PT91074A - Processo para a preparacao de derivados de morfolino da rodomicina - Google Patents

Description

áXffiXMOliKLMOHâM, alemã, in * * -9m · dustrial e comercial, com sede em D-355O Marburg, Republi ca Federal Alemã, (inventores: Dr. Cenek loifti** JDr. Bans Reter Kraemer, Dr. Manfred Gerken, Ursula Hhódler e Dr. Peter Hermentin, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE MORFOLINO DA RODOMICINA».

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se aos novos derivados de antraciclina eficazes como citoestáticos, e refere-se em particular a derivados de 7-0~glicosil-(? e epsi-lon-(iso)rodomicinona que contém no fragmento hidrato de carfeo no da molécula uma estrutura morfolino modificada* ao processo para a sua preparação assim como a sua utilização como medica- A classe de substâncias das antracicli nas está amplamente descrita na literatura especializada. A do xorubicina e o seu análogo em 14-desoxi, a dâunorubicina, são aqui citados como representantes com êxito desta classe de substâncias que são utilizadas na prática clínica para 0 trata mento de um grande número de tumores sólidos e leucemias. 0 êxito destes compostos especiais, porém, tipicamente não é igual para todos os pacientes, e o grau de exito para algumas espécies particulares de tumores, como por exemplo 0 cancro do intestino grosso e o melanoma, é reduzido. Como acçoes colate-

rais do tratamento com doxorubicina e daunorubioina raftereanse entre outras» uma lesão do sistema circulatório © as dificulda des caracteaAsticas da mesma. bambem se descreve um certo numero de outros compostos análogos que foras modificados· tanto na parte aglicono como também na parte carbobidrato. A literatura rele- í vante conhecida ate à data ê indicada a seguir* Âcton et al descrevem em Anthracyclíne Antibiotícs, Editor H. S. EI Khadem, 119-139» Academic Press (1982) entre outros, derivados morfolí nicos de antraciclinas, a sua preparação e resultados biológicos* Outros derivados de morfolino, que derivam sobretudo dos compostos de origem doxorubicina e daunorubioina, foram descri tos na Especificação DE 3 325 816 A 1.

No grupo das substâncias da §-rodomi-cina foi descrito até ao presente um derivado de morfolino dê 7*.0—(=<-L-daunosaminil)-rodomieinona por H. IJmezawa et al (J. Antibiotics 40/7» 1058-1061 (1987))*

Os derivados de morfolino do grupo de substâncias£-(iso)rodomicina não foram descritos até ao presen ;tC*

Os derivados de morfolino investiva-dos até esta data, sobretudo os derivados de cianomorfolino das antraciclinas, são na sua maioria consideravelmente mais citotóxieos. do que os compostos de origem doxorubicina e dauno píibâcina*

Devido â elevada toxidade destes compostos a sua aplicação terapêutica é escassícima e 0 seu manuseamento reveste-se de problemas.

Partindo-se deste estado actual da técnica constitui um ob^ectivo da presente invenção revelar no vas antraoielinas que se distingam por um novo espectro de ac-ção e uma fraca toxidada*

Surpreendentemente, em ensaios comi de rivados de morfolino de ê-(iso) rodomicina mostrou-se que a * f-0- (3 <-morfolino-3 * -desaaino-^-L-daunosaminil )-íl-Isorodomici« <·' - 2 - nona g. 1) possui no modelo a® tumor l 1210» in vivo, ape nas uma acção marginal, mas pelo contrário 0 composto estrutu-raliMate aparentado (flg. 2) que I preparado partindo-se do produto de oxidação do ^ -metilgalaotopiraiiósido e de 7-0- (°c-L-daunoswainil)«£-isorodoaioinonat I eficas como curativo neste modelo* .Abre-se assim uma nova vi® pare a preparação e utilisa ção doe novos derivados de rodomiaína*

Tendo como base estes factoo, » presente invenção tem como bb-jecto, partindo-se dos produtos de oxidação de hidratos de oar bono e derivados semi - aint e t i ôos de (3 -ou- ç- (í so )rodomicina, que contêm um 3-sminoaçuocr, a prepara ção de novos derivados modificados de aorfolino, cujãs propriedades parwâtw a sua u-tilização como agentes de terapêutica d® tumores* 0 prcblems posto 4 solucionado de ecor do com a presente invenção com os novos derivados de antraci-clina. de eficácia citoestátics, quo correspondem ' foratula geral I seguinte - 3 - f

aaa qual os radicai o te;., os seguintc-s significados: R1 representa um átomo de hidrogénio m um grupo hldroxi, -2 * *· R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo,

"Z R Representa u» grupo metiloxicarhonilo ou usi grupo hidroa&, R^ representa um átomo de hidrogénio ou us grupo hidroxi* bP representa um átomo do hidrogénio, um grupo metilo ou um grupo hidroximetilo,

Ri apresenta um grupo alquiloxi com 1 a 4 átomos da cartono, grupos azido ou oiano ou um radical 9-h-adanlno, $~IT-£uani-* no, l-N-citosi», 1-4,-j-uraeilo ou «a 1-á-tisino, R^ pode também representar um átomo de hidrogénio se 3* representar hidroxilo e tP representar 000 R^ e em conjunto representam -C-OHg* e e R8 representam um átomo de hidrogénio ou um grupo de oiano· iSs preferidos os compostos de fórmula 1 aos quais; R^ representa OQH^, oiano, Uj ou 9-^-adeniao ou R^ e R® em conjunto representam -o-QHg- e os restantes radicais tira ©e significados jê indicado»* 0 processo de acordo com a invenção para a preparação - 4 - r

de um dos novos compostos de fó«mile I e oamcteriçado pelo facto de a) se converter de forma conheoi&a por ei um O-ou-l-glicspi»-no sido ou -furanosido de um derivado de hidrato âe carbono de fórmula IX, por oxidação com ácido periódico, a» deriva do de dialdeído; de fórmula XII.

Fórmula 11

Formula III tendo os radicais nas fórmulas 11 e 121 os seguintes significados : Π R representa um átomo de Mdrogênie, ua grup© metilo ou um grupo hidroximetilo, R representa us liaras dc- hidrogénios um grupo alquiloxi mm. 1 a 4 átomos de carbono, a sido, eis no, um radical 9-?T-adenI no, 9-K“guaniao, l-H-citosIno, 1-H-urseilo ou 1-H-timino, ou C /Γ R e R° em conjunto representam e η e* o ou ls s© fsger reagir ura rodomicInogll eó si do de fórmula I? - 5 -

ffemla ITT is cpal R’*’ representa ura átomo d© hidrogénio ou u i grupo hidroÀi, n R^ representa um átomo dê hidrogénio ou um grupo metido, 1? representa um grupo aetiloxiearbenllo ou um grupo hidroad e sfi repreBenta um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroil, ou um seu sal de adição de ácido, som ura excesso de um dialdeí, do de formula XXX9 na presença de 1 a 5 equivalentes de um cia noborohidreto de metal alcalino e de um dissolvente orgânico polar, como por exemplo metanol, acetonitrilo ou as suas mistu. ras aquosas, a 10°G atl 5^°G, obtendo-se uma mistura de produtos constituida por um derivado de morfolino de fórmula I na qual os radicais R1, R2, P9 R^, R^ e R6 mantém os seus signi-ficados anteriormenta aitadoa, e &' @ representam átomos de hidrogénio, e por uia derivado de oiano-morfolino de fórmula I na qual os radicais R1, R2, $9 à*r9 R? a raantêm os seus sijr nificados anteriorraente indicados e r7 e ifl representam um 1¾ mo de hidrogénio ou um grupo ciano, isolando-se ambos os derivados, de preferência por cromatografie através de uma coluna de sílica-gel, utilizando-se um sistema eluente constituído por cloreto de metileno/acetona ou metanol (95-80/5 volume/vo-lume) e uma adição de áeido acético e trietilamina. lio tenbéu ob^eeto da presente intenção medicamentos que contêm un ou mois dos compostos de flrma- - '0 - t

la I como substancia aetiva

Alia dos agentes auxiliares e/ou dilu- entes farmaceuticajnente correntes, estes medicamentos, alem dos compostos di fórmula I, para auxiliar & terapia pode", even tualmente conter tâabês ainda outrao substancias estivas, desde que estas quando combinadas oo:.: cs compostos de ffcnula Ϊ de acordo com a invenção, não apresentem qualquer acçãc colete ral indesejável;» fs doses e viar de anlicação correspondem Is conhecidas para a doxorrubicina o cl"unorrubioina, podendo também, devido â reduzida toxids.de dos coiapcotoa de acordo com a invenção, pratiosr-se também ume .1osr;;en maio elevado e/ou tsas administração maia frequente.

ca dos compostos aqui descritos 1' realizada in vitro m õllii-las de leucemia L1210 do rato, Sisia somo em células ^5/-· e HC-29, ou in vivo eia leucénia L121U, em nolanoma J16 e e 1 ada-nocarcinoma pulmonar de leuio.. à toxidede aguda dos compostos foi determinada em ratos BúPl* Cu mítodos, bem oomo os resulte dos destes ensaios, estSo descritos na parte experimentei.

Exemplos

Nos exemplos seguintes a presente lavaaçSo i descrita msls ροχ 'aenori^fciienle* sem a limitar aos moamos*

Exemplo 1

Preparação de disldeídos partindo-se ds derivados de Mdrstoe de saAoao 1* ('E|-Mdroxiffletil-lC- )-metoxi-2,2 *«oxidiacetsldefdo (oompoeto 1) lg (5,1 amole) de rf-D-gelactapirsnosiclo de metile em SC ml de etanol foi misturado Is porçdee oow 100 ml do uma r^Iuçâb aquosa 0,11 â» perlodato de sódio I temperatura ambiente,* Depois de 3 h de agitação a misture recetiva foi evaporad- em v£ cuo. 0 resíduo foi posto em. suspensão em metanol e o scl inorgânico foi removido por filtração* Depois da evaporação da bq«* liaçlo metanólice 0 xarope- resultante foi dissolvido em acetato • de etilo, foi triturado cem sulfete de sódio, filtrou-se e e 7

«* solução foi evaporada em vácuo e o resíduo foi seco em alto vá cuo. 0 produto que era unitário de acordo com a cromatografia em oâmada delgada (eluente: cloroformio/metanol 5:1 ou cloro-formio/metanol/ácido aceptico/água 8:4:2:1) foi utilizado no passo seguinte sem qualquer outra purificação. Rendimento: §30 mg (produto bruto) Rf = 0,76 em cloroformio/metanol 5*1· 1®(R)»hidroximetil-l(R)-metoxi-2,2'-oxidiacetaldeído (composto 2). Partindo-se de 1,0 g de @-D-galactopiranosido de metilo preparou-se o composto de título de acordo com o processo ante rior. Rendimento: 835 mg (produto bruto), Rf = 0,78 em cloro-fórmio/metanol 5*1. l(S)-metoxi-l*(S)-metil-2,2J-oxidiacetaldeído (composto 3)· Partindo-se de 1 g (5,6 mmoles) de #»L»fucopiranosido de meti» lo preparou-se o composto de título títa acordo com o processo para a preparação do composto 1.

Rendimento: 820 mg (produto bruto) Rf * 0,8 m clorofórmio/me» tanol 5*1· l(S)-ciano-l*(R)-hidroximetil-2,2*-oxidiacetaldeido (composto 4) · Partindo-se de 1 g (5,61 mmole) de 1-ciano-l-desoxL-^-D-ma ! nopiranbose e 120 ml de solução 0,1 i-i de periodato de sódio preparou-se o composto de título de acordo com o processo para a preparação do composto 1.

Rendimento: 830 mg (produto bruto) Rf « 0,58 em clorofórmio/me tanol 5:1· l(S)-azido-l*(R)-hidroximetil»2,2'-oxidiacetaldéído (composto 5) . Partindo-se de um grama (4,87 milimoles) de alfa-L-manopi-ranosilazida preparou-se o composto de título de acordo com o processo para a preparação do composto 1.

Rendimento: 850 mg (produto bruto) Rf = 60 em clorofórmio/meta I nol 5:1· l,3-dioxolano-2(R),2*(R)-dicarbaldeído (composto 6). Partindo--se de 1 g (6,17 mmole) de Igi-aiudro-^^mawpiranoae preparou—se o composto de título de acordo com o processo para a preparação do composto 1* • Rendimento: 800 mg (produto bruto) Rf = 0,55 em clorofórmio/me * tanol 5:1» τ &

1(S)-adenino-9-il-l*(R)-hidroximetil-2,2 *-oxidiacetaldeído (composto 7). Partindo-se de 1 g (3>74 mmole) de adenosina e de 70 ml de solução 0,1 H de periodato de sódio preparou-se o composto de título de acordo com o processo para a preparação do composto 1.

Rendimento: 990 mg (produto bruto) Rf » 0,67 em clorofórmio/me tanol 2:1«

Exemplo 2

Preparação de dertfados de morfolíno de 6-isoi^oÍemiiOii»· 7-0-(3 *-(6"(S)-hidroxiraetil“2H(S)-metoxi-4Hmorfolinil)-2 *»3', 6,-tri-desoxi-o<-L-«lixohexopiranoBil)-é--isorodomicinona (compoj3 to 8). 270 mg (0,47 mmole) de L-0“(*-I^daunosaminil)-£-isorod£ micinona foram dissolvidos em 10 ml de metanol e misturados com 29,6 mg (0,47 mmole) de cianoborohidreto de sódio e 152,7 mg (0,942 mmole) de dialdeído composto 1, dissolvido em 1,5 ml de metanol. Depois de 30 minutos de agitação à temperatura am-; biente adicionaram-se mais 1*12,7 mg (2 equivalentes) do dial» deído composto 1. A mistura remeiiva foi evaporada ao fim de 2 horas e o resíduo foi purôJ&oeâs cromatografleamente (silica-gel, eluente: clorofórmio/aeetona/áeido aceptico/água/trietiXa mina 95:5:1:0,25:0,1).

Rendimento: 202 mg (62%) I>G D=+6862 (c »0,1 em clorofórmio) MS-FAB Qfcfcff*·) m/e - 704, ponto de fusão * 173-175°C.

Os compostos 9 a 14 adiante foram preparados segundo 0 proces-í so para a preparação do composto B* 7-0-(3*-(6”(s)-hidroxíιietil-2,,(R)-metoxi-4M-morto2Íiaii|*<#|t, 3*> 6 f-tri-desoxi- ^-L-lixohexqpiraaesil}- £-i Borodomiclnona (compqs |tc 9).

Compostos de partida: 270 mg de 7-0-(^-L-daunosaminil)-S-isoro domicinona, 29,6 mg de cianoborohidreto de sódio e 305 mg do composto 2

Rendimento: 200 mg (61%), 1S*FAB (K+I*) m/e * 704 *. 7-0-(3*-(6M(S)-metiX-2w(S}«Mtt^-4BNιloιrtblAnill-2,, 3·, 6*-t^Mie^xi-oí-lrXixil^opiranosil)-£-isorodomicinona (composto ~ 9 - $

Cosmpostos de partida: 25Ό mg (0*436 mmole) de saminil) - £-i sorodomicinona, 27*4 mg de cianoborohidrato de só- dio e 127,4 mg do composto 3.

Rendimento; 191,8 mg fS4%|* :7^-fe,*(8tt(^)-Mdretí,Betil-2w(S)-ciano-4w-morf olinil)-2*, 3*, 6*-tri-desoxi-°Í-]>lixohexopJLranosil)-£-isorodomicinona (compojj to 11)

Compostos de partida: 2gQ mg (0,436 mmole) de 7-0-(«c-L-dauno&a minil)- £-isorodomi cinona, 27*4 mg de çianoboroMdreto de sódio e 151 mg do composto 4·

Rendimento: 173 mg (57%)· 7-0-(3*-(6" (S)-hidroximetil-2’f (S)-a^do«4w*^^®li®il J~2*, 3*, 6,-tri-deBoxi—x-L-lixohexopiranosil)-t-isorodomicinona (compos to 12).

Compostos de partida: 250 mg (0,436 mmole) de 7-0-(<*-L-daunosaminil )- £-isorodomicinona, 27,4 mg de cianoborohidreto de sódio e 151 mg (2 equivalentes) do composto 5).

Rendimento: 174 mg (56%). 7-0- (3 * - (2W, 6,,-epoximetano-4,,-morfolinil )»2', 3 * * 6 * -tri-iei®-xi*oç-L_lixohexopiranosil)-à -isorodomicinona (composto 13) Compostos de partida: 250 mg (0,456 mmoles) de 7-0-(^-L-dauiK>-saminil)-£>isorodomicinona, 27,4 mg de cianoborohidreto de sódio e 113 mg (2 equivalentes) do composto 6.

Rendimento: 181 mg (62%6 MS-FAB (M+H+) m/e = 672 7-0-(3 *-(2” (ít)~ (9" '-aâenlnllj-e1· f S )-Mdro3d.metil }-4”-morfoli-nil)-2f, 3*t 5*-tri-desoxi-^-Ij-lixõhexopiranosil)-6-isorodomi-cinona (composto 14)

Compostos de partida: 2g0 mg (0,43fS mmoles) de saminil)-ε-isorodomicinona, 27*4 mg de cianoborohidrato de sódio e 231 mg do composto 7

Rendimento: 253 mg (72%) MS-FAB (M+H+) m/e = 807 7-0-(3 *- (6” (s )-hidroximetil-2 ” (S )-metoxi-4,,-morfoÍinil)-Íf, 3*, 6*,-tri-desoxi-<*-L-arabinohexopiranosil)-l-isorodomicinona (compssto 15) 10 -

Compostos de partidas 270 mg C0,47 amoles) de 7M0~fw«i^eosanfl liLlJ-Ê-isorodomicinona, 29,6 mg de cianoborohidreto de sódio © :3J2*f mg do composto 1

Rendimento i 200 mg (61%) (300 KHz, H, H-COSY, GDOl^, delta (ppm)) a 7,26 s (H-2 und H-3), 5.19 bs (H-7 J*2.5 Hz), 2.31 d (H-8a, J=15 Hz), 2.19 dd (H-8b J=15 Hz e J=2.5 Hfc)f 4.25 s (H-10), 1.82 m (E-13a), 1.41 m CH-Ub), 1.11 t (H-14 J=7.2), 12.94 s e 12.29 e (PhOH), 3.69 s (OOOMe), 4.30 bs (9-0h), 5.51 d (H-l') 1.66 ddd (H-2a, J«13 Hz, J=*13 Hz, J=4 Hz), 1.89 dd (H-2*e, J=13 Hz, J=3 Hz), 2.61 m (H-3»), 5*22 t (H-4S J*10 Hz, J*9 Hz), 3.89 m (H-5'), 1.35 d (H-6% J=6.5 Hz), 4.58 s (H-2n)» 2.65 d (H-3««a), 2.52 d (H-3«e, J-11.5 Hz), 2.22 t 2.64 d (H-5ne), 3*95 m (H-6"), 3.64 dd (ΟΗ^ΟΗ1®, *f«12 Bs, d«4 Hz), 3.54 dd (CH20H»b, «í»12 Hz, J=5.5 Hz, 3.31 s (MeO)

Exemplo 5

Preparação de derivados de morfolino de <?-rodomioina 7-0-(3*-(6"(S)-hidro3±aetil-22*(*3)-taetoxi- 4n-morf alí nil)~2*, 3*, e^tri-desoxi-oc-L-iixoiiexopirarLOsilJ-^-rodomiGinona (composto 16) 300 mg (0,582 mmoles) de 7-0~(’χ-L-daunosominil) -t^-ro-domi-cinona foram dissolvidos em 210 ml de acetonitrilo e foram mis turados a -15°0 com 36,6 mg de cianoborohidreto de sódio e oom 188,7 mg do composto 1 dissolvidos em 2 ml de metanol, A mistura reactiva foi agitada 2 horas à temperatura ambiente e em seguida foi concentrada em vácuo* 0 resíduo foi purificado cro matograficamente (silica-gel, eluente: clorofórmio/acetona/áci do acetico/água/trietilamina 92:8:1:0,25:0,1.

Rendimento: 244 mg (65%)t°0 q=+520s fg = 0,05 em clorofórmio/ metanol 1:1) ponto de fusão: 198-200^0» - 11 - 1 7.62 d (H-l, 1*7,5 Hz), 7.46 t (H-2), 7.06 d (H-3, . 4.91 s (»-71* 1.93 » (H-8a), 1.93 a (Mb), 4.58 * s (H-10), 1,56 m CíMJa* ÍW3b)# 0.84 t (H-14, 2 H-NMR (300 3SSbv Β,Β-ΟΟδϊ, OOGly delta (ppa)| *

_ 5.26 s (Η-1*), 1.63 m (h-2*a, B-2»b), 2,06 m (H-3), 3.46 s (H-4*), 3.82 m (H-5*), 1.09 d (H-6*, J*6»5 Hz), 4.43 e (H-2"), 1.97 m (H-2«a), 2,79 d (H-2"b, J=11.5), 1.63 m (H-5Ha), 2.59 d (Η-5»%, Jsl0,5 Hz), 3.66 m (H-6W), 4.24 s (CH^OH), 5.32 s (MeO)

Os compostos 17 a 20 adiante foram pre parados de acordo com o prossso para a preparaçao do composto ‘16, 7-.0-(3*-(6Μ (S)-hidroximetil-2H (R)-metoxi-4”-morfolinil)-2*, 3’» 6*-tri-desoxi-(A-L~lixohexopiranosil)-(5-rodomicinona (composto 17) . ' Oefflçesfos de partida: J00 mg (0,582 mmoles) de 7M0-*|^-L-dauno* saminil)-(2-rodQmicinona, 36,6 mg (l equivalente) de cianoboro-bidret© de sódio e 188{7 mg (2 equivalentes) do composto 2

Rendimento : 240 mg (64%) IsS-FAB (K+H+) m/e==646 (M+Na+) m/e » 668. 7-0-(3'-(6"(S )-Mdroximetil~2"(S)-ciano-4"-morfolinil)-2*, 3*, 6,-tri~desoxi-°<”L-lixohexopiranosil)-(s-rodomicinona (composto 18)

Compostos de partida: 300 mg (0,582 mmoles) de 7-0-(°<-L-daimo-saminil)-(3r-rodòmicinona, 36,6 mg (l equivalente) de cianoboro-hidreto de sódio, 183 mg (2 equivalentes) do composto 4

Rendimento: 201 mg (54%) 7-0-(3-(6”(S)-metil-2"(S)-metoxi-4M-morfolinil)-2«, 3S 6*--tri-desoxi-<*-L-lixohexopiranosil )-(* rodomicinona (composto 19) Compostos de partida: 300 mg (0,582 mmoles) de 7-0-(°<-L-dauno-saminil)-^-rQdomicinona, 36,6 mg (1 equivalente) de cianoboro-hidreto de sódio e 170 mg (2 equivalentes) d© composto 3

Rendimento: 230 mg (63%) 7-0-(3*-(2M,6tt“epoximetano-4n-morfolinil)-2*, 3*, 6*, tri-desô xi-tf-L-lixohexopiranosil)-(s-rodomi cinona (composto 20) Compostos de partida: 300 mg (0,582 mmoles) de 7-0-(^-L-dauno-. saminil)-^-rodomicinona, 36,6 mg (l equivalente) de cianoboro-. bidreto de sódio, 151 mg (2 equivalentes) do composto 6 . Rendimento: 205 mg (58%), KSMftAB (K-f-H*) m/e * 614· - 12 - 9

Exemplo 4

Preparação de derivados âê morfolino de 4-0-metil*$** -rodomicina 7-0-(3'-(6" (S)*hidroximetil-2n (S)-metoxi-4w-niorf olinil)-2*,5?» 6* »-tri-desoxi-ô<-L-lixohexopiranosil)“4“0-niotil-(?-rodomicinona (composto 21) 250 mg (0,472 mmoles) de 7-0-(^-L-daunosaninil)-4-0-me til-í3-r£ domicinona foram dissolvidos em 10 ml de metanol e misturados com 29,7 mg (1 equivalente) de cianoborohidreto de sódio e 153 mg (2 equivalentes) do composto 1# Depois de 2 horas à tempera tura ambiente a mistura reactiva foi concentrada em vácuo e 0 resíduo foi purificado cromotograficamente (siliea-gel, elue»-te: clorofórmio/acetona/ácido aeetico/água/trietilamina 95*5 t 2*0,25*01)

Rendimento* 190 mg (62%) Í.;S-FAB (ΚφΗ+) m/β * 650» 7-0- (3 * -2” (3 )-ciano-SM CS l-bidroximetil-^-morfoliniD-a * * 3 % 51-tri-de8oxi-^-L-lixofcexopiranosi2)-4-0-meiIl-(^rodomicdnona (composto 22)

Partindo-se de 250 mg (0*472 «meios) de ^0«(^-L-daun©MainilJ -4-Q-metil-{5-rodomieinona* 29,7 mg (l equivalente) ôm cianobo-rohidreto de sliio e 149 mg (2 equivalentes) do aompestô 4 psg : perro-se o composto de título de acordo 0« 0 processo para a preparação do composto 1§*

SeBâteK&tof 20? rn (67%) <dS-EAB m/e - $55«

Exemplo 5

Preparação de derivados de 31'- ou 5"-01000-morfolino 7-0-(3 *“(3U ou 5n-cia»-6e (3)-hi droximetil-2” (s)-metoxi~4u-mor folinil)-2*, 3*, 6'-tri-desoxi-e^ lixehexopimnosil)—ã-isorodo micinona (composto 23) 270 mg (0,47 mmoles) de 7-0-(^-L-deEuaosaminlll-E-isoroiawícino na foram dissolvidos mm 10 ml de metanol e misturados com 29,6 mg (0,47 mmoles) de cianoborohidreto de sódio, 30 mg de cianeto de sódio e 152,7 mg (0,942 mmoles) do composto de dialdeído * i 1, dissolvido em 2 ml de metanol/lgua 1:1. Depois de 4 boras 1,de agitação ã temperatera ambiente a mistura reactiva foi eva- - 13 - % «*·

porada e o resíduo foi purificado cromatograficamente por uma coluna (silioa-gel, eluente: clorofórmio/ffletanol/ácido aeeti-co/água/trieiilamina 4liiliOf610* 02)·

Rendimentoí 106 mg (31%) q»+5268 (c=0,05 em clorofórmio) ponto de fusão: 209-211^0, i'3-FAB (I.+H+) m/e«?29* (h-CN) a/e** 702. 0a compostos 24 e 25 adiante foram pre parados de acordo com o processo para a preparação do composto 23. 7-0-(3"-ou 5M-ciano-6M Cδ)«Mí3Mκiffietil·-2,I C8)HBeto^-4M~«*% linil)-2», 3*, 6f-1ri-desoxl-^I^ãraOinolieáopiranõsil)~&-iBoro domicinona (composto 24)·

Compostos de partida: ZfG mg (0*47 maoles) de T^-C^^daunosâ mini! )-£-isorodomicinona9 29,6 mg de eianoboroMdreto de sódio, 30 mg At cianeto de sódio e 152,7 mg do composto 1.

Rendimento: 97 mg (28%) 00 .^+3562 (c=0,05 em clorofórmio) pon to de fusão: 22G-222°C, «S«Fá3 (L+H*) m/&*7&9 (K-dN) m/e«702. 7-43-13^(311 ta 5M-ciano“-SMti)-Mdroximetil^M(i)-aitaxi-4,*^ao|: folinil-2*, 3*, S^tri-desoEl-^-L-li^lieiopiraMísillw^-ródõmi*-cinona (composto· 25)

Compostos de partida i 5D0 ag (09 582 maeles) áe T-Q-^-X^daunosa minil)-(s-rodomiDinona, 36,6 mg de cianoberobidret©' de sódio, 40 mg de cianeto de sldio e 188,f mg do composto 1*

Rendimento: 117 mg (30*) ^*#2202 (c=0,l em clorofórmio) pon t® m fusão: 152-154% H3-FáS (rt*H+) m/e=671, (M-CN) m/e*644*

Exemplo 6

Preparação de derivados de morfolino e de 3w-ciano-morfolino 7-0-(3*-(4«-morfolinil)»2’, 3I|!, i*«ttliiese«i«^«W:ÍS3bexopira- nosil)-£-isorodomicinona (composto 2S) ;i 7“0- (3 * - (3,,-ciano“4,,“-morfolinil )-2 *, 3 *, hexopiranosil)-E--isorodomicinona (composto 27) 270 mg (0,47 mmoles) de 7-0-(^-L-daunosaminilisorodomicino na foram disselvidos em 10 ml de metanol e misturados com 29,6 • mg (0*47 mmoles) ds cianoborohidreto de sódio e 10 mg de 2,2*-

Tc

— -õxi-bi s-acetaldeídQ. â mistura reactiva foi tratada de forma habitual. Os compostos Zê e 27 foram purificados cromatografi-camente por coluna atrwris de silica-gel com o eluente: cloro-férmio/metanol/ácido aoltioo/agua/trietileaiaa 4í2flí0,ií0,02 e foram oaracterizados por análise ÍS® e análise MS* 4-Q-ffiétil-7-0-(3*-fiM-morfolinil)-2*, 3** 6’-trodesoxi-^-X-li-xohexopiranosil)-(S-rodomicinona (composto 28) e 4-0-metiÍ-7-0-(3,-(3,,-ciano-4l,-morfolinil)-2*, 3*» é^trideso-xi-^-L-lÍ3lOhexopiranosil)-^-rodomicinona (composto 29) Partindo-se de 7-0- (^-L-daunosaminil)-4-0-metil-(?-rodomicinonã e de 2,2*-oxi-bisacetaldeido foram preparados os compostos 28 e 29 como descrito acima, S foram oaracterizados por análises RMN e UB*

Exemplo f titotoxictdade contra ©liais s de leucemia 13220 (stem celi as- say) 0 ensaio foi realizado de forma correspondente a metodologia descrita por Hamburger e Salmos ©o© as modificações adiante descritas. 0 meio ©ondicionad© foi substituido por meio HeOoy 5/. Goto consequência das altas taxas de clona-gem das células de leucemia 1*1210 m soft agar, redu»iu-s® 0 numero de células de tumor por placa para 5 x 10^*

As ©IlaAae foram incubadas com diversas eonseairaçies da substância ensaiada* durante 1 hora a 37°C. SegoidemezEtre as células foram lavadas duas vezes com meio MeCoy β Â9 e e» seguida foram colocadas em placas como ca mada superior, num sistema de duas camadas de agar,. de forma correspondente ao método de Hamburger e Sâlmon. : As experiências paralelas adicionais foram realizadas utilizando-se um tampo de ieoubaçl© contínuo, misturando-se diversas concentrações da substância ensaiada â camada superior de agar das culturas de células. âs placas foram incubadas em estufa 1 com 5% de 002, 20% de 02 e 95$ de humidade relativa do ar, du-

raate 5 » 7 ΛΙ»®* Depois deste perioáe de tempo m colónias com um diâmetro superior a 60 Λ-m foram coutadas com auxílio da 0» resultados foram indicados como fim® çlSot em percentagem das colónias nos grupos tratados relativamem te aos grupos não tratados* § coeficiente de variação em experiências repetidas é menor do que xm*

Os resultados obtidos com os compostos ensaiados figuram no quadro 1* A partir da curva dose-acçã© determinou η» o valor I0^Q para a incubação contínua e dê uma hora (quadro 1).

Os numeros apresentados neste quadro comprovam que a maioria das substâncias possui uma citotoxida-de muito alta (I0^Q 0sl em diversos sistemas de ensaio in vitro» relâtivamente a células de tumores do homem e dos a-nimais.

Itorolo §

Ensaio de proliferação (redução de HM} Células L1210, A 549 ou HT-29, na fase de crescimento exponencial» foram incubadas com uma densidade de células de 5 x 10^ iCeldlcs/ml em RPMI I64O, numa placa dfe microtítulo de 96 çavi-dades9 ao longo de 72 horas, com diversas concentrações da substancia ensaiada a 37°0, 5% de GO^ e 95% de humidade relati ira do ar. As experiências de controlo, em vtz da substância en caiada» receberam apenas 0 aeio de cultura* Para cada ígubstân-|iia ensaiada assim como para os controlos, realizaram-se deter minações evm quadruplicado. Depois de 65 horas de incubação a-lidicionarass-s© 50 /M de uma solução de i-M (2,5 rag/ml em soro fisiológico tsmponizaâô com fosfato). Na presença de células vivas 0 MM foi reduzido a um corante de formazano insolúvel, Vermelho escuro. Esta reaeção estava terminada ao fim de 7 horas (células L121o) ou ao fim de 24 horâs (células A 549 e Hf • 29) e o meio sobrenadaate foi cuidadosamente removido por aspi,

* ração. 0 corante insolúvel foi dissolvido por adição de 100 jaI - IS -

de DM60 e mediu-se em seguida a extinção das soluções asei® ob tidas, para cada cavidade, mm ítiltiscôn Photometer 340 GG da firma Flow, a um comprimento de onda de 492 m* A partir das relações de extinções de células não tratadas traçou-se uma curva dose-acção a partir da qual se determinou, por leitura, ss concentração que extermi nava precisamente 50% das células (IC^0). Para ensaios repetidos o coeficiente de variação em menor âô que 15%*

Exemplo 9

Determinação da toxicidade aguda

Para a determinação da toxicidade aguda injectaram-se* per via intraperitoneal, ratos BDF1 no dia 0 com diversas doses da substância ensaiada dissolvida em 0,5 ml de uma solução a m de glucose. Os grupos âe controlo receberam apenas 0,5 ml da solução de glucose. F©r cada concentração da substância ensaia da utilizaram-se 5 ratos» No dia 14 determinou-sê o numero dos ratos sobreviventes e a partir deste, de acordo com © método Lichtfield Wilcoxon, calcularam-se os valores LD5, MS© e LD95» A toxicidade (LD50 (mg/kg)) dos compostos aqui descritos foi determinada em comparação com a adriamicii»»:

Exemplo 1©

Eficácia in vivo de rodomioinas contra células de leucemia L1210 do ratô

Retirou-se líquido d® ascite em condições estérreis de ratos DBA2 (fêmeas, li-SG g) 7 dias depois da implantação. Â ascite foi lavada 3 vesti @©a PBS, foi contada s ©justada, para um numero de célula® át i©'^ em 0,2 ml de PBS,

Injectaram-se depois por via intrapeid toneal 10^ células, postas em suspensão em 0,2 ml de PBS, em ratos DBF1 (fêmeas, 18-20 g). Foram utilizados 6 animais por grupo para cada concentração da substância ou como controlo.

Para a determinação da eficácia antitu mérica os animais foram pesadps nos dias 1 s 5 depois da injeç! * ção da substância de ensaio. Uma perdia de peso maior do que - 17 -

20% no dia 5 foi tomada como indicador de uma acção tóxica da substância.

No termo da experiência (morte de to» dos os animais ou animais sobreviventes no dia 60) determinou--ee @ tempo medio de sobrevivência dos animais em cada um dos grupos, desde que no dia 5 da experiência estivessem ainda vi vos pelo menos 65% dos animais. 0 tempo medio de sobrevivência foi determinado exclusivamente para os animais que morreram no decurso da experiência. As sobrevivências a longo prazo (Iffi) nSo foram tomadas em consideração neste eilculo* A partir dos tempos médios de sobrevivência (MS3? ) dos grupos tratados* assim somo dos grupos de controlo (MSTQ) determinou-se a eficácia antitumóriea (T/C) pa ra cada uma das concentraçoes êm substinoias em percentagem dos controlos não tratados, de aoorio com a seguinte fórmulaj MS%j, T/C % m * - -------------- X 100

Os valores £/C maiores do que 125$ foram tomados como indicador de uma eficácia antitumórica slgnifi, cativa da substância ensaiada. Determinou-se a dose que corres, pondia ao maior efeito antitumórico (dose óptima) bem como as doses que em cada caso se situavam um ponto acima e m ponto abaixo desta dose. Os animais que ainda viviam no dia 60 da e|g periência foram contados aparte como sobreviventes a longo ρ% zo.

Η Ο GÍ

Q >** £> α

Claims (1)

1. HEI V X N ΰ I Q à C 1 0 Processo para a preparação de um deri-vado de oatreciolina de fórmula I

   ΓΗ Fórmula I na R1 R- r5 R6 ífi qual os m&imí,® têm os seguintes signiileadosí J) X*I3 S€í ΧΙΈ 8. um átomo & Mdrojpnio ou um jpupo hidreatí.., TOpresenia um Item© de Mdrogénio uu um grupo metilo, representa um grupo metlloxlearbonilo ou um grupo hidroxia representa m átomo de hidrogénio cru um grupo hidrwi*. r^re senta um átomo de hidrogénio , um grupo metilo «a um jpupo í&dre3dffiêtilo* representa um grupo alquiles! sem um a quatro atamos de car Ιοη©* azido ou ciano, ou um radical g-K-adenino, 9-N-guanihé l-H-eítosino, 1-N-uraoilo ou l-N-tímino, pode também representar um átomo de hidrogénio se R*^ representar MdMtílo e representar ¢000¾» e R^ em coaj^^o representam -0-CH2 e ir e R? r^pesentWi um átomo de hidrogénio ou um grupo ciano, cara c ter iza-do pelo fasto de m fazer reagir u» rodomioinoglieosi-do de firmul» IV

   Formula IV Formula III nas quais R^* representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hldroxi, i m ív representa um átomo de hidrogénio: ou um grupo metilo, .. ·% R Representa um grupo metiloxicarbonilo ou um grupo hidrozi e R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidrozi» ou um seu sal de adiçSo de ácido, com um excesso de um dial deído de fórmula III, na qual os radicais R? representa ura átomo de hidrogénio, um grupo aetilo ou um grupo hidroximetilo, R® representa um átomo de hidrogénio, um grupo alquiloxi com 1 a 4 átomos de carbono, um grupo azido ou um grupo ciano, ! ou um radical 9-N-adenino, 9-H-guanino, 1-N-çitosino, 1-N--uracilo ou 1-N-timino, ou e R^ em conjunto representam : na presença de i a 6 equivalentes de um cianoborohidreto de um metal alcalino, e de um dissolvente orgânico polar, de preferência metanol ou aoetonitrilo, ou das suas misturas aquosas, a 10°0 até 50°0,; obtendo -se uma mistura de produtos constituída por um derivado de morfolino de fórmula I no qual os radi-©ais R^, R2, R^, R^, e mantêm os seus significados ante-; riormente indicados e fl? a R? representam átomos de hidrogénio,, íí e um derivado de ciano-morfolino de fórmula I no qual os radicais R1, R2, Rpt R^s H? e mantêm os seus significados ante-•, riormente citados, e R1 e R representam um atomo de hidroge-* aio· ou de um grupo oiano^ e se isolarem os 2 derivados* - 21 - * Á requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresen·. tado em 8 de Julho de 1988, sob o P 38 23 224.3. Lisboa, 6 de Julho de 1989 t* » Di J v-i-HEDADE isim