PT89440A - Processo para a preparacao de insecticidas porfiricos - Google Patents

Description

6o.568 Case UI-I91O - l· $·>*,«, in.^G /\ .< V * • / 1 y 10 15

Muci. 71 - 10 000 θχ - 4-67 20 -RESUMO- "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE INSECTICIDAS PORFÍRICOS"

Descreve-se um processo para a preparação de composições insecticidas, caracterizado por se incorporar uma quantidade eficaz como insecticida de um ou mais com postos escolhidos do grupo que consiste em ácido delta-ami-nolevulínico, indutores do ácido delta-aminolevulínico e in-tensificadores da conversão de ácido delta-aminolevulínico em tetrapirroles fotodinâmicos, sendo a quantidade dos referidos compostos suficiente para fornecer de 113,^ a 907i2 g (0,25 a 2 libras) de ácido delta-arninolevulínico por ^.0^6,8^ m^ (l acre) e/ou de ^5,6 a 680,85 g (0,1 a 1,5 li-bras) de indutor ou intensificador por k.Ok6,8k m (l acre). 25 30 35 160.568 Case UI-1910

Descrição do objecto do invento que 5 THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNI-VERSITY OF ILLINOIS, Instituição Académica norte-americana (Estado de Illinois), com sede em 506 South Wright Street, Urbana, Esta do de Illinois 6l801, Estados Unidos da América, pretende obter em Portugal, para : "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE INSECTICIDAS PORFÍ-RICOS” 15

Mod. 71 - 10 000 οχ - 4-87 25 30 0 invento aqui descrito foi concebido no de^ curso de trabalhos suportados pelos subsídios provenientes do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, A Fundação Nacional de Ciência, a Universidade de Illinois, a Estação de Experiência Agricultural de Illinois, e da "John P. Trebellas Photobiotechnology Research Endowment". 0 presente invento refere-se a composições e processos insecticidas, e mais particularmente a composições insecticidas e processos para elevar os níveis de te-trapirrole endógenos em insectos. 0 pedido de patente co-pendente norte-ameri cano N9 de Serie 895.529 descreve composições herbicidas que compreendem um ou mais compostos escolhidos do grupo que consiste em ácido delta-aminolevulínico, indutores de ácido delta-aminolevulínico em plantas, intensificadores da conversão de ácido delta-aminolevulínico até tetrapirroles fotodinâmicos em plantas, e inibidores de conversão de te- 1 35

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10 15

Mod. 71 - 10 000 θχ - 4-87 25 pirroles de divinilo em tetrapirroles de monovinilo em plan tas; processos para induzir a acumulação de tetrapirroles fotodinâmicos em plantas vivas utilizando as referidas composições, e processos para exterminar plantas utilizando as referidas composições. Todavia, as referidas composições não eram anteriormente conhecidas nem tinham sido descritas como insecticidas.

Os termos seguintes, como utilizados anteriormente e em seguida, têm o seguinte significado, a menos que seja expressamente indicado o contrário: ALA = ácido delta—aminolevulínico; Chi = clorofila; Chlide=Clorofilida; Coprogen = coproporf irinogeno; DP = dipiridilo; DV = divjL nilo; Mg-Proto = Mg-protoporfirina IX; MV = monovinilo; PA = fenantrolina; PBG = porfobilinogeno; PChl = protoclor fila; PChlide = protoclorodilida; Pheo = feofitina; Pheobide = feoforbida; Proto = protoporfirina IX; Proto-gen = protoporfirinogeno; Uro = éster octaraetílico de uro-porfirina; e Urogen = uroporfirinogeno. Os termos Proto, Mg-Proto, PChlide, Chlide, Chi, Pheo, e Pheobide referem-se a associações compostas por componentes MV e/ou DV a menos que precedidos por uma designação MV ou DV. 0 ácido delta-aminolevulínico, um aminoaci-do com cinco átomos de carbono, é encontrado na maior parte das células de animais e plantas vivos e é o precursor primário de tetrapirrole. 0 mesmo está disponível a partir de uma variedade de fontes da especialidade, por exemplo a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Em plantas, ALA e um precursor de clorofila através de uma passagem hexagonal envolvendo protoporfirinogeno, protoporfirina, Mg-pro topor firina, metaloporfirinas de mais comprimento de onda, pro-toclorofila, e clorofilida / ver Fig. 1 do Pedido de patente co-pendente norte-americano N? de Série 895*5297· sectos, ALA é transformado em protohema (protoporfirina ferrosa IX) através de uma passagem que envolve porfobili- 2 35

6ο.568 Case UI-I9IO / s nogeno, uroporfirinogeno, ciproporfirinogeno, protoporfiri nogeno, protoporfirina IX, e protoporfirina ferrosa IX (isto é protoheme): GRÁFICO DE FLUXO A:

HOOC 10 15 ch2-cooh 0II 2 COOH-CH2-CH2-C-CH2-NH2

ALA h2c CH, 4-87

Η2Ϊ H2N

H

PBG 20 25 30 COOH CH_

Γ2 COOH

CH2 I COOH OROGEN III = 3 = 35 10 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25 30 6θ.568 Case Ul-1910

CH_ CH I I COOH COOH COPROGEN III

CH=CH, -CH. COOH COOH DV PROTOGEN IX = h = 35 1 5 10 15

O 8 O p o 2 20 25 30 60.568 Case UI-1910 /' .VIA / \S3S.v

Tl·; \s

DV PROTO IX

COOH COOH Fe-Proto (Protoheme) 5 35 60.568

Case UI-1910 j 1. * /

Os

25

Heme A R, = ÇH ÇH-CH2-CH2-CH=Ç---CH2-CH=C---CH2-CH2-CH=Ç OH CH3 CH3 CH3

r2 = -ch=ch2 R3 = -CHO

Heme C R^ = çh-ch3 s 1 f

Proteína

R 3

-CH 3 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25

6o.568 Case UI-I9IO /“Ver também Granick, S. e D. Mauzerall, em Metabolic Path-ways, Vol. 2 (D.M. Greenberg, ed.) (Academic Press, NY, 1961), págs. 525-6l67· Protoheme e hemes a. e £ são grupos prósteticos de todos os citocromas em células de plantas e animais. Verificou—se agora que os insectos podem ser exterminados pela administração de uma composição que compreende um ou mais compostos escolhidos do grupo que con siste em ALA, indutores de ALA em insectos, e intensifica-dores da conversão de ALA em tetrapirroles em insectos. Em particular, verificou-se agora que os in sectos vivos podem ser induzidos por exposição a ALA exógeno para acumular artificialmente elevadas quantidades de intermediários tetrapirrole em excesso dos níveis normalmen te controlados em tais insectos, e que tais elevados níveis artificialmente induzidos são tóxicos para o insecto. Isto é surpreendente, visto que os insectos sintetizam normalmen te citocromas apenas a uma porção suficiente para manter com desenvolvimento e restabelecimento, e não se acreditava anteriormente que esta proporção seria suficiente para permitir a acumulação de quantidades letais de tais intermediários tetrapirrol. Embora o mecanismo exacto de toxicidade não seja conhecido, parece que os tetrapirroles acumulados podem actuar de uma ou duas maneiras, λ luz, crê-se que os tetrapirroles acumulados fotosensitivam a formação de oxigénio singleto, que é um oxidante muito forte. O oxigénio singleto oxida rapidamente os componentes de lipoproteína das membras celulares de insecto, ajustando assim em movimento uma reacção em cadeia de radical livre altamente destrutivo, que pode ser sumarizado como segue (hv = fotão de luz; ^Tet = tetrapirrole no estado triturado singleto;3 * 3 Tet = tetrapirrol no estado excitado tripleto 0„ = oxi- 1 / ^ génio no estado triturado tripleto; = oxigénio no = 7 = 30 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25 30 •Γν λ 1¾ r 60.568

Case UI-1910 estado excitado singelto; UMLP = lipoproteínas de membrana insaturada): 1) 1Tet + hv 3 * JTet 2) 3*3 JTet + J02 l,n , 1_ * Tet + 02 3) 102* + (UMLP) hidroperóxido s *0 hidroperóxidos radicais livres 5) radicais livres + UMPL mais hidroperóxidos 6) repetição das fases (k) e de UMPL estar oxidada (5) até a maior parte A fotosensibilização por meio de tetrapirroles injectados foi descrita em tecidos de animais e seres humanos/-ver, por exemplo, Ellefson, R.D., Mayo Clinic Proc. 57*^5^—^*58 (1982); Christensen, T.f T. Sandquist, K. Feren, H. Waksvil· e J. Moan, Br. J. Câncer 48:35-^3 (1983); Hopf, F.R., e D.G. Whitten, em The Porphyrins, Vol. 1_, Dolphin, D., ed. (Academic Press, Nova Iorque, 1978), págs. l6l-195; Sande-berg, S., I. Romslo, G. Hovding, e R. Bjorndal, Acta Derma-tovener (Estocolmo) Suppl. 100:75-80 (1982); Latham, P.S., e J.R. Bloomer, Photochem. Photobiol. 37!553-557 (1983); Bickers, D.R., R. Dixit, e H. Mukhtar, Biochim. Biophys. Res. Comm. 108:1032-1039 (l98227m&s este fenómeno de acumulação de tetrapirrole ALFA-dependente não tinha sido pre-viamente demonstrado em insectos, mas tinha sido previamen-te adaptado para exterminar espécies de insectos indesejáveis .

No escuro, parece que os tetrapirroles acumulados actuam através de um mecanismo diferente e resultam em níveis aumentados de Zn-protoporfirina. 0 Zn-Proto não é um intermediário metabólico natural do caminho porfirina--heme. A sua ocorrência em células vivas e tecidos denota usualmente um metabolismo porfirina-heme envenenado /"ver = 8 = 35 1 5 10 15

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\ por exemplo, Lamolla, A.A., e T. Yamane, Science 186:936-938 (197*07- A maior parte dos ferroquelatases (os enzimas que introduzem ferro ferroso em Proto para formar heme) pode introduzir Zn em vez de ferro no Proto para dar Zn-Proto, particularmente sob condições de reacçâo desfavoráveis / Marks, G.S., em Heme abd Chlorophill (Van Nostrand, 1969), págs. 146-1^77· Embora o mecanismo exacto não seja conhecido e a requerente não deseje ficar ligada a qualquer teoria particular, crê-se presentemente que a acumulação de Zn-Proto comc um resultado dos métodos insecticidas do presente invento pode ser provocada por dano do sistema ferroquelatase fazendc com que o enzima introduza zinco em vez de ferro ferroso em alguns dos Proto. Eventualmente isto significa que zinco em vez de ferro ferroso é encontrado em alguns grupos prostéti— cos do enzima respiratório crucial citocroma c oxidase. Come consequência aquelas moléculas de citocroma c oxidase contendo Zn-Proto em vez de heme não podem manter-se fixas aos radicais livres tóxicos tais como superóxidos de oxigénio e rai dicais livres de hidróxido que são normalmente formados durar te o ciclo de ácido cítrico de Krebs / Halliwell, B., What's New in Pant Physiology 15í21-24 (1984)7· Nestas circunstâncias os radicais livres destrutivos podem ser libertados no ambiente da membrana biológica e contribuir para a perda do radical-dependente livre o que tem como resultado a morte do insecto.

Verificou-se ainda que além da exposição al ALA exógeno, a exposição de insectos vivos a indutores de ALA resultará também na acumulação de quantidades maciças de tetrapirroles nos tecidos dos insectos. Por "indutor de AMA' quer-se significar um compost que, quando aplicado a insectos, estimula o insecto a produzir uma quantidade superior à normal de ALA endógeno, o qual tem então o mesmo efeito que o ALA exógeno descrito acima. Assim, as composições insecticidas do presente invento compreendem um ou mais indutores de ALA além de, ou no lugar do próprio ALA. Exemplos = 9 = 10 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25 30 60.568 Case UI-1910 não limitativos de indutores são 2,2'-dipiridilo; 1,10-fe- nantrolina; 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina; 4-metil-l,10--fenantrolina; 5-nitro-l,10-fenantrolina; 5-metil-l,10- -fenantrolina; 5,6-dimetil-1,10-fenantrolina; ^,7-dife- nil-fenantrolina; 5-cloro-l,10-fenantrolina; 3,^,7»8- -tetrametil-1,10-fenantrolina; 2,2'-ditiobis(piridina N-ó- xido); 4,4'-dimetil-2,2'-dipiridilo; fenil-2-piridil ce-toxima, e 2,2'j6',2"-terpiridina. Verificou—se ainda que determinados compos tos funcionam como intensificadores de conversão de conversão ALA até tetrapirroles em insectos. Por "intensificador de ALA" ou "intensificador" quer-se significar um composto que quando aplicado a insectos aumenta a capacidade de os insectos tratados transformarem os exógenos ou endógenos ALA em tetrapirroles insecticidas. Assim as composições insecti-cidas da presente invenção podem também compreender um ou raais intensificadores de ALA além de, ou em vez de ALA exógeno ou indutores de ALA. Exemplos não limitativos de intensificadores adequados são 2,2'-dipiridilo; 1,10-fe- nantrolina; 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina; 4-metil-1,10--fenantrolina; 5-nitro-l,10-fenantrolina; 5-metil-l,10- -fenantrolina; 5»6-dimetil-1,10—fenantrolina; 4,7-dife- nil-1,10-fenantrolina; 5—cloro—1,10-fenantrolina; 3»^,7»8- -tetrametil-1,10-fenantrolina; 2,2 ' di tiobis-(piridina N-óxjL do); 4, 4 ' -dimetil-2,2 '-piridilo; fenil-2-piridil cetoxi-ma, e 2,2·:61,2"-terpiridina. Certos compostos que funcionam como indutores numa composição podem funcionar como intensificadores noutra composição ou com diferentes concentra ções. Alternativamente, certos compostos (por exemplo 2,2 -piridilo; 1,10-fenantrolina; 4,7-dimetil-l,10-fenantrolina; 4-metil-l,10-fenantrolina; 5-nitro-l,10-fenantrolina; 5,6-dimeti1-1,10-fenantrolina; 4,7-difenil-1,10-fenantrolina; 5-cloro-l,10-fenantrolina; 3*4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina; 2,2'—ditiobis(piridina N-óxido); 4,4’-dimetil -2,2 ' -dipiridilo; f enil-2-pir idil-cetoxima , e 2,2^6^2^ 10 35 5 10 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25 30 60.568 Case UI-1910

g í Í -terpiridina) podem funcionar como indutores e intensifi-cadore s.

Os compostos insecticidas do presente invento podem também compreender combinações de dois ou mais compostos escolhidos do grupo que consiste em ALA, indutores e intensificadores, por exemplo ALA + um ou mais indutores ALA + um ou mais intensificadores ALA + um ou mais indutores + um ou mais intensificadores, um ou mais indutores + um ou mais intensificadores; etc. A composição pode também conter um ou mais dos seguintes: veículo(s) adequado(s) / por exemplo silicato de alumínio magnésio coloidal, pedra-pomes, talco, ou combinações dos mesmos7; dissolvente(s) /""por exemplo água, 0,45 de acetona: 0,45 de etanol:0,l de Tween 80:9 de água (v/v/v/v), 0,45 de acetona; 0,45 de metanol:0,l de Tween 80,9 de água (v/v/v/v), 0,1-1$ de Tween 80 em água (v/v), 0,9 de polie- tileno glicol (PEG): 0,1 de· Tween 80:9 de água (v/v/v), 0,1-0,7 PEG:0,2-0,8 metanol:0,l de Tween 80:9 de água (v/v/ /v), 0,45 de acetona:0,45 de etanol:0,2 de Tween 80:9 de etileno glicol:l8 de água (v/v/v/v), ou um ou mais dos seguintes: benzeno, tolueno, xileno, queroseno, 2-metoxi- etanol, propileno glicol, dietileno glicol, éter dietíli-co de dietileno glicol, formamida, metilformamida, ciclo-hexanona, isoferona; tampões / por exemplo ácido cítrico/; agente(s) molhante(s) / por exemplo N-metilN-oleciltaurato de sódio, um alquilfenoxi polioxietileno etanol, sulfona-to alfa-olefina de sódio, sulfonato isopropilnaftaleno de sódio, óleo vegetal polioxietilado7; agente(s) de dispersão / por exemplo sulfonato de lignina de sódio, o sal de sódio de um condensado de ácido-formaldeído naftaleno sul-fónico, hidroxietil celulose/; agente(s) de eliminação de espuma / por exemplo silicone/; emético(s) / por exemplo tripolifosfato de sódio, pirofosfato de tetrapotássio, are- 11 35 1 15 10 15

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6o. Case UI-I9IO ‘4, !·,>· i 'f v cotina, apomorfina, sulfato de cobre7; agente(s) contra cheiros /"por exemplo piridina75 nenetrante(s); agente(s) tensioactivo(s); emulsionante(s); adjuvante(s); herbici-da(s); e um ou mais outros insecticidas conhecidos. A composição pode ser formulada de uma ma neira convencional utilizada para preparações insecticidas, por exemplo como um ingrediente no alimento para aplicação sistémica interna, ou como uma solução, suspensão, emulsão, concentrado fluível, concentrado emulsionável, gel, pasta, espuma, creme, aerosol, pó molhável, pó, grânulos dispersáveis e análogos para aplicação tópica externa, de acordo com os processos conhecidos dos entendidos na técnica. A for mulaçâo é concebida para libertar uma quantidade adequada de um ou mais ingredientes activos para o insecto ou insec-tos em alvo. Para aplicação tópica, a composição é de pre^ ferência uma solução, suspensão, emulsão, aerosol, concentra do fluível ou emulsionável, ou pó molhável. Evidentemente, a formulação tópica deve ser tal que o(s) ingrediente(s) activo(s) penetre(em) no tecido do insecto e se desloque para os locais da síntese de tetrapirrole. 25 30

Quando o ingrediente activo é combinado com um ou mais compostos ou composições activas ou inertes acima mencionada, a combinação pode ser feita à temperatura ambiente, ou a temperaturas acima ou abaixo da temperatura ambiente desde que a estabilidade da composição não seja afectada. Quando a composição compreende ALA, a temperatura é de preferência mantida entre cerca de k°C e cerca de 75°C. Quando a composição insecticida da presente invenção está em solução aquosa, o pH pode estar no ponto isoeléctri-co do ingrediente(s) activo(s), ou acima ou abaixo do ponto isoeléctrico, desde que a estabilidade e solubilidade do ingrediente activo não seja tão adversamente afectada que interfira com a eficácia. Todavia, quando a composição inser ticida contém ALA, o pH é de preferência ajustado de modo a 35 12 - \i 60.568 Case UI-I910 *\ * \ ‘ •y 3

!*" |P'··^ .Λ,Ι. V y 5 10 15

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87 20 ficar entre cerca de pH e e pH 8

Quando dois ou mais componentes são combinados para formar as composições insecticidas, os mesmos são de preferência combinados sob condições que asseguram uma concentração uniforme através da mistura. Isto é convenientemente feito por técnicas tais como movimentação, agitação, mis-turação, combinação, etc. Naqueles casos em que o ingrediente activo é para ser o único componente da composição insecticida do presente invento, o imgrediente activo deve ser cuidadosamente preparado para se conseguir a aplicação uniforme. No caso de um ingrediente activo sólido, isto é convenientemente efectuado subdividindo o mesmo até um pó fino. Quando um tal componente único está na forma de um líquido, o mesmo pode convenientemente ser atomizado até nevoeiro ou névoa a temperaturas adequadas por meio de técnicas bem conhecidas para os entendidos nesta matéria. Quando as composições de regime ou tópi^ cas são feitas em solução, as mesmas convenientemente compre emdem concentrações de cerca de 2 a cerca de 50 nM ALA e de cerca de 0,1 a cerca de 50 nM indutor ou intensificador. 25 30

De acordo com os métodos do presente invento, os insectos a ser extreminados são contactados com uma composição insecticida que compreende ALA e/ou indutores de ALA e/ov intensificadores de conversão de ALA em intrapirroles. As composições insecticidas do presente invento podem ser aplicadas topicamente, por exemplo como pó, embebimento, imersão pulverização, nevoeiro ou névôa, numa quantidade suficiente para se conseguirem os níveis laterais internos de tetrapir-roles. A quantidade de composição insecticida a ser aplicada topicamente variará conforme o(s) ingrediente(s) activo(s), mas em geral será uma quantidade suficiente para fornecer de cerca de 0,25-2 lb por acre e/ou de cerca de 0,1-1,5 lb de indutor ou intensificador por acre. Meios para a determinação da aplicação de proporções óptimas estão dentro da compe = 13 = 35

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Λ ,½¾ 3JUUS8S tência dos entendidos nesta técnica.

Alternativamente, as composições insecticidas do presente invento podem ser administradas através de dieta, incorporadas em engodo ou outro alimento ou bebida a ser ingerido pelos insectos a serem exterminados. Novamente, a quantidade da composição insecticida a ser administrada variará conforme o(s) ingrediente(s) activo(s) escolhidos, mas em geral estará numa quantidade suficiente para fornecer de cerca de }.0 ng a cerca de 5 ug de ALA por mg de peso de corpo, e/ou de cerca de 1 ng a cerca de 5/ug de um indutor ou intensificador por mg de peso de corpo.

Se for desejado que o insecto seja morto atra vés do mecanismo de escuro, o insecto pode ser tratado e depois protegido da exposição a luz para permitir a acumulação máxima de tetrapirrole. 0 insecto pode ser protegido de qual quer maneira conveniente, como por cobertura do chão ou área em que o insecto é para ser encontrada, mediante tecido, papel escuro ou chpa. Nas condições do campo, o método ideal para proporcionar um período de incubação no escuro consiste em aplicar a composição insecticida ao crepúsculo ou durante a noite, num momento escolhido para permitir que os insectos permaneçam no escuro durante pelo menos uma hora. Deve compreender-se que, a fim de facilitar a acumulação de tetrapir-role, a escuridão não necessita ter total ausência de luz, mas antes substancial ausência de luz a comprimentos de onda de 380 a 700 nm. De preferência, os insectos são mantidos no escuro durante cerca de 1 a cerca de 20 horas. De uma a 8 horas é um período de tempo particularmente preferido. Evidentemente, muitos insectos preferem naturalmente os ambientes escuros e não são necessárias fases extra para proteger os mesmos da luz depois do contacto com a composição insecticida.

Se os insectos forem para ser extreminados através do mecanismo de luz, a composição insecticida é apli- = lU = 35

i 6o.568

Case UI-I9IO cada ou administrada e os insectos são ao mesmo tempo ou subsequentemente expostos a velas de cerca de ft. ou mais de luz a comprimentos de onda de cerca de 38o a cerca de 700 nm. A luz pode ser fornecida por qualquer fonte conveniente, por exemplo uma lâmpada incandescente, lâmpada de ha logeneto metálico, lâmpada solar, ou um bolbo fluorescente branco ou clarabóia. No campo, evidentemente, a fonte de luz preferida é a luz do sol. Os insectos são expostos a luz durante um período de tempo suficiente para oxidar a maior par te das lipoproteínas de membrana insaturadas; prefere-se um período de cerca de 2 minutos a cerca de 3 dias.

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

Os insectos a serem tratados pelo presente in vento podem adequadamente estar na fase oval, larval ou adu_l ta. Em larvas, a fase do instar pode afectar a susceptibili-dade do tratamento; as larvas em instares posteriores são relativamente mais susceptíveis ao tratamento que as larvas nos instares iniciais ou médios. De acordo com isto, pode ser necessário variar os níveis de dosagem de acordo com a fase de desenvolvimento da maioria da população larval protegida. A actividade insecticida é indicada por al-tera,ão da cor da pele, seguida por dissecação e morte. 25 30

Uma outra interpretação do presente invento pode ser tomada a partir dos seguintes exemplos não limitativos, Como utilizada acima e em seguida, a não ser que de outro modo seja expressamente indicado, em contrário, todas as temperaturas e parâmetros de temperatura são referidos ao sistema centígrado e os termos ambiente e temperatura ambiente referem—se a cerca de 20—25°C. O termo percentagem ou (*) refere-se â percentagem em peso e os termos mole e moles referem-se a moles por grama. "Nível de significância' refere-se à probabilidade de para uma população para a qual o coeficiente de correlação (r) é igual a zero, pode ser tomada uma amostra de tamanho n , para o qual o coeficiente = 15 - 35

10 15

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Case UI-1910 de correlação iguala ou excede o valor calculado de r reportado para a amostra dada. A abreviatura "n.s." quer dizer "não significativo".

EXEMPLO I

Pigmentos das Dietas em que Larvas T. ni foram criadas

Ovos de Trichoplusia ni (Hubner) (larva da couve, a peste raais extensiva em culturas vegetais nos Estados Unidos) foram obtidos por cedência da Sra. Paula Peters do USDA Insect Biological Control Laboratory, Departamento de Entomologia na Universidade de Missouri na Columbia. As larvas, ninfas e mariposas adultas, foram criadas em incubadoras Percival Modelo 1-60 (Percival Mfg. Co., Boone, Iowa 5OO36) a 25°C e 75 de humidade com um regime diário de ik horas de luz e 10 horas de escuridão. As larvas foram mantidas em dietas artificais seguindo os métodos descritos por Waldbauer, G.P., R.W. Cohen e S. Friedman, Great Lakes Ento-mol. (198^*) 17sH^· Vinte-trinta larvas foram criadas em re cipientes de papel de 8—02 com tampas de plástico transparente vendidos pela Lily-Tulipe, Inc. (Augusta, GA). Para evitar alterações genéticas na colónia, foram adicionadas colecções selvagens às culturas em cada varão. Para minimizar as doenças microbianas, os ovos e ninfas de cada geração foram esterilizados superficialmente. 30

Visto que as larvas ni. criadas numa dieta contendo farinha de alfalfa verde-amarelada adquirem uma cor verde-amarelada, enquanto que as larvas R. iii criadas sem farinha de alfalfa estavam visualmente isentas de pigmentação, o teor de pigmento endógeno da dieta foi investigado como uma fase preliminar para estudar a indução de tetrapir-roles por tratamento químico. A cor verde-amarelada da dieta contendo farinha de alfalfa foi típica da cor verde-amarelada de Pheos = l6 = 35 15 10 15

Mod. 71 - 10 000 ax - 4-87 20 25 30 60.568 Case UI-1910

| J, 1} ;η/ιΠ MA. % (Chis que perderam o seu átomo Mg) e de Pheobides que perderam o seu átomo Mg) e de Pheobides (Chlides que perderam o seu átomo Mg). Isto foi confirmado por analise espectrofluo rométrica a 77°C. Quantidades Gram da dieta foram homogeneizadas em 6 ml de acetona:0,l N NH^OH (9*1 v/v) e o extrai to de acetona aquosa resultante contendo vários pigmentos foi limpo de lipoproteínas e fragmentos da célula por centri fugação a 39000 g durante 10 minutos a 0°C. Pigmentos opala— res tais como Chis e Pheos foram removidos da solução de ace tona aquosa por extracçSo com hexano. Os pigmentos mais polares di- e monocarboxílicos tais como Proto, Mg-Proto, PChlides e Pheos permanecem na fracção de acetona aquosa extraída com hexano. Uma pequena parte alíquota do extracto de hexano contendo os pigmentos clorofilosos foi secada sob gas de azoto e o resíduo foi dissolvido de novo em acetona a 80$ para a determinação espectrofluorométrica das quantidades de Chis e Pheos de acordo com o método de Bazzaz, M.B. e C.A. Rebeiz, Photochem. Photobiol. (1979) 30:709. Os espectros de fluorescência foram registados num medidor de espectro de fluorescência contador de fo-tães completamente corrigido, Modelo SLM 8000DS como descrito em Rebeiz, C.A, Montazer-Zouhoor, H.J. Hpen e S.M, Wu, Enzyme Microb. Technol. (1984) 6:3°0. A excitação foi a 400, 4-20 e 440 nm. Os espectros de absorção foram registados a uma largura de fenda de 2 nm num espectrfotómetro de comprimento de onda duplo DW—2, modelo Aminco (Travenol Laboratories Inc., Silver Springs, MD 20910). Os controles foram MV Pheo a e b preparados a partir de MV Chi a e b, res-pectivamente, como descritos em Bazzaz, M.B. e C.A. Rebeiz, Photochem. Photobiol. (1979) 30:709. 0s resultados estão a-presentados na Tabela I: 17 = 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25 30 60.568 Case UI-1910 13

i I^CSQ •a.

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Mod. 71-10 000 βχ - 4-87 20 25 30 35 60.568 Case UI-I910 if · . kfiwna ,^Q C'-'

Excitações sensíveis do copo do éter do extracto polar entre *+00 e *+50 nm extraíram duas bandas de emissão Chl-análogas com os máximos a 655 e 666—667 nm respectivamente (Tabela : Cl, 2). 0 espetro de excitação Soret da banda de emissão de 655 nm apresentou a fenda de excitação máxima Soret a *+*+0 nm (máximo tamanho) e a *+50 nm (o mais pequeno) Tabela I: Cl). Estes máximos de emissão e excitação foram idênticos aos do auautêntico MV Pheo b (E*+*+0 E*+50F656) (Tabela I: A) . Neste contexto "E*+*+0 *+50" refere—se à fenda máxima de excita ção Soret de MV Pheo b a 77°K em éter, enquanto "F656" se re fere ao máximo de emissão de fluorescência de MV Pheo b a 656 nm. A banda fluorescente (E*+*+0 E*+50F656) foi identifi cada como MV Pheo b. Pequenas quantidades de MV Chi b estavam também presentes. 0 espectro de excitação Soret da banda de emissão de 666 nm, apresentou um máximo de excitação simples a *+1 *+ nm, e era idêntico ao autêntico MV Pheo a (Tabela I: B, C 2). Este composto fluorescente (E*+l*+F666) foi portanto identificado como MV Pheo a. As propriedades espectrofluorométricas da fracção polar foram muito semelhantes as da fracção apoiar (Tabela I:C l-*+) . Todavia, os compostos (E*+*+0 E*t50F655) e (E*+l*+F666-667) eram demasiado polares para a divisão com he-xano e permaneceu no resíduo aquoso da acetona. Os mesmos foram identificados com MV Pheobide b e MV Pheobide a, respectivamente. Os Pheobides têm as mesmas propriedades espe-ctroscópicas electrónicas que os Pheos mas são mais polares porque eles perderam o álcool de cadeia comprida na posição 7 do macrocíclo. Foi documentado que a extensão de esterifi-cação nas posições 6 e 7 do macrociclo não tem efeito nas propriedades de absorção electrónica e fluorescência de te-trapirroles (ver, por exemplo, Belanger, F.C. e C.A. Rebeiz, J. Biol. Chem. (1982) 257:1360).

As quantidades de Proto, Mg-Protos, 19 =

ay 6o,568

Case UI-1910 PChlides, Chlides e Pheobides foram determinados por espec-trofluorometria sobre partes alíquotas da fracção polar he-xano acetona extraída de acordo com os métodos de Rebeiz, C.A. , J.R. Mattheis, B.B. Smith, C.C. Rebeiz, e D.F. Dayton, Arch. Biochem. Biophys. (l975) 171:5^9 e Bazzaz, M.B. e C.A.

Rebeiz, Photochem. Photobiol. (l979) 3L:709· Os resultados estão apresentados na Tabela II: 10

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25 20 30 15 10 15

Mod. 71 - 10 000 θχ - 4-87 20 25 30 60.568 Case UI-1910 cn cd Ό cd •H U o E Cd u 0

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60.658

Case UI-1910 em que "Diet + A.M." = a dieta contendo farinha de alfalfa, e "Diet - A.M." = dieta que não contém farinha de alfalfa.

As quantidades de MV Pheobide a e b na dieta contendo farinha de alfalfa estão indicadas na Tabela 5 II: A. Pequenas quantidades de Chlide a e b estavam também presentes (Tabela IIs A). A dieta que não continha farinha de alfalfa tinha apenas vestígios de pigmentos clorofí-losos (Tabela II: B). 10 EXEMPLO II Pigmentos de T, ni 15

Mod. 71 - 10 OOO ex - 4-87 20 25

Larvas T. ni no seu quinto instar criadas sobre dietas contendo ou não farinha de alfalfa foram cuidadosamente homogeneizadas quer com argamassa e almofariz quer com um homogeneizador Brinkman modelo PT 10/35 (Brinkman Instrument Co., Westbury, N.I. H590) em acetona: :0,1 N NH^OH (9:1 v/v) a uma proporção de 6 ml de dissolven te por grama de tecido. Pigmentos polares e apoiares foram extraídos como no Exemplo I. Os resultados estão indicados na Tabela III: 22 30

1 O 5 10 15 20 25 30

60.658 Case UI-I9IO t1:i / / H H H << a a PO <: H 0 VO > Φ J0| m £ -c * a Η Ο 0 -3- ί- > φ Ο Ο £ A Φ| «k *. a ο ο ctí C '•rl 0) Η t- -P > H CV 0 O £ Λ £>| «k «k c O ο ο a φ 0J ι— Ό > H Η CM £ Λ Λ - ·- ω Ο Ο ο £ •Η I cl O Φ O Ό •I H •Η σ\ οο Hl σ\ οο U £ ο ,Ω| ·» ·» 05 0 φ m a Φ a Λ -3· > a U 05 ttí Φ t—l φ 0 Ό 05 £ •Η Ον j· Φ c > ^ ΡΛ Ο Ό £ Ο Φ| ·> ·* E Φ Η Ο 0 Φ Λ 05 -P a c 0 Φ -P s C φ 6β Φ Ό a m •H £ > Ή ro ot a 6b a η tO| ·« » *H Λ CV O 05 a Ο a Ό φ U Ό Φ 0 Ό 00 -3· Φ U ^ τΙ no a H O £ a cd I «k ·» Φ Λ 0 0 H Ο 0 -Ρ Ol ο •k U O O a + 1 Φ a| a| -Ρ c · C · φ M M •Η •1 · «1 « « T A T A 1 1 φ G a<® φ X -Η -Η A B w u ο = 23 = 35

.ΓΛ0 •V 15

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87 20 25 30 6o.658

Case UI-1910 em que "Τ\_ ni + A.M. = a larvas criadas sobre dietas conter do farinha de alfalfa e "T^ ni - A.M." = a larvas criadas sobre dieta isenta de farinha de alfalfa.

Em contraste com a dieta de farinha de alfalfa que continha quantidades substanciais de MV Pheo a e b além de MV Pheobide a e b , o ni continha pequenas quantidades de Pheos, cujo nível parece variar de corte para corte (Tabela III: A; ver também Tabela IV abaixo). Os pigmentos acumulados pelas larvas eram mais polares e consistiaiT principalmente em MV pheophorbide a e MV pheophorbide b (Tabela I: E; Tabela III: A). Por outro lado, as larvas cria das sobre a dieta que não tinha farinha de alfalfa continham apenas vestígios de pigmentos clorofilosos (Tabela III: B). A fim de determinar o local da acumulação de pigmento, a pele, hemolinfa e entranhas do quinto instar das larvas T. ni criadas sobre a dieta contendo farinha de alfalta foram separadas e analizadas quanto ao teor de pigmento. A hemolinfa foi reunida a partir de 9 a 10 larvas a-limentadas com uma dieta sem alfalfa e de 9 a 10 larvas alimentadas com uma dieta com alfalfa perfurando suavemente a pele sobre o coração compartimentado em um segmento posterior do abdómen das larvas. A hemolinfa extrudida foi recolhida numa ceringa No. 22 e foi imediatamente esguichada em acetona fria: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v). Depois da colheita de hemolinfa, as larvas foram parcialmente descongeladas antes da abertura da pele longitudinalmente com um escalpelo afiado. A pele dej congelada (isto é, o tegumento de insecto) foi então cuidadosamente retirada das entranhas ainda congeladas. A pele foi colocada com água destilada arrefecida com gelo para posterior lavagem enquanto as entranhas foram colocadas em acetona arrefecida por gelo: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v). A pele foi enxaguada três vezes com água destilada, depois foi colocada em acetona fria: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v) para horaogenização. A hemolinfa, entranhas e fracçSes de tegumento foram homogeneizadas em acetona fria: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v) com argamassa 2h = 35

6o.6 56

Case UI-1910 e almofariz e extraídas de acordo com o processo do Exemplo I. Os resultados estão apresentados naTabela IV: 5 10 15

Mod. 71 - 10 000 θχ - 4-87 20 25 25 = 35 15 10 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 25 30 60.658Case UI-1910 > H<: -)am<: f-1

J 4^

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Mod 71 - 10 000 βχ - 4-87 20 60.658 Case UI-1910 <· \ 1--4 § U3 JJH. φ & y T '

Como indicado na Tabela IV, a maior parte do pigmento foi encontrada nas entranhas. Pequenas quantidades de pigmento foram também detectadas no tegumento e na hemolinfa.

EXEMPLO III

Acumulação de Protoporfirina IX em T. ni Tratada com Ácido Delta—aminolevulínico e 2«2*—Dipiridilo

Um bloco de alimento (2,5 x 1,5 x 1 cm,) e 20 a 30 larvas T_^ ni no seu terceiro instar foram colocados num recipiente de papel 8-oz (9 cm de diâmetro) e o recipiente foi pulverizado com 0,35 ml de 40 mM ALA -30 nM 2,2'--DP em acetona: álcool etílico: Tween 80: água (O,^5:0,^5: :0,1:9 v/v/v/v), ajustado ao pH 3*5· A solução foi aplicada como uma pulverização fina com um diâmetro médio das gotícu-las de cerca de 50 microns. Isto fod/fequivalente a uma velocidade de pulverização de kO galões por acre. Os tratamentos foram repetidos quatro vezes. Os recipientes pulverizados foram cobertos com uma tampa de plástico transparente e as larvas tratadas foram então incubadas durante a noite (l7 horas, geralmente das 4 da tarde de um determinado dia até às 9 da manhã do dia seguinte) no escuro a 28°C antes da ex-tracção como no Exemplo II. Os resultados estão indicados na Tabela V. = 27 = 30 15 10 15

Mod. 71 - 10 000 θχ - 4-87 20 25 30

6θ.6 58Case UI-I9IO

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K o o o o d o 2 20 25 30

6ο.658 Case UI-I9IO 7 '/ /

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:ΐ.

Embora o perfil do pigmento das larvas de controle, que foram pulverizadas apenas com dissolvente, seja semelhante ao descrito nas Tabelas I: E e III: A, o perfil de pigmento das larvas tratadas com ALA - 2,2'-DP foi drasticamente diferente. A fluorescência de MV Pheobide a^ e b na fracção de acetona aquosa extraída com hexano tornou-se completamente obscura por fluorescência com uma emissão máxima à temperatura ambiente a 631 nm e uma excitação máxima Soret a 405 nm. Este perfil de fluorescência foi idêntico ao do au têntico DV Proto dissolvido em acetona aquosa extraída com hexano /~Fig. 1: (a), extracto extraída com hexano de larvas de controle; o pico de emissão a 6jk nm é o mesmo de MV Pheo a ; (b) extracto das larvas tratadas; (c) autêntico DV Pro to na acetona extraído com hexano7· A confirmação da natureza do pigmento acumulado foi conseguida comparando o seu es pectro de absorção em acetona a 80$ para os de éster octame-tilo de uroporfirina, coproporfirina, DV Proto, e DV Mg-Proto (Porphyrin Products, Logan, UT). Como está indicado na Tabela V, o extracto de acetona a 80$ de T. ni apresentou um espectro de absorção à temperatura ambiente que era idêntica ao autêntico DV Proto. Depois de transferido para éter, o pigmento apresentou a mesma emissão de fluorescência e excitação máxima Soret a 77°K (629 e *K>9 nm respectivamente) como Proto autêntico. Depois da inserção de Mg no pigmento (como descrito em Belanger, F.C. e C.A. Rebeiz, J. Biol. Chem. (1982) 257:136o), o mesmo apresentou a mesma emissão de fluorescência e máxima excitação em éter a 77°K como autêntico DV Mg-Proto (Tabela V). Conjuntamente estes resultados indicam que o tratamento de larvas T. in com ALA e 2,21 —DP resultou na biosíntese e acumulação de DV Proto pelas larvas. EXEMPLO IV Efeitos Insecticidas do Tratamento ALA + 2.2'—DP Para determinar as relaçães entre o trata- = 29 = 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 10 000 ΟΧ - 4-87 20 25 30 60.658 Case UI-1910

CÓ mento ALA + 2,2 *-DP, acumulação de pigmento e efeitos insec-ticidas, larvas nji na terceira instar foram pulverizadas com mM ALA - mM 2,2'-DP a um pH de 3,5 e foram incubadas durante a noite (17 horas) no escuro a 28°C como no Exemplo XXX. Na manhã seguinte, uma série de três replicas foram colocadas na estufa a 25°C sob um fotoperíodo de 1^ horas de luz, 10 horas de escuro, a fim de se se obsrvar a morte das larvas. A quarta réplica constitui o controlo (pulverizado apenas com dissolvente); o controlo e as replicas tratadas foram extraídas para determinações quantitativas de pigmento como no Exemplo II. A morte das larvas foi avaliada por comparação diária das larvas sobreviventes entre os insec-tos tratados e os de controle. A proteína foi determinada suspendendo o resíduo de acetona insolúvel que foi precipitado por centrifugação do homogeneto tecido em água destilada com um triturador de tecido totalmente de vidro. As proteínas totais foram determinadas por biureto numa pequena parte alíquota depois da aplicação de acordo com o método de Re-beiz, C.A. e P.A. Castel franco, Plant Physiol. (1965) ^0:28li Os resultados de várias experiências estão indicados na Tabela VI: 30 = 35 1 5 10 15 4-87 o o o o -o o 2 20 25 30

υΟ.658 Case UI-I9IO

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6θ .658 Case UI 1910

I

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Mod. 71 - 10 000 βχ · 4-87 20 25 30

60.658 Case UI-I9IO

em que "Morte Larval" se refere a percentagem de morte no início do quarto fotoperíodo, isto é, depois de 3 dias na estufa, e "alteração A " refere-se à diferença em teor de pigmento entre as larvas tratadas com ALA + 2,2'-DP e as lar vas de controle depois do período de incubação no escuro de 17 horas após a pulverização. 0 tratamento ALA + 2,2'-DP resultou em acumulação maciça Proto e morte larval significativa. A percentagem de morte larval apresentou um elevado grau de correlação com a acumulação (Tabela Vi). A maior parte das mortes ocorreram durante o período fotoperíodo. Dentro de minutos até poucas horas depois da exposição à luz as larvas tor naram-se lentas e flácidas devido à perda de fluídos do corpo; a morte foi acompanhada por dissecação extensiva. Para determinar o local de acumulação Proto, o tegumento, hemolinfa e entranhas tratadas com ALA + + 2,2'-DP, na sua anterior quinta instar, foram separados e analisados quanto ao teor de pigmento como no Exemplo II. Numa base de proteína por unidade, cerca de 59$ do Proto a-cumulado foi observado na Hemolinfa, 35 $ nas entranhas e 6$ no tegumento. EXEMPLO V Efeitos de Acumulação de Protoporfirina sobre a Morte Larval e Alteração de peso do Corpo no Escuro e a Luz Durante o curso da experiência, foi obser vado que o tratamento com ALA + 2,2'-DP tinha causado de modo consistente a morte larval tanto no escuro como à luz. Para determinar se a morte larval depende de ALA + 2,2' foi ou não um fenómeno fotodinâmico, larvas T. ni na terceira instar foram pulverizadas quer apenas com dissolvente (controles) quer com 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP com o pH ajusta- 33 = 35 foo. 658

Case UI-I9IO 1 do a 3,5 como no Exemplo III. As larvas pulverizadas foram deixadas acumular Proto durante a noite por incubação no o 5

escuro durante 17 horas a 28 C. Na manhã seguinte, algumas das larvas foram expostas a 0, 3 ou 6 horas a luz, na estufa, antes da extracção do pigmento como no Exemplo II. Amos tras em duplicado submetidas ao mesmo tratamento de luz fci ram levadas de novo para o escuro durante 48, 45 e 42 horas respectivamente, antes de controlar a média da morte larval como no Exemplo V. Avaliação posterior dos danos do tratamento dependente entre as larvas vivas foi feita por determinação do peso do corpo passados três dias de exposição fo_ toperiódica na estufa. Os resultados das duas experiências estão indicados na Tabela VII: 15

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-B7 20 30 = 3^ = 35

X ο ο ο ο ο 1 5 10 15 6θ.658 X) ο 2 20 25 30

Case Η Η > < Ι-) W η Η UI -1910 A y. ÍlJN. 1032 f •y 3^/ / 5’ ./ / 1 1 Ê X 0 (0| φ 0 £ a x V VI x a x X Φ 0 0 CO Φ Ό rH 10 Pt MO MO o 0 a > a br »· — ·> *· r τι •r H iH £ m -d- MD MO o 0 ; > 0 <0 pf -d- Pt CM a •Ό CO -P · •H β (0 0 X O 0 Φ > (0 a XJ ο <0 CU ε Ή cn Φ Φ ιβ cu o o m 0) eu τι -P h a Ό MO a ο <u O Ό > τι rH Ο Η Λ CM P O γλ 0 Ο 3 SH CO r—1 ολ MD fp 00 κο a x a m 0 o> Φ O MO co cn Ό a -p (η '0 φ a cn -Ρ •H Ή a 0 31 1 C Ctí a ϋ 0) -¾¾. > φ β Φ pp φ x T3 -H CO O •Hl X O Φ β H 03 iH CM ON cl -cd V CM Cci CM a Φ o> O ·| a (0 x m 0 ΗΙ x s th X 0 X tv <0 3 >—t N X x Η XI O cO 3 > XI χ 0 cd|a| ffi ,C0 cn c n ε X CO u 3 0) Ό 0 í η H U) Φ CO ICC Φ ·Η H -P 0 cn th > 0 — X x n CO rl Φ 0 cO 0 3 Λ XI 3 fl Η C flí (0 Xi O «3 X ϋ a 3 X \su CM O Pt a O cn ϋ 1 XJ Η Φ ·· *> r •k CO W 0 β cn 0 -P O CM 0 a CM -P •HOCO Ε O MO MO CD 0 0 a · β X X c x Φ O'-' a xi a V 3 0 0 Η Φ 0 cn cu x Λ 3 tcd x 0 o o O 0 0 φ c— kc cd KO 0 6-* Η Φ Ο- β 0 (0 0 Ό 3 O ε «si θ| N x 1 N 3 N Φ O -P 3 »cd 3 N s O 3 u 0 Ή Ό O H O 3 3 a a < x * 3 a 0 0) 03 a 0 a 0 0 0 3 Φ O O ,«J X cO Φ u X a »aS X 0 ϋ > «0 01 cn 3 X ,c0 3 ,«S 3 3 -P 03 H th Φ •ΗΛΟ O O O O «£ ϋ 0 w 3 cd O 03 X3 β Λ cn XI 03 •H 03 x \ axj 0 T3 -3· Φ Φ Φ 0 -ο- Φ cu N 3 C rH Ο X MO Ό a 3 Φ ϋ - O 0 O 0 Φ xi τι β « O 03 β -CO ~ β - β ·> 03 β •D •H CO Η O O -Ο O O o 0 Φ CO (η ΟΌ £ τι τι x! Ό Λ 3 3 X O ε -η φ ο X O cO + cd cd CO 0 P •Η 3 XJ -P VH O -P -P ΙΛ a cm aMO *H tlD a 0 C X H cO N cO -Ο cO -Ο cd X a Φ Φ Φ ICO t~- Ο φ X 3 Χ Χ X φ Cp « Τ3 tha 0 a + H rU H + H + H a + W + H C\l ΓΛ -d- m 1 (ti •H *H t u 0 < Φ c w a<» c < < << < 35 35 15 10 15

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-Θ7 20 6o.568

Case UI-I9IO

0 cd| oi|o| α G G Ό '•H g a O G ω 0 α cd d) V rH r- rH o 0 > a * ·* r ·> Ό -T H rH bC _a- m C\J 0 o 0 > 0 cd c St St c^, a Ό cn a xj -p V-✓ 0 •H G cd 0 cn 0 0 cu > cn -p Λ Q) cn α ε 4 a 1 n cu d) cd ro 0 0 m a Ό a a aO O Ό «I 0 O > Ό «d rH 0 a Λ CV 00 m c- 0 P s-t cd cv -d* !a cd α G -P iO G \ d> Φ O d! cn ό a -p a Ό iH a cn < •H 31 l H 0 /·-N Φ cd α 0 cn > φ G Φ G Ό ã •Hl cd O 0 c| (-1 0 d) G 0 θ', O a ccd «d Ό rH CNJ a 0 •I d) a> O Λ Hl N a cd £ «d O 3 3 G N t» G c rH £ 0 -H t- cd 3 •rH CC Σ G H £ 0 -P > ,cd c g 3 1 1 0 cd <u a cd a 0 £ cn N E 0 cd 3 a 3 ω (D G Ό Rd G H E H a P cd 0 φ a H G υ cn ns > 0 > O cn 11 í H 4 0 JS W M 3 3 3 H -—- (tf ctf rD o < α o a \ cd cv H C\i \C £ cd 0 c 1 £ a c ·> r ·» - W G O -H cn 0 'a 0 O rH 0 O d) -P *0 vo E d) st < G O Ο Φ α « C a H X) a U Ό o -—· 0 0 G a 0 G CD O Λ G d) 0 a 0 G 3 Rd O 0 ί o O 0 icd 0 α) H cn Rd cd 0 Ό H φ o> c cd

E 0 0 0 3 cd| d) ol N G G G O N Ό O a 3 /Cd 3 /Cd 3 /Cd 3 < 0 a g 0 a O u 0 G G 3 a 0 cn cn cn cn cn cn 0 3 Φ O o /« G cd d! cd d) cd d) a o > «d cn cn 3 G G G 0 cn a o> φ a si u O 0 0 0 0 O G W 3 cd 0 cn Si G £ G £ C a — 0.3 0 T3 Pf φ N 3 G a O cn cn 'sO <n d) 3 d) o ·· 0 cd cd cd Ό JD C » cu cn G • G •k G - G a cd a 0 O 0 O O O 0 O φ cn g O X5 Si Ό £ Ό £ £ £ a E a φ 0 G 0 cd cd cd a ao si a •a O a co a m a a· d) bo a 0 C G a cd N PJ- cd N Pt cd N a 4 01 Μ N O 0) G 3 G 3 G 3 w CS T3 cxa 0 a + H a + H rH + H t—1 + Ψ a Oi r> 1 cd a a 1 G 0 X Φ G w a«u m m PQ = 36 = 1 5 10 15

Mod. 71 -10 000 ex - 4-87 20 25 30

60.568Case UI-I9IO -P G O o H H >< 2 « PQ< a O <0| d>| 0| a E E X SH <U <u E -P O E Ό —1 0 a C0 d) - tn o O 1 > a feO CO 30 X •r H 1-H E ·> 0 0 1 > 0 to '—' cn O a X tn -P T3 -p 1 •H C (0 0 O O <U > tn -p λ o W a E i 4 •Η 1 tn d) 0) (0 cC 0 0 m 0) a TH -P r—1 α x co O Φ| 0 X X > X co i—1 Ο Η 2 tn 0 O 3 SH tO σχ 00 •co a e -p in •ys. o \ d> tl Oto 0 tn Cfl to X a a E '0 <U a tn a •H 1—1 1—1 O 31 l — <: (0 a υ tn yt > ai G <u h—- 0) E X á (0 O 00 a O 0) E OJ -HI KO X c| a) 0 O -P Λ £«0O •| E N Cri E Hl O *H r- to 3 N 2 E H 2 o iH 3 (0 2 > < 0 cd|-H| e /(0 (0 í N E cfl (0 ri 3 W! 2 d) Ό 3 E Η E (0 XO d) tri tu O (0 0 > 0 -P e to Cfl H <U tfl E 3 to 2 3 X Η Λ a O υ a 3 a \ c *» 2 tn O 1 ÍHE 0 2 0 2 (0 O d) -fl- cfl -P H o\ú ε -μ 0 0 a ·* c 0 d) C E <D O'-' E E a Ό 0 α 2 O E d) 0 O α E λ 3 KO tn E O υ 0 0 0 d) tn κο to 0 0 H Ή <u 0 c Kti 0 0 to X l—t 0 1 3 cfl| d> .(0 E tu c N X O o| 3 E 5 0 -Η E -p tn O E υ E E 3 O (0 tn O < 3 d) 0 u a e tu O 0 > κο tn 0 O tn r-π 0 d) tn Λ 0 <u -P « 3 «0 a G X tfl 0 \ 0 O Pf -H e N 3 C X a tn oj υ Eh 3 d> 0 (0 a c 3 3 C n - tn E G «tfl <U a (d 0 0 0 tu υ X d> tn E X X 2 a a E a Φ 0 (0 0 u a O •HO 2 a sh O a a -P Mft O tfl E N a c d> dJ Kfl C-- E V 3 tu & oj a χ οή dt 1—1 + 0 a Ch 0 tn W =#= 1Λ d) <u X X 1 (0 a 0 *H *H <U Kfl 1 E O PQ > o> X d) 0 SH tfl « a<d> 2 a

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/«"V / / /

fQ Cu O tratamento das larvas com ALA + 2,2'-DP resultou na acumulação de Proto. Um grau significativo da morte de larvas foi também observado nas larvas tratadas ao fim de 17 horas depois do período de incubação de pulverização no escuro, antes de qualquer exposição à -luz (Tabela VII: A 2, B 2). A incubação adicional no escuro resultou em posterior morte larval. Este modo de morte larval é aqui referido como morte larval dependente do escuro. As larvas que sobreviveram ao período de morte larval no escuro com compre emdem uma perda de peso do corpo detectável (Tabelas VIIj A 1, 2; B 1, 2). Estes resultados indicam que a acumulação Proto de ALA + 2,2'-DP-dependente foi acompanhada pela morte larval no escuro.

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-B7

Três ou seis horas de elúminação das larvas que tinham acumulado Proto durante as 17 horas de incubação no escuro depois da pulverização resultou na destruição e desaparecimento do Proto acumulado (Tabela VII: A 2-4, B 2-4). A mortalidade de larvas tratadas que foram expostas a 3 ou 6 horas de iluminação antes de serem colocadas de novo no escuro durante 45 e 42 horas, respectivamente, excedeu o nível de mortalidade larval no escuro (Tabela VII: A 2-4, B 2-4). Este modo de morte larval é aqui referido como morte larval dependente da luz. Esta forma de mortalidade apresentou uma correlação significativa com a extensão da iluminação (Tabela VIIs coluna 6). Além disso, as larvas tratadas que sobreviveram ao tratamento de luz apresentaram uma inibição significativa em ganho de peso de corpo em comparação com os controles não tratados que foram pulverizados apenas com dissolvente (Tabela VII, coluna 7). A correlação entre a extensão da esposição do pós-tratamento à luz e a inibição no ganho do peso do corpo foi altamente significativa (Tabela VII, coluna 7)·

Em conjunto, estes resultados indicaram que além da morte larval no escuro, a acumulação de Proto resul tou numa mortalidade larval dependente da luz ou fotodinâ- = 38 = 35 60.568 Case UI-1910

n Ír.£& mica. Além disso o Proto acumulado desapareceu durante a iluminação, provavelmente como uma consequência de fotodes-trição.

EXEMPLO VI

Efeitos Sinérgicos de ALA e 2,2'-DP sobre Acumulação de

Proto e Morte Larval em T. ni

Os efeitos relativos de ALA e 2,2'-DP sobre acumulação de Proto e morte larval na terceira instar Tj_ ni tratada como no Exemplo III e ensaiada como no Exemplo II estão descritos na Tabela VIII: A:

TABELA VIII

Efeitos Sinérgisticos de ALA e 2,2'-DP que Provocam a

Acumulação Proto e Morte Larval em T. ni Ex- Teor de Proto (nmol/ Morte larval passados 3 dias na peri- ência 4* Tratamento 100 mg proteina) estufa (*) 1 Controle 0 6 A 2 40 mH ALA 2,5 26 3 30 mM 2,2»-DP 15,5 4i 4 40 mM ALA + 30 mM 2,2»-DP 80,4 90 1 Controle 0 2 2 30 mM 2,2'-DP 11 6i B 3 30 mM 2,2»-DP + 10 mM ALA 75 86 4 30 mM 2,2'-DP + 20 mM ALA 89 76 5 30 mM 2,2*-DP + 40 mM ALA 73 92 = 39 = f\ 60.568

Case UI-1910 TABELA VIII (Continuação)

Efeitos Sinergísticos de ALA e 2,2'-DP que Provocam a Acumulação Proto e Morte Larval em T. ni

Ex- 10 peri- Tratamento ência

Teor de Pro to (nmo1/ 100 mg pro teína)

Morte larval passados 3 dias na estufa (*) 15

Mod. 71 - 10 000 θχ - 4-87 20 25

D 1 Controle 0 7 2 15 mM 2,2'-DP 1 22 3 15 mM 2,2'-DP + 10 mM ALA 8 k2 k 15 mH 2,2’-DP + 20 mM ALA 3^ ko 5 15 mM 2,2'-DP + kO mM ALA 27 k3 1 Controle 0,2 5 2 40 mM ALA 1,1 7 3 ko mM ALA + 5 mM 2,2 -DP 3,8 k 4 ko mM ALA + 10 mM 2,2' '-DP 6,7 18 5 ko mM ALA + 20 mM 2,2' 1 -DP 12,1 3k 6 ko mM ALA + 30 mM 2,21 '-DP 15,3 71 0,857 0,1 1

Correlação entre o teor de Proto e a morte larval Nível de significância 30 = Uo = 35 f- •6 o 2 20 25

60.568 Case UI-I9IO 3. Ajt i v ,13 Α.,.*6β ·'· U 3 *» 0 ácido delta—aminolevulínico isolado resultou no modesto nível de acumulação Proto e morte larval (Tabela VIII: A 2) 2,2'-Dipiridil na ausência de ALA adicionado foi mais eficaz que ALA para provocar a acumulação Proto e morte larval (Tabela VIII: A 2, 3); isto é, na ausência de ALA adiciona do, o 2.2’-DP actuou como um indutor de acumulação de Proto. Finalmente, os efeitos sinergísticos de ALA + 2,2'-DP foram manifestados quando os dois produtos químicos foram utilizados conjuntamente no tratamento das larvas T_j_ ni.

Sob estas condições a acumulação Proto (80,b nmoles) Sob estas condições a acumulação Proto (80,h nmoles) e morte larval (90$) excedendo largamente a soma de acumulação Proto (2,5 + 13,5 = 18 nmoles) e a morte larval (26 + 4l =67$) provocada pelos tratamentos separados com ALA e 2,2'-DP (Tabela VIII: A 2-k).

EXEMPLO VII

Aumento de Conversão ALA até Protoporfirina por meio de 2,2'-Dipiridilo

Para determinar se além das suas propriedades de indução (Tabela VIII: A 3) a propriedades de aumen to de 2,2'-DP apresentadas como sugeridas pela Tabela VIII; A, os seus efeitos sobre a acumulação de proto e sobre a concomitante morte larval foram examinados na presença de várias quantidades de ALA adicionada. As larvas na sua terceira instar foram pulverizadas como no Exemplo III e ensai adas como no Exemplo II. A concentração alta (30 mM) e a média (15 mM), de 2,2'-DP apresentaram propriedades aumenta das além das suas propriedades indutoras de Proto. As propriedades indutoras de Proto 2,2'-DP foram demonstradas pelo aumento na acumulação de Proto e a morte larval concomitante na ausência de ALA adicionado (Tabela VIII: B 2, C 2); As propriedades melhoradas de 2,2'-DP foram evidenciadas pelo aumento dramático em acumulação Proto e morte larval = kl = 30 6o.568 Case UI-1910 -rx/ \ ; 3, Λ,Γ4'4. 1939 10 15

Mod. 71 - 10 000 ex · 4-87 25 / nas larvas tratadas com ALA + 2,2'-DP, sobre a para além das tratadas apenas 2,2't como resultado da conversão grandemente melhorada de ALA exógeno até rroto (Tabela VIII: B 3-5, C 3-5). Finalmente a dependência das propriedades de intensificação do 2,2'-DP sobre a concentração de 2,2'-DP está descrito na Tabela VIII: D. 0 conjunto dos resultados anteriores indica que embora na ausência da adição de ALA, o 2,2'-DP ac-tuou como no indutor de acumulação de froto,na presença de ALA exógeno e também actuou como um intensificador da conversão de ALA até Proto. 2,2'-DP é assim um exemplo de um indutor-intensificador de biosíntese de tetrapirrole.

EXEMPLO VIII

Efeito de pH sobre a Acumulação de Proto Dependente de ALA -2,2'-DP e sobre a Morte Larval em T. ni 0 ácido delta-aminolevulínico é um Zwit— terion, isto é, a sua carga líquida é uma função do pH.Visto que o seu ponto isoiónico é a um pH 6,47, o mesmo adquire uma carga positiva abaixo do pH 6,47 e uma carga negativa acima desse pH. Visto que a translocação de Zwitterions nos tecidos biológicos é influenciada pela magnitude da car ga eléctrica líquida sobre o ião, a influência deste parâmetro sobre a translocação de ALA e 2,2'-DP nas larvas tratadas foi examinada. A extensão de translocação de ALA e 2,2'-DP nas larvas ni foi inferida a partir da extensão da acumulação de Proto e morte larval. 30 As larvas T. ni na terceira instar foram pulverizadas com soluçães de 30 mM 2,2'-DP + 4o mM ALA ao pH 3,5 e 5,5 (ALA carregado positivamente) e ao pH 7,5 (ALA carregado negativamente) de acordo com o processo do Exemplo III. Como é usual os controles foram pulverizados 35 com apenas o dissolvente. Passadas as 17 horas do período = 42 = 10 A -? * 'í >5 13 ja.-& j V. 15 71 - 10 000 οχ - 4-8/ 20 25 6θ.568

Case UI-I9IO pós-pulverização de incubação no escuro, algumas das larvas foram extraídas para determinação Proto de acordo com o processo do Exemplo II, enquanto as amostras em duplicado foram expostas a luz na estufa. A morte das larvas foi determinada passados 3 dias na estufa. Os resultados estão indicados na Tabela IX:

TABELA IX

Efeito de pH sobre ALA + 2,2'—DP Acumulação Dependente de Proto em larvas T. ni

Ex- peri- ψ Tratamento ência

Teor de Proto (nmol/ 100 mg proteína)

Morte larval passados 3 dias na estufa (*) 1 Controle 0,1 3 2 Tratado, PH 3,5 85,0 81 3 Tratado, pH 5,5 73,8 «5 4 Tratado, pH 7,5 108,5 80 1 Controle 0,0 1 2 Tratado, PH 3,5 96,7 75 3 Tratado, PH 5,5 110,4 82 4 Tratado, pH 7,5 73,7 85 a b

Coeficiente de correlação 0,007 0,540 Nível de significância 30

Correlação entre o pH e o teor Proto em larvas tratadas com ALA + 2,2’

Correlação entre o pH e a morte larval em larvas tratadas com ALA + 2,2'-DP. = 43 = 35

7 , I 60.568

Case UI-1910

Como está representado na Tabela IX, quantidades consideráveis de Proto foram formadas pelas larvas tratadas a todos os valores de pH. A morte larval foi também substancial a todos os valores de pH. Entre o pH 3,5 e 7,5, nem a acumulação Proto nem a morte lerval mostraram estar correlacionadas com o pH. Em conjunto estes resultados indicam que a translocação de ALA + 2,2'-DP em larvas T\_ ni e subsequente conversão de ALA em Proto pelas larvas não estava estrictamente dependente do pH na gama de 3,5 a 7,5·

EXEMPLO IX

Dependência da Morte Larvar em T. ni Tratadas com ALA — 2,2*—DP sobre a Idade das Larvas A dependência da morte larval T\_ ití tratadas com ALA + 2,2'-DP sobre a idade das larvas tratadas foi investigada. As larvas T_j_ ni, na primeira, segunda, terceira e quarta instar foram tratadas com 4θ mM ALA + 30 mM 2,2' -DP ao pH 3,5 como no Exemplo III. Depois de um período de incubação no escuro de 17 horas, as larvas tratadas e de controle foram expostas à luz na estufa. A morte larval foi avaliada passados 3 dias na estufa. Os resultados estão indicados na Tabela X: = kk = 60.568 Case UI-1910

* M jd. 71- 10 000 θχ - 4-B7 TABELA X Dependência da Susceptibilidade de Ί\_ ni para o Tratamento ALA + 2,2'-DP sobre o Instar das Larvas Tratadas Morte larval sobre a para além Experi dos controles depois de 3 dias ência 4 Instara na estufa (#) A 1 1 76 2 2 42 3 3 43 1 1 64 B 2 2 63 3 3 27 1 2 75 C 2 3 28 3 4 11 1 2 70 D 2 3 23 3 4 11 Coeficiente de correlação -0,897 entre o grau da instar e a morte larval Nível de significância 0,1# al. 2, 3 referem -se a primeira, segunda e terceira instar, re spectivamente A Tabela X mostra que a susceptibilidade de T. ni para o tratamento ALA — 2,2'-DP foi inversamente proporcional ao grau do instar, sendo as larvas do instar mais jovens as = 45 =

10 71 - 10 000 ΘΧ - 4-87

60.568

Case UI-I9IO

mais susceptíveis e sendo as da quarta instar as menos susceptíveis .

Para determinar se a susceptíbilidade ao tratamento ALA + 2,2'-DP depende da fase de desenvolvimento dentro de uma instar particular, larvas T. ni nas fases inicial, média e final da terceira e quarta instares foram tratadas com ALA + 2,2'-DP como acima. Os resultados são mostrados na Tabela XI:

TABELA XI

Dependência da Susceptíbilidade de T_^ ni para ALA -- 2,2'-DP sobre o Estágio de Desenvolvimento dentro de uma Instar Particular

Ex peri ência 4 Estágio de instar Morte larval sobre e para além dos contro les depois de 3 dias na estufa Grau de Antes de Depois de suscep— normali— normali-tibili- zação zação dade (#) ($) 1 Terceiro médio 1 47 52 A 2 Terceiro primitivo 2 60 66 3 Terceiro tardio 3 91 100 1 Terceiro médiõ 1 47 92 B 2 Terceiro primitivo 2 39 76 3 Terceiro tardio 3 51 100 1 Terceiro médio 1 21 57 C 2 Terceiro primitivo 2 18 49 3 Terceiro tardio 3 27 100 1 Terceiro médio 1 26 54 D 2 Terceiro primitivo 2 35 73 3 Terceiro tardio 3 48 100 Correlação entre 0 estágio de desenvolvimento 0,739 dentro de uma instar e a morte larval Nível de significância 1# = 46 =

6o.568 Case UI-I9IO

í!\ $ 1," ϊ3-ν···>· J ¾ .'od. 71 - 10 000 βχ - 4-87

Os resultados sugerem que, para uma instar particular, o último estágio foi o mais susceptível, seguido pelos estágios primitivo e médio. Isto por sua vez sugere que quanto mais próximas as larvas estiverem da apólise (separação do cutí-culo da epiderme), mais susceptíveis as mesmas são ao tratamento com ALA - 2,2'-DP. Os estágios médio, primitivo e tardio de cada instar particular foram assinalados com um grau de 1, 2 ou 3, indicando "1" o estágio menos susceptível e "3" o estágio mais susceptível. Para eliminar as diferenças 10 estatísticas em susceptibilidade entre as terceira e quarta instars (ver Tabela X), todos os valores de percentagem de morte dentro de cada experiência foram normalizados para o mesmo valor. 0 último foi escolhido como 100, e representou a percentagem de morte para o último estágio dentro de cada 15 instar (Tabela XI, última coluna). Deste modo tornou-se possível testar a relação entre a morte larval e os estágios primitivos, médio e tardio da instar, indendentemente do grau da instar. Como está indicado na Tabela XI, esta relação foi altamente significativa com os estágios primitivo e 20 médio da instar a ser menos susceptíveis ao tratamento com ALA + 2,2'-DP que o estágio tardio da instar. Este período de máxima susceptibilidade corresponde ao período em que as larvas são imóveis e a nova cutícula para a instar seguinte está sendo activamente sintetizada por baixo da cutícula 25 velha.

EXEMPLO X 30

Relação entre as espécies Larvais, ALA + 2,2'-DP Proto-acumulação Dependente, e Morte Larval

Para determinar se ALA + 2,2'-DP-acumula-ção Proto dependente e morte larval foram fenómenos gerais comuns a todas as larvas de insectos ou específicos para determinadas espécies particulares de insectos, foi realizado um estudo da resposta de várias espécies larvais ao trata- = *»7 = 35

60.568 Case UI-I9IO mento com ALA + 2,2-DP.

Colónias do perfurador do milho Heliothis zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae) foram desenvolvidas a partir de ovos proporcionados pelo Dr. Gilbert Waldbauer,no Departamento de Entomologia da Universidade de Illinois em Urbana Champaign. As larvas foram alimentadas com a mesma dieta que as T\_ jni acima.

As larvas de H_^ Zea foram pulverizadas como no Exemplo III; todavia, ao contrários das T\_ rri, as larvas H. zea são canibalísticas e têm de ser tratadas de maneira diferente. Vinte e cinco larvas com 1 cm de comprimento (mis tura da terceira e quarta instar) foram colocadas individualmente com um cubo de dieta em compartimentos individuais (3 x 5 x 1,5 cm) de um tabuleiro de plástico com 25 células (Bioserve, Inc,, Frenchtown, NJ 08825). Para confinar as larvas aos seus compartimentos individuais, o tabuleriro plástico foi coberto com uma placa de vidro. A placa de vidro foi removida antes da pulverização e foi colocada de novo imediatamente depois, Á pulverização foi como se descreveu para T\_ n_i. Os recipientes pulverizados foram cobertos com uma placa de vidro antes de ser colocadas no escuro a 25° durante 17 horas.

Os resultados são apresentados na Tabela XII:

TABELA XII

Dependência de ALA + 2,2'—DP — Acumulação Proto Dependente e Morte Larval sobre as Espécies Larvais

Ex peri ência Tratamento de H. zea Teor de Proto (nmol/lOO mg proteina) Morte Larval em H.zea passa dos 3 dias na estufa (*) Controle 0 0 A Tratado 2,5 7 alteração 2,5 7 Controle 0 0 B Tratado 1,* 33 alteração ιΛ 33 6ο.568 ij

Case UI-1910

Os tratamentos com ALA *+0 mH + 30 mM 2,2’-DP que resultaram em quantidades maciças de acumulação e em morte significativa larval em T ni (Tabelas VI-OX), resultaram num baixo nível de acumulação Proto em H_j_ Zea. A morte larval foi também muito mais baixa que em T. ni (Tabela XIl). Não se sabe presentemente se a proporção mais baixa de acumulação Proto e a concomitante proporção mais baixa de morte de lar vas H. Zea tratadas com ALA - 2,21-DP em comparação com T. ni é devida a(a) diferenças na transposição dos produtos químicos aplicados aos tecidos internos do insecto ou (b) a algumas outras diferenças fioquímicas básicas na regulação da passagem porfirina—heme entre as duas espécies. Nos

I T« ni tratados com ALA + 2,2’—DP, a maior parte de proto acumulou-se na hemolinfa. Isto por seu turno indicou uma transposição adequada de ALA e 2,2'—DP para os locais pretendidos. Se estes produtos químicos se transpõem do mesmo para os tecidos interiormente de H. zea não é conhecido.

Estes resultados mostram que algumas espécies de larvas são mais susceptíveis que outras ao tratamento com ALA - 2,2'-DP. Visto que é muito desejável extremi-nar insectos nocivos enquanto se defendem os benefícios, a susceptibilidade diferencial das diferentes espécies de insectos para os insecticidas porfíricos pode ser explorada concebendo insecticidas porfíricos para espécies específicas .

EXEMPLO XI

Eficácia do Tratamento com ALA + 2,2'-DP na Ausência de um Período de Incubação no Escuro Pos--Pulverização

Larvas de T. ni na segunda instar foram pulverizadas com ALA + 2,2'-DP e foram submetidas a um período de incubação no escuro de 17 horas antes da exposição à luz na estufa (pulverização no escuro). Larvas semelhan- 60.568 Case UI-1910 v - itóJíSSJ S % / 71 - 10 000 βχ - 4-87 25 tes foram pulverizadas com ALA + 2,2'-DP na estufa, no início da fase de luz do fotoperíodo 1^ horas de luz-10 horas de escuro (pulverização à luz). Os resultados de quatro experiências estão indicados na Tabela XIII:

TABELA XIII

Comparação da Eficácia de ALA + 2,2'—DP Pulverização com 10 15 20 Luz e Pulverização no Escuro em T. n_i Es- peri- ência Tratamento Morte Larval passados 3 dias na estufa ($) DSP Controle 21 A DSP 20 mM ALA + 15 mM 2,2*-DP 90 DSP de alteração 69 LSP Controle 25 B LSP 20 mM ALA + 15 mM 2,2'-DP 9 b LSP de alteração 60 DSP controle 1*» C DSP J*0 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP 93 DSP de alteração 79 LSP controle 5 D LSP kO mM ALA + 30 mM 2,2’-DP 83 LSP de alteração 78 30 em que "DSP" = pulverização no escuro e "LSP" = pulverização à luz. As pulverizações à luz foram tão eficazes a Pr£ vocar a morte larval como as pulverizações no escuro. Estes resultados foram por sua vez muito semelhantes aos dos tratamentos herbicidas fotodinâmicos no escuro e à luz apresen tados na patente norte-americana Numero de Serie 895*529* = 50 = 35

6o.568 Case UI-I9IO /"*.·

EXEMPLO XII 1,10-Fenantrolina como um Inibidor/lntensificador 5 10

Para determinar se os produtos químicos que apresentaram propriedades indutoras ou intensificadoras apresentariam propriedades semelhantes em insectos, foi examinado o efeito sobre acumulação em T_^ ni de vários inten-sificadores e indutores de acumulação de tetrapirrole em plnatas conhecidas. As larvas ni na terceira instar foram pulverizadas com uma solução de kO mM ALA + 30 mM 1,10--PA como descrito no Exemplo III para ALA + 2,2'-DP. As larvas de controle e as larvas tratadas foram trabalhadas e a-nalisadas como descrito no Exemplo II. Os resultados destas experiências são apresentados na Tabela XIV: 15 71 - 10 Q00 οχ - 4- 87 20 25 30 TABELA XIV Efeitos Sinérgicos de ALA + 1,10-PA ao Provar Acumulação Proto e Zn-Proto e a Morte Larval em T. ni nMoles/100 mg Morte Larval passa Ex- proteina dos 3 dias na per i- 4 Tratamento Teor de Teor de estufa ência Pro to Zn-Pro to (*) 1 Controle 0,19 0 0 2 hO mM ALA 3,18 0 16,8 A 3 30 mM 1,10-PA 35,26 b,k5 69,6 u kO mM ALA + 30 mM 1,10-PA 151,92 3,75 93 1 Controle 0 0 6,1 2 40 mM ALA 2,08 0 5,3 B 3 30 mM 1,10-PA 18,55 1,08 7b,7 k b0 mM ALA + 30 mM 1,10-PA 227,77 6,15 93,3 Coeficiente de correlação 0,78 0,862b Nível de significância 5# 1 i> Correlação entre morte larval e acumulação Proto ^Correlação entre morte larval e acumulação Zn—Pro to. = 51 = 35 10 15

Mod. 7Τ - 10 000 θχ - 4-87 25 60.568

Case UI-I9IO

Como foi observado com 2,2'-DP (Tabela VIII), o 1,10-PA apresentou propriedades muito fortes de indução-intensificação de tetrapirrole, como é mortrado pelo muito forte sinergismo em acumulação Proto que foi observada quando ALA e 1,10-PA foram utilizados conjuntamente.

Além disso, para a acumulação maciça de Proto, o tratamento com 1,10-PA na presença ou na ausência de ALA, resultou na formação de quantidades mais pequenas de Zn-Proto. A correlação entre a acumulação Zn-Proto e a morte larval foi altamente significativa. Iéto, por sua vez, sugeriu que a formação de Zn-Proto estava de algum modo fortemente relacionada com a morte larval.

Outras experiências foram designadas para determinar se o Zn-Proto foi de facto formado enzimaticamen-te ou não. Por exemplo, a adição de 1,10-PA a Proto dissolvidos em acetona a 80$ não resultou na formação de Zn-Proto depois de 17 horas de incubação. Noutras experiências, larvas T\_ ni. vivas e mortas foram tratadas com kO mM ALA + + 30 mM 1,10-PA exactamente como descrito na Tabela XIV. As larvas vivas foram mortas por fervura em água a 100°C durante 5 minutos antes da pulverização. Os resultados estão a— presentados na Tabela XV:

TABELA XV

Efeito do tratamento com ALA + 1,10-PA sobre Zn-Proto e Acumulação do Proto em Larvas Tj_ ná. vivas contra as mortas 30

Ex- peri- =$= Tratamento ência nMoles/lOO mg proteína

Teor de Teor de Proto Zn-Proto

Morte Larval passados 3 dias na estufa ($)

1 Controle 2 Larvas mortas tratadas com kO mM ALA + 30 mM 1,10-PA 0, 0 0 0 0 = 52 = 35

'X-*'60.568 Case UI-I91O 13. í i V/, \ . . t. 71 - 10 000 βχ · 4-87 1 TABELA XV (Continuação)

Efeito do tratamento com ALA + 1,10—PA sobre Zn—Proto e Acumulação do Proto em Larvas T. ni vivas contra as rnortas 1 Ex- nMoles/100 proteína mg Morte sado s Larval pas-3 dias peri- 4 Tratamento Teor de Teor de na estufa ênc ia Proto Zn—Proto (*) 3 Larvas vivas tratadas com *40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA 2*42,7 3,25 93,*4 1 Controle 0,11 0 0 2 B Larvas mortas tratadas com *40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA 0 0 3 Larvas vivas tratadas com *40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA 251,23 *4,*43 100

Como está apresentado, apenas insectos vivos com metabolismos activos foram capazes de acumular Proto e Zn-Proto. 0 conjunto destes resultados indica fortemente que a formação de Proto e Zn-Proto pelos insectos tratados foi uma consequência da actividade enzimática.

EXEMPLO XIII

Administração do Tratamento ALA + 1,10-PA na Dieta

Sob certas condiçães de campo é por vezes preferível administrar um insecticida como um engodo em vez de como uma pulverização. As seguintes experiências foram portanto concebidas para demonstrar a eficácia de insecti-cidas porfíricos quando administrados como engodo. = 53 =

ί 6θ.568

Case UI-1910

Numa experiência, cubos de alimento de i':eio Waldbauer foram pulverizados a uma velocidade total de 1,5 ml por 10 ml de dieta sólida. Um terço do volume foi pui verizado ao mesmo tempo. Os cubos de dieta foram deixados secar, depois o processo foi repetido mais duas vezes. As larvas não tratadas foram então colocadas com as tratadas com dieta no escuro durante 17 horas. Alternativamente, as larvas, juntamente com a sua dieta, foram pulverizadas como no Exemplo III. Os resultados estão apresentados na Tabela XVI:

TABELA XVI

Efeito da Adição de ALA + 1,10-PA a Dieta na Morte

Larval de T. ni

Tratamento

Morte Larval dentro dos primeiros 8 minutos a luz (*)

Morte Larval passados 3 dias na estufa (*)

1 Controle 2 Dieta pulverizada apenas com kO mM ALA + 30 mM 1,10-PA 3 Dieta e insecto pulverizados com 40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA 0 62,5 91,2 2,2 95,9 96,7

Como apresentado, a aplicação dos produtos químicos apenas através do alimento foi tão eficaz em provocar a morte larval como na pulverização tanto nos insectos como na sua dieta. Além disso observou-se que a maior parte da morte larval em insectos que ingeriram a dieta tratada ocorreu durante 02 primeiros 8 minutos de exposição à luz, com substancial nú-

60.568 Case UI-I9IO

Ί V / v 15 Μ o d. 71 - 10 000 οχ - 4-87 20 * y * mero de mortes ocorrendo durante os primeiros 2 minutos a luz.

Noutra experiência, o ALA e 1,10-PA foram incorporados na dieta a uma velocidade de l6 a 12 m>! res-pectivamente. A dieta foi misturada com o ALA e 1,10-PA num misturador a 37°C durante 5 minutos. As larvas foram colocadas na dieta engodada duranie 17 horas no escuro antes de se rem expostas a luz. Os resultados estão apresentados na Tabela VII:

TABELAXVII

Efeito da Adição de ALA + 1,10-PA a Bieta na Morte

Larval de T. ni =j^ Tratamento

Morte Larval den tro dos primeiros 8 minutos a luz

Morte Larval passados 3 dias na estufa (*) 1 Control 0 4 2 Dieta contendo l6 mM ALA + 12 mM 1,10-PA 91,9 100 25 30

Noutra experiência, a dieta foi aquecida num forno de convecção e o ALA e 1,10-PA foram adicionados à dieta aquecida a 57°C. A mistura foi então amalgamada durante 45 segundos num Sorvai Omnimixer (Omni Co. International, CT O6706). Os resultados são apresentados na Tabela XVIII: = 55 = 35

60.568 Case UI-I9IO

TABELA XVIII Efeito da Adição de ALA + 1,10-PA à Dieta na Morte Larval de T. ni

Morte Larval deri Morte Larval pas — tro dos primeiros sados 3 dias na # Tratamento 8 minutos à luz (*) estufa (*) 10 1 Con trole 0 2 Dieta contendo ALA l6 mM 0 5,2 3 Dieta contendo 1,10-PA 12 mM 0 4o, U 15 k Dieta contendo ALA + 12 mM 1, l6 mM 10-PA 9h,k 71 - 10 000 βχ - 4·Β7 20 25 30 EXEMPLO XIV Administração de Indutores e/ou Intensificadores Alternativos 0 meio de Waldbauer foi aquecido num forno de convecção a 57-65°C e combinado com 4 mM de ALA e 3 mM de um dos vários compostos de teste. A mistura foi então combinada durante 2 minutos num Omnimixer Sorvai. Larvas ni_ foram colocadas com a dieta tratada no escuro durante 17 horas como acima. A morte das larvas foi determinada ao fim do período de escuridão (antes da exposição á luz) e depois de três dias na estufa. Um controle que consiste em dieta em branco (não tratada) foi passado por cada composto testado.

Os resultados são apresentados na Tabela = 56 = XIX: 35 15 10 15 O O o o t3 -7 20 25 30 60.568Case UI-1910

ctí φ G £> O inco P Φ *H P «a c to ο > I Φ CO (0 α c Ρ Φ (0 (0 > Ή G Ό X--X C0 Ρ ΙΤ\ "-" (0 Φ φ <Η Ρ ο 3 f-ι V -Ρ Ο Ctí C0 X <η φ ο(0 ο Ό ο co *ρ

Ρ C0 G G > G φ U φ ο Ρ cd α G Ρ Ρ 3^-» C ο φ Ό cn -—- φ Ρ φ φ Ρ G Ε G (0 Ο Ρ ο ο > X Ρ C Ό G cO (0 Ο Ρ Φ •Η Η X Ρ ρ| Ο Η •Η G| G X φ Ρ C •1 G < φ Ρ1 0 Ρ Ρ ο « G φ Ρ Η η < η 3 φ Ο Ρ χ G Φ Ο X o o a\ o o os

CT\ ON r- <J\ r~- CT\ N \ΰ líl σ\ σ\ x t- ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο

Λ G ο ο ο ο ο ο φ 0 φ G X--V G P o ο cd cd cd G Ό Ρ G G G (S •H 3 Ρ P P G X iH Ό Ρ P P Φ vo mH C ο cd cd cd o o cd P l *0 Η G G C G G G G 1 z cd Ρ P P P P P P o b £ φ C P P P G G P P cd mH mH cd Ο cd o o o cd cd o ·> c P* X G •Η G G G G G G G P •H mH O P G Φ P P P Φ φ P 1 V Ό -P Ό Ή Ρ c G G P P c P •H 1 0) P > CC 1 cd cd cd 1 1 ctí P u - O G G ο G C G o o G P mH CV P + Ρ ιΗ Φ Φ φ P P Φ Φ α •k rH α Ρ •k P P P •k — P E V-" CV mH G C ο Η 1 1 1 rH P 1 ctí Vi 1 Ό φ Ρ G 1 o o o 1 1 o G mH rH •ri P << Ρ »Η P P Η P P rH P x> mH ÍH 1 C •Η «k ·. •k P P ·> Φ 0 -P •H r φ α -Ρ H P rH P c iH P •H Φ α CM Ό C Φ 1 1 1 Φ Φ 1 1 -P £ I •k φ ε P o 1—1 E P o oo mH Ή cv Ο Ρ mH P g P P P G •k Ό Ό VO Ρ 1 Ό P P P Ό TJ O C-- 1 1 rH ·· Ρ ο 1 Φ P Φ 1 1 rH #k — — •H - φ Ρ ε G ε f- O Hf C\í Hf c cv Ρ •k •k 1 1 1 1 •k ·. Φ •k W Ή J· P- in m m <r\ cv Hf Cm cv = 57 = 35 15 10 15 o o o o 20 25 30

6ο.568 Case UI-I9IO

Alt " ‘ '' η·.

co 1 m co Φ cd G G α X 0 h cn (0 cd co > P /-N cO G Ό -P cd '—' φ P c^ P co O φ cn Ch P O d cd G Ό -P G 0 cd cn 2 cn φ cn 0 > O P cd 0 -P Ό cO P O G cd <P --s G > G 0 V G 0) 0 tco -P cd α G θ’ Ή _l d-—’ cd c 0 0 d Φ Ό cn —· G cn -P φ P co tH G E P G Λ O P 0 C 0 > 2 <G G 0 u g O cd cd — 0 G) Φ Ή H X «H •Hl O H -H cl G X n -P G •I G c 0) Hl O -l p 0 w G Φ m H •σ < H d 1) O -P \ G Φ O 2 cn 0) G 0 -P d Ό C H cn 0 •H G 'cd > + C X c Φ Ό 0 p P 0> Ch « cjn CMn -J-í -3- r\ c~\ η cm

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6ο.568 Case UI-I9IO ίο d 0) Λ C U a X> 0 h m w 3 3 > P y-s. ca u x -P 3 ^—' a) h cp *w «J Q φ m P p 0 3 3 C Ό V c 0 3 m Z cn φ 10 O > 0 •H 3 0 -P •D «3 rH O C 3 *P U > c ^ d) U Φ 0 0 -P 3 a c Kí P 3/-v 0 < 0 3 Φ X 3 '— D (Π p Φ C 0) C E P ÍH Ή O -H O -P 0 3 Z <H c c Ό > 0 «a u 0 o 3 Φ '_* P P Ch O X •Hl u H Λ cl p X c c 0) •1 0 < -P hI 0 p C « H <u m X < D c-1 O Φ —^ -P d) u 0 W z

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CP CP P

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Experiências repetidas com 4 mM ALA apenas deram a morte larval passados três dias na estufa que consistentemente variou entre 0 e 5$· Assim, os resultados acima mostram claramente que 1,10-fenantrolina; 4,7-di- metil-1,10fenantrolina; 4-metil-l,10-fenantrolina; 5- -nitro-1,10-fenantrolina; 5-metil-l,10-fenantrolina; 5,6-dimetil-l,10-f enantrolina; 4,7-difenil-1,10-fenantrolina; 3,4,7»8-tetrametil-l,10-fenantrolina; 2,2’-ditio- bis(piridina N—óxido); 4,41 —dimetil—2,2’-dipiridilo; fenil 2-piridil cetoxima; e 2,2':6',2"-terpiridina funcionam como indutores e/ou intensificadores de ALA e são eficazes como insecticidas activos à luz.

EXEMPLO XV

Efeito de ALA e 1,10-Fenantrolina sobre Larvas de Mamestra brassicae 0 efeito de insecticida ingerido que compreende ALA e 1,10—fenantrolina foi testado sobre as larvas de Mamestra brassicae, uma peste importante em vegetais crucíferos. A dieta foi preparada num vaso de aço inoxidável utilizando um misturador de cozinha Kenwood como segue: 1. 1530 ml de água desmineralizada, 504 g de milho triturado (também máximo de partícula 1 mm), 135 g de levedura de cerveja, e 135 g de germen de trigo foram combinados à temperatura ambiente. 2. 5,4 g de parahidroximetilbenzoato foram diluídos em 12 ml de etanol a 90°C e todos os 12 ml foram adicionados à mistura da fase (l) acima. 3. 1530 ml de água foram combinados com 72 g de agar e 6 g de ácido benzóico e a mistura foi levada até a ebulição. A mistura foi deixada arrefecer até = 60 = 35 10 15 4-87 20 25 30 60.568Case UI-1910

70°C, depois foi adicionado abd à mistura resultante a partir da fase (2) acima. k, A mistura resultante da fase (3) acima foi deixada arrefecer até í*0°C e foram adicionados 18 g de ácido ascórbico como um retardador de oxidação. 5. A mistura resultante foi homogeneizada e armazenada para utilização como dieta padrão. A dieta tratada foi preparada dissolvendo uma quantidade apropriada('S) de ingrediente ( s) activo(s) em etanol e adicionando 1 ml desta solução a 9 ml de água desmineralizada. Todos os 10 ml da solução etanol:água (l:9 v/v) resultante contendo a quantidade(s) apropriada(s) de ingrediente(s) activo(s) foram então adicionados à mistura resultante da fase (3) acima, antes da adição de ácido ascórbico.

Colónias de brassicae foram criadas em massa sobre dieta padrão (não tratada). λ medida que as lar! vas se aproximavam da terceira instar, porções de 20 larvas cada foram desviadas da dieta padrão para várias dietas de teste contendo ingrediente(s) activo(s). Os discos foram cobertos com folha de alumínio e as larvas foram deixadas alimentar—se sobre a dieta de teste ad libitum durante um período no escuro de 16 horas. Depois a folha foi removida e as larvas foram expostas a luz artificial (lâmpada de vapor de Mercúrio de ^00 watts a 50 cm). Os controles foram alimentados com dieta não tratada. Os resultados estão indicados na Tabela XX: = 6l = 35

6ο.568

Case UI-I9IO

TABELA XX

Efeito de ALA e 1,10-Fenantrolina sobre Larvas de M. brassicae

Depois da exposição Antes da exposi a luz durante ção a luz 2 minutos

l6 mM ALA + 12 mM 1.10- fenantrolina 0 100

2 mH ALA + 1,5 mM 1.10- fenantrolina O 100

Controle 0 O O efeito da exposição a luz é dramático: ime diatamente depois da exposição,os insectos tratados começaram a torcer-se e morreram. 100$ dos insectos tratados estavam mortos num espaço de dois minutos. Esta experiência foi repetida três vezes com resultados idênticos.

EXEMPLO XVI

Efeito de ALA e 6-Aminonicotinamida sobre Blatella germanica adultos 0 efeito de insecticida ingerido compreenden do ALA e 2-aminonicotinamida foi testado sobre a peste doméstica Blatella germanica (barata germânica). A dieta padrão compreendeu uma mistura de grãos triturados (milho, trigo, arroz e farelo), açúcar de cana, proteína de soja, ovos, extracto de erva doce, alimento completo para ratos de laboratório, e água desmineralizada. 0 alimento tratado foi preparado dissolvendo 62 =

60.568

Case UI-1910 quantidade apropriada de ingredientes activo(s) em etanol, combinando uma parte desta solução de etanol com 19 partes de água, e adicionando 1 ml de solução resultante a 5 g de alimento. O alimento foi deixado secar antes de ser utilizado .

Colónias de B. germanica foram desenvolvidas em massa sobre dieta padrão (não tratada) até à fase adulta. Num princípio de tarde em Novembro, em Marselha, França, dez machos adultos foram colocados em cada um dos discos de Petrie juntamente com 5 g de uma das dietas de teste. Os dis^ cos foram deixados assentar sobre o topo da bancada, receben do a luz do dia), durante o resto do dia (cerca de 3,5 horas). Os discos foram depois deixados assentar sob condições ambientes normais (luz e temperatura ambiente) durante quatro dias para simular as condições domésticas normais. Os mesmos foram expostos a escuridão natural durante, cada noite, 13 horas e k luz ambiente durante cerca de 11 horas cada dia. Um quarto disco de controles foi alimentado com dieta padrão (não tratada). As contagens de mortalidade foram conduzidas em cada tarde . Os resultados estão indicados na Tabela XXI:

TABELA XXI

Efeito de ALA e 6-Aminomicotinato sobre B. germanica Adultas

Concen— $ de Mortalidade tração __

Ingrediente activo (mg/g de alimento) Dias 1 de 2 Esposição 3 k Controle 0 0 0 0 0 ALA 1 0 0 0 0 6-Aminonicotinato 1 0 0 0 0 ALA + 6-Aminonicotinato 1+1 50 70 90 100 = 63 = 10 15 71 - 10 000 θχ · 4·07 20 25 30 35 60.568 Case UI-1910

jíh. ess

Estes resultados mostram claramente que o 6-aminonicotinato é um indutor e/ou intensificador de ALA, e as composições insecticidas do presente invento podem ser eficazes contra insectos sob condições normais no interior de luz e escuridão ambientes. A indução química das larvas de insecto para Proto e Zn-Proto acumulados que provocam a morte larval no escuro e à luz do dia proporciona novas composições e métodos insecticidas. Propõe-se a expressão "insecticidas por fíricos" para referir este fenómeno. λ luz o Proto e Zn--Proto acumulados desaparecem dos tecidos dos insectos dentro de horas. Esta aproximação é semelhante à concepção dos herbicidas fotodinâmicos apresentada na patente norte-americana No. de Série 895*529. Todavia, o dano nas plantas tratadas com os referidos herbicidas ocorreu apenas à luz do dia e foi apenas de natureza fotodinâmica. Além disso, os tetrapirroles que mais danificaram foram Mg-tetrapirroles que pertenciam ao caminho biosintético Chi. Crê-se que o ramo Mg do caminho biosintético de tetrapirrole que conduz à biosíntese de Chi não é funcional em insectos. Como consequência a biosíntese de ir termediários contendo Mg do caminho biosintético Chi não pode ser detectada em T. ni tratadas com ALA ou com ALA + + 2,2'-DP. Portanto, os pigmentos de clorofila que dão às larvas a sua cor verde amarelado são muito provavelmente derivados de pigmentos de clorofila da dieta (Tabelas II, III, IV). Todos os insectos, contudo, devem conter citrocromas que actuam como veículos de electrões em fosforilação oxida-tiva. Crê-se presentemente que a metade heme de citocromas é formada a partir de Proto que é sintetizada por sua vez a partir de ALA através do caminho biosintético de porfirina / Flowchart A acima/. A acumulação dependente de ALA de Proto por Ti. ni é completamente compatível com esta hipótese. Ao contrário do que foi observado em plan- 6U = 1 5 10 15

Mod. 71 · 10 000 βχ - 4-87 20 25 30 60.568 Case UI-1910

tas a acumulação no escuro de Proto em T^_ n_i é acompanhada pela morte larval no escuro (Tabela VII). λ luz, uma formação maciça de Proto não parece ser obrigatória, todavia, para a ocorrência de dano fotodinâmico (Tabelas VII, XIII). Esta conclusão é baseada em duas observações: (a) à luz, a acumulação maciça de Proto não é observada, provavelmente como uma consequência do estado uniforme de foto-destruição do Proto biosintetizado (Tabela Vil), e (b) pulverizações à luz (que não envolvem um período de incubação pós-pulveriza-ção durante o qual o Proto se pode acumular) foram tão eficazes em provocar a morte larval como as pulverizações no escuro que não incluíam um tal período de incubação no escuro pós-pulverização antes da exposição à luz (Tabela XIIl), Em todos os casos estes resultados sugerem que o que é neces sário para a ocorrência de dano fotodinâmico em insectos tra tados é uma formação de estado uniforme de pequenas quantidades de Proto em proporções suficientemente grandes para iniciar as reacções em cadeia de danificação de radical livre . Um dos maiores problemas em relação à in-dústira dos insecticidas é a alarmante velocidade à qual os insectos desenvolvem resistência contra os insecticidas.Is to é normalmente uma consequência de mutações que podem aumentar os mecanismos de desintoxicação dos insectos ou alteração das propriedades liofílicas da toxana, reduzindo assim a sua permeabilidade de membrana. Isto por sua vez encurta consideravelmente o tempo de vida útil de insecticidas recentemente introduzidos e reduz o seu valor comercial. Crê--se que visto que a modulação química do caminho porfirina--heme de acordo com o presente invento parece envolver mais que uma fase metabólica, será mais difícil para os insectos desenvolver resistência contra insecticidas porfíricos. Mesmo se alguns insectos tiverm êxito em desenvolver contra a acumulação de tetrapirrolepor desenvolvimento de meios para rapidamente destruírem os tetra-pirroles acumulados, isto = 65 = 35 13 13 10 15 71 - 10 000 θχ - 4-87

A 60.568

Case UI-1910 não é suficiente para proteger os insectos mutados contra o dano fotodinâmico à luz. Como é sugerido pelas Tabelas VII e XIII, a luz o Proto é mais provavelmente destruído quase tão rapidamente como é formado; ainda, tal acumulação mínima é suficiente para provocar o dano fotodinâmico extensivo âs larvas. Ainda, uma mutação que bloqueia o Proto e a biosín-tese de citocroma em conjunto seriam analogamente mais letais.

Outros exemplos de composições e aplicações dentro do espírito e âmbito do presente invento tornar-se-ão evidentes para os entendidos nesta técnica tendo em consideração o que antecede e consequentemente apenas tais limitações como aparecem nas reivindicações anexas deverão ser colocadas ao mesmo. 0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América em 13 de Janeiro de 1988 sob o N? 144 883. 20 25 30 = 66 = 35

Claims (1)

1. 60.568 Case UI-1910 -REIVINDICAÇÕES- 1? - Processo para a preparação de uma com posição insecticida, caracterizado por se incorporar uma quantidade eficaz como insecticida de um ou mais compostos que consistem em ácido delta-aminolevulxnico, indutores de ácido delta-aminolevulínico, ou intensificadores da conversão de ácido delta-aminolevulínico em tetrapirroles. 2§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar ácido delta—aminole-vulínico. 3* - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender um ou mais indutores de ácido delta-aminolevulínico. 4* - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por se incorporar um ou mais in tensificadores de conversão de ácido delta-aminolevulínico em tetrapirroles. 5» - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a quantidade dos referidos compostos ser suficiente para fornecer de 113,4 a 907,2 g (0,25 a 2 libras) de ácido delta-aminolevulí^ nico por 4.046,84 m'” (l acre) e/ou de 45,6 a 680,85 S (0,1 a 2 1,5 libras) de indutor ou intensificador por 4,0,46,84 m (1 acre). 6¾ - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se incorporar um ou mais dos seguintes: veículo(s), dissolvente(s), tampão(ões), agente(s) de humedecimento, agente(s) de disper são, agente(s) de eliminação de espuma, emético(s) agente(s) contra cheiros, penetrante(s), agente(s) tensioactivo(s), emulsionante(s), adjuvante(s), herbicida(s) e um ou mais de outros insecticida(s). = 67 = 15 KVjJ. 71 - 10 000 οχ - 4-87 20 25

   6θ.568 Case UI-I91O 7- - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os referidos compostos estarem contidos numa solução que tem uma concentração de cerca de 2 a cerca de 50 mM de ácido delta-aminolevulínico e/ou de cerca de 0,1 a cerca de 50 mM de indutor ou intensificador. 8- - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os referidos compostos estarem contidos numa preparação a ser ingerida por insectos e a quanti dade dos referidos compostos ser suficiente para fornecer de cerca de 10 ng a cerca de 5 ng de ácido delta-aminolevulínico por mg de peso do corpo do insecto e/ou de cerca de 1 ng a cerca de 5 microgramas de indutor ou intensificador por mg de peso do corpo do insecto. 9- - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a referida composição compreender um oy mais compostos que consistem em ácido delta-aminolevulínico; 2,2'-dipiridilo; 1,10-fenantro-lina; k,7-dimetil-l,10-fenantrolina; ^-metil-l,10-fenantroli na; 5—nitro—1,10—fenantrolina; 5—metil-1,10—fenantrolina; 5,6-dimetil-l,10-fenantrolina; 4,7-difenil-1,10-fenantrolina ; 5-cloro-l,10-fenantrolina; 3»^,7,8-tetra-metil-1,lOfenan trolina; 2,2'-ditiobis(piridina N-óxido); U,k'-dimetil-2,2'--dipiridil; fenil 2-piridil cetoxima, e 2,2':6',2terpiri-dina. 10* - Processo para a preparação de uma composição insecticida de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se formular a referida composição de modo a incluir uma quantidade eficaz como insecticida de um ou mais compostos que consistem em ácido delta-aminolevulínico, indutores de ácido delta-aminolevulínico, ou intensif ficadores da conversão de ácido delta-aminolevulínico em te-trapirroles. 11* - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se utilizar ácido delta-aminolevu- = 68 = 35 60.5Ó8 Case UI-I91O Ixnxco· 12- - Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por compreender a utilização de um ou mais indutores de acido delta—aminolevulínico. 13- - Processo de acordo com a reivindicação 10, 11 ou 12, caracterizado por se utilizar um ou mais intensificadores da conversão de acido delta—aminolevulínico em tetrapirroles. 10 15

   lOQQ vOo 14* - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 10 a 13, caracterizado por a quantidade dos referidos compostos ser suficiente para forne cer cerca de 113,4 a 907*2 g (0,25 a 2 libras) de ácido del-ta-aminolevulínico por 4.046,84 m (l acre) e/ou de cerca de 45,6 a 680,85 S (0,1 a 1,5 libras) de indutor ou intensifica ift-fr - xo ooo ov - li 20 25 30 dor por 4.046,84 m (1 acre ). 15- - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 10 a 14, caracterizado por se incorporar um ou mais dos seguintes: veículo(s), dissolven-te(s), tampão(ões), agente(s) de humedecimento, agente(s) de dispersão, agente(s) de eliminação de espuma, emético(s), agente(s) contra cheiros, penetrante(s), agente(s) tensioac-tivo(s), emulsionante(s), adjuvante(s), herbicida(s) e um ou mais de outros insecticida(s). 16- — Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os referidos compostos estarem incluídos numa solução que tem uma concentração de cerca de 2 a cerca de 50 mM de ácido delta-aminolevulínico e/ou de cerca de 0,1 a cerca de 50 mM de indutor ou intensificador. 17“ - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os referidos compostos estarem incluídos numa preparação a ser ingerida por insectos e a quan tidade dos referidos compostos ser suficiente para fornecer cerca de 10 ng a cerca de 5 ng de acido delta-aminolevulxni- = 69 = 35 71 - 10 000 βχ - 4-07 60.568 Case UI-I9IO .f / .·» v 1 co por mg de peso de corpo de insecto e/ou de cerca de 1 ng a cerca de 5 microgramas de indutor ou intensificador por mg de peso do corpo do insecto. 5 18? - Processo para induzir a acumulação de tetrapirroles em insectos vivos, caracterizado por se pôr em contacto os referidos insectos com uma composição obtida pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9. 10 19- - Processo para exterminar insectos, caracterizado por se por em contacto os referidos insectos com uma composição obtida pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9. 15 s X 0 0 20* - Processo de acordo com a reivindicação 19» caracterizado por os referidos insectos tratados serem expostos à escuridão durante cerca de 1 a 8 horas e depois expostos à luz. 0 0 0 í 20 21* - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a referida luz compreender a luz natural do dia. 22* - Processo de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado por a referida exposição à luz ser efectuada durante um período de cerca de 1 a l4 dias. 25 23* —Processo de acordo com as reivindicações 10, 18 ou 19* caracterizado por compreender a utilização de um ou mais compostos que consistem em ácido delta-ami nolevulínico ; 2,2 ' -dipiridilo ; 1,10-f enantrolina ; í+,7-dime-til-1,10-fenantrolina; U-metil-1,10-fenantrolina, 5-nitro- 30 -1,10-fenantrolina; 5"metil-1,10-fenantrolina; 5»6-dimetil- 35 = 70 = 6ο.5ό8 Case UI-I9IO 6o . 568 Case UI-I9IO - 1,10-fenantrolina; 2,21-ditiobis(piridina N-óxido); k,k'~ -dimetil-2,2'-dipiridil; fenil 2-piridil cetoxima, e 2,2': :6',2terpiridina. 5 Lisboa, ]3JANia3Q Por THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY 10 OF ILLINOIS 15

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