PT863871E - Derivados de aldeidos peptidicos anticoagulantes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO “DERIVADOS DE ALDEÍDOS PEPTIDICOS ANTICOAGULANTES”

Esta invenção refere-se a novos derivados de aldeídos peptídicos de fórmula geral (I), D-Xaa-Pro-Arg-H (I) em que

Xaa representa um grupo 2-cicloheptil-2-hidroxiacetilo ou um grupo 2-ciclopentil-2-hidroxiacetilo.

Pro representa um resíduo L-prolilo e

Arg representa um resíduo L-arginilo, os seus sais de adição ácida formados com um ácido orgânico ou inorgânico e composições farmacêuticas que os contêm.

Os compostos de fórmula geral (I) da invenção têm valiosas propriedades terapêuticas, em particular como anticoagulante, antiplaquetário e antitrombótico.

Representantes particularmente preferidos dos compostos da invenção de fórmula geral (I) são os seguintes derivados:

Hemisulfato de aldeído D-2-ciclo-heptil-2-hidroxiacetil-L-propil-L-arginina e Hemisulfato de aldeído D-2-ciclo-pentil-2-hidroxiacetil-L-propil-L-arginina.

Definições

As abreviações dos hidroxi- e dos aminoácidos, dos seus substituintes e dos peptídeos usadas daqui em diante estão de acordo com as técnicas anteriores, por exemplo Biochem. J. 126, 773 (1972); Biochemistry 14, 449 (1975). É 2

Aminoâcidos:

Arg = L-arginina [ácido (2R)-2-amino-5-guanidino-pentanóico],

Asp = ácido L-aspártico [ácido (2S)-2-amino-3-carboxipropiónico], boro Arg = L-boroarginina [ácido (lR)-l-amino-4-guanidino-butilbórico], D-Chg = D-2-ciclo-hexilglicina [ácido (2R)-2-amino-ciclo-hexil-acético], D-cHga = ácido D-2-ciclo-heptil-2-hidroxi-acético [ácido (2R)-2-cicloheptil-2-hidroxiacético], D-cPga = ácido D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético [ácido (2R)-2-ciclopentil-2-hidroxiacético],

Gla = ácido gama-carboxi-L-glutâmico [ácido (2s)-2-amino-4,4-dicarboxibutírico], Glu = ácido L-glutâmico [ácido (2S)-2-amino-4-carboxibutírico],

Gly = glicina (ácido 2-aminoacético), D-Hma = ácido hexa-hidro-D-amigdálico [ácido (2R)-2-ciclo-hexil-2-hidroacético], D-MePhe = N-metil-3-fenil-D-alanina [ácido (2R)-2-metil-amino-3-fenilpropiónico], D-MePhg = D-N-metilfenilglicina [ácido (2R)-2-amino-3-fenilacético],

Nal(l) = 3-(naft-1 -il)-L-alanina [ácido (2S)-2-amino-3-(naft-l-il)-propiónico], D-Phe = 3-fenil-D-alanina [ácido (2R)-2-amino-3-fenilpropiónico],

Pro = L-prolina [ácido (2S)-pirrolidina-2-carboxílico],

Substituintes:

Ac = acetilo, Boc = tert-butoxicarbonilo, Bz = benzoílo, Bzl = benzilo, Me = metilo, 4MeP = 4-metil-pentanoíIo, pNA = p-nitrofenilamino, THP = tetra-hidropiranilo, Tos = p-toluenossulfonilo, Z = benziloxicarbonilo.

Peptídeos e derivados.

As abreviações dos aminoâcidos por si só representam o respectivo L-aminoácido. O D-aminoácido é referido em separado, por exemplo 3-fenil-D-alanina = D-Phe. O hífen antes e depois da abreviação do aminoácido significa a falta de um átomo de hidrogénio do grupo amino ou a falta de um grupo hidroxi do grupo carboxi, respectivamente. Assim sendo, D-cHga-Pro-Arg-H representa aldeído D-ciclo-heptil-2-hidroxi-acetil-L- prolil-L-arginina e Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA representa benzoíl-L-iloleucil-L-glutamil-glicil-L-arginina p-nitroanilida.

Descrição das técnicas anteriores A coagulação do sangue representa parte do mecanismo de protecção do organismo. Uma lesão nas paredes dos vasos sanguíneos iniciam a cascata, forma-se um coágulo sanguíneo para impedir que haja hemorragia até à morte. Para além disso, as doenças vasculares, a hemostasia e a activaçâo patológica dos factores de coagulação também podem induzir a coagulação sanguínea. O vaso é totalmente ou parcialmente obstruído pelo trombo intravascular formado e desenvolve-se a trombose. A fíbrinólise representa outra parte do mecanismo de protecção. Neste caso, o excesso de coágulo de sangue é removido pelas enzimas que participam na trombóiise e também na dissolução do trombo.

O processo de coagulação do sangue é uma reacção em cascata, uma série de reacções catalisadas por enzimas, em que as proteínas do plasma, isto é, os factores de coagulação, são activados consecutivamente. Os factores são designados por números romanos, sendo a forma activa representada pela letra “a”. Também se usam nomes triviais, assim fibrinogénio = factor I (fl), fibrina = factor Ia (fia), protrombina = factor II (fll) e trombina = factor lia (fila). Durante o processo de coagulação formam-se proteases séricas (fXIIa, fVIIa, fXIa, flXa, fXa e trombina), alguns co-factores aceleradores (fVa e fVIIIa) e a própria molécula coagulável (fibrina). O fXa e a trombina são os dois últimos factores entre as proteases formadas. A trombina, formada pela acção do fXa, inicia a divisão do fibrinogénio, o que tem como resulta um coágulo de fibrina.T

De acordo com conceitos prévios sobre o mecanismo de coagulação do sangue [R. G. MacFarlane, Nature 202, 498 (1964); E. W. Davie e O. D. Ratnoff, Science 145, 1310 (1964)] fX é activado de dois modos, por um patamar intrínseco e por um patamar extrínseco. No primeiro caso o processo é iniciado pelo fXII (fXIIa) com a superfície activada com a transformação fXI-»fXIa que é seguido da reacção fIX-»fIXa; fX é 4

activado por flXa. No patamar extrínseco o processo é iniciado pelo aparecimento de um receptor de superfície celular, o factor tecido (FT), e pelo desenvolvimento do complexo [fVIIxFT] ou [fVIIaxFT]./Vé activado pelo complexo ffVIlaxFT]

De acordo com descobertas recentes a coagulação sanguínea nos organismos vivos é o resultado de ambos os patamares combinados [E. W. Davie et al., Biochemistry 43, 10363 (1991)] em que os passos principais são os seguintes: 1. No caso de lesões na parede dos vasos ou doença, o FT migra para a superfície e liga-se a uma porção do factor VII que circula no sangue. O complexo [fVII-FT] formado é convertido, pela acção de pequenas quantidades de proteases apropriadas (por exemplo fXIIa, fXa, flXa e trombina) no complexo enzimático activo [fVIIa. FT] que activa uma pequena porção de factores plasmáticos IX e X (isto é, formam-se pequenas quantidades de flXa e fXa), depois é inactivado pela acção de IPFT (Inibidor do Patamar do Factor Tecido ‘TFPI’: anteriormente chamado ICAL Inibidor da Coagulação Associado a Lipoproteínas ‘LACI’), o inibidor comum de fXa e do complexo [fVIIaxFT] [T. J. Girard et al., Nature 338, 518-520 (1989)]. 2. O flXa produzido, em conjunto com o factor X e cofactor VlIIa produz, na presença de iões Ca+\ numa superfície fosfolipidica (FL) o complexo “tenase’', [flXa.fVIIIa.fX.FL.Ca^], em que fX é activado pelo fXa. 3. O fXa produzido até este momento, em conjunto com a protrombina (fll) e com o cofactor fVa, produz o “complexo protrombinase” [fXa.fVa.fíl.FL.Ca'^], que tem uma estrutura semelhante à “tenase”. Aqui a protrombina é convertida em trombina. As conversões fV—>fVa e fVIII—»fVIIIa são levadas a cabo quer pelo fXa quer pela trombina. 4. A pequena quantidade de trombina produzida converte uma porção de fXI na enzima fXIa e activa parte dos factores VIII e V, de modo a produzir novas quantidades de fVIIIa e fVa, respectivamente. Neste momento o fXIa pode conduzir a conversão do 5 factor IX na enzima fIXa. Com este passo resume-se a reacçâo em cadeia que começou no complexo Xase e terminou com a formação da trombina. com a repetição do processo formam-se maiores quantidades de trombina. 5. Em concentrações adequadamente altas de trombina, o fibrinogénio dissolvido no plasma sofre uma proteólise parcial, forma-se um monómero de fibrina que primeiro se associa ao polímero de fibrina solúvel, depois converte-se num polímero de fibrina insolúvel. Aqui, a trombina também representa um papel como fXIIIa, o factor que realiza a polimerização, que é produzido com esta acção [L. Lorand e K. Konishi, Arch. Biochem. Biophys. 105, 58 (1964)]. O polímero de fibrina insolúvel é o principal componente do coágulo sanguíneo e do trombo, sendo o outro componente os agregados de plaquetas sanguíneas que são produzidos principalmente pela acção da trombina. O trombo ou coágulo sanguíneo formado prende a maior parte da trombina produzida durante o processo, o que inicia um novo processo de coagulação quando fica em solução durante a dissolução do trombo [A. K. Gash et al., Am. J. Cardiol. 57, 175 (1986); R. Kumar et al., Thromb. Haemost. 72, 713 (1994)].

Os factores anteriormente descritos demonstram o papel chave.da trombina na formação do trombo. Consequentemente, todos os compostos que interferem com a função e/ou formação da trombina são de enorme importância na terapia da trombose e de doenças relacionadas.

No momento, os compostos com mais sucesso e mais usados na profilaxia e no tratamento de tromboses são as heparinas e cumarinas antagonistas da vitamina K (por exemplo Syncumar e Warfafina) que são inibidores indirectos da trombina. A heparina catalisa a reacção entre a trombina e o seu inibidor natural, a antitrombina-III (AT-III). No entanto, esta acção da heparina não existe se a concentração plasmática de AT-III for inferior a 75% do nível normal [R. Egbring et al., Thromb. Haemost. 42, 6

225 (1979)]. Também é importante o facto de que a ligação da trombina pelo trombos acima mencionados não é inibida por este método indirecto por ser inacessível ao complexo heparina-AT-III [J. I. Weitz et al., J. Clin. Invest. 86, 385 (1990)]. Para além disto, não se devem negligenciar os efeitos secundários, como as hemorragias relacionadas com o tratamento e o desenvolvimento de trombo- embolias, devidos aos processos imunopatológicos [J. M. Walenga et al., Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 2 (Suppl. 1), S21-S27 (1996)].

Os antagonistas dâ vitamina K também podem ser administrados oralmente, o seu efeito desenvolve-se após 16-24 horas. Inibem o desenvolvimento de formas reactivas de alguns factores de coagulação com conteúdo em Gla (isto é, protrombina). Para conseguir efeitos terapêuticos é necessária inibição parcial (60-70%) [Μ. P. Esnouf e C.V. Prowse, Biochim. Biophys. Acta 490, 471 (1977)] que pode ser conseguida utilizando a dose de droga correcta. No entanto a utilização de antagonistas da vitamina K não é fácil devido à sua fraca abrangência terapêutica, forte dependência da composição da dieta (vitamina K) e sensibilidade individual variável. O primeiro composto sintético altamente potente que inibida directamente a trombina foi o aldeído tripeptídico D-Phe-Pro-Arg-H, um inibidor reversível, que apresentava uma actividade anticoagulante significativa quer in vitro quer in vivo [S. Bajusz et al., em: Peptides: Chemistry, Structure and Biology (R. Walter e J. Meienhofer, Eds.), Ann Arbor Publ., Ann Arbor, Michigan, USA, 603-608 (1975); Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217 (1978)]. Sintetizou-se uma série de compostos relacionados com o D-Phe-Pro-Arg-H. Um dos primeiros foi Boc-D-Phe-Pro-Arg-H [S. Bajusz et al., Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217 (1978)] e o análogo clorometilcetona (D-Phe-Pro-Arg-CH2Cl) que mostrou ser um inibidor irreversível [C. Kettner e E. Shaw, Thromb. Res. 14, 969 (1979)]. Outros peptídeos e acilpeptídeos que devem ser mencionados são os análogos de boroarginina (D-Phe- e Boc-D-Phe- tal como Ac-D-Phe-Pro-boroArg) que são fortes inibidores reversíveis da trombina [C. Kettner et al., J. Biol. Chem. 265, 18289 (1990)] e outros análogos de Boc-D-Phe-Pro-Arg-H, incluindo o análogo Boc-D-Chg-Pro-Arg- Η [(Ρ. D. Gesellchen e R. T. Shuman, especificação da Patente Europeia n° 0,479,489 A2 (1992)].

Em soluções aquosas o D-Phe-Pro-Arg-H mostrou propensão para sofrer conversão espontânea, mas o D-MePhe-Pro-Arg-H (GYKI-14766), obtido pela metilação do terminal do grupo amino, mostrou ter boa estabilidade mantendo a actividade do composto semelhante [S. Bajusz et al., especificação de patente U.S. n° 4,703,036 (1987); J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)]. A coagulação do sangue e a formação de trombos foram significativamente inibidos em animais de laboratório pelo composto [D. Badgy et al., Thromb. Haemost. 67, 357 e 68, 125 (1992); J. V. Jackson et al., J. Pharm. Exp. Ther. 261, 546 (1992)]; a sua acção inibitória nas enzimas da fibrinólise era desprezável, - co-administrado com trombolíticos promovia significativamente a dissolução do trombo [C. V. Jackson et al., J. Cardiovascular Pharmacol. 21, 587 (1993)] o que não era atingido pelo complexo heparina AT-III. Sintetizaram-se vários compostos relacionados com o D-MePhe-Pro-Arg-H, por exemplo D-MePhg-Pro-Arg-H [R. T. Shuman et al., J. Med. Chem. 36,314 (1993)].

Obtiveram-se análogos do D-Phe-Pro-Arg-H potentes e estáveis, substituindo um grupo α-hidroxiacilo pelo terminal da parte Phe. Alguns deles, por exemplo o análogo do D-2-ciclohexil-2-hidroxiacetilo, D-Hma-Pro-Arg-H exibiu, de modo semelhante a Cl, efeito anticoagulante e antitrombótico muito elevado [especificação de patente húngara n° 211,088; S. Bajusz et al., Bioorg. Med Chem. 8, 1079 (1995)]. A actividade anti-coagulante (isto é, inibição das reacções proteolíticas no processo) mede-se pelos testes anticoagulantes por exemplo pelo testes do tempo da trombina (TT), tempo da tromboplastina parcialmente activada (APTT) e tempo da protrombina (PT) [E. J. W. Bovie et al; Mayo Clinic Laboratory Manual of Haemostasis; W. B. Sanuders Co., Philadelphia (1971)]. Faz-se coagular o plasma, inibido quanto à coagulação espontânea, por exemplo plasma-citrato, e regista-se o tempo necessário à coagulação. Segundo a acção dos anticoagulantes o tempo de coagulação é prolongado proporcionalmente à inibição da ou das reacções do processo. O efeito anticoagulante 8

ΰ pode ser caracterizado pela concentração da substância necessária para duplicar o tempo de coagulação quando em comparação com o controlo (IC50). O efeito dos anticoagulantes nas proteases coagulantes individuais é medida pelo método amidolítico [R. Lottenberg et al., Methods in Enzymol. 80, 341 (1981); G. Cleason, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 411 (1994)]. O factor activo isolado (por exemplo trombina, fXa) e o seu substracto peptídeo-amida cromogéneo ou fluorogéneo reagem na presença ou ausência do inibidor, respectivamente. A acção de inibição da enzima é caracterizada pela constante de inibição (IC50) medida durante a amidólise.

No teste TT a coagulação é iniciada pela trombina adicionada ao plasma citrato. No sistema existem 22 pmol/ml de trombina e na presença de componentes de plasma, a sua inibição pode ser medida pelo fibrinogénio (um dos substractos naturais da trombina) presente. Nos testes APTT e PT , leva-se a cabo todo o processo de coagulação. Dependendo do activador, fX é activado pelo patamar intrínseco ou extrínseco. O fXa produzido activa a protrombina em trombina que, por sua vez, inicia a coagulação do plasma. No teste, o tempo de coagulação é prolongado se as enzimas ou uma delas é inibida pelo inibidor. Nos testes APTT e PT produz-se no máximo 40 pmol/ml Xa (é quantidade máxima de factor X presente em ambos os sistemas) enquanto que se produzem 150 pmol/ml (APTT) e 350 pmol/ml (PT) a partir da trombina [B. Kaiser et al., Thromb. Res. 65, 157 (1992)].

No caso de D-MePhe-Pro-Arg-H (Cl) a concentração que duplica o tempo de coagulação nos testes TT, APTT e PT foi respectivamente 87, 622 e 2915 nM. Estes valores e a quantidade de trombina (22, 150 e 350 pmo/ml) a funcionar nos testes aumentou de modo semelhante, sugerindo que o Cl tem um comportamento de inibidor da trombina em ambos os testes APTT e PT e tem pouca ou nenhuma influência na função do fXa. Em boa concordância com estes resultados, o efeito amidolítico da trombina no substrato Tos-Gly-Pro-Arg-pNA foi inibido pelo Cl com um valor de IC50 = 2 nM, enquanto que o efeito amidolítico do fXa no substrato correspondente Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA foi apenas ligeiramente afectado com um valor de IC50 = 9,1 nM (Bajusz et al., resultados não publicados). 9 É característica inerente ao mecanismo de coagulação do sangue que o processo seja inibido não apenas pelos inibidores directos da trombina mas também por factores que bloqueiam a formação da trombina, por exemplo inibidores do fXa. O polipeptídeo com 60- membros isolado do ‘tick TAP (Peptídeo Anticoagulante Tick) [L. Waksman et al., Science 248, 593 (1990); A. B. Kelly et al., Circulation 86, 1411 (1992)] e o DX-9065a (C2), um não- peptídeo sintético, hidrocloreto de ácido (+)-(2S)-2-[4[[(3S)-l-acetimidoíl-3-pirrolidinil]-oxi]-fenil]-3-[7[amidino-2-naftil]-propiónico pentahidratado [T. Hara et al., Throm. Haemost. 71, 314 (1994); T. Yokoyama et al., Circulation 92, 485 (1995)] são fortes inibidores da coagulação do sangue e da formação do trombo. Tanto o efeito amidolítico como a coagulação plasmática do fXa são fortemente inibidos por estes compostos nos testes PT e APTT, isto é, tanto os factores Xa livres como ligados no complexo são igualmente bem inibidos enquanto que, de acordo com a sua natureza de inibidores específicos do fXa, a trombina não é de todo inibida, isto é, não evidenciam qualquer actividade no teste TT. O 4-MeP-Asp-Pro-Arg-H (C3) (pedido de patente internacional n°93/15756) e o Boc-D-Phe-Nal(l)-Arg-H (C4) (pedido de patente internacional n°94/13693) são peptideos sintéticos inibidores de fXa. De acordo com a literatura o C3 e o C4 inibem a actividade amidolítica de fXa no substrato Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA com ICS0 = 57 e 30 nM, respectivamente. Não existem dados sobre a sua potência anticoagulante. Nos nossos testes C3 e C4 também apresentam inibição significativa no substrato Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA enquanto que a sua actividade anticoagulante mostrou ser negligenciável nos testes de coagulação do plasma. A actividade de inibidores de fXa sintéticos publicadas (C2) e medidas (C3-C4) comparadas com o composto antitrombina Cl encontram-se na Tabela 1.

Os dados da Tabela 1 demonstram que no caso do Cl, o efeito anticoagulante é devido à inibição da trombina enquanto que no caso de C2 é devida à inibição de fXa. O significativo efeito inibitório de fXa causado pelo C3 e C4 não é acompanhado por qualquer efeito coagulante significativo. Muito provavelmente o centro activo do fXa no complexo protrombinase é inacessível ao C3 e C4, sendo que estes peptideos inibem apenas o fXa livre na solução. 10 10

Tabela 1

Efeito inibidor fXa (A) e anticoagulante (B) de inibidores sintéticos conhecidos

Inibidor A: B: IC50, μΜ^ IC50, nMb PT APTT TT Cl 9133 2,91 0,62 0,09 C2 70 0,52 0,97 NAC C3 64 19,32 4,59 0,87 C4 86 53,62 9,96 17,24 a Concentração de peptídeo que duplica o tempo de coagulação comparado com o controlo nos testes do tempo da protrombina (PT), tempo da tromboplastina parcialmente activa (APTT) e tempo da trombina (TT). b Valor medido com o fXa no substrato cromogeneo Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA. c NA = inactivo

De acordo com uma recente publicação [N. A. Pager et ai., Circulation 92, 962 (1995)], não apenas a trombina mas também o factor Xa, preso no trombo/coágulo sanguíneo e libertado durante a dissolução, contribuem para o início e manutenção de um novo processo de coagulação através da activação do complexo [fVri.TF] ou factores V ou VIII, respectivamente. Consequentemente, é vantajoso se o anticoagulante for capaz de inibir o factor Xa para além da inibição da trombina, em particular se esta inibição se estender à trombina e ao factor Xa presos no coágulo.

Breve descrição da invenção É um objectivo da presente invenção preparar novos derivados de peptídeos com maior actividade anticoagulante quando comparada com compostos conhecidos que exibem actividade anticoagulante, também com administração oral.

Observou-se que o efeito amidolítico do factor Xa foi inibido com valores de IC50 cerca de 30 vezes mais baixos com conhecidos aldeídos a-D-hidroxiacil-L-propil-L-arginina [S. Bajusz et al., Bioorg. Med. Chem. 8, 1079 (1995)] quando em comparação com o Cl, enquanto que têm actividade anticoagulante significativa similar. O D-Hma-Pro-

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Arg-H- (C5) é um análogo do D-2-ciclohexil-2-hidroxiacetilo. Verificou-se inesperadamente que os análogos obtidos com o ácido 2-cicloheptil-2-hidroacético e ácido 2-ciclopentil-2-hidroxiacético, D-cHga- e D-cPga-Pro-Arg-H, inibem com mais eficácia o factor Xa mantendo também um efeito anti-caogulante significativo.

Descrição detalhada da invenção

Esta invenção refere-se a novos derivados aldeídos peptídicos de fórmula geral (I), D-Xaa-Pro-Arg-H (I) em que

Xaa representa um grupo 2-cicloheptil-2-hidroxiacetilo ou um grupo 2-ciclopentil-2-hidroxiacetilo.

Pro representa um resíduo L-prolilo e

Arg representa um resíduo L-arginilo, os seus sais de adição ácida formados com um ácido orgânico ou inorgânico e composições farmacêuticas que os contêm.

Os compostos de fórmula geral (I), em que Xaa, Pro e Arg têm os significados já definidos, são preparados pela condensação de um acilpeptídeo Q-D-Xaa-Pro, protegido com um grupo hidroxi com um grupo protector Q, com uma L-arginina ‘lactam’, protegida no grupo guanidino com um grupo benziloxicarbonilo, e reduzindo o peptídeo ‘lactam’ protegido ao aldeído peptídico protegido de fórmula Q-D-Xaa-Pro-Arg(Z)-H, e finalmente removendo o grupo Z do grupo guanidino da arginina e o grupo Q do grupo α-hidroxi, e isolando o derivado de peptídeo de fórmula geral (I) na forma do sal de adição formado com um ácido orgânico ou inorgâncio. O acilpeptídeo Q-D-Xaa-Pro, usado como matéria prima, é preparado pela conversão deum D-Xaa α-hidroxiácido a um éster benzílico, protegendo o grupo hidroxi com um grupo Q, convertendo o Q-D-Xaa-OBzl resultante por hidrogenólise no ácido livre, e juntando-o no éster benzílico de L-prolina. O acil-peptídeo O-protegido necessário é obtido pela remoção do éster benzílico por hidrogenólise. 12 12

Q-D-Xaa, ο α-hidroxiácido protegido por um grupo Q no grupo OH e necessário para o acoplamento com a prolina, é preparado de forma vantajosa pela O-acetilação do composto DL-Xaa racémico. depois removendo o grupo acetilo do Ac-D-Xaa por hidrólise enzimática. Num processo preferido, o DL-Xaa também pode ser resolvido com hidrazida de D-tirosina.

Os compostos de fórmula geral (I) da invenção em que Xaa, Pro e Arg têm os significados já definidos, exibem forte actividade anticoagulante quer in vitro e in vivo e têm excelente biodisponibilidade. O efeito anticoagulante in vitro dos compostos de fórmula geral (I) foi medido pelos testes do tempo da protrombina (PT), tempo da tromboplastina parcialmente activada (APTT) e tempo da trombina (TT) [D. Badgy et al., Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)]. O efeito inibidor do factor Xa dos compostos também foi determinado usando o substrato cromogeneo Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (ver método M6). .

Os resultados obtidos estão representados na Tabela 2. Os dados correspondentes de Cl e C5 servem de controlo. Na Tabela, os compostos estão ordenados por ordem decrescente de actividade PT. Os dados demonstram definitivamente o efeito benéfico das partes terminais cHga- e cPga quando em comparação com resíduos Hma e MePhe.

Tabela 2

Efeito anticoagulante (A) e inibidor do factor Xa (B) dos novos aldeídos peptídicos da invenção e dos compostos controlo com estrutura semelhante por ordem decrescente de actividade PT

Aldeído peptidinil A: IC 50, uMa B: IC só arginina (n°b) PT APTT TT nMc D-cHga-Pro-Arg-H (1) 1,20 0,37 0,11 63 D-cPga-Pro-Arg-H (2) 2,03 0,71 0,10 107 Compostos controlo D-Hma-Pro-Arg-H (C5) 2,14 0,79 0,22 247 D-MePhe-Pro-Arg-H (Cl) 2,92 0,62 0,09 9133 13 13

y<ú-: ri tf» \.·Ά·3 “ Concentração de peptídeo que duplica o tempo de trombina em comparação com o controlo b Idêntico ao número do exemplo da preparação descritiva do respectivo composto e controlo (Cl, C5) c Valor medido no substrato Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA com factor Xa humano isolado (ver métodos M1-M5). A Tabela 3 demonstra no composto n°l como exemplo, o efeito inibitório dos compostos de fórmula geral (I) no factor Xa, preso no coágulo plasmático, e na trombina tal como na trombina ligada ao gel de fibrina; os dados correspondentes de Cl e C2 servem de controlo. O coágulo plasmático foi obtido recalcificando o plasma citrato humano rico em plaquetas e o gel de fibrina pela coagulação de fibrinogéneo humano com fibrina humana. Usou-se Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA e Tos-Gly-Pro-Arg-pNA como substrato para a medição da actividade do factor Xa e da trombina (métodos Ml-M5).

Tabela 3

Efeito inibidor do novo aldeído peptidinil- arginina (1) da invenção e dos compostos controlo (Cl, C5) (IC 50, μΜ) no factor Xa preso no coágulo plasmático e na trombina tal como na trombina ligada ao gel de fibrina3.

Aldeído peptidinil arginina (n°b) Coágulo plasmático Gel de fibrina factor Xa Trombina Trombina D-cHga-Pro-Arg-H- (1) 0,20 0,52 0,21 Compostos controlo D-MePhe-Pro-Arg-H (Cl) U2 0,38 0,30 D-Hma-Pro-Arg-H (C5) 0,19 0,27 0,22 a O Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA e Tos-Gly-Pro-Arg-pNA serviram como substratos para a medição da actividade do factor Xa e da trombina na determinação dos valores de IC 50 de acordo com os métodos M1-M5. b Idêntico ao número do exemplo da preparação descritiva do respectivo composto e controlo (Cl, C5)

Os dados demonstram que o factor Xa e a trombina presa no coágulo plasmático rico em plaquetas tal como a trombina ligada ao gel de fibrina são inibidos pelo composto (1) da invenção com valores de IC J0 mais baixos que a micromole/nanomole, de modo similar ao composto C5.

,á& ,á&

Estudou-se o efeito inibitório dos novos compostos da invenção na plasmina (PL) tal como na formação da plasmina induzida pelo activador do plasminogéneo dos tecidos (tPA) e na uroquinase (UK), pelo método da fibrina- plaquetas [D- Bagdy et al., Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)]. Os compostos Cl e C3 serviram de controlo. Verificou-se que a acção antifibrinolítica moderada de Cl era desprezível in vivo e podia ser usada como adjuvante na dissolução de trombos experimentais enquanto que a actividade antifibrinolítica de C3 era detectável in vivo [C. V. Jackson et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 587 (1993)].

Na Tabela 4 apresentam-se, como exemplo, os resultados obtidos com os novos compostos 1 e 2 tal como com os controlos Cl e C3. Para além dos valores de IC 50 (colunas A) também se encontra a eficácia dos compostos relacionados com Cl (colunas B). Os últimos dados indicam que de modo similar com o composto Cl, a actividade antifibrinolítica dos novos compostos 1 e 2 é moderada, a sua actividade contra as 3 enzimas testadas é 7,5-12-39 vezes inferior à do compostos C3.

Tabela 4

Efeito inibidor (IC 50) dos novos aldeídos peptidinil- arginina da invenção e dos controlos com estrutura similar na plasmina (PL) tal como na formação da plasmina induzida pelo activador do plasminogéneo dos tecidos (tPA) e na uroquinase (UK) estudada pelo método da placa de fibrina'1.

Aldeído peptidinil arginina (n°c) A: IC 50, e B: eficácia relativa·3 PL tPA UK A B A B A B D-cHga-Pro-Arg-H- (1) 83 0,6 74 1,8 120 0,7 D-cPga-Pro-Arg-H (2) 3,9 0,13 112 1,2 137 0,6 D-MePhe-Pro-Arg-H (Cl) 54 1,0 132 1,0 82 1,0 Boc-D-Phe-Pro-Arg-H (C3) 12 4,5 6 22,0 n _> 27,3 a IC 50= concentração do peptídeo (mM) quando a área de hidrólise na placa de fibrina é reduzida em 50% comparada com o controlo. fa Valores relacionados com a actividade de Cl (1/IC 50=1).

15

c Idêntico ao número do exemplo da preparação descritiva do respectivo composto e controlo (Cl, C3) O efeito inibidor da agregação das plaquetas e de anticoagulante dos compostos de fórmula geral (I) foi estudado em coelhos brancos da Nova Zelândia ex vivo de acordo com D. Badgy et al., [Thromb. Haemost. 67, 357 (1992)]. Os compostos foram dissolvidos numa solução salina isotónica tamponada e administrada intravenosamente (0,04-5,0 mg/kg) ou por infusão (0,25-5,0 mg/kg/h) ou por via subcutânea (0,5-6,0 mg/kg) ou p.o. (2,5-20 mg/kg). O efeito dos compostos foi detectável dentro de 30 minutos após a administração p.o., atingindo-se os picos após 60-180 minutos e o nível terapêutico manteve-se dependentemente da dose durante 3->6 horas. O efeito in vivo de D-cHga-Pro-Arg-H (1) encontra-se em detalhe nas Tabelas 5 e 6. Os valores correspondentes de Cl estão referidos como controlo. O composto foi administrado p.o. em doses de 5 mg/kg. Analisaram-se as amostras de sangue que foram retiradas do caudal venoso em cada 30-60 minutos. Determinou-se o tempo de coagulação total do sangue (WBCT) e a inibição da agregação das plaquetas sanguíneos induzida pela trombina (PAI).Também se mediu o tempo da tromboplastina parcialmente activada (APTT) e o tempo da trombina (TT)no plasma citrato obtido a partir das amostras de sangue. Os valores de APTT e de TT estão compilados nas tabelas 5 e os valores WBCT e PAI na Tabela 6.

Tabela 5

Efeito anticoagulante do D-cHga-Pro-Arg-H e do D-MePhe-Pro-Arg-H em coelhos com doses p.o. de 5 mg/kg nos testes APTT e TT caracterizados pelos tempos relativos de coagulação1.

Tempo min. D-cHga-Pro-Arg-H (1) D-MePhe-Pro-Arg-H (Cl) APTT TT APTT TT 0 1,0 1,0 1,0 1,0 30 2.01 ±0.43 10,57±5.98 1,27±0,38 1,52±0,17 45 2,2 5 ±0.4 3 10,89±5,89 1,30+0,02 2,50±0,44 60 2.32 ±0,4 3 11,67±5,69 1,37±0,03 4,75±1,38 90 2,11 ±0,31 14,00+6,48 1,45±0,09 10,50±5,49 120 1.43±0,11 5 51+3 59 180 1,84±0,11 10,60±4,22 1,39±0,09 ? 05+0 38 240 1,66±0,10 2,22±0,71 1,31 ±0,11 1 81+0 39 300 1,37+0,08 1,23±0,07 1,25±0,22 1,31 ±0,09 ],13±0,05 3 Ratio de tempos de coagulação medidos em animais tratados e não tratados. Os valores terapêuticos estão em itálico.

Tabela 6

Efeito anticoagulante e de inibição da agregação das plaquetas sanguíneas (PAI do D-cHga-Pro-Arg-H e do D-MePhe-Pro-Arg-H em coelhos com doses p.o. de 5 mg/kg no teste WBCT caracterizado pelo tempos relativos de coagulação e inibição percentual1.

Tempo min. Õ 30 45 60 90 120 180 240 D-cHga-Pro-Arg-H (1) D-MePhe-Pro-Arg-H (Cl) WBCT PAI (%) WBCT PAI (%) 1,0 1,80±0,36 ' 2,03±0,35 I,98±0,30 1,7 8 ±0,26 1,52±0,13 1,29+0,07 1,13±0,04 0 71,0±19,4 7 4,0 ±13,9 91,0±4,5 93,0 ±3,5 92,4±6,5 71,6± 19,8 49,4±21,5 1,0 1,07±0,13 1,26±0,07 1,55±0,17 1,61 ±0,3 4 1,45±0,21 1,44±0,08 1,22±0,08 0 52,8 ±14,7 5 8,4 ±15,6 5 4,2 ±11,6 83,2 ±8,9 7 5,2 ±12,3 47,5±20,9 32,2±16,0 1

Ratio de tempos de coagulação medidos em animais tratados e não tratados. Os valores terapeúticos estão em itálico. r 17

Os dados das tabelas mostram que o novo composto 1 tem actividade anticoagulante e inibitória da agregação das plaquetas sanguíneas mais elevada e mais estável que o composto controlo Cl.

Os compostos da invenção de fórmula geral (I) são utilizados no tratamento e na prevenção das doenças seguintes em que está envolvida a trombose e/ou hipercoagulação: trombose venosa profunda, embolismo pulmonar, trombose arterial, angina instável, enfarte do miocárdio, fibrilação auricular e ataque com base numa trombose. Na aterosclerose podem ser usados para prevenir doenças das artérias coronárias, doenças trombóticas das artérias cerebrais, como profilaxia cirúrgica de pacientes de alto risco ou outras profilaxias cirúrgicas. Podem ser aplicadas na trombólise de angioplastias transluminais percutâneas na prevenção de reoclusão, na terapia adjuvante na neffose no caso de hemodiálise e em doenças com hipercoagulação: em tumores malignos e inflamação (por exemplo: artrite) tal como em diabetes. Podem ser aplicados em casos em a administração de outros anticoagulantes não seja eficaz ou seja contra indicada, por exemplo: falta de antitrombina-III no caso da heparina ou trombocitopenia induzida pela heparina (HIT), e no caso das cumarinas, por exemplo: na gravidez.

Os compostos da invenção e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis são usados apenas com fins terapêuticos ou de preferência na forma de uma formulação farmacêutica. A invenção também se refere a estas formulações.

As formulações farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de um composto de fórmula geral (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um veículo farmaceuticamente aceitável, materiais de enchimento, diluentes e/ou outros excipientes farmacêuticos conhecidos.

Os veículos, diluentes ou materiais de enchimento acima referidos podem ser água, álcoois, gelatina, lactose, sacarose, amido, pectina, estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, óleos vários de origem animal ou vegetal, outros glicóis, por exemplo: 18 y propileno glicol, polietilenoglicol. Os excipientes farmacêuticos podem ser conservantes, vários emulsionantes naturais ou sintéticos, dispersantes ou agentes humidificantes, materiais corantes, agentes aromatizantes, tampões, materiais que promovem a desintegração ou outros materiais que melhorem a biodisponibilidade do ingrediente activo.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em formulações comuns como composições orais (administradas através da boca como comprimidos, cápsulas, pós, drageias ou granulados) ou composições parentéricas (drogas administradas evitando o sistema gastrointestinal . como injecções, infusões, supositórios, emplastros ou pomadas). O nível de dose terapêutica do composto da invenção depende do estado de saúde do indivíduo e da idade do paciente e pode variar de acordo com estas variáveis; consequentemente, o seu nível é fixado pelo médico responsável pelo tratamento. Em doenças em que seja necessária a inibição da função e/ou formação da trombina com fins profilácticos ou terapêuticas pode-se administrar, por dia e por via oral ou parenteral (por exemplo intravenosamente) uma dose de 0,01 a 1000 mg/kg de peso corporal, de preferência 0,25 a 20 mg/kg de peso corporal.

Os compostos de fórmula geral (I) da invenção administrados em conjunto com agentes trombolíticos (por exemplo tPA ou uroquinase) promovem activamente a dissolução do trombo formado em artérias ou veias e previnem eficientemente a sua nova formação. Nestes casos é preferível administrar os compostos da invenção em simultâneo com os agentes trombolíticos ou imediatamente após tratamento trombolítico.

Os exemplos que se seguem são ilustrativos mas não limitativos do âmbito da invenção.

Os valores R, registados nos exemplos foram determinados por cromatografia em camada fina, usando gel de sílica como adsorvente (DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, Merck, Darmstadt), nos seguintes solventes: 19

1. Acetato de etilo 2. Acetato de etilo-piridina-ácido acético-água (480:20:6:11) 3. Acetato de etilo-piridina-ácido acético-água (60:20:6:11) 6. Acetato de etilo-piridina-ácido acético-água (240:20:6:11) 12. Acetato de etilo-ciclo-hexano (1:9) 14. Clorofórmio- ácido acético (95:5)

Os factores de capacidade (k’) especificados nos exemplos foram determinados com o aparelho “Pharmacia LKB Analytical HPLC System Two” como se segue:

Coluna: “VYDAC C-18 fase reversa: 10pm, 300 A 50 mm”

Tampão A: ácido trifluoro-acético a 0,1% em água Tampão B: ácido trifluoro-acético a 0,1% em acetonitrilo Gradientes aplicados (taxa de fluxo) a 1 mL/min. I: 0-5 min. 0-25% B, depois 25% B isocrático; II: 0-30 min. 0-60% B. O gradiente aplicado na análise de HPLC (I ou II) é especificada entre parêntesis depois da abreviação nos passos individuais dos exemplos. A pureza ópica foi determinada com o aparelho de HPLC abaixo indicado e indicada com a expressão “HPLC quiral” entre parêntesis:

Coluna: Chiralpack WH (DAICEL) 4x250 mm Eluente: 0,25 mM CuS04; fluxo de 1 mL/min. A análise foi levada a cabo a 50°C. O conteúdo peptídico do eluído foi detectado com luz UV a 214 nm. Concentração da amostra: 1 mg/mL em tampão A (fase reversa) ou metanol (fase quiral) respectivamente.; volume injectado 25pL.

Os aldeídos de acilarginina estão presentes em estruturas de equilíbrio, isto é, em aldeído, hidrato de aldeído e duas formas aminociclol. Durante a análise HPLC, o hidrato de aldeído e uma ou ambas as formas de aminociclol aparecem em picos separados, consequentemente os aldeídos de acilarginina descritos nos exemplos são especificados por dois ou três valores de k\

Espectrometria de massa. As medições de ionização positiva FAB foram feitas num aparelho Finnigan MAT 8430. As amostras foram dissolvidas numa matriz álcool m-nitrobenzílico e introduzida directamente na fonte iónica. No espectro de aldeídos de peptidinil-arginina era detectável uma molécula iónica adicional, o que o composto de adição formou com o álcool m-nitrobenzílico (ANB): [M+H]’’ e [M+H+ANB]+. Nos exemplos, os dados de espectro FAB foram especificados de acordo com estes factos. As medições de ionização positiva ESI foram levadas a cabo num aparelho VG Quattro _ (Fisons). As amostras foram dissolvidas numa mistura de acetonitrilo-água (1:1) contendo 1% (v/v) de ácido fórmico e foram introduzidas com uma ansa-amostra de 10 mL na fonte iónica com um fluxo de 15-25 mL/min.

As rotações específicas ([a]D) foram determinadas a 20°C.

Exemplo 1

Hemisulfato de D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-proIil-L-arginina (D-cHga-Pro-Arg-H) aldeído

Passo 1: Tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-prolil-N°- benziloxicarbonil-L-arginina lactam

Suspende-se 7,85 g (20,1 mmole) de tert-butiloxicarbonil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina lactam [(S.Bajusk et al. J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] em 20 ml de clorofórmio, depois adiciona-se 20 ml de acetato de etilo saturado com HC1 gasoso (0,11-0,15 g/ml), com agitação e com arrefecimento com gelo. A clivagem do grupo Boc é monitorizada por cromatografia em camada fina [Rt(3) = 0,5 (composto livre); 1,0 (composto Boc)]. No fim da reacção a suspensão é diluída com 40 mL de éter dietílico, 21 y '3 1 .j a massa cristalina formada é filtrada, lavada com 10 mL de acetona e 10 mL de éter dietílico, e seca com pressão reduzida com hidróxido de potássio durante duas horas. O hidrocloreto de Nc-benziloxicarbonil-L-arginina lactam resultante é dissolvido em 20 ml de dimetilo formamida, arrefecido a -20°C e adicionado ao anidrido misto seguinte.

Dissolve-se 7,1 g (20,1 mmole) de tetra-hidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-prolina (Exemplo 1, Passo 1) em 20 ml de dimetil formamida, arrefecida a -20°C, depois adiciona-se com agitação 2,23 ml (20,1 mmole) de N-metil-morfolina, 2,65 ml (20,1 mmole) de isobutil cloroformato, após 10 minutos de agitação adiciona-se a solução acima referida de NG-benziloxicarbonil-L-arginina lactam em dimetil formamida e por fim adiciona-se trietilamina numa quantidade tal que ajuste o pH da mistura de reacção a 8 (são necessários cerca de 2,8 ml). A mistura de reacção foi agitada a -10°C durante 30 minutos, depois a 0°C durante 1 hora. Depois os sais são retirados por filtração e o filtrado é diluído com 100 ml de acetato de etilo. A solução resultante é lavada com 3x 25 ml de água, 10 ml de hidrogeno sulfato de potássio 1 M e 3 x 10 ml de água, seca com uma solução de sulfato de sódio anidro e evaporada a 2,0- 2.5 kPa. O produto obtido é submetido a cromatografia em coluna de gel de sílica usando 200 g de Kieselgel 60 como adsorvente e acetato de etilo como eluente. As fracções contendo apenas o produto puro [(Rf(l) = 0,60] são juntas e evaporadas a 2,0- 2.5 kPa. O resíduo da evaporação é recristalizado com éter di-isopropílico. -

Rendimento 8,1 g (64%), Rt(l) = 0,6 P.f: 66-68°C. O espectro de massa FAB (626 [M+H] , 779 [M+H+ANB]") confirma a estrutura prevista.

Passo 2: Tetra-hidropiranil-D-2-cicIo-heptil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-NG- benziloxicarbonil-L-arginina aldeído

Dissolve-se 8,0 g (12,9 mmole) de tetra-hidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-proplil-Nc-benziloxicarbonil-L-arginina lactam (Exemplo 1, Passo 1) em 15 ml de tetra- 22 22

hidrofurano, depois com agitação e a temperaturas que não excedam os -50°C adiciona-se uma solução de 3,6 mmole de hidreto de alumínio lítio dissolvido em tetra-hidrofurano. O progresso da redução é monitorizado por cromatografía em camada fina usando acetato de etilo- piridina- ácido acético- água (240: 20: 6:11) como solvente de desenvolvimento e, caso seja necessário pode-se adicionar mais uma porção de hidreto de alumínio lítio. A esta mistura de reacção adiciona-se ácido sulfurico 0,5 M gota a gota com agitação constante e arrefecimento até se atingir pH 3, e depois adiciona-se 35 ml de água. A solução resultante é extraída com 2x15 ml hexano, depois com 3x20 ml de cloreto de metileno. Os extractos de cloreto de metileno são juntos, lavados com 3x15 ml de água, 15 ml de solução de 5% de hidrogeno carrbonato de sódio fria e novamente com 15 ml de água, secos com sulfato de sódio anidro e evaporados a 2,0-2,5 kPa. O resíduo da evaporação é tratado com éter di-isopropílico, filtrado e seco a pressão reduzida.

Rendimento 7,25 g (90%), Rf(6) = 0,40 P.f: 107°C

[a]D = +16,0°C (c= 1, tetra-hidrofurano) O espectro de massa FAB (628 [M+Hf, 731 [M+H+ANB]+) confirma a estrutura prevista.

Passo 3: Hemisulfato de D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-prolil-L-arginina aldeído

Dissolveu-se 7,05 g (11,23 mmole) de tetra-hidropiranil-D-2-ciclo-heptil-2-hidroxiacetil-L-prolil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina aldeído (Exemplo 1, Passo 2) em 60 ml de etanol, depois adiciona-se 11,23 ml de ácido sulfúrico 0,5 M, 13,3 ml de água e 0,7 g de catalisador Pd-C suspenso em 25 ml de etanol e a mistura é hidrogenada a cerca de 10°C. O progresso da redução é monitorizado por cromatografía em camada fina e é completada em cerca de 15 minutos. O catalisador é filtrado e o filtrado é concentrado a cerca de 7-9 ml a 2,0-2,5 kPa. O resíduo é diluído com 80 ml de água, extraído com 4x15 ml de cloreto de metileno e a solução aquosa é deixada a repousar durante 24 horas a 20-22°C. A solução é de novo extraída com 3x15 ml de cloreto de

metileno e o pH é ajustado a 3,5 com uma resina de troca iónica Dowex AG 1-X8 (OH), e depois a solução é liofilizada.

Rendimento 4,28 g (83%) [a]D = -94,7°C (c= 1, água) HPLC (I): k’= 4,93 e 5,25. O espectro de massa FAB (410 [M+H]+, 563 [M+H+ANB]') confirma a estrutura prevista. O material de iniciação da reacção pode ser preparado do seguinte modo: Tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-prolina (THP-D-cHga-Pro)

Passo A: Sal ácido 0-acetil-DL-2-cicloheptil-2-hidroxiacético diciclo-hexilamónio Dissolve-se 1,72 g (10 mmole) de ácido DL-2-cicloheptil-2-hidroxiacético [H. Takeshita et al., Buli. Chemi. Soc. Japan 47, 1767 (1974)] em 20 ml de piridina anidra, adicionou-se 9,4 ml (100 mmole) de anidrido acético e a solução é deixada a repousar à temperatura ambiente durante 24 horas, depois é evaporada a 2,0-2,5 kPa e o resíduo da evaporação é dissolvido em 25 ml de éter dietílico. A solução é lavada com água, depois com uma solução de 1 M de hidrogeno sulfato de potássio e depois novamente com água, depois é seca com sulfato de sódio anidro e evaporada. O resíduo é dissolvido em éter dietílico, depois adiciona-se 2,1 ml (10,5 mmole) de diciclo-hexilamina e 20 ml de ciclo-hexano. A solução é deixada no frigorífico durante 2 dias. Os cristais formados são filtrados, lavados com 3x10 ml de n-hexano e secos ao ar.

Rendimento: 2,56 g (64,6%)

Análise para C23H41N04 (395,57)

Calculado: C%= 69,83; H%= 10,45; N%= 3,54;

Verificado: C%= 69,9; H%= 10,7; N%= 3,5.

Passo B: Resolução do ácido 0-acetil-DL-2-cicloheptil-2-hidroacético com a enzima

acilase I β

ig ε·. a . t1 v /¾ 24

Dissolve-se 1,58 g (4,0 mmol) de sal ácido 0-acetil-DL-2-ciclohpetil-2-hidroxiacético diciclo-hexilamónio em 15 ml de éter dietílico e 5 ml de uma solução 1 M de hidrogeno sulfato de potássio. As fases foram separadas, a fase do éter dietílico é lavada até á neutralidade, seca com sulfato de sódio anidro e evaporada. O resíduo, 0,86 g (4,0 mmole) de um óleo -ácido 0-acetil-DL-2-ciclohpetil-2-hidroxiacético- é dissolvido em 20 ml de hidrogenocarbonato de sódio 0,2 M, depois adiciona-se 0,01 g de hexa-hidrato de cloreto de cobalto (II) e 0,005 mg da enzima acilase I (Sigma, 2000-3000 unidades (mg) e a solução é deixada a repousar durante 3 dias a cerca de 25°C. A solução aquosa é acidificada com 4,5 ml de uma solução 1 M de hidrogenossulfato de potássio e é extraída com 3x10 ml de éter dietílico. As fases de éter dietílico são juntas, lavadas com água, secas com sulfato de sódio anidro e evaporadas. O resíduo da evaporação é um óleo, uma mistura de ácido L-2-ciclo-hpetil-2-hidroacético [Rf(14)= 0,2] formado depois da acção da enzima e ácido O-acetil-D-2-cicloheptil-hidroacético [Rf(14)= 0,5], que não foi clivado pela enzima. A mistura é submetida a uma cromatografia em coluna de gel de sílica, usando uma mistura de clorofórmio- ácido acético (95:5) como solvente de desenvolvimento. As ífacções contendo apenas o produto puro são juntas e evaporadas a 2,0-2,5 kPa. O resíduo da evaporação 1 é ácido 0-acetil-D-2-ciclohpetil-2-hidroxiacético [Rt(14)= O, 2], 0,34 g (79%) num óleo que é usado directamente no passo C seguinte. O resíduo da evaporação 2 é ácido L-2-cicloheptiI-2-hidroxiacético [Rf(14)= 0,2], 0,25 g (80%) num composto sólido que é filtrado com n-hexano e seco ao ar.

P. f: 78°C

[oc]D= +18,15° (c= 1, metanol). Pureza óptica cerca de 95% (HPLC quiral)

Passo C: Acido D-2-cicloheptil-2-hidroacético (deacetilação do derivado O-acetil com metilato de sódio) O ácido 0-acetil-D-2-cicIoheptiI-2-hidroxiacético (resíduo de evaporação 1), obtido no passo B, é dissolvido em 4 ml de metanol contendo 1,59 mmole de metilato de sódio. A solução é deixada a repousar durante 24 horas e depois é evaporada. O resíduo é 25

dissolvido em 10 ml de éter dietílico e 2,5 ml de uma solução 0,5 M de hidrogeno sulfato de potássio. A fase de éter dietílico é lavada com água, seca com sulfato de sódio anidro e evaporada. O resíduo cristalino é trabalhado com hexano, filtrado e seco ao ar. Rendimento 0,21 g (61%) [a]D= -14,7° (c= 1, metanol). Pureza óptica cerca de 86% (HPLC quiral)

Passo D: Ácido D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético (resolução do composto DL com D-tirosina)

Suspende-se 17,2 g (100 mmole) de ácido DL-2-cicloheptil-2-hidroxiacético e 19,52 g (100 mmole) de hidrazida de D-tirosina em 600 ml de etanol anidro e a mistura é sujeita a refluxo até completa dissolução. Deixa-se a solução a arrefecer, em primeiro lugar à temperatura ambiente, depois deixa-se no frigorífico durante a noite. Os cristais formados são filtrados, lavados com 2x 20 ml de etanol anidro e secos em pressão reduzida. O produto, 19,54 g (53,18 mmole) do sal diasteriomérico, é recristalizado duas vezes com 15 ml/g de etanol anidro. Obtém-se 12,45 g (67,7 %) de sal diasteriomérico que é dissolvido em 50 ml de éter dietílico e 50 ml de 1M de hidrogeno sulfato de potássio. A fase de éter dietílico é lavada com água até à neutralidade, seco com sulfato de sódio anidro e evaporada a 2,0-2,5 kPa. O resíduo cristalino é trabalhado com n-hexano, filtrado e seco ao ar.

Rendimento: 5,61 g (32,57 mmole, 65,2%) de ácido D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético. P.f: 80°C

[a]D= -20,2° (c= 1, metanol), e -30°C (c—1, ácido acético).

Pureza óptica > 98% (HPLC quiral)

Análise para C9H1503 (172,22)

Calculado: C%= 62,76; H%= 9,36;

Verificado: C%= 62,01; H%= 9,31;

Passo E: Éster benzílico de ácido D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético

Dissolve-se 5,51 g (32 mmole) de ácido D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético (Exemplo 1, passo D) em 37 ml de dimetil formamida, depois adiciona-se 3,7 ml (31,3 mmole) de 26

brometo de benzilo e 6,34 ml (32 mmole) de diciclo-hexil carbodi-imida e a mistura é agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. Depois a mistura é filtrada e evaporada a 2,0-2,5 kPa. O resíduo é dissolvido em 50 ml de éter dietilico e 50 ml de hidrogeno sulfato de potássio 0,5 Μ. A fase de éter dietilico é lavada com água até è neutralidade, 2x10 ml de hidrogeno carbonato de sódio a 5% e 2x10 ml de água, seca com sulfato de sódio anidro e evaporada a 2,0-2,5 kPa.

Rendimento: 7,4 g (88%), óleo, Rt(12)= 0,20 [a]D= +13,2° (c= 1, metanol).

Passo F: Éster benzílico de ácido tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético Dissolve-se 7,4 g (28 mmole) de éster benzílico de ácido D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético (Exemplo 1, passo E) em 65 ml de cloreto de metileno, depois adiciona-se 3,6 ml (39,4 mmole) de 2,4-di-hidropirano e 0,3 ml de acetato de etilo saturado com HC1 gasoso (0,11-0,15 g/ml) e a mistura é deixada durante 16 horas à temperatura ambiente. Depois a mistura é diluída com 40 ml de cloreto de metileno, lavada com 3x20 ml de água, 3x 20 ml de uma solução de 5% de hidrogenocarbonato de sódio fria, novamente com 2x20 ml de água, seca com sulfato de sódio anidro e evaporada a 2,0-2,5 kPa. O resíduo é considerado 28 mmole de éster benzílico de ácido tetrahidro-piranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético [Rf(12)= 0,30].

Passo G: Ácido tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético Dissolvem-se 28 mmole de éster benzílico de tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroacético (Exemplo 1, Passo F) em 50 ml de metanol e é hidrogenado na presença de 0,1 g de catalisador Pd-C. O progresso da reacção é monitorizado por cromatografia em camada fina [Rt(12)= 0,30 (éster); 0,00 (ácido); Ri(2)= 1,00 (éster); 0,8 (ácido)]. No fim da reacção o catalisador é filtrado, o filtrado é evaporado a 2,0-2,5 kPa e o resíduo oleoso é seco em pressão reduzida.

Rendimento 6,7 g (25 mmole, 89%) óleo, [ Rt(2)= 0,80].

Passo H: Éster benzílico de tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-prolina. ία

Dissolvem-se 25 mmole de ácido tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacético (Exemplo 1, Passo G) em 25 ml de dimetil formamida, depois 2,8 ml (25 mmole) de N-metilmorfolina, 6,04 g (25 mmole) de hidrocloreto de éster benzílico de L-prolina, depois com agitação com agitação e arrefecimento em água- gelo adicionam-se 5,16 g (25 mmole) de diciclo-hexil carbodi-imida. A mistura da reacção é agitada durante uma hora a 0°C e durante a noite à temperatura ambiente, finalmente é filtrada e evaporada a 2,0-2,5 kPa. O resíduo é dissolvido em 100 ml de éter dietílico, lavado com 3x20 ml de uma solução de hidrogeno càrbonato de sódio a 5%, água, uma solução de hidrogeno sulfato de potássio a 1M e água, seco com sulfato de sódio anidro e evaporado. O resíduo da evaporação é seco em condições de pressão reduzida.

Rendimento 9,9 g (90%) óleo, Rt (l)= 0,80.

Passo 1: Tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxi-acetil-L-prolina Dissolvem-se 9,9 g (22,5 mmole) de éster benzílico de tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-prolina (Exemplo 1, Passo H) em 100 ml de metanol e é hidrogenado na presença de 0,1 g de catalisador Pd-C. O progresso da reacção é monitorizado por cromatografia em camada fina [Rt(l)= 0,80 (éster); 0,00 (ácido); Rf(2)= 1,00 (éster); 0,30 (ácido)]. No fim da reacção o catalisador é filtrado, o filtrado é evaporado a 2,0-2,5 kPa e o resíduo oleoso é seco em condições de pressão reduzida.

Rendimento 7,2 g (90%) óleo, Rr(2)= 0,30, sendo a maior parte usada directamente no Exemplo 1, Passo 1, e uma pequena porção é convertida num sal cristalino, pelo modo que se segue. 0,35 g (1 mmole) de tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxi-acetiUL-prolina (óleo) são dissolvidas em 5 ml de éter dietílico e adiciona-se 0,115 ml (1,05 mmole) de ciclo-hexilamina. Os cristais formados são filtrados, lavados com éter dietílico e secos em condições de pressão reduzida. .3 .3

3..28

Rendimento: 0,40 g (90%) de sal de tetrahidropiranil-D-2-cicloheptil-2-hidroxiacetil-L-prolina ciclo-hexilamónio.

P.f.: 146-150°C

[a]D= -12,8° (c= 1, etanol).

Análise para C25H44N2C>5 (452,62)

Calculado: C%= 66,34; H%= 9,80; N%= 6,19;

Verificado: C%= 66,20; H%= 9,90; N%= 6,08;

Exemplo 2

Hemisulfato de D-2-cicIopentil-2-hidroxiacetiI-L-prolil-L-arginina aldeído (D-cPga-Pro-Arg-H)

Passo_1_: Tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-NG- benziloxicarbonil-L-arginina lactam

Faz-se acoplar 0,82 g (2,1 mmole) de tert-butiloxi-carbonil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina lactam [S. Bajusz et al., J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] e tetrahidropiranil-D-ciclopentil-2-hidroxiacetil-L-prolina (Exemplo 2, Passo G). Usando o processo descrito no Exemplo 1, Passo 1, e utilizando quantidades proporcionais de reagentes e solventes, o produto final foi purificado por cromatografia. As fracções contendo apenas o produto final puro [Rf(l)= 0,4] são juntas, evaporadas a 2,0-2,5 kPa e o resíduo é seco em condições de pressão reduzida.

Rendimento 0,59 g (47%) de um óleo que é considerado 0,97 mmole de tetrahidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxiacetil-L-prolil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina lactam. O espectro de massa FAB confirma a estrutura prevista: (598 [M+H]+, 751 [M+H+ANB]+).

Passo_2: Tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-N°- benziloxicarboni 1-L-arginina aldeído

Reduzem-se 0,56 g (0,98 mmole) de tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-N°-benziloxicarbonil-L-arginina lactam (Exemplo 2, Passo 1) pelo processo descrito no Exemplo 1, Passo 2, utilizando quantidades proporcionais de reagentes e solventes, à excepção que no caso da cromatografia em camada fina para a monitorização do progresso da reacção, se utiliza acetato de etilo [Rf(l)= 0,4 (lactam); O, 0 (aldeído)].

Rendimento 0,4 g (67%) do produto desejado após ter sido trabalhado com hexano. Rf(6)= 0,4 (lactam).

P. f.:91-93°C O espectro de massa FAB confirma a estrutura prevista: (600 [M+H]+, 753 [Μ+Η+ΑΝΒΓ).

Passo 3: Hemisulfato de D-2-ciclopentil-2-hidroxiacetil-L-prolil-L-arginina aldeído Transformam-se 0,38 g (0,63 mmole) de tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-NG-benziloxicarbonil-L-arginina aldeído (Exemplo 2, Passo 2) pelo processo descrito no Exemplo 1, Passo 3, utilizando quantidades proporcionais de reagentes e solventes.

Rendimento 0,22 g (81%) do produto desejado. HPLC (I): k’= 4,29 e 4,68. O espectro de massa FAB confirma a estrutura prevista: (382[M+H]+, 535 [M+H+ANBD- O material de iniciação da reacção pode ser preparado do seguinte modo: TetrahidropiraniI-D-2-ciclopentil-2-hidroxiacetil-L-prolina (THP-D-cPga-Pro)

Passo A: Resolução do ácido 0-acetil-DL-2-ciclopentil-2-hidroacético com a enzima acilase I

Acetila-se e hidrolizou-se 0,72 g (5,0 mmole) de ácido DL-2-ciclopentil-2-hidroxiacético [M. Robba e Y. Le Guen, Chim. Therap. 1966, 238; Chem. Abst. 66, 18633f (1967)] com acilase I pelo processo descrito no Exemplo 1, Passos A e B, usando quantidades proporcionais de reagentes e solventes. A mistura resultante de ácido L-2-ciclopentil-2-hidroxiacético [Rf(14)= 0,35] e ácido O-acetil-D-2-ciclopentil- 30

2-hidroxiacético [Rf( 14)= 0,52] é separada e a última é transformada pelo processo descrito no Exemplo 1, Passo C, usando quantidades proporcionais de reagentes e solventes, em ácido D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético. Rendimento: a) 0,2 g (1,39 mmole) de ácido L-2-ciclopentil-2-hidroxiacético, p.f. 108-109°C; [a]D=-15 ,95°C (c= 1, metanol); pureza óptica 99% (HPLC quiral), e b) 0,16 g (1,1 mmole) de ácido D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético, p.f. 106°C; [a]D= +15,5°C (c= 1, metanol); pureza óptica 98% (HPLC quiral), e

Passo B: Ácido D-2-ciclopentiI-2-hidroxiacético (resolução do composto DL com hidrazida de D-tirosina)

Suspende-se 1,44 g (10 mmole) de ácido DL-2-ciclopentil-2-hidroxiacético [M. Robbae Y. Le Guen, Chim. Therap. 1966, 238; Chem. Abst. 66, 18633f (1967)] e 1,97 g (10 mmole) de hidrazida de D-tirosina em 50 ml de etanol anidro e a mistura é sujeita a refluxo até completa dissolução. Deixa-se a solução a arrefecer à temperatura ambiente e depois deixa-se no frigorífico durante a noite. Os cristais formados são filtrados, lavados com 2x 2 ml de etanol anidro frio e secos em condições de pressão reduzida. O produto obtido 2,14 g (6,3 mmole) do sal diasteriomérico, é recristalizado duas vezes com 40 ml/g de etanol anidro. Obtém-se 1,54 g (4,53 mmole) de sal diasteriomérico que é dissolvido em 10 ml de éter dietílico e 5 ml de hidrogeno sulfato de potássio 1M. A fase de éter dietílico é lavada com água até à neutralidade, seco com sulfato de sódio anidro e evaporada a 2,0-2,5 kPa. O resíduo cristalino é trabalhado com éter de petróleo, filtrado e seco ao ar.

Rendimento: 0,56 g (3,88 mmole, 76,7%) de ácido D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético, p.f.: 109-110°C; [a]D= +14,8° (c= 1, metanol), e -30°C (c=l, ácido acético).

Pureza óptica 98% (HPLC quiral).

Análise para C7H1203 (144,17)

Calculado: C%= 58,31; H%= 8,39;

Verificado: C%= 58,56; H%= 8,50; 31

Passo C: Éster benzílico de ácido D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético Transformam-se 0,47 g (3,2 mmole) de ácido D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético (Exemplo 2, Passo B) pelo processo’ descrito no Exemplo 1, Passo E, usando quantidades proporcionais de reagentes e de solventes.

Rendimento: 0,74 g (95%), do produto desejado na forma de um óleo, [Rf(12)= 0,20].

Passo D: Éster benzílico de ácido tetrahidropiranil-D-2-cicIopentiI-2-hidroxiacético Transformam-se 0,74 g (3,2 mmole) de éster benzílico de ácido D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético (Exemplo 2, Passo C) pelo processo descrito no Exemplo 1, Passo F, usando quantidades proporcionais de reagentes e de solventes. O resíduo resultante da evaporação é considerado 2,75 mmole do produto desejado Rf(12)= 0,27-0,36.

Passo E: Ácido tetrahidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético Transformam-se 2,75 mmole de éster benzílico de ácido tetrahidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético (Exemplo 2, Passo D) pelo processo descrito no Exemplo 1, Passo G, usando quantidades proporcionais de reagentes e de solventes.

Rendimento: 0,6 g (2,6 mmole, 95%), do produto desejado, [Rf(l)= 0,25].

Passo F: Éster benzílico de tetrahidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxiacetil-L-prolina Condensam-se 2,6 mmole de ácido tetrahidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxiacético (Exemplo 2, Passo E) e 0,62 g (2,6 mmole) de hidrocloreto de éster benzílico de L-prolina pelo processo descrito no Exemplo 1, Passo H, usando quantidades proporcionais de reagentes e de solventes.

Rendimento: 0,97 g (90%), do produto desejado na forma de um óleo. Rí( 1)=0,7.

Passo G: Tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolina 32

Transforma-se 0,97 g (2,3 mmole) de éster benzílico de tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolina (Exemplo 1, Passo F) pelo processo descrito no Exemplo 1, Passo I, usando quantidades proporcionais de reagentes e de solventes.

Rendimento 0,71 g (89%) do produto desejado na forma de um óleo, [Rf(9)= 0,5], sendo a maior parte usada directamente no Passo 1 do Exemplo, e uma pequena porção é convertida num sal cristalino, pelo modo que se segue. O, 03 g (0,1 mmole) de tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolina (óleo) são dissolvidas em 5 ml de éter dietílico e adiciona-se 0,018 ml (0,1 mmole) de diciclo-hexilamina. Os cristais formados são filtrados, lavados com éter dietílico e secos em condições de pressão reduzida.

Rendimento: 0,048 g (95%) de sal de tetra-hidropiranil-D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolina diciclo-hexilamónio.

P. f.: 145-147°C

Análise para C29H50N2O5 (506,73)

Calculado: C%= 68,73; H%= 9,95; N%= 5,52;

Verificado: C%= 67,25; H%= 9,94; N%= 6,20; O espectro de massa FAB confirma a estrutura prevista: (507 [M+H+DCHA]+). Métodos Método Ml

Preparação do coágulo plasmático a) Prepara-se plasma rico em plaquetas (PRP) centrifugando uma mistura) 9:1 de sangue humano e de uma solução aquosa 3,8% de citrato de sódio (1/2) durante 5 minutos a 240 xg- b) Coloca-se 200 μΐ de PRP em cada recipiente de reacção, adiciona-se 80 μΐ de uma solução de cloreto de cálcio 40 mM e a mistura é deixada à temperatura ambiente durante uma hora. O coágulo plasmático que se forma é lavado suavemente com 6x2 33 ml de uma solução de cloreto de sódio 0,9 % seguido de sedimentação durante 5 minutos para remover as enzimas dissolvidas (factor Xa e trombina). O conteúdo em trombina das lavagens é testado da seguinte maneira. c) A 400 μΐ de líquido de lavagem adiciona-se 100 μΐ de solução de substrato 1 mM Tos-Gly-Pro-Arg-pNA e a mistura é incubada durante 30 minutos a 37°C, depois a reacção é parada pela adição de 100 μΐ de ácido acético a 50%.

Transferem-se porções de 150 μΐ da mistura para poços de uma placa de microtitulação de 96 poços e a extinção é medida a 405 nm (ELISA READER SLT Laborinstruments GmbH, Áustria). Quando a lavagem tem sucesso, a extinção é inferior a 5% do controlo. Método M2

Ensaio da inibição do factor Xa preso no coágulo plasmático a) Preparam-se soluções do peptídeo inibidor com as concentrações de 0,1- 1,0- 10 e 100 pg/ml com tampão Tris 0,1 M contendo 0,02% de albumina humana a pH 8,5. b) Depois de escorrer o líquido de lavagem, coloca-se 400 μΐ da solução de peptídeo (3 amostras paralelas para cada concentração) e 400 μΐ de tampão, que serve de controlo, no coágulo (Método Ml) e a mistura é incubada durante 5 minutos a 37°C. Depois adiciona-se 100 μΐ de solução de 2 mM de substrato Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA e a incubação continua a 37°C, por mais 30 minutos, depois a reacção é parada pela adição de 100 μΐ de ácido acético a 50%. c) Colocam-se porções de 150 μΐ de cada mistura de reacção nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços e a extinção é determinada a 405 nm (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Áustria). A concentração de peptídeo (IC50) necessária para 50% de inibição é determinada graficamente a partir dos valores médios de extinção em relação aos controlos. ·.- .. a tò s> ./; /λ Λ, 34 Método M3

Ensaio da inibição da trombina presa no coágulo plasmático a) As soluções do peptídeo inibidor são preparadas pelo processo descrito no método M2, ponto a). b) Depois de escorrer o líquido de lavagem, coloca-se 400 μΐ da solução de peptídeo (3 amostras paralelas para cada concentração) e 400 μΐ de tampão, que serve de controlo, no coágulo (Método Ml) e a mistura é incubada durante 5 minutos a 37°C. Depois adiciona-se 100 μΐ de solução de 1 mM substrato Tos-Gly-Pro-Arg-pNA e a incubação a 37°C continua por mais 30 minutos, depois a reacção é para pela adição de 100 μΐ de ácido acético a 50%. A operação continua como descrito no Método M2, ponto c). Método M4

Preparação do gel de fibrina a) Coloca-se em cada recipiente de reacção 200 μΐ de fibrinogénio humano 6 mg/ml (SIGMA), 25 μΐ de trombina humana 25 NIH U/ml (SIGMA) e 40 μΐ de uma solução de cloreto de sódio 100 mM e as misturas são armazenadas durante uma hora a 20-22°C. A fibrina formada é lavada suavemente com 3x2 ml de uma solução salina isotónica seguida de sedimentação para remover, da solução, o conteúdo em trombina. A eficácia da lavagem é controlada pelo processo descrito no Método Ml, ponto c). Método M5

Ensaio da inibição da ligação da trombina ao gel de fibrina a) Preparam-se soluções de 0,1- 1,0- 10 e 100 pg/ml com tampão Hepes/ NaCl (Hepes 0,01 Me cloreto de sódio 0,1M, pH= 7,4). b) depois segue-se o procedimento descrito no Método M3, ponto b). Método M6

Ensaio da inibição do factor Xa em solução na placa de microtitulação de 96 poços a)Usam-se soluções de factor Xa 1,3 U/ml (humano, SIGMA), peptídeos inibidores com concentrações de 0,1- 1,0- 10 e 100 pg/ ml em tampão fosfato (fosfato de sódio 0,1 M e

I cloreto de sódio 0,05 M, pH 7,4) e soluções 0,33 nM do substrato Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA em água destilada. b) Preparam-se três misturas de reacção a partir do controlo e de cada solução de peptídeo. Nos poços da placa coloca-se 30 μΐ de cada peptídeo e do tampão que serve de controlo, 30 μΐ de factor Xa, 90 μΐ de tampão e 150 μΐ de substrato lendo-se, então, 10 minutos depois os valores de extinção a 405 nm. O procedimento continua como descrito no Método M2, ponto c).

Lisboa, «2 JUN. 2000

Américo da Silva Carvalho

Aoente Olicial de Propriedade Industrial R. Castilho, 201-3.» t - 1070 LISBOA Telefs. 3851339 - 385 4613

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Derivados de aldeídos peptidicos anticoagulantes de fórmula geral (I), D-Xaa-Pro-Arg-H (I) em que Xaa representa um grupo 2-cicloheptil-2-hidroxiacetilo ou um grupo 2-ciclopentil-2-hidroxiacetilo. Pro representa um resíduo L-prolilo e Arg representa um resíduo L-arginilo, os seus sais de adição ácida formados com um ácido orgânico ou inorgânico.

2. D-2-ciclo-heptil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-L-arginina aldeído e os seus sais de adição ácida.

3. Hemisulfato de D-2-ciclo-heptil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-L-arginina aldeído.

4. D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-L-arginina aldeído e os seus sais de adição ácida.

5. Hemisulfato de D-2-ciclopentil-2-hidroxi-acetil-L-prolil-L-arginina aldeído.

6. Uma composição farmacêutica que compreende como ingrediente activo pelo menos um composto de fórmula geral (I), em que Xaa, Pro e Arg têm os significados definidos na reivindicação 1, ou um sal de adição ácida farmaceuticamente aceitável em mistura com solventes, diluentes, veículos e/ou aditivos normalmente usados na indústria farmacêutica.

7. Um composto como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 6 para utilização como agente terapêutico. 2 ΐ +- t * u

8. Um composto como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 6 para utilização como agente terapêutico antitrombótico. Lisboa, _ 2 jUN. ?000 fL·-!_àt U Américo da Siiva Carvalho Agente Oficial de Propriedade Indcslr.?· R. Castilho, 201 - 3.*' £ - >070 USBOA TSlelS- 3851339 - 3654513