PT90329B - Processo para a preparacao de peptidos protectores derivados do virus-1 da imunodeficiencia humana, gp 160 - Google Patents
Processo para a preparacao de peptidos protectores derivados do virus-1 da imunodeficiencia humana, gp 160 Download PDFInfo
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Description
Âmbito do Invento presente invento refere-se ao campo dos tratamentos e diagnósticos para a infecção virai. Mais particularmente, o in vento refere-se ao campo dos tratamentos e diagnósticos para a infecção pelo vírus 1 da imunodeficiência humana.
Referência a Pedidos Relacionados
Este pedido é uma continuação em parte do pedido de patente IT.S. com o número de série 183,840 depositada em 20 de Abril de 1988 em nome de Mark I. Greene., Wílliam V. Williams e David Weiner, entitulado Methods of Modulating Retro-Virus Host Cell Interactions, pedido esse que é específicamente incorporado como se totalmente estabelecida no presente pedido.
Antecedentes do Invento
Síndroma da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) é uma das doenças mais temidas presentemente. A infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), tomado como causador da SIDA é quase sempre fatal. Os sintomas da doença podem levar anos a des senvolver-se, facilitando assim a disseminação desta doença fatal, por pessoas que desconhecem ser portadoras do vírus. Os tra tamentos para a SIDA são limitados e não têm tido sucesso no controlo da doença.
Foi demonstrado que o HIV-1 infecta lulas que expressam CD4, uma glicoproteina las,de 55 000 dalton.
preferencialmente cé superficial das célu
Crê-se que este tropismo resulta de interacções entre o envelope do virus gpl20 e um ponto de ligação de elevada afinidade na glicoproteina CD4 que permite a adsorção virai. O gpl20 é parte da glicoproteina envelope gpl60. Esta grande glicoproteína consiste em duas porções principais de glicoproteína-gpl20 e gp41. Crê-se que gpl20 é a parte mais exterior do complexo formado por estas duas glicoproteínas. gp41, a porção in6 9 174
Ref: UPN-207 (Portugal)
-3 terior do complexo, está embebida na membrana virai. Após a l_i gação inicial do vírus à molécula CD4 da superfície da célula o gp41 penetra nas membranas da célula alvo e inicia a fusão. Esta interacção precede a entrada virai, o des-revestimento e a replicação.
A Patente U.S. n2. 4,520,113 de 28 de Maio de 1985 deposi^ tada por Gallo et al., descreve métodos para a detecção de HTLV-III (agora nomeado HIV—1) no soro de pacientes com SIDA e pré-SIDA. Estes métodos detectara a presença de anticorpos no so ro dos pacientes, que se ligam a pontos antigénicos no HIV-1 ou fracções de HIV-1, assinalando a presença do próprio vírus no paciente. Uma fracção conhecida como p41, uma proteína envelope virai de 41 000 dalton, verificou-se ser particularmente útil nos métodos de diagnóstico do invento porque muitas pessoas com a doença da SIDA ou PRÊ-SIDA mostraram possuir anticorpos contra esta proteína virai.
A patente U.S. ne. 4,725,669 depositada em 16 de Fevereiro de 1988 por Essex e Lee descreve novos péptidos em conjunto com análises que utilizam polipéptidos para detectar a infecção de células pelo virus-lll linfotrópico da célula T humana (isto é HIV-1). Os polipéptidos podem ser formas purificadas de glicoprjo teínas encontradas na membrana celular de células infectadas com o vírus-IH linfotrópico da célula T humana. Os polipéptidos con têm determinantes antigénicos imunológicamente reactivos em cruzado com glicoproteinas possuindo um peso molecular de 120 OCO daltons e 160 000 daltons que ocorrem na superfície de células infectadas com HTLV-III (HIV-1).
O tratamento de indivíduos infectados com HIV-1 foi complicado pela capacidade de ligação do vírus às células de mamíferos e pela extrema toxicidade da infecção com o vírus. A proba bilidade de inadvertidamente infectar indivíduos sãos com um HIV-1 apenas parcialmente inactivado, ou componentes do vírus co mo parte de uma vacina, é extremamente elevada, utn composto comercialmente disponível, que é útil como agente anti-inf ecçao, é uma forma de CD4 . Crê—se que este composto é bem sucedido por li
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Ref: UPN-207 (Portugal)
-4gar a gp!2C tão fortemente como a CD4 natural. Desta forma, se administrado em concentrações suficientemente elevadas, a CD4 livre (administrado) ligará todo a gpl2O virai e evitará assim a sua ligação a CD4 nas células hospedeiras. Cs esforços para controlar o vírus através de drogas não tiveram sucesso até aqui. São necessários meios alternativos para o tratamento de indivíduos infectados com HIV-1, bem como meios alternativos pa ra a prevenção ou inibição da infecção de células com HIV-1, que não sejam tóxicos para o indivíduo infectado com HTV-l e que sejam seguros para indivíduos nao infectados com o vírus.
O problema principal com as infecçoes com retrovírus é a forma como os retrovírus conseguem subverter a resposta imunoló gica dos organismos hospedeiros em detrimento do hospedeiro. Es te facto é mais vivamente ilustrado pelo efeito da infecção com HIV em células T auxiliares humanas, o HTV-l infecta as células ligando-se primeiramente às moléculas CD4 da célula hospedeira, utilizando a glicoproteina envelope virai gpl2O, e fundindo-se subsequentemente à membrana celular. Numa célula infectada, a gpl2O é expressa na superfície da célula criando um alvo potencial para respostas citolíticas de anticorpos. Superficialmente uma resposta de anticorpos para gp!2O pareceria ser vantajosa para o hospedeiro. No entanto, durante a infecção com HIV, libertam-se também grandes quantidades de gpl2O das células infe£ tadas com ligação subsequente a moléculas CD4 em células não in fectadas. Estas células não infectadas tornam-se também alvos para a ligaçao citolítica de anticorpos e lise subsequente. Entre as células possuidoras de CD4 no hospedeiro encontram—se as células T auxiliares, as células necessárias para o desenvolvimento de respostas de anticorpos. Libertando a gpl2O das células infectadas o HIV consegue inutilizar uma arma essencial da resposta imunológica que conduziria à eliminação de HIV.
Assim, é um dos objectivos do presente invento proporcio , por nar agentes e métodos para inibir a infecção de células/HIV-1. Utn outro objectivo é proporcionar polipéptidos capazes de efectuar essa inibição. Outro objectivo é interferir na ligação de HIV-1 às células hospedeiras. Ainda outro objectivo é proporcio·
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-5nar métodos para detectar a presença de HIV-1 em espécimes biológicos ou para detectar a presença de anticorpos para HIV-1 nesses espécimes, á também um objectivo do presente invento pro porcionar métodos de tratamento das células para evitar a infec. ção com HIV-1.
Seria óbviamente benéfico para o hospedeiro o desenvolvi, mento de respostas de anticorpos capazes de reconhecer e destruir células infectadas, deixando intactas as células não infectadas. Assim, é também um objectivo do presente invento proporcionar esses anticorpos, fí ainda objectivo do invento propor cionar métodos para o reconhecimento de pontos nos retrovírus que sejam imunogénicos e conduzam ao desenvolvimento de anticor pos benéficos deste tipo. Estes e outros objectivos tornar-se-3o aparentes a partir da revisão da presente descrição.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra a ligação de soro anti—H156 a células L de murídeos.
A Figura 2 mostra a imunoprecipitação competitiva das gli. coprotelnas envelope do vírus.
A Figura 3 mostra a ligação idiotípica específica a H156.
A Figura 4 mostra a electroforese em gel das segundas gli coprotelnas receptoras.
Descrição Sumária do invento
O presente invento descreve novos receptores presentes nas células e que ligam a gp41, que nunca tinham sido descritos até aqui. Estes receptores parecem regular a entrada de HIV-1 nas células após a ligação do vírus à célula no receptor CD4 por meio da gp!20.
presente invento descreve- também novos anticorpos que são específicos para o ponto antigénico gp41 gue liga os novos receptores. Crê-se agora, que estes anticorpos são pelo menos parcialmente responsáveis pela inibição da formação de sincícios que ocorre quando as células humanas são infectadas com HIV—1. Crê-se que o gp41 possui pelo menos dois determinantes antigéni6 9 174
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-6cos e que pelo menos um deles se liga a polipéptidos na superfí^ cie de uma célula hospedeira. Os anticorpos específicos para o determinante antigénico de gp41 que se ligam aos novos receptores possuem a capacidade de inibir a formação de sincícios, enquanto que os outros anticorpos para gp41 já conhecidos, nao inibem a formação de sincícios. Sabe-se que os anti-corpos para gp41 ocorrem em pessoas infectadas com HIV—1, no entanto não se crê que estes anticorpos sejam específicos para um determinante antigénico,. ou determinantes não associados com a ligação de HIV-1 à célula hospedeira.
A descoberta de um segundo ponto de ligação que parece regular a entrada de HIV-1 nas células e os novos anticorpos e£ pecíficos para gp41 no determinante antigénico que se liga ao se gundo receptor, proporcionam um avanço substancial no tratamento de células por inibição da infecção. A descoberta de um segundo ponto de ligação e de novos anticorpos para gp41 proporciona tam bém métodos e agentes para a Inibição da infecção das células. Crê-se que este segundo ponto de ligação está compreendido entre uma ou mais glicoproteínas possuindo pesos moleculares de 25 000 a 35 000 daltons, 45 000 daltons a 60 000 daltons, 80 000 a 100 OOO daltons e 180 000 a 220 000 daltons. O segundo ponto de ligação liga gp41, uma glicoproteína envelope de HIV-1.
presente invento proporciona novos agentes para interfe rir com os efeitos de HIV-1 em células hospedeiras possuindo polipéptidos superficiais capazes de ligar HIV-1. O presente inven to proporciona polipéptidos substancialmente puros possuindo um determinante ou determinantes antigénicos imunológicamente reactivos em cruzado com determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons e com determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 160 000 daltons; sendo cada uma das glicoproteínas obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 de imuno deficiência humana. Os polipéptidos adequados para uso no invento incluem anticorpos anti-idíotipo possuindo os determinantes antigénicos apropriados. A glicoproteína conhecida como gp41 que possui um peso molecular de 41 000 daltons e que é obtida a par69 174
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-7tir de células infectadas com HIV-1, contém uma região polipéptídica que possui um determinante antigénico apropriado e gue é adequado para uso no invento.
Por polipéptidos contendo determinantes antigénicos imu nológicamente reactivos em cruzado significa-se polipéptidos possuindo em comum determinantes antigénicos com os quais reag_i rá um determinado anticorpo.
O invento proporciona também novos polipéptidos compreeri dendo polipéptidos substancialmente puros possuindo um determinante ou determinantes antigénicos específicos para uma glicopro teína possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons que é obtida a partir de células infectadas com o vírus-1 da imunodeficiência humana, possuindo os polipéptidos um determinante ou determinantes antigénicos imunológicamente reactivos em cruzado com pelo menos uma glicoproteína com um peso molecular de 25 000 a 35 OOO daltons, 45 000 daltons a 60 000 daltons, 80 000 a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons. As glico proteínas são preferivelmente obtidas a partir de células HSB,
ST, HeLa e humanas. 0s polipéptidos são também úteis nos métodos de interferência com os efeitos de HIV-1 sobre células hospedeiras possuindo polipéptidos superficiais capazes de ligar o HIV-1. Os anticorpos e as glicoproteínas são exemplos de polipéptidos que podem proporcionar um determinante, ou determinantes, antigé nico adequado para uso no invento.
presente invento proporciona ainda métodos de interferência com os efeitos do vírus 1 da imunodeficiência humana em células hospedeiras possuindo polipéptidos na superfície da célula capazes de ligar o vírus 1 da imunodeficiência humana. Estes compreendem polipéptidos possuindo um determinante, ou deter minantes, antigénicos imunológicamente reactivos em cruzado com determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons e determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 160 OCO daltons, sendo cada uma das glicoproteínas obtidas a partir de células infectadas com o vírus—1 da imunodeficiência humana pos
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-θΐά em contacto com as células em condições seleccionadas para permitir a ligação do polipéptido aos polipéptidos superficiais da célula hospedeira inibindo assim a ligação do vírus ao polipéptido da superfície da célula para efectivar a interferência.
De acordo com outras concretizações do invento, proporcio nam-se processos de interferência com o efeito do vírus 1 da imu nodeficiência humana em células hospedeiras possuindo polipéptidos na superfície da célula capazes de ligar o vírus 1 da imunodeficiência humana. Estes processos compreendem o contacto do v_í rus 1 da imunodeficiência humana com um polipéptido possuindo um determinante, ou determinantes, antigénico específico para uma glicoproteina com um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons que é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana; o polipéptido possuí ainda um determinante, ou determinantes, antigénico imunológicamente reactivo em cruzado com pelo menos uma glicoproteína possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 000 daltons, 45 000 daltons a 60 000 daltons, 80 000 a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons. Estas glicoproteínas são obtidas a partir de células HSB, ST, HeLa e humanas. 0 contacto é efectuado em condições se leccionadas para permitir a ligação do polipéptido ao vírus, in_i bindo assim a ligação do vírus às células hospedeiras e efectivando a interferência.
São também proporcionados pelo presente invento processos para a detecção da presença de anticorpos neutralizadores de HIV-1 em espécimes biológicos suspeitos de conter HIV-1. 0 espécime biológico é posto em contacto com um polipéptido possuindo um determinante antigénico ou determinantes imunológicamente reactivos em cruzado com determinantes de uma glicoproteí. na com um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons e com determinantes de uma glicoproteína com um peso molecular de apro ximadamente 160 000 daltons, sendo cada uma das glicoproteinas obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana, sob condições seleccionadas para permitir a ligação do polipéptido a anticorpos neutralizadores no espécime biológico. 0 polipéptido é então detectado. Nas concretizações
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- 9 preferidas do invento, o polipéptido é marcado de forma detectável com um marcador conhecido na especialidade. Usando estes métodos pode seguir-se o tratamento das células com anticorpos neutralizadores ou polipéptidos.
O invento proporciona ainda métodos adicionais para a detecção da presença do vírus 1 da imunodeficiência humana em espécimes biológicos suspeitos de conter o vírus. Estes métodos compreenderam o contacto do espécime biológico com um polipépti. do contendo um determinante antigénico ou determinantes específicos para uma glicoproteina com um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons, gue é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana; o polipéptido possuí ainda um determinante antigénico ou determinantes imunológicamente reactivos em cruzado com pelo menos uma glicoproteí^ na possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 000 daltons,
000 daltons a 60 000 daltons, 80 COO a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons, sendo estas glicoproteínas obtidas a partir de células HSB, ST, HeLa e humanas sob condições seleccio nadas para permitir a ligação do polipéptido ao vírus no espécime biológico. O péptido é então detectado. Nas concretizações preferidas do invento, o péptido é marcado de forma detectável com um marcador conhecido na especialidade.
O invento proporciona ainda processos para a determinação da presença de anticorpos neutralizadores para o vírus 1 da imunodeficiência humana no soro de humanos, anticorpos esses que inibem a formação de sincícios. o soro humano é posto em contacto com uma mistura de células capaz de formar sincícios na presença de HIV-1 e as células, infectadas com HIV-1, com so ro humano sob condições seleccionadas para permitir a ligação de anticorpos neutralizadores às referidas células. A formação de sincícios é então detectada. Nas concretizações preferidas do invento, os anticorpos neutralizadores possuem um determinan te antigénico ou determinantes específicos para uma glicoproteí na com um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons que é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodef iciência humana; o polipéptido possuí ainda um determinante
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-10antigénico ou determinantes imunológicamente reactivos em cruze do com pelo menos uma glicoproteína possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 000 daltons, 45 OCO a 60 000 daltons, 80 000 a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons, sendo estas glico proteínas obtidas a partir de células HSB, ST, HeLa e humanas.
O invento proporciona também processos para o tratamento de células possuindo pêptidos na superfície da célula capazes de ligar o vírus 1 da imunodeficiência humana para inibir a infecção por HIV-1. Sao proporcionados agentes que bloqueiam o ponto de ligação de gp41 nas células e estes agentes são administrados às células em condições seleccionadas de forma a permitir a ligação dos agentes às células, bloqueando assim o ponto de ligação de gp41 e inibindo a infecção das células. Nas concretizações preferidas do invento, os agentes que bloqueiam o ponto de ligação de gp41 nas células são os polipéptidos que possuem um determinante antigénico ou determinantes imunológicamente reactivos em cruzado com determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons e com determinantes de uma glicoproteína possuindo um pe so molecular de aproximadamente 160 000 daltons; sendo cada uma das glicoproteínas obtida a partir de células infectadas com HIV-1.
invento proporciona, adicionalmente, processos para in_i bir a infecção por HIV-1 de células possuindo polipéptidos na superfície de célula, capazes de ligar a gp41 em HIV-1. São proporcionados agentes que se ligam a gp41 e estes agentes são admi nistrados a HIV-1 em condições seleccionadas de forma a permitir a ligação do agente a gp41, bloqueando assim a gp41 e tornando-a indisponível para se ligar às células, o que inibe a infecção destas. Nas concretizações preferidas do invento, os agentes que se ligam a gp41 são polipéptidos possuindo um determinante antigénico ou determinantes específicos para uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons, sendo esta glicoproteína obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana; o polipéptido possuí ainda um determinante antigénico ou determinantes imunológicamente
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-11 reactivos em cruzado com pelo menos uma glicoproteína possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 000 daltons, 45 000 daltons a 60 000 daltons, 80 000 a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons, sendo estas glicoproteínas obtidas a partir de células HSB, HeLa e humanas.
O invento proporciona ainda péptidos possuindo uma sequência de aminoácidos com cerca de 10 a cerca de 50 aminoácjL dos que correspondem a pelo menos uma porção de um epitopo pro tector de HIV. Estes péptidos correspondem a regiões da glico— proteína envelope de HIV, gpl60 que protege ou inibe a infecção e a formação de síncicios de linfócitos humanos ou outras células susceptiveis, quando péptidos correspondentes a pelo menos uma porção da região são postos em contacto com células pos. suíndo receptores para HIV-1. Sem pretender ficar ligado a nenhuma teoria ou modo de acção, acredita-se que os péptidos correspondem a regiões de gpl60 (ou gpl20 e gp41) que estão envolvidas na ligação de HIV a receptores na superfície de células humanas, os péptidos do invento podem ligar-se a esses receptores, tornando-os assim indisponíveis para a ligação a HIV. Os péptidos do invento podem também ser utilizados para eliciar anticorpos para evitar a ligação do vírus a receptores na superfí cie de células humanas. Os péptidos do invento são preferlvelme te seleccionados entre o grupo constituído por:
gly-glu-ile-lys-asn-cys-ser-phe-asn-ile-ser-thr-ser-ile-arg-gly-lys-val-gln-lys-glu-tyr-ala;
asn-gly-asn-ala-glu-glu-val-va1-ile-arg-ser-ala-asn—phe-thr-asp-asn-ala —lys —thr-ile —ile-va1;
cys-asn-ile-ser-arg-ala-lys-trp-asn-asn-thr-leu-lys-gln-ile-asp-ser-lys-leu-arg-glu-gln-phe;
gly-ser-asp-thr-ile-thr-leu-pro-cys-arg-ile-lys-gln-ile-ile-asn-met-trp-gln-glu-va1-gly-lys; va1-gln-gln-gln-asn-asn-leu-leu-arg-ala-thr-glu-ala-gln-gln-his-leu-leu-gln-leu-thr—val-trp— gly—ile—lys-gln-leu-gln; e péptidos contendo essas sequências.
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-12 O presente invento proporciona também anticorpos específicos para um péptido do invento descrito acirr.a·
O invento proporciona processos para desenvolver ou siri tetizar péptidos biológicamente activos. Os esquemas de ligação de anticorpos de um indíviduo saudável infectado com o retrovírus e de anticorpos de um indivíduo sintomático infectado com o retrovírus são comparados para determinar pelo menos uma região de ligação única para anticorpos de indivíduos saudáveis infectados. Sintetiza-se então um péptido correspondente a pelo menos uma porção de uma região única de ligação.
O passo de comparação compreende preferivelmente os passos de proporcionar pelo menos um péptido de teste derivado da sequência de aminoácidos de um componente do referido retrovírus; contacto de anticorpos de um indivíduo saudável infectado e de um indivíduo sintomático infectado com pelo menos um péptido de teste para determinar a presença de anticorpos ligá veis com o péptido de teste; comparação dos resultados do segun do passo para o indivíduo saudável infectado com os do indivíduo sintomático infectado, para determinar pelo menos uma região única de ligação para anticorpos do indivíduo saudável in fectado.
As células de rato não possuem o receptor CD4 na sua super fície e não podem ser infectados com o vírus da SIDA em condições normais. As células de rato nas quais o ADN codificando pa ra CD4 foi inserido no material genético expresso podem, no entanto, expressar CD4 nas suas superfícies e são capazes de ligar o vírus da SIDA. As células não são no entanto infectadas pelo vírus. As células humanas que não expressam CD4 não são também geralmente infectáveis pelo vírus, mas se forem modificadas para possuir CD4 nas suas superfícies podem ser infectadas, indicando que CD4 por si só é insuficiente para produzir infecci□sidale e que existe qualquer outro elemento expresso nas superfícies das células humanas necessário para a infecciosidade. .
Os anticorpos de rato que sao semelhantes em estrutura à parte funcional de GP41 actuam como sondas para as proteínas da
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-13superfície das células que actuam como um receptor GP41. As cé_ lulas que possuem CD4 mas n3o ligam os produtos parecidos com GP41 não são infectáveis com o vírus da SIDA. Uma vez infectadas com o vírus da SIDA, as células começam a manifestar as gli. coproteínas que codificam, por meio do vírus da SIDA nas suas próprias superfícies. Como estas células possuem as proteínas que conduzem à fusão da membrana do vírus da SIDA com a membra na da célula humana, elas tendem a fundir-se elas próprias em conjunto pelos mesmos mecanismos moleculares envolvidos na in— fecção formando aquilo a que se chama sincício. Tanto os anticorpos de rato como os anticorpos humanos de que derivam podem bloquear a formação de sinclcios entre células infectadas, indicando que quer a ligação do ponto activo GP41 quer a ligação do ponto receptor humano são capazes de evitar a fusão. Crê—se que este facto significa que qualquer um deles é capaz de evitar a infecção celular uma vez que a fusão é um passo essencial para essa infecção.
O soro de pacientes com níveis elevados de anticorpos para GP120 não impede a fusão dessas membranas celulares e constitui mais uma evidência de que os anticorpos para GP120 não são protectores contra a infecção.
É sabido que pessoas infectadas com HIV-1 produzem anticorpos para gp41; no entanto nem todos estes anticorpos exibem um efeito neutralizador ou inibidor sobre a capacidade do HIV-1 entrar em células susceptiveis. Os anticorpos que possuem um efeito neutralizador encontram-se no âmbito do presente invento. Crê-se que gp4I possuí pelo menos dois determinantes antigénicos e que pelo menos um deles se liga a polipéptidos na superfície de uma célula hospedeira. Crê-se que os anticorpos não neutralizadores são específicos para um determinante antigénico ou determinantes não principalmente associados com a ligação de HIV-1 à célula hospedeira, enquanto que os anticorpos neutralizadores deverão estar dirigidos para um determinante antigénico ou determinantes envolvidos na ligação de HIV-1 à célula hospedeira. São estes últimos anticorpos que são especialmente úteis
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-14 na prática do presente invento.
Estes anticorpos neutralizadores, que são uma fonte de alguns dos polipéptidos do presente invento, podem ser obtidos por exemplo, testando o soro de pessoas com SIDA, ARC ou que po£ sam ter sido infectadas com o vírus por contacto com pessoas infectadas com o vírus.. 0 soro destas pessoas pode ser testada na Análise de Inibição de Fusão ou Sincícios, descritas no presente invento, ou por outros processos que determinem a inibição de fusão. Os anticorpos que inibem a formação de sincícios são seleccionados e utilizados no presente invento como fontes de polipéptidos possuindo um determinante antigénico ou determinan tes específicos para uma glicoproteína possuindo um peso molecu lar de aproximadamente 41 000 daltons que são obtidos a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana e que possuem ainda um determinante antigénico ou determinantes imunológicamente reactivos em cruzado com pelo menos uma glicoproteína possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 000 daltons, 45 000 daltons a 60 000 daltons, 80 000 a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons, sendo as referidas glicoproteínas obti. das a partir de células HSB, ST, HeLa e humanas.
De acordo com o presente invento, estes anticorpos podem também servir como fonte de anticorpos para uso na preparação de anticorpos anti-idiotipo. 0s anticorpos anti-idiotipo são de facto anticorpos para um anticorpo. 0 ponto activo de um anticor po anti-idiotipo contém um equivalente funcional da região antigénio para a qual o anticorpo é específico. Estes anticorpos podem ser uma fonte de polipéptidos possuindo um determinante antigénico ou determinantes imunológicamente reactivos em cruzado com determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecu lar de apróximadamente 41 000 daltons, e determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 160 000 daltons, sendo ambas as glicoproteínas obtidas a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana.
Os entendidos na especialidade reconhecerão que podem efec tuar-se várias modificações nos compostos polipéptidos do presen te invento sem sair do âmbito do mesmo. É contemplado que as té69 174
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-15cnicas de modelação molecular permitirão a substituição das diferentes estruturas primárias e secundárias para os polipéptidos do presente invento, desde que possam determinar-se estruturas terciárias equivalentes. Todas estas modificações poderão estar contempladas em certas concretizações do invento.
Outros polipéptidos que podem ser adequados para uso no invento incluem as porçOes não glicosiladas das glicoproteínas. Outros polipéptidos ou proteínas úteis, que possuem os determinantes imunogénicos necessários, incluem os polipéptidos sintéticos. Os fragmentos polipéptidicos de anticorpos e anticorpos anti-idiotipo podem também ser úteis para uso no invento assim como os polipéptidos produzidos por técnicas de ADN recombinante. Por exemplo, os genes que codificam para um polipéptido que se liga a gp41 ou ao segundo receptor podem da mesma forma ser clonados num vector de expressão ou plasmideo que possa então ser obrigado a produzir o polipéptido. As linhas celulares que contêm o vector de expressão que codifica genes para o polipéptido proporcionarão então uma fonte de polipéptido.
Alguns dos polipéptidos úteis no invento podem ser purificados por electroforese do produto da lise de células ou de ex tractos contendo os polipéptidos, com subsequente remoção dos po lipéptidos do gel de electroforese para originar polipéptidos su bstancialmente puros, a electroforese em gel e remoção dos polipéptidos dos geles é fácilmente levada a cabo usando os processos conhecidos na especialidade. Podem empregar-se outras formas de purificação quer em adição quer em substituição dos referidog, sem se sair do espírito do invento. Os polipéptidos que são imunológicamente reactivos em cruzado com uma glicoproteína possuin do um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons (gp41) que é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imu nodeficiência humana, são úteis como agentes de diagnóstico para medir os níveis de anticorpos anti-gp41 em sistemas biológicos e no soro de pacientes. Crê-se que gp41 é uma proteína envelope , , . zforsiri de virus. Os anticorpos para gp41/encontrados no soro de vários pacientes com SIDA e ARC; crê-se que a presença de anticorpos pa ra gp41 é um indicador seguro da presença do vírus nas células.
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-16 Os polipéptidos que são imunológicamente reaotivos em cru zado com uma glicoproteina possuindo um peso molecular de aproxi madamente 41 000 daltons fgp41) que ê obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana, são também úteis como age»tes para detectar a presença de detectores de pol péptidos em células hospedeiras que sejam específicas para um po lipéptido possuindo um determinante antigénico ou determinantes específicos para uma glicoproteina possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 OCO daltons que é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana, e polipéptidos esses que possuem ainda um determinante antigénico ou determinantes imunológicamente reaotivos em cruzado com pelo me nos uma glicoproteína possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 000 daltons, 45 000 daltons a 60 000 daltons, 80 000 a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons. Crê-se que a presença na superfície das células, de polipéptidos possuindo as características acima, determina a capacidade das células de se tornarem infectadas com HIV-1. As células que possuem receptores CD4 para ligar gpl20 mas que não possuem receptores de polipépti dos como descrito acima, não se tornam infectadas com HIV-1. Assim, a presença dos polipéptidos acima é um marcador para células que podem ser infectadas com HIV-1. Os polipéptidos que são imunológicamente reaotivos em cruzado com uma glicoproteína pos_ suindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons (gp4J) que é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imu nodeficiência humana, podem ser usados em processos designados para determinar a infecciosidade de células com HIV-1. Estes po lipéptidos são postos em contacto com células de teste em condiçSes seleccionadas para permitir a ligação dos polipéptidos às células deteste. Os polipéptidos que se ligaram 3s células de teste são então detectados. 0s polipéptidos podem ser marcados de forma detectável usando qualquer um dos processos conhecidos na especialidade, como enzimas, para detecção posterior com substratos cromogénicos, radiomarcadores, análises imunosorventes de enzimas lisados e semelhantes. Cs processos de detecção de in fe'c cio Sidade de células podem também combinar a utilização de
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-17 anticorpos para CD4 ou outras moléculas capazes de ligar CD4, para determinar o estado exacto de infecc iosidade da célula.
Os procedimentos convencionais de análise para detecção de antigénio, anticorpos e equivalentes marcados são adequados para uso nos processos do invento que detectam a presença de HIV
-1 em espécimes biológicos. Nas concretizações preferidas do in vento, por exemplo, os polipéptidos podem ser marcados com um 12 5 3 5 radiomarcador como I ou S para uso em análises radio-imunológicas, ou com biotina para análises de biotina-avidina ligadas. As análises de imobilização em que o polipéptido se encontra ligado a uma fase insolúvel e a detecção do vírus ou dos an ticorpos é realizada por medição da sua ligação à fase insolúvel, são também adequados para uso no invento. Estes métodos são apenas exemplares, existindo outros que podem ser úteis no invento.
Os espécimes biológicos como o sangue, soro, linfócitos, urina, tecidos, saliva, fezes e semelhantes, podem ser testados usando os métodos do invento. 0 processo particular empregue pa ra preparar um espécime para uso nos processos do invento varia rá de acordo com o tipo de espécime e a preparação pode ser fácilmente levada a cabo1usando métodos conhecidos na especialida de. A análise de produtos derivados do sangue, como as vacinas, pode também ser efectuada pelos processos do invento.
Os polipéptidos que são imunológicamente reactivos em cru zado com uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproxi madamente 41 000 daltons (gp41) que é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiência humana, podem também ser utilizados como substâncias antigénicas para a produção de anticorpos protectores contra a infecção de células por HIV-1. Assim, crê-se que a apresentação desses polipéptidos ao sis tema imune de pacientes é capaz de produzir anticorpos protecto res contra essa infecção.
Os polipéptidos possuindo um determinante antigénico ou determinantes específicos para uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons que é obtida a
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-18partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiéncia humana e que possuem ainda um determinante antigénico ou deter minantes imunológicamente reactivos em cruzado com pelo menos uma glicoproteina possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 COO daltons, 45 000 daltons a 60 000 daltons, 80 000 a 100 000 daltons ou 180 000 a 220 000 daltons que sao obtidas a partir de células HSB, ST, HeLa e humanas, são agentes úteis para interfe rir na infecção de células por HIV-1. Estes polipéptidos são postos em contacto com HIV-1 em condições seleccionadas para permitir a ligação dos polipéptidos e interferir assim na ligação do vírus às células hospedeiras. Cré-se que estes polipépti dos se podem ligar a polipéptidos imunológicamente reactivos em cruzado com uma glicoproteina possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons (gp41) que é obtida a partir de células infectadas com o vírus 1 da imunodeficiéncia humana, no meadamente gp41 na superfície de HIV-1. Desta forma, um número substancial de pontos por meio dos quais o vírus se liga às células hospedeiras estará já ocupado pelos polipéptidos do inven to e estará portanto indisponível para se ligar ao hospedeiro. Isto resultará na incapacidade total ou quase total do vírus se ligar a células hospedeiras e consequentemente na redução da ve locidade de infecção das células pelo vírus.
Uma grande gama de agentes retrovirais pode infectar hos pedeiros humanos, incluindo HIV-1 & 2, HTLV-1—4, SIV, FeLv, o vírus da leucemia bovina e muito outros. Estes vírus têm uma ca racterística comum na organização das suas glicoproteínas de membrana. Estas glicoproteínas envelope são sintetizadas como uma única unidade e são então clivadas numa glicoproteína exter na (por exemplo gpl20) e numa proteína integral da membrana (por exemplo gp41) gue actua como ancoragem para a glicoproteína externa. A interacção destas glicoproteínas envelope com ele mentos celulares determina o tecido e tropismo de espécie destes retrovírus. A natureza imunodominante da glicoproteína externa, em conjunto com a sua capacidade de ser partilhada parece desempenhar um papel importante na patogenicidade das infecções retrovirais. 0 desenvolvimento de substâncias que se ligam
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-19à proteína integral da membrana, sem interactuar com a glicopro teína externa, tem portanto a utilidade de alvejar células infe ctadas com vírus e eliminá-las sem provocar efeitos adversos em células espectadoras inocentes'·. Assim, delineia-se um método geral por meio do qual as respostas de anticorpos de indivíduos saudáveis infectados são utilizadas para desenvolver substâncias que se ligam à proteína integral da membrana em células infectadas, sem se ligarem a células não infectadas, mesmo se possuírem a glicoproteina externa na sua superfície.
Assim, os anticorpos produzidos para o péptido F56O derivado da sequência de gp41 de proteína integral da membrana de HIV-1, e preferivelmente reconhecidos por anticorpos de um individuo saudável infectado, ligam-se a células possuindo gp41 e tornam-nas alvos para lise mediada por complemento. Em contraste, os anticorpos para o péptido F160, derivado da sequência de gp]2O da glicoproteina externa de HIV-1 ligam-se a células possuindo gpl2O e tornam-nas alvos para lise mediada por complemento qualquer que seja a natureza de associação de gpl2O com a superfície da célula (isto é, quer expressa endógena ciente , quer adsor vida na superfície da célula). Espera-se que esta estratégia te nha utilidade geral no desenvolvimento de substâncias capazes de se ligar específicamente a células infectadas com retrovírus sem interactuar com células não infectadas que possuam componen tes ou receptores virais.
Para outros retrovírus, as respostas de anticorpos de in divíduos infectados que sejam saudáveis ou que doutra forma não exibam sintomas de doença associados com infecção, podem ser comparados com a resposta imune de indíviduos sintomáticos infe ctados, para determinar epitopos que sejam únicos para o indivi duo saudável infectado e não compartilhados pelo indivíduo sinto mático infectado. São sintetizados péptidos correspondentes a pelo menos uma porção do epitopo protector único. Os péptidos podem ser utilizados como vacinas para a produção de anticorpos ou em análises de diagnóstico.
A comparação das respostas imunes pode ser efectuada como aqui descrita ou por outros métodos apropriados, os péptidos de
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-20teste possuindo um comprimento de cerca de 10 a cerca de 5o ami. noácidos correspondentes a porções das glicoproteínas envelope dos retrovírus são sintetizados ou purificados a partir de fontes naturais. Os péptidos de teste são seleccionados dividindo arbitráriamente a sequência de aminoácidos da glicoproteina envelope em porções e sintetizando os péptidos correspondentes. Em alternativa, podem sintetizar-se péptidos de teste correspondentes a porções expostas da molécula ou outras regiões de interesse. Quando a sequência de aminoácidos da glicoproteina nSo está determinada, os péptidos podem ser gerados por digestão limitada da molécula que foi isolada a partir de fontes naturais. A sequência de aminoácidos dos péptidos que possuem propriedades protectoras pode ser determinada subsequentemente por técnicas convencionais.
Os péptidos de teste são utilizados para analisar o soro de indivíduos saudáveis infectados e de indivíduos sintomáticos infectados em análises de ligação para determinar a presença de anticorpos no soro que se liga aos péptidos. os resultados das análises de ligação constituem o perfil de ligação do soro. Com param-se os perfis de ligação dos soros do indivíduo saudável infectado e do indivíduo sintomático infectado. Em certas circuns tâncias poderá ser preferível utilizar o soro de diversos indiví duos sintomáticos infectados na comparação com o indivíduo saudá_ vel infectado, de forma a poder calcular-se a média das respostas imunes individuais para se utilizar uma resposta imune repre sentativa na comparação. As reactividades em ambos os soros, para o mesmo péptido, são desprezadas. As reactividades encontradas únicamente no soro de indivíduos saudáveis infectados corres pondem assim a regiões do envelope do retrovírus importantes para o desenvolvimento de imunidade protectora. Os péptidos corres pondentes a essas reactividades únicas podem então ser testados para determinar a sua utilidade para inibir a replicação virai e para produzir anticorpos capazes de se ligarem específicamente a células infectadas com retrovírus sem interactuar com célu las não infectadas que possuam componentes ou receptores virais.
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-21Os péptidos protectores do presente invento foram deriva dos de epítopos de gpl6O, a glicoproteína envelope de HIV-1 de 160 000 daltons. As regiões de gpl60 demonstraram conter sequên cias de aminoácidos que protegem células susceptíveis da infecção com o vírus ou inibem a formação de sincícios com células infectadas, quando péptidos correspondentes a pelo menos uma por ção da região são postos em contacto com células susceptíveis. Estes péptidos são apresentados na Tabela 1.
TABELA 1
Posição linear aproximada em gplóo
155-175 (F160)
265-284
3 3-351
415-430
552-575 (F56O)
Sequência de aminoácidos gly-glu-ile—lys-asn-cys—ser-phe-asn-ile— -ser-thr-ser—ile-arg-gly-lys-va1-gln-lys -glu-tyr-ala asn-gly-asn-ala-glu-glu-va1-va1-ile-arg-ser-ala-asn-phe-thr—asp-asn-ala-lys-thr -ile-ile-vai cys-asn-ile—ser-arg-ala-lys-trp-asn-asn-thr-leu-lys-gln-ile -asp-ser-lys-leu-arçr -glu-gln-phe gly-ser-asp-thr—ile-thr—leu-pro-cys-arg— -ile-lys-gln-ile-ile-asn-met-trp-gln-glu -va1-gly-lys val-gln-gln-gln-asn-asn-leu-leu-arg-ala—thr-glu-ala-gin-gln-his—leu-leu-gln-leu -thr-va1-trp-gly-ile-lys-gln-leu-gln
Os péptidos preferidos possuem uma sequência de aminoáci dos com cerca de 10 a cerca de 50 aminoácidos que correspondem a pelo menos uma porção de um epitopo protector de HIV e inibem a formaçao de sincicio de células de linfócitos humanos. Também no âmbito do invento encontram-se outras porções da molécula gpl60 que também proporcionam protecção. Deverá entender-se
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-2 2que as modificações destes pêptidos que retenham a função protectora se encontram também no âmbito do invento. Essas modif_i cações incluem pêptidos possuindo uma sequência de aminoácidos que se estenda para além da região dos pêptidos sintetizados, em qualquer direcção; pêptidos contendo sequências de aminoáci. dos correspondentes a pelo menos uma porção de duas ou mais re giões protectoras; pêptidos possuindo um ou mais aminoácidos su bstituídos com outros aminoácidos ou com outros compostos mas que mantenham ainda a função protectora; pêptidos possuindo uma molécula citotóxica, ou outra, ligada; ou qualquer combinação destes pêptidos. Adicionalmente, os pêptidos podem fazer parte de uma molécula maior, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Além disso, é contemplado pelo presente invento que as técnicas de modelação molecular permitem a substituição das diferentes estruturas primárias e secundárias dos polipéptidos, do invento, desde que se possam determinar estruturas terciárias equivalentes. Todas estas modificações poderão estar compreendidas em certas concretizações do invento.
Os pêptidos do presente invento são seleccionados por comparação dos esquemas de ligação de anticorpos de um indivíduo saudável infectado com os anticorpos de um indivíduo sintomático infectado, para determinar pelo menos uma região de ligação única para os anticorpos do indivíduo saudável infectado. Estas regiões únicas definem regiões ou epitopos protectores.
Uma vez determinadas as regiões ou epitopos protectores, preparam-se os pêptidos correspondentes a pelo menos uma porção de pelo menos uma destas regiões. Os pêptidos podem ser prepara, dos por quaisquer métodos tais como síntese com os aminoácidos apropriados e um sintetizador de pêptidos ou por técnicas de ADN recombinante, nas quais uma sequência de aDN codificando pa ra a sequência de aminoácidos é sintetizóda ou preparada a partir de fontes celulares e inseridas numa célula hospedeira apropriada para a produção do péptido. Os pêptidos de teste podem também ser preparados por síntese química, técnicas de ADN recombinante ou por purificação a partir de fontes naturais.
Para algumas concretizações do invento poderá ser preferi
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-23vel conjugar os péptidos protectores a uma proteína portadora como hemocianina de lapa. Os péptidos podem ser conjugados a proteínas portadoras por técnicas convencionais para a conju gação de proteínas. Um processo preferido para a conjugação dos péptidos à proteína portadora é o processo aqui descrito. Para este processo, adiciona-se um resíduo de cisteína à porção ami— no—terminal do péptido antes da conjugação com a proteína porta dora. Isto pode ser convenientemente efectuado por sintese química durante ou posteriormente à preparação do péptido.
Os péptidos do presente invento são úteis como reagentes de diagnóstico e vacinas. A presença dos epítopos protectores em anticorpos de pessoas infectadas com HIV é uma medida da pro habilidade dessa pessoa desenvolver sintomas de infecção virai e progredir no sentido do Síndroma da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) numa data posterior; a presença de anticorpos protectores indica uma diminuição da probabilidade dessa pessoa vir a desenvolver sintomas de SIDA. Os reagentes péptidicos de diagnóstico podem ser utilizados em imunoanálises convencionais pa ra a detecção de antigénios ou anticorpos e a presença de anticorpos protectores na amostra de teste pode ser determinada por qualquer processo adequado, incluindo radiomarcação com i ou para uso em análises radio-imunológicas, com fluoresceína para imunoanálises de fluorescência, com umaenzima para imunoanálises enzimáticas ou com biotina para análises de ligação bio tina-avidina. Estes processos são meramente exemplares e poderão utilizar-se outros processos no invento.
Por exemplo, os péptidos do invento podem ser ligados a uma fase sólida como uma placa de várias cavidades. As amostras teste suspeitas de conter anticorpos protectores contra HIV, são postas em contacto com os péptidos em condições que permitam a ligação de anticorpos protectores, presentes na amostra teste, aos péptidos. Os anticorpos protectores ligados são então postos em contacto com um anticorpo como IgG anti-humano marcado
125 com I em condiçoes que permitam a ligação do anticorpo marcado aos anticorpos protectores ligados. O marcador é então de
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-24tectado por meios auto-rad iográf ic os . A presença do radiomarcador indica a presença de anticorpos protectores na amostra teste .
Os anticorpos do invento podem ser preparados por proces sos convencionais para a produção de anticorpos mono ou policio nais. Os anticorpos policlonais podem ser produzidos por proces sos como o descrito no presente invento para a produção de antj. corpos de coelho. Para os anticorpos monoclonais, um animal, tal como um rato, é primeiramente infectado com o antigénio, as suas células do baço são removidas e fundidas com células de mieloma ( para formar cé lulas/h ibr idoma, estas últimas são clonadas num meio contendo soro e os anticorpos monoclonais são separados do me io .
Parte Experimental
Análise da Inibição de Fusão
As células Sup-Tl são preferidas como células alvo devido ao seu elevado grau de fusão celular quando co-cultivadas com linhas celulares produtoras de HIV-1. A cultura celular é efectuada de acordo com o método de Dalgleish et a 1, Nature 312:763, (1984)
As células Sup-Tl são plaqueadas em placas de 96 cavidades (IC células/cavidade,em RPMI 1640 + 10% FCS) e incubadas com ou sem diluições de soro de pacientes, soro de rato ou anticorpos monoclonais de controlo, durante 30 minutos a 37^c. Adicionam-se então células H9 Infectadas com HTLV-III B (HIV-1), 5xlO4/cavidade, e conta-se o número de células gigantes multinucleadas por 16x campos, com um micróscopio de contraste de fase de campo invertido, Zeiss, ao fim de 18 horas. Os sincícios são fácilmente identificáveis e a inibição de sincícios pelo soro dos pacientes ou antisoro antí-idiot ípico pode ser comparada com a inibição de sin cicios induzida por anticorpos monoclonais anti-CD4 .
Para a análise do soro dos pacientes, recolheram-se amostras, as quais foram directamente adicionadas a análises de sincícios como descrito acima, a várias diluições. Sm análises posteriores, as células H9 infectadas com HTLV-III B (HIV-1) foram substituídas por uma linha celular construída, não infecciosa,
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-25que expressa o envelope de CHO-HIV-1 com capacidades de fusão se melhantes è do vírus infeccioso, de acordo com o método de Sodrosfsky et al, Nature 322:470 (1986). A concentrações elevadas observou-se inibição da formação de sincícios. Em contraste, não se observou inibição da formação de sincícios a qualquer concentração quando se utilizaram anti-soros anti-id iotí picos gerados contra a imunoglobulina de pacientes com SIDA.
Os anticorpos de um paciente, H156, demonstraram inibir significativamente a formação de sincícios. Estes anticorpos foram utilizados em experiências subsequentes e foram utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo. As referências aqui efectua das a H156 referem-se aos anticorpos deste paciente que foram obtidos por meio do processo de análise descrito.
Actividade Inibidora de Sincícios
1/8 1/16 1/3 2 1/64 1/128 1/256
Proteína A O purificada fracçao 0
IgM
Soros de 0
H 156
Sor os humanos
4L normais o
4L
2M
4L
IM
O
4L
2M
IM
4L
1Ξ
2M
2M
4L
Grau de formação de sincícios
4=Total o=Iíenhum
Tamanho dos sincícios formados S=Pequeno M=Medio
L=Grande
HPLC
Cssorcsdos pac ientes forarn tota lmente dialisadcscontra tampão fosfato e submetidos a fibração em gel em colunas de cromatografia líquida de alta eficiência T0Y0SDA TSK G 4000-3000 dispo£ tas em série. As amostras foram analisadas em solução tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,2). As fracções foram analisadas a
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-260,5 ml/min durante um tempo total de 120 min. A coluna foi cali brada usando padrões de peso molecular (Sigma). Analis3ram-se fracções de 1 ml por análises de inibição de sincícios; visuaU zaram-se fracções de imunoglobulina por SDS-PAGS seguida de colo ração com azul de Commassie. As fracções IgG e IgM purificadas foram armazenadas a -7o9 até à altura da utilização. As fracções activas foram observadas em duas gamas de peso molecular aproximadas, de 17o Kd e superior a 570 Kd. Quando combinado com os da dos da análise de inibição de sincícios acima, este fraccionamen to de tamanho sugere actividade de inibição de sincícios segrega da nas gamas de peso molecular de IgG e IgM. A electroforese em
SDS - gel de poliacrilamida das fracções testadas revelou a pre.de sença de bandas/IgM, características da imunoglobulina, a pesos mo leculares superiores a 590 Kd e igG em fracções de 170 Kd, que suportam esta interpretação. A maior inactividade foi encontrada na fracçâo IgG.
Cromatografia de Afinidade
Para demonstrar adicionalmente que a actividade anti-s incícios era mediada por IgG, purificaram-se fracções de imunoglo bulina por cromatografia de afinidade em leitos de proteína a agarose (Sigma). Cs anticorpos purificados pela proteína A media ram significativamente a actividade anti-sincícios, enquanto os materiais que nao ligam a proteína a apresentaram pouca activida de .
Produção de Anti-soro Anti-idiotipico
Inocularam-se subcutaneamente ratos Balb/c, femêa, com 8 a 10 semanas de idade com 100 /Ag de IgG H156 purificado com pro teina A ou IgG de um paciente com SIDA emulsionado em adjuvante completo de Freunds. Após a imunização inicial, os ratos foram inoculados bimensalmente com 100/Ag de anticorpo emulsiônado em adjuvante incompleto de Freunds. Uma semana após a quarta e subse quentes inoculações, os ratos foram sangrados através das veias da cauda e guardou-se o soro para análise. 0 soro recolhido foi ex tensivamente absorvido em colunas de anticorpos humanos HIV Ab ne gativas antes de serem filtradas assépticamente e reconcentradas
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-27aos seus volumes originais. As amostras absorvidas foram armaze nadas como amostras pequenas a -7oeC até à análise.
Purificação dos Soros
Os anticorpos do soro foram purificados a partir de fluído ascitíco' con hihrldoma por precipitação sequencial com sulfato de amónio e cromatografia sobre proteína A-sejharose(Sigma). 0 so ro foi levado gradualmente a uma concentração de 50% de sulfato de amónio,pela adição de um volume igual de sulfato de amónio S£ turado, a 4ec com agitação. A solução foi agitada durante mais 60 minutos para permitir a precipitação completa das imunoglobulinas. 0 precipitado foi recolhido por centrifugação a 15 000 xg durante 15 min, e re-suspendido em solução salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 188 mM, PO^ 10 mM, pH 7,2). A solução de imunoglobulina resultante foi dialisada durante 24 h contra PBS com pelo menos três mudanças. O sulfato de amónio isolado foi então clarificado por centrifugação e passado sobre uma coluna de proteína A—sepharose. A coluna foi lavada com solução salina normal até o OD28o do filtrado ser inferior a 0,1. A imunoglobulina ligada foi então eluida com MgCl2 3,5 M. As fracções relevantes fo ram agrupadas e dialisadas extensivamente contra uma solução salina normal e em seguida PBS e filtradas através de um filtro de 0,45 /Am. A solução de anticorpos foi concentrada usando um concentrador Amicon sob pressão reduzida e a concentração de prote í^ nas foi determinada usando um Protein Assay Kit (BioRad Labs, Richmond, CA).
Citometria de Fluxo
Removeram-se células de uma cultura de tecido e lavaram-se duas vezes em meio FACS (solução de sal equilibrada de HanK (Gibeo) suplementada com 2% de soro bovino fetal, 0,2% de azeto de sódio e Hepes 10 mM). Incubaram-se 1x10 a 1x10^ células em 0,1 ml de meio FACS com anticorpos ou sobrenadante de controlo num volume de 0,1 ml durante lh a 4 sc . As células foram diluídas em 2,5 ml de meio FACS, pelotizadas por centrifugação a lOOOxg e lavadas duas vezes com 2,5 ml de meio FACS por lavagem. Após a la. vagem final, a pelota de células foi suavemente re-suspendida e
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-28de coelho as células incubadas com 0,1 ml de igG anti-rato/conjugada com FITC (reactivo com cadeias leves e pesadas de anticorpos, Laboratórios Miles) diluídas a 1:20 - 1:50 em meio FACS durante Ih a 4ec. As células foram diluídas e lavadas tal como após a primeira incubação. A pelota de células foi finalmente re-suspendi da e as células fixadas em 0,5-1,0 ml de paraformaIdeído-PBS a 2% As amostras foram analisadas num Becton Dickinson FACS TV. Anali. saram-se em rotina 20 000 células por amostra. A fluorescência específica foi quantifiçada, subtraindo o canal de fluorescência média de células coradas apenas com imunoglobulina de coelho, anti-rato conjugado com FITC (controlo negativo) do canal de fluores cência média de células coradas com anticorpos específicos e em seguida com imunoglobulina de coelho, anti-rato conjugado com FITC (coloração positiva).
As linhas de células CD4+, Malt4 e SupTl, demonstraram am bas fortes reactividades específicas com anti-Hl56. Em adição, linhas de , as/celulas humanas incluindo HSB (American Type Culture Collecti on número CCL120.1), uma linha de células de CD4-T, mostrou também ser reactiva. isto demonstra que o determinante reconhecido pelo soro anti-idiotipico não é CD4 . Para determinar se o esquema de reactividade do anti-soro anti-idiot ipo era semelhante ao tropi£ mo da espécie de HIV referida, a ligação do soro anti-Hl56 a células de murídeos foi examinada. Observou-se uma reactividade des. prezsvel (Figura 1). A absorção com células L de murídeo antes da coloração de linhas de células humanas e outras linhas de célu las de murídeo removeu toda a reactividade para as células de murídeo, sem afectar a reactividade para as células humanas. Quando a experiência foi efectuada com o anti-soro anti-idiotípico gerado pela imunoglobulina agrupada da SIDA não se observou coloração das linhas de células humanas ou de murídeo. C esquema de reactividade superficial do anti-soro anti-Hl56 parece ser devido a com ponentes das linhas de células humanas examinadas e distinto do receptor CD4 de HIV-1. Esta estrutura correlaciona-se com o tropismo de espécie referido para HIV-1 na indução da formação de sincícios produtivos.
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-29Esguema de Imunoprecipitação
As linhas de células foram pré-cultivadas em metionina e cisteína livre RPMI (Gibco) + 10% de FCS dialisado e marcadas du 3 5 3 5 rante 16 horas com meios suplementados com S-cisteína e S-metionina (100/ACi/ml) e prepararam-se e pré-aclararam-se lisados como descrito em Sodrosfsky et al, Nature 3 22 :470 (1986). Adicionaram-se porções (200/11) de lisados aclarados a 20/Λ1 de leitos Proteina A-agarose pré-incubados com soro e feitos rodar durante 3 horas a 4sc. Os leitos foram lavados sequencialmente em tampão de lise (LB); LB contendo NaCl 0,5 M; e LB com dodecilsulfato de sódio (DSS) a 0,1%. 0 material adsorvido é eluido por aquecimento a 1009C durante 3 minutos em 5/1.1 de tampão de amostra / tris 0,01 M, pH 8,0, contendo DSS a 2%, 2-mercaptoetanol a 5% (em volume), azul de bromofenol 25/Ag/ml e glicerol a 10% (em volume )_27/ θ é analisado em DSS-PAGE a 7,5%. Os geles são então fixados, secos e auto-rediograf ado a -705 em filme XAR (Kodak).
Para a imunoprecipitação competitiva das glicoproteinas en velope de vírus o procedimento básico foi modificado. O IgG H156 purificado com proteina A foi acoplado a sepharose CnBr 4B de acordo com as instrucções do fabricante (Sigma). Pré-incubaram-se 40/1.1 de leitos H156 (aproximadamente 3 2/Ag de K156 baseado em 80% de eficiência de acoplamento) a 372C durante 30 minutos num aparelho rotativo circular com 50yuLL dos seguintes reagentes (veja-se figura 2): nada (lamela 1), soro H156 (lamela 2), soro normal de rato (SNR) (lamela 3), soro de rato anti-pAlg (lamela 4) ou soro de rato anti-H156 durante 30 minutos num aparelho rotati vo circular. O soro foi então arrefecido em gelo durante 15 minu tos e adicionaram-se contagens iguais de lisados celulares pré3 5
-aclarados marcados com S-met a cada tubo de teste Eppendorf, precipitando-se como descrito em Sodrosfsky et al., Nature 322: :47o (1986) que é aqui incorporado em referência.
Os anticorpos anti—idiotípicos bloquearam a capacidade dos anticorpos H156 para precipitarem gp!60 mas bloquearam apenas minimamente a imunoprecipitação de gpl20. Em contraste, o an ti-soro anti-idiotípico agrupado de pacientes com SIDA não exibiu
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-30bloqueamento total de nenhuma das proteínas (figura 2). Este re sultado suporta os dados de imunomancha competitiva, no facto de a resposta anti-idiotípica predominante ser dirigida con tra anticorpos específicos para gp41. Os estudos corroboram tam bém as observações préviamente publicadas, como as de McCune et al., Cell 53:55, (1988) de que os epitopos do gpl20 livre e de gpl20-gp41 (gpl60) covalentemente ligados nao são idênticos.
Enquanto o soro H156 bloqueia toda a reactividade das gli coproteínas envelope de HIV-1, gpl60 e gpl20, NMS não exibe capa cidade de bloqueamento e anti-pAlg exibe a capacidade de bloquear parcialmente as reactividades de gpl60 e gpl20. 0 soro de rato anti-H156 bloqueia parcialmente a reactividade de gp!20 mas bloqueia específica e repetidamente toda a reactividade de H156 com a proteína percursora da glicoproteina envelope de gpl60.
Doze em doze ratos imunizados com H156 produziram esta idên tica resposta imune dominante, suportando a observação de um idiotipo dominante no soro H156 dirigido para gp41. Este resultado suporta os dados de imunomanchas competitivas no sentido de a respos ta anti-idiotípica predominante ser dirigida contra anticorpos específicos para gp41.
I mun orna nch as
As linhas de células produtivamente infectadas com HIV-1 são lisadas em tampão de lise (tris 0,02 M e NaCl 0,12 M, pH 8,0 com fluoreto de fenetilsulfonilo 0,2 mH, EGTA 0,2 mH, NaF 0,2 mM, 5/Xg/ml de aprotinina, desoxicolato de sódio a 0,2% e 0,5% em volume de Nonidet P-40). Cs lisados são levados à ebulição durante 5 minutos em DSS a 3% e aproximadamente 15/Xg de proteína por lamela são separados em 1C% de DSS—PAGE, electrotransferidos para nitrocelulose e feitos reagir com soro ou antPsoro de controlo. Para a análise Western competitiva os filtros electrotransferidos foram feitos reagir com imunoglobulina agrupada de paciente com SIDA em soro de controlo, a uma concentração de 1 mg/ml e após uma pre-incubação de 30 minutos 5o ng de H156 marcado com i de IgG ou IgM purificados foram adicionados e deixados incubar duran te mais 1 hora com agitação a 25^0. Após lavagem extensiva, a man
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-31cha foi exposta a filme autoradiográfico XAR (Kodak) a -70^C du rante 24 horas. As bandas relevantes foram submetidas a detecção por densitometria para quantificação da reactividade especí fica com a glicoproteína envelope do vírus, gp41 ou gpl2C.
A maior parte da reactividade para gpl20 foi inibida por pré-tratamento da nitrocelulose com imunoglobulina agrupada de pacientes com SIDA. Sm contraste, permanecia uma reactividade si gnificativa para a glicoproteína envelope gp41 após a sua ligação a imunoglobulina agrupada de pacientes com SIDA. Isto reflec te a reactividade de H156 com epitopos únicos expressos em gp41. Estas reactividades não estão presentes em quantidades significa^ tivas no soro agrupado de pacientes com SIDA.
Produziu-se uma redução de 95% na reactividade para gpl2O por pré-tratamento da nitrocelulose com imunoglobulina agrupada de pacientes com SIDA (pAig). Em contraste, permanecia 90% da rea ctividade para a glicoproteína envelope gp41 após bloqueamento com pAIg. Isto reflecte a reactividade de H156 com epitopos únicos expressos em gp41.
Análise radio-lmunológica
A análise radio-imunológica (ARI) do anticorpo anti-idiotípico foi efectuada de acordo com o procedimento de Burnstin et a 1. , Virology 117 :14 6, (1986). A análise ARI demonstrou respostas específicas contra as imunoglobulinas imunizantes com ligação miníma â imunoglobulina humana normal (figura 3). O anti-H156 de rato foi comparado com anti-pAig de rato (imunoglobulina agrupada de pacientes com SIDA) e com soro normal de rato (SNR) em relação à ligação específica de idiotipos a H156. Tanto o anti-H156 como o anti-pAlg demonstraram uma ligação específica a pAIg consisten te com a presença de idiotipos comuns em pAIg e H156, relevantes para a exposição a HIV-1. No entanto, o anti-Hl56 demonstrou uma actividade de ligação idiotípica específica a H156 muito maior que o anti-pAlg, enquanto que o SNR apresentou uma ligação desprezável a qualquer uma das imunoglobulinas. Estes resultados demonstraram a natureza anti-idiotípica do anti-Hl56 bem como a presença de idiotipos particulares no soro de H156 que não estão
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Ref: UPN-207 (Portugal)
-3 2representados no soro de pAlg.
Caracterização do Receptor da Célula Hospedeira (Segundo Receptor)
As linhas de células (HSB humanas (American Type culture
Collection numero CCL12O.1), ST e HeLa (American Type Culture Col lection numero CCL2) e células T de murídeo e células NIH 3T3) são pré-cultivadas em RPMI (Gibco) livre de metionina e cisteína + 10% de FCS dialisado e marcadas durante 16 horas com meio su3 5 3 5 plementado com S-cisteína e S-metionina (100/LCi/ml) e os li. sados foram preparados e pré-aclarados como descrito em Sodrosf£ ky et a 1.,Nature 322:470 (1986). Adicionaram-se porções (200/11) dos lisados aclarados a 2 0/Xl de leitos de Proteína A-Agarose pré -incubados com soro e girados durante 3 horas a 4ec. Os leitos são lavados sequencialmente em tampão de lise (LB); LB contendo NaCl 0,5 M; e LB com 0,1% de dodecilsulfato de sódio (DSS). 0 material adsorvido é eluído por aquecimento a looec durante 3 minutos em 50/11 de tampão de amostra /2~tris 0,01 M, pH 8,0, contendo 2% de DSS, 5% de 2-mercaptoetanol (em volume), azul de bromofenol 25/lg/ml, e 10% de glicerol (em volume)^/ e analisado em DSS-PAGE a 7,5%. Os geles são então fixados, secos e auto-radiografa dos a -702 em filme XAR (Kodak).
Como mostrado na figura 4, o anti-Hl56 imunoprecipita específicamente, a partir de células humanas e não a partir de células de murídeo, diversos polipéptidos incluindo uma banda maior a 25-35 Kd, bem como bandas menores a 45-60 Kd, 80-100 Kd e 180220 Kd.
Péptidos Protectores
PÉPTIDOS Os péptidos foram sintetizados pelo Laboratório de
Uuimica Proteica da Universidade de r-ensilvânia usando técnicas convencionais. Os resíduos aminoterminais de cisteína foram adicionados à sequência de alguns dos péptidos durante a síntese pa. ra acoplamento às proteínas. Os péptidos foram purificados e con jugados com hemocianina de lapa (HL) pelo processo seguinte. A 15 mg de hemocianina de lapa (HL, Sigma) em 1 ml de bicarbonato de sódio 1 mM adicionaram-se 5 mg de suifo—MBS (Pierce). Após
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Ref: UPN-207 (Portugal)
-3 3trinta minutos à temperatura ambiente a HL foi separada do exces so de sulfo-MBS por filtração em gel em Sephadex G50. Adicionaram-se cinquenta mg do péptido em 1 ml de bicarbonato de sódio à HL e deixou-se reagir durante mais 3 horas. O conjugado macro molecular foi separado do péptido não conjugado por filtração em gel em Sephadex G5C. 0 conjugado péptido-HL foi suspendido em solução salina tamponada com fosfato (fosfato de sódio 20 mM, NaCl 154 mM, pH 7,2) numa concentração de 1 mg/ml.
PACIENTES H156 representa o soro de um indivíduo infectado com t
HIV-1 que era as sintomático e que demonstrava um grau caracteristicamente elevado de actividade inibidora de sincícios em diversos espécimes isolados de HIV-1, Weiner et a 1., 1989. As moléculas não-CD4 em células humanas são importantes na entrada de HIV-1 nas células. Vaccines 89 Cold Spring Harbor Laboratories, CSH,
N.Y. 115-120.
DETERMINAÇÃO DE EPÍTOPOS: Utilizou-se H156 para obter IgG purifj. cado e radio-iodou-se directamente como em Williams et a 1,, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:6488 C1988). As placas de análise radio-i munológica foram revestidas com diversos péptidos derivados da sequência gpl60 de HIV-1, incluindo os péptidos apresentados na Tabela 1 e a ligação de IgG de H156 radio-iodado purificado, a e£ tes péptidos foi efectuada como descrito em Williams supra.
Escolheram-se vários péptidos para estudo adicional com base na capacidade de H156 para ligar estes péptidos a um nível muito superior ao do IgG do IgG de controlo de pacientes com SIDA preparado da mesma forma. Estes são detalhados na Tabela 2. Dois destes péptidos foram designados por F160 (comportando a sequência de resíduos 150-170 de gplôo) e F56O (comportando a sequência de resíduos 550-570 de gpl60) (veja-se a Tabela 1).
IMUNIZAÇÃO: Injectaram-se subcutaneamente ratos NZW com 50-100/lg de conjugado péptido-HL ou péptido não conjugado emulsionado com 50-100/11 de adjuvante completo de Freund. Após duas semanas, os ratos receberam uma injecção semelhante usando adjuvante incomple to. Efectuaram-se mais injecções de reforço com duas semanas de intervalo usando 50 Ltg do conjugado sem adjuvante. 0 soro foi obti
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Ref: UPN-207 (Portugal)
-34do a partir de animais imunes após a terceira inoculação de reforço e foi utilizado sem inactivação por calor.
soro foi obtido uma semana após a quinta injecção e foi testado para anticorpos anti-péptidos usando uma análise radio-imu nológica de fase sólida. Para esta análise, secaram-se 25yjg de péptido em 50/jl de água para cada cavidade de uma placa de micro título de cloreto de polivinilo com 96 cavidades. Adicionou-se uma solução de albumina de soro bovino (20 mg/ml) em solução sali. na tamponada com fosfato contendo 0,1% de azeto de sódio, para preencher cada uma das cavidades. Estas placas foram armazenadas a 4?c até ao momento de utilização. Os soros pré-imunes e imunes de cada rato foram diluídos em tampão contendo albumina e adicionados às cavidades drenadas, as placas foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente e as cavidades foram então lavadas com solução salina tamponada com fosfato. Adicionaram-se cadeias leves de /~125l~7-cabra anti-rato (40 OOO cpm/cavidade, Southern Biotechnology Associates, iodadas usando uma modificação do méto do da cloramina T como descrito em Hunter e Greenwood, (1962) Na ture 194 :4 95-4 96) em lOC/jl de solução salina tamponada com fosfato contendo albumina de soro bovino, a cada cavidade e incubou -se durante duas horas a 373c. A placa foi então lavada várias vezes com água e a radioactividade em cada cavidade foi determinada num contador gama automático.
CITOFLUORIMETRIA: A capacidade do soro de coelho imune, para corar células portadoras de gpl20 e gpl60 foi determinada por citofluo rimetria como descrito em Williams et a 1., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 85:6488 (1988). Os soros dos coelhos foram utilizados nas dilui_ ções 1:10 a 1:100. A coloração positiva foi determinada por % po sitiva ou /10 ou Δ fluorescência média do canal /8.
LISE DAS CÉLULAS: As células foram lisadas por anticorpos e complemento de tratamento como descrito em Williams et a 1., ( 1987)
The Cellular Basis for the la restrictions in murine experimental autoimmune thyroiditio, Cell. Immunol. 110:35-45. O anti-so ro dos coelhos foi utilizado nas diluições 1:2-1:128. Os considera dos positivos lisaram as células a diluições de pelo menos 1:16.
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Ref: UPN-207 (Portugal)
-3 5A lise das células foi determinada por visualização directa e contagem de células. A lise foi considerada presente se se elimi nassem mais de 90% das células originalmente presentes na amostra .
Coloração e Lise de Células por Soro de Ratos Imunes
Para construir células comportando gpl20 mas sem gp41, os sobrenadantes da cultura de células CH0/gpl60, que libertam gplóC foram incubados com células H9, que comportam grandes quantidades de CD4 . As células foram lavadas e utilizadas na lise celular e nas análises de citofluorimetria aqui descritas.
CÉLULAS: As células de ovário de criceto chinês (CHO) e as células CHO que são infectadas com e expressam o gpl60 de HIV-1 (CHO/ /gpl60) foram descritas em Weiner et al,, 1989. As moléculas não -CD4 em células humanas têm importância na entrada de HIV-1 nas células. Vacclnes 89. Cold Spring Harbor Laboratories, CSH, N.Y., 115—120. H9 é uma linha de células T humanas que expressa grandes quantidades de moléculas CD4. Todas as células foram feitas crescer em RPMI 1640 com adição de penicilina/estreptomicina, L-gluta mina e 10% de soro fetal de bezerro (meio de cultura).
PREPARAÇÃO DE SOBRENADANTE CONTENDO gp!20: As células CH0/gpl60 foram seleccionadas para a secreção de grandes quantidades de gpl20. Estas células foram feitas crescer em meio de cultura até uma densidade de células elevada, os sobrenadantes foram recolh_i dos, centrifugados e filtrados, através de um filtro 0,45 antes de serem utilizadas.
Comparando os resultados obtidos usando estas células com os resultados de células CH0/gpl60 e H9 infectadas com HTLV-IIIb, Weiner et al., 1984 foi possível distinguir a ligação e lise por gp!20 e gp41 às moléculas não-CD4 em células humanas importantes para a entrada de HIV-1 nas células. Vacoines 89. Cold Spring Har bor Laboratories, CSH, N.Y. 115-120. Os resultados são apresentados na Tabela 2.
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Ref: UPN-207 (Portugal) —36 —
TABELA 2
| COLORAÇÃO | E LISE DS LINHAS CELULARES POR | SORO DE | ||
| COELHO | IMUNE | |||
| Linha Celular | Anticorpo | para : | Complemento | Citometria de |
| Lise Mediada | Fluxo Colora- | |||
| ção | ||||
| CHO | F56O-KLH | - | — | |
| CHO | F160 | - | — | |
| H9 | F560-KLH | - | - | |
| H9 | F160 | — | - | |
| Η9+ΟΡ1203 | F56O-KLH | - | - | |
| H9+GP12O | F160 | + | + | |
| CHO/gpl6O | F56O-KLH | + | + | |
| CHO/gpl6O | F160 | + | + | |
| H9/lllb | F56O-KLH | + | + | |
| H9/lllb | F160 | + | + |
acélula H9 incubada com sobrenadante de cultura de células CH0/gpl6 contendo gpl2O.
^células H9 infectadas com o espécime HTLV-IIIb isolado de HIV-1.
Como apresentado na Tabela 2, os anticorpos para o péptido F56O acoplados com KLH não provocam lise das células H9 que foram pré-incubadas com o sobrenadante da cultura de células CHC/gpl6C contendo gpl2O, enquanto que os anticorpos para o péptido F160 se ligam a estas células. Este resultado indica que estes anticorpos anti-F560-KLH são específicos para uma região de gpl6O que se tor na gp41 e que o péptido F56O define um epitopo de gp41. Cs anticorpos anti-F160 são específicos para uma região de gpl6O que se torna gp!2O e o péptido define assim um epitopo de gp!2O.
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Ref: UPN-207 (Portugal)
-37Signif içado
Um componente estrutural importante dos vírus HIV é a mole cuia que abrange toda a membrana, gp41. Durante a replicação virai, a proteína envelope de HIV é sintetisada como uma grande uni dade, denominada gpl6O, que ê subsequentemente clivada em gpl2O e gp41. Gpl2O forma a glicoproteína exterior da membrana de HIV enquanto gp41 permanece ancorada na membrana actuando como ponto de ancoragem ao qual se liga gpl2O. Enquanto ypl2O pode ser libertada para o meio gp41 permanece ancorada na membrana do vírus ou da célula infectada. É importante notar que a sequência do epitopo definido por F560 é completamente coberto em todas os espécimes de HIV-1 isolados até à data. Espera-se que existam regiões análogas presentes noutros retrovirus.
Obteve-se soro com actividade,potente,inibidora da formação de sincícios,a partir de um indivíduo saudável infectado com HIV-1. Colocou-se a hipótese de esta resposta individual de ant_i corpos reconhecer regiões do envelope de HIV importantes no desen volvimento de imunidade protectora. Comparando este perfil de anticorpos individuais para a ligação a péptidos derivados de gpl6O com o perfil de anticorpos de indivíduos sintomáticos com HIV-1, os requerentes dc presente invento conseguiram detectar reactividades únicas para diversas regiões peptídicas. Estas incluem os aminoácidos 150-170 de gpl60 (contidos em gpl20) e os aminoácidos 550-570 de gpl60 (contido em gp41). Os requerentes imunizaram entSo coelhos com estes péptidos (quer não acoplados ou acoplados a KLH) e testaram os seus anti-soros em relação à ligação a gpl20/ /gp41 e em relação à sua capacidade de lisar células portadoras de gpl20 e/ou gp41. Os anticorpos específicos para os péptidos li garam-se a gpl20/gp41 e mostraram poder lisar as células portadoras de gpl20 e/ou gp41. 0 péptido correspondente aos aminoácidos 550-570 de gpl60 (F56O) que está contido em gp41 é especialmente útil porque define um epitopo em gp41, a proteína integral de mem brana de HIV-1. gp41 não é libertado pelo vírus ou pelas células infectadas mas permanece ancorado na membrana. Os anticorpos espe cíficos para o péptido F56O ligam-se a gp41 em células infectadas, iniciando a lise mediada por complemento, da célula infectada. Os
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Ref: UPN-207 (Portugal)
-38anticorpos específicos para o peptido F56O nSo se ligam a célula nao infectadas que expressam os receptores CD4 que possuem gp!20 ligado, poupando assim as células espectadoras inocentes da li se .
Claims (12)
1 - Processo de preparação de pêptidos biologicamente acti vos caracterizado por compreender os seguintes passos:
(a) testar o soro de pessoas infectadas pelo vírus da imu nodeficiência humana para determinar a presença no soro de anticorpos neutralizantes possuindo pelo menos um péptido compreendendo uma determinante, ou determinantes, antigénica especifica pa ra uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamen te 41.000 daltons, a qual é obtida a partir de células infectadas com o vírus-1 da imunodeficiência humana e possuindo ainda uma de. terminante antigénica, ou determinantes, imunologicamente de reac. ção cruzada com pelo menos uma glicoproteína possuindo um peso mo lecular de 25.000 a 35.000 daltons, de 45.000 daltons a 60.000 daltons, de 80.000 a 100.OCO ou de 180.000 a 220.000 daltons, sen do a referida glicoproteína obtida a partir de células HSB, ST,
HeLa e humanas;
(b) purificar o referido péptido do referido anticorpo ne utr a 1 iz a nte .
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por compreender ainda os passos de:
(a) preparar anticorpos utilizando o péptido da reivindicação 1, (b) testar os referidos anticorpos para identificar anticorpos possuindo um péptido compreendendo uma determinante antigénica, ou determinantes, imunologicamente de reacção cruzada com determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 41.000 daltons, e determinantes de uma glicoproteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 160.000 dal. tons, sendo cada uma das referidas glicoproteínas obtidas a partir de células infectadas com o vírus-l da imunodeficiência huma na ;
(c) purificar o referido péptido do referido anticorpo.
3 - Processo para a detecção da presença do vírus da imu69 174
Ref: UPN-2C7 (Portugal)
-4 0nodeficiência humana 1 em espécimes biológicos suspeitos de conter o vírus, caracterizado por compreender:
o contacto do espécime biológico com um polipéptido possu indo um determinante ou determinantes antigénicos específicos pa_ ra uma glicoproteina possuindo um peso molecular de aproximadamente 41 000 daltons, sendo a referida glicoproteina obtida a par tir de células infectadas com o vírus da imunodeficiência humana 1, possuindo ainda o referido polipéptido um determinante ou determinantes antigénicos imunologicamente reactivos em cruzado com pelo menos uma glicoproteina possuindo um peso molecular de 25 000 a 35 000 daltons, de 45 000 daltons a 60 OCO daltons, de 80 000 daltons a 100 000 daltons ou de 180 000 a 220 000 daltons, sendo as referidas glicoproteínas obtidas a partir de células HSB, ST, HeLa e humanas, em condições seleccionadas para permitir a ligação do polipéptido ao vírus no espécime biológico; e a detecção do polipéptido.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido polipéptido estar marcado de forma detectável.
5 — Processo para o desenvolvimento de péptidos biologica mente activos, caracterizado por compreender os passos de:
(a) obter anticorpos de um indivíduo saudável infectado com um retrovirus;
(b) obter anticorpos de um indivíduo sintomático infectado por um retrovirus;
(c) comparar os esquemas de ligação dos referidos anticor pos para determinar pelo menos uma região de ligação característica dos anticorpos do indivíduo do passo (a); e (d) sintetizar um péptido correspondente a pelo menos uma porção da referida região de ligação característica.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do por o referido passo de comparação compreender:
(a) obter pelo menos um péptido de teste derivado de uma sequência de aminoácidos de um componente do referido retrovirus;
69 174
Ref: UPN-207 (Portugal) —41 — (b) pôr em contacto anticorpos do referido indivíduo infe ctado saudável e do referido indivíduo infectado sintomático, com pelo menos um dos referidos péptidos de teste para determinar a presença de anticorpos que se possam ligar com pelo menos um dos referidos péptidos de teste; e (c) comparar os resultados do passo (b) para o referido indivíduo infectado saudável e para o referido indivíduo infect£ do sintomático, para determinar pelo menos uma região de ligação característica dos anticorpos do referido indivíduo infectado sau dável.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido retrovírus ser uma estirpe do vírus da imunodeficiência humana, do vírus linfotrópico das células T humanas, do vírus da imunodeficiência dos símios, do vírus da leucemia felina, ou do vírus da leucemia bovina ou retrovírus relacionados.
8 — Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do por o referido retrovírus ser o vírus da imunodeficiência humana e por o referido antigénio ser o gpl6O.
9 — Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do por o referido antigénio ser uma proteína completa da membrana do referido retrovírus.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida proteína completa da membrana ser o gp41 do vírus da imunodeficiência humana 1.
11 - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o péptido obtido possuir uma sequência de aminoácidos de cerca de lo a cerca de 5o aminoácidos que corresponde a pelo menos uma porção de um epítopo protector de HIV e inibe a formação sincitia de células linfócitas humanas.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracteri zado por o péptido ser seleccionado entre o grupo constituído por:
gly-glu-ile-lys-asn-cys-ser—phe-asn-ile-ser-thr-ser-ile-arg-gly-lys-va1-gln-lys-glu-tyr-ala;
69 174
Ref: UPN-207 (Portugal)
-4 2asn-gly—asn-ala-glu-glu-va1-va1-ile-arg-ser—ala-asn-phe-thr-as p-asn-ala-lys-thr-ile-ile-va1;
cys—asn-ile —ser-arg-a la-lys —trp—as n-asn—thr—leu—lys-gIn—ile-asp-ser—lys-leu-arg-glu-gln—phe;
gly-ser-asp-thr-ile-thr-leu-pro-cys-arg-ile-lys-gln-ile-ile-asn-met-trp-gln-glu-val-gly-lys; e va1-gln—gln-gln-asn-asn—leu—leu-arg-ala-thr-glu-ala-gin— -gln-his-leu-leu-gln-leu-thr-va1-trp-gly-ile-lys-gln-leu -gin; e pêptidos contendo essas sequências.
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Effective date: 19940316 |
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