PT91171B - Processo para obtencao, isolamento e purificacao de epidermina - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de DR. KARL THOMAE GESELLSCHAFT MIT BESCHR*ANKTER HAFTUNG, alemã, industrial e co mercial, com sede em D-7950 3i-berach an der Riss, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Rolf-Gunter Werner, Prof. dr. Hans Z"áhner, Prof. Dr. Gúnther Jung, Thomas Horner, Roland Kel lner, Hans-Peter Fiedler, residentes na Alemanha Ocidental), I para "PROCESSO PARA OBTENÇÃO. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE EPI-DERMINA".

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para a obtenção do polipeptídeo epidermina. 0 antibiótico epidermina é conhecido através do pe dido de Patente Europeia 85 113 908.9 (número de publicação 0 181 578).

M.A

Nessa publicação descreve-se um processo para a ob tenção, para o isolamento e para a purificação desta substância a partir de um caldo de cultura obtido com a participação de uma estirpe resistente de Staphylococcus epidermidis. A estirpe resistente foi depositada em 26.10.1984 sob o número DSM - 1 -

ι 3095 na "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen". Para o isolamento do componente activo procede-se à sua concentração quer através de extracção com n-butanol do filtrado da cultura liberto de células e de cal, evaporação do extracto de butanol, diluição em metanol do resíduo e agitação numa quantidade em excesso de éter dietílico frio para separação das impurezas li pídicas, obtendo-se a actividade no precipitado, quer por ad-sorção do filtrado da cultura centrifugado para concentração da epidermina em Amberlite XAD-8 ou em tipos análogos deste po límero numa base de éster acrílico (Pirma Serva), sendo a epidermina adsorvida eluída da resina com metano1/ácido clorídrico concentrado (99:1) e isolada por evaporação da solução meta nólica clorídrica após neutralização com amoníaco. Uma cromato grafia realizada de seguida do eluído da Amberlite XAD ou do extracto de butanol de que se eliminaram os lípidos, respecti-vamente, em Sephadex LH-20 com metanol/ácido acético (95:5) s_e para um grande número de pequenos peptídeos, ácidos aminados e sais do meio do antibiótico. Numa distribuição em contracorren te multiplicativa realizada de seguida de acordo com Craig, numa primeira distribuição do fluído com o sistema de n-butanol/ /acetato de etilo/ácido acético 0,1 N (3:1:3), o antibiótico mantém-se na parte inicial do aparelho. Numa segunda distribui ção de Craig com o sistema neutro 2-butanol/acetato de amónio 0,05 N (1:1) o antibiótico encontra-se no meio do aparelho. 0 acetato de amónio é removido por liofilização sob alto vácuo e i a epidermina formada surge após a liofilização sob a forma de um pó branco, apresentando homogeneidade em todos os sistemas de camada fina empregues. Deste modo è possível obter a partir de 80 litros de filtrado da cultura (por adsorçáo em Amberlite XAD-8, cromatografia em gel Sephadex liti-20 e repartição multiplicativa de acordo com Craig) 2,6 g de epidermina liofilizada. A cultura da estirpe produtora Staphylococcus epi dermids DSm 3095 realiza-se, tal como descrito na referência mencionada, aerobicamente a 37°C num meio complexo com uma com • posição de 2 a 4% de extracto de carne, 1 a 3% de extracto de 2

malte e 0,25 a 1% de CaOO^ ou 0,25 a 0,5.0 de Uaí^Oh^ (percenta gens de pesoj. Deste modo o máximo de actividade antibiótica é alcançado após 18 a 32 horas.

Verificou-se que o antibiótico epidermina pode ser obtido em rendimentos substancialmente superiores e de modo mais simples, por meio de adsorção do antibiótico formado no' filtrado da cultura ou no caldo da cultura, contendo ainda o microorganismo, em Amberlite XAD-1180 ou em Amberlite XAD-16 ou em tipos de polimeros modificados com base em copolimeros de estireno/divinilo através de uma coluna ou, no caso de caldo da cultura, também por adições sucessivas da resina. 0 componente activo é separado da resina por eluiçáo com metanol/á-cido clorídrico diluído, especialmente 0,Ul i\j (9:1, v:vj, o e-luido é ajustado a um valor de pH entre 5>3 e 5,8 e é feito contactar com um permutador catiónico fraco, tal como Amberli te IRO-50 ou uma resina análoga, como por exemplo Amberlite--1RC-84, podendo a permuta iónica ter lugar numa coluna ou tam bém por adições sucessivas, neste último caso de preferencia a través de adiçao dupla de uma quantidade de 3 por cento em volume de cada vez da resina ao eluído da resina XAD dentro de um período de uma hora. Após a adsorção a resina é feita passar através de uma coluna, as substâncias não ligadas são em seguida retiradas por lavagem com uma solução de tampão de fo_s fato de sódio 0,05 N em água a pH 7,0 e a epidermina e em seguida eluída com uma solução de 80% do tampão de fosfato de só dio acima mencionado, contendo uma concentração 1,5 N em clore to de sódio e 20% em volume de metanol, a um valor de pH entre 6,0 e 8,0, de preferencia 7,0.

Para desmineralização ajusta-se valor de pH do e-luído a 6,0 e faz-se contactar para adsorção sucessivamente nu ma resina do tipo do copolímero de estireno/divinilo anterior-mente referido, p.ex. em Amberlite XAD-1180. Os sais são elimi nados por lavagem com água e em seguida a epidermina é eluída com metano1/ácido acético a 50% (9:1, v:v). Após remoção do 3 -

solvente e liofilização obtém-se uma epidermina bruta liofili- j zada. A partir deste produto bruto I possível isolar a epider-mina pura por meio de cromatografia de KPLC preparativa (high performance liquid chromotography) com ajuda de Nucleosil 100 C-18 (10 |m) ou de Idchro-Sorb RP Select B. Para esse fim, a e pidermina é eluída e I lavada de modo faseado, primeiro com um solvente A, constituído por água com 1% do peso de ácido fórmi co, e depois com um solvente B, constituído por metano1/água (80:20, v:v) com 1% em peso de ácido fórmico.

Be acordo com técnicas do processuais fermentati-vas é possível realizar a obtenção da epidermina por meio de uma fermentação descontínua ("batch"), por meio de uma fermentação modificada com adições apropriadas realizadas durante o j processo ("feeding"), na qual são adicionados alguns nutrientes isolados durante a fermentação, por meio de uma fermentação com adsorção descontínua da epidermina realizada como no caso da adsorção "on lineM e por meio de uma fermentação com adsorção "on line" em contínuo.

Na fermentação descontínua, chamada fermentação em "batch", foram obtidos os melhores resultados com uma solução ndriente da seguinte composição: 3 »3% de extracto de carne, 3% de extracto de malte e 0,37% de hidróxido de cálcio (% em peso). É vantajoso para o rendimento efectuar uma adição de 1 a 3% em peso de um cloreto de um metal alcalino, tal como cloreto de sódio ou cloreto de potássio, e 0,001 a 0,002% em peso de iões de ferro, p.ex. sob a forma de FeCl^ e/ou FeSO^, e ain da de cloreto de amónio ou de sulfato de amónio (entre 57 e 200 m molar); as concentrações aproximadas preferidas são de 3% em peso de cloreto de sódio e 0,00125% em peso de cloreto férrico. A influência de concentrações iniciais de 3% de clore to de sódio e de diferentes concentrações de cloreto de férrico na produção de epidermina é apresentada na Figura 1. De todas as fontes de carbono os melhores resultados foram obtidos • com a maltose de extracto de malte. É conveniente que a adição - 4 -

de glucose seja feita apenas em conjunto com outras fontes de carbono. Uma combinação de lactose com maltose ou de galactose com maltose deu igualmente bons resultados. Uma combinação de glucose com maltose ou com lactose ou com galactose deu origem ao mesmo rendimento que o extracto de malte. Com todas as outras fontes de carbono tradicionais não se verificou qualquer produção de epidermina, ou apenas se verificou uma produção di minuta. A fermentação realiza-se sob bom arejamento a tem peraturas entre 34 e 37°C, de preferência a 36°C. Os melhores resultados da produção foram obtidos quando o pH da fermentação se situava entre 6,0 a 7,0. Na ausência de carbonatos ou de hidróxidos de catioes bivalentes, como carbonato de cálcio ou hidróxido de cálcio, apenas se obtém uma produção reduzida. Após adição de, por exemplo, carbonato de cálcio o valor de pH mostra um percurso característico com redução até à zona ácida, verificando-se neste caso apenas uma produção fraca. Se se faz subir em seguida o valor do pH para a zona alcalina inicia-se a produção. Sm vez de carbonato de cálcio também se pode empre gar carbonato de magnésio. 0 hidróxido de cálcio permite melho res resultados que o carbonato de cálcio. Com 50 mM de hidróxi. do de cálcio a produção pode ser um pouco superior em comparação com 25 mM de carbonato de cálcio. Ao utilizar as fontes de carbono (açúcares) a estirpe forma ácidos orgânicos, como p.ex. ácido acético, que podem ser complexados através de catioes bi valentes, obtendo-se simultaneamente uma tamponização do meio. 0 acréscimo de actividade no instante de produção máxima por meio da estirpe DSM 3095, avaliado por meio do teste de difusão em placas (determinação do diâmetro de inibição em mm contra Micrococcus luteus ATCC 9341), com utilização de uma linha calibrada, tomando a actividade numa solução nutriente de infu são Brain-Heart de acordo com a EP—A-0 027 710 como 100%, foi como se apresenta em seguida: segundo processo de acordo com o estado da técnica: - 5 -

a. ) agar de infusão de Brain-Heart de acordo com EP-A-0 027 710 100%, b. ) 3% de extracto de carne, 2% de extrac- to de malte, carbonato de cálcio 25 ml·! de acordo com ΞΡ-Α-0 131 573 200%, c. ) 3% de extracto de carne, 2% de extrac to de malte, hidróxido de cálcio 50 ml·; de acordo com ΞΡ-Α-0 181 573 320%; segundo o processo de acordo com a presente invenção: d. ) 3,3/o de extracto de carne, 3% de extrac to de malte, hidróxido de cálcio 50 ml·! 440%, e.) 3,3% de extracto de carne, 3% de extra£ to de malte, hidróxido de cálcio 50 mH, 3% de cloreto de sódio, cloreto de ferro (III) 75 μΑ 1720%, f.) 3,3% de extracto de carne, 3% de extrac to de malte, hidróxido de cálcio 50 mH, adição de glucose, de K^PO^ e de clore to de amónio 1950%, g.) 3,3% de extracto de carne, 3% de extra£ to de malte, hidróxido de cálcio 50 mH ou adsorção "on line" da epidermina a-pós as primeiras fases de isolamento, outros aditivos ver sob o ponto f 2780%. A Pig. 2 mostra o decurso da fermentação tal como anteriormente descrito em d); a Pig. 1 mostra a dependência da produção de epidermina em relação à adição de 3% de cloreto de sódio e de diversas quantidades de cloreto de ferro(lll), tal como referido em e). Todos os valores em percentagem anteriormente mencionados referem-se a percentagens em peso. A fig. 3

mostra o decurso da fermentação tal como se descreve sob o pon j to f) e a Eig. 4 o mesmo processo com intercalação da adsorçao i j "on line" tal como referido no ponto g). ί i

Uma comparação do valor obtido por meio do teste de difusão em placas ou por HPLC mostra, na utilização do processo da presente invenção com as suas variantes em comparação com os processos conhecidos em si, um aumento significativo do rendimento da epidermina, nomeadamente de 320% até 2780%.

Sm seguida descrevem-se com mais pormenor cada fase e as condições para se levar a cabo o processo da presente invenção. A estirpe produtora pode ser conservada, de preferência com congelação (-18°C), num meio contendo 3,3% em peso de extracto de carne, 3% em peso de extracto de malte, 0,37% em peso de hidróxido de cálcio em 40% em peso de glicerina (o resto é água). Para cada fermentação deixa-se crescer uma pré--cultura durante 18 horas a 3õ°C num meio de agar (pH 7,2 a 7,4), que contém por litro 3 g de Lab Lemco Pulver (Pirma Oxoid), 10 g de peptona, 3 g de cloreto de sódio, 2 g de Na2HP0 , 15 g de agar e 10 g de glucose esterilizada. A fermentação pode ser realizada em balões de Er lenmeyer apropriados para este fim e para a preparação de maio res quantidades de substância podem também ser empregues fer-mentadores de 200 litros ou mais.

Para as experiências em balões são utilizados ba iões de Erlenmeyer de 500 ml com uma indentação lateral. Os ba IÕes são cheios com 100 ml de solução nutriente e são colocados em autoclave durante 20 minutos a 121°C. Como material de inoculação pode utilizar-se 1% de uma pré-cultura com uma idade de 8 horas. A incubação realiza-se a 36°C num agitador orbital . com 160 rotações por minuto (rpm). - 7 -

Para a fermentação numa escala de 15 1 cairegou- ! -se um fermentador de 20 1 (tipo b 20. de Braun/Melsungen ou ] i de Giovanola Preres, Monthey, Suíça; com sistema de agitaçao j mecânica) com 15 1 de solução nutriente e com adição de 0,5 ml j de um poliol (propilenoglicol) e esterilizou-se in situ a 121° C durante 30 minutos. Para inoculação utilizaram-se 150 ml de uma pré-cultura com uma idade de 8 horas. A fermentação foi le vada a cabo a uma temperatura de 35 até 37°C, com 0,2 a 0,6 vvm e 700 a 1000 rpm, de preferência a 3ó°C, com 0,4 vvm e 900 rpm.

Obtenção da epidermina por fermentação em "batch".

Nos biorreactores utilizados o melhor crescimen- j to e o melhor rendimento em epidermina tiveram lugar a 3ó°C comj um nível de arejamento de 0,4 vvm e uma agitação de 900 rotações por minuto. Um arejamento reduzido ou uma rotação mais len ta diminuem o rendimento da epidermina (Fig. 5). Um reforço do arejamento e da rotação conduziu a um fraco melhoramento do ren dimento e também a uma formação intensa de espuma. Esta circunstância é devida à forte actividade de superfície do antibiótico e a supressão da espuma por meios mecânicos ou químicos não foi possível sem prejuízo da actividade. A Pig. 2 mostra o decurso de uma fermentação em "batch" numa escala de 20 1 com a estirpe fortemente produtora DSM 3095 numa solução nutriente contendo 33 g de extracto de carne, 30 g de extracto de malte, 3,8 g de hidróxido de cálcio em 1 litro. Esta estirpe gera assim epidermina numa quantidade até 80 mg/1. Ê possível detectar um crescimento intenso juntamente com a utilização das fontes de carbono adicionadas com formação de acetato por meio da queda do valor de pK. 0 número máximo de células é alcançado após 30 horas. Após este tempo são esgotadas as fontes de carbono fermentáveis principais, tais como glucose e maltose. 0 fosfato adicionado é consumido após 8 horas. A concentração máxima do antibiótico é alcançada - 8 -

após 48 horas e é de 30 mg/1. !

Tanto a adição de cloretos, como cloreto de sódio ou cloreto de cálcio, numa quantidade até 70 g por litro, como a de FeCl^ ou de PeSO^ até 150 mil aumentam o rendimento de epidermina sem prolongamento do processo de fermentação (Pig. 1). Obteve-se um rendimento máximo da epidermina de 310 mg/1 com a adição simultânea de 3% de cloreto de sódio e 75 mí-i de cloreto de ferro(III) ao meio de produção.

Esta produção de epidermina rápida oferece uma boa possibilidade para o desenvolvimento de um processo de íer mentação contínua com altas quantidades de circulação do meio empregue.

Obtenção da epidermina por fermentação "feedind".

Para se conseguir aumentar o rendimento de epider mina através do prolongamento da fase de crescimento e da obtenção de uma alta densidade celular, foram necessárias altas concentrações tanto das fontes de carbono como do fosfato adicionado. A produção de epidermina está sujeita a uma repressão catabólica forte (Pig. 6) e é também regulada através do conteúdo em fosfato do meio (Pig. 7)· A concentração de azoto mantém-se durante todo o processo de fermentação acima de 150 mH, mas a maior parte de_s te conteúdo não pode ser utilizada pelos microorganismos. Em culturas em balões realiza-se a adição de sais de amónio até 150 mH tal como consta da Pig. 8 (para cloreto de amónio), para um estímulo importante da produção de epidermina. A glucose é metabolisada antes do acetato, tal como mostra o aumento da acidez do meio. Se o açúcar escassear, os ácidos orgânicos são utilizados como fontes de carbono, alterando-se o valor de pH do meio para a zona alcalina. Por es- - 9 -

ta razão adiciona-se a glucose em dependência do pH durante o processo de fermentação. 0 valor do pH é fixado em pH 6,0, nao se reprimindo a acidificação. r í

Adicionam-se fosfatos de forma continua. A velo- | cidade de adição é regulada em função da velocidade de utiliza ! ção de fosfato nas fermentações "batch", nas quais se adiciona j fosfato até 10 mM. ! ! A adiçao de glucose e de fosfato provoca um aumento significativo do rendimento de epidermina quer quando são adicionados isoladamente quer em conjunto. 0 maior conteúdo em epidermina, o qual se verificou quando se adiciona gluco se de acordo com o valor do pH durante a fermentação, não depende das fontes adicionais de carbono, sendo devido a uma for mação mais lenta do antibiótico em meio ácido. Ê possível veri ficar esta dependência por meio de fermentações em que se conservou constante o pH por adição de ácido sulfúrico. Apenas o desenvolvimento de uma fermentação "feeding" combinada com uma adição de glucose em dependência do pH e com uma adição contínua de fosfatos e de azoto amoniacal permite a obtenção de um aumento significativo da biomassa como de um aumento do rendi-mento em antibiótico. A Fig. 3 mostra o decurso de uma fermenta ção "feeding" combinada. A massa celular cresce até triplicar, atingindo 2x10^ células por ml; o máximo rendimento de epidermina é de 350 mg/1. Se bem que a máxima concentração celular se atinja logo após 24 horas, o rendimento máximo de epidermina é obtido durante a fase estacionária após 72 horas; no decurso da fermen tação "feeding" não é possível identificar a fase de crescimen to e a fase de produção que caracterizam a fermentação em "batch". Pelo contrário a produção de epidermina torna-se dependente estreitamente do crescimento dos organismos. logo na fase exponencial alcançam-se Q0% do rendimento total e em seguida aumenta a biomassa por meio do número das células vivas, 10 -

de tal modo que a fase estacionária deve ser considerada como j um estado equilibrado entre o crescimento e a lise das células.; A adição de cloreto de sódio durante a fermentação "feeding" não tem como resultado a mesma acçao estimulante | i como no caso da fermentação em "batch". Durante as primeiras j i 24 horas a velocidade de produção foi 40jó mais elevada e a velocidade de crescimento 70% mais elevada do que no caso da fer mentação "feeding". A produtividade específica do microorganis; mo é por essa razão 2Q% mais baixa; após 24 horas termina a produção de epidermina, o que tem a sua razão de ser numa limi tação dos nutrientes por meio de um factor até agora desconhecido ou num envenenamento do organismo por meio de um produto secundário que possa ocorrer como resultado do metabolismo. A fermentação "feeding" combinada foi também e-fectuada na escala de 200 1 numa instalação piloto utilizando o mesmo factor de arejamento, a mesma velocidade de agitação e as mesmas condições de adição. Sem qualquer optimização adicic) nal conseguiu-se um rendimento de epidermina da ordem de 80 a 90/ó do rendimento obtido na escala de 20 1.

Obtenção de epidermina com adsorção "on line" do antibiótico.

Adsorção descontínua: A fim de tornear a inibição retroactiva ("feed back") e outras influências possíveis sobre o organismo produtor e a fim de proteger a epidermina já formada da influência destruidora de proteases e do calor, retirou-se de forma descontínua a epidermina a partir do caldo de fermentação durante o decurso da fermentação.

Para este fim, pulverizou-se o caldo de fermenta ção inteiro, incluindo o organismo produtor, por meio de pres-• são numa câmara de adsorção de forma esférica cheia com Amber- 11 -

I

lite XAD-1180. Provocou-se deste modo uma turbolência importar, j te da resina e uma adsorção rápida da epidermina. A resina sob [ a forma de esferas facilmente móveis foi separada por filtração através de uma rede (abertura da malha 0,25 mm), fazendo-se em seguida retornar para o fermentador o caldo de fermentação i com a biomassa (Fig. 9). Na Fig. 4 mostra-se a evolução de uma fermentação "feeding" com adsorção descontínua da epidermina.

Os parâmetros e as condições da fermentação foram idênticos aos anteriormente descritos. A máxima massa celular foi obtida após 46 horas com 4·10"^ células e o rendimento máximo de epidermina após a eluição a partir da resina foi de 500 mg/1. A duração integral da fermentação foi a mesma do que a da fermen tação "feeding". A primeira purificação ou pré-purificação foi sim plificada por meio da inclusão da primeira fase de isolamento no processo de fermentação; o rendimento da epidermina depois desta primeira fase de purificação foi 50?o superior em compara ção com o rendimento da fermentação "feeding" antes da purificação .

Adsorção contínua: A adsorção contínua "on line" da epidermina durante o processo da fermentação foi efectuada por meio de uma instalação de filtração tangencial ("cross flow"). 0 produto retido foi feito retornar ao reactor enquanto que o filtrado foi adsorvido numa coluna de Amberlite XAD-1180. Também se fez retornar o eluído para o reactor (comparar com Fig. 10). A adsorção foi estabelecida após 12 a 15 horas do início da fermen tação. 0 rendimento máximo de epidermina após separação do antibiótico a partir da resina adsorvente foi obtido num máximo de 500 mg/1 após 80 a 90 horas. 0 esquema de isolamento optimizado, como se pode verificar na Fig. 10, representa um grande avanço na investiga 12

ção tendente a aumentar a produção de epidermina. Gomo resulta do final, obtém-se a partir do composto da adsorção de acordo com a presente invenção com a cromatografia de permuta iónica um produto com uma pureza de 80/6. A utilização de um processo em "batch” ou também de um processo com adsorção "on line" con duz a um método rápido de purificação da epidermina.

Para o controlo do decurso da fermentação recolhe ram-se amostras de modo estéril e diferentes momentos durante a fermentação. As amostras foram analisadas do modo seguinte: a) Valor do pH:

Medição com um aparelho de determinação do pH de laboratório (pH-mV-Meter Knick) b) Decurso do crescimento:

Foi possível seguir o crescimento por meio do acréscimo do número de células vivas.

Para este fim diluiram-se em solução salina 0,5 ml de uma amostra da cultura e inocularam-se placas com amostras de 0,1 ml (meio: peptona 10 g, extracto de carne 8 g, cloreto de sódio 3 g, hidrogenofosfato dissódico 2 g, glucose 10 g para 1 litro). Após 18 horas de incubação a 37°C foi possível contar as colónias. c) Concentração de antibiótico:

As amostras foram centrifugadas numa centrífuga de Eppendorf 3200 durante 2 minutos e foram ensaiadas utilizando 10 μΐ do sobrenadante no teste de difusão em placas ou por meio de HP1C, como se descreve em seguida. Paralelamente traçou--se uma curva padrão com concentrações conhecidas.

Sistema de HP1C:

Volume injectado : 10 μΐ

Solvente de arrastamento: A : água com 0,05 /6 de ácido per- clórico a 70 % 13 - 3 : acetonitrilo

Gradiente : Minutos A 3 0 77,5 22,5 8 63,0 37,0 3,5 0 100 9,5 0 100 10 77,5 22,5 ’ Caudal Detecçao 14 : 2 ml/min : 210 nm 77,5 22,5 Coluna : Nucleosil 7 C-13 com tiva prá-coluna. a respec- d) Determinação de fosfato: 0 conteúdo em fosfato no filtrado da cultura foi determina- do de acordo com 0 método Chim. Acta 14, 361-366. de Itaya e Ui 1966) em Clin. e) Determinação do azoto: A concentração de azoto f oi determinada de acordo com 0 mé- todo de Kjeldahl com um aparelho de destilação automático (tipo Kjeldahlsvstem II, da firma Tecador). f) Determinação da glucose e de maltose: 0 conteúdo de glucose e de maltose no meio foi determinado por via enzimática com um "kit" de análise da firma Boehxin ger de Marinheira. g) Determinação do acetato:

Esta determinação foi efectuada por meio de cromatografia em fase gasosa de acordo com as instruções de Platen e Schink (I937), Arch. Microbiol. 149, 136-141. h) Determinação da epidermina: A concentração de epidermina no caldo de cultura foi determinada umas vezes por análise microbiológica e outras vezes por HPLC de acordo com Eiedler et al., 1987, Chromatogra- 14 -

í phia 24, 433-433.

Após se ter atingido o máximo de produção centri fugou-se o caldo de cultura por meio de centrifugação contínua (centrífuga: tipo LA 71b-4, Loher & Sohne, Ruhstorf/Rott) a 1330 rpm. Para uma separação óptimas das células o caudal deve ser mantido muito reduzido. Conseguiu-se uma primeira concentra ção dos componentes activos por meio do método de adsorçao em copolímeros de estireno-divinilo anteriormente descrito. Já foram descritos anteriormente outros processos para a adsorçao do antibiótico, por exemplo por adsorçao em "batchu e por processos de adsorção descontínua e contínua sem e com separaçao da massa celular.

Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar mais completamente a presente invenção:

Exemplo 1

Fermentação em "batch" com a estirpe de Staphylococcus epider-midis DSM 3095:

Meio: 3,3°o em peso de Lab Lemco Pulver 3,0% em peso de extracto de malte 0,38% em peso de hidróxido de cálcio pH 6,5 (com 3 N)

Reactor; tipo b 20 (Giovanola) com 15 1 de meio

Arejamento: : 0,4 vvm

Frequência de agitação: 900 r/min

Temperatura : 36°C:

Resultado: Rendimento máximo de epidermina: 80 mg/1 após 43 h; Resultados ver Fig. 2.

Exemplo 2

Fermentação "feeding" com a estirpe de Staphylococcus epider- - 15 -

midis DSM 3095:

Meio: 3,3% em peso de Lab lemco Pulver 3,0% em peso de extracto de malte 0,335o em peso de hidróxido de cálcio pK 6,5 (com H2S04 3 N)

Reactor; tipo b 20 (Giovanola) com 15 1 de meio Arejamento : 0,4 vvm frequência de agitação : 900 r/min Temperatura : 36°0:

Condiçoes de adiçao:

Solução 1:

Glucose 1 kg, água 1 1, pH 6,0. Esta solução foi adicionada em função do pH, sendo pH do meio de fermentação ajustado a 6,0

Solução 2: NH^Cl 500 g, KF^PO^ 120 g, água ,1,5 1, pH 6,0 (ajustado com NaOH anidro). A solução foi adicionada de forma constante com um caudal de 1 ml por litro e hora. A adição foi iniciada após 4 horas.

Resultado: Rendimento máximo de epidermina: 350 mg/1 após 72 h Resultados ver Pig. 3.

Exemplo 3

Permentação "feeding" com adsorção "on line" do antibiótico:

Meio: Reactor: Adsorção: Resultados: ver Exemplo 2 ver Exemplo 2 em Amberlite XAI>-1180; 150 g de peso seco

Rendimento máximo de epidermina: 350 mg/l após 72 h; 0 rendimento em epidermina foi determinado depois da 1^ fase do isolamento (ver também Exemplo 4). Para os resultados ver também a Pig. 4. - 16 -

Exemplo 4 i

Isolamento e purificação da epidermina a partir de um caldo de cultura de 15 1 após utilização da adsorção "on line": j

Após adsorção "on line" da epidermina durante o j processo da fermentação lavou-se a resina (ver Exemplo 3) com j 150 1 de água e, quando se utilizou uma câmara de adsorção, ' fez-se passar por uma coluna para nova lavagem e eluição.

Lavagem: 5 1 de metanol/H^O 1:1 (v:v)

Eluição: 5 1 de metanol/ácido clorídrico 0,01 L 9:1 (v:v). 0 valor do pH do eluído foi ajustado a 5,5; a e- ! pidermina foi adsorvida na resina por adição de 2 porções de 45 g cada de Amberlite IRC-50 num período de uma hora ao eluído. A resina foi carregada numa coluna para lavagem e eluição.

Lavagem: 2 1 de tampão de fosfato de sódio 0,05 N a pH 7,0; Eluição: 10 1 de fosfato de sódio 0,05 N, cloreto de sódio 1,5 E em água/metanol 8:2 (v:v), pH 7,0. A fim de desmineralizar a solução ajustou-se 0 valor do pH do eluído a. 6,0 e adsorveu-se a epidermina por fases sucessivas em Amberlite XAD-1180 em 2 cargas de 75 g de p_e so seco cada uma num período de 1 hora. Para lavagem e eluição encheu-se uma coluna com a resina.

Lavagem: 20 1 de água

Eluição: 2,5 1 de metanol/ácido clorídrico 0,01 N 9:1 (v:v).

Depois de se eliminar o solvente por evaporação e de se liofilizar o eluído obtiveram-se 6500 mg de uma substância que continha 5200 mg de epidermina (pureza 80%)· A purificação final foi levada a efeito por HPLC preparativa com eluição por gradiente:

Coluna: Eucleosil 100 C-18 (10 μιη)

Solvente: A: água com 1% em peso de ácido fórmico B: metano1/água 8:2 contendo 1% de ácido fórmico. 17 -

Após HPLC preparativa ("hight performance liquid ; chromatography") e liofilização obtiveram-se 4,94 g de epider-mina pura. 0 antibiótico apresenta-se como uma única substância em todos os ensaios realizados com o produto obtido. Na Fig. 10 apresenta-se o fluxograma.

Durante a preparação e o isolamento da epiderml-na utilizou-se para controlo e para caracterização biológica o ensaio de difusão em placa. Para uma descrição mais exacta podem ser seguidos os métodos descritos em EP-A-85 113 903.8. Nesta publicação define-se mais em pormenor a estirpe Staphylo coccus epidermidis D3M 3093· 0 caldo de cultura obtido com a estirpe DSí-í 3095 pode também ser substituído por um caldo de cultura obtido a partir da estirpe NCIB 11536 (depositada na National Gollection of Industrial Bactéria, Aberdeen) obtendo-se do mesmo modo a _e pidermina a partir deste caldo por isolamento e purificação fi nal. Com respeito à produção de epidermina, no entanto, considera-se a estirpe DSM 3095 preferida em relação à estirpe NCIB 11536. A epidermina possui actividade como antibiótico contra infecçóes na pele, como eczemas, impetigo, celulite e acne.

18 -

Claims (1)

1. R5IVINDICACfl g S - lã - Processo para o isolamento de epiderraina a partir de um caldo de cultura ou de um filtrado da cultura de uma ostirne de Staphylococcus epidermidis e para a puriíicação dè_s -^a substância caracterizado por a>) fazer contactar o filtrado da cultura ou o caldo da cultu ra com um copolímero de estireno-divinilo, v, ) libertar o componente activo da resina por eluição com m_e tanol/ácido clorídrico diluído, c<) ajustar o pH do eluído a um valor de 5,3 a 5,8, fazer contactar o eluído com um permutador de catiães ira co e<) em seguida retirar a substância não ligada por lavagem com uma solução tampão a pH 7, ) eluir o componente activo do permutador de catioes com u-ma solução composta por uma substância tampao, cloreto de sódio e metanol a um pH de 6,0 a 8,0 e, para purificação, ) readsorver a substância activa do eluído num copolímero o * ' ^ de estirenodivinilo, lavar a resina com água para eliminar os sais, dissolver a epiderraina a partir da resina com uma mistura metanol/ácido acético e evaporar ou liofi lizar a solução, podendo ainda a epidermina deste modo ob tida ser em seguida submetida a uma cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) para conseguir uma purificação fina. - 2S - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se extrair a epidermina a partir do caldo de cul-tura ou do filtrado de cultura por adsorção num copolímero de 19 -

   estireno-divinilo, libertar a substância activa da resina com j metano1/ácido clorídrico 0,01 N (9:1 v:v)f fazer contactar o | eluído, cujo pH foi ajustado a um valor entre 5,3 e 5,3, com um permutador catiónico constituído por um copolímero de ácido metacrílico-divinilbenzeno, como a Amberlite IRC-50 ou IRC-34, tendo a permuta iónica lugar numa coluna ou também por adições j sucessivas, retirar as substâncias não ligadas a partir da re- j sina por lavagem com um tampão de fosfato de sódio 0,05 N a pH 7,0, dissolver a substância activa a partir da resina com uma solução constituída por 30½ de tampão de fosfato, 20½ de metanol, que é 1,5 N em relação a cloreto de sódio, a pH 7, ajustar o eluído obtido deste modo a um valor de pH de 6,0 e fazer ; contactar com uma resina constituída por um copolímero de esti reno-divinilo, purificando-o em seguida por eliminação dos sais por lavagem, libertar a epidermina desta resina com meta-nol/ácido acético a 50½ (9:1 v:v) e evaporar ou liofilizar o _e luido, podendo a epidermina deste modo obtida, se desejado, ser ainda submetida a uma purificação final por meio de croma-tografia líquida de alto rendimento (HPLC) preparativa. - 3â - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, caracterizado por a produção da epidermina ser levada a efeito por uma fermentação com adições sucessivas num biorreactor a uma temperatura de 35 a 37°G, com um grau de are jamento de 0,2 a 0,6 vvm e uma velocidade de agitação de 700 a 1000 rpm com adição de um cloreto, de preferência de cloreto de sódio, numa quantidade de até 70 g por litro e/ou de um sal de ferro numa quantidade de até 150 mM. _ 4ã _ Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se adicionarem fontes de carbono e/ou fosfatos e/ • /ou amoníaco ou sais de amónio de modo contínuo ou descontínuo 20 -

   ao caldo de fermentação no decurso da fermentação. _ 5a _ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se retirar de forma descontínua durante 0 decurso da fermentação a partir do caldo de fermenta ção a epidermina formada por adsorção num copolímero de estire no-divinilo, sendo 0 caldo de fermentação tratado deste modo e a biomassa feitos retornar ao fermentador. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se retirar de forma contínua durante o decurso da fermentação a epidermina formada por adsorção "on line" a partir do caldo de fermentação num copolímero de estireno-divinilo, sendo o retentado feito retornar conti-nuamente ao fermentador. - 7« - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o meio de cultura conter 2 a 4% em peso de extracto de carne, 1 a 3% em peso de extracto do malte ou de maltose, galactose, lactose, glucose ou misturas de lactose com maltose ou de galactose com maltose e 0,25% a 1% em peso de carbonato de cálcio ou 0,25 a 0,5% em peso de hidróxido de cálcio e ainda de modo facultativo 1 a 6% em peso de um cloreto alcalino, 0,001 a 0,002% em peso de iões de ferro e sais de amónio numa quantidade correspondente a uma solução 57 a 200 m molar a um pH entre 6 e 7· - 8« - Processo de acordo com a reivindicação 7, carac- 21 - terizado por o meio de cullura conter 3,3% em peso de extracto de carne, 3% em peso de maltose, 0,37% em peso de hidróxido de cálcio e eventualmente 1 a 6% em peso de cloreto de sódio e/ou de cloreto de potássio, 0,001 a 0,002% em peso de iões de ferro, de preferencia sob a forma de cloreto férrico ou de sulfato ferroso, bem como sais de amónio, de preferencia cloreto de amónio ou sulfato de amónio numa quantidade correspondente a'u ma solução 57 a 200 m molar, e eventualmente também hidrogeno-fosfato de potássio ou de sódio a um pH entre 6 e 7· - 9§ _ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a estirpe produtora de epidermi-na usada ser Staphylococcus epidermidis DSrl 3095. - 10 - - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a estirpe produtora de epidermi-na usada ser Staphylococcus epidermidis NCIB 1153c. A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 15 de Julho de 1933, sob o núme ro de série 219,693. Lisboa, 14 de Julho de 1939 0 A6E5TE OFICIAL DA PfiOPBIEDADE LSDCSTRlAL

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   "PROCaSSO PARA OBTE1TÇÃO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO ΡΞ EPIDERMINA" A invenção refere-se a um processo para o isolamento de epidermina a partir de um caldo de cultura ou de um filtrado de cultura de uma estirpe de Staphylococcus epidermi-dis e para a purificação desta substância que compreende a. ) fazer contactar o filtrado da cultura ou o caldo da cultu ra com um copolímero de estireno-divinilo, b. ) libertar o componente activo da resina por eluição com me- tanol/ácido clorídrico diluido, c. ) ajustar o pH do eluído a um valor de 5,3 a 5,3, d. ) fazer contactar o eluído com um permutador de catiões fra co , 8o) em seguida retirar a substância não ligada por lavagem com uma solução tampão a pH 7, f. ) eluir o componente activo do permutador de catioes com uma solução composta por uma substância tampão, cloreto de sódio e metanol a um pH de 6,0 a 8,0 e, para purificação. g. ) readsorver a substância activa do eluido num copolímero de estireno divinilo, lavar a resina com água para eli.iinar os sais, dissolver a epidermina a partir da resina com uma mistura metanol/ácido acético e evaporar ou liofilizar a solução, podendo ainda a epidermina deste modo obtida ser em seguida submetida a uma cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) para conseguir uma purificação fina.