribose (6-MPR) são cindidas, libertando-se 6-metilpurina (6-MP), que constitui a substância tóxica para as células (G.J. McGarrity, et al. (1982), Exp. Cell Research, 139, 199). Segue-se a lise da cultura de células contaminada com micoplasmas, uma vez que mesmo concentrações tão baixas como 5 uM do produto da cisão são tóxicas para as células. Uma vez que todas as estripes de mico- 2 -

plasmas relevantes contém fosforilase de adesosina são também abrangidas com este sistema de ensaios todos os meios de contaminação possíveis.

A descontaminação de culturas que contêm micoplasmas tem sido considerada até agora como difícil e dispendiosas. Uma possibilidade é a passagem da cultura contaminada em ratos pelados. Este processo é empregue em culturas de hibridomas, mas exige grandes dispêndios técnicos. Em outras espécies celulares (p. ex. células BHK) existe também o perigo de se poderem perder as células por este procedimento. A segunda possibilidade encontra-se no tratamento com diferentes antibióticos. Existe uma série de substâncias que são relativamente bem suportadas por células animais e com as quais os micoplasmas podem ser eliminados pelo menos por um curto período de tempo. Muitas vezes as diferentes estirpes de micoplasmas são apenas reprimidas no seu crescimento de maneira que depois de algumas passagens a cultura encontra-se de novo contaminada. Além disso no emprego repetido encontra-se o perigo de se formarem resistências contra os diferentes antibióticos.

A presente invenção refere-se por conseguinte a um processo para a descontaminação de culturas que contém micoplasmas, em que, numa primeira fase são empregues antibióticos activos contra micoplasmas. Numa outra fase são em seguida eliminadas as células ou clones de células que contêm ainda micoplasmas através da cultura em presença de 6-metilpurina-desoxirribose, de maneira que apenas restem, isto é, apenas sobrevivam as células ou clones de células efectivamente isentas de micoplasmas. De preferência são empregues como antibióticos tiamulina e micociclina e a 6-metilpurina-desoxirribose numa concentração de 50 jiM.

A presente invenção refere-se ainda às culturas de células isentas de micoplasmas obtidas deste modo bem como ao seu emprego, especialmente na preparação por tecnologia genética, de proteínas estranhas nestas células. A presente invenção é elucidada adicionalmente nas reivindicações e exemplos.

Exemplo: Descontaminação de células de Hamster que contêm micoplasmas

As células de roedor representam um sistema de expressão preferido para a expressão de proteínas recombinantes heterólogas. As células mais frequentemente utilizadas são células de CHO (ovário de hamster chinês; chinese hamster ovary) e BHK (rim de hamster bébé; baby hamster kidney). Ambas as linhas de células são culturas estabelecidas e são já utilizadas para a produção de proteínas recombinantes em escala técnica.

Com um dispendioso processo de transfecção, selecção e clonagem, isolaram-se clones de BHK e CHO, que segregam uma determinada proteína (p.ex. factor VIII:C ou AT III). Em alguns destes clones foi provocada uma contaminação por micoplasmas.

A fim de não repetir mais uma vez o demorado processo de transfecção e selecção foi aplicado o seguinte processo de descontaminação: as culturas de células contaminadas foram em primeiro lugar tratadas alternadamente com duas passagens cada uma com os antibióticos tiamulina e minociclina (Sebio, concentração segundo as indicações do fabricante). Em seguida as células foram tratadas em 4 passagens sem antibióticos. Após verificação em ensaios de detecçâo de micoplasmas as células isentas de micoplasmas foram isoladas sob a forma de clones. Para isso as células foram inoculadas em limiting dilution com uma densidade célular de 2 células/alvéolo e 10 células/alvéolo numa placa de 96 alvéolos. Verificou-se ser suficiente a utilização de 5 alvéolos por cada diluição de cada cultura. Após uma fase de crescimento de 1 a 2 dias adicionou-se às culturas 5 pl/alvéolo de uma solução 1 mM de 6-metilpurina-desoxirribose (6-MPDR) (concentração final de 50 pM/depressão). Em seguida as células foram incubadas durante 5 a 6 dias (até se alcançar a confluência) com esta solução.

As células ainda contaminadas, embora fracamente, com micoplasmas citoadsorvidos morreram com este tratamento.

Em seguida as células foram transferidas para uma placa de 24 alvéolos e mais tarde para uma placa com 6 alvéolos e foram

mantidas sem 6-MPDR.

Após este tratamento foram realizados de novo diversos ensaios de detecção de micoplasmas (cultura microbiológica e citotoxicidade mediada por micoplasmas). Perante resultados negativos os clones foram em parte congelados e em parte mantidos em cultura. Após 5, 10, 15 e 20 passagens as células foram novamente examinadas para verificação de contaminação por micoplasmas, tendo sido sempre possível determinar um resultado negativo em todas as culturas que foram tratadas pelo processo acima descrito.

Paralelamente ao procedimento descrito as células foram tratadas só com os antibióticos acima descritos, isoladas sob a forma de clones e tratadas sem ser em presença de 6-MPDR. Em seguida as células foram congeladas e em parte foram mantidas em cultura para controlo. Após 5, 10, 15 e 20 passagens foram realizados igualmente os ensaios de detecção de micoplasmas sendo possível comprovar a reincidência de micoplasmas em cerca de 30 $ das culturas após a 10ã. passagem. Nesta experiência as células foram mantidas em condições sob as quais eliminava a possibilidade de uma reinfecção.

Este processo foi aplicado também em culturas de células humanas (células Hela e KB) bem como células de macaco (células COS) com o mesmo resultado.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - 1§ Processo para a descontaminação de culturas de células que contêm micoplasmas caracterizado por se tratar a cultura numa primeira fase com antibióticos activos para micoplasmas e numa fase que se segue a esta com 6-metilpurina-desoxirribose.

   - 5 - 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por os antibióticos utilizados serem a tiamulina e a micociclina.

   _ 3§ _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por se utilizar a 6-metilpurina-desoxirribose numa concentração final de 50 jjM.

   _ 4a _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 , 2 ou 3 caracterizado por após o tratamento com antibiótico se utilizar o tratamento com 6-metilpurina- desoxirribose sobre culturas clonais esporádicas.

   - 5ã _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 , 2 ou 3 caracterizado por as linhas de células descontaminadas terem origem humana ou animal.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 26 de Maio de 1989, sob ο N5.