PT88248B

PT88248B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo rnas de cadeia dupla com actividade topica

Info

Publication number: PT88248B
Application number: PT88248A
Authority: PT
Inventors: William A Carter
Original assignee: Hem Res Inc
Priority date: 1987-08-12
Filing date: 1988-08-11
Publication date: 1995-03-01
Also published as: KR890003387A; NO883564D0; IL87415A; AU2053688A; KR970007904B1; DK449988A; HUT47855A; PH31174A; JPH01139531A; EP0303516A3; HU209749B; EP0303516B1; IE882398L; EP0303516A2; MX12643A; NO883564L; DE3850535D1; DE3850535T2; PT88248A; FI883734A0

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de HEM Research, Inc,, norte-americana, industrial e comercial, estabelecida em 12220 Wilkins Avenue, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos da América, (inventor: William A. Cárter, residente nos E.U.A.), para:PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES

FARMACÊUTICAS CONTENDO RNAs DE CADEIA DUPLA COM ACTIVIDADE TÓPICA.

Memória descritiva

Esta invenção refere-se a composições farmacêuti cas para aplicação tópica contendo ácidos ribonucleicos (ds RNAs) de cadeia dupla desencontrados e a fragmentos biologicamen te activos de dsRNAs desencontrados estabilizados na forma de um complexo ternário com um agente tensioactivo. As composições são estáveis e mantêm a sua actividade tópica como agentes antivirais ou outros.

Os agentes tensioactivos não iónicos revelam actividade espermicida e têm sido utilizados como ingredientes activos em vários cremes e espumas contraceptivos de venda livre (sem receita médica). Em concentrações elevadas os tensioactivos apresentam evidentes efeitos tóxicos sobre as células, o que limita a sua utilidade potencial; tais concentrações são necessárias para uma acção contra vírus de herpes pois causam a ruptura do envólucro virai. Os tensioactivos têm sido referidos como i. nactivantes de certas estirpes do vírus da imunodeficiência huma

J.M, na (HIV), pelo menos in vitro.

Uma outra classe de macromoíéculas activas contra vírus, cancro e células inflamatórias in vivo são os dsRNAs que, embora pouco tóxicos, são biologicamente instáveis à temperatura do corpo (37° C), o que pode limitar a sua utilidade e fa cilidade de manuseamento. No estado líquido, por exemplo, certos dsRNAs devem armazenar-se cuidadosamente a 4° C de modo a evitar a sua destruição molecular. Por estas razões, os dsRNAs administram-se por injecção na corrente sanguínea do paciente. Descobri mos agora que preparando misturas de agentes tensioactivos e de dsRNAs em suportes fisiologicamente aceitáveis se conseguem obter múltiplas propriedades inesperadas. Estas novas propriedades incluem: (a) estabilização dos dsRNAs contra a destruição enzimá tica dependente da temperatura, (b) actividade biológica sinergística, que aumenta apreciavelmente o espectro antimicrobiano dos produtos combinados comparado com o de qualquer dos compostos isolados e (c) uma mais fácil absorção pelas células locais resultando numa maior concentração intracelular do material bioactivo devido á facilidade de penetração através das membranas dos complexos ternários e quaternários formados à volta de uma molécula central de ds RNA carregada negativamente. Mais impor- j tante ainda, os produtos combinados mostram uma inesperada bioaJ tividade altamente específica contra o HIV bem como contra outros agentes patogénicos transmitidos por via venérea incluindo os membros da família dos vírus do herpes. Descrevemos deste modo uma nova série de complexos ternários (2 cadeias de RNA desen contrado complementares mais um agente tensioactivo que forma uma micela à volta do dsRNA), com novas propriedades biofísicas e biológicas. Isoladamente, ou com linfoquinos e/ou inibidores complementares da transcriptase reversa, estes produtos promovem uma maior eapaciaade de defesa do hospedeiro em relação á entrada de vários agentes patogénicos. Em seguida, descrevem-se detalhadamente esta e outras caracteristicas da invenção.

Os agentes tensioactivos utilizados podem ser de natureza aniódica, catiónica ou não iónica. Tipicamente, a eficá cia de tais agentes em aplicações tópicas tem sido atribuída à sua capacidade para dissolver várias membranas contendo lípidos

possuindo por isso capacidade de actuar como espermicida e de dissolver as estruturas nucleocapsídicas do vírus do herpes 1 e 2; vide Patente U.S. N9. 4.507.281 de Asculai et al e patentes aí citadas que se incluem como referência.

Em particular, os tensioactivos não iónicos têm tido considerável utilização em espermicidas em contraceptivos vaginais e um tensioactivo não iónico particular, designado por nonoxinol-9 (NP-9), tem tido larga utilização em cremes e espumas contraceptivos. Contudo, deve ter-se cuidado na aplicação destes tensioactivos uma vez que eles podem causar toxicidade em células normais (Asculai et al, Antimicrob. Agents and Chemo., Vol. 13, p. 686, 1978). Rapp et al ob servaram um efeito sinergias tico do interferão alfa humano (uma proteína) com nonoxinol-9 em termos da inibição específica do HS tipo 2 (Rapp et al, Antimi— crob. Agents and Chemo., Vol, 28, p. 449, 1985). Também Hicks et al (Lancet. Vol. 2, Dez. 21/28, p. 1442, 1986) de screveram uma inactivação in vitro do HTLV-III (HIV, anteriormente virus HTV ) por concentrações de nonoxinol-9 (usado isoladamente), de 0,05$ ou superiores. Hicks observou também toxicidade do nonoxinol-9 em linfócitos normais que se tornou evidente a concentrações superiores a 1$. Deve notar-se que uma vez que as concentrações de nonoxinol-9 em espermicidas disponíveis no mercado vão de 1$ a 5$ (Voeller, Lancet, Vol. 1, p. 1153, Maio 17, 1986), o nonoxinol-9 pode causar lesões nas células genito-urinárias normais C£ mo HTV livre potencialmente atacante ou como HIV contido nos linfócitos. Embora o desenvolvimento de uma vacina contra o SIDA possa ainda demorar vários anos (vide Fauci, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 83, ρ. 927θ, 19θ6), devem implementar-se rapidamente vários passos para o controle da sua disseminação. Tal como Fauci refere: um problema central acerca de em quem testar a potencial vacina em relação à sua segurança e eficácia é difícil de estudar mesmo em homossexuais masculinos. Isto minimiza a im portância de desenvolver imediatamente certos processos de uso tópico para diminuir o risco de transferência virai, ou por outros microorganismos, no processo das relações sexuais, de modo a impedir a sua posterior disseminação na população em geral.

Por exemplo, Fauci calcula que o tip of the iceberg será de

150 000 casos (HIV) só nos Estados Unidos.

As composiçSes tópicas para o tratamento de esta dos virais encontram-se descritas na literatura da patente. As composições para o tratamento de infecções de herpes simplex con tendo interferão humano, um agente tensioactivo não iónico antiviral (nonilfenoxipolietoxietanol) e um veículo, encontram-se descritos na U.S. 4.507.281 por Asculai et al. Os polinucleótidos que induzem o interferão, tais como o ácido poliriboinozínico: ácido poliribocitidílico do dsRNA ou poli I.C., encontram-se descritos na U.S. 4.283.393 por Field et al, na qual um indutor de interferão (poli I.C) em mistura homogénea com um polímero S£ lúvel em água, se refere como uma aplicação tópica de libertação controlada para o tratamento de afecções virais da pele, dos olhos e de membranas de mucosas susceptíveis de tratamento com o interferão. Levy, na U.S. 4.024.241, descreve complexos hidrofílicos resistentes à nuclease de poli I.C complexada com poli-1-lisina e com carboximetilcelulose. Misturas simples de poli I.C em solução aquosa, ungentos, cremes ou preparações líquidas, encontrara-se descritos na U.S. 4.124.702 por Lampson et al.

A toxicidade do poli I.C encontra-se referida na literatura (Adamson, Nature, Vol. 223, Agosto 16, 1969)» θ por esta razão se abandonou em grande parte o uso terapêutico do poli I.C. Pelo contrário, os dsRNAs desencontrados utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção são não tóxicos ou relativaraente pouco tóxicos. Alem disso, o inventor refere que os produtos de degradação (fragmentos) dos dsRNAs desencontrados, que inevitavelmente se formarão num armazenamento prolon gado, mantêm uma actividade biológica durante um tempo considera vel e, em alguns casos, são mais activos do que o composto paren t e.

Finalmente, deve referir-se que existem pelo menos duas designações diferentes para os virus HIVj LAV e a deshg nação para o virus HIV isolado no Instituto Pasteur, Paris, Fran ce, e HTLV-III é a designação para o virus HTV isolado no National Institute 7 Health, Bethesda, Maryland, U.S.A. Neste texto, o vírus será referido frequentemente por uma designação genérica ou sera designado por HTV ou por HTLV—III ou LAV sem a intenção

de os distinguir entre si. Além disso, o termo HIV na especifi. cação e nas reivindicações inclui todos os outros virus que possam estar associados à produção de infecçoes HIV em seres humanos, incluindo veículos seropositivos assintomáticos, complexos relacionados com SIDA ou ARC e síndroma de imunodeficiencia adquirida ou SIDA, quer isolados ou não. No registo de patente europeu publicado como 0 213 921 em Março 11, 1987, intitulado Mo dulation of ViruS-Related Events by Double-Stranded RNAs, o inventor descreve a inibição do HIV em cultura de células humanas por meio de dsRNAs, usando especificamente Ampligerr* como d sRNA pro té tipo.

Os agentes tensioactivos catiénicos são os tensioactivos preferidos; contudo, podem também usar-se tensioactivos aniénicos ou não iónicos. Os teçsioactivos aniónicos adequados incluem alquilsulfonatos de sódio e alquilbenzenosulfonatos de sódio. Os tensioactivos catiénicos apropriados incluem detergentes de amónio quaternário, incluindo cloretos de cetilpiridínio e cloretos de benzalcónio. Ao contrário dos tensioactivos ca tiónicos e aniónicos, os não iónicos contêm grupos não ionizáveis e não têm carga molecular; a sua actividade superficial depende geralmente da molécula inteira.

Contudo, quase qualquer composto hidrofóbico que tenha na sua estrutura um grupo carboxilo, hidroxilo, amido ou amino com um hidrogénio livre ligado ao azoto, se pode fazer rea gir com óxido de etileno para formar um detergente não iónico. Nesta invenção descreve-se o novo complexo ternário de dsRNA desencontrado complexado com agentes tensioactivos; os dsRNAs têm também um carácter hidrofóbico que leva as bases dos nucleótidos nas duas cadeias complementares a formarem uma estrutura helicoi. dal dupla coesa. Na presente invenção prepara-se um complexo ter nário, isto é uma cadeia de RNA 1, mais a cadeia de RNA comple mentar 2, mais o tensioactivo, formando um complexo ternário (ou de três membros) com propriedades completamente novas biofísica e terapeuticamente importantes.

Descrição dos desenhos

A FIGURA 1 é uma representação de um dsRNA desen = 5 =

contrado isolado, um complexo binário de duas cadeias de RNA com uma carga total negativa à superfície da massa do dsRNA; e

A FIGURA 2 β uma representação do complexo terna rio de dsRNA desencontrado (duas cadeias de RNA complementares mas desencontrados, rodeadas de um tensioactivo catiónico) desta invenção com a parte carregada positivamente das partículas do tensioactivo catiónico orientadas para a superfície carregada ne gativamente do dsRNA e a parte não polar da superfície orientada no sentido contrário da massa do dsRNA.

A concentração relativa do agente tensioactivo (catiónico neste exemplo) controlará a polaridade relativa do complexo resultante, que pode variar para usos terapêuticos diferentes. Fornecendo-se um excesso de tensioactivo, uma vez formado o complexo ternário, poderá ocorrer a precipitação do complexo o que pode levar a propriedades desejáveis para certos usos tópicos.

Uma chave para a presente invenção e a formação de uma micela no dsRNA ou à volta deste (como acontece com um tensioactivo neutro, aniónico ou catiónico) de modo a facilitar um novo aspecto terapêutico -nomeadamente uma actividade biológica (localizada) elevada. Uma micela define-se como a estrutura formada por adição de moléculas com grupos moleculares bifuncionais a um substrato aquoso (compatível com a água) tal como o dsRNA. No presente contexto, o termo bifuncional (bifuncionalidade) aplica—se a uma molécula com um extremo polar (isto ó, mis cível com água, que e polar) e um outro extremo apoiar (isto e, com maior afinidade com lípidos - como os constituintes principais das membranas celulares). A necessidade de uma estrutura co mo o complexo ternário que se forma numa micela, e que ela será mais activa terapeuticamente devido a duas ou mais propriedades que permitem ao complexo resultante atravessar mais rapidamente as membranas celulares das células a que se destinam (células cancerosas, células infectadas por vírus, células imunolégicas, etc.):

. Propriedade 1: um aspecto fundamental para facilitar a transferência através das membranas é a carga superfi= 6 =

ciai do complexo ternário (micelar) em relação ao dsRNA não com plexado (binário) e a maior hidrofobicidade que facilita a apro ximação e mesmo a fusão física com a membrana celular e uma mais rápida assimilação.

. Propriedade 2: a natureza particular dos compostos ternários descritos em seguida (incluindo os complexos micelares, mas não a eles limitados) facilita ainda mais a assi milação pelas células permitindo uma propriedade adicional - a fagocitose celular - que ocorre apenas minimamente sem a formação de micelas. A fagocitose é o processo em que a excressão ce lular (vacúolos pinocitóticos, etc.) envolve fisicamente as par tículas de dsRNA em complexos ternários (ou quaternários), acelerando assim a sua transferência para o compartimento intracelular (vs. extracelular), que é um passo necessário para uma bioactividade máxima no homem. Este processo de fagocitose pode também ocorrer com dsRNAs biofragmentados, por exemplo dsRNAs desencontrados.

A fracção molar (concentração relativa) do agen te tensioactivo controlará a polaridade relativa do complexo r£ sultante que poderá variar para os diferentes usos terapêuticos Fornecendo um excesso do agente tensioactivo uma vez formado o complexo ternário, poderá ocorrer a precipitação do complexo o que pode levar a propriedades desejáveis para certos usos tópicos. Um caso especial que ilustra a utilidade da presente inven ção e o complexo ternário formado entre um tensioactivo catióni co tal como o brometo de cetiltriraetilamónio (abreviado por CTAB) θ o dsRNA. Devido à natureza básica dos seus grupos polares, ele próprio se orientará para o dsRNA de maneira a que o dsRNA constitua um núcleo positivamente carregado à volta do qual o detergente positivamente carregado (com os seus grupos acídicos) se depositará (vide diagrama). Qualquer detergente bá sico (cationico) pode substituir o CTAB, obtendo—se uma micela que será muito mais estabilizada e bioactiva do que, digamos, a que se obtém colocando o dsRNA no interior de uma estrutura li— pídica simples (por exemplo um liposoma) que se mantém apenas por meio de ligações hidrofóbicas muito mais fracas. Uma consequência, na micela reguladora, é que a natureza polar do deter= 7 =

gente minimiza a superfície carregada negativamente do dsRNA, de modo que o complexo ternário largamente não polar será mais fácil de transportar através da membrana celular. Pode conseguir-se uma ainda maior especificidade na assimilação da micela se se introduzir uma especificidade adicional para as células de destino, construindo-se por exemplo um complexo quaternário no qual a quarta componente tem um tropismo ou uma atracção específica para uma determinada classe de células, por exemplo in corporando a proteína HIV, gp 120, para atrair o complexo resul tante para as células de linfócito T4, se o objectivo primário for o tratamento ou a prevenção de um retrovírus.

A apresentação do dsRNA como um complexo ternário, em particular como uma micela, não só estabiliza e protege o dsRNA instável com o calor, como também, como explicado acima, facilita a assimilação do dsRNA e aumenta a acção do dsRNA desencontrado. A estrutura micelar promove um melhor contacto da substância da droga (ingrediente activo) com a superfície da cf lula. A carga superficial total da micela é mais atractora e/ou mais compatível com a maior parte das células. Pelo contrário, o dsRNA desencontrado nu possui uma carga negativa elevada e pode ser repelido fisicamente pela célula. A micela do complexo ternário de dsRNA é aceite pela célula por atracção electrostática. Em segundo lugar, a estrutura micelar permite ao dsRNA formar complexos de partículas que, por sua vez, conduzem a novos mecanismos de fagocitose, como se explicou detalhadamente acima. Sempre que se forma um complexo ternário/veículo, é inevitável que se formem fragmentos bioactivos únicos de dsRNA, fragmentos bioactivos esses que são desejáveis. A razão é a seguinte: as ribonucleases, a razão química pela qual se formam estes fragmentos, encontram-se sempre presentes e formar-se-ão sempre mais ou menos fragmentos qualquer que seja o complexo formado. A capacidade para formar micelas com estes fragmentos bioactivos constitui uma concretização crítica que aumenta a utilidade da invenção. Haverá alterações biofísicas qualitativas inevitáveis enquanto a composição farmacêutica (creme, loção ou semelhante) estiver armazenada aguardando utilização. 0 armazenamento pode fazer-se a -4° C, a 7° C ^ou à temperatura am biente (usualmente a cerca de 20° C). Longe de um inconveniente estas alterações foram previstas pela invenção, nomeadamente: numa forma de concretização preferencial, o produto começa por um núcleo de dsRNA do tipo desencontrado, pretendendo-se construir um complexo ternário ou quaternário a partir deste material de partida. Isto, na prática, significa que o decaimento inevitável do RNA macromolecular libertará materiais bioactivos residuais, de menor peso molecular, que serão complexados com o agente tensioactivo presente, obtendo-se complexos micelares ld. geiramente diferentes com as propriedades farmacológicas deseja das semelhantes.

Com o decorrer do tempo o produto continua a exibir uma actividade biológica terapêutica, mesmo que o número dos núcleos de RNA continue a diminuir, uma vez que o número de fragmentos bioactivos do dsRNA pai continuará a aumentar à medi da que os núcleos de RNA vão sendo digeridos. Assim, a potência biológica continua a manter-se ou aumenta ligeiramente com o tempo à medida que os fragmentos bioactivos do dsRNA se continuam a libertar. Por isso, o termo estável aqui empregue significa que o produto mantém a sua actividade terapêutica ao lon go do tempo. Os agentes tensioactivos não iónicos com utilidade na presente invenção podem dividir—se em pelo menos três catego rias: (l) os que têm uma ligação de eter (como por exemplo entre as regiões hidrofílica e hidrofóbica das moléculas) como os álcoois de polioxietileno, ésteres de ácidos gordos e polioxietileno, alquilfenois ou mercaptanos ou alquilaminas de polioxie tileno; (2) o que tem uma ligação de éster ou de éter-éster; e (3) os que têm uma ligação de amida. Os detergentes iónicos tam bém se podem utilizar como descrito noutra parte da patente, particularmente na formação de novas micelas que dão origem rapidamente a elevadas concentrações intracelulares dos dsRNAs e dos respectivos fragmentos bioactivos. As ligações de éter ou de amida são formas de concretização preferenciais no contexto da presente invenção, sendo alguns exemplos os seguintes: nonoxinol-9 (nonilfenoxipolietoxietanol); triton-100 (p-diisobutilfenoxipolietoxietanol)} éter de oleilo de polioxietileno (também chamado Brij 97); θ Onyx-OL (também chamado onyx-OL 34-5).

Na invenção abaixo descrita, a quantidade de tensioactivo empregue varia entre 0,01$ e 20$, embora a gama preferida seja in ferior a 12$ em peso, sendo a formulação final também função do teor relativo de dsRNA desencontrado, tem como do objectivo terapêutico (por exemplo, a chlamydia é um pouco mais resistente ao complexo ternário do que o HSV-2) e, em especial, da apresen tação farmacêutica. De preferência, a quantidade de dsRNA desen contrado varia desde cerca de 0,001 a cerca de 10 por cento em peso da composição ou mais, dependendo da formulação particular (a solubilidade do dsRNA não é um factor limitante em suspensões, por exemplo) e das condições clínicas que o produto se destina a tratar. Quando se utilizam fragmentos de dsRNA, o limite superior da concentração pode ser bastante elevado uma vez que não há restrições de solubilidade. Qualquer que seja o teor relativo do dsRNA em relação ao tensioactivo na formulação, o balanço da composição farmacêutica compreende em geral um veícu lo inerte, fisiologicamente compatível e farmacologicamente acei tável. J

Bases teóricas dos dsRNAs

Este assunto foi descrito recentemente do ponto de vista histórico (Cárter et al, J. Biol. Resp. Modifiers, Vol.

4, artigos que começam nas pags 495^-6l3» que se incorporam como referência). Os dsRNAs têm sido desprezados clinicamente como potenciais drogas anticancerosas ou antivirais devido aos vários;

tipos de toxicidade clínica e à falta de eficiência do primeiro dsRNA testado clinicamente - ácido poliinosínico ácido policit_i dílico (poli I.C ou RI . rC ). Contudo, demonstrou-se anteriorn n' mente que as hélices de dsRNA desencontradas, que causam muito menor indução do factor de necrose de tumores (TNF), uma linfoquina (proteína) altamente tóxica que conduz à cachexia, melhoraram tanto a actividade terapêutica como a redução da toxicida de. De facto, o dsRNA é mais activo que o interferão contra vários tumores e viroses incluindo o HIV (Cárter et al, Lancet. Junho 6, 1987 θ referências aí citadas). Contudo, a formulaçãcf farmacológica e o armazenamento de dsRNA desencontrado, a forma de dsRNA de rendimento terapêutico mais favorável em estudos

com seres humanos, mostrou ser uma desvantagem ou um obstáculo que e possível ultrapassar no contexto da presente invenção.

Os resultados mostram que uma vez colocado o dsRNA numa solução aquosa, deve ser injectado no paciente humano ou animal num período de 4 horas ou então ser rejeitado. Este uso rápido ou re jeição é necessário porque a droga, a temperaturas à volta de 4° C, sofre degradação gradual, em parte devido à existência de várias RNases, isto é, enzimas que degradam o dsRNA, às quais os dsRNAs desencontrados são particularmente susceptí— veis. Tais enzimas encontram-se presentes na natureza, encontrando—se assim nas mãos, na saliva, na água esterilizada, na louça de vidro, etc. Por esse facto, o único modus operandi — ate a presente invenção aqui descrita — para preservar com segurança os produtos de dsRNA desencontrados têm sido os pós lio f ilizados.

Na presente invenção conseguiu-se vencer efecti vamente este antigo obstáculo, pela formação de um novo conjunto de complexos ternários com muito maior estabilidade a várias temperaturas ambientes. Os dsRNAs desencontrados são vulneráveis ao ataque por nucleases, mas rodeados e complexados com o tensioactivo (formando um complexo ternário), os produtos de de gradação do dsRNA mantêm—se activos, muitas vezes mais activos do que o composto pai, como descrito em seguida.

Num outro artigo recentemente publicado (Brodsky, Cárter et al, J. Biol. Res. Med., Vol. 4, pag. 66, 9,

1985; vide em especial a Fig. 1, pag. 673), verificou-se que (a) os inibidores de RNase devem mesmo adicionar-se aos tubos em que se introduzem as amostras de dsRNA desencontrado, durante a labil idade/Instabilidade, e (b) a estabilidade do dsRNA in vivo é muito breee, medindo-se em termos de apenas alguns minutos. De facto, o T l/2 (vida média) do dsRNA injectado (por exetnplo, rl_n· ^Γ (θϋ l4’U)_n fa^mhém chamado Ampligeneⁿ, uma marca registada da HEM Research, Inc.) tem um T l/2 calculado no soro humano de · 20 minutos +. 15 minutos. Seres humanos diferentes terão quantidades variáveis de enzimas hidrolíticos, como se veri ficou em estudos preliminares sobre este assunto; todos os seres humanos estudados ate à data (aproximadamente 115 indiví11 duos) têm níveis apreciáveis de enzimas (endo- ou eaonucleases) que degradam rapidamente o dsRNA.

Esta invenção é uma composição farmacêutica de aplicação tópica para o tratamento de estados clínicos susceptíveis ou sensíveis ao tratamento com dsRNA desencontrado, tais co mo infecções virais, cancro da pele e semelhantes, no qual se aplica topicamente o dsRNA numa forma bioactiva. 0 dsRNA desencontrado normalmente sensível ao calor encontra-se presente num complexo ternário de duas cadeias de RNA, desencontradas como de finido anteriormente, complexadas com um agente tensioactivo ou um detergente aniónico, não iónico ou catiónico. 0 ingrediente activo forma frequentemente uma micela com o tensioactivo e pode estar na forma do composto pai (dsRNA desencontrado) ou como fragmentos bioactivos do composto pai. Os estados clínicos trata dos pelas composições tópicas desta invenção incluem os que se sabem ser sensíveis à terapia com dsRNA desencontrado e aqueles para os quais o dsRNA desencontrado constitui o único meio de ad ministraçâo. Estes estados clínicos incluem, embora não exclusivamente, (l) infecções por retrovírus humanos incluindo a HIV, (2) membro da família do virus do herpes, por exemplo herpes sim plex e herpes zosterj (3) citomegalovirus ou CMV (muitas vezes classificado como virus tipo herpes), (4) cancro de pele localizado com e sem etiologia virai, (5) estados virais susceptíveis transmitidos sexualmente e infecções venéreas incluindo chalmidia (muitos dos estados clínicos mencionados acima são transmiti^ dos sexualmente), e (6) infecções venéreas nas quais o agente vi ral que as causa é primário ou secundário em relação a outra infecçâo venérea ela própria não sensível ou inadequadamente controlada pelo dsRNA desencontrado, sendo a infecçâo secundária tra tada por uma outra modalidade terapêutica (tal como uma infecçâo gonorreal concorrente para a qual se administra ao paciente uma terapia de tetracidina).

As composições farmacêuticas desta invenção incluem formas de apresentação farmacêutica tais como líquidos soluções tais como gotas oculares e nasais isotónicas ou sprayrf! loções, cremes, espumas, geles e fluidos viscosos, incluindo lubrificantes bem tolerados pelo sistema génito/urinário e/ou es12 permicidas bem tolerados pelo sistema génito/urinário; preparações sólidas e semi-sólidas - ungentos, ungento oftálmico ou creme, cremes, pomadas, supositórios (tanto rectais como vaginais), batons tais como batons labiais usados para tratar lesões de herpes simplex, e inserções oculares.

Por dsRNAs desencontrados designam-se todos aqueles em que as ligações de hidrogénio (emparelhamento de bases) entre as cadeias complementares estão relativamente intactas, isto e, encontram-se interrompidas em media menos de que um par de base em cada conjunto de 29 bases consecutivas. 0 desencontro e uma interrupção da geometria normal da hélice dupla do RNA, fazendo sobressair (ou repuxando) as cadeias, o que origina pontos de vulnerabilidade do dsRNA à digestão por ribonucleases. É neste sentido que se deve entender o termo dsRNA desencontrado.

dsRNA pode ser um complexo de poliinosinato e de um policitidilato, contendo uma proporção de bases uraciÃo ou guanina, por exemplo de 1 em 5 ^a 1 em 30 dessas bases (pç li I. - poli (θ4_₂₉ ^x >^{u ou G}))· dsRNA pode ter a fórmula geral rl^, (^C12^U)n· Outros exemplos convenientes de dsRNA serão descritos abaixo.

No dsRNA desencontrado preferencial, rl_n« (C^2^G)_n» uma região constituída por uma sequência ininterrupta de 6 a 12 pares de bases, isto é, por um meio a um passo comple to de uma hélice de RNA, serve tanto como peneiro biológico provocando a libertação de linfoquinas como co-factor intracelular obrigatório para enzimas incluindo os mecanismos antivlrais naturais. As regiões desencontradas constituídas por unidades de uracilo encontram-se periodicamente inseridas na cadeia de polipirimidina para acelerar a hidrólise do dsRNA impedindo assim a toxicidade.

Os dsRNAs desencontrados preferidos para uso na presente invenção baseiam-se em co—polinucleótidos seleccionados de poli (C_n, G) em que n e um número inteiro com um valor de 4 a 29, β são análogos desencontrados dos complexos de ácido poliriboinosínico e ácido poliribocitidílico, formados por

2^5 modificação de rl^. ^Γ^_η incorporando bases desemparelhadas (uracilo ou guanina) ao longo da cadeia de poliribocitidilato (rC_n). Em alternativa, o dsRNA pode ser derivado de dsRNA poli (i), poli (c), modificando a estrutura ribosílica do ácido poliriboinosínico (rl_n), por exemplo incluindo unidades de 2'-O-metilribosilo. Estes análogos desencontrados do rl ,rC , n n’ dos quais se preferem os que têm a fórmula geral rl ,r(C_ni ,,,.υ) e rl . r(c_ori, G) , encontram-se descritos por Cárter e Ts’O nas patentes U.S. 4.130.641 e 4.024.222, cujas descobertas se incorporam aqui como referência. Os dsRNAs aí descritos são geralmente adequados para utilização de acordo com a presente invenção.

Outros exemplos de dsRNA desencontrado para use na invenção, incluem:

poli	(1).	poli	(C₄,	U)
poli	(I).	poli	(c₇,	U)
poli	(I).	poli	(^Cl₃	U)
poli	(I).	poli	(^C22	, U)
poli	(I).	poli	(^C20	» ^G)
poli	(I).	poli	(^C2 9	, G) e
poli	(I).	poli		23 G

A invenção pode tornar-se mais prática adicionando uma outra linfoquina ao complexo ternário - sendo o objectivo desta adição o de modular posteriormente o número e a natureza das células disponíveis para a reacção com o dsRNA aplicado topicamente. Por exemplo, a adição de interleucinas ao complexo ternário promoverá o recrutamento posterior de lin fócitos T bem como a potencial interaeção terapêutica sinergística com o dsRNA. Outros exemplos da utilidade da adição são as combinações com outras linfoquinas tais como, embora não exclusivamente, interferões e factores de necrose de tumores. Estas linfoquinas são de utilidade especial no tratamento de cancros tópicos e de certas infecçoes virais. Em alguns casos, podem também adicionar-se inibidores virais específicos tais como azoditimidina ou gangliclovir.

Para ilustrar o potencial dos complexos quater= 14 =

nários formados, preparou-se uma loção farmacêutica (designada por A no texto) que continha 5000 a 20 000 unidades de IL-2 e 10 mg de dsRNA. Aplicaram-se porções abundantes da loção na pe le de ratos atímicos (sem pelo) directamente sobre a área que se tinha infectado previamente com células de melanoma humano (cancro de pele). Na ausência de tratamento, essas células de tumor injectadas subcutaneamente crescem de tal maneira que, eventualmente, o animal fica cosmeticamente desfigurado pela massa do tumor. No entanto, os animais a que se aplicou a loção IL-2/dsRNA/tensioactivo apresentaram uma rápida regressão do tumor e melhoraram em relação aos animais não tratados. Con seguiu—se também documentar um efeito sistémico deste regime analisando as subpopulações de células imunológicas nos seus baços, por meio da técnica da citometria de fluxo, através da qual se podem determinar os números específicos de células imu nologicamente relevantes. Quando comparados com os casos não tratados, os incrementos foram: células KN (natural killer)63% de dsRNA isolado os. 87% por combinação com interleucina-2 £~o marcador de anticorpo usado no aparelho de citometria de fluxo foi o ASGMl/; células LAK (lymphokine-activated killer) — 228% de dsRNA isolado vs. 4l2% por combinação com inter leucina-2 £o marcador de anticorpo usado na citometria de flu xo foi o Thy 1.2/; β células de linfécito - ausência de incremento significativo no caso do dsRNA isolado vs. 263% por combinação com interleucina-2 J_ o marcador de anticorpo usado na citometria de fluxo foi o L3T4.7· Como controlo negativo verificou—se que nenhuma das loções aplicadas topicamente afecta ram o número de células de linfécito T8 (supressores) medido no baço.

Como se discutiu anteriormente, as linfoquinas são capazes de incluir os interferões, de preferência o interferão alfa, as interleucinas, especificamente a interleucina-2 (lL-2) e a interleucina-2 recombinante (rIL-2) e o factor de necrose de tumores (TNF). Incluem-se ainda as células destruidoras da linfoquina activadas (LAK) formadas nos animais em resposta à exposição a uma linfoquina. Os inibidores de transcriptase reversa, tais como a 3¹-azido-3’-desoxitimidina (AZT) =

podem incorporar-se nas formulações, para além de, ou em vez de, uma linfoquina.

Quando se utiliza o interferão (alfa) como lin;

foquina, emprega-se uma quantidade de 0,01 a 100 000 IRU por mililitro de fluído corporal do paciente. Quando a linfoquina é IL-2, de preferência rIL-2, a quantidade administrada situa2

-se numa gama de cerca de 10 unidades de IL-2 por kg de peso corporal do paciente até um valor próximo do limite inaceitável de toxicidade no paciente, o que pode atingir 10° unidades] !

de IL-2. Contudo, os valores manuseáveis de reacção tóxica 3 4 mais efectivos situam-se na gama de 10 a cerca de 10 IL-2 por kg de peso corporal.

As quantidades usuais de dsRNA administradas | i

originam um nível de 0,1 a 1 000 microgramas de dsRNA por mili:

litro de fluído corporal do paciente. 0 termo fluido corporal5 i

refere-se à solução de soro, sais, vitaminas, etc. que circulaj no organismo e banha os tecidos. Quando se administram ambos os agentes (o dsRNA e uma linfoquina e/ou um inibidor de trans criptase reversa) administram-se geralmente como uma mistura, mas podem administrar—se separadamente ao mesmo tempo ou se— : quencialmente.

A administração do dsRNA e de uma linfoquina em combinação diz respeito a formas de apresentação em que ambos os agentes se administram em conjunto como uma mistura terapêutica, e ainda a processos em que os dois agentes se administram separadamente mas ao mesmo tempo. A administração em combinação inclui ainda a administração separada de uma das drogas em que uma das drogas se administra primeiro seguida em breve pela administração da segunda.

Observou-se uma anomalia bioquímica, previamen te não detectada, em que um enzima chave (RNase L) associado ao mecanismo de defesa do corpo contra doenças cancerosas e vi tais, opera de uma maneira acelerada e aparentemente não controlada. Esta e outras observações encontram-se descritas no nosso pedido com o nS de série 074.649, Ίθ Julho 17, 1987 θ in titulado Double-Stranded RNA Correction of Aberrant Metabolic =

Pathways Associated with Uncontrolled Tumor Cell and Virus Growth Cycles, cujas descobertas se incorporam aqui como referência. Em experiências separadas, compararam-se as capacidades relativas destas duas diferentes células (células com RNase L anormal) para responderem ao desafio dos virus. Verificou-se que os títulos (rendimentos) dos virus descendentes eram significati vamente maiores nas células com actividade anormal de RNase L que geravam NPC tão rapidamente.

Os RNAs de cadeia dupla, em especial os dsRNAs desencontrados, restauram a normalidade da cinética da RNase L e dos produtos de degradação, como referido no nosso pedido de patente U.S. de Julho 17» 1987» acima mencionado. Além disso, a velocidade de restauração da normalidade pelo RNA de cadeia dupla pode acelerar-se por uma exposição prévia às linfoquinas.

Nas experiências abaixo descritas, os dsRNAs reconstituiram-se primeiro a partir de pés liofilizados e misturaram-se depois com soluções de vários agentes tensioactivos, em particular de tensioactivos não ionicos. Em algumas experiências utilizou-se um veículo inerte, especialmente quando o objectivo era aplicar o complexo resultante a uma superfície ou a uma cavi dade biológica, etc. 0 complexo de dsRNA/tensioactivo incubou-se durante a noite e diluiu-se então a mistura com uma solução sali na média padrão, para alguns dos testes descritos nas Tabelas 1 e 2.

Deve notar—se que estas novas composições farmacêuticas se podem administrar topicamente por meio de uma gran de variedade de métodos. Por exemplo, as composições podemaplicar-se à região afectada, ou de um modo profilático à região ain da não afectada, numa forma microencapsulada, usando vesículas lipídicas ou do tipo lipídico. Podem também aplicar-se na forma de espuma, spray, tampão, supositório vaginal ou rectal, ou directamente num e sobre um preservativo durante a manufactura. E_s te último caso (introdução no preservativo) não teria sido possível sem esta invenção, que permite agora uma estabilidade prolongada e uma bioactividade contínua do dsRNA desencontrado ou dos seus fragmentos biologicamente activos a temperaturas ambien tes (20° C - 23° C) e uma boa capacidade de armazenamento do =

produto. Por exemplo, a presente invenção pode pôr-se rapidamen te em prática inserindo o complexo de dsRNA/tensioactivo por meio do processo mecânico descrito por Reddy na U.S. Patent n? 4.415.548, que descreve o fabrico de um contraceptivo masculino espermicida lubrificado.

Em particular, a presente invenção permite tam bém ultrapassar alguns dos efeitos indesejáveis de certos espermicidas tais como o popular nonoxinol-9 (nonilfenoxipolietoxietanol), uma vez que esta descoberta permite reduzir a concentração efectiva do nonoxinol-9, pelo menos para certas indicações, como se discute abaixo mais detalhadamente (vide Tabela 2). Com este espermicida tem-se comprovado a ocorrência de vaginites bem como de necroses placentais e de um potencial embriotáxico (Tryphones et al, Toxicology, Vol. 39 (2), Maio, pag. 177, 1986). Ef ec tuarani-se experiências semelhantes com outros espermicidas incluindo inibidores aril-4-guanidinobenzoatos (NPGB) da acrosina do esperma, um enzima com um papel fundamental no processo de fertilização; sendo essas moléculas de NPGB capazes de efectuar a síntese a partir de fenóis aprovados pela FDA, como descrito por Kaminski et al, J. Med. Chem. (Abril), Vol. 29 (4), pag.

514, 1986. Outros espermicidas compatíveis com a presente invenção incluem o diacetato de clorohexidina (descrito por Sharman et al, Fértil. Steril. Vol. 45 (2), Fevereiro, pag. 259, 1986); o menfegol (vide Lamptey et al, Contraception, Vol. 32 (5), Novembro, pag. 445, 1985); o cloreto de benzalcónio (não absorvido através da parede vaginal como o nonoxinol-9, como descrito por Zufferey, J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. (Paris), Vol. 14 (3) pag. 359, 1985); ® o sistema bifásico de nonoxinol-9 recentemente descrito, no qual um sistema lubrificante contém silicone fluído mais nonoxinol-9 mais um creme espermicida (vide Rodgens-Meame et al, Fertiliz. Steriliz. Vol. 43 (6), Junho, pag. 931, 1985)· No último caso, é evidente que aproximadamente 2,0 mg de dsRNA se podem adicionar a qualquer (ou ambos) os componentes, isto é ao sistema lubrificante constituído por 0,45 +. 0,1 ^ml de silicone fluído contendo 6,6 0,5$ d® tensioactivo ou ao creme espermicida base constituído por 0,45 + 0,1 ml de polietilenogli col 400 (aproximadamente 63$) e polietilenoglicol 3350 (aproxima

damente 30%)· Os casos anteriores são apenas exemplos não limitativos da compatibilidade desta invenção como adjuvante de vários métodos contraceptivos.

é importante referir que as composições farmacêuticas aqui descritas desempenham uma actividade tanto antimicrobiana como antiviral (vide Tabela 2, como exemplo). Embora se refira também esta possibilidade em Asculai e Rapp, na U.S. Patent N⁵. 4.507.281 (na qual se combinam interferão com nonoxinol-9), o facto é que os interferões, isolados ou misturados con tais agentes tensioactivos, são relativamente inertes contra mui tos virus, em especial os virus da imunodeficiência humana. Não há qualquer referência a um novo agregado macromolecular, tal co mo o aqui descrito, com um desvio dramático em ambas as propriedades biológicas e um concomitante desvio em certas propriedades biofísicas. Embora tenhamos observado um aumento no peso molecular aparente dos complexos ternários usando difracção laser de baixo ângulo (corrigido para por meio da equação de Studier), não se verificou qualquer alteração no peso molecular apa rente durante a ultracentrifugação analítica porque o efeito de arrastamento das novas camadas de hidratação do complexo terná rio compensa o aumento aparente de massa.

As tabelas 1 e 2 mostram resultados típicos desta invenção. Os resultados são extremamente expressivos quer em termos das novas propriedades biofísicas (maior estabilidade térmica dos complexos ternários) quer das novas propriedades bio lógicas (maior espectro antiviral e antimicrobiano).

=

TABELA 1

Estabilização das propriedades biofísicas e bioquímicas do dsRNA complexado com tensioactivos

Formulação/	Tempo, a 37°C¹	Peso Mole.	Actividade Espe
Concentração	(em 25$ de soro	Cale.)²	cifica^
	humano)	h₂₀h	(Síntese de 2', 5'-oligo A) em$
1. dsRNA	0	10,5	100
desencontrado	1 hr.	6,3	90
(2,5 mg/ml)	6 hr.	2,1	5
	24 hr.	Não detec tado	3
	48 hr.	Não detec tado	3
	72 hr.	Não detec. tado	3
	90 hr.	Não detec tado	3
2. dsRNA desencon-	0	10,5	100
trado (2,5 mg/ml)	1 hr.	10,5	100
mais nonilfenoxi.	6 hr.	10,0	100
polietoxi etanol	24 hr.	8,3	90
(nonoxinol-9 em	48 hr.	4,5	4o
1$ de tampão fi-	72 hr.	3,0	25
siol.)	90 hr.	Não detectado 3
3. dsRNA desencon-	0	10,5	100
trado (2,5 mg/ml)	6	10,0	95
mais oleiléter de	24 hr.	8,5	8,8
polioxietileno (l$) 48 hr.	6,0	70
Legenda: ¹ Utilizou-	se soro humano,	recolhido de	voluntários noi

mais, como fonte de enzima ando- e exo-nucleolítico; 2

Determinações de peso molecular como descrito pre20

viamente (Cárter et al, J. Mol. Biol., Vol. 70, pag. 567» 1972); indução de oligo 2’,5-sintetase A medida em extractos de células de fibroblasto humano deploides, usando poli I.C como controlo (lOO$) como descrito anteriormente (Cárter et al, J. Biol. Resp. Mod.,

4, pag. 613, 1985).

formulação de complexos de dsRNA/tensioactivo alarga o espectro terapêutico contra agentes patogénicos incluindo virus cn eti •rl

Ό

B eti

H

Λ

O

CM

I >

cn

-p '•rl

o teti o

cd

P

-P d

φ o

d o

o «ti o

ttti o

cd

H

B d

O fe m

o ft

P

Or—. o tn

Φ φ P Ό eti -P o 3 p ©

® ε

CO

un

o

O

o

O

00

O

00

o

un

o

m

ε ®

O

o

O

cn

00

rd

O

rd

o

CM

-3·

m

'3 rd

rd

d ®

MO MO -3 -Ct cn o o o o o t—1 rd rd rd r—I

X X X X X m cn m cm co mo cn «n «n mo mo h cm cn cm cooooo ooooo t—l

XXX 1T\ cn 4 rd

X rd

X m

rd

X rd i—I

XXX cm h m cn o

M0 o rd

un O rd

m o rd

cn o rd

MO O rd

cn o rd

cn O rd

rd cn

MO o rd

X

O rd

X

o

X

m

X

o

O

rd

r>

rd

un

rd

\Z

rd

cn

CM

cn

rd

V

un o

_a -¾^ Η O un \ \ /0,01$ <10 tn eti

E eti d

tiO

O d

O tH ffl (ti ε

eti d

tifi

O d

O tI

B «ti z

rd

O o \ en en en

en	cn	(0	-P	-P	(ti	eti	cd	cd
eti	eti	eti				3	3	ε	g	ε	ε
ε	ε	ε	o	0	o	Φ	Φ	eti	eti	eti	©
eti	cd	ed	-P	-P	•P	O	O	P	P	P	P
p	P	P	3	3	3			ω	tifl	60	(W
60	00	tio	Φ	o	Φ	P	P	0	O	0	o
O	o	O	o	o	o	O	O	P	P	P	P
P	P	P				fe	fe	o	o	o	o
u	O	o	P	P	P			•rd	-rl	•rl	•rd
•rd	-rl	id	o	0	o	un	rd	ε	ε	ε	ε
ε	ε	ε	P.	ft	Pl	o	O
							—	o	o	o	o
o	o	o	o	un	rd	o	O	o cn	cn	cn	cn
cn	un	o

I rd

O d

•rl

o\	X 0
rd	3
O	0
3	3
ΤΪ
X	«ti
o	z
3	Cti
o	«n
z	Ό

CM cn

Legenda

Utilizou—se um teste de Ιϋ^θ como descrito por Hicks (ref? citada acima). Resumidamente, empregou-se um sistema de microcultura para titular infecçoes de HIV a seguir à exposição a células sanguíneas de indivíduos normais na presença ou na ausência das formulações citadas; interromperam-se as culturas após 21 dias e recolheram—se os fluídos sobrenadantes e testaram-se para a transcriptase reversa de HIV de 2 acordo com a metodologia padrão. O HS—2 mediu-se em células HEL confluentes por meio da formação de áreas (plaques) após deposição em metilcelulose (Rapp et al, Antimicrob. Agents and Chemo., Vol. 28,

O pag. 499, 19θ5)· Empregou-se um teste de corpos elementares por quantificação em monocamadas de células McCoy em placas de microtitulação de 96 orifícios; adicionaram-se inóculos padronizados, contendo quantidades conhecidas de inclusão formando unidade^ /ml, a cada um dos orifícios, e incubou—se durante 60 minutos com as várias formulações (Kappes et al, Sexually Transmited Diseases, Vol. 13, pag. 134,

1986).

Os exemplos seguintes são tipicamente representai^ vos de formulações adequadas contendo um agente tensioactivo não iónico 1,2,3 e dsRNA:

Creme farmacêutico A

água purificada	4l,00	grama
cera cristalina	3,00	11
lanolina	10,00	tf
petrolato	41,00	ff
monooleato de sorbitano	4,75	tf
polisorbato 80	0,25	grama
dsRNA	10-180	mg
Loção farmacêutica
água purificada	7,00	ml
ácido oleico	1,50	grama

= 23 =

Monoestearato de polietilenoglicol Carbopol-934 polietilenoglicol	10,50 grama 42,25 24,75 ml
trietanolamina	1,00 ml
Silicone fluído	10,00 ml
dsRNA	10-180 mg
Creme farmacêutico B
Spermaceti	7,5#
cera	12,0#
óleo mineral	56,0#
borato de sódio	0,5#
monooleato de sorbitano	5,0#
água	19,o#
dsRNA	1-200 mg

Os tipos de tensioactivos utilizados foram os seguintes:

Ligações tipicamente de éster ou de éter-éster tais como sorbitanol (mono- ou tri-estearatos), monooleatos de sorbitano, sesquiolatos de sorbitano, trioleatos de sorbitano, polioxietileno, monolaurato de sorbitano, monopalmitado de sorbitano.

Ligações tipicamente de éter-amida tais como alcanolamidas gordas, incluindo onix-ol, unamidas, monoamidas e dietanolamidas lauricas, tais como polisorbato 20, polisorbato-80, onix-ol p-diisobutilfenoxilpolietoxietanol, nonilfenoxipolietoxietanol, éter de oleilo do polioxietileno, etc.

o

Ligações éter como as descritas no texto, incluindo alquilfenois do polioxietileno, álcoois do polioxietileno, ésteres de ácidos gordos do polioxietileno, mercaptanos do polioxietileno e alquilaminas do polioxietileno, etc.

Ensaiaram-se também composições mais complexas incluindo os que contêm linfoquinas ou substâncias mediadoras relacionadas com o dsRNA, para determinar a sua compatibilidade com a presente invenção. Especificamente, introduziram-se nas preparações tópicas, neste caso loções, interferões e/ou certas

moléculas 2',5'-A núcleo, incluindo três núcleos trimétricos

2,5-fosfotioato com ligações internucleótido RR,SR e R S , P P^F PP P P* que se demonstrou recentemente activarem a RNase L associada aos mecanismos de defesa hospedeira intracelular. Tais produtos com vectores adequados, tais como liposomas unilamelares, anticorpos monoclonais, envólucros virais reconstituídos, etc., podem aplicar—se intracelularmente de modo a constituírem uma camada adicional com propriedades antivirais, imunológicas e anti cancerosas.

Claims

REIVINDICAÇÕES _ 19 _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação tópica no tratamento de estados clí nicos susceptíveis ou sensíveis ao tratamento com dsRNA desencontrado, caracterizado por se incorporar como ingrediente actjí vo uma quantidade efectiva de um dsRNA desencontrado, incluindo num complexo ternário de duas cadeias desencontradas de dsRNA complexadas com um agente tensioactivo, com um veículo farmacêu ticamente adequado para aplicação tópica.

- 29 _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação tópica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o complexo ternário ser uma micela na qual o dsRNA desencontrado se encontra rodeado pelo agente tensioactivo .

. 39 Processo para a preparação de uma composição farmacêutica com actividade tópica espermicida e anti—virai, ca racterizado por se incorporar tuna quantidade efectiva de ura es— permicida e uma percentagem ponderai de 0,001 e 10 de um dsRNA desencontrado, calculada em relação ao peso total da composição farmacêutica, com um veículo farmacêuticamente adequado.

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica com actividade tópica espermicida e anti-viral, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por além dos ingredientes referidos na reivindicação 3, se incorporar também uma substância lubrificante não irritante para o tracto ge nito-urinário humano.

_ 5« _

Processo para a preparação de um contraceptivo, caracterizado por se revestir um preservativo com uma composição farmacêutica preparada de acordo com as reivindicações 3 ou 4.

- 6? Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a quantidade de dsRNA ser de 0,001 a 10 por cento em peso em relação ao peso total da composição e a quantidade do agente tensioactivo ser de 0,005 a 20 por cento em peso em relação ao peso total da composição referida.

_ 75 _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dsRNA desencontrado ser um complexo de poliinosinato e de um poli-citidilato contendo de 1 era 5 a 1 30 bases uracilo ou guanina.

_ 8?Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dsRNA conter regiões de quebra de ligação e exibor a propriedade da razão terapêutica favorável ^rIn«^r(^₄2-l4’^^η*

- 9* Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poi o dsRNA ser o rl_n<r(c^^ χ4«υ)_η·

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado nos Estados Unidos da América 12 de Agosto de 1987» sob o número de série 07/084,226.

em

Lisboa, 11 de Agosto de 1988.

S AC-ENTE. OflClAL DA PR Z ·’=! t ΕΟΛ D E I ,'i 0 u S T Ri 4*.

= 27 =