PT91519B - processso para a preparaçAo de novos derivados de Acido glutAmico e de COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS que os contêm - Google Patents

Description

Descrição da patente de invenção de ROUSSEL-UCLAF, sociedade anónima francesa, industrial e comercial, com sede em 35, Bd des Invalides,

7500 7 Paris, França, (inventores: Constantin Agouridas, Chantal D_amais e Patrick Faureau, residentes na França), para PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS DE ÁCIDO

GLUTANICO E DE COMPOSIÇÕES

FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM

Descrição

No pedido de Patente Portuguesa depositado em 25 de Fevereiro de 19SS, sob o número 86835, a sociedade Requerente descreveu e reivindicou um processo para a preparação de derivados do ácido qlutâmico, assim como dos . seus sais de adição com ácidos minerais ou orgânicos ou com bases que correspondem à fórmula geral I co - r₃

I

Z-C-NH-CO- CH„ - CH - CH - COOR„ (i)

2 6

I I

Y NH-Rj.

GSP

na qual o ácido glutâmico tem a configuração D ou L;

representa um átomo de hidrogénio, um resíduo de ácido aminado ou um péptido constituido por dois, três ou quatro ácidos aminados e um ácido aminado ou um péptido constituido por dois, três ou quatro ácidos aminados, cuja amina é esterificada por um ácido alifático saturado ou não saturado que contém seis a vinte e quatro átomos de carbono, ou representa o radical de um ácido alifático saturado ou insaturado que contém seis a vinte e quatro átomos de carbono;

R5 representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo que contém um a cinco átomos de carbono;

R^ representa um radical hidróxi, alquilo que contem um a cinco átomos de carbono ou um ácido aminado cuja amina pode ser substituida por um radical alquilo que contém um a cinco átomos de carbono;

representa um agrupamento de fórmula

- R.

I

R -NH-C-UX em que R₂ representa um átomo de hidrogénio, um ácido aminado ou um péptido constituido por dois, três ou quatro ácidos aminados, R₄ representa um radical hidroxi, alquiloxi que contém um a cinco átomos de carbono ou um ácido aminado cuja amina pode ser substituida por um radical alquilo que contém um a cinco átomos de carbono, U representa uma cadeia de fórmula -ch₂-g-ch₂-, -ch=ch-ck₂- (E ou Z),

-CK₂-CK=CH- (E ou Z) ou -CH₂-CH-CH₂GH₃ ou U representa, em conjunto com X, uma cadeia de fórmula =CH-CH₂-CK₂- (E ou Z) ou U representa, em conjunto com Y, uma cadeia de fórmula -CH₂~CH₂-CK= (E ou Z); e

X e Y representam um átomo de hidrogénio ou uma ligação suplementar com U, a partir de um derivado do ácido glutâmi co de fórmula (II)

HOOC - CH₂ - CH₂ - CH - COO - Alk (ll) f

NH na qual Alk representa um radical alquilo que contém um a três átomos de carbono e R'^ tem as significações de R já mencionadas, com excepçao de hidrogénio ou representa um agrupamento de protecção de uma amina, com um derivado de fórmula III

COO-Alk COO-Alk

1

I I

C - nh₂ (III)

X' y· na qual U tem as significações já acima referidas;

Alk^ e Alk₂ representam um radical alquilo que contém um a três átomos de carbono;

X¹ e Y* representam um átomo de hidrogénio ou um radical -COO-Alk^, tendo Alk₃ as significações de Al^ e Alk₂; e r'₂ representa um agrupamento de protecção de uma amina ou um ácido aminado ou um peptido constituido por dois, três ou quatro ácidos aminados, cuja amina é protegida por um agrupamento de protecção.

Na fórmula geral I, o ácido aminado é, de preferência, um ácido alfa-aminado e pode ser escolhido do grupo constituido por Ala, Vai, Ival, Leu, Ile, Asp,

Asn, Glu, Gin, Ser, Thr, Cys, llet, Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, His e Pro, Nva, Nle, Hyp, Orn, estando estes ácidos sob a forma D ou L, assim como por Sar e Gly, podendo todos os ácidos anteriormente mencionados ser N- esterificados ou N-alquilados, no caso de um péptido que compreenda dois, três ou quatro ácidos aminaóos, estes são escolhidos no grupo constituido pelos ácidos aminados acima mencionados.

Admite-se, por convenção, que os símbolos dos ácidos alfa-amino-carboxílicos representam estes ácidos sob a sua configuração D ou L (por exemplo, o símbolo Ala significa alanina sob a forma D ou sob a forma L).

O ácido alifático saturado ou não saturado que contem seis a vinte e quatro átomos de carbono tem, de preferência, entre doze e vinte e dois átomos de carbono; podem citar-se, por exemplo, os ácidos esteáricos, palmítico, láurico, caprílico, mirístico, alga-linolénico, gama-linoléni co, araquidónico, linoleico ou docosopentaenóico.

A expressão radical alquilo que contém um a cinco átomos de carbono designa, por exemplo, os radicais pentilo, isobutilo, butilo, isopropilo e, de preferência, os radicais propilo, etilo ou metilo.

A expressão radical alquiloxi que contém um a cinco átomos de carbono designa, por exemplo, os radicais pentoxi ou butóxi, mas, de preferência, propoxi, etoxi ou metoxi.

Os sais dos derivados podem ser formados com bases orgânicas e inorgânicas. Entre as bases minerais, podem citar-se os hidróxidos de metais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como, por exemplo, os hidróxidos de sódio, de potássio, de lício e de cálcio, o hidróxido de magnésio ou de amónio. Entre as bases orgânicas, podem citar -se as aminas alquiladas substituidas ou não substituidas, tais como por exemplo, a trimetilamina ou tris-(hidroximetil)-metilamina? podem citar-se igualmente ácidos aminados básicos, tais como, por exemplo, lisina ou arginina; podem citar-se ainda outras bases, tais como, por exemplo, glucosamina ou procaína.

Os sais de adição com os ácidos minerais ou orgânicos podem ser, por exemplo, os sais formados com os ácidos clorídrico, bromídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, acético, fórmico, propiónico, benzóico, maleico, fumárico, succínico, tartárico, cítrico, oxálico, glioxílico, aspártico, alcano-sulfónicos, tais como os ácidos metano-sulfónico, etano-sulfónicos, areno-sulfónicos, tais como os ácidos benzeno-sulfónicos, para-tolueno-sulfónico e aril-carboxílicos.

O presente pedido de patente refere-se ainda a um processo para a preparação dos produtos que corres pondem à fórmula (I) do pedido de patente, citado anteriormente e não descritos neste pedido, a saber;

o ácido 2-amino-4-metileno-ó- / /~N-/N- (1-oxo-octadecil)-L-alanil_7-gama-D-glutamil_7-amino J -heptanodióico (isómero B) e o ácido 2-amino-4-metileno-6- / / N-(1-oxo-octadecil)-gama-D-glutamil_/-amino J -heptanodióico (isómero A e isómero B), assim como os que seus sais de adição com os ácidos e as bases orgânicos e mfíaerais.

E_ste processo caracteriza-se pelo facto de se fazer reagir um derivado do ácido glutâmico de fórmula (II) (II)

HOOC - CH₂ - CH₂ - GH - COO - GH

I I

NH R_a na qual R_A representa um resíduo do ácido N-/“N-(1-oxo-octadecil)-b-alanil_7-D-glutâmico ou do ácido N-(1-oxo-octa decenil)-D-glutâmico com um derivado de fórmula (III)

000-Et

I

COO-Et ι

R_ - NH - CH - CH_n - C - GH_ - CH - NH, hi 2 2, (III)

GHna qual R_B representa um agrupamento de protecção de uma amina, para se obter um produto de fórmula (I ) Ά

GOO-Et COO-Et

I I

R_B-NH-CH-CH₂-C-CH₂-CH-NH-CO-CH₂-CH₂-CH-aOO-CH₃ (I_A)

I I gh₂ nh-r_a na qual R_A e R_0/ Alk, Alk^, ALk , X', Y' e U tem as mesmas significações que já se indicaram, se isolar e separar os isómeros por meio de uma das reacções seguintes, realizadas por uma ordem qualquer:

a) desprotecção das funções amina,

b) hidrólise das funções éster, e depois, caso assim se pretenda, se salificar as funções carhoxi por uma base ou as funções amino por um ácido.

E_m condições preferenciais de realização prática da presente invenção, o derivado do ácido glutâmico é activado pela presença de agentes de condensação, tais como diciclo-hexil-carbodiimida, N,N'-carbonil-di-imidazol ou amidas bis-alquiladas de ácidos sulfurados, tais como SO(N(CH )₂)₂ ou N, Ν'-sulfinil-bis-(dimetilamina) ou ainda por formação de anidrido misto com o cloroformiato de isobutilo.

A separação dos isómeros ou dos diesteres-isómeros efectua-se pelas técnicas usuais, mais particularmente, por cromatografia.

A desprotecção das funções amina (formilo ou SOC, por exemplo) realiza-se, de preferência, por acção de um ácido mineral diluído, tal como ácido clorídrico.

A hidrólise das funções éster realiza-se, de preferência, por saçonificação com o auxílio de uma base mineral como hidróxido de potássio e, nomeadamente, hidróxido de sódio. Ela pode, caso isso seja necessário, ser efectuada por duas vezes, no caso em que ela se encontrasse incompleta.

Os derivados de fórmula (11) são conhecidos. Podem ser preparados, nomeadamente, como se indica nos Exemplos ou como se indica no pedido de patente acima citado.

Os derivados de fórmula (III) podem preparar-se como se indica no pedido de patente acima citado.

Os derivados obtidos de acordo com o processo acima descrito possuem carácter básico, Os sais de adição dos derivados de fórmula (i) podem vantajosamente preparar-se fazendo reagir em proporções sensivelmente estequiométricas um ácido mineral ou um ácido orgânico com o mencionado derivado.

Os derivados obtidos de acordo com o processo acima descrito possuem propriedades farmacológicas muito interessantes, pois são dotados, nomeadamente, de propriedades imunomoduladoras assinaláveis, nomeadamente, por activação dos monócitos humanos e produção de monoguinas tais como o TNF (factor de necrose de tumores) e a IL-1 (interleucina-1) .

E_stas propriedades justificam a utilização dos produtos acima citados e dos seus sais a título de medicamentos, nomeadamente no tratamento de doenças auto-imunes quer que se trate de doenças não específicas de certos órgãos (poliartrite reumatóide, lupus eritematose, anemia hemolítica, leucopenia auto-imune, etc.) ou de doenças específicas de órgãos (tiroidite, doenças de Basadow, doença de Addison, esclerose em placas, pênfigo, rectocolite homorrágica, certas nefropatias, etc.). E_stes medicamentos podem igualmente ser utilizados no trtamento de hemopatias, cancro, sida, afecções virais s microbianas, sobretudo crónicas e recorrentes (bronquite, gripe, etc.); de doenças da cavidade bucal, etc. Podem constituir auxiliares da terapia virai, da antibioterapia ou da quimioterapia anticancerosa.

Tem igualmente aplicação no tratamento de numerosos deficites imunitários secundários ou adquiridos observados no decurso de afecções muito diversas: deficites associados com perturbações metabólicas, deficites de origem iatrogénica (corticóides, radiações ionizantes, etc.), deficites observadas nos grandes queimados, etc.

A dose usual, variável de acordo com o derivado utilizado, o paciente e a afecção em causa, pode situar-se, por exemplo, entre 0,05 mg e 50 mg por dia. P_or via oral, no homem, os produtos podem ser administrados com a dose quotidiana de 0,5 mg a 50 mg, por exemplo, para trata mento de poliartrite reumatóide, ou seja, cerca de 0,007 a

0,1 mg por quilograma de peso corporal.

Os derivados obtidos de acordo com o processo acima descrito, assim como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para preparar composições farmacêuticas que os contém a título de principio activo.

A título de medicamento, os produtos de acordo com a presente invenção e os seus sais de adição de ácidos ou de bases farmaceuticamente aceitáveis podem ser incorporados em composições farmacêuticas destinadas à administração por via digestiva ou parentérica.

E_stas composições farmacêuticas podem ser, por exemplo, sólidas ou líquidas e apresentar-se sob as formas farmacêuticas correntemente utilizadas em medicina humana, como, por exemplo, comprimidos, simples ou drageificados, gélulas, grânulos, supositórios, preparações injectáveis, que são todos preparados de acordo com métodos usuais.

principio activo ou os princípios activos podem ser incorporados em excipientes habitualmente empregados nestas composições farmacêuticas, tais como talco, goma-arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, manteiga de cacau, veículos aquosos ou não aquosos, gorduras de origem animal ou vegetal, derivados parafínicos, glicois, diversos agentes molhantes, dispersantes ou emulsionantes, agentes de conversáção.

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção sem, no entanto, a limitarem.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Ácido 2-amino-4-metileno-6- í /~N-/ N-(1-oxo-octadecil)-L-alanil 7-gama-P-qlutamil 7-amino -heptanodióico (isómero B) e o respectivo sal trissódico

Fase A : 2-Formamido-4-metileno-6- { / 0-metil-N-/ N-(l-oxo-octadecil)-L-alanil /-gama-D-glutamil 7-amino } -heptanodiato de dietilo

Arrefece-se a 14°C + 1°C uma solução que 00110001 0, 992 grama de N-/~N- (1-oxo-octadecil)-Lr-alanil/-D-glutamato de metilo, preparado como se indica no pedido de patente acima citado, 50 centímetros cúbicos de dioxano e 50 centímetros cúbicos de tetra-hidrofurano. Juntam-se 0.58 centímetros cúbico de trietilamina e 0,3 centímetro cúbico de cloroformiato de isobutilo.

Agita-se durante trinta e cinco minutos a 14°C. Adiciona-se 0,572 grama de 2-amino-6-(formamido)-4-metileno-heptano-dioato de dietilo em solução em 10 centímetros cúbicos de tetra-hidrofurano. Agita-se durante duas horas à temperatura ambiente. Leva-se à secura sob pressão reduzida a 30°G. Obtem-se um produto que se cromatografa em sílica eluindo com uma mistura de ciclo-hexano/acetato de etilo (2,5 : 7,5). Ofetem-se 480,6 mg de diastéreo-isómero A e 476 mg do diastéreo-isómero B.

Fase B : 2-Amino-6- O~ 0-etil-N-/~N-(l-oxo-actadecil)-L-alanil /-qama-D-qlutamil /-amino j -4-metileno-heptanodioato de dietilo

Agita-se a SO°C durante quarenta e cinco minutos uma solução etanólica que contém 403 mg do produto obtido na fase anterior e uma solução de ácido clorídrico concentrado (0,41 centímetros cúbico) diluída até 10 com etanol. Aprefece-se, adiciona-se 2 centímetros cúbicos

de água e neutraliza-se com bicarbonato de sódio. E_xtrai-se com cloreto de metileno, seca-se o extracto sobre sulfato de magnésio e leva-se o filtrado à secura. Submete-se a cromatografia e obtem-se o produto pretendido.

Fase C

Ácido 2-amino-4-metlleno-6- 1 / N-/~M-(1-oxo-octadecjl)-L-alanil /-gama-D-glutamil /-amino J -heptanodióico e o seu sal trissódico

Dissolvem-se 107 mg do produto obtido na fase anterior, diastéreo-isómero B, em 5 centímetros cúbicos de etanol. Arrefece-se a 0°C e adiciona-se 0,43 centímetro cúbico de soda. Agita-se durante uma noite à temperatura ambiente. Evapora-se até à secura e obtem-se 117 mg de produto, ao qual se adicionam 10 centímetros cúbicos de água apirogénica. Filtra-se e liofiliza-se. Obtem-se 50 mg do produto pretendido.

/alfa? = -25° + 2° (c = 1% Η Ό) .

— D — 2

Preparação do 2-amino-6-(formamido)-4-metileno-heptanodioato de dietilo, utilizando como substância de partida para o Exemplo 1.

Numa solução que contém 6,4 gramas de 6-(tér ciò-butoxicarbonil)-amino-2-formamido-4-metileno-heptanoato de dietilo sob a forma de mistura de isómeros, prepararada como se indicou no pedido de patente acima citado, adicionam-se 200 centímetros cúbicos de cloreto de metileno,

100 centímetros cúbicos de uma solução de ácido clorídrico em éter anidro (2,6 N) . Agita-se durante uma hora à temperatura ambiente. Efectua-se o borbulhamento de uma corrente de azoto. Evapora-se à secura sob pressão reduzida a 30°C. Retoma-se o resíduo assim obtido com cloreto de metileno, neutraliza-se e concentra-se até à secura. Obtem-se 4,6 grame do produto pretendido bruto, que se purifica por cromatografia em sílica, eluindo com mistura de acetato de etilo/etanol (9 : 1).

Valor de Rf = 0,06.

Exemplo 2

Ácido 2-amino-4-ro_etileno-6- ~f /~N-(1-oxo-octadecil)-qama-D-qlutamil 7-amino 7 -heptanodióico

Fase A : 2-Formamido-4-metileno-6- / 0-metil-N-(1-oxo-octadecil7-qala-D-c;lutatnil7-amino J -heptanodioato de dietilo

Numa solução de 615 mg de N-(1-oxo-octadecil)-glutamato ácido de metilo (1) no seio de uma mistura de tetra-hidrofurano/dioxano (50 : 50), arrefecido a 14°C, juntam-se durante cinco minutos 0,062 centímetro cúbico de trietilamina, 0,3 centímetro cúbico de cloroformiáb de isobutilo. Agitou-se a suspensão assim obtida a 14°C durante trinta e cinco minutos. Juntam-se então 915 mg de 2-amino-6-(formamido)-4-metileno-heptano-dioato de dietilo em 10 centímetros cúbicos de tetra-hidrofurano. M_antem-se a mistura reaccional sob agitação durante duas horas à temperatura ambiente. Junta-se gelo, extrai-se com cloreto de metileno, lava-se, seca-se, filtra-se e concentra-se por evaporação a 30°C. Obtem-se 2, 1 gramas da mistura dos diastéreo-isómeros A e B, que se cromatografam em sílica, eluindo com a mistura de ciclo-hexan-acetato de etilo (2,5 : 7,5), Obtem-se 588 mg do diastéreo-isómero A e 580 mg do diastéreo-isómero B.

Fase B : 2-Amino-4-metileno-6- /O-metil-N- (1-oxo-octadecil)-qama-D-qlutamil7-amino J -heptanodioato de dietilo

a) D-j astério-Isómero A

Adiciona-se 0,5 centímetro cúbico de acido clorídrico coBcentrado a uma solução que contém 470 mg de diestereo-isomero A obtido na operação anterior em tr o

4,7 centímetro cúbicos de etanol. Aquece-se a 80 G durante quarenta e cinco minutos. Juntam-se 20 centímetros cúbicos de água e eleva-se a pH = 7; extrai-se com cloreto de metileno, seca-se, filtra-se e leva-se o filtrado à secura. Obtem-se 500 mg de diastéreo-isómero A, que se purifica por cromatografia em sílica. Obtem-se 251 mg do diastéreo-isómero A.

E_spectro de Ressonância Magnética Nuclear (CDCl^, 250 MHz)

3.64 : H na posição 2 da cadeia principal

4,99 : H do grupo metileno substituído na posição 4 da cadeia principal.

b) Djastéreo-Isómero B

Opera-se da mesma maneira que se descreveu na fase A e obtem-se 243 mg do diastéreo-isómero B a partir de 580 mg de produto de partida (diastéreo-isómero B)

E_spectro de Ressonância Magnética Nuclear (GDCl^, 250 MHz):

1.65 : H do grupo amino substituído na posição 2 da cadeia principal;

3,61 ; H na posição 2 da cadeia principal;

4,96 - 4,98 ; H do grupo metileno substituido na posição 4 da cadeia principal.

?ase C ; Ácido 2-amino-4-metileno-6- / N (1-oxo-octadeçil)-qama-D-glutamil 7-amino -beptanodióico e seu sal trissódico (diastéreo-isómero A e diastéreo-isómero B)

À temperatura de 0°C, introduzem-se 1,0 2 centímetros cúbicos de uma solução 0,00102 molar de soda numa solução que contém 233 mg do produto preparado na fase

anterior no seio de etanol, Agita-se a solução obtida durante uma noite à temperatura ambiente. Leva-se à secura sob pressão produzida e dissolve-se o resíduo assim obtido em 15 centímetros cúbicos de água. Filtra-se e liofiliza-se, Obtem-se 133 mg de diastéreo-isómero A.

/alfa_?_D -9° + 2° (c = 0,7%).

Espectro de ressonância magnética nuclear (D2O)^:

4,16 e 4, 33 : H na posição 6 da cadeia principal e H do CH do grupo gama-D-glutamilo;

3,41 : H na posição 2 da cadeia principal;

0,89 : H na posição 18 do grupo octadecilo.

Operando nas mesmas condições, obtem-se 194,4 mg de diastéreo-isómero 3, a partir de 234 mg de produto de partida (diastéreo-isómero 3).

/^_alfa_?_D -8,5° + 2° (c = 0,7%).

Egpectro de Ressonância Magnética NueJsr ^:

4,15 e 4,32 : H na posição 6 da cadeia principal e H do CH do Grupo gama-D-glutamilo;

3,46 : H na posição 2 da cadeia principal;

0,88 : H na posição 18 do grupo octadecilo.

Preparação de N-(1-oxo-octadecil)-glutamato de ácido de metilo utilizado como produto de partida do Exemplo 2

Prepara-se de acordo com o seguinte esquema reaccional

oo ₂Me

CH₃(CH₂)₁₆OOC1 + H₂N - GH

CH₂CH₂CO 2^tBu

TEA ch₂ci

C0 Me CO ₂Me cf₃go₂h ^Ca3^(CH2⁾16^COlíHCH CH.Cl. ' CH₃(CH₂)₁₆CONHCH

CH2CH2CO2tBu Ta		°Η2σΗ2°°2Η
Ponto de fusão = 70°C	Ponto de	fusão = 100°C
/ alfa / =10 +1	/alfa/^0	= +15 + 1
c = 0,8% de piridina	c = 1% em	piridina
Exemplo 3
Prepararam-se	comprimidos que correspon-
dem à frnulação seguinte
Produto do Exemplo 1	50	mg
Exicipiente q.b. para um comprimido acabado com	250	mg
(Porraenor do excipiente : lactose,	amido, talco,	estearato de

magnésio).

ESTUDO FARMACOLÓGICO

Estimulação das células monocitárias por um agente imuno-estimulante

A_s células mononucleadas do sangue em circulação de doadores normais são separadas de acordo com a técnica clássica descrita por Boyum, utilizando um gradiente de Ficoll. Depois de lavagem, as células mononuclea res são po;. tas a incubar a 37°G durante uma hora na razão de 5 . 1Q⁶ monócitos (células N3S⁺) por mililitro de meio de cultura, 5 ml de por frasco de cultura.

O meio de cultura utilizado nesta experiência é constituído por RPMI 1640, adicionado com antibióticos e com tampão Hépès.

Ao fin de uma hora, as células não aderentes são retiradas por lavagem dos balões com o auxílio de meio procedentemente aquecido a 37°C, sendo as células aderentes essencialmente constituídas por monocitos ( z* 90%) que são recolocadas em cultura em presença de diferentes quantidades dos produtos a ensaiar num tampão de P3S

2+ 2+ (Dulbecco) sem Ca nem Mg ,

Faz-se prosseguir a cultura durante vinte e quatro ou quarenta e oito horas e os sobrenadantes | das células são retirados, centrifugados, divididos em partes alíguotas e conservados quer a -80°C quer a -20°C. Os líquidos sobrenadantes da cultura são substituídos nos balões pela mesma quantidade de água destilada apirogénica,afim de lisar as células. Recupera-se o lisato, subdivide-se em partes alí-quotas e conserva-se igualmente a -20°G. As experiências seguintes foram realizadas em presença ou na ausên3 cia de interferão-gama recombinante (10 U/ml), com uma dose em que apenas o IFN gama é inactivo.

Ensaios da presença, nos líquidos sobrenadantes, de tnonoguinas (Interleucina 1 e Factor de Necrose de Tumor) relativamente à sua actividade biológica

Ensaio de Interleucina-1 (IL-1)

Este ensaio foi descrito pela primeira vez por I. Gery e Waksman, em 1972 (I. Gery e B. H. Waksman, 1972, Potentiation of the T Lymphocyte Response to Mitogens II. The C_elular Source of P_otentiating Mediator (_s), J. Exp. Med., 136 - 143.

Baseia-se na acção comitogénica da IL-1 em presença de um antigene (mimado pela fito-hemaglutinina do ensaio) em timócitos de rato.

Cultivam-se 1,5 x 10^ timócitos de rato C3H/HeJ (provenientes do C. S. E. A. L. de Orléans) durante três dias, em presença de diferentes diluições de sobrenadantes e de lisatos celulares susceptíveis de conter actividade de IL-1 e de PHB-3 Wellcome (1 /1 g/ml) nas placas de cultura de noventa e seis depressões de fundo plano, num volume final de 200 microlitros de meio composto de RPMI 1640 contendo, além dos antibióticos (penicilina 1 U/ml, estreptomicina 1000 U/ml no tampão de Hépès), 1 mM de glutamina, 2 mM a 5% de soro de vitelo e 5 x 1O^-^ M de 2-mercapto-etanol.

Ao fim de sessenta e oito horas de cultura, adiciona-se em cada depressão 1 /íCi de timidina tri3 tiada ( H-metil-timidina, CEA Saclay, TMM79A de actividade específica 1 /iCi/mM), a radio-actividade incorporada pelas células é avaliada depois de se terem filtrado as culturas num aparelho colector semi-automático do tipo Skatron e contadas as cintilações dos filtros com um contador de cintilação (LKB). Os resultados são expressos pela diferença entre os impulsos por minuto incorporados pelas culturas em

presença de sobrenadantes e os impulsos por minuto incorporados pelas culturas-testemunhas.

Ensaio do Factor de Necrose de Tumores (TNF)

A aetividade de TNF é evidenciada pela toxicidade deste factor sobre células cibles L-929 (sub-clone alfa). A técnica foi sensibilizada adicionando ao líquido actinomicina D.

A_s células L são distribuídas na propor4 / ção de 2 x 10 células por depressão de uma microplaca de fundo plano em 100 microlitros de meio RPMI 1640, enriquecido com 5% de soro de vitelo, glutamina, tampão de Hépès e antibióticos.

Ao fim de vinte e quatro horas, diferentes diluições dos sobrenadantes a ensaiar são adicionados a um volume de 100 microlitros, assim como uma dose de actinomicina D igual a 1 ug/ml. Ao fim de vinte e quatro horas de cultura, a quantidade de células viáveis nlo lisada é avaliada corando as placas com violeta-cristal e medindo a densidade óptica das diferentes depressões utilizando um leitor dd varrimento múltiplo.

RESULTADOS

Os produtos dos Exemplos estimulam os monócitos e a sua produção de IL-1 e de TNF. Além disso, há sinergia entre os produtos dos Exemplos e o interferão gama e/ou o LPS.

E.gtimulaçrão das células linfocitárias por um agente imuno-estimulante

En.saio de transformação linfoblástica

A_s células mononucleadas do sangue da circulação são colocadas em cultura, na proporção de 2.

10⁶ células/ml em microplacas de noventa e seis depressões com fundo plano (Nunc), em 100 microlitros de meio RPMI 1640, enriquecido com 10% de soro de feto de vitela (Hyclone) antibióticos, glutamina e tampão de Hepès.

Os produtos a ensaiar são adicionados nas depressões na proporção de 100 microlitros com diluições finais de 1, 10 eu 100 ^ig/ml, quer sozinho quer em presença de fito-hemaglutinina PHA-P (Wellcome Labs.) a 1 e/ou 10 /im/ml. As placas são colocadas, a 37°C,, numa incubadora com 00£ em atmosfera saturada de humidade. Ao fim de dois e de cinco dias, interromperam-se as culturas, realiza-se uma incorporação de timidina tritiada nas condições acima descritas no ensaio de detecção da interleucina-1. Os resultados são expressos em impulsos por minuto.

Resumindo, os produtos dos exemplos químicos revelaram-se não serem nem citotóxicos para os linfócitos em culturas nem mitogénicos para esses mesmas células. Pelo contrário, adicionados ao mesmo tempo gue um produto considerado como mitogénico T não especifico, como a PHA, revelaram-se capazes de inibir em parte (sobretudo a 100 jug/ml) os efeitos deste produto (ver Figura junta).

S_stes resultados puderam ser reproduzidos em todos os doadores ensaiados (entre três e trinta por produto).

Produção de imunoglobulinas

Cultivaram-se as mesmas células durante uma semana, em presença dos diferentes produtos a ensaiar, com as doses de 0,1, 1 e 10 /íg/ml, sozinhos ou em presença de duas doses de bactérias de Staphvlococcus aureus Cowan (SAC) (10 e 10 bactérias essas que se sabe que estimulam a produção de imunoglobulinas pelos linfócitos B humanos, de maneira não específica.

Os sobrenadantes são recolhidos ao fim da cultura e o seu teor em imunoglubolinas é determinado por técnicas clássicas de detecção por método de ELISA, utilizando um anticorpo anti-imunoglobllinas humanas à venda no comércio. Os resultados são expressos em ng de imunoglobllinas por mililitro de sobrenadante.

As experiências mostram gue os produtos utilizados sozinhos não são capazes de provocar a estimulação dos linfôcitos de tipo 3 (nem a sua proliferação nem a sua diferenciação em plasmocitos), mas, em presença de SAC, o produto do Exemplo 1 é capaz de aumentar a produção de imunoglobulinas. Pelo contrário, o produto do Exemplo não origina o mesmo resultado (ver Figura).

Actividade in vivo

Artiverão dos mactofaqos

A capacidade de activar as células do compartimento monocitário matrofágico foi confirmada in vivo no rato. Após injecção por via intraperitonial de diferentes doses dos produtos a ensaiar, recolheram-se as células peritoniais de ratos BALB/c; a quantidade de células encontradas não aumentou e são essencialmente matrófagos, o que mostra que estes produtos não são quimiotácticos, pelo menos, nas condições utilizadas,

Os macrófagos apresentam a particularidade de poderem responder melhor a uma estimulação da membrana que mima uma fagocitose; com efeito, estas células não produzem esponfeneamente aniões de superóxidos ou de água oxigenada, mas este metabolismo oxidante foi preparado e inicia-se a partir do sinal fagocitário.

A_s experiências realizaram-se com difere tes produtos; o exemplo proposto na Figura anexa é o produto

número 1, evidenciando o metabolismo oxidante que foi feita por uma técnica de quimioluminescéncia em presença de luminol, empregando um quimiluminómetro Berthold LB95O.

A cinética da reacção mostra que este fenómeno de activação dura de vinte a quatro a quarenta e oito horas, a seguir à injecção única de produto.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lã Processo de preparação dos derivados de ácido glutâmico cujos nomes são os seguintes

   - ácido 2-amino-4-metileno- 6 í 2fN-/N- (1 -oxo-octadeci1) -L-alanil7-gama-D-glutamil7_amino } -heptanodióico (isómero B) e ácido 2-amino-4-metileno-6- j /~N-(1-oxo-octadecil)-gama-D-glutamil/-amino } -heptanodióico (isómero A e isómero B) assim como dos seus sais de adição de ácido derivados de ácidos orgânicos e minerais e das bases, caracterizado péb facto de se fazer reagir um derivado do ácido glutâmico de fórmula (II)

   HOOC - ch₂ - ch₂ - CH - COO - ch₃ (II) ι

   NH - R_a na qual representa um radical do ácido N-/N-(l-oxo-octadecil)-L-alaniX/-D-glutâmico ou do ácido N-/ (1-oxo-octadecil) -D-glutâmico, com um derivado de fórmula (III)

   OOOEt

   COOEt

   R - NH - CH - CH„ - C - CH - CH - NH„ B
2. 2 Z Z «I (III)

   CH, na qual

   R_ representa um agrupamento de protecção da função amina, tí para se obter um produto de fórmula (1^)

   COOEt COOEt

   I I

   R_n-NH-CH-CH_-C-CH„-CH-Nn-00-CH„-CH„-CH-000-CH_ (I)

   B Z Z Z Z o A

   II I

   CH₂ nh-r^ ^RA ^{e R}B ^{tem as} significações já indicadas e se isolar e separar os isómeros por meio de uma das seguintes reacções realizadas por uma ordem qualquer

   a) desprotecção das funções amina,

   b) hidrólise das funções éster e, caso assim se pretenda, se salificar as funções carboxi por reacção com uma base ou as funções amino por reacção com um ácido.

   - 2â P_rocesso de preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se incorporar, como ingrediente activo, pelo menos, um dos compostos de acordo com a reivindicação 1 ou pelo menos um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis numa mistura veicular ou auxiliar farmaceuticamente aceitáveis e se conferir à mistura a forma de apresentação pretendida.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido francês apresentado em 24 de Agosto de 1938, sob o ns 88-11155.