PT93755A - Processo para a modificacao de actividores do plasminogenio - Google Patents

Description

O presente invento está relacionado com formas de activadores do plasminogénio, sua preparação, preparações farmacêuticas que os incluem e anticorpos que os reconhecem especificamente. A activação do plasminogénio (PA) é necessária intravascularmente para a digestão de coágulos de fibrina e extravascularmente para a regulação de interacções entre superfícies celulares e os componentes proteicos da ma-trix extracelular e a membrana de revestimento. 0 produto da reacção PA, plasmina, pode degradar a fibrina, protoglicanos, fibronectina, laminina e alguns colagénios; em adição, ele é também capaz de activar colagenases latentes, o sistema PA é composto pelas duas enzimas de activação do plasminogénio, uro-cinase (u-PA) e PA de tecidos (t-PA) e por inibidores específicos de PA (PAI-1 e PAI-2), Em adição, foi identificado um re-ceptor específico para u-PA. Se bem que a função da fracção ca-lítica destas proteases seja melhor compreendida, a dos domínios reguladores é menos clara e apenas agora se começou a acumular informação. Por exemplo em u-PA, o domínio do factor de crescimento é responsável pela ligação ao receptor de u-PA. Em t-PA, o domínio "em dedo" e o segundo domínio de ansas múltiplas medeiam a ligação da enzima à fibrina.

Estes sistemas permitem a formação de plasmina, tanto em solução como a ligada a superfícies. Para este último, as mesmas células podem ter receptores para os activadores do plasminogénio e plasminogénio como é o caso das células humanas U937 e das células HT1080. Ainda, nas células HT1080, o u-PA ligado a receptores é capaz de produzir plasmina ligada a receptores. A proteólise dirigida por plasmina de superfície parece ter várias pecularidades: a) pro-u--PA ligado a receptores é activado pelo u-PA de duas cadeias com uma velocidade muito mais rápida que em solução; b) a plasmina ligada à superfície é resistente à antiplasmina <o(-2; e c) o u-PA ligado a receptores, por outro lado, é activo e acessível à inibição por PAI-1,,pelo menos em células U937.

V

u-PA é secretado como uma proteí na inactiva de 431 aminoácidos, pro-urocinase (pro-u-PA), a qual pode ser ligada a receptores se superfícies(u-PAR) e acti-vada por uma única clivagem proteolítica. Na linha celular maligna A431, todos os sítios u-PAR estão ocupados pelo ligando pro-u-PA produzido pelas mesmas células numa via autócrina. Resultados semelhante foram descritos para uma variedade de células tumorais humanas produtoras de u-PA.

Pro-u-PA é clivada entre o amino ácido 157 (Lis) e 158 (Ile) para activar a proenzima. A clivagem resulta na formação de u-PA de duas cadeias. Se bem que não conhecida em detalhe, pensa-se que esta clivagem altere a estrutura secundária e terciária da protease de modo a expor o centro activo e torná-lo acessível ao substrato (plasminogé-nio) e aos inibidores (PAI-1, PÀI-2, protease nexina, o(2"“macro“ glubulina, e outras). A clivagem de pro-u-PA no sítio de acti-vação resulta de facto numa alteração conformacional e no ganho de actividade de activador do plasminogénio, com substratos naturais e sintéticos.

Semi-vida de activadores do plasminogénio usados em terapêutica

Os activadores do plasminogénio (u-PA, t-PA, pro-u-PA, entreptocinase e seus derivados) são ou podem ser utilizados em terapia tromboembólica. Um dos problemas relacionados com esta terapia é a dosagem elevada necessária a qual é, pelo menos em parte, devida à eliminação muito rápida destes agentes. Razões possíveis para a curta meia-vida incluem ligação a inibidores específicos circulantes, ligação a receptores, internalização e degradação do activador do plasminogénio ligado a inibidores e/ou receptores . 5-

0s resultados apresentados nos

Exemplos 8, 9 e 10 mostram que pro-u-PA fosforilado está ligada a receptores, que a ligação ao receptor não é necessária para a fosforilação e que u-PA de duas cadeias fosforiladas apresenta um decréscimo dramático na sua sensibilidade ao PAI--1. Propõe-se pois: em primeiro lugar, que os activadores do plasminogénio fosforilados possam ter uma meia-vida maior do que os activadores do plasminogénio não fosforilados uma vez que não se ligariam a PAI-1. Em segundo lugar, que activadores . do plasminogénio totalmente fosforilados poderão ser empregues em terapia tromboembólica uma vez que, tal como os seus homólogos não fosforilados, eles podem ser activados, e.g. no caso de pro-u-PA nas suas formas activas de duas cadeias (ver Exemplo 2). Em terceiro lugar que activadores do plasminogénio totalmente fosforilados podem ser desfoforilados in situ por fos-fatases de superfície pré-existentes (Bailou e Pisher, 1986) ou por fosfatase naturais ou sintéticas ainda por descobrir. Assim, as proteases fosforiladas seriam inactivas na circulação, activáveis no local onde fossem necessários e resistente à acção de inibidores presentes na circulação geral.

No seu aspecto mais lato, o pre- , sente invento proporciona activador do plasminogénio fosforilado que está substancialmente livre de activador do plasminogénio não fosforilado. Tipicamente, substancialmente todas as moléculas de activador do plasminogénio têm substancialmente todas fosforiladas as suas fracções fosforiláveis. O activador do plasminogénio fosforilado de acordo com o invento pode ser obtido por separação do activador do plasminogénio fosforilado de uma mistura de activador do plasminogénio fosforilado e activador do plasminogénio não fosforilado, produzido por células procarióticas ou eucarióticas. Adequadamente, o activador do plasminogénio fosforilado pode ser obtido por: -6-

(i) cultura de uma linha celular humana <3U um activador do plasminogénio; produz (ii) isolamento do activador do plasminogénio assim produzido; e (iii) separação do activador do plasminogénio fosfori-lado a partir do activador do plasminogénio não fosforilado. 0 activador do plasminogénio fosforilado é tipicamente separado no passo (iii) por cromatografia, por exemplo por cromatografia de quelatação com Fe3+,

Pode ser usado um dextrano sintetizado. Por exemplo, a separação pode ser conseguida por cromatografia em coluna. Pode-se usar Sepharose. Tipicamente, o activador do plasminogénio está numa solução de pH aproximadamente 3. 0 pH pode ser ajustado usando ácido acético, por exemplo ácido acético Ο,ΙΜ. A solução é aplicada numa coluna. A coluna é eluida usando um tampão de fosfato de potássio. 0 pH do tampão é tipicamente de aproximadamente 8,0, Colhe-se o eluato de activador do plasminogénio fosforilado livre de activador do plasminogénio não fosforilado.

Como alternativa, o activador do plasminogénio fosforilado pode ser obtido substancialmente livre de activador do plasminogénio não fosforilado por fosfori-lação de activador do plasminogénio não fosforilado com uma enzima de fosforilação. Uma mistura de activador do plasminogénio fosforilado e não fosforilado pode ser tratada com uma enzima de fosforilação.

Os activadores do plasminogénio fosforilados de acordo com o invento são úteis como agentes terapêuticos nos casos trombóticos venosos e arteriais, como seja enfarte do miocárdio, trombose de veias profundas e cho- -7-

ques. É considerado que nenhum dos activaâbres do plasminogé-nio fosforilados se liguem a inibidores dos activadores do plasminogénio. Os activadores do plasminogénio fosforilados podem portanto ter uma meia-vida maior devido à sua resistência à acção de inibidores presentes na circulação geral.

Uma quantidade eficaz de activa-dor do plasminogénio fosforilado de acordo com o invento é administrado a um paciente que dele necessite. A administração a um mamífero, de preferência a um humano, pode ser efectuada potencialmente e parenteralmente de preferência intravenosamente. Tipicamente uma dose de 4 a 40 mg, por exemplo de 5 a 10 mg, do activador do plasminogénio fosforilado é dada parenteralmente. O invento também está relacionado com composições farmacêuticas compreendendo o activador do plasminogénio fosforilado de acordo com o invento e um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável. 0 activador do plasminogénio fosforilado deve pois ser apresentado numa solução aquosa esterilazada e apirogénica ou numa outra forma adequada.

Assim, realizações importantes do invento são constituídas pelo tratamento de u-PA, pro-u-PA ou t-PA com uma enzima de fosforilação, em particular numa cinase de proteínas, para fosforilar o u-PA, pro-uPA ou t-PA. A substância fosforilada pode ser usada do mesmo modo que u-PA, pro--u-PA e t-PA são usados no tratamento de e.g. doenças tromboem-bólicas e outras doenças conforme referido atrás. Como a meia--vida da substância administrada (e.g. injectada) é aumentada de acordo com os princípios atrás explicados uma vez que a inactivação da substância por inibidoras, (tais como PAI-1 ou PAI-2) é evitada pela fosforilação, a dosagem deve ser reduzida consequentemente.

Conforme é explicado detalhada-mente nos exemplos, encontram-se que pro-u-PA é fosforilado. -8-

Em particular, encontrou-se que a fosforilàção ocorre era resíduos serina específicos. 0 pro-u-PA fosforilado substancialmente livre de pro-u-PA não fosforilado foi obtido e clivado pela plasmina para formar u-PA fosforilado. Encontrou-se que, vantajosamente, o u-PA fosforilado não se liga ao inibidor PAI-1.

Assim, o presente invento proporciona pro-u-PA fosforilado que está substancialmente livre de Pro-u-PA não fosforilado. Tipicamente, substancialmente todas as moléculas de pro-u-PA têm substancialmente todas fosforila-das as suas fracções fosforiláveís. 0 tratamento do pro-u-PA fosforilado com plasmina dá uPA fosforilado que está substancialmente livre de u-PA não fosforilados, 0 u-PA fosforilado é resistente a PAI-1. 0 pro-u-PA fosforilado está portanto fosforilado num resíduo de aminoácido que assegura que o n-PA fosforilado resultante do tratamento do pro-u-PA fosforilado com plasmina seja insensível a PAI-1.

Poi de facto estabelecido que pro--u-PA totalmente fosforilado é fosforilado em dois sítios.

Cada sítio é um resíduo serina. Um sítio é o resíduo serina na posição de aminoácido 303. 0 outro sítio é um resíduo serina na posição 138 e/ou 139. Os números dos aminoácidos são de acordo com Verde et al., 1984. 0 peso molecular do pro-u-PA fosforilado é 47KD, conforme determinado por electroforese num gel de agarose. O pro-u-PA fosforilado não se liga a PAI-1. O pro-u-PA fosforilado de acordo com o invento pode ser obtido por separação do pro*-u-PA fosforilado de uma mistura de pro-u-PA fosforilado e de pro-u-PA não fosforilado. 0 pro-u-PA produzido pelas células procarió-ticas ou eucarióticas, por exemplo produzido em bactérias, leveduras ou células de mamíferos, é de facto uma mistura de pro-u-PA fosforilado e não fosforilado. Adequadamente pro-u-PA fosforilado pode ser obtido por: -9-

(i) cultura de uma linha cêlulâr1humana que produz pro-u-PA, por exemplo a linha celular A431 ou HT1080; (ii) isoladamente do pro-u-PA assim produzido; e (iii) separação do pro-u-PA fosforilado do pro-u-PA não fosforilado. 0 pro-u-PA fosforilado é tipicamente separado no passo (iii) por cromatografia, por exemplo 3+ por cromatografia de quelatação com Fe . Pode ser empregue um dextrano inter-ligado. Por exemplo, a separação pode ser conseguida por cromatografia em coluna. Pode ser usada Sepha-rose,Tipicamente o pro-u-PA é obtido numa solução de pH apro-xlmadamente 3. 0 pH pode ser ajustado usando ácido acético, por exemplo ácido acético Ο,ΙΜ. A solução é aplicada numa coluna. A coluna é eluida usando um tampão de fosfato de potássio. 0 pH do tampão é tipicamente aproximadamente 8,0. Colhe--se eluato do pro-u-PA fosforilado sem pro-u-PA não fosforilado.

Como alternativa, pro-u-PA fosforilado pode ser obtido substancialmente livre de pro-u-PA não fosforilado por fosforilação de pro-u-PA não fosforilado com uma enzima de fosforilação. Uma mistura de pro-u-PA fosforilado e não fosforilado pode ser tratada com a enzima de fosforilação. Pode-se usar caseína-cinase II para fosforilar o sítio fosforilável composto por resíduo(s) serina na posição 138 e/ou 139 . 0 pro-u-PA e u-PA fosforilados de acordo com o invento são úteis como agentes terapêuticos em casos de situação trombóticas venosas e arteriais, tais como enfarte do miocárdio, trombose de veias profundas e choques. O pro-u-PA fosforilado pode ser clivado para dar u-PA de duas -10-

cadeias fosforiladas. O u-PA de duas câd'éias fosforilado ou o pro-u-PA fosforilado não pode ligar-se adequadamente ao inibi-dor PAI-1, Os activadores do plasminogénio fosforilados podem pois ter uma meia vida maior devido à sua resistência à acção de inibidores presentes na circulação geral.

Uma quantidade eficaz de pro-u--PA ou u-PA fosforilado de acordo com o invento é administrada a um doente dela necessitado. A administração a um mamífero, de preferência um ser humano, pode ser efectuada parente-ralmente e de preferência intravenosamente. Tipicamente uma dose de 4 a 40 mg, por exemplo 5 a 10 mg, do pro-u-PA ou u-PA fosforilado é administrada parenteralmente, O invento também está relacionado com composições farmacêuticas compreendendo o pro-u-PA ou u-PA fosforilado de acordo com o invento a um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável. O pro-u-PA ou u-PA fosforilado pode portanto ser apresentado numa solução aquosa esterilizada e apirogénica ou noutro modo adequado. 0 activador do plasminogénio tipo tecido, t-PA, também contem resíduos fosforiláveis numa posição análoga ao resíduo serina 303 de pro-u-PA. É nesta base que se considera que o t-PA fosforilado, em particular t-PA substancialmente livre de t-PA não fosforilado, pode ser obtido pelos mesmos métodos como descrito para pro-u-PA e u-PA e que tal produto pode ser usado com as mesmas finalidades. É por vezes desejável que o activador do plasminogénio esteja substancialmente 100¾ fosforilado, i.e. que substancialmente todas as moléculas de protease tenham substancialmente todas as suas fracções fosforiláveis fosforilados. No entanto, também são interessantes os activadores do plasminogénio tais como pro-uPA, u-PA ou tPA com um grau mais baixo de fosforilação, como seja na gama de 70-100¾, tal como 80-100^ e.g. 90-100¾ ou 95-100¾. O presente invento -11- torna assim possível obter activador do-p'làsminogénio como seja pro-u-PA como um grau mais elevado de fosforilação do que o produto natural, e.g. 70%, 80% ou 90%, e.g. aumentando o grau de fosforilação através de fosforilação com uma enzima fosforilante.

Num outro aspecto, o presente invento está relacionado com anticorpos que reconhecem especifi-camente o activador do plasminogénio fosforilado, em particular pro-u-PA fosforilado ou u-PA fosforilado. Tais anticorpos podem ser úteis para o tratamento e reconhecimento de células cancerosas que produzem u-PA fosforilado num grau mais elevado do que as células normais, cf. Exemplo 1 abaixo. Tais anticorpos podem ser produzidos por um método que se caracteriza pela administração numa forma imunogénica pelo menos uma parte de protease fosforilada para se obter células produtoras de anticorpos reactivos com a referida protease fosforilada e isolamento do material contendo o anticorpo a partir do organismo ou das células. Gs métodos de produção de anticorpos serão explicados mais à frente. O anticorpo é de preferência um anticorpo monospecífico. O anticorpo monospecífico pode ser preparado através da injecção de um animal adequado com uma preparação substancialmente pura da protease fosforilada seguido de uma ou mais injecções de memória em intervalos adequados (e.g. uma ou duas semanas a um mês) até quatro ou cinco meses antes de sangrar o animal. O protocolo de imunização estabelecido é continuado e os animais são sangrados cerca de uma semana após cada injecção de memória e o anticorpo a partir do soro de forma adequada (cf. e.g. Harboc e Ingild, 1973).

Para fins que não requeiram uma elevada especificidade do ensaio, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos, e.g. como descrito em Harboe e Ingild, ver atrás. Mais especi-ficamente, quando se pretende obter anticorpos policlonais, a

protease fosforilada é, de preferência apos adição de um adjuvante adequado, como seja adjuvante incompleto ou completo de Freund, injectada num animal. Quando os imunogénios são protease fosforilado humana, os animais podem ser coelhos. Os animais são sangradas regularmente, por exemplo em intervalos sem mais regulares, e o sangue obtido foi separado numa frac-ção de soro contendo anticorpo .e facultativamente a referida fracção é sujeita a outro.processos convencionais para purificação de anticorpos e/ou processo envolvendo a utilização de proteases fosforiladas purificadas.

Numa outra realização preferida são obtidos anticorpos monoclonais. 0 anticorpo monoclonal pode ser induzido contra ou dirigido substancialmente contra um componente essencial das proteases fosforiladas, i.e. um epítopo. 0 anticorpo monoclonal pode ser produzido por técnicas convencionais (e.g. como descrito por Kohler e Milstein, 1975), e.g. utilizando uma linhã celular de hibridoma ou por seus clones ou subclones ou por células portadoras da informação genética da linha celular de hibridoma codificadora do referido anticorpo monoclonal. 0 anticorpo monoclonal pode ser produzido por fusão de células produtoras de anticorpo monoclonais com células de uma linha celular adequada e selecção e clonagem das células de hibridoma resultantes produtoras do referido anticorpo monoclonal. Como alternativa, o anticorpo monoclonal pode ser produzido através da imortalização de uma linha celular não fundida produtora do referido anticorpo monoclonal , subsequentemente crescimento das células num meio adequado para produzir o referido anticorpo e recuperaçãoodo anticorpo monoclonal a partir do meio de crescimento, 0 animal imunizado usado para a preparação de anticorpos do invento é de preferência seleccio-nado do grupo constituído por coelho,,macaco, carneiro, cabra, ratinho, rato, porco, cavalo e cobaia. As células produtoras dos anticorpos do invento podem ser células do baço ou células linfóides, e.g. linfócitos periféricos. -13-

Quando se usa'células de hibrido-ma na produção dos anticorpos do invento, estas podem ser cultivadas in vitro ou numa cavidade do corpo de um animal, A célula produtora de anticorpos é injectada num animal, por exemplo ratinho, resultando na formação de um tumor de ascites que liberta elevadas concentrações do anticorpo nas ascitas do animal. Se bem que os animais também produzam anticorpos normais, estes constituirão apenas uma pequena percentagem dos anticorpos monoclonais que podem ser purificados a partir das ascites por processos de purificação convencionais, tais como centrifugação, filtração, precipitação, cromatografia ou uma combinação deles.

Um exemplo de um modo adequado pelo qual o anticorpo monoclonal pode ser produzido é como um resultado da fusão de células do baço de ratinhos imunizados (tais como ratinhos Balb/c) com células de mieloma usando técnicas convencionais (e.g. como descritos por R. Dalchan et al. 1980). As fusões obtidas são despistadas por técnicas eoneen-cionais tais como ensaios de ligação empregando proteases fos-foriladas.

Os anticorpos que reconhecem específicamente pro-u-PA fo3forilado ou u-PA fosforilado podem ser·usados para determinar a sua presença numa amostra. Uma amostra suspeita de conter pro-u-PA fosforilado ou u-PA fosforilado é posta em contacto com o anticorpo e determinada a presença ou ausência de um complexo imune entre o pro-u-PA ou u--PA fosforilado e o anticorpo. Qualquer processo conveniente pode ser adaptado para esta finalidade.

Pode ser proporcionado um agente de diagnóstico que compreenda um anticorpo conforme definido atrás, de preferência ura anticorpo monoclonal, e meios para determinar se o janticorpo usado formou ou não um complexo imune com um activador do plasminogénio fosforilado tal como t-PA, pro-u-PA ou u-PA. O agente pode ser proporcionado com um "kit" -14-

. ν’ ! k ' de testes compreendendo uma protease fosfòrilada ,num recipiente. 0 agente de diagnostico pode ser usado no diagnóstico de doenças relacionadas com proteases fosforiladas. A administração das vários acti-vadores do plasminogénio fosforilados atrás referidos a um mamífero, de preferência um ser humano, pode ser efectuada paren teralmente, em particular intravenosamente, em analogia com o método de administração presentemente usado para u-PA, pro-u--PA e t-PA.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento. Nas figuras:

Figura 1 mostra que o pro-u-PA secretado pelas células A431 está fosforilado. Imunoprecipita- 35 ção de meio de células A431 e HT-1080 marcadas com S (Figura 32 IA) e P (Figura 1B) usando o anticorpo monoclonal 5B4 acoplado a agarose (faixa Ab). Na faixa C, o meio foi precipitado com agarose bloqueada com glicina. Faixa M: marcadores de pesos moleculares.

Figura 2 mostra a digestão limi-32 tada com plasmina do pro-u-PA marcado com P e imunoprecipi-tado. Imunoprecipitados em duplicado do meio marcado foram testados (faixas 2,3) ou não (faixas 0,1) com plamina. Faixa Cí imunoprecipitado testemunha em que o meio marcado foi incubado com agarose bloqueada com glicina.

Figura 3 mostra os resultados da P determinação do aminoácido fosforilado em 32 -pro-u-PA, O meio marcado com P imunoprecipitado foi sujeito a hidrólise ácida e analisado por electroforese de alta voltagem em placas de camada fina na presença de marcadores fosfoaminoácidos são marcados .

Figura 4 mostra que o u-PA de -15-

duas cadelas exógeno não está fosforilado nò meio das células A431. Imunoprecipitação de meio marcado com P de células A431 a que foi adicionado nenhuns (faixa -) ou 7,5 ug de n-PA de duas cadeias não marcado (faixa +) durante o período de marcação. Faixa C: imunoprecipitação testemunha. Faixa M: marcadores de pesos moleculares.

Figura 5 mostra que o pro-u-PA intracelular é fosforilado. Duas séries de células A431 foram 35 32 marcadas com S-metionina (painel A) ou P-ortofosfato (painel B), lavadas com ácido e lisados. Faixas A, C; irnuno- precipitados testemunhas. Faixas fí,D: imunoprecipitação com o anticorpo 5B4„ Faixa M: marcadores de pesos moleculares.

Figura 6 mostra os resultados de uma experiência de marcação "pulso-caça" da fosforilação de pro-u-PA e secreção em células A431 tratadas com PMA.

Painel esquerdo: células A431 tra- 32 tadas com PMA foram marcadas durante 7 horas com P-ortofosfato, lavadas com ácido e o meio de marcação removido e substituído com DMEM normal. 0 período de caça durou 16 horas. Faixa 1: marcadores de pesos moleculares. Faixa 2: imunoprecipitação do meio marcado durante 7 horas. Faixa 3: imunoprecipitação do lisado celular lavado com ácido no fim do período de marcação de 7 horas. Faixa 4: imunoprecipitação do meio após 16 horas de caça. Faixa 5: imunoprecipitação do lisado celular lavado com ácido após 16 horas do período de caça.

Painel direito: Células A431 fo-32 ram marcados durante 18 horas com P-ortofosfato, o meio de marcação substituído com DMEM normal e feito um período de caça com meio contendo fosfato não marcado durante 3,5,8 e 11 horas. Para cada tempo o meio foi imunaprecipitado. A faixa marcada "pré-caça” mostra imunoprecipitação do meio no final do período de marcação de 18 horas.

Figura 7 mostra que o pro-u-PA ligado a receptores está fosforilado nas células A431 confor- 32 me mostrado pela imunoprecipitação específica de P-pro-u-PA a partir da lavagem com ácido de células A431 marcados. Faixa 1: imunoprecipitação testemunha; faixa 2: imunoprecipitação com o anticorpo monoclonal 5B4.

Figura 8 mostra que a ligação a receptores não é necessária para a fosforilação de pro-u-PA. A imunoprecipitação do meio condicionado e da lavagem com áci-do das células A431 marcadas com S (faixas 1 a 3) e P (faixas 4 a 7). Efeito de um peptídeo sintético 0,lmM /ú-PA (12--32) ala 197 que compete para a ligação ao receptor de u-PA.

Faixas la, lb: imunoprecipitação da lavagem com ácido de célu- 32 las marcadas com S incubadas na presença e ausência de peptídeo, respectivamente Faixas 2, 4 e 5: imunoprecipitados de meios condicionados de células incubadas na ausência de peptí-deos. Faixas 3, 6 e 7: imunoprecipitados de meios condicionados de células incubadas na presença de peptídeo.

Figura 9 mostra a ligação de pro- 35 32 -u-PA marcado com Se P, imunoprecipitado e tratado com plasmina de meio condicionado de A431 a PAI-1. cular; faixas faixas faixas

Faixa M: marcadores de peso mole-32 35 1, 4: pro-u-PA marcado com P e S não testado derivado de meio de A431 imunoprecipitado; 2, 5: o mesmo, mas após tratamento com plasmina do pro--u-PA; 3, 6: o mesmo das faixas 2, 5 mas após ligação a PAI-1 (numa proporção de PAI-1 para pro-uPA de 12, 5).

Figura 10 mostra os resultados da separação por cromatografia liquida de alta resolução (HPLC) dos peptídeos produzidos por digestão tríptica de pro-u-PA mar- -17- cado com

X

Figura 11 mostra o resultado do tratamento do peptxdeo 301-313 de pro-u-PA com quimotripsina.

Figura 12 mostra o resultado da aplicação de peptídeos resultantes da digestão com tripsina de 32 pro-u-PA marcado com P numa coluna de Sepharose de quelata-ção com Fe^+.

Figura 13 mostra os resultados da análise em gel de SDS-poliacrilamida (12,5%) das fracções 3+ 35 32

de eluiçao em bloco da Fe -Sepharose de S (TDP) e P (BGTTOM). Os géis migraram em condições redutoras,

Faixa M; marcadores de pesos, moleculares

Faixa 1; sobrenadante após a incubação

Faixa 2: eluição em acetato de sódio 0,5 M pH 3

Faixa 3: o mesmo, pH 4

Faixa 4: o mesmo, pH 5

Faixa:5: o mesmo, pH 5,5

Faixa 6: o mesmo, pH 6,5

Faixa 7: eluição em acetato de sódio a 1% pH 7,0 Faixa 8: o mesmo pH 8,0

Faixa KP-1; eluição com fosfato de potássio, o,5M NaCl pH 8,0, fracção 1

Faixa KP-2: o mesmo, fracção 2

Faixa KP-3í eluição em 0;1M EDTA, 0,05M Tris-HCl pH 7,5, 0,5M NaCl. O símbolo pro indica a migração de pro-u-PA de cadeia simples- Os simbolos B e A indicam a migração das cadeias A e B do u-PA de duas cadeias

X

Figura 14 mostra .os resultados 35 do ensaio dos eluatos derivados de S-pro-u-PA de uma coluna ~ 3+ \ de Sepharose de quelataçao com Fe quanto a sensibilidade a PAI-l.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Reagentes

Albumina de soro bovina (BSA), ácido 3-trimetilsilil-l-propanossulfónico (DSS), aprotimina, leupeptina, bonzamidina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), ortovanadato de sódio e plasmina foram da Sigma. Agarose foi do BRL. Meio e Eagle, modificação de Dulbecco (DMEM), DMEM sem metionina DMEM sem fosfato, soro fetal bovino (FSS), soro fetal bovino dialisado (dFBS) e glutamina foram da Gibco. 35 32 S-metionina, P-ortofosfato e marcadores de pesos moleculares *^C (gama larga) foram da

Amersham. Affigel usado no acoplamento de proteína, acrilami- da, bis-acrilamida, Temed, parsulfato de amónio e azul de bro- mofenol foram de Biorad» Enlightring foi da NEN. 0 anticorpo monoclonal 5B4 foi adquirido aos laboratorios Leptit S.p.a. Milão, Itália (Nolli et al., 1986). 0 peptídeo sintético /u-PA (12-32) ala 19j foi gentilmente proporcionado por Ettore Appella (N.I.H.) (Appella et al., 1987). >S . -X v \ '

Linhas celulares A linha celular A431 (Pabricant et al., 1977; Stoppelli et al„, 1986) foi obtida a partir de uma mulher de 85 anos de idade portadora de um carcinoma epi-dermóide da vulva. Poi adquirida a I.Pastan, NIH, Bethesaa, Maryland, USA. A linha celular HT108Q (Andreasen, et al., 1986) foi obtida a partir de um fibrossarcoma que surgiu adjacente ao acetabulum de um homem caucasiano de 35 anos de idade. Ela foi adquirida no laboratório de K. Danp, Copenhagen, Denoiark. Ambas as linhas celulares cresceram aderentes a placas de cultura de tecidos em DMEM suplentado com 1Q% FBS numa atmosfera de 10¾ de EXEMPLO 1

Fosforilação in vivo de pro-u-PA

Para determinar se o pro-u-PA se- cretado por uma linha celular humana é portador de um grupo / 32 fosfato, as células A431 foram marcadas com P-ortofosfato de acordo com o seguinte processo: Método

Marcação de células

Dia 1: Células A431 ou HT1Q80 fo-

C ram semeadas a uma densidade de 1,5 x 10° células numa placa -20-

de 10 cm em 10 ml de DMEM + 10% FBS e cultivadas durante 24 horas.

Dia 2: 0 meio foi aspirado das células e substituído com 5 ml de DMEM sem metionina ou sem fosfato + 5% dFBS. Após 6 horas, este meio foi ainda substi- 35 tuido por 2 ml de meio sem metionina contendo 400 pCi de S- -metionina ou com 2 ml de meio sem fosfato contendo 600 uCi 32 , ' de P-octofosfato. O período de marcação foi de 18 horas.

Dia 3: Os meios de cultura condi-35 32 cionados marcados com S ou com P foram colhidos com uma pipeta de Pasteur e centrifugada a 1500 rpm durante 10 minutos à temperattira ambiente numa Heraeus Sepatech Labofuge T para remover as células mortas e detritos celulares. No final da centrifugação, os sobrenadantos foram colhidos e usados como material de partida para o processo de imunoprecipitação que foi como se segue:

Imunoprecipitação

Passo 1: 0,3 ml de meio marcado 35 32 com S e 1 ml de meio marcado com P foram usados para cada amostra e suplementados com 0,1 e 0,3 ml respectivamente, de tampão fosfato de potássio (PPB; 0,22M K^HPO^) pH 7,0, 0,2M NaCl, 0,4% de triton X-100) à temperatura ambiente.

Passo 2; A imunoprecipitação (Sto-ppelli et al,, 1986) foi efectuada usando o anticorpo monoclo-nal 5B4 acoplado a Affigel e mantida numa suspensão de 1:1 em PPB diluído 4 vezes. As amostras testemunha foram .incubadas com Affigel bloqueado com glicina mantidas nas mesmas condições. O volume de 5B4 usado foi de 1/25 do volume de reacção total; a incubação foi efectuada durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. -21-

Passo 3: :tUbos de reacção fo ram centrifugados numa "microfuge" a 10000 x g durante 3 minutos e o sobrenadante rejeitado. Os sedimentos foram ressuspen-sos em 1 ml de PPB 4 vezes diluido e centrifugados durante 3 minutos numa "microfuge" Eppendorf, O mesmo processo foi repetido 3 vezes mais.

Passo 4: Os sedimentos foram então ressuspensos em 0,4 ml de tampão de eluição (EB: 0,1M gli-cina-HCl, pH 2,5, 0,5M NaCl, 0,1/ triton X-100) e incubados durante 15 minutos a temperatura ambiente com agitação suave. As amostras foramcentrifugadas como descrito no passo 3 e os sobrenadantes recuperados.

Passo 5: Os sobrenadantes foram precipitados com ácido tricloroacético (concentração final = 20¾) com citocrómio C (70 pg) como veículo; eles foram incubados em gelo durante 20 minutos e centrifugados como descrito no passo 3. Os sedimentos foram lavados com 1 ml de éter die-tílico, centrifugados, levados com mais 1 ml de acetona, centrifugados e secos ao ar.

Passo 6: Os sedimentos foram ressuspensos em 50 pl de tampão Laemmli (ver Laemmli, 1970) (0,14 M Tris, pH 6,8, 22,3% glicerol, 6% SD>S) e aplicados num gel de SDS-PAGE de 12,5%, 5 pl de marcadores de pesos moleculares marcados com C (gama larga) foram também sujeitos ao mesmo processo e aplicados no mesmo gel, A electroforese foi efectua da em 12% de poliacrilamida como descrito por Laemmli, 1970. Géis contendo amostras marcadas 32 com P foram directamente secos sob vácuo durante duas horas num secador de géis Biorad. Quando contendo as amostras de S eles foram fixados em metanol a 25%, ácido acético a 10%, embebidas em Enlightning (NEN) e secos. 0 gel seco foi então exposto numa cassete de antorradiografia com écrans "anlightning plus" (Dupont) usando filmes Kodak X-OMAT,

X

Resultados

Uma experienciaatípica mostra uma 35 32 proteína marcada com S ou P de tamanho de pro-u-PA (47 Kilodeltas) que surge quando se usa o anticorpo 5B4. Pelo contrário, as faixas resultantes das incubações com agarose bloqueada com glicina (determina a testemunha da imunoprecipita-ção) não apresentam qualquer banda (Figura 1). Os resultados apresentados na Figura 1 referem-se a células A431 e a células HT1080; obtiveram-se resultados idênticos. Portanto, em pelo menos duas linhas celulares diferentes, o pro-u-PA biossinté-tico é fosforilado. EXEMPLO 2

Determinação do número minimo de sítios de fosforilação no pro -u-PA Método É conhecido que a protease serina corta o pro-u-PA de uma única cadeia de 47 k<J num sítio específico, dando origem a uma molécula com duas cadeias (30 kd e 17 kd) (Stoppelli et al., 1986); a molécula retem as propriedades enzimáticas. A cadeia A (17 kd) contem domínios reguladores; a cadeia B tem domínios catalíticos (Stoppelli et al., 1965; Stoppelli et al., 1986). X -

Esta proprieda^ô foi usada para investigar se a banda de 47 kd resultante do Exemplo 1 é de facto pro-u-PA: portanto foi efectuada uma marcação de células 32 A431 com P-ortofosfato nas mesmas condições descritas no

Exemplo 1, seguido de imunoprecipitação até ao passo 6.

Os sedimentos resultantes da precipitação com TCA foram então ressuspensos era 30 jal de Tris--HC1, pH 6, na presença ou na ausência de plasmina (concentração de 175 pg/ml); as amostras foram então incubadas a 372C durante 30 minutos. No final da incubação, 30 pi de tampão laemmli 2x (ver Exemplo 1) foram adicionados, a amostra fervida e aplicada num SDS-PAGE como descrito no Exemplo 1.

Resultados

Conforme esperado da clivagem de pro-u-PA pela plasmina, a qual liberta duas cadeias de testemunha diferentes (17 kd e 20 kd, respectivamente, a incubação 32 do meio condicionado de A431 marcado com P e imunoprecipita-do dá origem a duas bandas de 17 kd e 30 kd em oposição a banda única de 47 kd das amostras testemunha (ver Figura 2). Portanto, cada uma das duas cadeias deve conter pelo menos um sítio de fosforilação. Assim, o pro-u-PA fosforilado tem um mínimo de dois sítios de fosforilação.

Determinação do aminoácido fosforilado hs proteínas fosforiladas podem ser portadoras do grupo fosfato covalentemente ligado a serina trionina ou tirosina; uma maneira de determinar qual o aminoácido que está envolvido é efectuar uma hidrólise total da proteína, separar e identificar o fosfoaminoácido. Método

Marcação de células e isolamento de pro-u-PA fosforilado l*rês placas de 10 cm de células 32 A431 foram marcadas com P e o meio foi imunoprecipitado como descrito no Exemplo 1. A SDS-PAGE (ver Exemplo 1) foi efectua- 32 da usando a testemunha do imunoprecipitado de P da experiência. Marcadores de pesos moleculares marcados com 14c ajudaram à localização da região do gel que continha o pro-u-PA marcado.

Passo 1: Removeu-se uma fatia de gel de acrilamida, correspondente à banda de pro-u-PA.

Passo 2: A fatia de gel foi fervida era 1 ml de 1% SDS durante 15 minutos, homogenizada usaan-do um homogenizador Ultraturrax e centrifugado a 4500 rpm durante 15 minutos.

Passo 3; Colheu-se o sobrenadante suplementou-se com 5 volumes de acetona fria e 50 pg de BSA cora veículo e incubou-se a -15QC durante 30 minutos. ‘ ·ν„ \ -25-

Hidrólise ácida

Passo 1: ãs amostras foram centri-fugadas a 4500 rpm durante 15 minutos. O sedimento de proteína foi lavado com 1:1 vol de éter-etanol e finalmente ressuspenso em 1 ml de 6N HC1.

Passo 2: Às amostras foram hidro-lisadas a ΙΙΰΰΟ durante 5¾ minutos e depois diluídas com água e liofilizadas durante a noite,

Separação de fosfoaminoácidos

Passo 1: As amostras secas foram ressuspensas em 20 jil de água contendo fosfo-serina, fosfotreo-sina e fosfotirosina frias, 2 mg/ml de cada, e submeteram-se a electroforese em camada fina numa dimensão a 1000 Volts e 4SC em placas de camada fina de 100 um Macheray-Nagel usando ácido acético/piridina/água (50:5:945) a pH 2,5 durante 1 hora.

Passo 2: Após a migração, as placas de celulose foram secas, coradas com minidrina e expostas a filme de raios X Kodak X-OMAT para detectar os aminoácidos 32 fosforilados com P.

Resultados

Além do fosfato livre, o único componente marcado da hidrólise de pro-u-PA que pode ser detec-tado foi uma mancha que migrou com o marcador fosfo-serina não marcado (ver Figura 3). Tal mancha não surge nas amostras testemunha onde uma testemunha negativa da imunoprecipitação (amos -26-

tra de agarose bloqueada com glicina; ver Exemplo 1) foi sujeita ao mesmo processo (não apresentador."' EXEMPLO 4

Determinação do local celular da fosforilação de pro-u-PA

Para excluir a possibilidade de a fosforilação de pro-u-PA poder ser um artefacto que ocorre no meio de cultura das células durante o período de marcação, efectuou-se a seguinte experiência: Adicionou-se urocinase de duas cadeias a células durante o período de marcação para testar se aquela ficava fosforilada. Método

Passo 1: Duas placas de cultura de tecidos de 10 cm de células A431 foram postas em jejum e 32 marcadas com P-ortofosfato como descrito no Exemplo 1. O meio de uma das duas placas foi suplementado com 5,7 pg de urocinase fria desde o inicio até ao fim do período de marcação, A outra placa foi a testemunha da experiência,.

Passo 2: No final da incubação, retiram-se amostras de 1 ml de meio condicionado das placas e suometidas ao processo de imunoprecipitação descrito no Exemplo 1. As amostras foram analisadas era duplicado.

.V ' - \ /

Passo 3: Uma?èrlectroforese SDS--PAGE em condições redutoras seguido de autorradiografia como descrito no Exemplo 1 tornou possível visualizar o resultado da experiência.

Resultados

Se a fosforilação pudesse ocorrer no meio de cultura das células após o pro-u-PA ter sido secre-tado, seria de esperar que a urocinase adicionada exógenamente pudesse ser igualmente fosforilada. Pelo contrário os resultados da electroforese em gel mostram que em ambos os casos, está presente uma única banda de 47 kd (pro-u-PA) que não é acompanhada pelas bandas de 30 kd e 17 kd o que indicaria marcação da urocinase de duas cadeias, mesmo quando urocinase urinária de duas cadeias não marcada está presente no meio de incubação (Figura 4), Portanto, concluiu-se que, pelo menos nas presentes condições nenhuns factores serectados ou associados à su-perfxcèe podem ser responsáveis pela fosforilação observado no Exemplo 1. EXEMPLO 5

Fosforilação intracelular de pro-u-PA

Os resultados divulgados no Exemplo 4 sugerem que pro-u-PA pode ser fosforilado antes de ser secretado. Projectam-se duas experiências diferentes para testar esta hipótese. -28-

Métodos

Passo 1: As células A431 marcadas e lavadas com ácido (ver Exemplo 8) foram lisadas e testadas por imunoprecipitação. Depois da lavagem com ácidç as células foram lavadas duas vezes com tampão de fosfato salino, raspadas com um raspado de borracha, colhidas para um tubo e cen-trifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos.

Passo 2: 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento ressuspenso em 2 ml de tampão de lise (20mM Hepes, pH 7,5, 156 Triton X-100, 1056 glicerol). As células foram agitadas num córtex durante 30 segundos e centrifugadas numa "microfuge" a 10000 rpm e 4QC durante 30 minutos.

Passo 3: O sobrenadante foi sujeito ao processo de imunoprecipitação e SDS-PAGE como descrito no Exemplo 1. Résultados

Observou-se uma banda correspondente ao peso molecular do pro-u-PA (47 kd) que não aparece na testemunha negativa (ver Figura 5). Assim, o pro-u-PA marcado está presente no lisado de células Ά431 lavadas com ácido, ou seja no interior das células. -29-

EXEMPLO 6

Marcação de pulso-caça do pro-u-PA Método

Passo 1: Quatro placas de 10 cm 32 A431 foram postas a jejuar durante a noite e marcadas com P-35 -ortofosfato au S-metionina. Forbol-miristato-acetato (PMA) esteve presente numa concentração de 50 ug /ml durante 7 horas para aumentar a produção de pro-u-PA das células A431 (Stoppelli et al., (1986a).

Passo 2: As células foram lavadas duas vezes com DMEM sem fosfatos e sem soro e sujeitos a lavagem com ácido como descrito no Exemplo 5.

Passo 3: Buas das placas foram suplementadas com tampão de lise como descrito no Exemplo 5 e os lisados resultantes foram congelados. 2 ml de DMEM sem soro (agora contendo fosfato) suplementado com 50 ug/ml de PMA foram adicionados a cada uma das duas placas restantes que foram então incubadas durante 16 horas a 37SC e 1Q% de COg.

Passo 4: As placas 3 e 4 foram novamente lavadas com tampão ácido e lisados (ver passo 3).

Passo 5: Todos os lisados e meios de experiência foram imunoprecipitados e submetidos a SDS-PAGE (ver Exemplos 1 a 5).

Resultados

Em todas as amostras examinadas surgiu uma banda de 47 kd, mas a intensidade relativa mostra que quando o meio de incubação é substituído com meio fresco não marcado, o pro-u~PA marcado anteriormente sintetizado é secretado e acumulado (ver Figura 6, painel esquerdo). A experiência mostra que o pro-u-PA é primeiro fosforilado e depois secretado. EXEMPLO 7

Cinética de acumulação Método

Passo 1: Cinco placas de 6 cm de células A431 foram postas em jejum e marcadas como descrito no Exemplo 1. Após uma incubação durante a noite, o meio foi subs tituído com 0,75 ml de DMEM em fosfatos e sem soro e cada placa incubada durante um tempo diferente (3 horas, 5 horas, 8 horas, 11 horas e 24 horas).

Passo 2: Após a incubação, cada porção de 0,75 ml foi imunoprecipitado e analisada como desvri to no Exemplo 1. -31-

Resultaáos A banda de pro-u-PA mal se vê às 3 horas de incubação e a sua intensidade aumenta com o tempo, mostrando que se acumula no meio (ver Figura 6, painel direito) . EXEMPLO 8

Pro-u-PA ligado a receptores está fosforilado

Foi descrito um método (Stoppelli et al., 1986) para remover selectivamente urocinase ou pro-u--PA ligado ao receptor. Tal processo foi usado para determinar se o pro-u-PA ligado a receptores também está fosforilado. Método

Passo 1: Dez placas de cultura de tecidos de 15 cm de células »A431 a 8056 da confluência foram postas a jejuar e marcadas como descrito no Exemplo 1. Paralelamente outras placas foram postas a jejuar para metionina e 35 marcadas com S-metionma. - Passo 2: 0 meio marcado foi removido; as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois adicionado 3 ml de tampão ácido (50mM glicina, 102mM NaCl, pH 2,5) para remover as moléculas de pro-u-PA do receptor. -32-

Passo 3: Três amostras de 1 ml cada de lavagem em tampão foram pré-incubadas com agarose bloqueada com glicina durante 1 horas à temperatura ambiente para eliminar possível ligação inespecífica durante o processo de de imunoprecipitação.

Passo 3: As amostras foram cen-trifugadas numa Microfuge e os sobrenadantes sujeitos a imunoprecipitação com o anticorpo 5B4 e a SDS-PAGÊ como descrito no Exemplo 1.

Resultados

Observou-se uma banda correspondente a um peso molecular de 45 kd. Esta banda foi observada 32 nos imunoprecipitados da lavagem ácida marcadas com P e com 35 S (ver Figura 7). Assim, a lavagem ácida contem pro-u-PA fos-forilado. EXEMPLO 9

Está o receptor urocinase envolvido no processo de fosforila-ção do pro-u-PA?

Sabe-se que muitas interacçÕes entre factores de crescimento e receptores de factores de cres cimento são acompanhadas de reacções de fosforilação ;alguns receptores são eles próprios cineses de proteínas (Hunter, 1987). -33-

0 receptor de urocinase deve me diar uma resposta semelhante guando interactua com pro-u-PA produzido endógenamente. As células foram marcadas em condições que não permitem a ligação do pro-u-PA secretado ao receptor, i.e. na presença de excesso do peptídeo antagonista sintético /u0A (12-32) ala 19/ (Appella et al.f 1987). Método 0 peptídeo sintético /u-PA(12-32) ala 19.7 ^em uma sequência correspondente aos resíduos 12-32 do pro-u-PA humano. Este peptídeo compete com pro-u-PA para a ligação ao receptor do urocinase (Appella et al., 1987).

Usou-se o processo que se segue:

Passo 1; Duas placas de cultura de tecidos de 10 cm de células A431 80¾ comfluentes foram postas a jejuar relativamente a fosfatos durante a noite.

Passo 2: O meio foi removido e as células lavadas duas vezes com PBS e depois com 2 ml de um tampão ácido (50mM glicina, lOOmM NaCl, pH 2,5) durante 5 minutos para remover a urocinase ligada à superfície. As células foram então rápidamente neutralizadas pela adição de 0,5 ml de 0,5M Hepes, pH 7,0.

Passo 3: 2 ml de meio sem fosfato e sem soro foram adicionados a ambos as placas, uma das duas contendo o peptídeo numa concentração final de 100 e, incubada a 42C durante 30 minutos.

Passo 4: Adicionaram-se 600 uCi 32 de P-ortofosfato. O período de marcaçao foi de 6 horas e a marcação foi efectuada a 372C.

Passo 5: 0 meio marcado foi removido e amostras de 800 pl foram imunoprecipitadas e analisadas como descrito no Exemplo 1.

Paralelamente, duas placas de 6 cm com células A431 foram postas a jejuar relativamente a me-tionina e depois sujeitas a lavagem ácida e neutralizar como descrito nos passos 2 e 3. 750 pl de meio sem metionina e sem soro foram adicionados às células. Numa das duas placas, o meio continha o peptídeo fuPA (12-32) ala 19/ (concentração final = 100 uM). As células foram incubadas a 42C durante 30 ' 35 minutos e depois marcadas com 300 pCi de S-metionina, durante 6 horas a 372C e lavadas novamente com 600 P1 de tampão ácido. Amostras de 150 pl de meios marcados e de 600 pl de lavagem ácida foram imunoprecipitadas como descrito no Exemplo 1.

Depois da imunoprecipitação, as 32 amostras marcadas com P e as marcadas com 35S-metionina foram sujeitas a sds-page.

Resultados 1: A preserjça de peptídeo provoca uma forte redução da quantidade de pro-u-PA ligada ao receptor como se pode ver na imunoprecipitação da lavagem ácida da mar-35 cação com S (Figura 8, faixas 19, lb). 32 2: As células marcadas com P-orto- fosfato na presença do peptídeo não apresentam qualquer redução na intensidade da banda de 47 kd imunoprecipitada a partir do meio condicionado versus testemunha marcada na ausência de peptídeos (ver Figura 8, faixa 4-7).

Concluiu-se pois que a maioria da fosforilação não é devida a interacção de pro-u-PA com o -35- > > -35- > >

receptor da urocinase. Uma cinase de prpteínas, localizada no interior das células, deve ser responsável pela fosforilação de pro-u-PA. EXEMPLO 10

Ligação do pro-u-PA fosforilado ao inibidor PAI-1 A fosforilação é uma maneira regular a actividade biológica e/ou as propriedades enzimáticas de algumas proteínas (Hargreaves et al., 1986; Sutherland, 1972; Bailou and Pischer, 1986; Cohen, 1988).

Sabe-se qu® o activador do plas-minogénio urocinase é capaz de interactuar com três outras moléculas; o receptor de u-PA, o inibidor de u-ΡΑ e o substrato, plasminogénio. Portanto pode-se perguntar se tais actividades podem ser afeetadas por fosforilação de .resíduos serina específicas. É conhecido que o inibidor PAI-1 se liga ao sítio activo de urocinase de modo irreversível e bloqueia a actividade enzimática (Andreasen et al., 1986). Ti-rando partido da marcação metabólica com P do pro-u-PA de A431 que apenas torna possível visualizar as moléculas fosfo-riladas, testou-se se o u-PA fosforilado ainda é capaz de se ligar ao inibidor PAI-1.

Passo 1: Preparação do pro-u-PA marcado metabólicamente: 0,5 ml de meio condicionado de A431 32 marcado com 35S e 2,5 ml de meio marcado com P foram prepa-

-36-

rados e imunoprecipitados como descrito 'rio Exemplo 1.

Passo 2; Tratamento com plamina dos pro-u-PAs marcador: As amostras precipitadas com TCA foram ressuspensas em 50 (ul de lOOmM Hepes, pH 7,5 e incubadas com 2 pg de plasmina/jag de pro-u-PA durante 30 minutos a 37SC 10 ug de aprotimina foram então adicionados para bloquear a reac-ção.

Passo 3: Activação do inibidor PAI-1 purificado como descrito/Andreasen et al., 1986; Andrean-sen et al., 1986a): 43 jig/200 pl do inibidor PAI-1 foram suplementados com um volume igual de guanidina 8M e incubadas a 37QC durante 1 hora. A amostra foi então diluida 10 vezes com PBS + 100 (ug/ml de BSA e dialisada usando um tubo tipo "cen-trlon" (AMICON). Diluições com PBS seguido de centrifugação a 3500 rpm durante 90 minutos baixou a concentração de guanidina para lOmM final. No final do processo de aciivação-diálise, o inibidor foi recuperado numa concentração aproximada de 43 ,ug/ 200 yl.

Passo 4: Ligação do u-PA de duas 32 cadeias marcado com P a PAI-1: As condições de ligação cer- 125

tas foram testadas com urocinase urinária marcada com I usando diferentes proporções entre PAI-1 e u-PA. Uma proporção de 8:1 é suficiente para se obter uma conversão completa da banda 33K na banda 86K do complexo uPA/PAI-1. Quando analisado em gás de SDS-poliacrilamida em condições redutoras, cerca de 32 35 2,5 ug de P pro-u-PA (ou 0,5 pg de S pro-u-PA) convertidos em u-PA foram incubados com 20 fug/93 ]a1 (ou com 6 jig) de PAI-1 activado e dialisado durante 1 hora à temperatura ambiente. No final da incubação, a amostra foi suplementada com tampão de Laemmli, fervida e aplicada num SDS-PA6E de 10%. V > V >

Como se mostra na Figura 9, en-35 quanto u-PA marcado com S activado por plasmina forma um complexo de aproxlmadamente 92 kd com PAI-1, o u-PA marcado 32 com P activado por plasmina nao forma um complexo em quantidades detectáveis.

Conclusões 1. u-PA fosforilado liga-se a PAI-1 com uma eficacia mais baixa do que o u-PA marcado com S. No entanto, pro-u-PA fosforilado e pro-u-PA são convertidos na forma de duas cadeias com a mesma eficácia. Portanto, u-PA fosforilado representa apenas parte do u-PA total. 2. Uma vez que apenas parte do pro--u-PA biossintético e fosforilado, a percentagem de grau pro--u-PA fosforilado pode ser aumentado por fosforilação in vitro com os cinases de proteínas adequadas. 3. A incapacidade do pro-u-PA fosforilado pode ser devido a uma modificação no sítio activo ou perto dele. Isto não implica necessáriamente um decréscimo ou perda da actividade mas torna-o possível. 4. A incapacidade do u-PA fosforilado para se ligar a PAI-1 deve resultar numa meia-vida maior do pro-u-PA e u-PA solúveis e ligados a receptores. Portanto o pro-u-PA e u-PA biossintéticos estão protegidos da acção dos inibidores. 5. As mesmas conclusões são aplicá veis aos medicamentos contendo u-PA e pro-u-PA usados na tera- -38-

EXEMPLO 11

Identificação dos sítios fosforilados

Redução, carboximetilação e hidrólise triptica de 32

P-pro-u-PA 200 μg de pro-u-PA não marcado purificado, misturado com cerca de 30 ug de pro-u-PA purifica-32 do marcado com P» foram precipitados com TCA e redissolvidos em 25 μΐ de 6M guanidina-HCl, 0,2% EDTA, 0,2M Tris-HCl pH 8,4, 2,5 pmoles de ditiotreitol e incubados a 37SC durante 2 horas numa atmosfera de argon. Em seguida, adicionou-se um excesso de 1,25 vezes de ácido iodoacético relativamente aos grupos-~SH presentes, mantendo o pH noutro e a incubação continuou durante 30 minutos à temperatura ambiente. A redução e carboximetilação foram paradas pela adição de ditiotreitol 0,1M. A proteína foi então dializada contra bicarbonato de amónio 200 mM pH 8,0 a 4SC e depois hidrolizado com tripsina (1 pg/ml em lOmM CaClg) durante 17 horas à temperatura ambiente. A hidrólise foi parada com ácido trifluoroacético a 0,1% e o material aplicado numa coluna de 2 mm de HPLC C18 a um fluxo de 270μ1/ min, com um gradiente de 0 a 100% da solução B (70% acetonitri- lo 0,08% de ácido trifluoroacético). Colheram-se fracções in- 32 dividuais, a radloactividade P medida e as fracções radioac-tivas analisadas num sequenciador de proteínas Applied Biosys-tems modelo 477A, conforme recomendado pelo fabricante. V »

- φψ *

Separação cromotográfica quelatada com Fe de fosfopeptídeos

Pro-u-PA purificado (mistura de proteína marcada com P e não marcado como no parágrafo anterior) foi carboximatilado e digerido com tripsina como descrito atrás. A mistura de peptídeo foi levado a pH 3,1 com ácido acético 0,1M, aplicada numa coluna de Sepharose quelatada com Fe^+ (Andersson & Porath, 1986; Michal & Bennett, 1987), a coluna lavada com ácido acético 0,1M e eluida por passos com 10 ml de tampão ácido acético/NaOH pH 5, lavada com’10 ml de água destilada e depois eluida com subsequentes adições de 10 ml de acetato de amónio pH 7,5, 17 ml de acetato de amónio pH 8,0 e finalmente com 10 ml de tampão fosfato de potássio 0,1M pH 7,4. Colheram-se várias fracções para cada passo, liofilizaram-se, contaram-se num contador de cintilação e submeteram-se à análise dos fosfoaminoácidos e da sequência.

Identificação e medição dos fosfoaminoácidos em peptídeos de pro-u-PA O analisador de aminoácidos baseado em permuta catiónica e os processos de hidrólise ácida em fase líquida ou gasosa foram préviamente daseritos (Barkholt e Jensen, 1989). As proteínas ou peptídeos fosforilados, no entanto, foram hidrolizados durantes 2-4 horas apenas. O hi-drolisado foi seco e redissolvido em 0,1M HC1 e injectados 40 P1 de amostra. A coluna tinha sido equilibrado durante 30 minutos com um solvente A de pH 1,6 (titulado para pH 1,6 com ácido citríco e diluído a 4í1 com água) e os aminoácidos fosforilados foram eluidos com este solvente, Ser-P aos 4,53 min., Tre-P aos 5,23 min. e aos 16,6 min.

Os peptídeos tripticos e a proteína carboximatilada foram separados por RP-HPLC num cromatógra- -40-

fo Applied Biosystems, modelo 130A. A coluna (220 x 2,1 mm, RP18, 5 um) foi eluida com um gradiente linear de 5-509Ó aceto-nitrilo em ácido trifluoroacético durante 50 minutos. As frac-ções foram colhidas manualmente.

Resultados

Como se mostra na Figura 10, a separação por HPLC deu principalmente duas fracções (Nos. 24 e 25) contendo quantidades significativas de radioactividade. A análise da sequência de aminoácidos na fracção 24 deu três pep-tídeos que correspondem às sequências 136-145 (KPSSPPEELK usando o código de aminoácidos de uma única letra, Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984), 301-313 (ENSTDYLYPEQLK) e 324-338 . (ECQQPHYYGSEVTTK) de pro-uPA (ver tabela 1). A análise de sequências da fracção 25 deu os mesmos dois peptídeos 136-145 e 301-313 maia a sequência 37-46 de pro-u-PA (PGGQHCEIDK) (Tabela 1). Esta última não contem qualquer resíduo serina. Os outros três no entanto contêm serina. A fosforilação do peptídeo 301--313 foi provada por tratamento do peptídeo com quimofcripsina que o encurta para ENSTDY e portanto altera a sua separação por HPLC (Figura 11). Para identificar se existem outros peptídeos fosforilados, usou-se uma coluna de Sepharose de quelata-ção com Fe^+ (Marca Registada) para isolar os fosfopeptídeos do pro-u-PA marcado, conforme foi feito anteriormente para a fotossistema II do espinafre (Michel & Bennett, 1987). A coluna foi carregada a pH 3,0 e tentaram-se vários lavagens em que o pH foi lentamente aumentado. Apenas se encontraram duas frac ções contendo qualquer material radioactivo, a fracção da água e o eluato de fosfato de potássio (Figura 12). Muitas dás frac ções da cromatografia de quelatação com Fe foram analisadas quanto a fosfoaminoácidos assim como para aminoácidos normais.

Os resultados'mostraram ausência completa de quaisquer fosfoaminoácidos em todas as fracções excepto no eluato de fosfato de potássio, fracções 52-55, (Tabela 2). Nas últimas fracções, fosfoserina for o único amino-ácido fosforilado, não se observou qualquer fosfotreomina ou fosfotirosina. 0 rendimento estimado de fosfoserina (comparado com o de lisina e arginina detectado nas mesmas condições) foi de aproximadamente 50% assumindo um único sítio de fosfo-rilação por molécula, ou 25% assumindo dois sítios por molécula. Assim, a análise de fosfoaminoácidos mostrou que o material eluido por fosfato de potássio continha de facto resíduos fosfo-serina enquanto a fracção da água não continha. Isto pode portanto representar fosfato livre libertado durante os processos de isolamento e hidrólise. As fracções que continham fosfo-serina foram sujeitas a análise da sequência de aminoácidos que identificou três peptídeos um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos amino-terminal do pro-u-PA; SNELHQVP e os dois peptídeos 136-145 e 301-313 que foram anteriormente identificados por separação por HPLC (Tabela 3). TABELA 1

Análise da sequência de aminoácidos dos peptídeos conti dos nas fracções 24 e 25 da coluna de HPLC da Figura 10

Fracção 24 Fracção 25 KPSSPPEELK (136-145) ENSTDYLYPEQLK (301-313) ECQQPHYYGSEVTTV (324-338) KPSSPPEELK (136-145) ENSTDYLYPEQLK (301-313) FGGQHCEIDK (37-46) -42- > >

Os números" éntre parêntesis re-ferem-se à posição do primeiro e último aminoácido na sequência de pro-u-PA (Verde et al., 1984), Cada uma das fracções foi sujeita a análise da sequência de aminoácidos como descrito atrás. As três sequências diferentes, indicando três peptí-deos , foram estabelecidos por comparação com a sequência conhecida do pro-u-PA (Verde et al., 1984).

Tabela 2

Determinação do 3+ coluna de FE pmoles teor em fosfo-serina Sepharose da Figura 12 (P-Ser) nas fracções da . Resultados expressos Fracção P-ser Lys Arg 9-12 0 91-100 97-110 13-20 0 45-70 50-76 26-32 0 64-113 60 40 0 141 92 50 0 137 72 51 0 108 59 52 12 2 71 114 53 28 291 194 54 6 78 68 56 0 78 108 58 0 66 69 -43-

As fracções 9 a 12, 13 a 20 e 26 a 32 estão representadas como um grupo e estão apresentados apenas as quantidades máximas e mínimas. TABELA 3

Análise da sequência de aminoácidos das fracções 52+53 da coluna de Fe^+ Sepharose da Figura 12 SNELHQVP (1-8) KPSSPPEELK (136-145) ENSTDYLYPEQLK (301-313)

Os números entre parêntesis referem-se à posição do primeiro e último aminoácido na sequência de pro-u-PA (Verde et al., 1984). As duas fracções 52 e 53 foram reunidas e sujeitas a análise de sequenciação de aminoácidos como descrito atrás. Devido a presença de três sequências diferentes, a sequência peptídica correcta foi identificada com base numa comparação com a sequência de pro-u-PA conhecida.

Conclusão A análise química das proteínas de pro-u-PE identificou com segurança serina 303 como o sítio de fosforilação e sugere fortemente serina 158 e/ou 139 com o segundo sítio possível de fosforilação. A sequência à volta das serinas 138 e 139 sugere que neste último caso, caseína

cinase II pode ser a enzima responsável pela fosforilação. A sequência 1-8 e a sequência 324-338 não são provávelmente fos- forilados; de facto, a primeira não é marcada durante a marca- ção com P (Figura 10) e a segunda não é retida na coluna de 3+

Sepharose Fe . Concluiu-se que o pro-u-PA sintetizado pelas células A431 é fosforilado nos sítios ser 138 e ser 139 e em ser 303. EXEMPLO 12

Separação cromatográfica de pro-u-PA fosforilado e não fosforilado.

Um passo necessário na análise da função da fosforilação de pro-u-PA é a separação das formas fosforiladas e não fosforiladas. Isto permite a análise das propriedades da enzima fosforilada e 'não fosforilada, a nivel funcional e molecular e também permite o estabelecimento de uma técnica que pode encontrar vias para a conversão entre as duas formas pela enzima de fosforilação ou desfosforilação. 45-

Materiais e Métodos 35

Pro-u-PA foi marcado com S e 32 P em células A431 marcadas com PMA e purificadas como descrito no Exemplo 3. 3+

Cromatografia em bloco com Sepharose quelatada com Fe 5 ml de meio condicionado marcado 35 32 com S ou P de células A431 tratadas com PMA foram ajustadas a pH 3,0 com ácido acético e incubadas com 1 ml de Sepha-rose queletada com Fe (Pharmacia), preparado como sugerido (Michel & Bennette, 1987) como uma suspensão de 1:1 vol:vol em ácido acético 0,1M pH 3,0, pré-saturada com 2 mg/ml de albumina de soro bovino. Após 45 minutos de incubação à temperatura ambiente, a amostra foi centrifugada e o sobrenadante removido. 0 restante sedimento foi então suplementado com acetato de sódio pH 3, incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos e centrifugada para colher o material eluido a pH 3.

Este processo foi repetido com o mesmo tampão a pH 4,4, 5,5, 6, 6,5 com tampão acetato de amónio a 1% pH 7 e 8 e com tampão fosfato de potássio 20QmM pH 8?0 contendo 0,5M NaCl, Finalmente, a coluna foi lavada com tampão 0,1 MEDTA/0,05 Tris-HCl pH 7,5, 0,5M NaCl. Cada um dos sobrenadantes foi suplementado com tampão fosfato de potássio e imunoprecipitado com o anticorpo monoclonal 5B4 como descrito no Exemplo 3. Os imunoprecipitados foram analisados por electroforese em gel de 12,5¾ poliacrilamida e SDS (Laemmli, 1970). > > ' Λ \

Resultados

Separação de pro-*u-PA fosforilado de não fosforilado. Os resultados da eluição em bloco da Se- 3+ pharose queletada com Fe estão apresentados na Figura 13. 35

Encontrou-se S-pro-u-PA distribuído pelas várias fracções entre pH 5 e 8. A eluição com fosfato de potássio (KP), no entanto, libertou uma quantidade substancial de pro-u-PA marcado com 32P que pode ser calculado como aproximadamente 50--60% do' total. No caso de pro-u-PA marcado com P, no entanto pouco ou nenhum material foi eluido entre pH 3 e 8. A maior parte dele agara-se à coluna e é eluida pelo fosfato de potássio. Assim, o processo separa a forma fosforilada do pro-u-PA. Ainda, a separação funcionou não apenas para pro-u-PA, mas também para a u-PA de duas cadeias. As fracções (desde o material aplicado até à eluição com fosfato de potássio) do mate- 35 32 rial marcado com S e com P, além de banda de 45 kd do pro--u-PA, também apresentaram as cadeias A e B do u-PA de duas cadeias separadas do pro-u-PA uma vez que a electrodorese foi realizada em condições redutoras.

Conclusões

Com base na experiência mostrada na Figura 13, a eluição em bloco de Fe3+-Se]»harose pode ser usada para separar pro-u-PA e u-PA fosforilado do não fosforilado, Possibelmente, este processo pode mesmo ser melhorado usando uma eluição em coluna. EXEMPLO 13

Actividade catalítica e sensibilidade ao PAI-1 da pro-urocina-se (pro-u-PA) fosforilado

Para analisar as características específicas do pro-u-PA fosforilado e não fosforilado, foi necessário separar primeiro as duas formas. Para esta finali- 3+ dade usou-se cromatografia de queletaçao com Fe . As formas separadas foram então testadas quanto à ligação a PAI-1 e quan to a actividade catalítica específica.

Materiais e Métodos

Pro-u-PA não marcado foi preparado e purificado a partir de células humanas A431 hiperproduto-ras de pro-u-PA na presença de 100 ng/ml de PMA (Stoppelli et al., 1986). Nestas condições, as células A431 produzem pelo menos 10 vezes mais pro-u-PA do que as células A431 não tratadas.

Separação de pro-u-PA/u-PA fosforilado e não fosforilado Células A431 tratadas com PMA fo-35 ram marcadas com S-L-métionina como descrito anteriormente e o pro-u-PA marcado purificado como descrito no Exemplo 3. O pro-u-PA fosforilado e não fosforilado foi separado como descrito no Exemplo 11. Fracções individuais foram reunidas como descrito no Exemplo 11 e quantidades equivalentes de misturas pro-u-PA/u-PA analisadas quanto à formação do complexo PAI-1. <· 35 O nível baixo de marcação com S-L-metionina permite a quan- tificação de cada amostra.

Formação do complexo PAl-l/u-PA A interacção do u-PA com PAI-1 resulta na formação de um complexo covalente resistente a do-decilsulfato de sódio (SDS) (Andreasen, Nielsen et al., 1986). PAI-1 apenas interactua com u-PA activo de duas cadeias e não com o pro-u-PA de uma única cadeia. Portanto, uma vez que a quantidade de u-PA de duas cadeias no material pro-uPA purificado foi suficientemente alta, este foi usado com activação prévia com plasmina. A formação de complexos foi efectuada em PAI-1 reactivado com guanidina-HCl como anteriormente descrito (Cubcllis et al., 1989).

Determinação da actividade enzimática do pro-u-PA7u-PA A actividade enzimática foi determinada sem activação prévia do pro-u-PA de uma série única cadeia com plasmina uma vez que o contaminante plasmina das preparações de plasminogénio foi suficiente para assegurar activação total do pro-u-PA para u-PA de duas cadeias (não apresentado). Actividade foi medida em 40mM Tris-HCl pH 7,5, na presença de 86 pg/ml de plasminogénio bpvino e o substrato da plasmina S-2390 0,17 mM (Kabi Vitrum, Siveden). As amostras foram incubadas durante períodos de tempo diferentes a temperatura ambiente e o desenvolvimento de côr foi seguido ao longo do tempo a 405 nm. Os valores obtidos foram substraxdos de um valor de branco obtido na ausência da enzima adicionada. Os valores são expressas com OD a 405 nm desenvolvido em 20 minutos. 49-

Resultados

Sensibilidade ao PAI-1 do pro-u-PA/u-PA fosforilado

Para ensaiar a sensibilidade ao PAI-1 do u-PA fosforilado e não fosforilados, os eluatos da coluna de quelatação com Fe à qual foi aplicado S-pro-u-PA (ver Figura 13) foram reunidas em três grupos: conjunto A (pH 3-3,5), conjunto 3 (pH 6 - 6,5) e o eluato de fosfato de potássio (KP). Amostras de cada conjunto juntamente com a amostra 3-1- total de pro-u-PA purificado aplicada na Fe -Sepharose, con-tendo o mesmo número de radioactividade S, foram incubadas com PAI-1 a diferentes proporções de PAI-1 para u-PA (desde 0,2:1 a 10:1) e depois analisado por SDS-PAGE e fluorografe. Cada conjunto continha a mesma proporção de pro-u-PA de uma cadeia para u-PA de duas cadeias. A formação do complexo PAI--1/u-PA pode ser visualizada pela formação de uma bamda de aproximadamente 90 kd. Como se mostra na Fig. 14, a banda correspondendo do complexo PAI-l/u-PA ê formada no conjunto total de pro-u-PA7u-PA, nos conjuntos A e B, mas não no eluato de KP. Portanto, o material eluido por fosfato de potássio, apesar de conter quantidades equivalentes de u-PA de duas cadeias reage fracamente com PAI-1 quando comparado com as outras amo£ tras. Assim, a fosforilação interfere com a ligação do u-PA a PAI-1.

Determinação da actividade de pro-u-PA/u-PA fosforilados

As amostras das fracções obtidas 3+ com a eluição em bloco da Fe -Sepharose contendooo mesmo nú- 35 mero de contagens S foram ensaiadas quanto à actividade en-zimittica na presença de plasmina com um substrato específico da plasmínio S-2390, Os resultados estão apresentados na Tabe- 50-

la 4, A fracção kp (i.e. a que eluiu com&[tampão fosfato de potássio e representando o pro-u-PA/u-PA fosforilado) tem acti. vidade enzimática comparável à de material introduzido, i.e. o pro-u-PA/u-PA isolado a partir das células A431. Em relação ao material presumivelmente não fosforilado (conjuntos A e ô), o pro-u-PA/u-PA fosforilado é 20-30% mesmo activo. Quando comparado com um padrão de urocinase internacional, o conjunto KP tem uma actividade específica de aproximadamente 85000 UI/ /mg. TABELA 4

Actividade enzimática das fracções de pro-u-PA/u-PA 3* separadas por aluição em bloco com Fe -Sepharose

Fracção (a)

Actividade (b) 0,44 0,50 0,55 0,40

Total

Conjunto A Conjunto B KP (a) As fracções usadas são as mesmas da experiência mostrada na Figura 14 e são marcadas do mesmo modo. (b) A actividade de u-PA é expressa na OD450 nm desenvolvido em 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, subtraí^ da de um valor branco em que não se adicionou enzima. Amo£ tras de 5 ul de cada fracção correspondendo a valores apro -51-

35 ximadamente idênticas de radiocatividade de S foram usados para cada caso.

Conclusões

Os resultados demonstram claramente que o pro-u-PA/u-PA fosforilado é aproxiraadamente tão acti-vo quanto a enzima isolada das células A431. No entanto, ele é resistente ao inibidor específico PAI-1. A sensibilidade diferencial do PAI-1 é pelo menos 10 vezes raais baixo no caso do u-PA fosforilado. u-PA ou pro-u-PA comum e deverá permitir um decréscimo da dose activa de pelo menos 10 vezes. EXEMPLO 14

Posforilação in vitro dos peptídeos pro-u-PA

Sintetizou-se um peptídeo que simula a sequência do pro-u-PA que rodeia os resíduos fosfo-se-rina 138 a 139 identificados no Exemplo 11 e testado a sua capacidade para actuar como substrato da caseína cinase II.

Materiais e métodos

Sintetizaram-se peptídeos com um sintetizador automático de peptídeos em fase sólida (tipo 430A, Applied Biosystems) e purificarara-se por HPLC de fase reversa

numa coluna NOVAPAK C-18 usando um sistema Waters 501. Os pep-tídeos foram liofilizados e dissolvidos em 0,1M MES pH 6,4, 2mM EGTA, 5mM MgC^. A caseína, cinase II foi purificada a partir de cérebro de rato e testado como descrito (Maggio et al., 1981). Os ensaios com cinase foram efectuadas num volume final de 0,1 ml contendo peptídeos 100 μΜ e 10 μΜ ATP contendo 0,5 pCi de £gama- P-ATPj. As amostras foram incubadas a 30SC e as reacções paradas pela adição de 1M HC1. As amostras foram então aquecidas durante 5 minutos num banho-maria a ferver e adicionado um volume igual de ácido trifluoroacético. Noutras casos, as reacções foram paradas pela adição de ácido acético a 30% e as amostras tratadas como descrito (Egan et al., 1988) As amostras foram aplicadas numa coluna de HPLC em fase reversa (NOVAPAK C-18) e fraccionadas usando gradientes diferentes de 0-100% de acetonitrilo cora um fluxo de 0,5 ml/min. As frac-ções (0,5 ml) foram colhidas e a radioactividade associada determinada por contagem de cintilação líquido (radiação Caren-kov). Nalgumas experiências, ATO radioactivo não incorporado e peptídeos foram separados numa coluna Dowex AG l-x8 (0,6 ml 20-50 mesh mais 0,2 ml 200-400 mesh, equilibrada com ácido acético a 30%).

Resultados O peptídeo de pro-u-PA 133-143 e um peptídeo irrelevante ITKFGEQSTDY foram testados. Os resultados estão apresentados na tabela 5. Estes mostram que o peptídeo pro-u-PA 133-143 é um bom substrato para a caseína-cina-se II. A Figura 15 mostra a separação por HPLC do fosfopeptí-deo a partir da radioactividade não incorporada. 53-

TABELA 5

Posforilação do peptídeo pro-u-PA 133-143 ^ 32

Proteína-einase cpm de P-ATP inconparado CTR PEP1 PEP2

Caseína cinase XI 4000 48000 25000 CTR PEP1 PEP2

= incorporação na ausência de peptídeo as ITKFGEQSTDY = DGKKPSSPPEE (pro-u-PA 133-143)

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Claims (1)

1. -56-

   Χ' .· REIVINDICAÇÕES: lã. - Processo para obtenção de activador do plasminogénio fosforilado substâncialraente livre de activador do plasminogénio não fosforilado, caracterizado por compreender a separação de activador do plasminogénio fosforilado a partir de uma mistura de activador do plasminogénio fosforilado e de activador do plasminogénio não fosforilado. 2i. - Processo para obtenção de pro-u-PA fosforilado substâncialmente livre de pro-u-PA fosfo rilado a partir de uma mistura de pro-u-PA fosforilado e de pro-u-PA não fosforilado. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ou reivindicação 2, caracterizado por a preparação ser efectuada por cromatografia de quelação de Fe3+. 4S. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: (i) a cultura de uma linha celular humana que produz activador do plasminogénio; (ii) o isolamento do activador do plasminogénio assim produzido; e (iii) a separação do activador do plasminogénio fosforilado a partir do activador do plasminogénio não fosforilado. -57-

   5a. - Processa ;dè acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender: (i) a cultura de uma linha celular humana que produz pro-u-PA; (ii) o isolamento do pro-u-PA assim produzido; e (iii) a separação do pro-u-PA fosforilado a partir de pro-u-PA não fosforilado. 6â. - Processo para aumentar o grau de fosforilação de um activador do plasminogénio, caracterizado por compreender a fosforilação do activador do plasminogénio com uma enzima de fosforilação. 7â. - Processo para aumentar o grau de fosforilação de pro-u-PA, caracterizado por compreender a fosforilação de pro-u-PA com uma enzima de fosforilação. 8a. - Processo para a preparação de activador do plasminogénio fosforilado substâncialmente livre de activador do plasminogénio não fosforilado, caracterizado por compreender a fosforilação de activador do plasmini-nogénio não fosforilado com uma enzima de fosforilação. 9a. - Processo para a preparação de pro-u-PA fosforilado substancialmente livre de pro-u-PA não fosforilado, caracterizado por compreender a fosforilação de pro-u-PA não fosforilado com uma enzima de fosforilação. -58-

   10 ã. - Processo de acordo cora a reivindicação 8, caracterizado por uma mistura de activador do plasminogénio fosforilado e não fosforilado ser tratada com a enzima de fosforilação. lis. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por uma mistura de pro-u-PA fosforilado e não fosforilado ser tratada com a enzima de fosforilação. 12â. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável e, como ingrediente activo, activador do plasminogénio não fosforilado. 13â. - Processo para a preparação de Uma composição farmacêutica caracterizado por se incluir na referida composição um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável e, como ingrediente activo, pro-u-PA fosforilado que está substancialmente livre de pro-u-PA não fosforilado. 14â. - Processo para a preparação de u-PA fosforilado que está substancialmente livre de u-PA não fosforilado, caracterizado por compreender o tratamento, com plasmina de pro-u-PA fosforilado que está substancialmente livre de pro-u-PA não fosforilado. 15ã, - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável e como ingrediente activo, u-PA fosforilado que -59- -59-

   está substâncialmente livre de u-PA não fosforilado. 16â. - Anticorpo, caracterizado por reconhecer específicamente o activador do plasminogénio fosforilado. 17§. - Método de terapia trambo-lítica num paciente, caracterizado por se compreender a administração a um paciente, dela necessitado, de uma quantidade efica2 de activador do plasminogénio fosforilado que está substâncialmente livre de activador do plasminogénio não fosforilado, sendo a gama de dosagem de 4 a 40 mg, de preferência por via parentérica. 18â. - Método de terapia trombo-lítica num paciente, caracterizado por compreender a administração a um paciente, dela necessitado, de uma quantidade eficaz de pro-u-PA fosforilado que está substancialmente livre de Pro-u-PA não fosforilado ou de u-PA fosforilado que está -60-

   substâncialmente livre de u-PA não fosforilado, sendo a gama de dosagem de 4 a 40 mg, de preferência por via parentérica. Lisboa, 12 de Abril de 1990

   ]. PEREIRA DA, CRUS Ajente Oficial os Prspnesísáe hu.-istrisl RUA VICTOn COr®©N, 10-A, 1.‘ 1250 uesas