PT89224B

PT89224B - Processo para a preparacao de peptidos para o bloqueamento da actividade do pai-1 no sangue humano e sua utilizacao na preparacao de anticorpos

Info

Publication number: PT89224B
Application number: PT89224A
Authority: PT
Inventors: Thomas Stief; Werner Stuber
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-12-18
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1993-07-30
Also published as: FI885797A0; JPH01199996A; DK703588D0; EP0320840A2; DK703588A; KR890009972A; AU634955B2; PT89224A; AU2695588A; DE3742997A1; FI885797A; EP0320840A3

Description

(54) Epígrafe: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS PARA O BLOQUEAMENTO DA ACTIVIDADE DO

PAI-1 NO SANGUE HUMANO E SUA UTILIZAÇÃO NA PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS (57) Resumo:

% <5

X-.

Memória descritiva referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D“3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Thomas Stief e Dr. Werner Sttiber, residentes na Alemanha Ocidental), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS PARA O BLOQUEAMENTO DA ACTIVIDADE DO PAI—1 NO SANGUE HUMANO E SUA UTILIZAÇÃO NA PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS .

Memória descritiva

A invenção refere-se a póptidos que contêm a sequência de aminoácidos do centro activo do inibidor do activador de plasminogénio endoteliar (PAI-1), a um processo para a sua preparação, a anticorpos preparados através da imunização de animais com os referidos póptidos, bem como à utilização desses anticorpos para o bloqueamento do PAI-1 no sangue humano.

Descobriu—se recentemente que a actividade dos dois activadores de plasminogénio humanos de maior significado fisiológico, o t-PA e o u—PA, ó regulada por meio de dois inibidores específicos no sangue. Trata-se, por um lado, do ini bidor do activador de plasminogénio endoteliar, o chamado PAI-1 que ó fabricado e libertado, entre outros, pelas células endotólicas e pelos trombócitos, e, por outro lado, do inibidor do

J.M activador de plasminogénio placentar, o chamado PAI-2, das células trofoblásticas da placenta. Os dois inibidores equivalem —se nas suas elevadas constantes de associação com activadores de plasminogénio, mas não estão relacionados do ponto de vista imunolégico.

Estes inibidores parecem ter um grande significado clínico, uma vez que concentrações extremamente elevadas de PAI-1 podem conduzir a complicações graves para a vida. Estas situações foram já descritas para pacientes com trombose profunda das veias das pernas, enfarte cardíaco agudo, infecção sanguínea bacteriana, doenças de fígado, inflamações do pân creas, cancro, bem como na fase tardia da gravidez e em casos de toxicose da gravidez.

È de interesse diagnóstico e terapêutico en contrar uma substância que consiga bloquear a actividade deste inibidor, de modo específico.

Descobriu-se surpreendentemente que se pode bloquear a actividade do PAI—1 com anticorpos que se obtêm quan do se utiliza como agente imunogénico por exemplo um péptido com a sequência Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile, acoplado, conforme o caso, a uma molécula suporte.

objectivo da invenção é por isso um péptido contendo de 4 a 40 aminoácidos, cuja sequência coincida com a sequência de aminoácidos do péptido Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile ou com partes desta sequência.

A sequência -Arg—Met- parece ter um signifi cado especial, preferindo—se por isso os péptidos que contenham esta sequência.

Preferem—se os péptidos com 6 a 25 aminoáci. dos em que a sequência -Arg—Met- se encontre flanqueada por pelo menos 2 aminoácidos.

Preferem—se em especial os péptidos Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile ou

Cys-Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile.

Estes péptidos podem utilizar-se para a preparação de anticorpos apropriados no âmbito da invenção.

Estes anticorpos podem purificar-se por imunoadsorpção através dos péptidos correspondentes. Estes anticor pos bloqueiam especificamente a actividade do PAI-1 presente no sangue humano.

A preparação dos péptidos de acordo com a in venção efectua-se segundo processos em si conhecidos, por exemplo de acordo com a técnica clássica de síntese em solução, em que se condensam entre si aminoácidos protegidos ou segmentos peptídicos, obtendo-se o péptido desejado após remoção dos grupos protectores. Contudo, os péptidos de acordo com a invenção preparam-se de preferência segundo o método da síntese em fase sólida, sendo por isso também um dos objectivos da invenção um processo para a preparação destes péptidos.

Na síntese peptídica em fase sólida constroem-se os péptidos sobre uma matriz, como poliestireno de re de cruzada, poliacrilamida ou análogos, eventualmente providos de moléculas adsorventes, removendo-se depois da matriz. Empregou-se de preferência uma matriz de poliestireno insolúvel (de rede cruzada com divinilbenzeno a 1%) para estas sínteses, com uma carga do aminoácido C-terminal de 0,1-1 mmol/g, de preferên cia de 0,4-0,6 mmol/g de resina. Uma vez que a construção dos péptidos se efectuou empregando o grupo Fmoc lábil em meio bási. co, utilizaram—se como moléculas adsorventes (moléculas âncora) compostos p-alcooxibenziléster de acordo com o usual desta técnica. Como solventes empregaram-se nesta síntese de preferên cia diclorometano, N-metilpirrolidona e muito em especial dimetilformamida. Em cada passo de lavagem ou de reacção utilizou-se normalmente 10-25 ml de solução ou de solvente/g de resina, de preferência 15 ml. Uma vez que as funções NH₂ dos aminoácidos estavam protegidas pelo grupo Fmoc, utilizaram-se os seguin tes grupos protectores das funções laterais para os aminoácidos trifuncionais:

Serina, treonina ácido glutâmico arginina cisteína ester ter-butílico éster ter-butílico

4-metoxi-2,3,6-trimetilfen.ilsulfonilo ter-butilmercapto

A activação e o acoplamento dos aminoácidos efectuou-se por exemplo através dos respectivos ésteres activos, anldridos mistos ou simétricos, tendo-se procedido contudo a uma activação in situ com HOBt/carbodiimida, em especial com N,N’-diisopropilcarbodiimida.

A remoção dos grupos protectores de οζ-ΝΗ,^ efectuou-se com uma base, utilizando-se de preferência piperidina a 20% em DMF à temperatura ambiente. Após cada um destes passos de reacção lavou-se a resina, de preferencia com DMF e álcool isopropílico.

A separação dos péptidos do suporte efectuoy -se de preferência por hidrólise ácida com remoção simultânea dos grupos protectores das funções laterais. A função sulfidrí. lo da cisteína libertou—se por meio de tiois, como ditiotrei— tol, ou de preferência por meio de butilfosfina. Os péptidos de acordo com a invenção purificaram-se através de métodos em si conhecidos, por exemplo por permeação de gel em geles de aga rose, de preferência contudo por cromatografia líquida de alta performance.

Os péptidos sintéticos testaram-se em relação à sua composição química e à sua pureza. A composição dos péptidos determinou-se por meio da análise dos aminoácidos. Para este fim aqueceu-se uma pequena amostra com ácido clorídrico 6 N, na presença de fenol, durante 24 ou 72 horas, a 110° C. Pode assim verificar-se que os aminoácidos tinham sido introduzidos do modo esperado na cadeia peptídica, podendo assim deter minar-se o teor peptídico dos antigenes sintéticos como igual ou superior a 85%.

A pureza dos péptidos determinou-se por meio de cromatografia líquida de alta performance em fase reversa C18. Para este fim utilizou-se um gradiente de fosfato/acriloni

trilo. Verificou-se que os péptidos tinham uma pureza superior a 85%.

Para a preparação de anticorpos liga-se um péptido, preparado como se indicou acima, conforme o caso através de um grupo cisteína a um suporte de elevado peso molecular. Com este produto imunizam-se animais e recolhem-se os anticorpos, que se podem utilizar no âmbito da invenção.

Um suporte de alto peso molecular, como o referido, pode ser por exemplo albumina ou hemocianina keyhole limpet, ao qual o péptido se encontra acoplado através de uma ligação de tioéter. Técnicas de acoplamento adequados são ainda aquelas em que o péptido se liga a uma proteína de suporte atra vés de grupos amino, como por exemplo no método do dialdeído glutárico.

Com estes produtos como antigenes de imunização podem preparar-se anticorpos policlonais ou monoclonais. Estes anticorpos podem purificar-se por meio de cromatografia de afinidade. Os materiais de afinidade adequados são os que poí suem um péptido como ligando, como descrito acima, ou aqueles em que a proteína A desempenha este papel.

Um objectivo da invenção são assim também esses anticorpos bem como o seu emprego como medicamentos.

Abreviaturas

Cys	L—cisteína
Ser	L-serina
Thr	L-treonina
Ala	L-alanina
Vai	L-valina
Ile	L-isoleucina
Arg	L-arginina
Met	L-metionina
Pro	L-prolina
Glu	ácido L-glutâmico
Fmoc	9-fluorenilmetiloxicarbonilo

= 5 =

DMF	dimetilformamida
t BU	ter-butilo
Mtr	4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonilo
S tBu	ter-butilmercapto
TFA	ácido trifluoroacético
EDTA	ácido etilenodiaminotetraacético
Nva	norvalina
CHA	ciclohexilalanina
Lys	L-lisina
GMBS	éter N-hidroxisuccinimídico do ácido -maleimidobutírico ( gama) Os exemplos seguintes destinam-se a ilus-

trar a invenção mais em pormenor.

Exemplo 1

a) Síntese de Cys-Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile

A síntese efectuou-se num sintetizador peptídico semi-automático. Tratou-se 1 g de Fmoc-Ile-p-alcooxibenziléster-poliestireno (em rede cruzada com divinilbenzeno a 1$) com 15 ml de piperidina a 20$ (v/v) em DMF e lavou-se com DMF e isopropanol. Adicionaram-se 1,65 mmol de Fmoc-Ile e 2,25 mmol de HOBt dissolvidos em 14 ml de DMF bem como 1,1 ml de uma solu ção 1 M de diisopropilcarbodiimida. Agitou-se a mistura durante 1 hora à temperatura ambiente, lavando-se em seguida com DMF e isopropanol ate remover completamente todos os reagentes em excesso e os produtos secundários solúveis. Efectuou-se este processo até à obtenção do aminoácido N-terminal, tendo-se utiliza do os seguintes derivados de aminoácido:

Fmoc-Glu (otBu), Fmoc-Pro, Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Met, Fmoc-Arg (Mtr), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Thr (tBu), Boc-Cys (SStBu).

À resina peptídica protegida adicionaram-se 15 ml de trifluoroetanol, 200 )1L de água, 30 /11 de N-metilmorfo lina e 100 jil de butilfosfina, e agitou-se durante 12 horas à

temperatura ambiente. Lavou-se a resina com ácido acético a 1$ (v/v) em metanol e secou-se em alto vácuo. Misturou-se a resina com 18 ml de TFA, 1 ml de tioanisole, 500 /11 de dimercaptoetano e 500 mg de resorcinol e agitou-se durante 3 horas a 35° 0. Filtrou-se o resíduo libertado e cristalizou-se em 300 ml de éter dietílico. 0 produto cristalizado purificou-se por permeação de gel numa coluna de Sephadex-G25 (3 x 100 cm, 0,5$ (v/v) de ácido acético) em pequenas porções de 100 mg. Após lio filização obtiveram-se 3^8 mg de péptido.

b) Preparação de conjugados

Dissolveram-se 3θ mg de hemocianina keyhole limpet (KLH) em 0,05 mmol/1 de tampão de fosfato de sódio, a pH 8,0, e agitou-se com 3 ^mg de GMBS durante 1 hora. Cromatografou-se a proteína numa coluna de Sephadex-G50 (2 x 30 cm) (0,l mol/1 de fosfato de sódio, 0,5 mmol/1 de EDTA, pH 6,0). Concentrou-se a proteína activada até ao volume de 5 ml e incubou-se com 30 mg de péptido durante 1 hora. Após diálise e liofilização obtiveram-se 35 mg de antigene de imunização.

Exemplo 2

Imunização de coelhos

Imunizam—se 5 coelhos com 1,5 mg de antigene por animal durante o espaço de 4 semanas. 0 conjugado de péj} tido-KLH aplicou-se por via subcutânea e intravenosa. Sangraram —se depois os animais e estabilizaram-se os antisoros brutos com um agente de conservação. Rendimento por animal: 150 ml de antisoro.

Exemplo 3

Preparação de imunoadsorventes

Os antisoros brutos obtidos de acordo com o exemplo 2 purificaram-se por meio de cromatografia de afinidade. Para tal acoplaram-se 80 mg do péptido de 16 unidades Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile a 25 = 7 = ml de Sepharose activada com bromociano, de acordo com o proces so descrito por Axen et al. (Nature, 214, 1302, 1967). Em segui da, lavou-se o imunoadsorvente com uma solução de cloreto de só dio tamponizada com fosfato (PBS, 150 mmol/1, pH 7,2) e com áci do acético (500 mmol/1, pH 2,5) e equilibrou-se com um volumetriplo de PBS.

Exemplo 4

Preparação de anticorpos ml de antisoro bruto passaram pela Sepha rose equilibrada com PBS (de acordo com o exemplo 3) com uma ye lo cidade de fluxo de cerca de 6θ m 1/h a 23° C. Lavou-se em seguida com um volume de PBS três vezes igual ao volume da coluna com NaCl 1 M e com água destilada (pH 7,0)· Os anticorpos eluiram-se com água (pH 2,5), Ajustou-se o pH do eluído a 7,5 com Tris-HCl sólido e armazenou-se a -20° C. Rendimento: cerca de 40 mg de anticorpos.

Exemplo 5

Teste dos anticorpos obtidos por imunoadsorpção

a) Bloqueamento da actividade do PAI-1 em teste funcional

Incubaram-se 5θ μΐ de pl^asma deficiente em PAI, preparado por pré-incubação de 4θ IV de uroquinase/ml de plasma seguida de imunoadsorpção em Sepharose anti-anticorpos de uroquinase, e 50 μΐ de plasma rico em PAI (10 unidades/ml) com 50 μΐ de solução de anticorpos em PBS (de acordo com o exem pio 4), bem como diluições 1:10, 1:100 e 1:1000 destes componen tes, e ainda apenas PBS para controle, durante 15 minutos a 23^o C, efectuando-se em seguida uma identificação funcional da actividade do PAI. Para tal, adicionou-se 1 IV de uroquinase em tampão Tris (100 mmol/1 Tris; 100 mmol/1 NaCl; 1% de poligelina; 0,1% (p/v) de Triton x 100), incubou-se durante 10 minutos a 23^o C, adicionaram-se 200 μΐ de cloramina T 10 mmol/1, 200 jul de plasminogénio 10 CTA-U/ml em tampão Tris com 10 mmol/1 de ácido tranexâmico, e incubou-se durante 10 minutos a 23^o C. In_i = 8 = ciou-se a reacção de identificação com 500 ^j1 de substrato de plasmina cromogénico Nva-CHA-Lys-pNA 0,6 pmol/l (pNA - para-nitroanilida) em 500 mmol/1 de NaCl e terminou-se 10 minutos depois, a 23^o C, por adição de 100 pl de ácido acético 8,5 M. 0 teor em PAI funcional de uma amostra está em relação linear inversa com a variação de extinção medida a 405 nm.

Resultado s:

Plasma deficiente Plasma rico em PAI (mE) em PAI (me)

Aditivo: PBS	800	350
Anticorpos 1:1000	805	368
Anticorpos 1:100	793	590
Anticorpos 1:10	810	685
não diluído	802	700

Conseguiu bloquear-se por meio dos anticorpos cerca de 80% da capacidade de inibição rápida do plasma ric o em PAI.

b) Remoção imunoadsorptiva da actividade do PAI-1 a partir de líquidos biológicos

Imobilizaram-se 14 mg de anticorpos em 10 ml de Sepharose activada com bromociano, Adicionaram-se 5 ml de plasma rico em PAI à coluna de Sepharose a uma velocidade de fluxo de 10 ml/h. Atendendo ao factor de diluição testou-se uma amostra deste eluído em relação à actividade funcional do PAI—1. 0 plasma tinha perdido cerca de 70% da sua actividade de PAI.

Exemplo 6

a) Sxntese de Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Cys

A partir de 1 g de Fmoc-Cys (SStBu)-p-alcooxibenziléster-poliestireno, construiu-se o péptido, de modo análogo ao do exemplo la), removeu-se e purificou-se também do = 9 = mesmo modo. Rendimento: 245 mg.

b) Preparação do conjugado

	A preparação	do	conjugado efectuou-se	como
no exemplo 1 b).	Rendimento: 36	mg.
	A imunização	de	coelhos, a preparação	de
imunoadsorventes	e a preparação	de	anticorpos efectuou—se	de

acordo com os exemplos 2-4. 0 teste dos anticorpos obtidos por imunoadsorpção, de acordo com o exemplo 5» mostrou anticorpos bloqueadores da actividade do PAI (cerca de 80$ de bloqueamentc da actividade do PAl) até uma concentração (diluição) de 1:20.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1? _

Processo para a preparação de um péptido contendo de 4 a 40 aminoácidos, cuja sequência concorde com a sequência de aminoácidos do péptido Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile- ou com partes desta sequência, à qual esteja ligada uma cisterna conforme o caso N- terminal ou C-terminal, e eventualmente ligado a um suporte, caracterizado por se acoplarem entre si derivados de aminoácido protegidos ou segmentos peptídicos, em solução ou suportados numa fase sólida, e se separarem os péptidos obtidos por meio de remoção dos grupos protectores ou de, no caso da síntese em fase sólida, cisão da resina de suporte.

-
2? Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido que contém a sequência -Arg-Met-.

- ₃a _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido contendo de 6 a 25 aminoá eidos e a sequência Arg-Met, estando esta sequência flanqueada por pelo menos dois aminoácidos.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido com a sequência Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile.

_ ₅a _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido em que o extremo azotado ou carbonado é cisteína.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido em que o extremo cisterna se encontre ligado a um polímero.

- 7» -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido com a sequência Cys—Ser— -Thr-Ala-Val-Ile-V al-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile, ligada a um políemero.

Processo para a preparação de um anticorpo de acção terapêutica ou para fins de diagnsotico, caracterizado por se utilizar como antigene para a sua formação um péptido, conforme o caso ligado, a um suporte, quando preparado de acordo com a reivindicação 1.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 18 de Dezembro de 19θ7, sob o n? P 37 42 997·3.

Lisboa, 15 de Dezembro de 1988
3 AGENTE. OFICIAL BA PROPRIEDADE lOUSTRUb.

RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS PARA O BLOQUEAMENTO DA ACTIVIDADE DO PAI-1 NO SANGUE HUMANO E SUA UTILIZAÇÃO NA PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS

A invenção refere-se a um processo para a preparação de um péptido contendo de 4 a 40 aminoácidos, cuja sequência concorde com a sequência de aminoácidos do péptido Ser-Thr-Ala-Val-Ile-Val-Ser-Ala-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile ou com partes desta sequência, à qual esteja ligada uma cisteína conforme o caso N-terminal ou C-terminal, e eventualmente ligado a um suporte, que compreende se acoplarem entre si derivados de aminoácidos protegidos ou se gmentos peptídicos, em solução ou suportados numa fase sólida, e se separarem os péptidos obtidos por meio de remoção dos grupos protectores ou de, no caso da síntese em fase sólida, cisão da resina de suporte.