PT91502B - Processo para a preparacao da sub-unidade alfa do receptor de adesao de leucocitos mca-1 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 91 502

DANA FARBER CÂNCER INSTITUTE, instituto de investigação científica, norte-americano, com domicílio 44, Binney Street, Boston, Massachusetts 02115, Estados Unidos da América.

‘•PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA SUB-UNIDADE ALFA DO RECEPTOR DE ADESÃO DE LEUCÓCITOS MCA-1”

INVENTORES:

Timothy Alan Springer e Angel Corbi.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América em 23 de Agosto de 1988 e em 9 de Março de 1989, sob os N^l's. 07/235,353 e 321,239, respectivamente.

INPI. MOD. 113 RF 10732

I .

Descrição referente à patente de invenção de DANA FARBER CAN CER INSTITUTE, instituto de in vestigaÇao científica» norte-americano» com domicílio 44, Binney Street, Boston» Massa— chusetts 02115, Estados Unidos da América, (inventores: Timothy Alan Springer e Angel Cor— bi » residentes nos E.U. A.),para PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DA SUB-UNIDADE ALFA DO RECEPTOR

DE ADESÃO DE LEUCÕCITOS MCA-1

DESCRIÇÃO

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere—se ao receptor de adesao de leucócitos Mac-1. Para alfm disso a invenção refere -se ã clonagem de sequências de ADN que codificam para a sub— —unidade alfa desta molécula. Esta invenção foi em parte feita com o apoio do governo. 0 governo possui certos direitos sobre esta invenção.

DESCRIÇÃO DA MATÉRIA RELACIONADA sistema imunitário ê responsável pela pro— tacçao de um animal dos invasores estranhos» tais como bactérias, vírus, etc.. Uma excelente revisão dos sistema de defesa é-nos facultada por Eisen, H.W. (in: Microbjology, 3^a Ed. ,

N.

Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), págs. 290—295 e 381— -4l8). A capacidade do sistema imunitário para proteger um ani mal de invasores estranhos dependej em grande medida» da presença e do funcionamento das células do sangue» conhecidas co mo leucócitos. Verificou—se que capacidade dos leucócitos pro porcionarem tal protecção requer que estas células adiram a substractos celulares e extra—celulares.

Por exemplo» os leucócitos têm de ser capazes de se ligarem a células endoteliais de modo a poderem migrar da circulação para lugares onde a inflamaÇao ocorre. Para alem disso, eles devem ligar—se às células de antigene presentes para que assim possa ocorrer uma resposta imunitária. Os leucócitos devem também ser capazes de se ligarem a células alvo adequadas para que assim possa ocorrer a lise das células infectadas pelo vírus (ou de tumor). Para além disso os leucóci tos devem ser capazes de se ligarem a diversas proteínas acti vadas (tal como iC3b — a forma activada do terceiro componente do complemento) porque assim ê—lhes possível efectuar efi— cientemente a fagocitose e eliminar os resíduos microbianos e velulares. Assim a adesao dos leucócitos ê um requisito do normal funcionamento do sistema de defesa do hospedeiro. A ini biçao deste sistema de defesa é desejável em casos tal como a transplantaÇaO) porque o hospedeiro vê o tecido transplanta do como um estranho e inicia uma resposta imunitária contra aquele tecido. A adesao dos leucócitos é, por conseguinte, en volvida também na rejeição de tecidos e de órgãos transplanta dos. Por isso, uma compreensão da adesao do leucócito permite —nos o aumento da capacidade de um animal para lutar contra a infecção a supressão da capacidade de um animal de rejeitar tecido transplantado.

Recentemente, as moléculas da superfície dos leucócitos envolvidas na mediaçao da adesao dos leucócitos fo ram identificadas usando fl tecnologia dos hibridomas. Resumidamente, foram identificados os anticorpos monoclonais dirigi dos contra células T humanas (Davignon, D., et al., Proc.

Natl» Acad. Sei. USA 78:4535-5439 (19Ô1)) e células de baço de rato (Springer, Τ. , et al. , Eur. J. Immunol.

(1979)) que se ligam às superfícies dos leucócitos e inibem as funções relacionadas - com a ligaÇao descritas acima (Springer, Τ., et a1«» Fed. Proc. 44:2660—2663 (Ι9θ5))· As moléculas que foram reconhecidas por estes anticorpos compreendem um con^un to de receptores de adesao de leucócito conhecidos de Antige— ne—1 Associado à Função dos Linfócitoe (Lymphocyte Function -Associated Antigen-1 family·' ou a família LFA—1”) de molécu las de receptores de adesao.

A família LFA—1 de moléculas de receptores de adesao contêm três glicoproteínas de siperfície celular altamente relacionadas. Verificou—se que estas glicoproteínas me— deiam as interaeçoes celila—célula na inflamaçao. As glicopro teínas foram designadas por LFA—1 (antigene—1 associado à função dos linfócitoe), Mac—1 e ρ15Ο,95^υ· Enquanto que o LFA-1 ê encontrado nas superfícies de muitos leucócitos (Sprin ger, T.A. , et al. , Immunol. Rev. 68:111—135 (1962)), o Mac—1 e o pl5O,95 sao encontrados essencialmente nos macrófagos,nos granulócitos e noutros grandes linfócifcos granulares (Sprin— ger, T.A., et a1. Immunol. Rev. 68 11—135 (1962); Keizer, G., et al. , Eur. J. Immunol. 15 ί 114 2—1147 (1985) ).

A família de glicoproteínas LFA-1 ê composta por heterodímeros, contende cada um uma sub—unidade alfa que nao esta associada por covalencia com a sub—unidade beta. Tem —se verificado que as sub—unidades alfa da família diferem umas das outras e sao designadas por CDlla, CDllb, e CDllc res pectivamente. As sub-unidades alfa flicosiladas têm eproximadamente ÍÔO, 170 e 15θ kD. Em contraste verificou—se que a sub—unidade beta da família LFA—1 de receptores de adesao ê idêntica e tem um peso molecular de 95 kD (Sanchez—Madrid, F., et al. , J. Exper. Med 158; I785-I8O3 (1983); Keizer, G. D., et a1., Eur. J. Immunol. 15♦ 1142—1147 (1985)) Springer, Τ., Fed. Proc. 44 I 2660—2663 ( 1985) } Sanchez—Madri d, F. , et al. ,

J. Exper. Med. 158:586-602 (1983)).

- 3 Embora as sub-unidades alfa das glicoproteí— nas nao apresentem a homologia extensa partilhada pelas sub— -unidades beta, análises mais aproximadas das sub-unidades al fa das glicoproteínas revelaram que existem semelhanças substanciais entre elas. Sao proporcionadas revisões das semelhan ças entre as sub-unidades alfa e beta da família de glicopro— teínas de moléculas de adesao por Sanchez—Madrid, F., et al. (J. Exper. Med. 158: 586-602 (19Ô3)» J. Exper. Med. 158: 1785-I8O3 (I983)i Miller, L. J. , et al. , J. Immunol. 138: 2381-2383 (1987) ).

A importância da família LFA—1 de receptores foi inicialmente reconhecida em estudos que mostravam a capacidade de anticorpos monoclonais (que eram capazes de ligaçao cim as sub-unidades alfa específicas ou com a sub—unidade beta comum) para inibir as funções de leucocitrias dependentes da adesao (Sanchez—Madrid, F. , et a 1» , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7489-7^93 (I982)i Beller, D.I., et al., J. Exper. Med. 156:1000-1009 (1982)).

Recentemente foi identificado um grupo de indivíduos que nao era capaz de exprimir quantidades normais de qualquer membro da família de proteínas de adesao Mac—1 nas suas superfícies celulares dos leucócitos. Esta doença foi chamada Deficiência de Adesao de Leucócito” ou ”LAD” e ê ca— ** racterizada por infecções cronidas e recorrentes, bem como por outros sintomas clínicos (Anderson, D. C. , et al. , Fed. Proc.

44: 2671—2677 (1985)» Anderson, D. C. , et al. , J. Infect. Djs. 152: 668—689 (1985))· Os leucócitos de doentes com LAD apresentam in vitro defeitos que eram semelhantes aos observados quando se antagonizara leucócitos de indivíduos normais por an ticorpos específicos para membros da família LFA—1. Verificou —se que os doentes com LAD nao eram capazes de organizar uma resposta imunitária normal. Verificou—se que esta deficiência era devida a uma incapacidade dos leucócitos dos doentes com LAD para aderirem a substratos celulares e extras celulares (Anderson, D. C. , et al. , Fed. Proc. 44: 2671—2677 (I985)i An-

derson, D. C. , et al. , J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985))· Estes estudos mostram que as reacções inflamatórias sao mitigadas quando os leucócitos nao sao capazes de aderir dum modo normal devido à falta de moléculas de adesao funcional na sua superfície celular.

Assim, em resumo, a capacidade dos leucócitos para manter a saúde e viabilidade de um animal requer que eles sejam capazes de aderir a outras células (tais como células endoteliais) e a proteínas (tais como iC3b). Verificou—se que esta aderência requer contactos que envolvem moléculas de receptor específicas presentes na superfície de leucocitária dos leucócitos. Verificou—se que estas moléculas de receptor de superfície celular estão altamente relacionadas umas com as outras. Os seres humanos cujos leucócitos nao tem estas moléculas de receptor de superfície celular apresentam infecções crónicas e recorrentes, bem como outros sintomas clínicos.

Uma vez que a adesao dos leucócitos esta implicada no processo através do qual um tecido estranho é iden ti ficado e rejeitado, uma compreensão deste processo ê de valor significativo nos domínios de traneplantaçao de órgãos, de enxertos de tecidos, da alergia e na oncologia.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere—se a moléculas de receptor de adesao de superfície celular e, em particular, à clonagem e à expressão da sub-unidade alfa da molécula de receptor Mac—1 através do uso da tecnologia de ADN recombinante. A invenção encontra—se relacionada com a molécula de adesao propriamente dita, com fragmentos funcionais da molécula, com o ácido nucleico (isto é, ADN e especialmente ADNc) capaz de codificar para essas moléculas de receptor e com plasmídeos que contêm tais sequências de ácido nucleico. A presente invenção adicionalmente refere—se a um processo para a preparaçao das moléculas de receptor que utiliza tecnologia de ADN

- 5 SUJMi

re combinante.

** s

Em pormenor, a invenção diz respeito a sub— -unidade alfa de Mac—1 ou a um seu derivado, substancialmente livre de contaminantes naturais.

A invenção diz respeito para além disso, à sub-unidade alfa de Mac—1 anteriormente referida ou a um seu derivado funcional, que ê adicionalmente capaz de se ligar a uma molécula presente na superfície da célula.

*· * *

A invenção inclui também a molécula da sub-unidade alfa de Mac—1, molécula que contêm pelo menos um po— peptídeo seleccionado do grupo constituido por:

_a. a-n-g-r-g-s-l;

b. Μ—Ε—Q—L-K—K—S}

c. t-d-g-e-k-f-g;

d. G-V-F-L-Y-T-S i

e. V-D-V-D-S-S-N-G-S-T;

f. D-V-N-G-D-K-L-T-D-V-Ai

g. d-d-t-m-d-g-i^v-d-l;

h. Y—I—L—T—S—Η—N

i. C—Q—D—D-L-S—i

j. T-I-Q-N-Q-L-R

k. V—Q—S—L-V—L-G

l. Y-Q-H-I-G-I^-V

m. L—F—T—A—L-F—P

n. F—S—L-V-G-T—P

A invenção também inclui uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar quer a sub—unidade alfa de Mac—1 quer um seu derivado funcional.

A invenção também proporciona um processo pa—

M ra a recuperaÇao da sub—unidade alfa de Mac—1 numa forma subs tancialmente pura que compreende as fases de:

(a) solubilizar a sub-unidade Mac-] a partir de membranas de células, para formar um preparado de sub—unidade alfa de Mac—1 solubilizado, (b) introduzir o preparado de sub-unidade alfa de Mac—1 solubilizado numa matriz de afinidade, contendo a ** % • referida matriz um anticorpo imobilizado capaz de ligaçao a • sub-unidade alfa de Mac—1.

- 6 (c) permitir à sub—unidade alfa de Mac—1 ligar—se ao anticorpo da matriz-de afinidade, (d) remover da matriz qualquer composto incapaz de ligaÇao ao anticorpo e (e) recuperar a sub—unidade alfa de Mas-1 numa forma substancíalmente pura por eluiçao da sub—unidade alfa de Mac—1 da matriz.

A invenção também proporciona um método para tratamento da inflamaçao que resulta duma resposta do sistema de defesa específico (tal como sindrome da dificuldade respiratória do adulto} sindrome da lesão de múltiplos órgãos se— cundaria a septicemia, lesão de tecidos por reperfusaoj glome rulonefrite aguda} artrite reactivaj dermatose com componentes de inflamaçao aguda} uma afecçao inflamatória do sistema nervoso central} lesões térmicas} hemodiálise} leucaferesej colite ulcerativa} doença de Crohn} enterocolite necrozantej sindrome associada à transfusão de granulócitos} e toxicidade induzida por citoquinas) num mamífero que compreende proporcionar a um indivíduo com necessidade de tal tratamento uma quantidade de agente antiinflamatótio suficiente para suprimir a inflamaçao} em que o agente antiinflamatório referido ê seleccionado do grupo constituído por: sub—unidade alfa de Mac—1 e um derivado funcional da sub—unidade alfa de Mac—1.

A invenção inclui para além disso o método an teriormente referido que compreende adicionalmente a co—admi— nistraÇao de um agente seleccionado do grupo constituído por: a sub-unidade beta de Mac—1 e um derivado funcional da sub—uni dade beta de Mac—1.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta o mapa de restrição de clones de ADNc da sub-unidade alfa de Mac—1 e a estratégia de sequenciaçao. A terceira linha representa a região de codifi—

caÇao do ADNc. Os sinais de poliadenilaçao sao apresentados sob a forma de rectangulos negros. As regiões suprimidas em ÀM90 estão indicadas por linhas ponteadas. Os locais de restrição indicados sao Bal I (B) , Bam HI (Ba), Bgl II (Bg), Eco RV (Ev), Hinc II (Hc), Hinc III (H), Sma I (S) e Pst I (P).

A Figura 2 representa a sequência nucleotídi— ca e a sequência de ácidos aminados derivada do ADNc na sub— -unidade alfa de Mac—1. Os locais presumíveis de N—glicoaila— ** ** a ** çao estão sublinhados. A sequencia de sinal e a região presu# ** raivei de transmembrana estão indicadas por uma linha ponteada. 0 codao de terminação está marcado com um asterisco. Os rec—

A ** ** \ A tangulos na região 3’ nao traduzida correspondem as sequências ea de sinal de poliadenilaçao. As flechas marcam as fronteiras de um intrao potencial formado por junção de alguns dos ADNc’s

A Figura 3 apresenta a repetição homáloga oC de Mac-1. Os resíduos comuns encontram—se inscritos em rectan gulos. As tres repetições que contem os locais presumíveis de ligaçao de catioes divalentes (V a VII) estão alinhados com as sequências relacionadas N—terminais adicionais a que faltam os locais presumíveis de ligaçao de Ca⁺⁺ ou de Mg⁺⁺ (I a IV). Com base na frequência de cada resíduo nas sete repetições das sub—unidades CX de Mac—1 e de outras integrinas (pl50, 95» o receptor de ferronectina, o receptor de vitronectina e a glicoproteína Ilb de plaquetas) ((Corbi, A. et al. , EMBO J. .6:4023—4028 (Ι9β7))» 12—l4), derivaram-se sequências de consenso para as regiões de flanco dos locais presumíveis de li— ea gaçao de catioes divalentes. Os resíduos de consenso foram de finidos como os que ocorriam em pelo menos 3θ % das sequências analisadas. A sequência de consenso de ligaçao de catioes di— valentes e os eixos de coordenaÇao dos reeiduos de ligaçao ea ea _A dos catioes divalentes estão baseados na sequencia e na estru tura tridimensional das proteínas de ligaÇao de Ca⁺⁺ e deMg⁺⁺, parvalbumina, troponina C e calmodulina (36) e sao apresentados por debaixo dos alinhamentos das sete repetições.

A Figura 4 apresenta uma comparaçao da estru—

**Μι tura primária das sub—unidades de Mac—1, pl5O,95» receptor de vitronectinaj receptor de fibronectina e glicoproteina Ilb. As identidades entre as sub—unidades 0( de Mac—1 e das restantes integrinas estão inscritas em rectãngulos. Os locais pre— sumiveis de ligaçao de catioes divalentes e as sequências de flanco convertidas encontram—se sublinhados por linhas contínuas e ponteadas, respectivamente. As regiões presumíveis de transmembrana estão indicadas por 1M.

A Figura 5 apresenta uma comparaçao das sequências do domínio específico dos leucócitos da sub—unidade alfa de Mac—1 e da sub—unidade alfa de pl5O,95 com a repeti— çao A do factor de von Willebrand, o componente C2 do complemento e o factor B. Os resíduos comuns entre as sequências de Mac-1 e/ou pl5O,95 M e as restantes proteínas estão inscritos em rectãngulos. Os alinhamentos foram efectuados conforme descrito em Procedimentos Experimentais.

- **

A Figura o apresenta as relações evolutivas propostas da sub—unidade Λ de Mac—1, os domínios A do factor de von Willebrand, os factores B e C2. Os domínios de ligaçao e os ligandos para o factor de von Willebrand estão indicados no cimo (Shelton—Inloes, Β.B. et al. , Bjo chem. 25· 3164—3171 (1986); Girma, J. P. et al. , Blood £0:Ó05-6ll (1987))· As estruturas dos factores B e C2 foram também examinadas conforme anteriormente descrito (Mole, J.E. et al., J. Biol. Chem. 259 · 3407-3412 (1984); Bentley, D.R. Biochem. J. 239:339-345 (198Θ) As repetições de RCA (Regulador de activaÇao de complemento) nos factores B e C2 sao homólogos em repetições de 60 ácidos aminadoe comuns a muitos componentes do complemento e recep— tores. Os locais de N— gli co si laçao e os resíduos de cisterna na sub—unidade cZ de Mac—1 sao apresentados na parte superior e na parte inferior da sua representação esquemática, respe— etivament e.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

I. Natureza das Proteínas de Adesão dos Leucócitos da Família de Mac-1

As tres proteínas de adesao dos leucócitos Mac—1, pl5O,95 e LFA—1 diferem em função e em expressão nas subpopulaÇoes de leucócitos. A proteína Mac—1 e a proteína pl5O»95 sao expressas em neutrofilos e em monócitos (Springer, T.A., et a1., In: Bjochemistry of Macrophagea (CIBA Symposium 118); Pitman, Londres» págs. 102-126 (1986)). Durante a diferenciação dos monócitos do sangue nos macrófagos de tecido» a ** ** expressão de pl5O»95 e muito aumentada e a expressão de Mac—1 é reduzida (Schwarting, R. » et al. Blood 65·974— 983 (1985)» Hogg, N. et al. » Eur. J. Immunol. l6:240—280 (1986)). A proteína ρ15θ»95 ó também expressa em certos tipos de linfócitos T e B activados, mas nao e expressa nessas células no sangue (Kaligaris—Cappio, F., et al.» Blood 66:1035—1042 (1985)» Mil ler, L. J. » et al. » J. Immunl. 137^;2891—2900 (1986)» Keizer,

G. D. , J. Immunol. 138:3130-3136 (I987).

A proteína LFA—1 está presente em todos os leucócitos excepto num subconjunto de macrófagos. Os estudos de bloqueamento de anticorpos monoclonais mostraram que a LFA —1 e importante na destruição mediada por linfocitos T> nas respostas dos linfócitos T auxiliares» na destruição natural e na destruição dependente de anticorpos (Springer, T. A. , et al. » Ann. Rev. Immunol. $:223-252 (1987)). A adesao à célula visada é uma fase que ê bloqueada por anticorpos contra LFA—1. Estudos funcionais sugeriram que a LFA—1 interactua com vários ligandos, um dos quais ê ICAM—1 (Rothlein, R. , et al. , J. Im— munol. 137Σ127Ο-1274 (1986)).

As proteínas Mac-1 e pl5O,95 sao expressas num compartimento vesicular intracelular na circulação de neu trófilos e de monócitos que ê mobilizado para a superfície da célula por mediadores inflamatórios (Todcl, R. F. , et al. , J. Clin. Invest. 74:1280—1290 (1984); Springer, T.A. , et al. , In: Biochemistry of Macrophagea (CIBA Symposium ll8), Pitman, Lon

don, pp. 102—126 (1986) ί Lanier, L. L. , et al. , Eur. J. Immunol. 15:713—716 (1905); Yancey, K.B., et al., J. Immunol. 135 ^: 465-470))· Esta mobilizaÇao correlaciona-se com o aumento da capacidade de adesao (Anderson, D. C. , et al. , Ann, Rev. Med. 38:175-194 (1976)). A mensagem da sub-unidade (X de Mac-1 foi detectada em monócitos do sangue e em linhas de células mie— loides induzidas por PMA, mas nao em células das linhagens T ou B, em correlação com a expressão superficial de proteínas de Mac—1.

Verificou—se que alguns clones de linfócitos T citotóxicos exprimem quantidades semelhantes de pl5O,95 θ de LFA-1. Os anticorpos monoclonais para as sub—unidades alfa de LFA—1 e de pl5O,95 inibem a destruição por estes clones CTL em grau equivalente e sao aditivos nos seus efeitos inibi dores (Keizer, G. D. , et al. J. Immunol. 138: 3130-3136 (1987)). Para além disso,mostrou—se que os anticorpos para sub—unidades alfa de pl5O,95 inibem a ligaçao dos monócitos ao endotê— lio (Keizer, G. D. , et al. , Eur. J. Immunol. 17 ♦ 1317-1322 (1987)).

Os anticorpos monoclonais para Mac—1 ou pl5o , 95 inibem a agregaçao dos neutrofilos e a aderencia as células endoteliais, a superfícies revestidas de proteínas, a bactérias, a parasitas protozoários e a fungos (Harlan, J.M. , et al., Blood 66:167—178 (Ι9θ5)» Springer, T.A., et al., in: Bjochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman, Lon dres, págs. 102—126 (1986)} Dana, Ν., et al., J. Immunol. 137♦ 3259 (1986); Bullock, W.D., et al., J. Exper. Med. 165:195-210 (1987)» Mosser, D.M., et al., J. Immunol. 135:2785-2789 (1985)).

A proteína Mac—1 (CD llb/CDl8) ê uma gli copro teína heterodimérica de adesao aos leucócitos que funciona co mo um receptor para iC3b (CR3) para além do seu papel nas in— teracçoes de adesao cêlila—célula e célula—substracto (Beller, B.I. , et al. ; J. Exper. Med. 156:1000-1009 (1982)). Mostrou-se que as soluçoes em detergentes de Mac—1 e pl5O,95 sao ca—

pazes de se ligarem a Sepharose iC3b (Micklem, K.J. , et al» , Biochem. J. 231: 233-236 (1985)).

A sub—unidade « de Mac-1 ê uma proteína de transmembrana de 1137 resíduos com um domínio extracelular longo (IO92 resíduos) e um apêndice citoplasmático de 19 ácidos aminados. 0 domínio excelular contêm 3 sequências presumi veis de ligaçao de catioes divalentes e 19 locais de poten— ciai N—glicosilaÇao. A sequencia de ácidos aminados de Mac—1 apresenta uma identidade de 63 % com a sub—unidade & da glico proteína de adesao dos leucócitos pl5O,95 e 25 % com as sub— —unidades Λ da glicoproteína Ilb/lIIa de plaquetas dos receptores da matriz extracelular» do receptor de fibronectina e do receptor de vitronectina. Os locais presumíveis de ligaçao de catioes divalentes da sub—unidade Ot de Mac—1 e as regiões de flanco apresentam um alto grau de identidade tanto com a sub—unidade (Z de pl5O,95 (87 % de identidade ao nível dos áci dos aminados) como com as restantes sub—unidades ç/, de integri nas (3θ %)· A sub-unidade # de Mac-1, como a sub-unidade fi. de pl5O»95, contêm um domínio de 187 ácidos aminados na região extracelular que está ausente nas outras integrinas. Este domínio leucocitário ou domínio ”L” ê homólogo dos domínios A do factor de von Willebrand, os quais por seu turno sao homó— logos das regiões dos factores B e C2 das proteinas de liga— çao C3· Estes factos fazem chamar a atençao para esta região de Mac—1 como um local de ligaÇao potencial para iC3b.

papel funcional de proteína Mac-1 foi em pri meiro lugar ilustrado pela capacidade dos anticorpos monoclonais (AcM) anti—sub—unidade /fi de Mac-1 para bloquear a forma— Çao de roseta dos aritrócitos revestidos por iC3b com os ma— crófa gos e com os leucócitos polimorfonucleares (Beller, D.I. et al., J. Exper. Med. 156:1000—1009 (1982)), demonstrando que a proteína Mac—1 ê indistinguível do receptor de complemento do tipo três (CR3). Subsequentemente a participaçao da proteína Mac—1 nos processos inflamatórios foi poeta em evi—

Λ ** ** Λ • dencia pela inibição da agregaçao de neutrofilos e pela ade12

sao às células endoteliais pelos AcM específicos anti—sub—uni dade-^c. e anti—sub—uni dade fó de Mac—1 (Anderson, D. C. et al» ,

J. Immunol. 137 «15-27 (1906)» Dana , N. et al. i «J. Immunol. 3259-3263 (1986)} Vedder, N.B. et al., J. Clin. Invest. 8l: 672—682 (Ι9δθ)· Estudos recentes de mapeamento de epítopos su geriram que os locais implicados na ligaÇao de iC3b sao distintos dos implicados na agregaÇao dos neutrófilos e na aderência de plásticos revestidos por proteínas (Anderson» D.C. et al. , J. Immunol. 137·15—27 (1986)» Dana, N. et. al. , J. Immunol. 137^3259—3263 (1986). Rosen, H. et al. , J. Exper. Med. 166:1685-1701 (1987)). Por conseguinte, a proteína Mac—1 pare ce ser um receptor multivalente com pelo menos duas funções independentes relacionadas de adesao.

A expressão da actividade funcional de Mac—1 e regulada durante a diferenciação e a activaçao dos leucócitos. A diferenciação e a maturaçao de linhas de células mielo monocíticas têm como resultado um aumento de expressão de Mac -1 (Miller, L. J. et al. , J. Immunol. 137:2891-2900 (1986)), enquanto que a diferenciaÇao dos monócitos do sangue em macró fagos de tecidos e acompanhada por uma diminuição considerável na quantidade de Mac—1 em toda a superfície celular (Hogg, N. et a 1. , Eur. J. Immunol. l6:240— 248 (1986)). A expressão Mac—1 sobre a superfície de neutrófilos e de monócitos em cir culaçao é regulada em direcção ao aumento pelos estímulos inflamatórios} a proteína Mac—1 é armazenada no compartimento vesicular intracelular, o qual ê rapidamente mobilizado para a superfície da célula por quimioatractores (Todd, R. F. et al. J. Clin. Invest. 74: 1280-1290 (1984))} Miller, L. J. et al. ,

J. Clin. Invest. 80:535—544 (Ι9θ7))· Se bem que o aumento da expressão de Mac—1 possa levar a um aumento da adesao, as alterações qualitativas após a activaçao das células pode também ser importante na regulaÇao da ligaÇao de ligandos (Det— mers, Ρ. A. et al. , J. Cell. Biol. 105:1137-1145 (1987))- Tanto as alterações qualitativas como as quantitativas podem ser importantes na regulaÇao da ligaÇao dos leucócitos ao endotê— lio pós—capilar nos locais inflamatórios.

Foram referidos na literatura a sequencia N— -terminal das sub—unidades Cf. de Mac—1 murina e humana (Miller, L. J. et a1« , J.Imuno1. 138:2381— 23^3 (1987)» Springer, T. A.

et al., Nature 314^:540—542 (1985)) e um clone genómico murino que codifica para um exao N—terminal curto (Sastre, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (U. S.A. ) 83: 5644-5648 (1986) ).

A maior parte da sub—unidade Λ de Mac—1 ê semelhante às sub—unidades das integrinas dos receptores da matriz extracelular, com um domínio adicional que está relacionado com as repetições A do factor de von Willebrand e com as duas proteínas de ligaçao de C3 , os factores B e C2.

II. Clonagem da sub-unidade Alfa de Mac—1

Pode usar—se qualquer método de entre vários para clonar o gene da sub—unidade alfa de Mac—1. Um destes mê todos ê iniciado pela análise de um banco de vectores lança— deira de inserções de ADNc (derivados de uma célula que expres . ** sa a sub—unidade alfa de Mac-1) para detecçao da presença de uma inserção que contêm o gene da sub—unidade alfa Mac—1. Esta análise pode ser conduzida por transfecçao de células com o vector e em seguida por analise para determinar a expressão da sub—unidade alfa de Mac—1. A sub—unidade alfa de Mac—1 ê de preferencia analisada usando anticorpos específicos para a sub—unidade alfa de Mac—1. Um método preferido para clonar o gene da sub—unidade alfa de Mac—1 inicia—se determinando a se quência de ácidos aminados da molécula da sub-unidade alfa de Mac—1 ou os peptídeos trípticos da molécula. Para realizar es te trabalho as moléculas da sub—unidade alfa de Mac—1 sao de preferencia purificadas a partir das células produtoras por cromatografia de afinidade com um anticorpo monoclonal e sao isoladas por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio— -poliacrilamida (”SDS—PAGE”) e e le ctroelui çao (Miller, L. J. , et al. , J. Immunol. 138:2381—2383 (1987), cuja referência é aqui incorporada por referência). As moléculas da sub-unidade alfa sao fragmentadas por exemplo com brometo de cianogênio ou

com proteases tais como papaína, quimotripsina ou tripsina (Oike, Y., et al., J. Biol. Chem. 257^9751-9758 (1982)} Liu, C. , et al. , Int. J. Pept. Protein Res. , 21·209—215 (1983)).

De preferência, a sub-unidade alfa θ digerida por via proteolítica com tripsina. Os peptídeos resultantes sao separados por HPLC de fase invertida e submetidos a sequenciaÇao de aci dos aminados. Para realizar este trabalho a proteína ê, de preferência, analisada por sequenciadores automatizados. Apesar de ser possível determinar a sequência integral de ácidos aminados da sub—unidade alfa de Mac-1, ê preferível determinar a sequência de fragmentos peptídicos da molécula. Uma fon te da sub—unidade alfa de Mac-1 prefeível ê a linha de células SKW3.

A sequência de resíduos de ácidos aminados num peptídeo ê aqui designada quer através do uso das suas designações de três letras comumente usadas ou pela sua designa** - ** z» çao de letra única. Uma lista dessas designações de tres letras ou de uma letra finica pode ser encontrada em livros de texto tal como Bjo chemi stry. Lehninger, A. , Orth Publishers, Nova Iorque, NY (1970)· Quando uma tal sequência ê listada verticalmente, está definido que o resíduo terminal de amina está no topo da lista e o resíduo terminal de carboxilo do pe ptídeo está no fim da lista. De modo semelhante, quando lista da horizontalmente está definido que o terminal de amina está na extremidade da esquerda enquanto que o terminal de carboxi lo está na extremidade direita.

Os resíduos de ácidos aminados num peptídeo podem ser separados por hífens. Tais hífens sao apresentados «tf «tf apenas com a intenção de facilitar a apresentaçao de uma sequência. Como exemplo puramente ilustrativo a sequência de aminoácido designadaί indi ca que

Gly, e que resí duo de —Gly—Ala—Ser—Phe— um resíduo Ala está ligado ao grupo carboxilo de um resíduo Ser está ligado ao grupo carboxilo do Ala e ao grupo amina dum resíduo de Phe. A designa çao indica» para alêm disso» que a sequência de ácidos amina_ MM dos contem o tetrapeptideo Gly—Ala-Ser-Phe. A designação nao pretende limitar a sequência de ácidos aminados a este tnico tetrapeptideo, mas pretende incluir (l) o tetrapeptideo que tem um ou mais ácidos aminados ligados a qualquer dos seus terminais amina ou carboxilo, (2) o tetrapeptideo que tem um ou mais resíduos de ácidos aminados ligados a ambos os seus terminais amina e carboxilo e (3) o tetrapeptideo que nao tem resíduos de aminoácido adicionais.

Uma vez que um ou mais dos fragmentos de pe— ptídeos adequados tenham sido sequenciados, examinam—se as se quências de ADN capazes de codificar para estes fragmentos. Devido a que o código genético ê degenerado, mais que um codao pode ser usado para codificar para um aminoácido particular (watson, J.D. , Int Molecular Bjclogy of the Gene, 3rd Ed.

W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977). PP· 356—357). Os fragmentos de peptídeo sao analisados para identificar sequên cias de ácidos aminados que podem ser codificadas por oligonu cleótidos que têm o mais baixo grau de degenerescência. Isto ê realizado de preferência por identificação das sequências que contêm ácidos aminados que sao codificados apenas por um único codao.

Apesar de que ocasionalmente uma sequência de ácidos aminados pode ser codificada apenas por um único oligo nucleótido, frequentemente a sequência de ácidos aminados pode ser codificada por um oligonucleõtido qualquer de um conjunto de oligonucleótidos semelhantes. Ê importante notar que enquanto todos os membros deste conjunto contêm oligonucleóti dos que sao capazes de codificar para o fragmento de peptídeo e, assim, contêm potencialmente a mesma sequência oligonucleo tídica que o gene que codifica para o fragmento de peptídeo, apenas um membro do conjunto contêm a sequência nucleotídica que ê idêntica n sequencia nucleotídica do gene. Devido a que este membro está presente dentro do conjunto, e ê capaz de hi bridar com ADN mesmo na presença de outros membros de conjun—

to, e possivel empregar o conjunto nao fraccionado de oligonu cleútidos do mesmo modo que se pode empregar um oligonucleúti do único para clonar o gene que codifica para o peptídeo.

Um oligonucleútido, ou um conjunto de oligonu cleútidos, adequado, que ê capaz de codificar para um fragmen to do gene da sub—unidade alfa de Mac—1 (ou que é complementar para um tal oligonucleútido ou conjunto de oligonucleúti— dos) ê identificado (usando o procedimento acima descrito), sintetisado e hibridado por meios bem conhecidos na especieli dade, contra uma preparaçao de ADN ou de preferencia de ADNc derivada de células humanas que sao capazes de exprimir o gene da sub—unidade alfa de Mac-1. As técnicas de hibridaçao de ácido nucleico encontram—se descritas por Maniatis, T., et al. (in: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Har— bor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982), e por Haymes, B.D. , et al. (in! Nucleic Acid Hjbridization^ A Practjcal Approa ch IRL Press, Xashington, DC (Ι9θ5)), cujas referrncias sao aqui incorporadas para referência. A origem do ADN ou do ADNc usado e de preferência enriquecida em sequências da sub— —unudade alfa de Mac—1. Este enriquecimento pode ser obtido mais facilmente a partir de ADNc obtido por extracçao de ARN de células que produzem elevados níveis de sub—unidade alfa de Mac—1.

Técnicas tais como as descritas acima ou seme lhantes possibilitaram com sucesso a clonagem de genes para deidrogenases de aldeído humano (Hsu, L. C. , et al. , Proc. Natl Acad. Sei. USA 82:3771—3775 (1985)), fibronectin (Suzuki, S., et al. , Eur. Mol. Bjo. Organ. J. j4: 2519—2524 (1985)), o gene receptor de estrogénio humano (Walter, P. , et a1. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 7889-7θ93))< activador de plasminogeno de tipo de tecido (Pennica, D. , et al» , Nature 3θ1^; 214—221 (1983)) e ADN complementar de fosfatase alcalina placentária de termo (Kam, W, , et al. , Proc. Natl. Acad. Scj. USA 82:8715-8719 ( (1985) ).

Usando o cúdigo genético (Watson, J.D., In:

Molecular Bjology of the gene 3rd Ed. , W. A. Benjamin, Inc. , Menlo Park, CA (1977)), θ possível identificar um ou mais oli gonucleótidos diferentes, cada um dos quais seria capaz de co dificar para os peptideos tripticos da sub-unidade alfa de Mac—1. A probabilidade de que um oligonucleótido particular constitua de facto a sequência que codifica para a sub-unidade alfa de Mac—1 real pode ser estimada considerando relacçoes anormais de emparelhamento de bases e a frequência com a qual um codao particular e realmente usado (para codificar para um ãcido aminado particular) em células eucarióti cas. Tais regras de uso de codoes foram descritas por Lathe, R., et a 1. , J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)· Usando as regras de uso de codoes·' de Lathe, i denti fi ca—se um oligonucleótido único ou um conjunto de oligonucleútidos, que contém a sequência nu— cleétídica mais provável teoricamente, capaz de codificar para as sequências de peptídeo tríptico da sub—unidade alfa de Mac-1.

oligonucleótido ou o conjunto de oligonucle Stidos que contêm a sequência mais provável teoricamente ca paz de codificar para os fragmentos da sub-unidade alfa de Mac—1 ê usado para identificar a sequência de um oligonucleú— tido complementar ou de um conjunto de oligonucleútidos que ê capaz de hibridar com a sequência ou com o conjunto de sequên cias mais provável. Um oligonucleótido que contêm uma tal sequência complementar pode ser empregue como uma sonda para identificar e isolar o gene da sub-unidade alfa de Mac—1 (Ma— niatis, T., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Assim, em resumo, a identificaÇao real das se quências peptídicas da sub-unidade alfa de Mac—1 permite a identificação de uma sequência de ADN mais provável teórica, ou de um conjunto de tais sequências, capaz de codificar para um tal peptídeo. Por construção de um oligonucleótido comple— mentar para esta sequência teórica (ou por construção de um conjunto de oligonucleútidos complementares para o conjunto de oligonucleútidos mais prováveis), obtêm—se uma molécula

de ADN (ou um conjunto de moléculas de ADN), capaz de funcionar como uma sonda para identificar e isolar o gene da sub— —unidade alfa de Mac—1.

As moléculas de oligonucleétidos de cadeia sim pies complementares das sequências que codificam para o peptí deo tííptico da sub—unidade alfa de Mac—1 mais provável foram sintetizadas usando técnicas que sao bem conhecidas dos especialistas de competência normal (Belagaje« R. , et al» , J. Biol. Chem. 254:5765-5780 (1979)» Maniatis, T., et al., In: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, Nier— lich, D. Ρ. , et al. , Eds. , Acad. Press, NY (1976) j Wu, R. , et al. , Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101—l4l (1978)i Khorana, R. G. , Seience 203^: 6l4—625 (1979))· Adicionalmente a síntese de ADN pode ser conseguida através de sintetizadoree automáti co s.

Ê possível clonar o gene da sub—unidade alfa de Mac—1 a partir de preparações de ADN eucariotico de que se suspeite de conterem este gene. Para identificar e clonar o gene que codifica para a proteína da sub—unidade alfa de Mac—1 procede—se a uma busca num banco de ADN, ou de preferência de ADNc, para seleccionar o ADN que tem a capacidade de hibridar com as sondas de oligonucleótido descritas acima. Preparações adequadas de ADN (tais como ADN genómico humano) sao cindidas enzimaticamente ou cortadas ao acaso, e ligadas em vectores recombinantes. A capacidade destes vactores recombinantes para hibridar para as sondas de oligonucle&tidos acima descri— ***** tas é medida em seguida. Procedimentos para hibridaçao sao des critoe, por exemplo, em Maniatis, T., Molecular Cloning A La— boratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) ou em Haymes, B. T. , et al. , Nucleic Acid Hybridiza— tjon a Prctical Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra (I985X ea

Os vectores que sao identificados como capazes de tal hibrida çao sao então analisados para determinar a extensão e a natureza das sequências de sub-unidade alfa de Mac-1 que eles con tem. Com base puramente em considerações estatísticas ê possí vel identificar sem ambiguidades um gene como este que codifi

ca para a molécula da sub—unidade alfa de Mac-1 (através de busca por hibridaÇao) usando uma sonda de oligonucleótido ten do somente l8 nucleótidos.

O gene da sub—unidade alfa de Mac—1 clonado, obtido através do método descrito acima, pode ser ligado operativamente a um vector de expressão e introduzido em células procarióticas ou eucarióticas para produzir a proteína sub— —unidade alfa de Mac—1. As técnicas para estas manipulaçpoes encontram—se descritas por Maniatis, Τ., et al., supra, e sao bem conhecidas na especialidade.

III. A Expressão da sub—unidade Alfa de Mac-1

A presente invenção deriva, parcialmente, da descoberta da sequência de ADNc que codifica para a sub—unida de alfa da molécula de Mac—1. Por ligaçao de modo operacional desta sequencia (ou dum fragmento desta sequência) a um promo tor funcional, ê possível dirigir a expressão da sub—unidade alfa de Mac—1 (ou dum seu derivado funcional) numa célula, ou num organismo.

Diz—se que uma molécula de acido nucleico, tal como ADN, ê capaz de expressar um polipeptídeo se esta molê cuia contêm sequências nucleotídicas que contêm informação de ****** Λ regulaçao da transcrição e da traduçao e se estas sequências se encontram ligadas operacionalmente a sequências nucleotídi cas que codificam para o peptideo. Uma ligaçao operacional e ** Λ ** uma ligaçao na qual as sequências de ADN de regulaçao e a sequência de ADN que se pretende expressar se encontram ligadas de um tal modo que permita a expressão do gene. A natureza pre cisa das regiões de regulaçao necessárias para a expressão de gene poder variar de organismo para organismo, mas incluirão no geral uma região de promotor que, em procariontes, contem tanto o iromotor (que dirige o início dn transcrição de ARN) como as sequências de ADN que, quando transcritas do ARN, da— rao o sinal de início da síntese da proteína. As regiões de regulaçao em células eucarióticas incluirão uma região de pro

motor suficiente para dirigir o início da síntese de ARN.

Diz—se que duas sequências de ADN (tais como uma sequência de região de promotor e uma sequência que codifica para a sub-unidade alfa de Mac—1) se encontram ligadas ** Λ operacionalmente se a natureza da ligaçao entre as duas sequen cias (l) nao tem como resultado a introdução de uma mutaçao de alteraçao de quadro, (2) nao interfere com a capacidade da

A ** ** sequencia da região de promoter para dirigir a transcrição da sequência que codifica para a sub-unidade alfa de Mac-1, ou (3) nao interfere com a capacidade para ser transcrita pela sequencia da região de promotor. Assim uma região de promotor será operacionalmente ligada à sequência de ADN se o promotor for capaz de efectuar uma transcrição da sequência de ADN.

** _s M

A presente invenção diz respeito a expressão da sub-unidade alfa de Mac—1 (ou dum seu derivado·funcional) quer em células eucarióticas quer procarioticas. Para expressar a sub-unidade Mac—1 (ou um seu derivado funcional) numa célula procariótica (tal como, por exemplo, E. coli. , B. subtj— lis, Pseudomonas, Streptomyces, etc.), é necessário ligar ope racionalmente a sequencia que codifica para a sub-unidade alfa de Mac—1 a um promotor procariótico funcional. Tais promotores podem ser quer constitutivos,quer,de preferência, reguláveis (isto ê, inductível ou reprimível). Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor int de bacteriófago X, o promotor bla do gene da /3-lactamase de pBR322 e o promotor CAT do gene de acetil—transferase de cloranfenico1 de pPR325, etc.. Exemplos de promotores procarióticos inductíveis incluem os promotores maiores da direita e da esquerda de bacteriófa— go À, (Pj_, e Pp) , os promotores t rp, recA, lacZ, la cl e ga 1 de E. coli , os promotores específicos de CÇ— amilase (Ulamen, I. , et al. , J. Bacteriol. 102:176-182 (1985)) e de ($-28 de B. subtjli s (Gilman, Μ. Ζ. , et al. , Gene 32jll—20 (Ι9θ4)), os promo tores dos bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, T.J., In: The Molecular Biology of the Bacilli Academic Press, Inc. , NY (1982)), e promotores de Streptomyces (Ward, J.M. , et al. ,

Mol. Gen. Genet. 203 ’· 468—470 (1986) ). Os promotores procarioticos sao revestidos por Gli ck , B. R. , (J.Ind. Microbiol. _1: 277-282 (I987))j Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505-516 (1986))} e Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. l8:415—442 (1984)).

A expressão correcta numa célula procariética requer a presença de um local de ligaçao ribossomal a montante da sequência que codifica para o gene. Estes locais de liΜ M gaçao ribossomal sao descritos, por exemplo, por Gold, L. , et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35« 365—4θ4 (1981)).

Se se deseja a expressão numa célula eucarió— tica, tal como uma levedura, um fungo, células de mamífero ou células vegetais, então seré necessário empregar um promotor capaz de dirigir a transcrição num tal hospedeiro eucariótico. Os promotores eucariéticos preferidos incluem o promotor do gene do rato metallothionein I (Hamer, D., et a1., J. Mol.

Appl. Gen. 273—288 (1982)» o promotor TK do vírus de herpes (McKnight, S., Cell 31^;355—365 (1982))^ o promotor precoce de SV40 (Benoist, C., et al., Nature (London) 290:304-310 (l98l); o promotor do gene gal4 de levedura (Johnston, S.A. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81:5951-5955 (1984) ).

Como e largamente conhecido, a traduçao de ARNm eucariético ê iniciada no codao que codifica para a primeira metionina. Por esta razao, ê preferível assegurarmo-nos que a ligaçao entre um promotor eucariStico e a sequência de ADN que codifica para a sub—unidade alfa de Mac—1 (ou um seu derivado funcional) nao contem incluídos quaisquer codoes que sejam capazes de codificar para a metionina (isto é, AUG). A presença de tais codoes tem como resultado quer a formaçao de uma proteína de fusão (se o codao ÀUG esta no mesmo quadro de leitura que o Mac-1 que codifica para a sequência de ADN) quer uma mutaçao de alteraçao do qwadro de mudança (se o codao AUG nao está no mesmo quadro de leitura que a sequencia que codifica para Mac—1. )

- 22 De preferência introduz—se uma sequência de ADN que codifica para a proteína Mac—1 (ou um seu derivado) quando operacionalmente ligada a um promotor funcional numa célula receptora por qualquer meio de entre os vários adequa—

Μ M ** ** dosi transforma,ao, transfecçao, conjugação, fusão de proto— plastos, electroporaçao, etc..

Podem introduzir—se a sequência que codifica para a sub—unidade alfa de Mac—1 e um promotor operacionalmen te ligado numa célula receptora quer sob a forma de uma molécula de ADN que nao se replica (ou de ARN), que pode quer ser uma molécula linear ou, de preferência uma molécula circular covalente fechada. Apesar de estas moléculas serem incapazes de replicaÇao autónoma, a expressão do polipeptídeo da sub— -unidade alfa de Mac-1 pode ocorrer através de expressão trans iente da sequência introduzida. Em alternativa, pode ocorrer expressão permanente através da integraÇao da sequencia intro duzida no cromossoma do hospedeiro.

De preferência, a sequência introduzida será incorporada num plasmídeo ou num vector virai capaz de repli— caçao autónoma no hospedeiro receptor. Para este efeito pode ser empregue qualquer vector de entre uma ampla variedade. Os factores de importância na selecçao de um plasmídeo ou vector virai particular incluem: a facilidade com que as células receptoras que contêm o vector podem ser reconhecidas e selec— cionadas das células que nao contêm o vector) o número de có— pias do vector que sao desejadas num hospedeiro particular) e se ê desejável ser capaz de fazer o vector ser transferido en tre células hospedeiras de espécies diferentes. Os vectores procarióticos preferidos incluem plasmídeos tais como os pias mídeos capazes de replicaÇao em E. coli (tal como, por exemplo, pBR322, ColEl, pSClOl, pACYC l84, ríVX. Estes plasmídeos sao, por exemplo, apresentados por Mania tis, T. et al. , (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982). Plasmídeos de Bacillus incluem pC194, pC221, pT127» etc.. Estes plasmídeos sao des— “

critos por Gryczan, T. (in: The Molecular Biology of the Bacilli , Academic Press,NY (1982), págs. 3θ7-329)· Plasmídeos de Streptomyces adequados incluem pIJlOl (Kendall, K.J. , et al. , J. Bacteriol. 169 * 4177—4l83 (1987)), e bacteriófagos de estreptomices tais como 0C31 (Chater, K,F., et al., In! Sjxth International Simposium on Actinomyceteles Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54). Plasmídeos de Pseudomonas sao revistos por John, J. F. , et al. , Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986)), Izaki, K. (Jpn. J. Bacteriol. 33^729-742 (1978)).

Os plasmídeos eucarióticos preferidos incluem BPV, varíola bovina, SV4O, círculo de 2 mícron, etc., ou outros derivados. Estes plasmídeos sao bem conhecidos na especialidade (Botstein, D. , et al. , Miami Wntr. Symp. 19» 265—274 Broach, J.R., In: The Molecular Biology of the Yeast Saccaromyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Labora— tory, Colid Spring Harbor, ΝΎ, p. 445—470 (1981); Broach, J. R. . Cell 28:203-204 (1982)} Bollon, D. Ρ. , et al. , J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39—48 (1980); Maniatis, T., In: Cell Bjolo gy: A Compreensive Treatise, Vol. 3> Gene Expression, Academic Press, NY, pp. 563—6θ8 (1980)).

IV. Utilizações da Sub-unidade Alfa de Mac-1 ou Seus fragmen to s ** Λ

A presente invenção proporciona sequências de ácidos nucleicos e de proteína da sub-unidade alfa da molécula de receptor de Mac—1. Esta descoberta permite o uso da tecnologia do ADN recombinante para produzir a molécula da sub— -unidade alfa de Mac-1. Conforme discutido adiante, uma forma de concretização da presente invenção diz respeito ao uso da sub-unidade alfa de Mac-1 por ela própria, como um agente antiinflamatório. Numa forma de concretizaÇao preferida, a sub— -unidade alfa dn molécula de Mac-1 ê usada em combinação com a sua sub-unidade beta. De modo especialmente preferido numa combinação que cria um heterodimero funcional alfa e beta de Mac—1. De modo especialmente preferido, estes heterodímeros devem conter sub—unidades alfa de Mac—1 recombinantes ou os seus derivados funcionais. Esta combinação pode ser produzida usando uma variedade de métodos. Por exemplo, a sub-unidade beta de Mac—1 pode ser produzida separadamente da sub—unidade alfa de Mac—1, misturando-se as duas moléculas em conjunto. Ê contudo preferível produzir ambas as sub—unidades alfa e beta de Mac—1 na mesma célula hospedeira a fim de facilitar a sua própria junção na molécula de receptor de heterodímero de Mac· —1. A sub-unidade beta de Mac—1 (que ê comum a LFA—1 e a ρ15θ 95) pode ser produzida quer por síntese química quer por técnicas de ADN recombinante (Kishimoto, T.K., et al., Cell 48: 681—690 (1987)). A clonagem da beta su—unidade de Mac—1 é para além disso apresentada no pedido de patente dos E.U. pendente normalmente especificada NC de Série 019 440, depositado em 26 de Fevereiro de 1987, pedido esse que ê aqui incorpo rado por referência.

Um aspecto da presente invenção diz respeito às sequências de ácidos nucleicos e proteína da sub-unidade alfa da molécula de receptor de Mac—1. Esta descoberta permite o uso da tecnologia de ADN recombinante para produzir deri vados funcionais da sub-unidade alfa de Mac—1 que podem funcionar como antagonistas da adesao celular. Na presente memó— «M «tf ** ria descritiva a expressão antagonista de adesao celular re fere—se a qualquer molécula capaz de inibir o processo de ade sao célula—célula ou célula—substracto. Ê possível determinar quando um composto particular ê um antagonista realizando uma analise de adesao de monócitos a células endoteliais, de agre gaçao de neutrófilos ou de formaÇao de rosácea de iCb3 de neu trófilos. Análises adequadas de adesao celular sao apresentadas, por exemplo, por Anderson, D.C. et al., J. Immunol. 137^; 15—27 (1986)) e por Keizer, G. D. et al. , (Eur. J. Immunol.

17♦1317—1322 (1987)) cujas referências sao aqui incorporadas por referência. Os antagonistas de agregaçao de leucócitos po ser empregues como agentes antiinflamatótios.

«tf

Na presente memória descritiva a expressão de “

rivado funcioçal da sub—unidade alfa de Mac—1 ê um composto que possui uma actividade biológica (funcional ou estrutural) que ê substancialmente semelhante a uma actividade biológica da sub-unidade alfa de Mac—1. Exemplos de actividades biológi «M cas incluem a capacidade de ligaçao ao ligando natural de Mac -1 ou então a capacidade de ligaçao à sub-unidade da família LFA de gli coprotexnas. Tal ligaçao inibira os acontecimen tos relacionados com a adesao tal como a migraÇao de granuló— eitos através do endotêlio, a agregaçao de granulócitos e a formaçao de rosácea de iCb3· Diz—se que uma molécula ê subs— tancialmente semelhante” a outra molécula se ambas as moléculas têm estruturas semelhantes ou se ambas as moléculas possuem uma actividade biológica semelhante. Os derivados funcionais” da sub-unidade alfa de Mac—1 incluem quer •'fragmentos” quer variantes” da sub-unidade alfa. 0 termo fragmento da sub-unidade alfa de Mac—1” significa referir—se a qualquer sub—conjunto de polipeptídeos desta molécula. 0 termo varian te da sub—unidade alfa de Mac—1” significa uma molécula subs— tancialmente semelhante na estrutura à molécula inteira ou a um fragmento desta desde que a variante” tenha pelo menos uma actividade biológica que ê semelhante a uma actividade da sub —unidade alfa de Mac—1 ou que ê inibitória de uma actividade de Mac—1. Deste modo, conquanto que uma molécula possua pelo menos uma actividade biológica que ê quer semelhante a uma actividade de Mac—1 ou inibitória para essa actividade, é con siderado umavariante” da sub-unidade alfa de Mac—1, de acordo com o significado que ê dado a este termo na presente memó ria descritiva, mesmo se uma das moléculas contêm um ou mais resíduos de ácidos aminados que nao se encontram na outra, ou mesmo se as sequências de resíduos de ácidos aminados nas duas moléculas nao sao idênticas. Deste modo, por exemplo, um composto a que falta (ou que contêm) um ou mais resíduos de ácidos aminados que se encontram (ou que nao se encontram) na sub-unidade alfa de Mac—1 será considerado ser uma variante da sub-unidade alfa de Mac—1 se este composto possui uma acti vidade biológica semelhante a (ou inibitória de) uma activida de biológica da sub—unidade alfa de Mac—1. Entende—se que o

termo actividade biológica” compreende a actividade catalítica” bem como a actividade estrutural” (isto ê, a capacidade de se ligar a uma outra molécula» tal como ê sub—unidade beta de Mac—1, a um anticorpo anti—sub—unidade alfa de Mac—1, a iCb3 ou a outro ligando natural da molécula de Mac-1), etc.

A presente invenção proporciona um processo para a preparaçao de derivados funcionais da sub—unidade alfa de molécula de Mac—1. Para obter estes derivados ê necessário apenas efectuar uma mutagênese de um ADN, de um ARN ou (de preferencia) da sequência de ADNc que codifica para a sub—uni dade alfa de Mac—1. A mutagênese pode ser quer ao acaso ou di rígida especi fi camente a um local. Para além disso, a mutagê— nese pode ser quer espontânea quer induzida usando técnicas químicas, radioactivas ou recombinantes.

âmbito da presente invenção tem a intenção de incluir para além disso, derivados funcionais a que faltam determinados resíduos de ácidos aminados ou que contêm resíduos de ácidos aminados alterados, desde que estes derivados exibam a capacidade de aumentar ou de inibir a adesao celular.

Os agentes mutagênicos químicos incluem análo gos de bases (tais como, por exemplo, 5—bromouracilo ou 2—ami nopurina), agentes de desaminaÇao (tais como, por exemplo, ácido nitroso, hidroxilamina, etc.)j agentes de alquilaçao (tais como, por exemplo, alaranjado de acridina, brometo de etidio, psoraleno , etc. ). A mutaÇao induzida por radiaçao pode ser causada por agentes tais como a luz ultravioleta, gama, raios X, etc.. As técnicas de mutagênese das moléculas do áci do nucleico podem ser encontradas em Miller, J.H. (in!Experi— ments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, NY (1972)), e Silhavy, T. J. , et al» (in: Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor» NY (1984)).

A mutagênese dirigida especi fi cament e a um

local pode ser empregue para produzir mutações específicas em locais adequados do ácido nucleico que codifica para a sub— —unidade alfa de Mac—1. Em resumo, estes procedimentos na generalidade dao início à síntese de um oligonucleútido sintéti co que tem uma sequência de ADN pretendida e definida. Os métodos para sintetizar estes oligonucleútidos sao apresentados por Itakura, K. , et al. (Ann. Rev. Biochem. 53^:323-356 (1984)). Uma molécula de ácido nucleico que codifica para a proteína da sub—unidade alfa de Mac—1 ou para um seu derivado funcional, ê geralmente subclonada num vector de cadeia dupla tal como M13, 0X174, etc., cujas cadeias simples podem ser separa das uma da outra. Uma cadeia simples do vector ê então incuba da na presença do oligonucleútido sintético. Uma vez que o ADN do oligonucleútido é definido dum modo controlável, ê possível construir um oligonucleútido capaz de emparelhamento de bases com qualquer região do ácido nucleico que codifica para a sub—unidade alfa de Mac—1. Uma vez que o emparelhamento tenha ocorrido entre o oligonucleútido e o plasmídeo de cadeia simples, ê possível alongar o oligonucleútido usando polímera se de ADN para criar uma molécula de ADN de cadeia dupla que pode então ser fechada por ligase de ADN. Quando esta molécula de ADN de cadeia dupla é introduzida numa célula, a repli— caçao de ADN semi—conservativa dará como resultado a produção de moléculas precursores, nas quais a sequência de ADN do fra gmento oligonucleotídico foi incorporada nas sequências que codificam para a sub—unidade alfa de Mac—1.

A sub—unidade alfa de Mac—1 da presente inven çao, ou os seus derivados funcionais, podem em alternativa ser preparados por métodos de síntese química usando a técnica bem conhecida de Merriefield ou outras técnicas da síntese dos pe ptídeos. Em alternativa, estas moléculas podem também ser pre paradas por síntese química das moléculas de ácido nucleico (usando, por exemplo, técnicas de síntese de diêster fosfórico), as quais, depois da expressão, darao como resultado a sua produção.

Deste modo, se se deseja introduzir uma muta—

çao pontual, e uma sequência de ADN exógeno num local específico na sequência que codifica para o Mac—1, ou criar uma supressão de nucleótidos normalmente presentes em tal sequência, poderá projectar-se um fragmento de nucleótido que contêm (ou nao tem) a mutaÇao ou a sequencia e em seguida prossegue—se o processo acima descrito. A fim de introduzir uma tal mutaçao ou sequência de ADN exógeno numa região particular do êcido nucleico que codifica para a sub-unidade alfa de Mac—1, ê ne— cessêrio rodear a mutaçao ou a sequencia de ADN exógeno com se quências de ADN flanqueadoras que sao complementares para a sequência de ADN da região na qual a mutagenese ê desejada. (Jenkins, F. , et al. , Bjoessays J? :244-247 (1986)} Doer f ler,

W., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:919-931 (1984); Kaina, B., Biol. Zentralbl. 99 ♦ 513—531 (1980)} Kunke 1, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82:488—492 (1985); Nisbet, I.T., et al., Gene Anal. Tech. £:23-29 (1985); Hines, J. C. , et al. , Gene 11:207-218 (I98O); Messing, J. , et al. , Nucl. Acid. Res. £:309 (1981)).

As mutações podem também ser produzidas atra— . ** ves da aplicaÇao de tecnologia de ADN recombinante. Por exemplo, a sequência nucleotídica duma molécula de êcido nucleico que codifica para a sub—unidade alfa de Mac—1 pode ser examinada para identificar locais de do oligonucleótido que sao re conhecíveis por endonuclease de restrição. Estas endonucleases podem pois ser usadas para cindir especificamente a sequência de acido nucleico num sítio reconhecido. Usando uma endonuclease de restrição que reconhece (e cinde em) duas posições na sequência que codifica para o Mac—1, ê possível cor tar o fragmento da sequência que codifica para a sub-unidade alfa de Mac—1. Em alternativa, ê possível usar duas endonucleases diferentes com este fim. Por incubação das moléculas cindidas na presença de ligase de ADN, ê possível ligar de no vo as sequências que codificam para a sub-unidade alfa de Mac —1 para formar uma sequência única (a que falta o fragmento cortado). Se nao existe qualquer local de reconhecimento de endonucleases de restrição adequado nas sequências que codifi cam para a sub-unidade alfa de Mac—1, então estes locais po—

dem ser introduzidos nas sequências pelo processo da mutagêne se dirigida especi fi camente a um local descrito acima.

As mutações podem, em alternativa, ser introduzidas cindindo a sequência que codifica para a sub—unidade alfa de Mac-1 e mordiscando” as extremidades livres com uma exonuclease. Por meio de tal tratamento ê possível introduzir nao apenas supressões, mas também mudanças de quadro e outros tipos de mutações. Esta técnica ê, para além disso, capaz de ** A introduzir novos locais de endonuclease de restrição na sequen cia que codifica para a sub—unidade alfa de Mac—1. Os métodos para usar as endonucleases de restrição, as ligases de ADN, e as exonucleases sao apresentados por exemplo, por Maniatis,

T., et al. (ln: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).

As técnicas de ADN recombinante podem também ser usadas para produzir proteínas de fusão constituidas pela proteína da sub—unidade alfa de Mac—1 (ou um seu derivado fun cional) e por um novo polipeptídeo. Este novo polipeptídeo nao está li itado a qualquer polipeptídeo particular e pode ser constituido quer por um ónico ácido aminado quer por qual quer conjunto ou permutaÇao de ácidos aminados. Estas moléculas de fusão podem ser produzidas por ligaÇao da sequência de ADN que codifica para o novo peptídeo a uma sequência de ADN que codifica para a sub—unidade alfa de Mac—1 (ou um seu deri vado funcional), dum modo que nao introduz uma mutaçao de alteraçao de quadro. Exemplos de polipeptídeos preferidos que podem ser fundidos com o gene da sub—unidade alfa de Mac—1 (ou um seu derivado funcional) incluem sequências de sinal eu cariótico ou procariótico (Gilbert, W., et a1. Patente U.S.

NQ 4 4ll 994} Casadaban, Μ. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76: 4530-4533 (1979)) ou polipeptídeos que aumentam (ou diminuem) a estabilidade, o período de semi—vida biológica, ou a potência da sub—unidade alfa de Mac-1 (ou um seu deriva— do funcional). Uma revisão excelente da metodologia de fusão • de genes ê proporcionada por Silnavy, T. J. , et al. (ln: Expe—

riments with Gene Fusions Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)).

Os anticorpos (especialmente os anticorpos mo noclonais) podem ser postos em evidência em resposta à imunizaçao com fragmentos da sub—unidade alfa de Mac-1 ou à sub—unidade alfa de Mac—1 recombinante. Estes anticorpos· podem ser usados para evitar a ligaçao de alguns leucócitos a células endoteliais, a células que apresentam antigene ou a células alvo e deste modo podem ser empregues como agentes antiin f lamatório s.

Usando os métodos descritos acima, fragmentos da sub—unidade alfa de Mac—1 podem ser preparados e analisados para determinar se sao antagonistas da adesao celular. Fragmentos que se verificou serem antagonistas de adesao celu lar podem ser empregues como agentes antiinflamatórios de acor do com a presente invenção.

A presente invenção deriva em parte da descoberta de que a capacidade de adesao dos neutrófilos e dos mo— nócitos resulta das interaeçoes que envolvem a molécula receptora de Mac—1. Visto que a adesao celular ê necessária afim de que estas células possam migrar para locais de inflamaçao e/ou levar a cabo várias funções eficazes que contribuem para a inflamaçao, os agentes que inibem tal adesao celular atenuam ou evitam a inflamaçao. A molécula de receptor de Mac—1 está presente na superfície das células dos neutrófilos e dos monó eitos. A adesao destas células a superfícies de plástico ou monocamadas de células endoteliais é mediada em parte pela mo lécula de receptor de Mac-1. Para além disso, veri fi cou—se que a capacidade dos monócitos para fagocitar material estranho ê mediada pela molécula de receptor de Mac—1. A molécula de receptor foi também implicada como tendo um papel na quimioquinese e na quimiotaxia dos monócitos.

Os agentes que interferem com a capacidade da molécula do receptor de Mac—1 para se ligar ao seu ligando de

ligaçao natural sao deste modo capazes de impedir todas as fun çoes dependentes de Mac—1 acima descritas. Deste modo estes agentes podem servir como agentes antiinflamatérios de acordo com a presente invenção. Estes agentes incluem a sub-unidade alfa de Mac-1, (isto ê, o heterodlmero constituído pelas sub— —unidades alfa e betaíi uma composição constituída pelas sub— -unidades alfa e beta de Mac-1 nao associadas e anticorpos ca pazes de ligaçao à sub—unidade alfa de Mac—1 ou a fragmentos daquela sub—unidade. Numa forma de concretização da presente invenção, estes agentes sao constituídos por sub-unidades alfa de Mac—1 solúveis ou pelos seus derivados funcionais e pos suem a capacidade de interferir com ou inibirem tanto a ligaçao de alfa de Mac—1 natural com a sua sub—unidade beta como de inibir a capacidade do Mac-1 para se ligar a qualquer dos ligandos de ligaçao naturais. Todos estes agentes podem ser usados de acordo com a presente invenção. Os agentes antiin— flamatérios da presente invenção sao capazes de tratar a inflamaçao causada pela reacçao do sistema de defesa nao especi fi co.

Uma reacçao do sistema de defesa nao específico é uma resposta mediada por células leucocitárias incapa zes de memória imunológica. Estas células incluem linfúcitos e macrófagos. De acordo com o significado que lhe ê atribuído na presente memória descritiva diz—se que a inflamaçao resulta de uma resposta do sistema de defesa nao específico se a inflamaçao é causada por, mediada por, ou associada com uma reacçao do sistema de defesa nao específico. Exemplos de inflamaçao que resultam, pelo menos em parte, duma resposta do sistema de defesa nao específico incluem a inflamaçao associa da com condiçoes como por exemplo! síndrome da dificuldade respiratória do adulto (adult respiratory distress syndrome = ARDS) ou sindromes da lesão de múltiplos órgãos secundária a septicemia ou a um traumaJ lesão de tecidos do miocárdio ou outros por reperfusao} glomerulonefrite aguda} artrite reacti va} dermatose com componentes de inflamaçao aguda} meningite purulenta aguda ou outras afecçoes inflamatórias do sistema nervoso central} lesões térmicas} hemodiálise} leucaferesej

colite ulcerativai doença de Crohnj enterocolite necrozante) síndromes associadas à transfusão de granulócitos1 e toxicida de induzida por citoquinas e aterosclerose.

Uma vez que o Mac—1 ê expresso em células que sao capazes de ligaçao a tecido endotelial, a administraÇao de sub-unidade alfa de Mac—1, ou de Mac-1 (sub-unidades alfa e beta) a um paciente proporciona um meio para obter uma representação ou uma visualizaÇao do tecido endotelial. Para além disso, este procedimento proporciona informação de diagnóstico que diz respeito à qualidade e distribuição dos li— gandos de ligaÇao da molécula de receptor de Mac—1 que estão presentes no tecido visualizado. Nesta utilização, as sub—uni dades alfa de Mac—1 (ou as moléculas de receptor alfa beta de Mac-1) sao marcadas dum modo detectével, através do uso de ra dioisótopos, marcadores de afinidade (tais como biotina, avi — dina, etc.) marcas fluorescentes, átomos paramagnêticos, etc.. Os processos para realizar tal marcaÇao sao bem conhecidos na especialidade. Os anticorpos (ou os seus fragmentos) podem ser marcados dum modo detectável através do uso de radioisótopos, de marcas enzimáticas, de marcas fluorescentes, de marcas paramagnêti ca s , de marcas de densidade de electrao, de marcas de toxina, etc.. As marcas de toxina preferidas incluem a toxina de difteria, o rícino e as toxinas do cólera. A admini s— traçao de tais moléculas marcadas a um indivíduo identificará os locais de inflamaÇao. Estas marcas detectáveis podem também ser usadas para analisar o estado do sistema imunitório do paciente. A aplicaçao clínica de anticorpos na representação de diagnóstico foram revistas por Grossman, Η. B. , Urol. Clin. North Ametv 13:465—474 (1986)), Unger, E.C. et al. , Science 209:295-297 (1980)).

A capacidade dos monócitos para migrarem ex— pontaneamente para locais de inflamaÇao depende de Mac—1 (Kei zer, G.D. , et al. , Eur. J. Immunol. 17/1317-1322 (1987))· Tal migraÇao pode ser inibida por administraçao de sub-unidades alfa de Mac—1, ou de Mac-1 (sub-unidade alfa e beta) a um pa— ci ent e

De modo semelhante, tem—se verificado que a capacidade das células monocitoides para aderirem a células endoteliais e a capacidade das cémulas monocitóides para sofrerem quimiotaxia, quimioquinese ou fagocitose dependente de Mac-1. (Keizer, G. D. et al. , Eur. J. Immunol. 17^; 1317—1322 (1987)). Qualquer dos agentes antiinflamatórios da presente invenção podem ser empregues para inibir estas actividades.

Os ICAMs (tais como ICAM-l) sao reconhecidas por certos vírus humanos (particularmente rinovírus do tipo maioritério (que se ligam a ICAM-l)). Estes vírus ligam—se a células humanas em virtude deste reconhecimento e deste modo servem de mediadores na infecção virai. Deste modo, a interac çao entre estes receptores celulares e o vírus constitui uma fase importante na etiologia das doenças virais.

Os agentes que suprimem, que competem com ou que inibem a capacidade de um vírus para se ligar a uma molécula de ICAM—1 podem portanto ser utilizados no tratamento de infecções virais (e particularmente rinovirais).

Um aspecto da presente invenção esté deste mo do relacionado com a capacidade da sub-unidade alfa de Mac—1 e dos seus derivados funcionais para interactuarem com ICAM—1 e deste modo para evitarem a fixaçso célula—vírus e a infec— çao virai ou para atenuar ou diminuir a gravidade ou a dura— çao desta infecção.

Sao de especial interesse para a presente invenção os derivados funcionais da sub-unidade alfa de Mac—1 tais como as formas solubilizadas da sub-unidade alfa de Mac—1 os fragmentos da sub-unidade alfa de Mac-1, etc.. Estes agentes sao de preferência administrados a um paciente sob a forma de um heterodímero contendo a molécula em associaçao com uma molécula da sub-unidade beta da família CD—18. 0 objecti— vo acima descrito do tratamento de infecções virais pode ser

efectuado com um agente único ou com uma combinação de vários agentes.

Com o fim de tratar uma infecção virai, o(s) agente(s) da presente invenção acima descritos podem ser admi nistrados a um paciente (por exemplo por via intranasal) numa dose suficiente para permitir que o(s) agente(s) suprimam, com pitam com ou inibam a capacidade de um vírus para se ligar a uma molécula de ICAM-1. Esta dosagem deve, em geral, ser (para cada agente administrado) de 0,01 pg/kg de peso do paciente atê 1 mg/kg de peso do paciente, se bem que se possam utilizar quantidades superiores ou inferiores.

Com o fim de tratar uma infecção virai, a admi nistraçao deste(s) agente(s) pode ser realizada com fins pro filaticos ou com fins terapêuticos. Quando administrados com fins pro fi lé ti co s , os agentes sao administrados no início (isto ê, antes ou um pouco depois) do momento da infecção mas antes de qualquer sintoma da infecção virai. A administraçao profilêtica do(s) agente(s) tem por objectivo evitar ou atenuar qualquer infecção subsequente. Quando administrados te— rapeuticamente, o(s) agente(s) sao administrados no momento do aparecimento (ou logo em seguida) dos sintomas de uma infe cçao virai presente (como, por exemplo, a ocorrência de congestão nasal de indução virai, etc. ou a detecção de vírus nos

Λ ** fluidos orgânicos ou a detecção de anticorpos dirigidos contra os vírus no soro de um paciente infectado, etc. ). A administração terapêutica serve para atenuar qualquer infecção e deste modo reduzir a sua gravidade ou duraçao.

V. Administração da Sub-unidade Alfa de Mac—1

Os efeitos terapêuticos da sub-unidade alfa de Mac—1 podem ser obtidos pela administraçao a um paciente da molécula de receptor de Mac-1 (sub—uni dades y. ou $) , a molêcu la da sub-unidade alfa inteira de Mac—1 ou de qualquer seu de rivado funcional terapeuticamente activo. Estas moléculas podem ser obtidas quer por via sintética quer através do uso de tecnologia de ADN recombinante. Os fragmentos do receptor de Mac—1 ou a sua sub—unidade alfa podem ser adicionalmente obti dos por proteúlise. As vantagens terapêuticas destas moléculas podem ser aumentadas através do uso de derivados funcionais que possuam resíduos de ácidos aminados adicionais para aumentar a união ao veículo ou para aumentar a actividade.

As moléculas da presente invenção sao referidas como sendo substancialmente livres de contaminantes natu rais se as preparações que as contêm sao substancialmente li vres de materiais com os quais estes produtos sao normalmente e naturalmente encontrados.

Ao administrar a um paciente as moléculas terapêuticas da presente invenção, a dose de agente administrado vai variar dependendo principalmente de factores como a ida de do paciente, o peso, a altura, o sexo, a condição médica geral, a história médica anterior, etc.. Em geral, ê desejável proporcionar ao paciente uma dose de sub—unidade alfa de Mac—1 (ou de um seu derivado funcional) que esteja na gama de desde cerca de 1 pg/kg até 10 mg/kg (peso corporal do paciente), apesar de poderem ser administradas doses superiores ou inferiores.

As moléculas da presente invenção podem ser administradas aos pacientes por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, entérica ou parenteral. A administração pode ser por perfusao contínua ou por doses simples ou múltiplas.

Os agentes antiinflamatúrios da presente invenção destinam—se a ser proporcionados aos indivíduos recep— tores numa quantidade suficiente para suprimir a inflamaçao. Uma quantidade ê dita ser suficiente para suprimir a inflamaçao se a dosagem, a via de administraÇao, etc. do agente sao suficientes para atenuar ou suprimir a inflamaçao. Os agentes antiinflamatôrios da presente invenção podem ser proporcionados quer antes do início da inflamaçao (para deste modo supri mir a inflamaçao prevista) ou depois do início da inflamaçao.

Diz-se que a composição ê ”farraacologicamente aceitável” se a sua administraçao pode ser tolerada por um pa ciente receptor. Um tal agente diz—se ser administrado numa quantidade terapeuticamente efectiva” se a quantidade administrada ê fi siologi camente significativa. Um agente ê fisio— logicamente significativo se a sua presença tem como resultado uma modificação detectável na fisiologia dum paciente rece ptor. As moléculas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos para preparar composiçoes aceitáveis farmaceuticamente aceitáveis, sendo esses materiais ou os seus derivados funcionais, combinados em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados e a sua formulação, incluindo com outras proteínas humanas, por exemplo com albumina do soro humano, sao descritas, por exemplo, em Remington's Pharmaceutica1 Sciences (l6th ed.), Osol,

A. , ed. , Mack. Easton, PA (1980). No sentido de formar uma com posição eficaz farmaceuticamente adequada para administraçao eficaz, estas composiçoes conterão uma quantidade terapêutica mente eficaz de sub-unidade alfa de Mac-1 ou os seus fragmentos ou derivados funcionais, juntos com uma quantidade adequa da de veículo.

Podem ser utilizados métodos farmacêuticos

A* M adicionais para controlar a duraÇao da acçao. Podem ser conse guidas preparações de libertaÇao controlada através do uso de polímeros para complexar ou absorver a sub-unidade alfa de Mac-1 ou os seus fragmentos ou derivados funcionais. A libertação controlada pode ser exercida seleccionando macromolêcu— las apropriadas (por exemplo, poliésteres, ácidos poliamínicos, polivini1—pirroli dona, etileno/acetato de vinilo, metil— celulose, carboximetilcelulose ou sulfato de protamina) e a concentração de ma cromolêculas bem como os métodos de incorpo raçao no sentido de controlar a libertaÇao. Outro método possível de controlar a duraçao da acçao por preparações de li— bertaÇno controlada consiste em incorporar as moléculas da sub-unidade alfa de Mac-1, os seus fragmentos ou os seus deri vados funcionais, em partículas de um material polimérico tal como poliéstereS) ácidos po li amí ni co s , hidrogéis, poli-(ácido láctico) ou copolímeros de etileno/acetato de vinilo. Em alternativa, em vez de incorporar esses agentes em partículas poliméricas, ê possível encerrar essas moléculas em microcá— psulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulaçao ou por polimerização interfacial, por exemplo microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli—

-(meti la cri lato), respeetivamente, ou em sistemas de distribuição de produtos coloidais, por exemplo, liposomas, microes feras de albumina, microemulsoes, nanopartícuias e nanocápsulas em macroemulsoes. Estas técnicas sao apresentadas em Re— mington' s Pharmaceutica 1 Sciences (1980).

Tendo agora descrito a invenção dum modo geral, a mesma será mais rapidamente compreendida através da re ferência aos seguintes exemplos que sao proporcionados como ilustração e nao com a inteneno de limitar a presente invenção a menos que seja especificado.

EXEMPLO 1

Purificação das Proteínas e Sequenciaçao complexo de Mac—1 foi purificado a partir de lisados de leucócitos com Triton X—100 por cromatogra— fia de afinidade de anticorpos monoclonais. Esta purificaçao foi realizada quer através do uso do anticorpo monoclonal an— ti—sub—unidade de Mac—1, LM2/1 (Miller, L. J. et a 1. , J. Im— muno 1. 138:2381-2383 (1987)), ou, de preferência, através do uso do anticorpo monoclonal anti—/3, IB4. 5 (Wright, S.D. et al» Proc. Natl. Acad. Scj. (U. S.A. ) 80: 5699—5703 (1983))· A croma tografia de afinidade foi realizada ligando o anticorpo a Se— pharose como descrito por (Miller, L. J. et. a 1. , J. Immunol. 138:2381-2383 (1987); Scheider, C. et al., J. Biol. Chem.25?: 10766-10769 (1982)).

Prepararam—se lisados de células de expressão

de Mac—1 de acordo com o método de (Miller, L. J. et ai., J. Imunnol. 138:2381-2383 (Ι9θ7))· θ lisado foi passado através de uma pré—coluna de Sepharose-mroteína A de 3 ml ligada em série com a coluna IB4. 5 de 3,5 ml depois de pré—lavagem de ambas as colunas com 5θ ml de Triton X—100 a 0,5%, desoxicola to de sédio a 0,5%, Tris—HC1 2L mM a pH 8. Depois de carregar o lisado, lavou—se a coluna com 40 ml da mesma solução e efe— ctuou-se a eluição da substancia ligada com sucessivas lavagens com tampões de pH ou força iónica crescentes: l) 10 ml de Triton X-100 a 0,1%, glicina 0,1 M a pH 9i 2) 20 ml de Tri ton X—100 a 0,1%, glicina 0,1 M a pH 10} 3) 50 ml de Triton X-100 a 0,1%, TEA a 0,1%, pH 11,5i e 4) 40 ml de NaCl 0,l4 M, Triton X-100 a 0,5%, Tris-HCl 0,01 M a pH 8. Uma SDS-PAGE das fracções mostrou que a maior parte da substância ligada foi eluída a pH 11,5·

A sub-unidade Λ de Mac—1 foi isolada por electroforese preparativa em gel de polia crilaroida do antigene purificado por afinidade. Depois da electroeluiçao , a sub—uni dade ú( isolada foi precipitada com etanol, reduzida e alquila da. Di ssolveram— se 50 yag de sub-unidade & purificada em bicar bonato de amónio 0,1 M, cloreto de cálcio 0,1 mM e zwittergent 3-14 a 0,3% θ dig eriu—se com tripsina a 2% (p/p) a 37°C duran te 6 horas, com adições posteriores de tripsina a 1% cada 2 horas. Os peptídeos resultantes foram separados por HPLC de fase invertida numa coluna C4 (Vydac) e foram eluídos com um gradiente de acetonitrilo (0 a 60%) em ácido trifluoroacético (TFA) durante 2 horas. Concentraram—se as fracções recolhidas e submeteram—se a subsequenciaÇao num sequenciador de fase gás-líquido de Applied Biosystems.

Por imunoprecipitaÇao com anticorpo monoclo— nal específico da sub-unidade mostrou—se que a proteína Mac-1 era a molécula predominante eluída da coluna de Sepharose de anticorpo monoclonal anti—·, como esperado visto que os neu— trófilos sao as células primárias rio lisado de leucócito e ex pressa muito mais Mac—1 que LFA—1 ou p!5O,95·

EXEMPLO 2

Isolamento e Sequenciaçao de Clones de ADNc

A sub-unidade 0( purificada foi digerida com tripsina e os peptídeos resultantes foram separados por HPLC de fase invertida e submetidos a uma micro—sequenciaçao proteica (Quadro I). Por comparaçao das sequências peptidicas da sub—unidade Λ de Mac—1 com a sequencia da sub—unidade ot de pl5O,95 (Corbi, A. et al., EMBO J. £:4023-4028 (1927)) verifi cou—se um elevado grau de semelhança. 0 Quadro I mostra os pe ptídeos trípticos da sub—unidade ct de Mac—1 e as suas posiçoes na sequencia derivada de ADNc. No quadro, as posiçoes sem especificação de ácido aminado sao indicadas por *'X» as posições incertas sao indicadas entre parêntesis. Os peptídeos fo ram obtidos a partir de Mac—1 purificado em Sepharose—Proteí— na A-anticorpo monoclonal IB4 excepto para o peptídeo 86 que foi obtido a partir de Mac—1 purificado em Sepharose—anticorpo monoclonal LM2/1, e os peptídeos 88 e 90 que foram obtidos de ambas as origens. A sequência peptídica usada para o proje cto da sonda oligonucleotidica está sublinhada·

QUADRO I

SEQUÊNCIAS DE PEPTÍDEOS TRÍPTICOS DA SUB-UNIDADE ALFA DE

Mac-1

Peptí deo	Sequênci ε	ι de	ácidos aminados	Re sí duo s
14	T	I Q	N Q	L	R				307-313
32	V	Q S	L V	L	G	A	P	R	400-409
43	Y	V I	G V	G	D	A	F	R	267-276
44	Y	Q H	I G	L	V	A	M	F R	410-420
53A	w	Q C	(D)	A	V	L	Y	GEQGQPXGR	488-504
53B	E	F V	(S)	X	X	(M)	(E) (Q) (L)	155-164
54 A	Ι-	(G)	D P	L	G	Y	E	D V I Ρ Ε Λ D R	246-201
71	Ε	F T	A L	F	P	F	E	K	744-753
79A	V	D S	D M	N	D	A	Y	L G (Y)	379-390

Quadro I (continuação)

Peptí deo Sequência de ácidos aminados Resíduos

79B X Q (C)XIPFFGIQE 1015-1026

GCPQEDSDIAFLIDGSGSIIPHDFR 127-151

TOTVFFFPLDLSYR 801-8l4

LXFSLVGTPLSAFGNLRPVLAEDAQR 718-743

As sequências peptídicas foram usadas para o projecto de 4 sondas oligonucleotídicas de sequência simples.

peptídeo 88 foi seleccionado para o projecto de um oligonu cleótido de 42 bases específico para a sub-unidade á( de Mac—1 por causa do seu baixo nível de redundância e da sua homologia para uma região da sub-unidade Λ de p!5O,95 próxima da ex tremidade C terminal (isto ê, na direcçao da extremidade 3’ de um ADNc).

Os oligonucleótidos foram marcados na extremi

O Q dade usando quinase de po linucleóti do T4 e f~ fi Ρ ~7— ATP (Ma— niatiS) T., et al.i (in! Molecular Cloning, A Laboratory Manual. , Cold Srping Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor,

NY (Ι9θ2)) e foram usados para efectuar uma busca num banco de ADNc seleccionado por dimensão de células HLÓO induzidas por PMA (Corbi, A. et al., EMBO J. £:4023-4028 (1987)). Depositaram—se em placas 5 ^x 10^ recombinantes primários, transfe riram-se para filtros de nitrocelulose em duplicado e pré—hibridaram—se de um dia para o outro como descrito (Corbi, A. et al. , EMBO J. ^:4023-4028 (1987)). A hibridaçao com os oli— gonucleótidos foi feita em 6 x SSC, SDS a 0,1 %, pirofosfato de sódio a 0,05 % θ 100 jig/ml de ARNt a 37°C de um dia para o outro. Lavaram—se os filtros na mesma solução sem o ARNt a tem peratura ambiente durante 30 minutos e a 45°C durante 15 minu tos. Os filtros húmidos foram expostos de um dia para o outro a uma película raios—X pré—exposta a luz ralâmpago com um fi1 tro de intensificação.

Obtiveram—se placas de fagos que deram sinais

a partir da extremidade 5'

10^ recombinantes primários induzido por PMA com o oli positivos em duplicado depois da separaÇao com o oligonucleStido de 42 bases:

5'—ACCCAGGTGACCTTCTTCTTCCCCCTAGACCTGTCCTACCGG-3' e submeteram-se a três ciclos adicionais de subclonagem e selecçao com a mesma sonda· 0 isolamento de clones de ADNc de comprimento integral foi realizado por re—selecção dos filtros com um oligonucleÔtido marcado na extremidade que tem a sequên ci a '·

5’-GGATGGACTGGTAGACCTGACTGTAGGAGC-3' e sondas de translaÇao de encaixe do clone de ADNc parcial AMl4.

A selecção dos 5 x a partir do banco de ADNc de HL—60 gonucleótido de 42 bases deu origem a 16 clones positivos e o mais comprido destes clones (AMI 4, 2,9 kb) foi seleccionado para sequenciaçao (Figura l). A sequência de ácidos aminados derivada de ADNc de >Ml4 codificada para quatro dos peptídeos trípticos derivados da sub-unidade de Mac-1 purificada. A fim de isolar um clone de ADNc de Mac-1 de comprimento integral, o banco foi submetido a nova busca com um fragmento EcoRI de 1,0 kb e seleccionaram—se um oligonucleótido de 3θ bases derivado da extremidade 5' de ÀMl4 e vinte e quatro novos cio nes de ADNc que se prolongam na direcçao da extremidade N—ter minai da proteína. Por isolamento das inserções destes vinte e quatro clones de ADNc verificou—se que três deles (\J123, A.M42 e ΛΜ90) estendem—se 2 kb para 5’ de AMl4 (Figura 1).

clone M23 é um clone de ADNc Λ de Mac—1 de comprimento integral. Este clone codifica para a proteína da extremidade N—terminal (Miller, L. J. et a 1. , J. Immunol. 138: 238I—2383 (1987)) e para os peptídeos trípticos nao detectados em Atfl4. Os clones >Ml4 e AM23 apresentam mapas de restri çao idênticos nas suas regiões de sobreposição.

EXEMPLO 3

-. 42

Mapeamento de Restrição e Sequenciaçao

Purificou-se o ADN dos fagos positivos, cio— r.ou-se em pUC13, 18 ou 19 e fez—se o mapeamento de restrição usando procedimentos normais (Maniatis, Τ. , et a 1. (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora tories, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Os fragmentos de restrição foram subclonados em M13 mpl8 e mpl9 e foram sequencia dos pelo método da terminação didesoxi (Sanger, F. et al. i Proc. Natl» Acad. Sei» (U.S. A. ) 74 · 5463—5467 (1977))» A sequen ciaçao de ADN iniciada por oligonucleétido foi usada nos casos onde nao estavam disponíveis locais de restrição convenien tes. A região de codificaÇao completa, a região nao traduzida 5' e mais 60% da região nao traduzida 3’ foram sequenciadas em ambas as cadeias. As regiões nao traduzidas 3’ dos clones de ADNc VM23 e ÀM9O foram submetidas à sequenciaçao didesoxi do ADN plasmídico e a analise usando o sistema Erase—a—base (Pro mega) para fazer supressões de acordo com as instruções do fa bricante (Henikoff, S. Gene 28:351—359 (1984)).

A sequência de ADNc composto de ÀM23 contêm 474o pb e tem um quadro de leitura aberto comprido de 3534 nu cleétidos, deixando uma região nao traduzida 5' de 72 pb e uma região nao traduzida 3' de 1,2 kb (Figura 2). A região nao tra duzida 3’ de ÃMl4 contém uma extensão invertida de poli-(CA) (nucleétidos 3667 a 3θ62) (S un, L. et a 1. , Nucl. Acid Res. 12: 2669—269O (1984)), uma repetição disseminada Κρη I parfiai (nucleétidos 4566 a 4631) (S un , L. et al. , Nucl. Acid Res. 12: 2669-269O (1984)) e extremidades com uma extensão de mais de 4θ adenosinas. Existem dois sinais de poliadeniiaÇao de consenso nos nucleótidos 4191 e 4678. A análise das regiões nao traduzidas 3' de ÀMl4, ÀM23 e AM90 indicam que o primeiro sinal de poliadenilaÇao ê usado em AM23 e o segundo em ÀMl4 e Am 90, indicaçdo que ambos os sinais de poliadeniiaÇao sao fun cionais. 0 mapeamento de restrição de 15 clones de ADNc adicionais sugere que ambos os sítios de poliadeniiaÇao sao usados com igual frequência. Na região nao traduzida 3’ de,lM90

(e de )kM42) faltam 440 pb situados entre os nucleótidos 3629 e 4070 em JlMl4 e X>123 (Figuras l). As sequências GAA/GTATCC e AAG/A nos limites da supressão (flechas, Figura 2) estão de acordo com a regra de GT/AG para locais de corte (Mount, S.M., Nucl. Acid Res. 10:4$9—472) ) e assim as duas classes diferentes de ADNfc's parecem corresponder a ARNm's cortados alternativamente.

quadro de leitura aberto de AMl4/Afl23 é tra duzido numa proteína de 1137 resíduos, com um peptideo de sinal de l6 ácidos aminados definido pela sequência N—terminal da sub—unidade çX de Mac—1 anteriormente referida (Miiler L. J. et al. , J. Immunol. 138:2381-2383 (1987); Pierce, M. W. et al· , Biochim. Bjophys.Act a ·8·?4: 368—372) (Figura 2). Para além da concordância com a sequencia N—terminal da proteína, os l86 resíduos determinados por sequenciaÇao de peptídeos trípticos (Quadro I) concorda perfeitamente com a sequência traduzidaEste facto confirma o isolamento de clones de ADNc da sub—uni dade £< de Mac-1 autênticos. A sequência de ácidos aminados da sub—unidade 0( de Mac—1 tem as características de uma proteína de transmembrana clássica, com um domínio de resíduo 1092 N— —terminal, um domínio de transmembrana presumível hidrofóbico de 25 resíduos e um domínio hidrofílico C—terminal de 19 resí duos (Figura 2). A presença no domínio de 1092 resíduos N—ter minai de 19 locais de N—glicosilaÇao potenciais (Asn-Xaa-Ser/ Thr), um dos quais foi sequenciado no peptideo 90 (resíduos 718 a 743) confirma que este domínio ê um domínio extracelular. 0 peso molecular previsto da proteína ê de 125 6ll Daltons, consistente com estimativas anteriores depois do tratamento com N— glicanase da sub-unidade Ot de Mac—1 (Mr 137 000) (Miiler, L. J. et al. , J. Immunol. 1^9:842-847 (1987)). Supondo uma Mr de 2 500 por hidrato de xarbono de elevado grau de manose, prevê-se uma Mr = 173 001 para o precursor da sub—uni dade &· de Mac—1, que se pode comparar com o observado M =

160 000 (Miiler, L. J. et al. , J. Immunol. 139:842-84? (1987) )Depois do processamento do hidrato de carbono, a sub—unidade de Mac—1 apresenta uma Mr de 170 000.

A estrutura primária da sub-unidade zX de Mac-1 sugere a presença de sete repetições internas (Figura 3).

As repetições V, VI e VII mostram o mais elevado grau de seme lhança entre si, o qual ê estatisticamente significativo — 2 —4 Λ Λ (ρ < 10 a ρ ( 10 ), e contem sequências semelhantes ao motivo em lacete de EF de ligaÇao de catioes divalentes de proreínas como calmodulina e parvalbumina (Szebenyi, D.M.E. et a 1. , Nature 294: 327—332 (198l)) (Figura 3), em correlação com as necessidades de catioes divalentes da adesao mediada por Mac—1 (Wright, S.D. et al· , Proc. Natl. Acad» Sei. (U.S. A.)

80:5699— 57P3 (1983))· As repetições I a IV nao possuem as sequências semelhantes a lacete de EF mas contém as sequências altamente conservadas Y F G A S/A LeLVTVGAP que flanqueiam o centro das repetições (Figura 3)· Estas sequências flanqueadoras de consenso sao também conservadas em outras in tegrinas (Figura 3)· A presença das sete repetições sugere que uma grande parte da porção N-terminal da sub—unidade de Mac

-1 podem ter tido origem em acontecimentos de duplicaÇao.

EXEMPLO 4

Análise de mancha de Northern

As células mononucleares aderentes do sangue periférico foram isoladas por centrifugação em Fico11—Hypaque e incubaÇao das células mononucleares em placas de cultura de tecido com RPMI l64O e soro de vitela fetal a lo % durante 3θ min a 37°C. As células nao aderentes foram removidas das placas por lavagem extensiva com RPMI l64O. As células aderentes foram destacadas das placas por incubaÇao com 10 ml de PBS com EDTA 5 mM durante 15 min a 37°C. Mais de 95 % de células aderentes foram positivas para a presença de Mac-1 por detecçao por imunofluorescência indirecta. 0 tratamento com PMA das li nhas de células HL-60 e 0937 foi realizado como descrito (Mil ler, L. J. et al. , J. immunol. 137 ’ 2tí 91- 2 900 (198b). 0 ARN total foi extraído das células de aderentes do sangue periférico, bem como das linhas de células SKW3, JY, HL—60 e U937 usan

- 45 do isotiocianato de guanidina (Maniatis, T. , et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato ries, Cold Spring Harbor, NY (19Õ2)). Fe z—se correr 10 ou 20 jig de cada amostra em gel de agarose—formaldeído a 1 % e trans feriu—se para uma membrana de nylon. As hibridaçoes foram rea lizadas usando o fragmento Eco RI de 2,3 kb de ÀM23 como sonda .

Verificou-se que a expressão na superfície de célula do complexo 0(.//3 de Mac-1 era quase exclusivamente res trita a células da linhagem mielóide (Miller, L. J. et a 1. , J. Immunol. 137^2891-2900 (1986)). As manchas de Northern mostra ram que o ARNm da sub-unidade de Mac—1 ê de 4,7 kb e estava presente em monócitos e em linhas de células mielóides mas nao em linhas de células T ou B.

A expressão de Mac—1 era regulada durante a diferenciaçao dos leucócitos e podia ser induzida em linhas de células mielomonocíticas por cultura com éster de forbol durante 1 a 3 dias (Miller, L. J. et al. , J. Immunol. 137^:2891 — 2900 (1986). A análise de mancha de Northern revelou que ο ήί vel de estado de equilíbrio de ARN de (X de Mac—1 em linhas de células milemonocxticas HL—6θ e U937 era extremamente baixo ou nulo ((Miller, L. J. et al. , J. Immunol. 137:2891-2900 (1986)) 0 tratamento com PMA de ambas as linhas de células induziu a expressão de ARNm da sub-unidade ** de Mac—1 e aumentou a expressão de ARNm da sub-unidade /3 de Mac-1. Estes resultados sao concordantes com estudos anteriores na biossíntese das sufe—unidades o< e fi de Mac-1 (Miller, L. J. et a 1. , J. Immunol. 139:942—847 (1987)), na expressão de superfície do complexo A/ fi de Mac-1 nestas linhas de células (Miller, L. J. et al. , J. Immunol. 137·2891—2900 (1986)) e sugere que a expressão de su perfície de células de Mac—1 ê regulada pelo nível de ARNm.

Dum modo semelhante, o tratamento da linha de células premie— locíticas de murino MI com interferao induz a expressão do ARNm da sub-unidade <y de Mac—1 murina (Sastre, L. et al. , Pro c Natl. Acad. Sei. (U.S. A. ) 83: 5644—5648 (1986)). Duas mensagens de sub-unidade çf, de Mac-1 de aproximadamente 4,7 e 4,4 kb fo— ram resolvidas nas linhas de células mielomonocíticas HLÓO e Up37 depois de electroforese prolongada do ARN. A presença de múltiplas espécies de ARNm de tX, de Mac-1 pode ser o resultado do uso alternativo de dois sinais de po li a deni la çao ou cortes alternativos. A dimensão das espécies de ARNm está de acordo com estas possibilidades. A análise de mancha de Southern sob condiçoes críticas do ADN humano demonstrou que a sub-unidade Of ê codificada por um gene de cópia simples.

EXEMPLO 5

Homologias de Sequência

A sequência de sub-unidade IX de Mac—1 foi com parada com as sequências proteicas da base de dados na National Biomedical Research Foundation (NBRF) (Washington, DC). Usou-se o programa ALIGN para alinhamento de sequências (Day— hoff, M.O. et al. , Met. Enzymol. £1:524-545 (1983)). A significancia estatística dos alinhamentos foi estimada obtendo—se os resultados do alinhamento para 100 permutações ao acaso das sequências alinhadas e calculando-se o número de desvios pa— drao entre a média dos resultados para comparações ao acaso e o resultado do alinhamento cuja significancia se pretende est; mar. Para a obtenção de resultados usou—se a matriz de dados •O de mutaçao 25O PAM com uma penalidade de intervalo = o e um enviezamento = 6.

EXEMPLO 6

Mac-1 como um membro da Superfamília de Genes de Integrinas

A determinação da estrutura primária da sub— —unidade f) comum de Mac—1/LFA—l/pl50,95 (Kishimoto, T.K. et al. , Cell 48:681-690 (1987); Law, S.K.A. et al. , EMBO J. 6: 915—919 (1987)) e da sub-unidade oi.de plf»O,95 (Corbi, A. et al., EMBO J. _6:4O23-4O28 (1987)) mostrou que os receptores de adesao de leucócitos estão relacionadas dum modo evolutivo com

os receptores da matriz extracelular (ECM), e levou ao concei to de uma superfamília de genes de receptores célula—célula e célula—matriz denominados integrinas” (Hynes, R. 0. Cell 48:

549-554 (1987)).

Foram definidas tres subfamílias de moléculas de integrinas, cada com uma sub—unidade distinta, nomeadamente a subfamília do receptor de fibronectina (integrina de partilha , a subfamília de receptor de adesao de leucócitos (integrina de partilha $ ) ^{e a} subfamília do receptor de vi bronectina—Ilb/lIIa (integrina de partilha -^).

As coraparaçoes das sequências de ácidos amina dos e de ácidos nucleicos que codificam para as integrinas com os da sub—unidade 1% de Mac—1 foram levados a efeito a fim de definir as relações entre as sub—unidades <% das diferentes subfamílias de integrinas (Figura 4). Verificou-se que as sub — unidades Ci de Mac—1 e de ρ15θ,95 eram de 63 % idênticas ao nível de ácidos aminados e 68% idênticas ao nível de nucleôti dos. 0 elevado grau de semelhança estrutural entre as sub—uni dades Λ de Mac—1 e de ρ15θ,95 está reflectida no nível funcio nalíMac-1 e ρ15θ,95 apresentam capacidade de ligaçao a iC3b (Beller, D.I. et al., J. Exper. Med. 156:1000-1009 (1982)5 Micklem, K.J. et a1., Bjochem. J. 2315233—236 (Ι9θ5)) e ambas as proteínas sao conhecidas por desempenhar um papel na agre— gaçao de neutrSfilos e na adesao de neutrófilos e de monSci— tos às células endoteliais (Andersen, D. C. et a 1. , J. Iminunol. 137:15-27 (1986) 5 Vedder, N.B. et al. , J. Clin. Invest. 81:672 -682 (1988) 5 Te Velde, A. A. et al. , Immunol. 61:261-267(1987)). A sub—unidade X de LFA—1 ê em 35 % idêntica as sub—unidades o< de Mac-i e de pl5O»95· As sub—unidades Qí. do receptor de fibro nectina, do receptor de vitronectina e da glicoproteína Ilb sao em 40 % idênticas umas às outras. Uma vez que as sub—unidades « de Mac—1 e de pl5O,95 sao em 25 % idênticas às sub— — unidades dos tres receptores ECM, as sub—unidades de Mac — 1, de pl5O,95 e de LFA—1 estão mais proximamente relacionadas umas com as outras do que o resto das sub—unidades o( de integrinas. As sub—unidades o( leuco ci t ári a s também se parecem

unias com as outras por conter um segmento de 187 resíduos que nao encontra nas sub—unidades iX de ECM (ácidos aminados 150 a 33θ na sub-unidade oí. de Ma c-l) e na nao existência de uma região de 28 ácidos aminados (espaço no resíduo 1002 em Mac-l) onde as sub—unidades CÁ. do receptor de ECM sao cindidas proteo loticamente durante o processo de gerar duas cadeias ligadas por dissulfureto (Ruoslahti, E. et al. , Science _2J_8 :4 91-4 97 (1987))·

A área de identidade mais extensa entre sub— -unidade si de Mac—1 e o resto das sub-unidades de integrinas situa—se entre os resíduos 434 e 592, precisamente nas fronteiras das três repetições internas que contêm as sequências presumíveis de ligaçao a catioes divalentes. Nesta região a sub-unidade OC. de Mac—1 mostra 88 % de identidade com a sub— unidade oi de pi5O,95 ao nível de ácidos aminados e 90 % ao nível de nucleótidos, e a percentagem de identidade das sub— unidades of de integrina do receptor de ECM é de 38 %· As sub—

-unidades de receptor de ECM têm quatro locais tresumíveis de ligaçao de catioes divalentes no interior da sua estrutura primária (Suzuki, S. et a 1. , J.Bjol. Chem. 2Ô2: ΐ4θ8θ—ΐ4θδ5 (1987); Argraves, W.S. et al., J. Cell Biol. 105: II83-II9O (1987)i Poncz, M. et al., J. Biol. Chem. 202:8476-8482 (1987)) os quais se alinham com as repetições IV a VII nas sub-unida— des fr. de Mac—1 e de pl5O,95> a repetição IV em Mac—1 e pl50,95 nao contém a sequência presumível de ligaçao de catioes divalentes (Figura 3)· A ligaçao de ligandos pelas integrinas do receptor ECM ê dependente de cálcio (Ruoslahti, E.et al. , Science 238:491-497 (1987)) e no caso da sub-unidade da glico— proteína Ilb/lIIa foi verificada a ligaçao de cálcio radioac— tivo (Ruoslahti, E. et al., Science 238: 491-497 (1987)). 0 elevado grau de conservaÇao destas regiões sugere um papel na manutenção da conformação do receptor ou um envolvimento di— recto na ligaÇao do ligando.

Uma região adicional de alta conservaÇao entre as sub—unidades o( sao as regiões de transposição das membranas. 0 domínio de transmembrana de OC de Mac-1 apresenta 88%

- 49 25E®c2Sa»c

de identidade com o domínio correspondente de Λ em 150,95 e 40 a 50 % de identidade com os domínios das sub—unidades al de IId VNR e FNR (Tamkun, J.W. et ai. , Cell 46:271-282 (1986)} Argra ves, W.S. et al., J. Cell Biol. 105}II83-1190 (1987)} Poncz,

M. et al., J. Bjol. Chem. 202:8476-8482 (1987)) (Figura 4).

Uma conservaÇao semelhante foi verificada nos domínios de trans membrana e citoplêsmico das difetentes sub—unidades h. Kishimoto, T.K. et al., Cell 48:681-690 (1987)} Law, S.K.A et _al., EMBO J. £:915-919 (1987))} Tamkun, J.W. et al., Cell 46:271-282 (1986)} Fitzgerald, L. A. et al. , J. Bjol. Chem. 262:3936 -3939 (1987)} Argraves, W.S. et al., J. Cell Bjol. 105:1183—II90 (1987))· Com base neste alto grau de conservaÇao ê concebível que estas regiões podem desempenhar um papel na regulaçao da ligaçao de ligando (Vedder, N.B. et a 1« , J. Clin. Inve st. 8l:672—682 (1988) através de int eracçoes com outros com ponentes da membrana ou com o citoesqueieto. A descoberta de que o receptor de fibronectina liga a talina (Horwitz, A. et a i. , Nature 320:5 31—333 (1986)), de que as interacçoes mediadas por LFA—1 sao dependentes da integridade do citoesqueieto (Springer, T. A. et a 1« , Ann. Rev. Immunol» £:223-252 (1987)) e de que LFA-1 compete com talina depois da estimulação por éster de forbol (Burn, P. et a 1» , Proc. Natl. Acad. Sei. (U«5.

A. ) 85:4 97-501 (1988)) é mais um argumento a favor do envolvi mento destes domínios em interacçoes do citoesqueieto e em transduçao de sinal·

EXEMPLO 7

MapeaÇao do Gene da sub—unidade Alfa de Mac—1

Os genes das sub-unidades oc e P) de Mac—1, LFA-1 e pl5O-r95 foram localizados por mancha de Southern em híbridos de células de rato X células somáticas humanas e por hibridaÇao in situ cromossoma! usando sondas de ADNc. Os genes que codificam para as sub-unidades de LFA—i, Mac—i e pl5O,95 situam-se no cromossoma l6, entre as bandas pll e ρ13·1, definindo um aglomerado de genes implicado na adesao

- 50 de leucócitos. As cara ct eri st i ca s estruturais comuns e a e s— treita proximidade dos tres genes das sub-unidades Λ sugerem com nitidez que os genes para as sub—unidades (X de Mac-1, de pl5O,95 e de LFA—1 que participam nos acontecimentos de dupli caçao de genes e que estas duplicações de genes tiveram lugar depois da divergência das diferentes subfamílias de sub-unida des X de integrinas.

EXEMPLO 8

Homologia com o factor de von Willebrand e com o factor B

Conforme anteriormente descrito para pl5O»95 (Corbij A. et al. ι EMBO J. _6:4023— 4028 (1987))» existe uma re giao de 187 ácidos aminados na sub—unidade X de Mac—1 (resíduos I50 a 338) sem contrapartida nas 3 sub—unidades cd sequen ciadas de integrina de receptor ECM. Esta região e referida como domínio L, por causa da sua presença em integrinas leuco citarias. A busca discutida anteriormente da base de dados de sequências da National Biomedical Research Foundation usando o programa FASTP revelou homologia dos resíduos 128 a 314 da sub—unidade &· de Mac—1 com o factor de von Willebrand (vWF) (Shelton-Inloes, B.B. et a 1. , Bjochem. 25^;3164—3171 (1986)) (Figura 5)- As regiões homólogas sao de particular interesse porque corresnondem em Mac—1 quase exactamente ao domínio L e em vWF ao domínio de tipo A_t um domínio anteriormente definido pela sua presença em 3 repetições em série homólogas de 200 resíduos denominadas Al (497—716), A2 (717—909) e (910-1111) (Shelton-Inloes, B.B. et al. , Bjochem. 25·3164-3171 (1986)).

A sub-unidade de pl5O,95 (Figura 4) e a sub-unidade Λ de Mac—1 de murino também apresentam homologia com os domínios A de vWF. Uma vez que se verificou que os domínios A de vWF sao homólogos com o factor B (Shelton-Inloes_t B.B. et a 1. , Bjochem 2^:3164-3171 (1986); Mole, J.E. et al., J. Biol. Chem. 259: 3407-3^12 (1984)), uma componente da via alternativa do complemento que interactua com C3, examinaram—se também as homo— logias com o factor B e com o seu homólogo na via clássica,

C2 (Bentley, D.R., Biochem. J. 239:339-345 (1986) (Figura 5)· 0 domínio homólogo no factor B está claramente demarcado no lado da extremidade N pelo local pelo qual o factor B ê cindi do para dar o factor Bb activo e no lado da extremidade C pelo domínio de protease de serina (Mole, J.E. et al. , J. Biol. Chem. 259:3407-3412 (1984)); Bentley, D.R., Biochem. J. 239: 339—345 (1986)) (Figura 6). A avaliaÇao com o programa ALIGN (Dayhoff, M.0. et a1., Met. Enzymol. 91·524-$45 (1983)) mostrou que a homologia de Mac—1 com os domínios de vWF Al, A2 e A3 e com o factor B é de significado estatístico elevado (Quadro II) e deste modo que os segmentos homólogos de ácidos aminados em cada uma destas proteínas devem ter evoluído a partir dum domínio de sinal primordial. Se bem que a homologia de Mac-1 com C2 nao seja estatisticamente significativa, o factor B mostra homologia significativa com C2 e serve como ligaçao evolutiva, mostrando que o segmento em C2 evoluiu a partir do mesmo domínio primordial. 0 Quadro II compara os re suitados do alinhamento do domínio específico de leucócitos da sub-unidade alfa de Mac—1 (128—314) com as repetições de A de factor de von Willebrand (A1I5O9—692; A2: 73θ—9θ3» A3:923— — HO3), Factor B (240—443), e C2 (228—434). 0 quadro foi compilado usando o programa ALIGN. Os resultados de alinhamento sao apresentados em unidades de desvio padrao. A probabilidade de que os alinhamentos (apresentados na Figura 6) tenham ocorrido por acaso é apresentada entre parêntesis por baixo de cada resultado de alinhamento.

Q A D R 0 II

SIGNIFICÃNCIA DOS RESULTADOS DE ALINHAMENTO DO DOMÍNIO ESPECÍFICO DE LEUCÓCITO DA sub-unidade ALFA DE Mac-1 COM AS REPETIÇÕES A DO FACTOR DE von WILLEBRAND, FACTOR B E FACTOR C2

	vWf Al	vWf A2	vW f A 3	Factor B	C2
Mac-1	7,4	7,2	8,1	6,9	1,8
	(<io-11)	(¢10-11)	(<10-15)	(<io_iO)	(Cio-1

vWf Al	vWf A2	vWf A3	Factor	B C2
vW f À1 ---	10,3	9,1	7,0	4,6
	(<io“23)	(<io“18)	(<10 1:L) (/10 5)
vWf fi2 ---	—	13,4	4,0	4,1
		(<io“23)	( <104)	_4 (<10 Ό
vWf A 3 ---	—	—	4,8	3,2
			(/10-5)	(<io“2)
Factor B ---				23,8

(<ιο“²³)

EXEMPLO 9

Local de Ligaçao de Ligando da Sub-unidade Alfa de Mac-1

Λ homologia entre o factor B e o domínio L e a capacidade do factor B para se ligar com C3-b sustenta a con ciusao de que o dommio L e o local de ligaçao de ligando de

Mac—1 e de pl5O,95· Ê também de interesse a circunstancia de - +o que a ligaçao de Bb a C3b necessita de Mg * (Muller—Eberhard,

H. J. et al· , Adv. Immunol. 2 9: 1— 53 (19θ0 ) )· D um modo semelhante, a ligaçao de Mac-1 e de pl5O,95 isolados a células sensibi lizadas por iC3b ou a Sepharose-iC3b necessita de catioes diva lentes (Wright, S.D. et a 1. , Proc. Natl. Acad. Scj. (U.S.A.) 80:5699-5703 (1983); Micklem, K. J. et al., Biochem. J. 231: 233—23θ (1985))· Pode representar-se um local de ligaçao presumível de catioes divalentes no domínio L por um motivo de sequências que contém dG e por outro que contém DG e GD, os quais estão presentes em Mac—1, pl5O,95 θ fector B (sublinhado na Figura 5)· Se estes locais forem contíguos na estrutura tridimensional poderiam formar um local de ligaçao de catioes divalentes semelhantes na sequência aos presentes nas repetições internas V a VII da sub-unidade ρζ de Mac—1. 0 domínio L e ·* ** ** as regiões seguintes que contem as repetições IV a VII sao relativamente livres de locais de glicosilaçao ligados a N e de cisteínas (Figura 6), permitindo-lhe serem acessíveis e conforma ci ona lment e flexíveis. A ideia de que o domínio L poderia estar implicado no reconhecimento de iC3b suscita a possibilidade de reconhecimento de uma sequência de iC3b distinta de RGD. Se bem que em iC3b esteja presente RGD, carece ainda de confirmaÇao por dados de inibição de peptídeos se este domínio é importante no reconhecimento por Mac-1 (Wright, S. D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 84: 1965-1968 (19Õ7) ).

Tanto o domínio Al como o domínio A3 de vWF ligam—se a colagéneo (Girma, J.P. et a 1. , Blood 7θ· 605— 6ll (1987)) e o domínio Al liga—se a glicoproteína Ib de plaquetas e a heparina (Girma, J.P. et a 1. , Blood 70^;605—6ll (1987)) A via complemento alternativa na qual o factor B desempenha um papel importante ê o mecanismo mais primitivo do sistema imunitário para distinguir o material próprio do material estranho (Muiler- Eberhard , H. J. et a 1. , Adv, Immunol. 2 9 ♦ 1— 5 3 (Ι9θθ) Assim, o domínio de 200 ácidos aminados parece ser uma unidade de reconhecimento primitiva que tem sido duplicada e incor porada em várias proteínas que têm evoluído para desempenhar funções de reconhecimento diversas em hemostase (vWF), na ac— tivaÇao de complemento (factor B e C2) da matriz extraceiular (CMP) e nas interaeçoes receptor de complemento e célula—célu la (integrinas de leucócito).

EXEMPLO 10

A Relaçao Fjlogenética Entre as Integrinas

As integrinas de receptor ECM sao filogeneticamente antigas, conforme demonstrado ao nível de homologia de sequências em Drosophila (Ruoslahti, E. et a1., Science 238: 491-497 (1987)) e por reacçao cruzada imunológica com proteínas de dimensão semelhante em nemétodos e fungos. Estes resul tados demonstram que a sub-unidade ρζ de Mac-i evoluiu peln in troduçao de um domínio de reconhecimento primordial no receptor tipo ECM da sub-unidade ct (Figura 6). A introdução de um domínio extra pode ter aumentado o potencial para reconhecimento de diversos iigandos pelas integrinas dos leucócitos e pode explicar a sua especificidade algo diferente em relaçao ao ligando, visto que o reconhecimento do ligando ICAM-1 por LFA—1 não envolve RGD (Marlin, S. et al., Cell 5l:8l3-8l9 (1987) 1 Stauton, D.E. et a1. , Cell 52*925— 933 (1988); Simmons,

D. et a 1. , Nature 331·624—627 (19θ8)1 todas estas referências sao incorporadas aqui por referência).

A disponibilidade de clones de ADNc para as sub-unidades χ e β de Mac—1 permite a identificação de locais de ligaçao de ligando distintos que participam na ligaçao de iC3b e na adesao célula-célula e a avaliaçao da hipótese de que a estimulação celular tem como resultado uma alteraçao con formacional no local de ligaçao de ligando, transmitido a par tir dos domínios citoplasmáticos ou de membrana, que altera a afinidade para Iigandos.

Embora a invenÇao tenha sido descrita em rela Çao com as respectivas formas de concretização específicas, deverá entender—se que é susceptível de modificações adicionais e que o presente pedido de patente pretende cobrir quais quer variações, usos ou adaptações da invenção que sigam, no geral, os princípios da invenção e incluindo as aplicações da presente descrição como as que resultam das práticas conhecidas ou habituais da especialidade a qual a invenção pertence e as que podem ser aplicadas às características essenciais apresentadas anteriormente como se segue dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

Claims (1)

1. REIVINDI CAÇOES

   Processo para a preparaçao de uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar a sub-unidade alfa de Mac -1 ou um seu derivado funcional) caracterizado por compreender pelo menos uma das seguintes fases:

   (a) análise de um banco de inserções em vectores lançadeira de ADN derivado de uma célula que expressa a sub—unidade alfa de Mac—1 para determinar a presença de uma inserção que contêm o gene da sub-unidade alfa de Mac—1» (b) exame das sequências gmentos adequados de de ADN capazes de codificar para fra peptí deo s j (c) identificação de um oligonucleótido ou um conjunto de oli gonucleótidos que possui a capacidade de codificar para um fragmento do gene da sub-unidade alfa de Mac—1 (ou que ê complementar deste oligonucleótido ou conjunto de oligo nucleótidos)» (d) utilizaÇao do oligonucleótido ou conjunto de oligonucleótidos que contêm a sequência teoricamente mais provável capaz de codificar para os fragmentos da sub-unidade alfa de Mac—1 a fim de identificar uma sequência de um oligonu cleótido ou conjunto de oligonucleótidos que ê capaz de hibridar com a sequência ou conjunto de sequências mais provável} (e) obtenção de uma molécula de ADN ou conjunto de moléculas de ADN capaz de funcionar como sonda para identificar e isolar o gene da sub-unidade alfa de Mac—1 por construção de um oligonucleótido complementar da sequencin teórica ou conjunto de oligonucleótidos complementares do conjunto de sequências mais provável» (f) ligaçao funcional desta sequência ou de um fragmento desta sequencia a um promotor funcional de modo a dirigir a expressão da sub-unidade alfa de Mac-1 ou de um seu derivado funcional numa célula ou num organismo.

   - 2Q Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sub—unidade alfa de Mac—1 ou o seu derivado funcional conter adicionalmente pelo menos um polipe ptídeo seleccionado de entre o grupo constituído por)

   a. A—N—Q-R-G-S-L) h.

   b. M—E—Q—L—K—N— S , i.

   c. T-D-G-E-K-F-G) j.

   d. G-V-F-L-Y-T-S) k.

   _e. V—D—V—D—S—S—N-G—S—T ) 1.

   f. d—v—n—g—d—k—l—τ—d—v—a ; _m.

   Y-I-L-T-S-H—N C-Q-D-D-L-S-I Τ—I—Q—N—Q—L—R V_q_S-L-V-L-G y_Q_H-i-G-i^-v i—F-T-A-]U-F-P

   g. D—L-T-M—D—G-L-V—©-L)

   n. F-S-L-V—G-T-P

   - 3^a Processo para a preparaçao da sub-unidade alfa de Mac—1 ou de um seu derivado funcional sob forma substan cialmente livre de contaminantes naturais, caracterizado por se provocar a expressão de uma molécula de ADN preparada de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 1 ou 2 nu ma célula ou num organismo adequados.

   Processo de acordo com a reivindicação 3> ca— racterizado por a referida sub—unidade alfa de Mac-1 ser adi— cionalmente capaz de ligaçao a uma molécula presente sobre a superfície de uma célula.

   - 5^a Processo de acordo com a reivindicaÇao 4, caracterizado por a referida molécula presente sobre a superfície da referida célula ser iC3b ou outro ligando natural de Ma c— 1.

   Processo de acordo racterizado por a referida molécula com uma sub-unidade beta de Mac—1 a rodímero de Mac—1.

   com a reivindicaÇao 3» ca— ser capaz de associaçao fim de de formar um hete—

   - 7^a Processo de acordo com a reivindicaÇao 6, caracterizado por o referido heterodimero ser capaz de ligaçao a iC3b ou a outro ligando natural de Mac—1.

   Processo de acordo com a reivindicaÇao 4, caracterizado por a molécula da sub-unidade alfa de Mac—1 prepa rada conter adicionalmente pelo menos um polipeptídeo seleccionado de entre o grupo constituído por!

   y-i-l-t-s-h-n; C—Q—D—D—L—S—I ; t-i-q-n-q-i^r;

   k. V—Q—S—L—V—L—G;

   l. Y-Q-H-I-G-I^-V; l-f-t-a-l-f-p; f-s-l-v-g-t-p.

   a. Α-Ν-Q-R-G-S-L; h.

   b. M-E-Q-L-K-K-S; i.

   c. t-d-g-e-k-f-g; j.

   d. G—V—F—L—Y—T—S i k.

   e. V—D—V—D—S—S—N—G—S—T ;

   f. D-V—N—G—D—K—L-T—D—V—A j m.

   g. D-I^-T-M-D-G-JL-V-D-L; n.

   - 9^a Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se obter um derivado funcional que é um fragmento da sub—unidade alfa de Mac—1.

   - 10a Processo de acordo com a reivindicaÇao 4, caracterizado por se obter um derivado funcional que é uma variante da sub-unidade alfa de Mac—1.

   - lia Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se obter um derivado funcional que ê um análo go da sub-unidade alfa de Mac-1.

   - 12a Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se obter um derivado funcional que é um deri— vado químico da sub-unidade alfa de Mac—1.

   Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de inflamaçao resultante de uma resposta do sistema de defesa específico num mamífero ou para o tratamento de estados patológicos seleccionados de entre o grupo constituído por! síndrome de dificuldade respiratória do adultoj ateroscleroseJ síndrome de lesão em múltiplos órgãos em consequência de septicemia} síndrome de lesão em múltiplos órgãos em consequência de trauma} lesão de reper fusão em tecidos} glomeruionefrite aguda} artrite reactiva} dermatose com componentes de inflamaçao aguda} uma afecçao i flamatória do sistema nervoso central} lesão térmico} hemodi lise} leucaferese} colite ulcerosa} doença de CrohnJ enteroco lite necrosante} síndrome associada a transfusão de granulóci tos} toxicidade induzida por citoquinas e aterosclerose, cara cterizado por se incoeporar como princípio activo uma quantidade de um agente anti—inflamatório suficiente para suprimir a referida inflamaçao} em que o referido agente anti—inflamatório ê seleccionado de entre o grupo constituido por! a sub— —unidade alfa de Mac—1 ou um derivado funcionai da sub—unidade alfa de Mac—1 quando preparados de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 12.

   !□>* I 3

   Processo de acordo com a reivindicaçao 13, ca racterizado por o referido agente anti—inflamatório ser a sub unidade alfa dc Mac—I.

   - 15^ 60 -

   Processo de acordo com a reivindicação 13, ca racterizado por o referido agente anti—inflamatório ser um de rivado funcional da sub-unidade alfa de Mac-1.

   - l6â Processo de acordo com a reivindicaÇao 13, ca racterizado por adicionalmente se incorporar a sub-unidade be ta de Mac—i ou um derivado funcional da sub-unidade beta de Mac-1.

   - 17^a Processo de acordo com a reivindicação l6, ca racterizado por a referida sub—unidade alfa de Mac-1 ser preparada por expressão de uma molécula de um ácido nucleico re— combinante e por a referida sub-unidade alfa de Mac-1 estar associada com a referida sub-unidade beta para formar deste modo um heterodímero.

   - 18a Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de infecções virais cara— cterizado por se incorporar como princípio activo uma quantidade eficaz da sub-unidade alfa do Mac—1 ou de um seu derivado funcional.

   A requerente reivindica as prioridades dos pe didos norte-americanos apresentados em 23 de Agosto de 1988 e

   61 em 9 de Março de 19θ9» sob os números de série 07/235,353

   321,239» respectivamente.

   Lisboa, 22 de Agosto de 19Ô9