HU209749B - Method for the preparation of pharmaceutical compositions for topical application containing mismatched double-stranded rnas - Google Patents

Method for the preparation of pharmaceutical compositions for topical application containing mismatched double-stranded rnas Download PDF

Info

Publication number
HU209749B
HU209749B HU884320A HU432088A HU209749B HU 209749 B HU209749 B HU 209749B HU 884320 A HU884320 A HU 884320A HU 432088 A HU432088 A HU 432088A HU 209749 B HU209749 B HU 209749B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dsrna
mismatched
surfactant
complex
dsrnas
Prior art date
Application number
HU884320A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT47855A (en
Inventor
William A Carter
Original Assignee
Hem Res Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hem Res Inc filed Critical Hem Res Inc
Publication of HUT47855A publication Critical patent/HUT47855A/hu
Publication of HU209749B publication Critical patent/HU209749B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Credit Cards Or The Like (AREA)
  • Holo Graphy (AREA)
  • Details Or Accessories Of Spraying Plant Or Apparatus (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás antibakteriális hatású gyógyászati készítmény előállítására, mely 0,001-10 t% mennyiségű, össze nem illő ún. „hibás illesztésű” kétszálú RNS és 0,005-20 t% mennyiségű nonoxynol-9 felületaktív anyag temer komplexét tartalmazza hatóanyagként.
A felületaktív anyag stabilizálja a készítményt, miáltal ez a raktári tárolás során megtartja aktivitását.
A találmány tehát helyileg alkalmazható gyógyászati kompozíciókkal foglalkozik, amelyek hibás illesztésű, kettős szálú ribonukleinsavakat (dsRNS) és hibás illesztésű dsRNS-ek biológiailag aktív fragmentumait tartalmazzák terner komplexként valamely felületaktív anyaggal stabilizálva.
A nem ionos felületaktív anyagok spermicid hatásúnak is bizonyultak és így aktív alkotórészei különböző kereskedelmi forgalomban levő (recept nélkül kapható) fogamzásgátló krémeknek és haboknak. Nagy koncentrációknál a felületaktív anyagok nyilvánvaló toxikus hatásokat mutatnak a sejtekre, ez korlátozza lehetséges felhasználásukat; az ilyen koncentrációk szükségesek a hatékonysághoz a herpesz vírus ellen, mivel ezek a vírus burkolat elpusztítását idézik elő. A felületaktív anyagokkal kapcsolatban beszámoltak arról, hogy inaktiválják a humán immunhiány vírus (HÍV) bizonyos törzseit, legalábbis in vitro.
A vírusok, rák és gyulladásos sejtek ellen aktív makromolekulák egy másik osztályát képviselik a dsRNS-ek, amelyek, miközben viszonylag nem toxikusak, biológiailag nem stabilak a test hőmérsékletén (37 °C), amely korlátozhatja felhasználásukat és a kezelés könnyűségét. Folyadék formában bizonyos dsRNS-eket pl. gondosan 4 °C hőmérsékleten kell tárolni, hogy megelőzzük molekuláris elbomlásukat. Ebből az okból a dsRNS-eket injekció formájában adjuk be a beteg véráramába. Most arra jöttünk rá, hogy felületaktív anyagok és dsRNS-ek keverékét elkészítve megfelelő, fiziológiailag elfogadható hordozókban többszörösen váratlan tulajdonságokat kapunk. Ezek között az új tulajdonságok között találjuk az alábbiakat: (a) dsRNS-ek stabilizálása a hőmérséklettől függő enzimes bomlás ellen, (b) szinergikus biológiai aktivitás, amely ténylegesen szélesíti a kombinált termékek antimikrobiális spektrumát, amikor összehasonlítjuk bármelyik anyaggal önmagában, és (c) a helyileg jelen levő sejtek részéről megkönnyíteti anyagfelvétel, amely a bioaktív anyag nagyobb sejten belüli koncentrációját eredményezi; ez a temer és kvaterner komplexek membránon keresztüli megkönnyíteti áthatolásának tulajdonítható, amely komplexek egy negatív töltésű dsRNS „mag” molekula körül épülnek ki. Ami a legfontosabb, a kombinált termékek szokatlanul nagy fajlagos bioaktivitást mutatnak HÍV, valamint más, nemi szervek útján átvihető patogének ellen, pl. a herpesz vírus család tagjai ellen. így mi temer komplexek új sorozatát írjuk le (komplementer, hibás illesztésű RNS két szála és egy felületaktív anyag, amely micellát képez a dsRNS körül), amelyek új biofizikai és biológiai tulajdonságokkal bírnak. Egymagában, vagy limfokinekkel és/vagy reverz transzkriptáz gátlókkal kiegészítve, ezek a termékek megnövekedett gazdaszervezet védekező képességet nyújtanak a különböző patogének belépésének lehetséges helyeinél. Ajelen találmánynak ezeket és egyéb jellemzőit az alábbiakban majd részletesen leírjuk.
Az alkalmazott felületaktív anyagok természetük szerint lehetnek anionosok, kationosok vagy nem ionosok. Tipikusan az ilyen szerek hatékonysága helyi alkalmazásokban azon képességüknek tulajdonítható, hogy feloldják a különböző lipid-tartalmú membránokat és ezáltal képesek spermicidként működni és feloldani a herpesz vírus 1 és 2 nuldeokapszid szerkezetét, ezzel kapcsolatban lásd a 4,507,281 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást (Asculai és munkatársai) és az ebben idézett találmányokat, ezeket referenciaként építjük be a jelen találmányba.
A nem ionos felületaktív anyagokról úgy találták, hogy elsősorban hüvelyi fogamzásgátló szerekben lehet jelentős a felhasználásuk spermicidként, és egy adott felületaktív anyag, amelyet nonoxynol-9-nek (NP 9) neveznek, széles körben elterjedt a fogamzásgátló krémekben és habokban. Nagy gondossággal kell azonban alkalmazni az ilyen felületaktív anyagokat, mivel toxikusak lehetnek normális sejtekre is [Asculai és munkatársai: Antimicrob. Agents and Chemo. 13, 686 (1978)]. Rapp és munkatársai humán alfa interferon (amely fehérje) szinergikus hatását figyelték meg nonoxynol-9-cel, elsősorban a HS-2 típus gátlása szempontjából [Rapp és munkatársai: Antimicrob. Agents and Chemo. 28, 449 (1985)]. Hicks és munkatársai leírják [Láncét, 2. kötet, 1985. december 21/28, 1442. oldal] HTLV-IH (HÍV, korábban HÍV vírus) in vitro inaktiválását nonoxinol-9 (egyedül alkalmazva) különböző koncentrációinál, amely koncentráció 0,05% volt, vagy ennél több. Hicks megfigyelte a nonoxynol-9 toxicitását normál limfocitákra is, amely különösen hangsúlyozott akkor, ha a koncentráció 1%kal nagyobb. Meg kell jegyeznünk, hogy mivel a nonoxynol-9 koncentráció a kereskedelmi forgalomban levő spermicidekben 1% és 5% közti tartományban van (Voeller: Láncét, 1. kötet, 1986. május 17,1153), a nonoxynol-9 alaposan károsíthatja a húgy- és ivarszervek normál sejtjeit, miközben esetleg megtámadja a „szabad” HIV-t, vagy a limfocitákon belül levő HIV-t. Az AIDS vakcina kifejlesztése még sok évet igénybe vehet [lásd pl. Fauci: Proc. Natl. Acad: Sci. USA, 83, 9278 (1986)] addig is sok lépést kell gyorsan megvalósítani az elterjedés megakadályozására. Amint Fauci hangsúlyozza: „a fő kérdés arra öszpontosul, hogy a tervezett vakcinát vizsgáljuk abból a szempontból, hogy legyen biztonságos és hatékony, még férfi homoszexuálisoknál is, ezek a tanulmányok azonban nehézkesek”. Ez aláhúzza bizonyos helyileg alkalmazható eljárások nagyon gyors kifejlesztésének fontosságát, hogy csökkentsük a vírusos, vagy más mikroorganizmus-eredetű átviteli kockázatát a szexuális kapcsolatok folyamatában, és megelőzzük az ilyen eredetű betegségek további elterjedését a népességben. így pl. Fauci úgy becsli, hogy a Jéghegy csúcsa” 150 000 HÍV eset lehet csak az Egyesült Államokban egyedül.
HU 209 749 Β
Vírusos fertőzések helyi kezelésére szolgáló kompozíciók vannak leírva a szabadalmi irodalomban. Herpes simplex fertőzések kezelésére alkalmas kompozíciókat ír le a 4,507,281 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Ásculai és munkatársai), amely kompozíció humán interferont, egy vírusellenes, nem ionos felületaktív anyagot (nonil-fenoxi-polietoxi-etanol) és hordozót tartalmaz. Olyan polinukleotidokat, amelyek interferont indukálnak, pl. poliriboinozinsav, poliribocitidilsav vagy poli I. C. dsRNS, írnak le a 4,283,393 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Field és munkatársai), ahol egy interferon-induktort (poli I. C.) homogén módon összekvemek egy vízoldható polimerrel szabályozott kibocsátású helyi alkalmazáshoz, vírusosán fertőzött bőr, szem, és savós membrán szövetek kezelésére, amelyek érzékenyek interferonnal végzett kezelésre. Levy a 4,024,241 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban poli I. C. nukleáz-rezisztens hidrofil komplexeit írja le, a komplex poli-1lizinnel és karboxi-metil-cellulózzal képzett komplex. Poli I. C. egyszerű keverékeit vizes oldatokban, szemcseppekben, krémekben vagy folyékony készítményekben írja le a 4,124,702 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Lampson és munkatársai).
A poli I. C. toxicitásáról beszámoltak az irodalomban (Adamson: Natúré, 223, 1969. augusztus 16.), és ebből az okból a poli I. C. terápiás alkalmazása nagy mértékben korlátozott. Ezzel ellentétben a jelen találmány gyógyászati kompozícióiban alkalmazott hibás illesztésű dsRNS viszonylag kevéssé toxikus vagy nem toxikus. Ezen túlmenően, a hibás illesztésű dsRNS-ek bomlástermékei (fragmentumai), amelyek kétségtelenül előfordulnak a hosszantartó tárolás soránk jelentős ideig bioaktívak maradnak, és bizonyos esetekben aktívabbak, mint a szülő-vegyület.
A teljesség kedvéért meg kell említenünk, hogy a HÍV vírusnak legalább két jelölése van; a LAV a Pasteur Institute-nál (Párizs, Franciaország) izolált HIVvírusok jelölése, és HTLV-ΙΠ a National Institute of Health-nál (Bethesda, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) izolált HÍV vírus jelölése. Ebben a szövegben a vírusra gyakran utalunk általánosságban is, de gyakran jelöljük HIV-nek, HTLV-III-nak vagy LAVnak anélkül, hogy meg akarnánk különböztetni ezeket. Ezen kívül a „HÍV” kifejezés a leírásban és az igénypontokban más olyan vírusokat is magában foglal, amelyek társulnak a HÍV fertőzések kialakulásában emberekben; ilyenek lehetnek pl. szeropozitív tünetmentes hordozók, AIDS-sel kapcsolt komplex vagy ARC, és szerzett immunhiány betegség tünet vagy AIDS, akár izoláljuk ezeket, akár nem.
A0 213 921 számú, 1987. március 11-én publikált európai szabadalmi bejelentésben, amelynek címe: „Modulation of Virus-Related Events By Double-Stranded RNAs” (Vírussal kapcsolatos események módosítása kettős szálú RNS-ekkel), a feltaláló HÍV gátlását írja le emberi sejttenyészetben dsRNS-sel, elsősorban Ampligent alkalmazva, mint a dsRNS prototípusát.
A kationos felületaktív szerek előnyös felületaktív anyagok; lehet alkalmazni nem ionos és anionos felületaktív anyagokat is. Előnyös anionos felületaktív anyagok a nátrium-alkil-szulfonátok és nátrium-alkilbenzolszulfonátok. Az alkalmas kationos felületaktív szerek között találjuk a kvatemer ammónium detergenseket, beleértve a cetil piridinium kloridot és benzoalkonium kloridokat. A kationos és anionos felületaktív anyagokkal ellentétben a nem ionos felületaktív anyagok nem tartalmaznak ionizálható csoportokat és nincs molekuláris töltésük; ezek általában teljes molekulájuktól függnek felületi aktivitásuk szempontjából.
Csaknem minden hidrofób vegyület, amelynek szerkezetében karboxi-, hidroxi-, amid- vagy aminocsoport van a nitrogénhez kapcsolt szabad hidrogénnel, képes reagálni etilén-oxiddal, nem ionos detergenst képezve. Találmányunk szerint hibás illesztésű dsRNS új terner komplexét írjuk le, felületaktív anyagokkal alakítva ki a komplexet; a dsRNS-eknek szintén van olyan hidrofób vonása, amely a két komplementer szálban levő nukleotid bázisoknál feszes, kettős hélix szerkezet kialakulását idézi elő. A jelen találmányban sikerült temer komplexet kialakítani, vagyis az „1” RNS szál + a „2” (komplementer) RNS szál + a felületaktív anyag képez terner (vagy háromtagú) komplexet teljesen új biofizikai és gyógyászatilag fontos biológiai tulajdonságokkal.
Az alábbiakban ismertetjük a bejelentéshez mellékelt ábrákat.
Az 1. ábra egy hibás illesztésű dsRNS bemutatása önmagában, amely két RNS szál binér komplexe, amely összességében negatív töltést mutat a dsRNS massza felszínén.
A 2. ábra a jelen találmány szerinti hibás illesztésű dsRNS terner komplex (két komplementer, de hibás illesztésű RNS szál, kationos felületaktív anyaggal kötődve) bemutatása, ahol a kationos felületaktív anyagrészecskék pozitív töltésű része a dsRNS negatívan töltött felülete felé irányul és a felületaktív anyag nem poláris maradéka elirányul a dsRNS tömegétől.
A felületaktív anyag (ebben a bemutatásban kationos) relatív koncentrációja szabályozza a létrejövő komplex relatív polaritását, amely változhat a különböző gyógyászati felhasználások szerint. A felületaktív anyagok fölöslegét adva be, amikor a terner komplex képződik, a komplex kicsapása jöhet létre, amely bizonyos helyi alkalmazásoknál kívánatos tulajdonságokat hordozhat.
A jelen találmány egyik kulcslépése egy micella felépítése a dsRNS-en vagy akörül (mint semleges, anionos, vagy kationos felületaktív anyag), hogy elősegítsünk egy új, terápiás vonást - nevezetesen a nagy (lokalizált) biológiai aktivitást. A micellát úgy határozzuk meg, mint olyan szerkezetet, amely kétfunkciós molekulacsoportokkal bíró molekuláknak egy egyébként vizes (vízzel összeférhető) anyaghoz, mint pl. dsRNS-hez való hozzáadásával keletkezik. A bifunkcionalitás a jelen szövegösszefüggésben olyan molekulára vonatkozik, amelynek egyik vége poláris (pl. vízzel elegyedő, amely poláris anyag), és a másik vége nem
HU 209 749 Β poláris (vagyis inkább lipidekkel, mint a sejtmembránok elsődleges összetevőivel összeférhető). Az ilyen terner komplexeknek, amelyek micellát eredményeznek, a felépítésénél kívánatos az, hogy terápiásán aktí' vabbak legyenek két vagy több olyan tulajdonságuk szempontjából, amelyek nem engedik, hogy a létrejövő komplex könnyebben keresztezze a célsejtek (ráksejtek, vírussal fertőzött sejtek, immunsejtek stb.) sejtmembránját.
- 1. tulajdonság. A kulcsvonás a megkönnyített, membránon keresztüli átvitelhez a temer (micelláris) komplex létrejövő kívánatos felületi töltésváltozása a komplexet nem képző (binér) dsRNS-hez viszonyítva, valamint a megnövekedett hidrofobicitás, amely megkönnyíti a sejtmembránokhoz való közelítést, a sejtmembránokhoz való tényleges fizikai fúziót, és a gyorsított felvételt.
- 2. tulajdonság. Az alább leírt terner komplexet (ideértve a micelláris komplexeket, de nemcsak azokra korlátozva) szemcsés természete tovább könnyíti a sejtbéli felvételt azáltal, hogy lehetővé teszi további tulajdonságként a celluláris fagocitózist, amely csak minimálisan következik be micella képződés nélkül. A fagocitózis az az eljárás, amely által a sejt kidudorodása (amelyet pinocitotikus vakuolumoknak stb. nevezünk) fizikailag beborít szemcsés dsRNS-eket temer (vagy kvaterner) komplexekben, ezáltal gyorsítva meg átvitelüket a sejten belül rekeszbe (a sejten kívülivel szemben); ez az átvitel szükséges lépés, hogy maximális bioaktivitást vigyünk át emberbe. A fagocitózisnak ez a folyamata végbemehet biológiailag fragmentált dsRNS-ekkel, pl. hibásan illesztett dsRNS-ekkel is.
A felületaktív anyag móltörtje (relatív koncentrációja) szabályozza az így létrejövő komplex relatív polaritását, amely változhat a különböző terápiás alkalmazások szerint. A felületaktív anyag fölöslegét adva be, amikor a ternér komplex képződik, a komplex kicsapása jöhet létre, amely bizonyos helyi alkalmazásoknál kívánatos tulajdonságokat hordozhat.
Egy speciális eset, amely illusztrálja a jelen találmány alkalmazását, az a terner komplex, amely egy kationos felületaktív anyag, pl. cetil-trimetil-ammónium-bromid (ezt ezután CTAB-nak nevezzük) és dsRNS között képződik. Poláris gyökeinek bázisos természete miatt ez maga a dsRNS-re irányul olyan módon, hogy a dsRNS negatívan töltött magot nyújt, amely körül a pozitív töltésű detergens (savas csoportokkal) helyezkedik el (lásd az ábrát). Bármilyen bázisos (kationos) detergens helyettesítheti a CTAB-t és eredményezhet micellát, amely sokkal stabilizáltabb és bioaktívabb lesz, mint pl. ha mondjuk dsRNS-t helyezünk be egy egyszerű lipid szerkezetbe (pl. liposzómába), amelyet csak gyengébb hidrofób kötések tartanak össze. A szabályozott micellában a detergens poláris természete minimálissá teszi a dsRNS negatívan töltött felületét úgy, hogy az új, nagy mértékben nem poláris terner komplex megkönnyíti az átvitelt a sejtmembránon keresztül. A micella felvételében további fajlagosság alakulhat ki még további fajlagosságot adva a célsejteknek, pl. olyan kvaterner komplexet építve fel, amelyben a negyedik komponens fajlagos tropizmust vagy bizonyos sejt-osztályokra való vonzódást nyújt, pl. a HÍV fehérjét, a gpl20-at beépítve, hogy a létrejövő komplex a T4 limfocita sejteket célozza meg, ha az elsődleges cél egy retrovírus elleni kezelés vagy megelőzés.
A dsRNS temer komplexként, főleg micellaként való kialakítása nem csupán stabilizálja és védi a hőre labilis dsRNS-t, amint fentebb magyaráztuk, hanem megkönnyíti a dsRNS felvételét és erősíti a hibás illesztésű dsRNS hatását. A micella szerkezet a gyógyszer-anyag javított kapcsolatát idézi elő a sejt felületéhez. A nettó felületi töltés a micellán előnyösebb és/vagy inkább összeférhető a legtöbb sejttel. Ezzel ellentétben a „meztelen” hibás illesztésű dsRNS-nek nagy negatív töltése van és a sejt fizikai úton visszautasíthatja ezt. A dsRNS ternér komplex micella ilyen szempontból kedvező és ezt a sejt elfogadja a töltés vonzása révén. Másodszor a micella szerkezet lehetővé teszi a dsRNS számára, hogy szemcsés komplexeket képezzen, amely viszont a fagocitózis új mechanizmusát adja, amint ezt fentebb részletesen magyaráztuk. Amikor hordozó/terner komplex képződik, nyilvánvaló, hogy a hibás illesztésű dsRNS egyedi bioaktív fragmentumai keletkeznek, és ezek a bioaktív fragmentumok kívánatosak. Ennek oka a ribonukleázok jelenléte, vagyis a kémiai ok, amiért ilyen fragmentumok képződnek, hogy az ilyen enzimek mindenütt jelen vannak, így fragmentumok mindig képződnek, valahányszor komplex keletkezik. Az a képesség, hogy micellák képződnek ezekkel a bioaktív fragmentumokkal, a találmány alkalmazhatósága növelésének egyik kritikus megvalósítását jelenti.
Vannak elkerülhetetlen mennyiségi biofizikai változások, amikor a gyógyászati készítmény (krém, balzsam vagy hasonlók) elhelyezkednek a gyógyszerész polcán, várva az elosztásra. A tárolás történhet -4 °C, 7 °C hőmérsékleten vagy szobahőmérsékleten (általában 20 °C). A negatív vonástól megszabadulva ezek a változások előre megjósolhatok a mi találmányunk szerint, nevezetesen: egy előnyös kiviteli módban a termék a hibás illesztésű típusú dsRNS „magijával kezdődik, a cél az, hogy ebből a kiindulási anyagból temer vagy kvaterner komplexet építsünk fel. Ez a gyakorlatban azt jelenti, hogy a makromolekuláris RNS elkerülhetetlen bomlása bioaktív maradékokat, kis molekulatömegű anyagokat eredményez, amelyek komplexet képeznek a jelen levő felületaktív anyagokkal, ez pedig kevéssé eltérő micelláris komplexumokat eredményez hasonló, kívánatos farmakológiai tulajdonságokkal.
Az idő előrehaladtával a termék folytatja biológiai, terápiás hatásának kifejtését még akkor is, ha az RNS „mag”-ok folytatják a csökkenést, mivel a dsRNS szülő bioaktív fragmentmainak száma növekszik, miközben az RNS „mag”-ok emésztődnek. így a biológiai potenciál folyamatosan fönnmarad vagy enyhén növekszik az idő előrehaladtával, amíg a dsRNS lehetséges bioaktív fragmentumai folyamatosan kibocsátódnak. így a „stabil” kifejezés, ahogyan itt használjuk,
HU 209 749 Β olyan terméket jelent, amely biológiai aktivitást őriz meg az idő előrehaladtával.
A jelen találmányunkban hasznosítható nem ionos felületaktív anyagok legalább három kategóriába tartozhatnak: (1) azok, amelyek éter-kötéssel bírnak (a molekulák hidrofil és hidrofób részei között), ilyenek pl. a polioxietilén alkoholok, zsírsavak polioxietilén észterei, polioxietilén alkil-fenolok vagy merkaptánok vagy alkil-aminok; (2) azok, amelyek észter, vagy éterészter kötéssel bírnak, és (3) azok, amelyek amid kötéssel bírnak. Ionos detergenseket is lehet használni, amint ezt ebben a bejelentésben másutt leírjuk, főleg új micellák képzésében, amelyek dsRNS-ek és bioaktív fragmentumaik gyorsan elért nagy sejten belüli koncentrációját eredményezik. Az éter vagy amid kötések az előnyös kiviteli módok a jelen találmánnyal kapcsolatban, ezekre néhány példa: nonoxynol-9(nonil-fenoxi-polietoxi-etanol); Triton- 100(p-diizobutil-fenoxipolietoxi-etanol); polioxietilén oleil éter (ezt Brij 97nek is nevezik); és Onyx-OL (ezt Onyx-OL 345-nek is nevezik). A találmányban, amelyet az alábbiakban leírunk, az alkalmazott felületaktív anyag mennyisége célszerűen 0,01 t% és 20 t% között változik, bár az előnyös tartomány 12 tömeg% alatt van; a végső kiszerelés a hibás illesztésű dsRNS relatív mennyiségének is függvénye, valamint a gyógyászati eljárás tárgyának (pl. a Chlamydia valamivel rezisztensebb a terner komplexekre, mint a HSV-2) és a gyógyászati kiszerelés adott formájának is. A hibás illesztésű DNS menynyisége 0,001 és 10 tömegszázalék közti tartományban van, mely mennyiség függ az adott kiszereléstől (dsRNS oldhatósága nem korlátozó tényező pl. szuszpenziókban), és azoktól a körülményektől, amelyek között a terméket kezelni szándékozunk. Amikor dsRNS fragmentumokat alkalmazunk, a koncentráció felső határa valamivel magasabb lehet, mivel semmiféle oldhatósági kényszer nem vetődik fel. Bármi is legyen a kiszerelésben, a gyógyászati kompozíció mérlegéhez tartozik egy közömbös, fiziológiailag összeférhető, gyógyászatilag elfogadható hordozó is.
A dsRNS-ekről is adunk rövid ismertetést. Nemrégiben írtuk le ennek a területnek a történelmi áttekintését (Carter és munkatársai: J. Bioi. Resp. Modifiers, 4. kötet, a 495-613. oldal közti cikkek, amelyek ide referenciaként vannak beépítve). A dsRNS-eket nagy mértékben háttérbe szorítják klinikailag lehetséges rákellenes és vírusellenes gyógyszerként nagy klinikai toxicitásuk miatt és a hatékonyság hiánya miatt, amely az első klinikailag vizsgált dsRNS-sel - poliinozinsav. policitidilsav (poli I. C. vagy rIn.rCn) társult. Korábban is kimutattuk azonban, hogy a hibás illesztésű dsRNS hélixek, amelyek a tumor nekrózis faktor (TNF) sokkal kisebb indukcióját idézhetik elő (ez nagyon toxikus limfokin-fehérje, amely kachexiához vezet), javítják a terápiás aktivitást, valamint csökkentik a toxicitást. Sőt a dsRNS aktívabb, mint az interferon különböző tumorok és vírusok ellen, beleértve a HIV-t is (Carter és munkatársai: Láncét, 1987. június 6., és a benne idézett referenciák).
A hibás illesztésű dsRNS farmakológiai kiszerelése és tárolása a dsRNS formája a jelenleg legkedvezőbb gyógyászati aránnyal eddig fáradságos vonásnak vagy akadálynak bizonyult, amelyet mi képesek vagyunk leküzdeni a jelen találmánnyal összefüggésben. Az adatok azt jelzik, hogy ha a hibás illesztésű dsRNS-t vizes oldatba helyezzük, azt be kell injektálni a befogadó emberbe vagy állatba, vagy el kell dobni. Ez az „eldobás gyors alkalmazása” lépés szükséges, mivel a gyógyszer mintegy 4 °C hőmérsékleten következetesen fokozatos bomlást szenved, részben a különböző RNázok elteqedtsége miatt; ezek azok az enzimek, amelyek a dsRNS-t bontják, és amelyekre a hibás illesztésű dsRNS-ek különösen érzékenyek. Az ilyen enzimek a természetben mindenhol előfordulnak, és így jelen vannak a kézen, a könnyben, a steril vízen belül, az üvegárukon stb. Következésképpen csak az olyan munkaműveletek jöttek szóba az itt leírt találmányig a hibás illesztésű dsRNS biztonságos tárolásához, mint a fagyasztva szárított (liofilezett) porok előállítása.
A jelen találmányban hatásosan keresztülléptünk ezen a hosszan elhúzódott akadályon terner komplexek új sorozatának képzésével, amelyek megnövekedett stabilitással bírnak különböző hőmérsékleteken. A hibás illesztésű dsRNS-ek megtámadhatók a nukleázok révén, még felületaktív anyaggal körülvéve és komplexet képezve is (terner komplexként), a dsRNS bomlástermékei azonban aktívak maradnak, gyakran aktívabbak, mint a szülő vegyület, amint alább majd leírjuk.
Egy másik közleményben, amelyet nemrég közöltünk [Brodsky, Carter, és munkatársaik: J. Bioi. Rés. Mód. 4, 669 (1985)], ennek elsősorban a 673. oldalon levő 1. ábrájában, megfigyeltük, hogy (a) RN-áz inhibitorokat kell beadni minden csőbe, amelybe hibás illesztésű dsRNS mintákat vezetünk be a labilitás/instabilitás miatt, és (b) a dsRNS stabilitása in vivő nagyon rövid, csak percekben mérhető. Az injektált dsRNS [pl. rIn.r(Cn_14,U)n, amelyet Ampligennek is neveznek, ez a HEM Research Inc. márkaneve] félélettartama, vagyis Tl/2 értéke humán szérumban 20 perc ±15 percre becsülhető. Különböző embereknek különböző mennyiségű hidrolitikus enzime van, amint ezt ebben a témakörben végzett korábbi tanulmányoztunk (mintegy 115 egyén) jelentős enzimszintje van (endoés exonukleázok), amely enzimek gyorsan elbontják a dsRNS-t.
A jelen találmány helyileg alkalmazható gyógyászati készítményre vonatkozik olyan állapotok kezeléséhez, amelyek fogékonyak vagy érzékenyek hibás illesztésű dsRNS-sel végzett kezelésre, ilyenek pl. a vírusos fertőzések, bőrrák és hasonlók, amelyekben a dsRNS-t helyileg alkalmazzuk bioaktív formában. A normálisan hőre labilis hibás illesztésű dsRNS-t szolgáltatjuk az RNS két szálának terner komplexében, ahol a két szál az itt meghatározott módon hibás illesztésű, és a komplexképzés anionos, nem ionos vagy kationos felületaktív anyaggal vagy detergenssel történik. Az aktív komponens gyakran képez micellát a felületaktív anyaggal, és jelen lehet szülő vegyület (hibás illesztésű dsRNS) vagy a szülő vegyület bioaktív fragmentumai formájában.
HU 209 749 Β
A jelen találmány szerinti helyi kompozíciókkal kezelt állapotok lehetnek mindazok, amelyekről ismert, hogy érzékenyek a hibás illesztésű dsRNS terápiájára, és azok az állapotok, amelyeknél a hibás illesztésű dsRNS a beadás egyetlen módját jelenti. Ezek az állapotok az alábbiak lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak): (1) humán retrovírus fertőzések, beleértve a HIV-t; (2) a herpesz vírus család tagjai, pl. herpes simplex és herpes zoster; (3) cytomegalovírus vagy CMV (néha úgy osztályozzák, mint herpesz-típusú vírust); (4) lokalizált bőrrák vírus etiológiával vagy anélkül; (5) szexuálisan átvitt vírusos állapotok és nemi fertőzések, beleértve a Chlamydiákat (a legtöbb betegségi állapot, amelyet fentebb felsoroltunk, szexuálisan átvihető); és (6) olyan nemi fertőzések, amelyben az előidéző vírus elsődleges vagy másodlagos olyan további nemi fertőzések mellett, amelyek önmagukban nem érzékenyek hibás illesztésű dsRNS-re vagy nem kellőképpen szabályozhatók hibás illesztésű dsRNSsel; ebben az esetben ezt a második fertőzést egy másik módon kell kezelni (így pl. egy „versengő” gonorrheás fertőzés esetében a beteg tetraciklin kezelést is kap).
A jelen találmány szerinti kompozíciók magukban foglalnak olyan gyógyászati megjelenési formákat, mint pl. folyadékok, pl. izotóniás szemcseppek és orrcseppek; vagy permetek, balzsamok, krémek, habok, gélek és viszkózus folyadékok, beleértve az olyan kenőcsöket, amelyeket a húgy- és ivarszervek jól tűrnek, és/vagy spermicidek, amelyet a húgy- és ivarszervek jól tűrnek; szilárd és félig szilárd készítmények, kenőcsök, szemkenőcsök vagy krémek, balzsamok, kúpok (mind végbél-, mind hüvelykúpok), rudacskák, pl. ajakrúzs, amelyeket herpes simplex tünetek kezelésére alkalmaznak, és szembetétek.
A „hibás illesztésű dsRNS” fogalom azokra a dsRNSekre vonatkozik, amelyekben a hidrogénkötés (alapállapotban) az ellenkező szálak között csak viszonylag ép, azaz átlagosan kevesebb, mint egy bázispámál van megszakítva minden 29 egymást követő bázisgyökre számítva, A „hibás illesztés” az RNS kettős hélix normális geometriájának megszakítása a szálak kidudorodásával vagy bedudorodásával, amelyek a dsRNS megtámadhatósági pontjait képviselik a ribonukleázzal végzett emésztés számára. A „hibás illesztésű dsRNS” fogalmat tehát ennek megfelelően kell érteni.
A dsRNS poliinozinát és policitidilát komplexe, amely uracil bázisok vagy guanidin bázisok bizonyos hányadát tartalmazza, pl. 1 az 5 bázisban aránytól az 1 a 30 bázisban arányig [poli I. pol/C^gx U vagy G)].
A dsRNS lehet rIn(C12U)n általános képletű. A dsRNS-re további megfelelő példákat tárgyalunk meg az alábbiakban.
Az előnyös hibás illesztésű dsRNS-ben, az rIn(C12,U)n-ben, egy terület, amely 6-12 bázispárnak, vagyis egy RNS helix teljes fordulata felének megszakítatlan kiterjedését tartalmazza, szolgál mind biológiai „elsütő szerkezet’’-ként a limfokinek kibocsátását idézve elő, mind kötelező sejten belüli kofaktorként a természetes vírusellenes utakat tartalmazó enzimekhez. Az uracil gyököket tartalmazó hibás illesztésű területek periódusosán vannak beiktatva a polipirimidin szálba, hogy a dsRNS hidrolízise meggyorsuljon és így megakadályozzuk a toxicitást.
A jelen találmányban való felhasználáshoz előnyös hibás illesztésű dsRNS-ek olyan ko-polinukleotidokon alapulnak, amelyeket a poli(Cn,G)-k körül választhatunk ki, ahol n jelentése 4 és 29 közti egész szám; ezek poliriboinozinsav és poliribocitidilsav komplexeinek hibás illesztésű analógjai, amelyek úgy képződnek, hogy páratlan bázisokat (uracilt vagy guanidint) építünk be a poliribocitidilát (rCn) szál mentén. Egy másik módszer szerint a dsRNS poli(I).poli(C) dsRNS-ből származhat a poliriboinozinsav (rln) ribozil gerincének módosításával, pl. 2’-O-metil ribozil gyökök bevezetésével. Az rIn.rCn hibás illesztésű analógjait, amelyek előnyös változatai az rInr(C12_]4,U)n és rI„.r(C29,G)n általános képletű analógok, Carter és Ts’o írták le a 4,130,641 és 4,024,222 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben, amelynek leírását referenciaként építjük be ebbe a bejelentésbe. Az itt leírt dsRNS-ek általában alkalmasak a jelen találmány szerinti felhasználásra.
A jelen találmányban alkalmazható, hibás illesztésű dsRNS-ekre további példák:
poli(I) poli(C4,U) poli(I) · poli(C7,U) poli(I) · poli(C13,U) poli(I) · poli(C22,U) poli(I) · poli(C20,G) poli(I) · poli(C29,G) poli(I) · poli(Cp)23 G>p
A találmány gyakorlati alkalmazásában olyan megoldás is lehetséges, hogy további limfokineket adunk a temer komplexhez - ennek a további adaléknak az a célja, hogy tovább módosítsuk a helyileg alkalmazott dsRNS-sel való reakcióhoz rendelkezésre álló sejtek számát és természetét. így pl. interleukinok hozzáadása a terner komplexhez T-limfociták további megerősödését idézi elő, valamint a dsRNS-sel való szinergetikus, terápiás kölcsönhatás lehetőségét. Hasonló okokból hasznos eredmények alakulhatnak ki más limfokinek hozzáadásával kialakult kombinációkból, ilyenek még (de nemcsak ezekre korlátozódnak) az interferonok és a tumor nekrózis faktorok. Ezek a limfokinek speciális felhasználást nyerhetnek helyi rákok és bizonyos vírusos fertőzések kezelésében. Bizonyos esetekben adhatunk a készítményhez fajlagos vírusgátlókat is, pl. azoditimidint vagy gangciklovirt is.
Abból a célból, hogy bemutassuk a létrejövő kvaterner komplexek lehetőségét, gyógyászati balzsamot készítünk (amelyet a szövegben „A”-nak jelölünk), amely 5000-2000 egység IL-2-t és 10 mg dsRNS-t tartalmaz. A balzsam bőséges adagjait alkalmazzuk tímuszhiányos (meztelen) egerek bőrén közvetlenül a fölött a terület fölött, amelybe előzőleg humán melanóma (bőrrák) sejteket fertőztünk. A nem kezelt szubkután injektált tumorsejtek úgy nőnek, hogy az állat ténylegesen, kozmetikai értelemben eltorzul a tumortömeg révén. Azok az állatok azonban, amelyek IL2(dsRNS) felületaktív anyag balzsamot kaptak, gyors
HU 209 749 Β tumor-visszafejlődést mutatnak és fejlődésben túlhaladják nem kezelt társaikat.
Dokumentálni tudjuk ennek a gyógyítási rendnek a szisztematikus hatását az immun sejt szubpopuláció elemzésével ezeknek az állatoknak a lépében, az áramlásos citometria technikáját alkalmazva, amellyel az immunológiailag ide tartozó sejtek fajlagos számát lehet meghatározni. Amikor a nem kezeitekkel hasonlítjuk össze, a nagyobbodások a következők: NK (természetes ölő) sejtek-63% dsRNS egyedül, ezzel szemben 87% interleukin-2-vel kombinálva (az áramlásos citometriában alkalmazott antitest marker ASGMI); LAK (limfokin-aktivált ölő) sejtek -228% dsRNS egyedül, ezzel szemben 412% interleukin-2-vei kombinálva (az áramlásos citometriában alkalmazott antitest marker Thy 1.2) és T4 limfocita sejtek - nincs szignifikáns nagyobbodás a dsRNS-sel egyedül, míg az interleukin2-vel kombinálva 263% az eredmény (az áramlásos citometriában alkalmazott antitest marker L3T4). Negatív kontrollként megjegyezzük, hogy a helyileg alkalmazott balzsamok egyike sem hat a T8 limfocita (szuppresszor) sejtek számára, amikor ezt a lépben mérjük.
Amint már megtárgyaltuk, a limfokinek lehetnek az interferonok, előnyösen interferon alfa, az interleukinok, főleg az interleukin-2(rIL-2), és a tumor nekrózis faktor (TNF). A limfokinek közé tartoznak az aktivált ölő (LAK) sejtek is, amelyek a limfokineknek kitevésre adott válaszként állatokban képződnek. A reverz transzkriptáz inhibitorai, mint pl. a 3’-azido-3’-dezoxitimidin (AZT) szintén benne lehet a kiszerelésben a limfokinek mellett vagy helyett.
Amikor limfokinként (alfa) interferont használunk, 0,01-100 000 IRU/milliliter beteg testfolyadék mennyiséget szolgáltatunk. Amikor a limfokin IL-2, előnyösen rIL-2, a beadott mennyiség 102 IL-2 egység/beteg testtömeg kg-tól a betegben kialakuló toxicitásnak már az elfogadhatatlan szintjét közelítő értékig terjedhet, ez utóbbi akár a 106 IL-2 egységet is elérheti. A leghatékonyabb, a toxikus reakciót még elkerülő értékek a 103 és 104 IL-2/testtömeg kg tartományban vannak.
A beadott dsRNS szokásos mennyisége 0,11000 mikrogramm dsRNS/beteg testfolyadék milliliter szintet biztosít. A testfolyadék kifejezést úgy magyarázzuk, hogy szérum, sók, vitaminok stb. olyan oldatára vonatkozik, amely az organizmuson belül cirkulál és mossa a szöveteket. Amikor mindkét szert (dsRNS-t és egy limfokint és/vagy reverz transzkriptáz inhibitort) bevezetjük, ezeket általában keverékként adjuk be, de be lehet adni külön-külön is, akár egyidejűleg, akár egymás után.
A dsRNS és egy limfokin beadása kombinációban olyan beadási formát jelent, amelyben mindkét szert együtt adjuk be gyógyászati keverékben, és olyant is, amelyben a két szert külön-külön, de egyidejűleg adjuk be. A beadás kombinációban továbbá magában foglalja a két gyógyszer mindegyikének külön-külön beadását olyan módon, hogy először az egyik gyógyszert adjuk be, majd nem sokkal ezt követően a másodikat.
Megfigyeltünk egy korábban nem észlelt biokémiai anomáliát, amelyben egy kulcs-enzim (RN-áz L) a test mind rák, mind vírusbetegség elleni védekező mechanizmusával társulva meggyorsított és látszólag szabályozatlan módon működik. Ezek és más megfigyelések le vannak írva az ezzel együtt 074,649 sorozatszámon, 1987. július 17-én benyújtott bejelentésben, ennek a bejelentésnek a címe: „Double-Stranded RNA Correction of Abberrant Metabolic Pathways Associated With Uncontrolled Tumor Cell and Vírus Growth Cycles” (Szabályozatlan tumorsejt- és vírus növekedési ciklusokkal társult abnormális metabolizmus-utak kettős szálú RNS korrekciója); ennek leírását referenciaként beépítjük a jelen bejelentésbe. Ennek a két különböző sejtnek (sejtek abnormális RN-áz L-lel) a relatív képességeit összehasonlítottuk a vírusfertőzésre való ellenállás szempontjából. Megfigyeltük, hogy az utód retrovírusok titere (kitermelés) azokban a sejtekben sokkal magasabb, amelyek abnormális RN-áz L aktivitással bírnak, és amelyek gyorsan alakítanak ki NCP-t.
A kettős szálú RNS-ek, főleg a hibás illesztésű dsRNS-ek, helyreállítják az RN-áz L kinetikájának és bomlástermékeknek a normális állapotát, amint ezt a fentebb említett, 1987. július 17-én bejelentett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírtuk. Ezen kívül a normális állapot helyreállításának sebessége a kettős szálú RNS révén meggyorsítható limfokineknek való előzetes kitevéssel.
Az alább leírt kísérletekben a dsRNS-eket először liofilezett (fagyasztva szárított) porokból állítjuk helyre, majd összekeveijük különböző felületaktív anyagok oldataival, elsősorban hangsúlyozottan nem ionos felületaktív anyagokról van szó. Bizonyos esetekben semleges hordozót alkalmazunk, különösen akkor, ha a cél az, hogy a létrejövő komplexet felületeken vagy biológiai üregekben alkalmazzuk. A dsRNS/felületaktív anyag komplexet egy éjszakán át inkubáljuk, majd a keveréket hígítjuk standard fiziológiás sóoldat közeggel bizonyos, az 1. és 2. Táblázatban leírt vizsgálatokhoz.
Felismertük, hogy ezeket az új gyógyászati kompozíciókat helyileg nagyon sokféle módszerrel adhatjuk be. így pl. a kompozíciót adhatjuk a megtámadott területre, vagy a még meg nem támadott területre megelőzés céljából, mikrokapszulázott formában, pl. lipidvagy lipidszerű vezikulumok alkalmazásával. Ezek szolgáltathatók hab, permet, tampon, hüvelyi vagy végbélkúpok formájában, vagy közvetlenül kondomon vagy kondomban, a gyártás során rávezetve. Ez utóbbi (a bevezetés kondomban) nem lenne lehetséges e nélkül a találmány nélkül, mivel más eljárások nem teszik lehetővé a hibás illesztésű dsRNS vagy biológiailag aktív fragmentumaik megnyújtott stabilitását és folyamatos bioaktivitását szobahőmérsékleten (20-23 °C), és a termék megbízható raktári életét. így pl. a jelen találmányt gyakorlatban jól lehet alkalmazni a dsRNS/felületaktív anyag komplex bevezetésével, a Reddy által a 4,415,548 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt mechanikus eljárást alkalmazva a bekent spermicid férfi fogamzásgátló szer gyártásában.
HU 209 749 B
A jelen találmány leküzdi bizonyos spermicideknek, pl. a népszerű nonoxynol-9-nek (nonil-fenoxi-polietoxi-etanol) nem kívánatos hatásait, mivel a felfedezésünk lehetővé teszi, hogy csökkentsük a nonoxynol9 hatásos koncentrációját legalábbis bizonyos indikációknál, amint ezt később részletesen tárgyaljuk (lásd a 2. Táblázatot). Hüvelygyulladást, valamint méh-elhalást és embrió-toxicitás lehetőségét dokumentálták ezzel a spermiciddel [Tryphones és munkatársai: Toxicology, 39 (2), 177 (1986. május)]. Mi is végeztünk hasonló kísérleteket más spermicidekkel, beleértve a sperma akrozinját gátló aril-4-guanidino-benzoátokat (NPGB); az akrozin olyan enzim, amely eszenciális funkciót tölt be a megtermékenyítés! műveletben; az ilyen NPGB molekulákat az FDA által jóváhagyott fenolokból lehet szintetizálni, amint ezt Kaminski és munkatársai leírták [J. Med. Chem. 29 (4), 514 (1986. május)]. A jelen találmányunkkal összeférhető egyéb spermicidek közt találjuk a klórhexidin diacetátot [amelyet Sharman és munkatársai írnak le: Fertil. Steril. 45 (2), 259 (1986. február)]; a menfegolt [lásd Lamptey és munkatársai: Contraception, 32 (5), 445 (1985. november)]; a benzalkónium kloridot (nem abszorbeálódik a hüvely falán keresztül, mint a nonoxynol-9, amint ezt Zufferey leírta: J. Gynecol. Obstet. Bioi. Repród. (Paris), 14 (3), 359 (1985)]; és a legújabban leírt kétfázisú nonoxynol-9 rendszert, amelyben egy kenhető rendszer szilikon folyadékot + nonoxynol9-et + egy spermicid krémet tartalmaz [lásd RodgersMeame és munkatársai: Fertiliz. Steril. 43 (6), 932 (1985. június)]. Az utóbbi esetben világosan látható, hogy mintegy 2,0 mg dsRNS-t lehet beadni a kenhető rendszer valamelyikébe (vagy mindegyikébe), ahol ez a kenhető rendszer 0,45±0,l ml szilikon folyadékból áll, amely 6,6%±0,5% felületaktív anyagot vagy spermicid krém alapot tartalmaz, amely 0,45+0,1 ml polietilénglikol 400-ból (mintegy 63%) és polietilén-glikol 3350-ből (mintegy 30%) készült keveréket tartalmaz. A fentiek egyszerűen csak példák, nem korlátozó jelleggel, a találmányunknak, mint segítségnek az összeférhetőségére különböző fogamzásgátló módokban.
Nagy jelentősége van annak, hogy az általunk leírt gyógyászati kompozíciók mind antimikrobiális, mind antivirális aktivitást mutatnak (lásd erre példaként a 2. Táblázatot). Bár ezt valószínűnek állapították meg Asculai és Rapp is a 4,507,281 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (amelyben interferont kombinálnak nonoxynol-9-cel), a jelen helyzet mégis az, hogy az interferonok, egyedül vagy felületaktív anyagokkal keverve, viszonylag közömbösek a legtöbb vírussal szemben, főleg a humán immunhiány vírusok ellen. Egy olyan új makromolekuláris aggregátumnál, amelyet leírunk, nem várható el az a drámai eltolódás mind a biológiai tulajdonságokban, mind az ezzel társuló bizonyos biofizikai tulajdonságokban. Miközben növekedést figyelünk meg a terner komplexek látszólagos molekulatömegében kis beesési szögű lézer-fény szórást alkalmazva (és S2oW-ra korrigálva a kiszámító egyenlet alkalmazásával), nem találunk változást a látszólagos molekulatömegben az analitikai ultracentrifugálás során valószínűleg azért, mert a terner komplex új vízfelvevő rétegének „közegellenállási” hatása kiegyenlíti a tömegben való látszólagos növekedést.
Az 1. és 2. Táblázatok a találmányunk tipikus eredményeit mutatják be. Az eredmények rendkívüliek mind az új biofizikai tulajdonságok szempontjából (a terner komplexek megnövekedett hőstabilitása), mind az új biológiai tulajdonságok szempontjából (szélesebb vírusellenes és mikrobaellenes tartomány).
1. táblázat
Felületaktív anyagokkal komplexbe vitt dsRNS biofizikai és biokémiai tulajdonságainak stabilizálása
Kiszere- lés/koncent- ráció Idő, 37° C1 (25% humán szérumban) Molekulatömeg (becsült? (S20W) Fajlagos aktivitás3 (2'-5'oligo A szintézis) %-ban
1. Hibás illesztésű dsRNS (2,5 mg/ml) 0 10,5 100
1 óra 6,3 90
6 óra 2,1 <5
24 óra nem mutatható ki <3
48 óra nem mutatható ki <3
72 óra nem mutatható ki <3
96 óra nem mutatható ki <3
2. Hibás illesztésű dsRNS (2,5 mg/ml) + nonil-fenoxi-polietoxi-etanol (nonoxynol9) 1%-ban, fiziológiás pufferban 0 10,5 100
1 óra 10,5 100
6 óra 10,0 100
24 óra 8,3 90
48 óra 4,5 40
72 óra 3,0 25
90 óra nem mutatható ki <3
3. Hibás illesztésű dsRNS (2,5 mg/ml) + polioxi-etilénoleil-éter (1%) 0 10,5 100
6 óra 10,0 95
24 óra 8,5 8,8
48 óra 6,0 7,0
Megjegyzések: 1 Normális önkéntesekből összegyűjtött humán szérumot alkalmaznak az endo- és exonukleolitikus enzimek forrásaként 2 A molekulatömeg meghatározását úgy végezzük, ahogyan ezt korábban leírtuk [Carter és munkatársai: J. Mól. Bioi. 70, 567 (1972)].
3 Az oligo 2’-5’ „A” szintetáz indukciót diploid humán fibroblaszt sejtkivonatokban mérjük, kontrollként poli I.C-t alkalmazva, amint ezt korábban leírtuk [Carter és munkatársai: J. Bioi. Resp. Mód. 1, 613 (1985)].
HU 209 749 Β
2. táblázat
A dsRNS/felületaktív anyag kompozíciók patogének ellen; hatása
Kiszerelés Koncentráció HÍV titer1 HSV-2 titer2 Chlamydia3 (az elsődleges testek száma)
l.dsRNS 0 mikrogramm 1 · 106 5· 106 108
10 mikrogramm 5-1O5 3-106 105
30 mikrogramm 1-105 5-104 105
50 mikrogramm 1-103 2404 95
200 mikrogramm <10 81O3 80
2. Nonoxynol-9 0 százalék 1-106 5 106 110
5 százalék 3403 3-1O3 1-10
1 százalék 3103 4-105 110
0,05 százalék 2,3103 8-105 108
0,05 százalék 3-1O3 5106 110
3. dsRNS/no- noxynol-9 0 1-106 5-106 108
30 mikrogramm/5 t% <10 1-101 20
30 mikrogramm/1 t% <10 2-102 25
30 mikrogramm/0,051% <10 1-103 40
30 mikrogramm/0,011% <10 1-103 40
30 mikrogramm/0,011% <10 5-102 55
Megjegyzések: 1 ID50 mérést alkalmazunk, amint ezt Hicks és munkatársai leírták (fentebb idézett irodalmi hely). Röviden: egy mikrotenyészet rendszert alkalmazunk HÍV fertőzések titrálására normális egyének perifériás vérsejtjeinek való kitevést követően az idézett kiszerelések jelenlétében vagy távollétében; a tenyésztést a 21. napon fejezzük be és a felülúszó folyadékot kinyerjük és mérjük HÍV reverz transzkriptázra standard módszerrel.
2 A HS-2-t összefolyó HC1 sejtekben mérjük, tarfolt képzést alkalmazva metilcellulózos felülrétegzést alkalmazva [Rapp és munkatársai: Antimicrob. Agents and. Chemo. 28, 449 (1985)].
3 Elsődleges teszt vizsgálatot használunk sejt mono-rétegekben, 96 üreges mikrotitráló lemezekben; zárvány-képző egység/ml ismert számát tartalmazó standardizált inokulumokat adunk az egyes üregekhez és 60 percen át inkubáljuk a különböző kiszerelésekkel [Kappres és munkatársi: Sexually Transmitted Diseases, 13, 134 (1986)].
Az alábbiak tipikus - de nem korlátozó jellegű példái a nem ionos felületaktív anyagokat 1,2,3 és dsRNS-t tartalmazó megfelelő kiszereléseknek.
1. példa;
„A ” gyógyászati krém
tisztított víz 41,00 gramm
kristályos viasz 3,00 gramm
lanolin 10,00 gramm
vazelin 41,00 gramm
nonoxynol-9 4,75 gramm
poliszorbát 80 0,25 gramm
dsRNS 10-180 milligramm
2. példa:
Gyógyászati balzsam
tisztított víz 7,00 ml
oleinsav 1,50 gramm
polietilén-glikol-monosztearát 10,50 gramm
Carbopol - 934 42,25 gramm
propilén-glikol 24,75 ml
trietanol-amin 1,00 ml
szilikon folyadékok 10,00 ml
dsRNS 10-180 milligramm
3. példa:
„B gyógyászati krém
cetvelő 7,5 mg
viasz 12,0 mg
ásványolaj 56,0 mg
nátrium-borát 0,5 mg
szorbitán monooleát 5,0 mg
víz 19,0 mg
dsRNS 1-200 mg
Az alkalmazott felületaktív anyagok típusai az
alábbiak:
1 tipikus észter vagy éter-kötések, mint pl. szorbitánok (mono- vagy tri-sztearátok), szorbitán monooleátok, szeszkvioleátok, trioleátok, polioxi-etilén, szorbitán monolaurát, szorbitán monopalmitát; 2 tipikus éter-amid kötések, mint pl. zsír-alkanol-amidok, beleértve az onyx-olt, unamidot, monoamint és laurildietanolamidot, mint pl. a poliszorbát 20, poliszorbát 80, onyx-ol, p-diizobutil-fenoxil-polietoxi-etanol, nonil-fenoxi-polietoxi-etanol(nonoxynol-9), polioxi-etilén oleil éter, stb; 3 éter kötések, amint ezt a szövegben leírtuk, ide tartoznak a polioxietilén alkil-fenolok, polioxi-etilén-alkoholok, zsírsavak polioxi-etilén észterei, polioxi-etilén merkaptánok és polioxi-etilén alkilaminok stb.
Értékeltünk még inkább komplex kompozíciókat is, beleértve azokat, amelyek limfokineket vagy dsRNSsel kapcsolatos közvetítő anyagokat tartalmaznak, hogy meghatározzuk ezek összeférhetőségét a jelen találmánnyal. Pontosabban a helyi készítménybe, jelen esetben balzsamba, bevezettünk interferonokat és/vagy bizonyos 2’—5’ „A” „mag” molekulákat, beleértve három 2,5-foszforotioát trimer „mag”-ot RpRp, SpRp és RpSp nukleotidok közti kötésekkel, amelyekről mi már korábban kimutattuk, hogy aktiválják a sejten belüli gazda védekező utakkal társult RN-áz L-t. az ilyen termékeket megfelelő vektorokkal, mint pl. egy lamellás Iiposzómák, monoklonális antitestek, helyreállított vírus burkolatok stb., intracellulárisan lehet szolgáltat9
HU 209 749 Β ni, hogy vírusellenes, immunológiai és rákellenes tulajdonságok további új területét táljuk fel.

Claims (2)

1. Eljárás helyileg alkalmazható antibakteriális gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy 0,001-101% mennyiségű, hibás illesztésű kétszálú RNS és 0,005-201% mennyiségű nonil-fenoxi-polietoxi-etanol (nonoxynol-9) felületaktív anyag terner komplexét gyógyászatilag elfogadható hordozóval és adott esetben segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rIn.r(Cn_14)U)n képletű - ahol n jelentése 4 és 29 közötti egész szám -, hibás illesztésű kétszálú RNS-t alkalmazunk.
HU884320A 1987-08-12 1988-08-11 Method for the preparation of pharmaceutical compositions for topical application containing mismatched double-stranded rnas HU209749B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8422687A 1987-08-12 1987-08-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT47855A HUT47855A (en) 1989-04-28
HU209749B true HU209749B (en) 1994-10-28

Family

ID=22183613

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU884320A HU209749B (en) 1987-08-12 1988-08-11 Method for the preparation of pharmaceutical compositions for topical application containing mismatched double-stranded rnas

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0303516B1 (hu)
JP (1) JP2714021B2 (hu)
KR (1) KR970007904B1 (hu)
CN (1) CN1031325A (hu)
AT (1) ATE108066T1 (hu)
AU (3) AU2053688A (hu)
CA (1) CA1327001C (hu)
DE (1) DE3850535T2 (hu)
DK (1) DK449988A (hu)
FI (1) FI883734A (hu)
HU (1) HU209749B (hu)
IE (1) IE66830B1 (hu)
IL (1) IL87415A (hu)
MX (1) MX12643A (hu)
NO (1) NO883564L (hu)
NZ (1) NZ225755A (hu)
PH (1) PH31174A (hu)
PT (1) PT88248B (hu)
RU (1) RU2061470C1 (hu)
ZA (1) ZA885874B (hu)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4963532A (en) * 1987-11-25 1990-10-16 Hem Research, Inc. dsRNA-based prevention of viral escape
WO1990014090A1 (en) * 1989-05-19 1990-11-29 Hem Research, Inc. SHORT THERAPEUTIC dsRNA OF DEFINED STRUCTURE
EP0695186A1 (en) * 1993-04-28 1996-02-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Ocular delivery of nucleic acid
JP2690276B2 (ja) * 1995-01-10 1997-12-10 科学技術振興事業団 静電結合型高分子ミセル薬物担体とその薬剤
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
ES2374290T3 (es) 1998-03-20 2012-02-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes sintéticos y constructos genéticos que comprenden los mismos.
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
ATE450621T2 (de) 2000-03-30 2009-12-15 Whitehead Biomedical Inst Mediatoren von rns-interferenz, die rns- sequenzspezifisch sind
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
US20020132257A1 (en) 2001-01-31 2002-09-19 Tony Giordano Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
JP2005324511A (ja) * 2004-05-17 2005-11-24 Kawamura Sangyo Kk 積層体及びその製造方法
UA93354C2 (ru) * 2004-07-09 2011-02-10 Гилиад Сайенсиз, Инк. Местный противовирусный препарат
EP2351576A1 (en) * 2004-12-29 2011-08-03 Mannkind Corporation Methods to trigger, maintain and manipulate immune responses by targeted administration of biological response modifiers into lymphoid organs
FR2885808B1 (fr) * 2005-05-19 2007-07-06 Oreal Vectorisation de dsrna par des particules cationiques et utilisation topique.
US9139850B2 (en) 2005-05-19 2015-09-22 L'oreal Vectorization of dsRNA by cationic particles and topical use
JPWO2007102608A1 (ja) * 2006-03-06 2009-07-23 ナノキャリア株式会社 疎水性化合物の安定化剤
AU2010232180B2 (en) * 2009-03-31 2016-09-22 Japan As Represented By The Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases Method for prophylaxis of influenza using vaccine for intranasal administration
CN105434341B (zh) * 2015-12-22 2018-07-10 肇庆大华农生物药品有限公司 一种兽用聚腺尿苷酸注射液及其制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3582468A (en) * 1968-09-27 1971-06-01 Merck & Co Inc Recovery of double-stranded ribonucleic acid
BE793157A (fr) * 1971-12-21 1973-06-21 Beecham Group Ltd Substance antivirale
US4024222A (en) * 1973-10-30 1977-05-17 The Johns Hopkins University Nucleic acid complexes
US4415548A (en) * 1980-02-12 1983-11-15 Schmid Laboratories, Inc. Spermicidally lubricated prophylactics and method for making same
JPS57209050A (en) * 1981-06-19 1982-12-22 Jekusu Kk Condome
US4507281A (en) * 1981-10-13 1985-03-26 Exovir, Inc. Interferon-containing compositions
JPS59124514U (ja) * 1983-02-10 1984-08-22 不二ラテックス株式会社 避妊効果を確実に向上させたコンド−ム
FR2556727B1 (fr) * 1983-12-19 1990-01-19 Biostabilex Labo Pharma Nouvelles compositions therapeutiques a base d'adn a haut poids moleculaire et leur procede de preparation
CA1326450C (en) * 1985-08-26 1994-01-25 William A. Carter Modulation of aids virus-related events by double stranded rnas (dsrnas)

Also Published As

Publication number Publication date
KR890003387A (ko) 1989-04-14
NO883564D0 (no) 1988-08-11
IL87415A (en) 1993-05-13
AU2053688A (en) 1989-04-20
KR970007904B1 (ko) 1997-05-17
DK449988A (da) 1989-02-13
HUT47855A (en) 1989-04-28
PH31174A (en) 1998-03-20
JPH01139531A (ja) 1989-06-01
EP0303516A3 (en) 1989-12-06
EP0303516B1 (en) 1994-07-06
IE882398L (en) 1989-02-12
EP0303516A2 (en) 1989-02-15
MX12643A (es) 1993-09-01
NO883564L (no) 1989-02-13
DE3850535D1 (de) 1994-08-11
DE3850535T2 (de) 1995-01-12
PT88248A (pt) 1989-06-30
FI883734A0 (fi) 1988-08-11
ZA885874B (en) 1989-04-26
PT88248B (pt) 1995-03-01
ATE108066T1 (de) 1994-07-15
AU1736592A (en) 1992-07-30
AU1001395A (en) 1995-03-09
JP2714021B2 (ja) 1998-02-16
IL87415A0 (en) 1989-01-31
IE66830B1 (en) 1996-02-07
RU2061470C1 (ru) 1996-06-10
DK449988D0 (da) 1988-08-11
CA1327001C (en) 1994-02-15
CN1031325A (zh) 1989-03-01
NZ225755A (en) 1990-03-27
FI883734A (fi) 1989-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5712257A (en) Topically active compositions of mismatched dsRNAs
HU209749B (en) Method for the preparation of pharmaceutical compositions for topical application containing mismatched double-stranded rnas
EP0789564B1 (en) Polynucleotide compositions
US6933286B2 (en) Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
CA1327002C (en) Elaboration of host defense mediators into biological fluids by systemic dsrna treatment
US6359054B1 (en) Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US20040248833A1 (en) Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
US5683986A (en) Elaboration of host defense mediators into biological fluids by systemic dsRNA treatment
NZ223720A (en) Dsrna/lymphokine therapy optionally using cyclooxygenase activator to increase the levels of nk (natural killer) and lak (lymphokine activated killer) cells
US20030118550A1 (en) Compositions and methods for inducing activation of dendritic cells
JP3819422B2 (ja) 治療用送達組成物及びその使用方法
AU724058B2 (en) Topically active compositions of double-stranded RNAs
JP2001501620A (ja) 免疫不全ウイルス感染の治療方法
IL103630A (en) Pharmaceutical Destroyers Seeds and Viruses For Local Use Containing Seed Killer Selected From Non-Ionic Surface
JP2004509838A (ja) 樹状細胞の活性化誘導のための組成物および方法
AU724293B2 (en) Elaboration of Host Defense Mediators into Biological Fluids by Systemic dsRNA Treatment
US7202225B1 (en) Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
CA2174122C (en) Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
CA2455843A1 (en) Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee