PT89656B - Processo para a preparacao de suplementos de pigmentacao para composicoes deracoes para animais - Google Patents

Description

TITULAR: MICRÓBIO RESOURCES, 1NC.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE SUPLEMENTOS DE PIGMENTAÇÃO PARA CCMPOSIÇOES DE RAÇÕES PARA ANIMAIS

MEMÓRIA DESCRITIVA ¹· Çômpo_da_2Nvençao

A presente invenção refere-se, de um mo do geral, a suplementos de pigmentação para composições de rações para animais, e mais particularmente à utilização de a 1ga Haemato coccustriturada, como um suplemento de pigmentação nas compo-

s i ções para

rações de animais aquáticos e outros animais.

,· -* ’’ ’
A	cultura de ani ma i s ma rinhos, incluindo peixes,
crus táceos ,	e aná1ogos,tornou-se progressivamente importante

com a colheita excessiva nos habitats marinhos naturais, e o a ume nto do cons umo mu ndia'1 destes ani ma i s . Como esta cultura é tipicamente realizada em áreas limitadas, tais como tanques isolados e estuários, e com elevadas densidades de população, é necessário proporcionar fontes alimentares artificiais para

sup1emen t o,

sejam quais forem as fontes de alimentação na tu-

rais que possam estar presentes. Na medida do possível, as fontes de alimentação artificiais devem imitar as fontes de alimentação naturais, de modo que o produto animal cultivado se assemelhe de modo muito aproximado ao produto animal de colheita no rma 1 .

A presente invenção está relacionada principal me nte com um aspecto de tais fontes de alimentação artificiais, isto é, a provisão de uma fonte de pigmentação para animais naturalmente pigmentados tais como salmão, truta, camarão, lagosta, frangos e análogos. Esses animais, que geralmente têm

p i gme n t a ç ã o ama rela,	laranja e	vermelha, derivam	na	sua pi	ιgme n-
tação natural de uma	var iedade	de carotenóides, tai	s como	beta-
-caroteno, cantaxanti	na , zeaxan t	ina, astaxantina,	é s	ter de
astaxantina, e análogos.

das de p i gme n t a ç ã o n uma larga mu ι tas vezes sem a necess biologicamente, a astaxant tenó i de .

A astaxantina e

fontes de alímentação

d e i	nteresse particular na preparação
a r t i	f i c i a	1 proporcionando uma fonte
va r i	edade	de animais aquáticos,
dade	para	o anima 1 de converter,
i na	em qualquer outra forma de caro-

Embora as astaxantinas sejam altamente bem sucedidas em proporcionar uma pigmentação de aparência natural numa grande variedade de ani ma is, as astaxantinas naturais estão limitadas em disponibilidade, e as astaxantinas sintéticas são difíceis e dispendiosas quanto à sua preparação. Será portanto desejável proporcionar supl eme ntos de ração contendo astaxantina que podem ser produzidos em grandes quantidades a um custo relativamente baixo. Tais suplementos de ração devem ser eficazes no aumento da pigmentação do animai que recebe o suplemento, isentos de toxicidade, e armazenáveis durante períodos de tempo relativamente longos.

. DESÇRJ_ÇAO_DA_TÉÇN 1 ÇA_ANTERjOR

Simpson et al. (1981), em Carotenoid as Colorants and Vitamin A Precursors (Carotenóide como Precursor de Corantes e de Vitamina A) (Bauernfiend, ed.), páginas 463-538, Academic Press, Nova Iorque, N. I . , faz referência à incorporação de vários carotenóides, incluindo astaxantinas, em rações para peixes a fim de aumentar a pigmentação. Nakazoe e Hata (1978) Proc. Jpn. Soc. Sei. Fish., 53? Meet-, Tóquio, Abstract N2.558 (citado em Simpson et al. na pág.528), descreve a alimentação de Ήaematococcus tratado por pressão com ce1u1 ase, para aumentar a coloração de Chrysophyrs major. Embora um aumento na coloração vermelha seja referido, os autores notaram que o método de tratamento com Haematococcus exige aperfeiçoamento. Pringsheim (1966) Phycol. 2:1-7, descreve as exigências nutricionais de Haematococcus pluvialis. Droop (1955 ) Arkiv. fur Mikrobio 1ogie 21:267- 272, descreve os factores que controlam o enquistamento em Haematococcus pluvial is. A bioss íntese de carotenóides por Haema tococcus pluvial is é discutida em Goodwin e Oamikorn (1954) J.Biochem. 57:376-381; Droop (1955) Nature 175:42; e Donkin (1976) Phytochemistry 15:711-715.

SUMÁR.IO_DA__INVENÇAO

De acordo com a presente invenção as composições de

s up1emen to	de pigmentação compreendem a a 1ga Haematococcus
tr i turada,	preparada por moedura de Haematococcus seco,en-
quistado a	temperaturas criogénicas, até um tamanho de parti-

cuia médio abaixo de cerca de 10 As partículas trituradas serão usualmente tratadas para impedir a degradação por combinação com um anti-oxidante ou por vários processos de revestimento, -tais como revestimento por gel, micro-encapsulamento, revestimento por óleo, e análogos. Tais composições de suplemento de pigmentação têm provado ser particularmente adequadas para incorporação em rações para animais, particularmente rações para animais aquáticos, a fim de aumentar a

A utilização de células de Haematococcus enquistadas, como um suplemento de rações, exige que as células sejam efectivamente facturadas a fim de proporcionarem um pro-

duto digestíve	1. A moedu	ra criogénica é superi	ior a outros
mé todos de t r i	turação, ta	1 como tratamento por	enzimas,	, que
exige lavagem	separada e	fases de secagem para	r emo ver	a en -

zima do produto, e que potencialmente deixa um resíduo de enzima no produto final. A presente invenção, em contraste, permite a preparação do produto final numa simples fase de moedura que não exige tratamento químico ou enzima tico. O

tratamento anti-degradação permite	a	armazenagem do	produto,
mesmo durante períodos de	t empo	r e 1	a t	i vamen te pro 1 on	gados
quando expostos ao oxigéni	o e à	1 uz	>	sem degradação	s u b s tan-
ciai dos caratenóides. As	cé 1 u 1	a s	de	Haema t ococcu s	t r i tu-

astaxant ina.

radas podem também servir como uma fonte para caratenóides extraídos e purificados, particularmente

- 4 êBÉYE_DESÇRlÇAO_DO_DESENHO

Fig. I é um gráfico ilustrando a perda comparativa de xantofila entre amostras que contêm um anti-oxidante e outra que não cont ém ant i-oxidante.

ÇESÇRjÇAO_DAS_FORMAS_DE_REALj_ZAÇAO_PREFERlDAS

As composições de ração da presente invenção são preparadas a partir de células de algas enquistadas do género Haematococcus. O género Haematococcus consiste em elementos unicelulares flagelados da alga verde (Chlorophyceae). Os elementos de distinção característicos de diagnóstico des te género, de outros elementos da ordem

Volvocales é a parede de célula. Em células flageladas, da membrana de plasma, estando ligada à a parede é separada mesma apenas por uma série de fibras citop1ásmi cas. Por enquistamento, é f o rmada uma nova parede de célula dentro da parede de célula gasta.

Esta parede de célula engrossa e torna-se impe rmeáve1 a varios tipos de tensões químicas e físicas tornando-a refractária a técnicas de moedura convencionais.

A t a χ o n om i a do Haematococcus e dos géneros relacionados é um tanto indistinta.

O Haematococcus foi durante certo tempo referido como

Sphaerella, e as diferenças em relação ao el eme ntos do me smo genero ”Ch1amydomonas não são sempre claras. A Stephanosphaera é um género estreitamente associado em que as células crescem numa forma colonial.

Todas as espécies e estirpes de Haematococcus que produzem quantidades apreciáveis de astaxantinas são adequadas para utilização na presente invenção.

Usualmente, da de de astaxantina produzida será maior que 0,5% em peso da ga sobre uma base seca, sendo ma usualmente pe 1 o menos ce ca de 1% e sendo desejávelme n t e

5% ou mais.

Presen t emen re, e s pecιe s r pe s ident i f içadas que cumprem tas ex ί gênc i i nc1uemH.ρ1uvi

II par t i cu 1 armen te

Η. ρ1uv i a 1

Hl i s H2','H.

ρ 1 uv sp i t zbe r genen s i s e Η. ρ 1 u v nens i s; H.

capens ¹ J par t i cu 1armen te

H. capens i bo real i s; H .

d r oebakensi par cu larmenteH. d r oebaken s i s Wo 1 1 enweber; H.

bue t sch1 i i, pa r tιcu a rmen t eH.

buetschlii Bl ochmann; e H.

z imbabwi ens i s, par cuia rmen t e

H. z imbabw i en s i s Pocock'.' Além destas espéc es les e tιrpes , o

Haema t ococcu s e um organismo

comum em natureza e	i so 1 amento de novas	estirpes adequadas, e
é bem conhecido dent	ro da	técnica.
Prefer ida	é a u	t i 1 i zação deH	. pluvial is que é	ca r a -
cterizada tanto por	c r e s c	imen to rápido	como por produção	p r o -
f i c i en te de as taxan t	ina.	Partícula rmen	te preferida é a u	t i li -
zação de H. pluvial j	s H2,	disponível no	Scripps Institute	o f
Oceanography, La Jol	la, Califórnia.
A estirpe	de Haematococcus ,	escolhida para a	p r o -

numa cultura de armazenagem axén i da ι ca com dução, será ma n t um fornec imento de reserva de células enquistadas, no caso da cultura de armazenagem ser perdida. Uma cultura de partida será derivada expandindo a cultura de armazenagem num meio definido para crescimento de algas, tal como o meio de base de Bo1 d de meia concentração, de preferência suplementado com ti amina, ureia e acetato de sódio. As células são desenvolvidas em culturas de reserva até uma densidade de cerca de 1-5 x 10^ células/ml, sob condições de crescimento autotroíico ou heterotrófico. Verificou-se que condições de baixa luminus idade e baixa salinidade promovem a rápida expansão da cultura. O meio de cultura deve ser mantido a um pH na gama de cerca de 6,5 a 8. A cultura de partida deve ser expandida até um volume suficiente de inoculo ter sido obtido, por transferência, para a fase de produção, tipicamente na gama de cerca de 50 a 500 L, usualmente na gama de cerca de 100 a 200 L. Culturas inoculas intermédias podem subsequentemente ser desenvolvidas.

• r_r

A produção em larga escala de

Haematococcus sera realizada num volume adequado de agua, i p i c ame n t e um reservanão e ou tanque revestido. O vo lume do reservator ou tanque rigoroso, sendo os volumes ma ι o r e s compa tive c om a p r o ma i s e 1 evada da a 1ga.

Normalmen , os tanques de pr odução têm um volume na gama de

50.000 a

1.000.000 L, c om ma i o r f requênc i a na gama de 30.000 e 500.000

L.

Os tanques de p r o dução podem estar localizados em locais i nteriores ou e x t e rιοres, sendo vantajosas as me d i d a em que as me sma s 1 imi t am o potencial para introdução de microorganismos concorrentes.

no exterior são, e v i d e n t eme nte, muito menos dispendiosas.

Devido à contaminação potencial, a produção em tanques abertos será usualmente realizada por processos escalonados. Depois da limpeza e descontaminação, o tanque é cheio com nova água, tipicamente de qualidade de irrigação ou melhor. A água será usual me nte tratada com um esterilizante, tal c omo cloro, ozono, ou luz ul travioleta,a fim de retardar o desenvolvimento de organismo s concorrentes que podem estar presentes inicialmente na água. Os nutrientes adequados são então

introduzi	idos	na	água. Para desenvolvimento	autotróf ico,	, uma
fonte de	azo	to ,	tal como amónia ou nitrato,	e uma fonte	de
fósforo,	t a 1	como fosfato, serão usualmente	suficientes.

Uma vez adicionados os nutrientes aos me ios de deseni o n a d o o volvi me nto de produção aquosa, pode ser adie inoculo.

O	vol	ume do i	nóculo proporcionado dependerá	do	vo 1	ume	na	f a -
s e	de	produção ,	estando normalmente na	gama	de	cerca	de 0	,5 a
5%	do	vo 1 ume	de	produção, estando ma i s	u s ua	1 me n t e	na	gama	de
cerca	de la	2%	do volume de produção.	Depo i s	do	inoculo	ter

sido produção devem adicionado desenvolv imento da de

J o s me ιo s ser lentamente misturados. Dióxido de carbono, libertado como gás, deverá tipicamente ser utilizado para controlar o pH, assim como para proporcionar carbono inorgânico para o crescimento. O crescimento máximo á obtido quando as células são expostas a condições de luz relativamente baixas.

Alternativamente, o crescimento heterotrófico da célula pode ser conseguido (além do autotrófico ) , suplementando o meio de cresci me nto c om fontes de carbono orgânico, fontes de azoto e v i taminas.

Ura variedade de fontes de carbono orgânico estão d sendo o ácido acético o preferido. A ureia e a fonte de azoto preferida e a vi tami na preferida a t i am i n a

Embora o c r e sc imento heterotróf ico aumente a prototal do crescimento, tais culturas são mais susceptive i s de contaminar mi croorganismo s , e e essenci al que as me sma s sejam mantidas sob condições es ser

O desenvolvi me nto da fase de produção contιnuara ng i da uma desejada densidade ριcamen t e de cerca

0 na gama t

s ριcamen t e na ι

de 10^ a

gama de cerca	de 3	x 10	a 6 x 10J	cé1u1 a s/ml	nas cu	1 t u r a s
autotróf icas.	Uma	vez at	i n g i d a ta	1 densidade	de cé 1	u 1 a , o
enqu i st amen t o	das	células	a 1gácea s	será p r omo v	ido, t	i p i c ame n t e
por^p r.j y.a£j.í>	de nu	t r i e n t e	, um aumento de salin	idade,	ou ambas

e/ou de concentrações

A privação de de azoto as coisas.

(NaCl, CaCl , e aná 1 ogos) ac ima de cerca de mM (0,3% em peso) mo strou ser um p r omo t o r de enqu ι s t ame nto.

Uma vez ter sido conseguido o enquistamento , as células enquistadas podem ser colhidas por cessação da mistura do tanque, permitindo às células assentar. Depois a pasta é aquecida até uma temperatura acima de cerca de 70°C, para secar as células e eliminar as células e quaisquer mi croorganismos contaminantes. Opcionalmente, as células secas podem ser lavadas para remover material estranho. Conforme a pureza desejada, uma posterior limpeza das células enquistadas pode ser apropriada, tal como por lavagem com ácido diluído.

As células de Haema t ococcu s?' limpas, secas, serão trituradas para formar um pó tendo um tamanho de partícula médio abaixo de cerca de 10 pm, estando de preferência abaixo de 5 Partículas nesta gama de tamanho estão particularmente adequadas para incorporação nas composições de rações para ani ma i s , como será descrito com ma is po rme η o r ma is ad i a n t e .

Depois da trituração, o pó será normalmente tratado para impedir a degradação dos carotenóides que são os componentes desejáveis. Convenientemente, as partículas do pó ρ o d em ser revestidas c om um ma t e r i a 1 c ome stível, para formar uma barreira ao oxigénio para impedir a oxidação. Numerosas técnicas adequadas de revestimento por gel, revestimento por óleo e micro-encapsulamento estão descritas na patente e na 1 i teratura cient ífica.

Alternativamente, uma quantidade suficiente de um anti-oxidante adequado pode ser adicionada para impedir a degradação dos carotenóides presentes no produto moído. Anti-oxidantes adequados incluem hidroxi to 1ueno butilado (BHT), etoxiquina, tocoferóis, hidroxianiso 1e butilado, di-terc-buti 1 -paracreso 1 , gaiato de propilo, e análogos. A quantidade de anti-oxidante dependerá do anti-oxidante particular escolhido, estando tipicamente nà gama de cerca de 0,05 a 5% em peso do produto final, estando mais tipicamente na gama de cerca de 0,1 a 3% em peso do produto final. O anti-oxidante pode ser adicionado quer antes quer depois da trituração da

0 a 1 ga . Por adiçao, antes da trituração, uma fase de mistura separada pode ser evitada.

Como uma segunda alternativa, as células de Haematococcus tr i turadas pod em ser emb aladas de uma ma ne i r a que i mp e d e a oxidação, tal como embalagens por vácuo ou embalagens com absorvedores de oxigénio. Tais embalagens não são preferidas, contudo, visto que o produto se degradará logo que a embalagem seja aberta.

Como a parede de célula das células de Haematococcus enquistadas é refractária às técnicas de moedura convencionais, o processo de moedura é crítico para o presente invento. As células devem ser secas, a fim de permitir a fracturação por moinhos de imp.aç t o de_ alta velocidade e moinhos de jacto. Verificou-se que a moedura sob condições criogénicas, tipicamente a uma temperatura abaixo de cerca de -50°C, mais tipicamente a uma temperatura abaixo de cerca de -170°C, é grandemente facilitada e proporciona um produto altamente uniforme e bem preservado.

Convenientemente, as células de Haematococcusenquistadas podem ser combinadas com um líquido criogénico, tal como azoto líquido, antes da mo e d u r a . ' Um aparelho de mo edura particularmente adequado é um moinho de impacto fabricado pela Vortec Products, Long Beach, Califórnia. O mo í nh o de impac to Vortec permite a introdução simultânea, tanto das cé I u 1 as Haematococcus enquistadas, como de azoto líquido, de modo que as células são arrefecidas abaixo da temperatura desejada, durante o processo

1 de moedura. Depois da moedura, o azoto líquido é sublimado, deixando um produto final seco.

As composições de pigmento da presente invenção incluirão irra variedade de pigmentos derivados de células de Haerratococcus.

Os pigmentos incluem ésteres de astaxantina, a 1fa - caroteno, beta-caroteno, luteína, viο Ioxantina , neoxantina, clorofila a, clorofila b, e astaxantina livre, assim como quantidades que são apenas vestígios de epóxido de luteína, zeaxantina, anteraxantina, equinenona, cantaxantina, e vários ceto-carotenóides. Esteres de astaxantina são o pi gme n t o primário cm pluvial is¹,' variando tipicamente de 60% pigmento total. O teor de astaxantina quistos deHaematococcus a 80%, em peso, do teor de da composição de pigmento será t i p i c ame nte de, pelo menos, cerca de 0,5%, em peso, com ba se no-*pe's o^-,~dO~p r od u t o total, estando usualmente na garra

2% do peso do produto total.

As composições de pigmento da presente rão usualmente combinadas numa composição de ração de cerca de 1% a invenção s ef o rmu1 a d a para o animal a ser alimentado. Tais formulações incluem tipicamente grãos, tais como trigo, alfalfa, soja e farinha de arroz; farinhas de peixe; farinhas de camarão, assim como suplementos de vitaminas e óleo. Una grande variedade de formulações são referidas tanto na patente como na literatura científica.

As composições de pigmentação da presente invenção podem ser adicionadas a tais composições de ração convencionais, tipicamente a uma concentração na gama de cerca de 10 a 200 ppm, mais usualmente na gama de cerca de 25 a 100 ppm. Tais formu1 2 ações podem ser então dadas a animais por técnicas convencionais.

Os animais aquaticos que podem beneficiar por receberem composições de ração suplementadas com a composição de pigmento da presente invenção incluem peixes(pisces), tais como salmão, truta, e carpa pigprentada; crustáceos tais ccmo camarão, gambas, lagosta e caranguejo. Outros animais tendo uma pigmentação amarela ou laranja desejável, tais como frangos, podem também beneficiar das composições de ração da' presente invenção.

O Haema tococcu^' triturado pode também servir como uma fonte de carotenóides extraídos e purificados, particularmente astaxantina, que pode encontrar utilização em s u ρ1 eme n t o s de a corantes , e análogos. Os carotenóides podem ser extraídos do Haema t ococcu s triturado por meio de técnicas de extracção convencionais, utilizando solventes orgânicos adequados, incluindo óleos; produtos aromáticos, por exemplo, benzeno; hidrocarbonetos halogenados, por exemplo, cloreto de metileno; alcanos, por exemplo, hexano, e análogos. O processo de trituração da presente invenção é crítico na obtenção de rendimentos melhorados de carotenóides a partir de Haema t ococc u s Co n v e n i e n t eme nte, óleos c ome stíveis, tais c omo óleos vegetais, podem ser utilizados para extracção e o produto resultante pode ser utilizado directamente como um suplemento de ração com um mínimo ou nenhum processamento posterior. As células trituradas são misturadas com o solvente, e a fase líquida resultante contendo a tracção de lípido total (incluindo os carotenóides),

3 separada por filtração.

Os carotenóides extraídos, particularmente a astaxantina, podem ser também, ainda, purificados por técnicas convencionais, como adsorção, c r orna t o g r a f i a , extracção so1vente-sο Ivente, talização, e analogos. Usualmente, a pureza desejada será de p e1 o menos, cerca de 30% em peso, mais usual mente é de, peme nos, cerca de 75% em peso, e sendo frequentemente de, pelo me nos, cerca de

90% em peso, e ma

Os exemplos seguintes são dados a título de ilustra ção e não com fins limitativos.

EXPER1ENC1A

Estão descritos abaixo processos para o crescimento autotrófico exterior de Haema t ococcu s pluvial is H2 )' e subsequente produção de produto final.

Inoculo

Culturas armazenadas unialgáceas, isentas de bactérias, são mantidas n um me i o c om a seguinte c omp o s i ç ã o :

Componente	Concen tração
Cloreto de sódio	12,5 mg/1
Cloreto de cálcio	12,5 mg/1
Sulfato de magnésio	3 8 mg/1
Fosfato de potássio dibásico	93 mg/1
Fosfato de potássio monobásico	4 4 mg/1

Acido tetraacético etileno diamina de sódio (EDTA) 25 mg/1

Cloreto	f é r r i co	2,5	mg / 1
Molibdato de sódio	0,35	mg / 1
Sul fato	de zinco	4,4	mg / 1
Cloreto	d e ma n g a n é s i o	0,73	mg / 1
Sulfato	de cobre	0,77	mg / 1
Cloreto	de cobalto	0,23	mg / 1
T i am i n a		1	mg / 1
Acetato	de sódio	1	mg / 1
Ureia		0,12	mg / 1

O meio é composto em água desionizada e ajustado ao pH 7,3. Se for desejado um meio sólido, são adicionados 1,5% de agar, antes de ser colocado na autoclave. As culturas inoculas de partida são células verdes, vegetativas, nadantes, desenvolv i d a s_ axeni camente em frascos sucessivamente maiores, até aproximadamente a fase de dois litros. Como o inoculo é transferido para vasos de plástico transparentes de 10 e 200 litros para crescimento em maior escala, o acetato de sódio já não é adicionado ao meio e a ureia é substituída por 101 mg/litro de nitrato de sódio. Para além desta fase de crescimento, todas as culturas são autotróficas. Até aproximadamente a fase de 200 litros, a.s culturas são mantidas em condições interiores controladas. São proporcionadas cada dia, dezasseis horas de luz, a partir de lâmpadas fluorescentes brancas suaves (1,2 x 10quanta/cm² seg). As temperaturas do período de luz são mantidas a,aproximadamente, 30°C e as temperaturas, no escuro, a 25 C. E fornecido dioxido de carbono, conforme as exigências, para manter o pH a aproximadamente 7,3.

5

Em cada fase as culturas são desenvolvidas até uma densidade de, aproximadamente, 2 x 10^ células por ml.

Para além da fase de 200 litros, as culturas inoculas são desenvolvidas como células nadantes em tanques ao ar livre. Orneio, ao ar livre, é feito com água de irrigação desinfectada por filtração, cloração, ozonização, ou luz ultra-violeta. A esta água são adicionados 1,0 mM de bicarbonato de amón i o , 0, QttM de fosfato de potássio d i básico, 0,02 m\4 de cloreto férrico, 0,01 mM de EDTA, 0,025 mM de sulfato de magnésio. Os contentores de cultura ao ar livre têm paredes baixas, e têm uma divisória ao centro. Os mesmos são' revestidos com plástico branco. Uma roda de pás, numa extremidade, produz uma mistura circular lenta da cultura. A profundidade da cultura é de 12 a 15 cm. Cem inoculo suficiente (acima de 10^ células/ml), as culturas estão aptas a desenvolver-se à luz completa do sol, cerro células vegetativas. Contudo, é óptima a luz mais baixa, e as culturas jovens podem ser aumentadas co brindo os tanques com material de protecção. A contaminação com outras algas, fungos e protozoários, a partir do ambiente, é um problema muito significativo nas culturas ao ar livre.

As culturas são desenvolvidas tão rapidamente quanto possíve na fase nadan t e com dióxido de carbono fornecido conforme fôr necessário, para manter o pH a 7,3. As células serão, na maior parte, verdes com uma quantidade variável de astaxantina, aparente na região central de cada célula. Cada cultura é desenvolvida por quantidades com limpeza do revestimento, entre as culturas, para evitar a transmissão de contaminação. As culturas inoculas, ao ar livre, são desenvolvidas até uma densidade de célula de, apro

6 ximadamente 3 x 10^ células/ml antes da transferência. Sob condições óptimas de temperatura as mesmas podem desenvol-

5 ver-se a partir de um inoculo de 2 x 10 a .3 x IO em aproximadamente 5 dias. O desenvolvimento do inoculo, to em culturas sucessivas de 5.000 a

DESENVOLVLMENTO_DA_PRODUÇAO

As culturas de produção são de ⁵ liAs me sma s são iniciadas e desenvolvidas da mesma f o rma que as cu inoculas, acima descrita. Se for deixada amadurecer (desenvolvimento para além de cerca de 5 dias) tal cultura começará naturalmente a enqui s tes, e continuando através do processo t a r. Pr ec i samen t e ande enqu i s tamen to conteúdo de célula encher-se-á, de uma f o rma crescen te , com os pigmentos de astaxantina vermelhos.

Qu .i s maduros t en derão a fixar-se fora, mesmo enquanto a roda de pa s esta mi sturando.

Aproximadamente 10 dias depois da inoculação numa cu 1 todas as células estarão incapazes de se mover , com paredes espessas e completamente ve rmelhas

As me sma s estão en prontas para a colhe t ame n t o e o processo de formação d.e astaxantina podem ser fac i t a do s por vários a j tamentos ao meio. Azoto ou outro nutri ente chave, pode ser proporcionado para se tornar um escape.

A l ém disso, a salinidade do meio pode ser elevada evaporação natural quer através da adição de quer através de cloreto de sódio.

l 7

COLHEITA E SECAGEM

O mé todo de colheita utilizado aproveita a v a n t agem do facto de os quistos verme 1hos madu o s t e r em uma

densidade signi	f i ca t	i v ame n t e ma i o r	que a água.	Com	a roda de
pás vi rada	para	fora	, os quistos ba	i xam até	ao	fundo	d o	tan-
que, dentro	de	aprox	i ma d ame n t e uma	hora. O	me i	o no	topo	é

então bombeado para fora resultando numa redução inicial em volume de cerca de

80%. Os qu são a inda concentrados antes da

A centrifugação um meιo conveniente para c omp 1e t a r isto.

sto que os quis tos são ba tante densos resistentes à dani ficação mecânica pos de cen t r gadoras de fluxo contí nuo funcionarão bem.

pasta algácea resultante é em seguida usualmente aquecida até aprox imadamen te

70°C, para eliminar o células contaminantes.

Haema tococcus da secura (10% de água tipos de secantes convencionais im como quaisquer a s s

A pasta )

ou menos e

depo	i s t orna da até	p r ó x	i mo
antes	d a mo e d u r a.	Vá r i	o s
tais	c omo secantes	por	pu 1 -
vácuo	, ou secadore	s de	tabu-

>

verização , secantes de t amb o r de

1 e i r o , for am u t i	lizados com êxito.	Condi	çõe s	de t empe ra t u ra
e 1 evada , elevada	concentração de oxi	génio	e 1	uz e1 evada de -
vem ser evitadas,	, durante a secagem,	para	ev i	tar a degrada-
ção do pi gme n t o.

Mo e d u r a

Ê adicionado anti-oxidante (hidroxitolueno butilado a 2% ou etoxiquina a

2%) às a 1gas secas .

Ut i I i zando

8 um alimentador de sólidos do tipo de parafuso isolado, é c omb inado azoto líquido c om as células de algas precis ame nte antes de as mesmas serem introduzidas num moinho de impacto

Ml da Vortec Products Company. A temperatura lida na abertura de entrada acusa entre -170°C e -Ιδί+θΟ. O moinho de impacto é ajustado para funcionar a uma velocidade máxima de

20.000 pm.

As proporções de fluxo podem ser tão elevadas como

1,5 kg por minuto. O produto riturado seco emerge d o mo i n h o.

Devido à acumulação das células, um segundo passo de moedura com as mesmas condições é efectuado para assegurar que, virtualmente todas as célula estão partidas.

pó fino que emerge deste segundo passo é o produto na 1 .

F°LTEla2ã2_dÊ_Ra.2Õe s_pa£a_Pe_i_xe s

O pó vermelho foi ensaiado quanto ao teor de xan t o f a por extracção de uma amostra c om solvente o r gâ n i -

cos e 1 e	i t u r a	espectrofot omé t r i c a.	Os	n í ve i	s de xantofila
totais	entre	1,0% e 2,5% são norma	i s .	O pó	ve rme1ho pode
ser comb	inado	com um pó comestível,	t a 1	como	farinha de trigo

a fim de proporcionar um produto tendo um teor de xan t o f i a

consistente, por exemplo 1,0%. e 50 ppm foram utilizados na mi ra experiências de alimentação, natural bem sucedida de salmão foi conseguida nas experiências ção foi tão boa ou melhor que a

Níveis de xantofila entre 20 stura de ração para peixes, pa

Uhna	coloração	laranja-rosa
Coho	, goraz, e	carpa ko i
de a 1	i me n t a ç ã o .	A p i gme n t a -

obtida pela adição de astaxan ina sintética ou cantaxantina sintética.

PÊSLâdação_de_Xa.rH o_f j_]_a s

Porções iguais de pó vermelho foram obtidas, estando uma de tais porções isenta de anti-oxidante (BHT) e a outra contendo cerca de 1% de BHT.

As amostras foram expostas ao ambiente, à temperatura normal, e sob luz fluorescente durante

148	horas.	. O	teor de xantofila	foi medido a 0, 6 ,	5 4, 126 e
148	horas.	. Os	resultados estão	indicados	na F i g . 1 .	Pode	ver
-se	que a	u t i l	i zação de um an t i-	oxidante é	neces sár	ia para	a

estabilidade, a longo prazo, do produto quando exposto ao ar.

Embora a invenção que antecede tenha sido descrita com algum pormenor a título de ilustração e exemplo para fins de clareza quanto ao seu entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser efectuadas den tj;o. •do.-âmb i t o das reivindicações anexas.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo para a preparação de uma composição carotenóide, caracterizado pelo facto de compreender:

   arrefecer as células de Haematococcus enquistadas secas até uma temperatura abaixo de cerca de -50°C; e triturar as células arrefecidas para obter partículas tendo um tamanho médio abaixo de cerca de 10 pm.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda o tratamento das células de Haema tococcus trituradas para impedir a degradação de carotenóides nas partículas.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de as células de Haematococcus serem combinadas com um anti-oxidante para impedir a degradação.

   9 - Processo para extrair carotenóides da alga Haematococcus, caracterizado pelo facto de compreender:

   contactar células de Haematococcus enquistadas secas trituradas com um dissolvente orgânico para’ formar uma fase sólida e uma fase líquida; e

   separar a fase 1 í q u i d a que contém 0 s c a r o t e n ó ides s ο 1 u- b i 1 i zado s . 5 - Processo de acordo com a re ivindicação caracter i zado pelo facto de as cé 1 u las de Haematococcus terem sido t ri t u r adas a uma t emp'è*r atura abai xo de cerca de -50° C. 6 - Processo de acordo com a re ivindicação caracter izado pelo facto de o d isso [vente orgânico ser escolhi . do do grupo que

   consiste em óleos, produtos aromáticos, hidrocarbonetos e hidrocarbonetos halogenados.

   7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o di : s s o 1 vente orgânico ser um óleo come st í ve 1 .

   Lisboa, 8 de Fevereiro de 1989