PT87499B - Processo de preparacao de uma solucao para controlo da eficiencia da coluna de cromatografia liquida de alta eficiencia - Google Patents
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Description
Processo de preparação de uma solução para controlo da eficiência da coluna de cromatografia de per muta iónica de aparelhos de cromatografia líquida de alta eficiência para que
A. MENARINI S.a.s. , pretende obter privilégio de invenção em Portugal.
RESUMO presente invento refere-se a um processo para a preparação de uma solução para controlo da eficiência da coluna de cromatografia de permuta iónica de aparelhos para HPLC, e mais particularmente do aparelho AUTO A1C HA 8110-8111 com uma coluna MICROPEARL S-F-W-AlC, sendo a referida solução constituída por um hemolizado liofílico compreendendo hemoglobina, fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico,£\ -D-ribose, guanina, citosina, timina e uracilo, e um solvente, para regeneração do hemolizado liofílico, compreendendo um agente tensio-activo não iónico como o TRITON X-100, um agente bacteriostáctico, como por exemplo azeto de sódio e água, caracterizado por compreender os passos de:
- tratamento do sangue global com um agente anti-coagulante:
- centrifugação a l^O g durante dez minutos;
- remoção do plasma;
- adição de uma solução fisiológica em quantidades entre 4 e 10 ral;
- repetição da centrifugação até à obtenção de ura sobrenadan te límpido;
- suspensão aos eritrócitos na solução fisiológica durante 24 horas;
- centrifugação e remoção da porção superior, obtendo-se assim os eritrócitos lavados;
- preparação da solução estabilizante;
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-2-adição de 5θ microlitros da solução referida por cada ml de glóbulos vermelhos e homogeizaçSo suave da massa total:
- diluição da solução de eritrócitos + agente estabilizante na proporção de 1/50 com uma solução de fosfato de potássio mono básico, fosfato de potássio dibásico e água;
- manutenção da solução em repouso durante cerca de 60 minutos;
- enchimento de pequenos frascos com a solução e colocação dos frascos numa unidade de secagem e congelação até obtenção de um teor de humidade inferior a 2/; e
- regeneração do hemolizado liofílico, assim obtido com uma solução de um agente tensio-activo não iónico, um agente bacteriostáctico e água.
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-3MEMÓRIA DESCRITIVA presente invento refere-se ao processo de preparação de uma solução para controlo de eficiência da coluna de cromatografia de permuta iónica de equipamentos de HPLC. Mais particularmente, o presente invento refere-se a um hemolizado liofílico obtido a partir de corpúsculos sanguíneos vermelhos lavados, e regenerados por meio de um solvente adequado, para controlar o sistema analítico capaz de determinar o glicato de hemoglobina HbAlC com o método de HrLC por meio do dispositivo da companhia DAICHI denominado AUTO A1C HA 8llO-8lll, com uma coluna da MICROHEARL S-F-W-A1C, de forma que os resultados obtidos ofereçam sempre confiança e não sofram variações devido ao decaimento da coluna de separação.
A coluna do dispositivo AUTO A1C HA 8110-8111, de acordo com a companhia fabricante do equipamento de HPLC, é capaz de trabalhar em cerca de 1000 amostras.
Pelo contrário, obtém-se muitas vezes um rendimento inferior, devido a perda de precisão na determinação analítica, pelo que se torna necessário ter à disposição as denominadas amostras de controlo
Encontram-se já comercialmente disponíveis vários hemolizados de controlo, que satisfazem num grau elevado as necessidades da coluna do equipamento de HpLC particular para que foram preparados.
Pelo contrário, esses hemolizados de controlo que se encontram já disponíveis, danificam a coluna do dispositivo AUTO A1C HA 8IIO-8III, tornando menor a sua vida útil média.
Além disso, essas amostras de controlo, uma vez regeneradas, não possuem uma diluição óptima para o equipamento em questão, pelo que têm que ser ajustadas antes de serem processadas.
Adicionalmente, algumas das amostras de controlo comercialmente disponíveis presentemente, quando sujeitas a análises, mos trara, se forem empregues numa coluna MICROPEARL, picos de separação anómalos em relação aos picos obtidos com a rotina laboratorial normal.
Mais particularmente, o processo de liofilização efectuado
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-4sem medições adequadas, provoca um decaimento de hemoglobina que revela, na análise da amostra com HPLC, um aumento notável da denominada fracção a + b, o que dá a esse padrão um certo número de caracteristicas diferentes das das amostras normais de controlo.
Esse efeito é particularmente evidente quando se observam as figuras 1, 2 e 3, mostrando essas figuras, respectivamente as representações dos resultados obtidos empregando no equipamento de HPLC um padrão de controlo comercialmente disponível, e os resultados obtidos analisando amostras de rotina num paciente normal e num paciente patológico. Assim, a carência resulta do que acima de tudo se considera ser a característica principal de um padrão de controlo; isto é, um comportamento tão próximo quan to possível do comportamento de uma amostra de rotina.
De acordo com o anteriormente referido é evidente que é extremamente importante ter á disposição uma solução de controlo com a sugerida pelo requerente, a qual resolve os problemas acima mencionados sugerindo a preparação de uma solução, do tipo mencionado para controlar o dispositivo AUTO A1C.
Constitui outro objecto do presente invento a preparação de uma solução de controlo como a acima mencionada, caracterizada por uma diluição elevada dos glóbulos vermelhos do sangue no hemolizado liofílico, cerca de 1 cm^ de glóbulos vermelhos/^O ml de solução tampão, de forma que possa ser preparado um número elevado de frascos com uma quantidade muito pequena de sangue.
E ainda objecto do invento a preparação de uma solução de controlo que seja obtida empregando em geral sangue animal.
Assim, constitui um objecto específico do presente invento, a preparação de uma solução para controlo da eficiência da coluna de cromatografia de permuta iónica de equipamentos de HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência), e em particular de equipamentos AUTO A1C HA 8110-8111 com colunas MICROrEARL S-F-W-A1C, sendo a referida solução constituída por um hemolizado lio fílico compreendendo hemoglobina em quantidades de 8,0 χ 10-4g (+ 50^), fosfato de potássio monobásico em quantidades de 9*lO_4g (+ 50/0, fosfato de potássio dibásico em quantidades de 3 x 10~^g (+ bem como por um solvente compreendendo um agente tensio
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-5-activo, nao iónico em quantidades de 1,5 x 10 ( + 5θ%), azeto de sódio em quantidades de 3xl0~4g (+ 50%), e água na quantidade de 1,5 ml.
referido hemolizado liofílico, da solução de acordo com o presente invento, pode compreender oc-D- ri b o se em quantidades de
2,5 x 10'6g (+ 50%) e preferivelmente de 2,5 x 10“^ g.
Ainda de acordo com o presente invento o referido hemolizado liofilico pode também conter pelo menos uma das bases citosina, timina, guanina e uracilo, em quantidades tais que perfaçam um total de 4,7 x 10~4 (+ 50%) micromole.
preferivelmente, estarão presentes pelo menos duas bases seleccionadas entre citosina, guanina, timina e uracilo, em quanti dades tais que a quantidade total contida no hemolizado liofilico esteja compreendida dentro dos limites acima mencionados.
De acordo com uma concretização preferida da solução do presente invento, o referido hemolizado liofílico contém citosina em quantidades de 1,35 x 10~4 ( + 5θ%) micromole, guanina em quan tidades de 0,94 χ 10~4 (+ 50%) micromole, timina em quantidades de 0,93 x 10 4 (.+ 50%) micromole, e uracilo em quantidades de 1,49 x 104 (+ 5θ%) micromole.
Também de acordo com o presente invento o referido agente tensio-activo não iónico é constituído por TRITON (Marca registada) X - 100, em quantidades de 1,5 x 10~^g (+ 50%), e preferivelmente de 1,5 x 10 ^g, enquanto que o azeto de sódio se encon-4 tra presente numa quantidade de 3 x 10 g.
Uma composição da solução de controlo de acordo com o presen te invento que é particularmente preferida, compreende um hemolizado liofílico constituído por:
x 10 g de hemoglobina;
x 10 g ae fosfato de potássio monobásico;
x 10~4 g de fosfato de potássio dibásico;
2,5 x 10~ g de Ck-D-ribose;
0,94 x 10 micromole de guanina;
1,35 x 10 micromole de citosina;
0,93 x 10 micromole de timina;
1,49 x 10 micromole de uracilo;
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-6e um solvente constituído por:
1,5 x 10“3 g de TRITON X-100;
x IO’4 g de azeto de sódio;
1,5 ml de água.
A presença do agente tensio-activo e do agente bacteriostático serve para dissolver os estremas que se formam no hemolizado liofilico.
Mais ainda, o âmbito do presente invento contempla um proces so para a preparação da solução de controlo acima descrita, compreendendo o referido processo os passos de:
- tratamento do sangue total com um agente anti-coagulante;
- centrifugação a 150 0 durante aez minutos:
- remoção do plasma;
- adição de uma solução fisiológica em quantidades compreendidas entre 4 e 10 ml;
- centrifugação;
- repetição da centrifugação até se obter um sobrenadante límpido;
- suspensão dos glóbulos vermelhos do sangue na solução fisiológica durante 24 horas;
- centrifugação e remoção da porção superior, obtendo-se assim os glóbulos vermelhos lavados;
- preparação da solução estabilizante;
- adição de 5θ microlitros da solução referida por cada ml de glóbulos vermelhos e homogeneização suave da massa total;
- diluição dos glóbulos vermelhos + solução estabilizante numa proporção de 1/5θ» numa solução de fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico e água;
- permanência em repouso durante cerca de 60 minutos;
- enchimento de pequenos frascos com a solução e colocação dos mesmos num aparelho de secagem e congelação até se obter um teor de humidade inferior a 2%;
- regeneração do hemolizado liofilico assim obtido com uma solução de um agente tensio-activo não iónico, ura agente bacteriostático e água.
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-7EXEMrLO de PREPARAÇÃO
Centrifugam-se 10 ml de sangue total, tratado com um agente anti-coagulante, a 150 G durante 10 minutos.
Remove-se então o plasma.
Adicionam-se 5 ml de solução fisiológica e centrífuga-se a massa total.
A operação é repetida até se obter um sobrenadante límpido. Os eritrócitos são então suspensos na solução fisiológica durante 24 horas.
A massa é novamente centrifugada e a porção superior é removida. Obtém-se assim os eritrócitos lavados, como resíduo.
rrepara-se separadamente o agente estabilizante constituído por:
| c\ -D-ribose | 10 g |
| citosina | 0,060 g |
| guanina | 0,057 g |
| timina | 0,047 g |
| uracilo | 0,067 g |
| água | q. s. 11 |
| Adicionam- se | 50 microlitros desta solução por cada ml de |
glóbulos vermelhos.
Os glóbulos vermelhos são então homogeneizados suavemente com a solução e são em seguida diluídos (eritrócitos + estabilizante) na proporção 1/50 com uma solução de 3,600 g de KH^rO^,
1,2 g de K^HPO^ e água numa quantidade suficiente para perfazer 1 1.
Como resultado, os eritrócitos sofrem hemólise libertando hemoglobina.
material é mantido em repouso durante 60 minutos, enchendo -se então pequenos frascos de Ο,25θ ml com a solução, os quais são em seguida colocados num aparelho de secagem e congelação até se obter um teor de humidade inferior a 2$.
rara ser empregue, o hemolizado liofílico é regenerado com
1,5 ml de uma solução constituída por TRITON (marca registada) X-100 (1,0 g), NaN^ (2,0 g) e água numa quantidade suficiente
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-8para perfazer 1 1.
As figuras 4 e 5 mostram os resultados obtidos empregando a solução de controlo de acordo com o presente invento, respectivamente nos casos de valores fisiológicos e patológicos.
presente invento foi descrito de acordo com algumas das suas concretizações preferidas, mas deverá entender-se que se po dem introduzir modificações e/ou variações no mesmo, pelos enten didos na especialidade, sem sair do espirito e âmbito do invento para o qual se reclama um direito de prioridade.
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Tg.20.129 //
Claims (9)
- -REIVINDICAÇÕESle. - Processo de preparação de uma solução para controlo da eficiência da coluna de cromatografia de permuta iónica de aparelho para HPLC e em particular para uma coluna MICROrEARL S-F-W-A1C solução essa constituída por um hemolizado liofílico, com preenaendo hemoglobina em quantidades de 8,0 x 10-4 g (+ 50%), fosfato de potássio monobásico em quantidades de 9 x 10” g (+ $0%), fosfato de potássio dibásico em quantidades de 3 x lO^g (+ $0%), bem como por um solvente compreendendo um agente tensio -activo não iónico em quantidades de 1,5 x 10-^ g (+ 50%)» azeto de sódio em quantidades de 3 x 10-4 g (+ 5°%) e água na quantidade de 1,5 ml, caracterizado por compreender os passos de:- tratamento do sangue global com um agente anti-coagulante;- centrifugação a 150 g durante dez minutos;- remoção do plasma;- adição de uma solução fisiológica em quantidades entre 4 e 10 ml;- repetição da centrifugação até à obtenção de um sobrenadante límpido;- suspensão dos eritrócitos na solução fisiológica durante 24 horas;- centrifugação e remoção da porção superior, obtendo-se assim os eritrócitos lavados;- preparação da solução estabilizante;- adição de 5θ microlitros da solução referida por cada ml de glóbulos vermelhos e homogeizaçao suave da massa total;- diluição da solução de eritrócitos + agente estabilizante na proporção de 1/50 com uma solução de fosfato de potássio mono-básico, fosfato de potássio dibásico e água;- manutenção da solução em repouso durante cerca de 60 minutos;- enchimento de pequenos frascos com a solução e colocação dos frascos numa unidade de secagem e congelação até obtenção de um teor de humidade inferior a 2%; e- regeneração do hemolizado liofílico, assim obtido, com uma67 740Tg. 20.129( C J )-10solução de um agente tensio-activo não iónico, um agente bacteriostático e água.
- 2C. - processo de acorco com a reivindicação 1, caracterizado por a solução compreender ^t-D-ribose em quantidades de 2,5 x x 10'6 g (+ 50%).
- 3*. - rrocessc de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a solução compreender C<-D-ribose na quantidade de 2,5 x x 10'6 g.
- 4·. - rrocesso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a solução compreender pelo menos uma base seleccionada entre citosina, timina, guanina e uracilo, em quantidades tais -4 .que perfaçam uma quantidade total de 4,7 x 10 (+ 50%) micromoles.
- 5*. - processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se encontrarem presentes na solução pelo menos duas bases seleccionadas entre citosina, guanina, timina e uracilo, em quan tidades tais que perfaçam o valor total de 4,7 x 10~4 (+ 50%) micromoles.
- 6e. - processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a solução compreender citosina em quantidades de 1,35 x x 10“4 (+ 5θ%) micromoles, guanina em quantidades de 0,94 x 10-4 (+ 5θ%) micromoles, timina em quantidades de 0,93 x 10~4 ( + 50%) micromoles e uracilo em quantidades de 1,49 x 10~4 (+ 5θ%) micro moles.
- 7ft. - rrocesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido agente tensio-activo não iónico consistir em TRITON® X-100, em quantidades de 1,5 x 103 g (+ 50%).
- 8«. - processo de acordo com as reivindicações 1 e 7, caracte rizado por o referido solvente compreender 1,5 x 10“ g de TRITON ® X-100 e 3 x 10 6 de azeto de sódio.
- 9e. - processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se preparar um hemolizado liofilico constituído por 8 x 10 4 g de hemoglobina, 9 χ 10~4 g de fosfato de potássio monobásico, 3 x 10”4 g de fosfato de potás67 740Tg. 20.129(CJ)-11sio dibásico, 2,5 x 10 6 g de A^-D-ribose, 0,94 x 10 4 micromoles de guanina, 1,35 x IO-4 micromoles de citosina, 0,93 x 10~‘ -4 micromoles de timina e 1,49 x 10 micromoles de uracilo, e um solvente constituido por 1,5 * 10“^ g de TRITON® X-100, 3 x x 104 g de azeto de sódio e 1,5 ml de água.Lisboa, 1.'.' 1938For A. MENARINI S.a.s. - ϋ AGENTE OFICIAL O ADHJNTO,
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