PT92779A - Processo para microencapsular substancias bioactivas em polimeros biocompativeis - Google Patents

Description

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Descrição referente â patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, cora sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Países Baixos, (inventores: Joseph Komen e Jan Willem Groenendaal, residentes na Holanda), para "PROCESSO PARA MICROENCÃFSOIAR SUBSTÂNCIAS BIQACTIVAS EM POLÍ-MEROS BIOCOMPATlVEIS" .

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a um pro cesso para microencapsular substâncias bioactivas em polímeros bioccmpatlveis de acordo com o principio de separação de fases e de composições farmacêuticas que contem as microcãpsulas prepara das de acordo com este processo. A mieroencapsulação de substâncias bio activas em polímeros bioccmpatlveis e útil para a preparação de composições de libertação controlada· O polímero utilizado deter mina assim as earaeterlstieas de libertação das substâncias bioactivas· Os polímeros biocompatlveis que são também biodegradáveis são especialmente adequados para a produção de composições injectãveis.

As tecnologias para a microencapsula-ção foram descritas por W. Fong em "Controlled Release Systems: Fabrication Technology” Vol. I Editor Dean Hsieh 1989, CRD Press, 1

Piorida, 1988, capitulo 5, pãg. 81-108 "Microeneapsulation by solvent evaporation and organic phase-separation processes". Refere-se ai que o principio da separação de fases, ao contrario da dispersão em solventes, ê especialmente adequado para encapsu lar substâncias bioactivas hidrofílicas, mas S também aplicável ãs que são insolúveis em agua. Os produtos de encapsulação podem ser microcãpsulas verdadeiras, "heterogéneas", em que o polímero encapsula o núcleo bloactivo. Os produtos podem também ser "ml-croesferas homogéneas" em que a substância bioactiva é dispersa no polímero. A microencapsulação por separação de fases de substâncias hidrofílicas bioactivas em polímeros biodegradáveis foi descrita na patente EP 0052510 e GB 2165517. A microencapsulação de uma substância hldrofllica bioactiva em polímeros não-biodegradáveis foi descrita por S. Benita e col., J. Phatm. Pharmacol. 1985, 37, 391-395, "Microeneapsulation of Para cetamol Using Polyacrylate Resins (Eudragit Retard)". Estas técnicas compreendem geralmente as seguintes fases: a. Dispersar-se uma substância bioactiva numa solução (num solvente orgânico que não seja misclvel com a água) de um pollme ro bioccmpatlvel, b. Adicionar-se â dispersão um designado não-solvente (ou agente de coacervação), um liquido orgânico que não seja misclvel com o polímero blocompatlvel* Esta operação resulta na coacerva-ção (ou separação de fases) em que se deposita o polímero bio compatível na substancia bioactiva dispersa para formar micro capsulas "embrionãrias", c. Extrair-se o solvente orgânico residual das microcãpsulas "em brionãrias" e endurecerem-se por adição â dispersão um excesso, em relação ao volume combinado de solvente e não-solvente de um liquido designado por endurecedor, d. Recolherem-se as microcãpsulas endurecidas da dispersão, lava rem-se as microcãpsulas, e secarem-se as microcãpsulas por qualquer dos processos conhecidos.

As substâncias hidrofílicas bioactivas que podem ser encapsuladas por esses processos são os polipépti-dos como por exemplo a hormona luteinizante, somatostatina e in-terferio. Eles são muito dispersáveis em água antes de se disper - 2 -

sarem no solvente orgânico, mas isto não ê sempre necessário (vei por exemplo a patente 6B 2165517). Podem também ser encapsulados compostos lipofílicos bioactivos como por exemplo esteróides.

Os polímeros biocompatíveis, biodegradáveis que se sabe serem úteis na encapsulação de substâncias bioactivas nos processos acima descritos são os polilâctidos, po liglicólidos e copolímeros de lâctidos e glicólidos. Os polímeros não biodegradáveis biocompatíveis úteis são as resinas de po liacrilato dependentes de pH como por exemplo EODR&GIT-S e as re sinas de poliacrilato independentes do pH como por exemplo EUDRA GIT-RS e etil celulose.

Os solventes orgânicos que são raisci-veis com o polímero e com o não solvente, sendo contudo imiscí-veis com a ãgua, são os bidrocarbonetos halogenados, como por exemplo diclorometano {CH2C12)»

Os não solventes úteis são os óleos de silicone. A invenção refere-se em particular à fase de endurecimento de microcãpsulas. O líquido endurecedor a utilizar nesta fase tem de extrair eficientemente e totalmente qualquer solvente e não-solvente das microcãpsulas sem dissolver o polímero biodegradável ou a substância bioactlva e sem alterar as microcãpsulas ou provocar a sua agregação. Embora a quantidade de qualquer resíduo nas microcãpsulas deva ser mantida no mínimo, qualquer quantidade residual de endurecedor tem de ser absolutamente biocompativel.

Até agora apenas ura número muito limitado de líquidos tem efectivamente sido utilizado corno líquido endurecedor. A patente EP 0052510 refere como líqui dos endurecedores os solventes orgânicos de alcano como por exem pio heptano. A patente GB 2165517 refere que estes compostos ten dem a deixar uma quantidade substancial de resíduo nas cápsulas finais, e que são inflamáveis e/ou tóxicos. Assim a patente GB 2165517 dirige^se â utilização de líquidos endurecedores de M-drocarbonetos fluor- ou fluorhalogenados, como por exemplo os co nhecidos segundo a designação geral de Ereon®, que se sabe deixares uma pequena quantidade de resíduo e acurem menos tóxicos. 3

Contudo, a quantidade de resíduo ê efectivamente ainda substancial e estes compostos nao tem geralmente utilização para aplica ções médicas sistemáticas diferentes da inalação e eles não têm sido declarados livres de toxicidade. Além disso, embora a paten te GB 2165517 recomende a aplicação destes compostos na preparação de microcãpsulas baseadas em vários polímeros biocompatlveis, biodegradáveis, por exemplo os de L-lãctido, e os copolímeros de DL-lãctido e glicôlido, apenas os últimos, numa solução a 2%, fo ram efectivamente utilizados nos seis exemplos da patente GB 2165517. Têm sido feitas muitas tentativas para preparar micro-cápsulas de acordo com a patente GB 2165517 utilizando cjuer o Freon 113® (1,1,2-triclorotrifluoroetano) e Freon 11 ® (triclo-rofluorometano) como líquidos endurecedores e DL-láctido como po limero blocompatível numa solução 2% e a 10% p/p que falharam to dos no endurecimento das micro capsulas.

Verificou-se agora que os ésteres de etilo e de isopropilo de ácidos gordos de cadeia linear com 12--18 átomos de carbono são muito eficazes como líquidos endurecedores para utilização na preparação de microcãpsulas de acordo com o princípio de separação de fases. Exemplos destes compostos são o estearato de etilo, estearato de isopropilo, oleato de eti lo e preferivelmente miristato de isopropilo e palmitato de isopropilo. O miristato de isopropilo ê o liquido endurecedor mais preferido de acordo com a invenção, sendo o mais versátil nas suas aplicações. O miristato de isopropilo e o palmitato de isopropilo são ambos utilizados com excipientes dermatológicos e sabe-se que têm uma muito pequena toxicidade. For exemplo, tentativas para estabeleeer um valor de LDgg do miristato de isopropilo era ratos falharam quando as dosagens equivalentes a 100 ml/kg não afectavam os animais. Assim estes compostos são considerados totalmente biocompatíveis. Além disso, eles não são inflamáveis nera são prejudiciais para o ambiente, A invenção e portanto caracterizada por na fase de endurecimento das microcãpsulas o líquido endurecedor ser um éster de etilo ou de Isopropilo de um acido gordo de cadeia linear com 12-18 átomos de carbono ou uma sua mistura. G volume do líquido endurecedor utili- - 4 -

zado de acordo com m invenção e preferivelmente de 5-25 vezes o volume total de solvente e não-solvente.

Para evitar a formação de microcãpsu-las com forma irregular, a temperatura durante o proeesso de endurecimento ê preferivelmente mantida entre 3-259 C. Mais preferivelmente a temperatura e mantida entre 3-109 C guando se utili zam o miristato de isopropilo ou palmitato de isopropilo para o endurecimento de poli-DL-lactido-qo-glicólido ou poli-L-lãctidO, e entre 18-259 C quando se pretende endurecer o poli-DL-láetido.

Opcionalmente podem lavar-se as micro-cápsulas após a fase de adição do líquido endurecedor.

Deve notar-se que em principio se podem encapsular todos os tipos de substâncias hidrofílicas e lipo fílicas em microcãpsulas de acordo coia a invenção, especialmente quando se pretender uma acção prolongada. Exemplos de substancias hidrofílicas bioactivas são as hormonas e factores de liber taçao de hormonas e medicamentos com actividade anti-inflamató-ria, anti-ulcera péptica, anti-tumor, anti-depressiva, anti-hi-pertensiva ou antibiótica. Em particular os pêptidos e proteínas são adequados para serem utilizados como compostos hidrofilicos bioactivos, tais como hormonas adrenocorticotróficas, angiotensi nas, factores de coagulação do sangue (factor VII, factor VIII), calcitoninas, factores de libertação da corticotrofina, factores de regulação do crescimento celular ÍE6P, T6P-0C e -^), endorf i-nas, encefalinas, pêptidos inibidores gástricos, gastrinas, pêptidos libertadores de gastrina, hormonas do crescimento, factores hemopoiêtieos (11-3, 11-6, CSP e EPO), insulinas, interfe-rões, oxitocina, hormonas paratiróides, somatostatina e vasopres sinas, e os seus análogos e fragmentos farmacologicamente acfci-vos.

Exemplos de substâncias lipofílicas bioactivas que podem ser microencapsuladas de acordo com a inven ção são os esteróides. Em particular a invenção ê útil para encapsular o 17,21-dipropionato de beclometasona, em composições orais de libertação controlada para tratamento de problemas do intestino.

Exemplos específicos adicionais de - 5 -

substâncias bioactivas que podem ser microencapsuladas de acordo com a invenção são o ácido 4- e 5-amino-salicilIco e o Subeitra-to de Bismuto Coloidal. A invenção também inclui as microcâpsu las preparadas de acordo com o processo descrito bem como as com posições, como por exemplo composições farmacêuticas, que contêm estas raicrocãpsulas num veículo adequado, A invenção inclui, em particular, composições farmacêuticas injectãveis, em que as raicrocãpsulas são dispersas num veículo líquido adequado, e composições farmacêuticas orais, em que as microcãpsulas são dispersas num veiculo adequado, A invenção ê ilustrada pelos seguintes

Exemplos, EXEMPLO 1

Encapsulação de BSA em solução aquosa, num poli-L-lâctido

Dissolveram-se 100 mg de BSA (Sigma, art. NO, A 7030) em 0,8 ml de água. Adicionou-se esta solução a um balão de Erlenmeyer contendo 100 ml de uma solução a 2% de po li-L-lãctido (Boehringer Ingelheim, lot. 190. EC 8707, peso molecular médio 220 000, viscosidade inerente 1,82 dl/g, em CHCl^ a 250 C) em diclorometano. Passados 2 minutos de agitação (1000 RPM, adicionaram-se, mantendo a agitação, 60 ml de Sleo de sili-cone (Wacker AR 1000), durante mals 15 minutos (300 rpm). Deitou -se em seguida o conteúdo do Erlenmeyer em 1800 ml de miristato de isopropílo (Benkel) a 50 C, que foi também agitado (850 rpm) durante mals 90 minutos, apos o que se peneiraram as microcãpsu-las para extraí-las do líquido, utilizando uma sequência de 100, 50 e 25 pm nos peneires. Finalmente, lavaram-se e secaram-se as raicrocãpsulas.

As microcãpsulas recolhidas eram fluídas e por inspecção microscópica pareciam ser geralmente esféricas e conterem gotículas com cerca de 1-10 jam, dispersas uniformemente nos esfêrulos. As quantidades de microcãpsulas recolhidas nos três peneiros eram as seguintess

Tamanho de mlcrocápsula Quantidade recolhida 25 - 50 pm 223 mg 50 - 100 jam 354 mg ^ 100 jum 730 mg 1357 mg O teor âe BSA nas microcãpsulas foi de terminado de acordo com I-I.M. Bradford (Analyt. Biochem. 72 1576 248-254} e verificou-se ser de 2,40% p/p, correspondente a um teor total de BSA nas microcãpsulas recolhidas de 33 mg* Isto re presenta um rendimento de 33% em BSA. EXEMPLO 2

Encapsulacao de BSA, seco em poli-BL-lãcfcido co-glicólido

Adicionaram-se 100 ml de uma solução a 10% em diclorometano de poli-DL-lãctido co-glicõlido 50:50 (Bo ehringer Ingelheim. lot 179. EC 8713} peso molecular médio de 91 000, viscosidade inerente de 0,7 dl/g, em CHCl^ a 259 C) a 800 mg de BSA (Sigma, art. 179. A 7030, ccui uma fracção peneirada de 2-21 um de tamanho de partícula) num vaso de reacção seco, agitado a 1200 rpm durante 5 minutos. Posteriormente, enquanto se agitava a 400 rpm, adicionaram-se durante 1 minuto 50 ml de óleo de silicone (Wacfcer AK 2000), após o que continuou a agitação durante mais 5 minutos a 200 rpm. Deitou-se em seguida o con teudo do vaso de reacção em 2000 ml de mirlstato de isopropilo (Henkel) a 59 C, que foi também agitado (850 rpm) durante mais 2 horas, após o que se separaram, por peneiração, as microcãpsulas do líquido utilizando um peneiro de 25 jum. As microcãpsulas foram em seguida lavadas, peneiradas de novo utilizando uma seguên cia de peneiros de 140 e 25 jum.

As microcãpsulas recolhidas eram fluídas, por inspecção microscópica verificou-se que eram esfêrulas indentadas. A sua dimensão era de 25 e 140 jura e o rendimento total foi de 8500 mg, o que representa cerca de 85%* 0 teor de BSA nas microeapsulas foi determinado de acordo com M.M. Bradford e verificou-se ser de 4,73% p/p, correspondendo a um teor total de - 7 - lÒi J&j.

BSA nas microcãpsulas recolhidas de 402 mg. Isto representa um rendimento de 50,2% em BSA* EXEMPLO 3

Encapsulação do BSA seco em poll-DL-lâctido

Prepararam-se microcãpsulas utilizando as fases semelhantes as do Exemplo 2, cem as seguintes modificações: O polímero era o poli-DL-lãctido (CA--Biochem, lot. N9. COSO, peso molecular médio de 19.000) como uma solução a 10% em diclorometano. O não-solvente era o óleo de silicone Dow Corning DC 200 fluído 200 Cst.

Utilizou-se miristato de isopropilo nu ma quantidade de 2500 ml a 209 C.

As microcãpsulas recolhidas eram mode-radamente pegajosas. Elas tinham a forma esférica, e entre 25 e 140 jm de tamanho. Ô seu rendimento total «ca de 7900 mg, ou seja cerca de 80%. O teor de BSA das microcãpsulas foi determinada de acordo cora M.M. Bradford and verificou-se ser de 3,5% p/p, correspondendo a um total de teor de BSA nas microcãpsulas recolhidas de 276 mg. Isto representa um rendimento de 43,8% em BSA. EXEMPLO 4

Encapsulagao de BSA seco eia poli-DL-lãctldo co-glicõlido. Líquido endurecedor s laurato de efcilo

Adicionaram-se 32 ml de uma solução a 10% «a diclorometano de poli-DL-lãctido co-glicõlido 50:50 (Reso mer Rg 505 Boehringer Xngelheim, lot. N9. ECS713, peso molecular médio de 91 000, viscosidade inerente de 0,7 dl/g, em CHClg a 259 C) a 150 mg de BSA (soro de albumina de bovino Sigma prod. 119. A-7030, fracçao peneirada de 2-21 pm tamanho de partícula), num copo de vidro seco de 100 ml. Dispersou-se o BSA por agitação a 1000 rpm durante 5 minutos â temperatura ambiente. Poste- — 8 —

Λι<ί*

riormente, adicionaram-se durante 2 minutos, enquanto decorria a agitação a 400 rpm, 16 ml de polidimetilsiloxano {Dow Corning DC 360, qualidade medica, viscosidade 2000 cS). Adicionou-se em seguida o conteúdo do copo a 500 ral de laurato de etilo ("zar sun-these*, Merck art. 805334}, a 209 C, que também se agitou (400 rpm) durante mais 16 horas, após o que se parou a agitação. Apõs sedimentação das microcãpsulas decantou-se o laurato de isopropi lo. Em seguida adicionou-se uma quantidade fresca de 250 ml de etanol e agitou-se durante 16 horas a 400 rpm. Apõs se parar a agitação e se decantar de novo, adicionaram-se 250 ml de etanol e agitou-se a 400 rpm durante 10 minutos. Apõs os últimos procedimentos de lavagem com etanol, recolheram-se as capsulas sobre um filtro de membrana de teflon de 10 pM filtrando o etanol. Secaram-se as microcãpsulas durante 24 horas numa vazio continuo. O rendimento total de microcãpsulas fo:. de 3,02 gramas. 0 rendimento de microcãpsulas de 25-160 pM foi de 2,86 g o que representa cerca de 85,4%,

Determinou-se o teor de BSA de acordo com M.M. Bradford e verificou-se ser de 2,3% p/p, correspondente a um teor total de BSA nas microcãpsulas recolhidas de 0,066 gra mas de BSA. Isto representa um rendimento de 44,0% em BSA. EXEMPLO 5

Encapsulação de insulina seca em poli-DL-láctido co-gllcólido Líquido de endurecimento ; mirlstato de isopropllo

Micionarsm-se 200 ml de uma solução a 10% em diclorcunetano de poli-DL-lãctido co-glicõlido 50s50 (Re somer RG 505 Boehringer Ingelheim, lot. 139, EC7813, peso molecular médio de 91 000, viscosidade inerente de 0,7 dl/g, em CHCl^ a 259 C) a 1 grama de insulina (insulina de bovino Sigma prod. N9. 1-5500 lot. N9. 38F-0827 de partículas microcristalinas de *· 15 pM) num frasco de vidro seco de 300 ml, Dispersou-se a insuli na agitando a 1200 rpm durante 5 minutos â temperatura ambiente. Posteriormente, enquanto se agitava a 400 rpm, adicionaram-se 100 ml de polidimetilsiloxano (Dow Corning DC 360, qualidade med. ca, viscosidade de 2000 cS) durante 2 minutos. Adicionou-se em - 9 -

seguida o teor do frasco a 4000 ml de miristato de isopropilo (Henkel), a 209 C, que também se agitou (4i0 rpm) durante mais 24 horas, apôs o que se parou a agitação* Após a sedimentação das microcãpsulas decantou-se o miristato de isopropilo. Em seguida adicionou-se uma quantidade fresca de 1000 ml de miristato de isopropilo e agitou-se durante mais 24 horas a 400 rpm. Após se parar a agitação e decantar-se de novo, adicionaram-se 400 ml de etanol e agitou-se a 400 rpm durante 10 minutos. Após decan-tar-se o etanol, repetiu-se o procedimento da lavagem por duas vezes. Após o ultimo procedimento de lavagem com etanol, recolhe ram-se as microcãpsulas sobre um filtro de membrana de 10 pM por filtração do etanol. Secaram-se as microcãpsulas durante 24 horas em condições de vazio contínuo. O rendimento total de microcãpsulas foi de 20 gramas. O rendimento de microcãpsulas de 25-140 pM foi de 19,5 g que representa cerca de 93%. O teor de insulina foi determinado de acordo com M.M. Bradford e verificou-se ser de 3,9% p/p, correspondente a um teor total de insulina nas microcãpsulas recolhidas de 0,760 gramas de insulina, o que constitui um rendimento de 76,1% em insulina. EXEMPLO 6

Encar-sulação de insulina seca em poli-DL-lãctido co-glicólido. Líquido endurecedor : miristato de etilo

Adicionaram-se 109 ml de uma solução a 10% em diclorometano de poli-DL-lãctido co-glicólido 50;50 (Reso mer RG 505 Boehringer Ingelheim, lot. H9. EC8713, peso molecular médio de 91 000, viscosidade inerente de 0,7 dl/g, em CEC13 a 259 C) a 500 mg de insulina (insulina de bovino Sigma prod. N9. 1-5500 lot. ΪΙ9. 38F-0827 de partículas mierocristalinas de 15 μM) num frasco de vidro seco de 300 ml. Dispersou-se a insulina agitando a 1000 rpm durante 5 minutos â temperatura ambiente. Poste riormente, enquanto se agitava a 400 rpm, adicionaram-se 50 ml de polidimetilsiloxano (Dow Corning BC 360, qualidade medica, viscosidade de 2000 cS) durante 2 minutos. Adicionou-se em segui - 10 -

da o conteúdo do frasco a 3,500 ml de miristato de etilo ("zur synthese*, Merck art. 818970), a 20? C, que também se agitou (400 rpm) durante mals 2 horas, após o que se parou a agitação· Apôs a sedimentação das microcãpsulas decantou-se o miristato de etilo. Em seguida adicionou-se uma quantidade fresca de 500 ml de miristato de etilo e agitou-se durante mais 24 horas a 400 rpm. Após se parar a agitação e decantar-se de novo, adicionaram -se 400 ml de etanol e agitou-se a 400 rpm durante 10 minutos. Após decantar-se o etanol, repetiu-se o procedimento da lavagem por duas vezes. Apôs o ultimo procedimento de lavagem com etanol recolheram-se as mictocãpsulas sobre o filtro de membrana de 10 pM por filtração do etanol. Secaram-se as microcãpsulas durante 24 horas em condições de vazio contínuo. O rendimento total de microcãpsulas foi de 9,01 gramas, O rendimento de microcãpsulas de 25-140 jjM foi de 8,41 g o que representa cerca de 80%. O teor de insulina foi determinado de acordo com M»M. Bradford e verificou-se ser de 3,5% p/p, correspondente a um teor total de insulina nas microcãpsulas recolhidas de 0,294 gramas de insulina, Isto constitui um rendimento de 58,9% em insulina. EIEMPLQ 7

Encapsulação de insulina seca em poliHDL~lãctido co-glicolido. Líquido endurecedor t oleato de etilo

Adicionaram-se 100 ml de uma solução em diclorometano de poli-DL-lãctido co-glieõlido 50;50 (Resomer RG 505 Boehringer Ingelheim, lot. K?. 1C8713, peso molecular médio de 91 000, viscosidade inerente de 0,7 dl/g, em CHCl^ a 25? C) a 500 mg de insulina (insulina de bovino Sigma prod, B?. I--5500 lot. NP. 38F-0827 de partículas microcristalinas de 15 pM) e um frasco de vidro seco de 300 ml. Dispersou-se a insulina agi tando a 1000 rpm durante 5 minutos ã temperatura ambiente. Poste riormente, enquanto se agitava a 400 rpm, adicionaram-se 50 ml de polidimetilsiloxano (Dow Corning DC 360, qualidade medica, viscosidade de 2000 cS) durante 2 minutos. Adicionou-se em segui - 11 - da o conteúdo do frasco a 1500 ml de oleato de etilo (PSB ch. 969) a 209 C, que também se agitou (400 rpm) durante mais 2 horas, após o que se parou a agitação. Após a sedimentação das mi-crocãpsulas decantou-se o eleato de etilo. Em seguida adicionou--se uma quantidade fjssca de 500 ml de miristato de isopropilo e agitou-se durante mais 24 horas a 400 rpm. Após se parar a agita ção e decantar-se de novo, adicionaram-se 400 ml de etanol e agi tou-se a 400 rpm durante 10 minutos. Após decantar-se o etanol, repetiu-se o procedimento da lavagem por duas vezes. ApÓs o últi mo procedimento de lavagem com etanol, recolheram-se as mlcroeãg sulas sobre um filtro de membrana de 10 juM por filtração do etanol, Secaram-se as microcãpsulas durante 24 horas em condições de vazio continuo. O rendimento total de microcãpsulas foi de 9,01 gramas. O rendimento de microcãpsulas de 25-140 jaM foi de 8,2 gramas o que representa cerca de 78.0%. O teor de insulina foi determinado de acordo com M.M. Bradford e verificou-se ser de 3,5% p/p, correspondente a um teor total de insulina nas microcãpsulas recolhidas de 0,287 gramas de insulina. Isto constitui um rendimento de 57,4% em insulina. BKEMPLQ 8

Encapsulação de insulina seca em poli-DL-lâctido co-glicõlido.

Liquido endurecedor : palmitato de isopropilo

Adicionaram-se 100 ml de uma solução a 10% em diclorometano de poli-DL-lãctido co-glicôlido 50:50 (Re somer RG 505 Boehringer Ingelheim, lot. XT9. EC8713, peso molecular médio de 91 000, viscosidade inerente de 0,7 dl/g, em CECl^ a 259 C) a 500 mg de insulina (insulina de bovino Sigma prod. H9 1-5500 lot. N9. 38R-0827 de partículas microcristalinas de 15 JiM) num frasco de vidro seco de 300 ml. Dispersou-se a insulina agitando a 1000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Poste riormente, enquanto se agitava a 400 rpm, adicionaram-se 50 ml de polidimetilsiloxano (Dow Corning DC 360, qualidade medica, viscosidade de 2000 cS) durante 2 minutos. Adicionou-se em segui - 12 da o conteúdo do frasco a 1500 al de palmitato de isopropilo (Henkel Cospha products lot. 727067) a 209 C, que também se agitou (400 rpm) durante mais 16 horas, apôs o que se parou a agita ção. Apõs a sedimentação das microcãpsulas decantou-se o palmlta to de isopropilo. Em seguida adicionou-se uma quantidade fresca de 500 ml de miristato de isopropilo e agitou-se durante mals 10 minutos a 400 rpm. Apõs se parar a agitação e decantar-se de novo, adicionaram-se 400 ml de etanol e agitou-se a 400 rpm durante 10 minutos. Apôs decantar-se o etanol, repetiu-se o procedimento da lavagem por duas vezes. Apôs o último procedimento de lavagem com etanol, recolheram-se as microcãpsulas sobre um filtro de membrana de 10 pM por filtração do etanol. Secaram-se as microcãpsulas durante 24 horas em condições de vazio continuo. O rendimento total de microcãpsulas foi de 9,81 gramas. 0 rendimento de microcãpsulas de 25*140 fM foi de 3,10 gramas o que representa cerca de 30%. O teor de insulina foi determinado de acordo com. M„M. Bradford e verificou-se ser de 3,4% p/p, correspondente a um teor total de insulina nas microcãpsulas recolhidas de 0,105 gramas de insulina. Isto constitui um rendimento de 21,1% em insulina. EXEMPLO 9

Encapsulação do 17,21-dipropionato de beclomotasona eia EUDR&GIT--RL.

Liquido endurecedor ; miristato de isopropilo

Adicionaram-se 30 ml de uma solução a 10% em diclorometano de EUDRAGIT-RL-100 a 0,333 g de 17,21-dipro pionato de beelametasona num frasco de vidro de 100 ml. Dissol-veu-se o dipropionato de beclometasona agitando a 250 rpm â temperatura ambiente. Posteriormente, enquanto se agitava a 250 rpm, adicionaram-se durante 1 minuto 30 ml de polidimetllsiloxano (Wa cker AK-1000, viscosidade de 1090 cS), Adicionou-se em seguida o conteúdo do frasco a 500 ml de miristato de isopropilo (Henkel), a 209 C, que foi também agitado a 250 rpm durante mals 24 horas, apôs o que se parou a agitação. Apôs sedimentação das microcãpsu - 13 -

las deeantcu-se o miristato de isopropilo. Lavaram-se as micro» capsulas duas vezes com 200 ml de N-hexano e recolheram-se num filtro de membrana de 10 pM. Secaram-se em seguida as mierocãpsu las durante 24 horas ã temperatura ambiente. O rendimento total de microcãpsulas foi de 3 gramas, o que representa cerca de 90%. O teor de 17,21--dipropionato de beclometasona determinado por HPLC era de 7,9% p/p, correspondente a um teor total de 17,21-dipropionato de be-clometasona nas microcãpsulas recolhidas de 0,24 g, o que representa um rendimento de 72% p/p. EXEMPLO 10

Teor residual de líquidos endurecedores diferentes nas microcãp-sulas

Determinou-se o teor residual de miris tato de isopropilo nas microcãpsulas, preparadas de acordo com o Exemplo 2 por cromatografla de camada fina e verificou-se ser de 5% p/p.

Determinou-se o teor residual de hepta no nas microcãpsulas, preparadas de acordo cm o Exemplo 2 (miristato de isopropilo substituído por heptano) por cromatografia de gãs liquido e verificou-se ser de aproximadamente 8% p/p.

Determinaram-se os teores residuais de Freon 113 e Freon 11 em microcãpsulas, preparadas de acordo com o Exemplo 2 da Patente GB-2165517, por cromatografia de gãs-llqu.. do e verificou-se ser de 24% p/p e 19% p/p, respectivaaente· EXEMPLO 11

Libertação de BSA das microcãpsulas

Colocaram-se 10 amostras de Sõ mg de microcãpsulas, preparadas de acordo com o Exemplo 2, te 100 ml de tampão de fosfato, pH 7,4, a que se adicionaram 100 mg de azi da de sódio. Mantiveram-se os recipientes durante os períodos de seguimento a 379 C e agitaram-se a uma taxa de 37,5 ciclos por minuto* Analizou-se o teor completo das microcãpsulas a interva- - 14 - c c

J los de tempo diferentes até 28 dias e determinou-se o teor residual de BSA, utilizando o método de M.M. Bradford.

Os resultados recíprocos (BSA dissolvi do) são apresentados na figura 1 e mostram uma libertação aproxi madamente linear de BSA até 70% em 28 dias. EXEMPLO 12

Libertação da insulina de microcãpsulas

Colocaram-se 9 amostras de 60 mg de mi crocãpsulas, preparadas de acordo com o Exemplo 5, cada uma em 100 ml de tampão de fosfato, pH 7,4, a que se adicionaram 372 mg de EDTA de sódio e 100 mg de azida de sódio. Mantiveram-se os re cipientes durante os períodos de seguimento a 379 C e agitaram--se a uma taxa de 37,5 ciclos por minuto. Analisou-se o teor cem pleto das microcãpsulas a intervalos de tempo diferentes até 66 dias e determinou-se o teor residual de BSA, utilizando o método de M.M. Bradford.

Os resultados recíprocos (insulina dis solvida) são apresentados na figura 2 e mostram uma libertação aproximadamente linear de insulina até 160% em 50 dias. EXEMPLO 13

Libertação de 17,21-dipropionato de beclometasona de microcãpsu-las

Colocarara-se 40 mg de microcãpsulas, preparadas de acordo com o Exemplo 9, em 500 ml de tampão de fos fato, pH 7, a que se adicionou 1% de CETOMACROGOL 1000. Utilizem -se o sistema de dissolução com uma pã USP farmacopeia Norte-Ame ricana) com uma velocidade de agitação de 190 rpm. A temperatura era de 379 C. Tomou-se uma amostra de 1,5 ml em intervalos de tempo até 48 horas e filtrou-se, e determinou-se o seu teor de 17,21-dipropionato de beclometasona por HPLC contra um padrão de 6 jug/ml de 17,21-dipropionato de beclometasona num tampão de fos fato pE, contendo 2% de CETOMACROGOL 1000. Os resultados médios de 3 determinações, como se mostra na figura 3, demonstram clara - 15 - f>, mente uma libertação sustida. EXEMPLO 14

Encapsulacão do ácido 5-amino-salicilico eia EUDRAGIT-RS.

Liquido endurecedor : miristato de isopropilo

Adicionaram-se 100 ml de uma solução a 6% em diclorometano de EUDRAGIT-RS-100 a 20 g de acido 5-amino -salicílico num recipiente de 300 ml. Suspendeu-se o acido 5-ami no-salicilico agitando a 250 rpm â temperatura ambiente· Em seguida, enquanto se agitava a 250 rpm, adicionaram-se durante 1 minuto 100 ml de polidiraetilsiioxano (Dow Corning DC 360, viscosidade de 1000 cS). Após sedimentação local das microcãpsulas de cantou-se o líquido. Adicionou-se em seguida o conteúdo residual do recipiente a SOO ml do miristato de Isopropilo (Henkel), a 209 C, agitando-se a 500 rpm durante mais 24 horas, apôs o que se parou a agitação. Apôs sedimentação das microcãpsulas decan-tou-se o miristato de isopropilo. Lavaram-se em seguida as micro capsulas endurecidas duas vezes com 200 ml N-heptano e recolheram-se sobre um filtro de membrana de 10 μΜ. Secaram-se em segui da as microcãpsulas durante 24 horas ã temperatura ambiente. 0 rendimento total das microcãpsulas foi de 20 g, que representa cerca de 77%. EXEMPLO 15

Encapsulação do SUbcltrato de Bismuto Cololdal em etllcelulose. Líquido endurecedor s miristato de isopropilo

Efectuou-9e um procedimento idêntico ao descrito no Exemplo 14 utilizando 20 g do Subcitrato de Bismu to Cololdal como substância activa biológica, etllcelulose N22 como polímero nao-biodegradãvel, e polidimetilsiloxano (Dow Corning DC360, viscosidade 2000 cS) como agente de conservação. O rendimento total de microcãpsulas foi de 21,6 gramas, o que representa cerca de 83%. 16 -

I

EXEMPLO 16

Libertação do âcldo 5-amlno-salicilico de mierocâpsulas

Colocaram-se 340 mg de microcãpsulas, preparadas de acordo com o Exemplo 14 em 1000 ml de tampão de fosfato, pH 7,5, a que se adicionou 0,1% de PLORONIC F-68.

Utilizou-se o sistema de dissolução com pã USP com uma velocidade de agitação de 100 rpm. A temperatura era de 379 C.

Em intervalos de tempo ate 12 horas me diu-se a absorvância a 326 mm utilizando um espectrofotómetro equipado com um sistema de amostragem do fluido continuo.

Calculou-se o teor de acido 5-amino-sa licílico utilizando o valor da absorvância de uma padrão de 260 jug/ml de acido 5-amino-salicillco em tampão de fosfato de pH 7,5, contendo 0,1% de PLURONIC F-68.

Os resultados, apresentados na figura 4, demonstram claramente uma libertação sustida. 17 -

Claims (1)

1. m RBIVIHDICACÕBS ia - 1- - Processo para microencapsular substâncias bioactivas de acordo com o principio da separação de fases, compreendendo os seguintes passos; a» dispersar-se a substância bioactiva numa solução orgânica de um polímero biocompatível, b. adicionar-se ã dispersão um agente de coacervação, c. adicionar-se um excesso, em relação ao volume combinado do solvente e do não-solvente, de um liquido endurecedor, d. recolherem-se, lavarem-se e secarem-se as microcãpsulas, carácter izado por o liquido endurecedor ser um éster de etilo ou de isopropilo de um acido gordo de cadeia linear com 12-18 átomos de carbono, ou uma sua mistura. - 2- - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o liquido endurecedor ser mlristato de isopropilo ou palmitato de isopropilo·

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o volume do liquido endurecedor utilizado ser de 5-25 vezes o volume combinado de solvente e não solvente. - 4»- — 18 f Jà

   λλ «» 4"* Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, caracterizado por a substância bioactiva ser uma substância hidrofílica. - 5s- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a substância hidrofílica utilizada ser uma proteína. — 6— — Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o péptido ou proteína ser escolhido no grupo constituído por hormonas adrenocorticotrõficas, angiotensinas, factores de coagulação de sangue, calcitoninas, factores de libertação da corticotrofina, factores de regulação do crescimento celular, endorfinas, encefalinas, pêptidos inibidores do suco gástrico, gastrinas, pêptidos de libertação da gastrlna, faeto-res heraopoiêticos, hormonas do crescimento, insulinas, interfe-rão, oxitocina, hormonas paratirõides, somatostatina e vasopres-sinas, e os seus análogos e fragmentos farmacologicamente acti-vos. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se utilizar como substância hidrofílica o Subcitrato de Bismuto Coloidal. - 19 -

   Processo de acordo com a reivindicação 4, earacterizado por se utilizar como substância hidrofílica o ácido 4- ou 5- amino-salicílico. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, earacterizado por se utilizar como substância 1 ioactiva uma substância lipofílica. - 10- - Processo de acordo com a reivindicação 9, earacterizado por se utilizar como substância lipofílica bio-activa um esterõide. - lls Processo de acordo ccan a reivindicação 10, earacterizado por se utilizar como esterõide o 17,21-dipro-pionato de beclometasona. 12- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-11, earacterizado por se utilizar como polímero biocompatlvel um polímero biodegradável. — 20 —

   13- - Processo de acordo com a reivindicação 12, earacterizado por se utilizar como polímero biodegradável um poli-L-lãcti&o, um poli-D,L-lâctido ou um copolímero de um D,L--lâctido e glicõlido. - 14- - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-11, earacterizado por se utilizar como polímero biocompatível um polímero nio biodegradável. - 15- - Processo de acordo com a reivindicação 14, earacterizado por se utilizar como polímero não-blodegradã-vel, um polímero de etileelulose, EODRAGIT-RL, -RS, -NE, -L, ou -S, ftalatos de hidroxipropll-metil-celulose, acetatos ftalatos de celulose, acetato trimelitato de celulose, poli acetato ftala to de vinilo ou laca. - 16- - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, earacterizado por se dispersarem as micro-cápsulas quando preparadas de acordo com a reivindicação 15 num veículo adequado. 17- - * 21 — - 17- - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica injectável, caracterizado por se dispersarem as microcãpsulas quando preparadas de acordo com a reivindicação 15 num veiculo liquido adequado. 18- - Processo para a preparação de composições farmacêuticas orais, caracterizado por se dispersarem as mi crocãpsulas quando preparadas de acordo com a reivindicação 15 num veiculo adequado. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 4 de Janeiro de 1989, sob o n9. 89206015.9. Lisboa, 3 de Janeiro de 1990 ® iMMSm §ES(D3!M. ©L 23ISEZBWM EiB «ISf LMl.

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