PT85898B

PT85898B - Processo de preparacao de uma composicao trombolitica a base de um activador de plaminogenio e de um inibidor de agregacao plaquetaria

Info

Publication number: PT85898B
Application number: PT85898A
Authority: PT
Inventors: Ronald John Shebuski; Tsuneo Fijita
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1986-10-09
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1990-08-31
Also published as: MY101942A; AU7950187A; DK528489A; NZ221977A; DK528489D0; JPS6396134A; ZA877560B; AU4106889A; DK530087A; NZ230742A; FI874440A; FI874440A0; HUT44942A; NO874213L; NO874213D0; DK530087D0; IE872688L; PT85898A; KR880004820A; EP0265129A1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento refere-se ao campo da farmacologia cardiovascular e, mais especificamente, a activadores de plasminogée nio e à sua utilização para efectuar a fibrinólise/reperfusão que se seguem à oclusão trombótica da coronária ou de outros vasos sanguíneos.

Antecedentes do Invento

As terapêuticas em vigor para a reperfusãp dos vasos sari guíneos ocluídos incluem a administração intravenosa ou intracoronãria de um activador de plasminogénio, i.e., a terapia trombolítica. De entre os principais activadores de plasminogénio usados em terapia trombolítica salientam-se a estreptoquinase (SK), de origem bacteriana, e a uroquinase (UK) e o activador de tecido de plasminogénio (tPA), ambos de origem hu mana.

tPA apresenta diversas vantagens em relação à SK e UK. Estas incluem a falta de imunogenicidade , um problema potencial no caso de SK e a especificidade de ligação à fibrina, uma característica que tem como resultado uma reduzida fibrinó lise sistémica.

No entanto, a terapia trombolítica consegue apenas, no melhor dos casos, restabelecer a circulação íntegra numa artéria com enfarte. A terapia trombolítica não anulará os factores responsáveis pelo início do trombo tal como placas ateroscleréticas avançadas, rotura da íntima, aderência ou agregabilidade de plaquetas aumentada ou espasmo coronária. Os paciejn tes com estenose residual superior a 80%, após recanalizações sucedidas com tPA, têm um risco extremamente elevado de nova trombose, mesmo em presença de doses elevadas de heparina. Ver Gold et al. , Circ. 73:347 (1986). Para além da reoclusão persistente, pode também estar associado à administração de doses elevadas de tPA a hemorragia sistémica.

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-30 tromboxano A₂ (TXA₂) é um metabolito araquidonato que é sintetizado fundamentalmente nas plaquetas sanguíneas. Ver Hamberg et al., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 72:2994 (1975); Moncada et al., Pharmacol. Rev. 30:293 (1979). Este agente tem propriedades de agregação de plaquetas e propriedades vaso, constritoras potentes e tem sido objecto de grande interesse. Os inibidores de tromboxano-sintase não têm efeitos fibrinolíticos conhecidos mas são inibidores específicos da enzima das plaquetas tromboxano-sintase que converte o endoperóxido de prostaglandina induzido por araquidonato, PGH₂, em tromboxano A₂» Os inibidores de tromboxano-sintase têm demonstrado ser eficazes na inibição da agregação de plaquetas em vários modelos de animais de activação de plaquetas. Ver, Schumacher et al., 3. Pharmacol. Exp. Ther. 277:719 (1983), e Lindsay et al., Thromb. Res. 43: 127 (1986). Aiken et al. , 3. Pharmacol. Exp. Ther. 219:299 (1981) demonstraram que a prostaciclina endógena contribui para a eficácia da inibição de tromboxano-sintase por indução ou roubo de endoperóxidos derivados de plaquetas de modo a formar prostaciclina.

Schumacher et al., 3. Cardiol. Pharmacol. 7.:739 (1985) relataram que a prostaciclina aumenta a trombólise coronária induzida por estreptoquinase em cães.

Gallas et al., Fed. Proc. 45:96 (1986) relataram que CGS 13080, um inibidor de tromboxano-sintase, inibe a reoclusão que se segue à reperfusão induzida por estreptoquinase após oclusão trombótica da artéria circunflexa coronária num modelo de cão.

z

E um objecto deste invento proporcionar uma terapia trombolítica compreendendo administrar internamente um activa. dor de plasminogénio e um agente que diminui a necessidade de uma dose eficaz de activador de plasminogénio e tem como resul z tado uma menor incidência de reoclusão. E também um objecto deste invento proporcionar uma composição de activador de pias, minogénio compreendendo tPA e que é eficaz a doses de tPA meno, res. E ainda um objecto proporcionar a composição que é sujei, ta a uma incidência menor de reoclusão.

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Sumário do Invento invento reside na descoberta de que a dose eficaz de um activador de plasminogénio em terapia trombolítica e a inci. dência de reoclusão a ela associada podem ser diminuídas por administração de um inibidor da actividade de tromboxano.

Especificamente, este invento refere-se a uma composição trombolítica para administração parenteral para efectuar a trombólise e reperfusão de uma oclusão trombótica num mamífero, composição que compreende um activador de plasminogénio, um ini bidor da agregação de plaquetas induzida pór tromboxano e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Num outro aspecto, o invento refere-se a um método para efectuar a trombólise e reperfusão de uma oclusão trombótica num mamífero, método que compreende administrar internamente ao mamífero uma quantidade eficaz de um inibidor da agregação de plaquetas induzida por tromboxano e uma quantidade eficaz de um activador de plasminogénio.

Num outro aspecto, o invento é um conjunto para utilização num método para efectuar a trombólise e reperfusão de uma oclusão trombótica num mamífero, compreendendo num recipiente, um inibidor da agregação de plaquetas induzida por tromboxano e, num segundo recipiente, um activador de plasminogénio.

Estes e outros aspectos descritos detalhadamente abaixo são considerados aspectos adicionais do mesmo invento.

Breve Descrição das Figuras

A Fig. 1 ilustra as curvas dose-resposta relativas à infusão local de tPA a 0,01, 0,10 e 1,0 mn, i.a., na arté-

ria femoral do coelho. 0 restabelecimento da circulação sanguínea femoral é o ponto final utilizado para determinar a ef_i

A Fig. 2 ilustra as curvas dose-resposta relativas a tPA a doses de 0,01 e 0,10 mn, i.a. na presença de CGS 13080;

administraram-se duas vezes 2 mg/kg, i.v. de CGS 13080, sob a forma de injecção em bolo, 5 minutos antes do período de 30 mi

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nutos de infusão de tPA e no final deste período. (P<0,05 vs. CGS 13080 + tPA 0,01 yzg/kg/mn, i.a.).

A Fig. 3 ilustra uma comparação dos efeitos de 1,0^og/ /kg/mn de tPA em relação a 0,01 e 0,10 y^g/kg/mn de tPA na presença de CGS 13080 no restabelecimento da circulação sanguínea femoral.

Descrição Detalhada do Invento

Verificou-se agora que utilizando um agente que iniba a actividade do tromboxano se baixa significativamente a dose trombolítica eficaz de um activador de plasminogénio, se diminui o tempo de reperfusão e se reduz a incidência de reoclusão. Embora o invento não se limite a um mecanismo de acção particu lar, crê-se que este efeito resulta de um desvio desejável num equilíbrio dinâmico da fibrinólise, induzido pelo activador de plasminogénio, e da agregação de plaquetas, induzido pelo acti vador de plasminogénio e por outros factores, incluindo o trom boxano.

Os agentes que inibem a agregação de plaquetas induzida por tromboxano incluem inibidores da tromboxano-sintsse e anta gonistas de receptores de tromboxano das plaquetas. A inibição de tromboxano-sintase tem também como resultado a formação do intermediário endoperóxido-tromboxano, PGl·^, que é libertado pelas plaquetas e que é convertido em prostaciclina pelas células endoteliais da parede do vaso sanguíneo. Sabe-se que a prostaciclina é um inibidor potente da agregação de plaquetas. No entanto crê-se que o intermediário endoperóxido também induz a agregação de plaquetas. Um inibidor de tromboxano-sintase reduzirá também a vasoconstrição.

Os inibidores de tromboxano-sintase incluem geralmente piridinas e piridinas substituídas e outros derivados de piridina; imidazolo e imidazolos substituídos na posição 1 e outros derivados de imidazolo; análogos de endoperóxido de prcs. taglandina; antagonistas de prostaglandina. Exemplos específicos incluem:

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-6ácido 3-(lH-imidazol-l-ilmetil)-2-metil-lH-indol-l-propanóico (UK 38.485) /Uderman et al., 3. Cárdia. Pharmacol, .6: 969 (1984)_/;

dazoxibeno /Smith et al., Eur. 3. Pharmacol♦ 112:161 (1985)_7;

OKY-1581 Smith et al., Prostaglandins 22 (3): 353 (1981)_7;

piridina e piridinas 3- e 4-substituídas /Tai et al., Arch. Biochem. Biophys. 203(2):758 (1980)_7;

ácido imadozo/l, 5-a__7piridina-5-hexanóico (CGS 13080) /~Ku et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(3):899(1983) 7?

ácido 3-metil-2-(3-piridil)-l-indoloctanóico (CGS 12970) /~Ambler et al. Br. 3. Pharmacol. 86:497 (1985)_7j furegrelato;

2-isopropil-3-nicotinilindolo; e imidazolo.

Os antagonistas de receptores de tromboxano incluem:

EP045 e EP092 / Armstrong et al., Br. 3, Pharmacol. 84: :595 (1985)_7’ ácido 4-/~2-(benzenossulfonamido)-etil_/fenoxiacético (BM 13.177) /Patscheke et al., Thromb. Res. 33:277 (1984); U.S. 4 443 WlJ', ácido 4-/~2-(fenilsulfonilamino)etil_7fenoxiacético (BM 13.505) /“Stegmeier et al., Proc. EDTA-ERA 22:1012 (1985) U.S. 4 258 058_7;

N, N'-/7-(3-clorobenzenoaminossulfonil)-l,2,3,4-tetra-hidro-isoquinolil_7dissulfonamida (SKF 88046) /”Weichman et al., Prostaglandins Leukotrienes Med 15:167(1984)

5029548 /”Ogletree et al., 3. Pharmacol. Exp. Ther. 234: :435 (1985)_7;

AH23848 /Brittain et al., Circ. 72:1208 (1985)_7;

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-713APA /~LeBreton et al., Proc. Natl. Açad. Sei. U.S.A 76:4097 (1979)_7 e,

0N03708 £Kutsura et al., Adv. Pros. Thromb. LK. Res. 11:351 (1983)_7.

método do presente invento compreende um agente que inibe a agregação de plaquetas induzida por tromboxano, como adjuvante da terapia trombolítica, para tratamento de um mamífero, especialmente o Homem, que dele necessite. As indicações para esta terapia incluem enfarte do miocárdio, trombose das veias profundas, embolia pulmonar, apoplexia e outras desordens relacionadas com enfarte. 0 inibidor da agregação de plaquetas induzida por tromboxano é administrado imediatamente antes, ao mesmo tempo ou imediatamente depois da administração parentéri ca de um activador de plasminogénio.

Os activadores de plasminogénio úteis incluem qualquer agente farmaceuticamente aceitável que active o plasminogénio, tal como estreptoquinase (SK), uroquinase (UK) e activador de tecido de plasminogénio (tPA), bem como fibrinolíticos afins tal como complexo activador de estreptoquinase de plasminogénio acilado, pró-uroquinase, uroquinase de cadeia simples (SCUPA), activadores de plasminogénio ligados a anticorpo e proteínas híbridas tPA-UK e outros trombolíticos da chamada terceira geração. Preferivelmente utiliza-se um activador de plasminogénio que tenha afinidade pela fibrina, que é o caso de UK e tPA. 0 tPA tem uma afinidade mais elevada pela fibrina do que a UK. 0 tPA é o activador de plasminogénio prefe rido para utilização neste invento.

activador de plasminogénio usado neste invento pode ser obtido por síntese ou pode ser obtido biologicamente a paje tir de cultura de tecidos, de células naturais (p.e. de células de melanoma de Bou/es para o tPA e de células Caiu para a UK) ou de cultura de células, leveduras e bactérias recombinajj tes ou por uma combinação de técnicas biológicas e sintéticas. 0 tPA inclui variantes de tPA que têm as funções de ligação à fibrina do tPA e actividade activadora de plasminogénio. Estas variantes incluem proteínas que diferem num ou em alguns amino

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-8ácidos, bem como variantes que têm padrão de glicosilação ou composição em hidrato de carbono diferentes ou a que faltam quaisquer grupos glicosilo. Ver p.e. Robinson, W084-01786 e Rosa et al., W086-01538. Estão também incluídas as fusões das funções de ligação à fibrina de tPA com outras funções pro. teases porquanto estas moléculas têm essencialmente as mesmas propriedades biológicas que o tPA. A ΞΚ é tipicamente prepara da por fermentação de Streptococci produtores de acordo com procedimentos conhecidos ou pode ser expressa em cultura de cé lulas recombinantes. Ver p.e. EP-A-151.337.

Para utilização no método do invento, o activador de plasminogénio pode ser formulado com ou sem o inibidor da agre gação de plaquetas induzida por tromboxano. 0 activador de plasminogénio é formulado de acordo com procedimentos conhecidos. Formulações de tPA úteis são referidas, por exemplo, no Pedido de Patente dos E.U.A. co-pendente n2. 890 432 que é aqui incorporado por referência. Formulações de UK úteis são referidas, por exemplo, na EP-A-92 182.

inibidor, isto é, o inibidor de tromboxano-sintase ou o antagonista de receptor de tromboxano das plaquetas é formula do para administração oral ou parentérica, p.e., intramuscular ou intravenosa e é administrado de forma a proporcionar uma quantidade que potencie a actividade trombolítica do activador de plasminogénio e que iniba a reoclusão. Esta quantidade ini be a agregação de plaquetas, induzida por tromboxano, no local da oclusão pelo menos durante o período de terapia trombolítica, sem causar efeitos secundários adversos significativos.

No caso de um inibidor de tromboxano-sintase a potenciação é reconhecida pelo aumento na velocidade de circulação nos vasos reperfusados quando comparada com a observada com apenas um activador de plasminogénio. No caso de um antagonista de receptor de tromboxano, a potenciação é reconhecida por um aumento na velocidade de reperfusão comparada com a observada com apenas um activador de plasminogénio, permitindo assim usar uma dose de activador de plasminogénio mais baixa por tratamento de paciente.

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-9Pode mostrar-se desejável continuar o tratamento com o inibidor para maximizar a inibição da reoclusão pás-terapia d_u rante até 72 horas. A terapia oral de manutenção pode ser con tinuada p.e. por seis meses. A formulação e administração do inibidor é determinada de acordo com protocolos para administração desses agentes sozinhos, isto é, que não estão em conjunção com a terapia trombolítica. A dose eficaz variará com a potência do inibidor e, em alguns casos, com a via de adminis tração. Por exemplo, CGS 13080 e CGS 12970 podem ser administrados oralmente ou parenteralmente em quantidades de 0,1 a 10 mg/kg, preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 3 mg/kg. 0 BM 13177 pode ser administrado oral ou parenteralmente a doses de 0,1 a 100 mg/kg preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg. Ver, p.e., Stegmeier et al., Thromb. Res. 35; 379(1984) e Gresele et al., Lancet, 5 de Maio, 1984, 991.

Os activadores de plasminogénio como tPA, SK e UK, quando usados sozinhos em terapia trombolítica, são administrados parentericamente, p.e., intra-arterialmente, intracoronariameji te, intramuscularmente ou, preferivelmente, intravenosamente. 0 tPA é tipicamente administrado por infusão intravenosamente, em quantidades de cerca de 80 a cerca de 150 mg por pacieri te durante um período de 0,25 a 6 horas. A SK pode ser administrada por infusão, intravenosamente, em quantidades de cer4 6 ca de 5 x 10 a 3 x 10 IU por paciente durante um período semelhante. A UK pode também ser administrada por infusão, intravenosamente, em quantidades de cerca de 40 a cerca de 100 mg por paciente durante um período semelhante. Os resultados gerados no desenvolvimento deste invento indicam que a quantidade de tPA eficaz para fazer a lise de um trombo, em terapia auxiliar com um inibidor de agregação de plaquetas induzida por tromboxano, é reduzida a pelo menos cerca de 1/2 até ao má ximo de cerca de 1/10 a 1/100 da dose eficaz de tPA na ausência de inibição de tromboxano-sintase. Assim, uma dose útil de tPA no método do invento é de cerca de 1 a cerca de 75 mg por paciente adulto, preferivelmente cerca de 2 a cerca de 30 mg por paciente adulto embora não se exclua a utilização de d_o ses mais elevadas tais como as empregues no caso do tPA sozi-

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-10nho, p.e. até 150 mg/kg. Também parece que o período de infusão pode ser reduzido a cerca de 5 minutos - 3 horas, preferivelmente, cerca de 15 a cerca de 40 minutos, embora também não seja de excluir o tempo normal de tratamento. Usando outros activadores de plasminogénio podem-se obter reduções semelhantes na dosagem e/ou tempo de infusão.

A composição farmacêutica do invento destina-se a co-administração adequada, ou seja, administração simultânea do inibidor e do activador de plasminogénio. Esta composição é uma formulação para administração parentérica que compreende uma quantidade de um inibidor de agregação de plaquetas induzida por tromboxano, eficaz para inibir essa agregação de plaquetas no local da oclusão, durante o período de terapia trombolítica e uma quantidade de activador de plasminogénio, eficaz para efectuar a lise duma oclusão trombótica alvo, bem como um diluente ou outro veículo adequado para administração pa, rentérica. Assim, uma formulação farmacêutica típica do invejn to pode compreender 1 a 3 mg de CGS 13080, ou 0,1 a 10 mg de BM 13.177 e 1 a 150 mg de tPA, 1 a 100 mg de UK ou 5 x 10⁴ a 3 x 10^ IU de SK, por unidade de dosagem numa solução isotónica aquosa, tamponada. Uma unidade de dosagem é a quantidade administrada a um paciente, p.e. 1 a 1000 ml, dependendo da concentração da droga e a duração da infusão. 0 activador de plasminogénio pode ser formulado com ou sem o inibidor. Por exemplo, o tPA pode ser formulado num tampão tal como acetato ou adipato de amónio ou sódio, a pH 3,5-5,5. Podem também adi cionar-se outros excipientes tais como, p.e., polivinilpirroli dona, gelatina, hidroxi-celulose, acácia, polietileno-glicol, manitol e cloreto de sódio. Esta composição pode ser liofilizada.

Para a administração adequada do inibidor e do activador de plasminogénio, ao mesmo tempo ou em tempos diferentes, prepara-se um conjunto compreendendo num recipiente único tal como uma caixa, caixa de cartão ou outro recipiente, garrafas, sacos, frascos ou outros recipientes individuais, contendo cada um,uma quantidade eficaz do inibidor, para administração oral ou parentérica, como se descreveu acima, e uma quantidade

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-11eficaz do activador de plasminogénio para administração parentérica, como se descreveu acima. Este conjunto pode compreender, por exemplo, os dois agentes farmacêuticos em recipientes separados, opcionalmente na forma de grânulos liofilizados e recipientes com soluções para reconstituição.

Quando ambos os agentes são fornecidos na forma de solução eles podem estar incorporados num sistema de infusão/inje£ ção para administração simultânea ou numa disposição em tandem, p.e., possuindo o inibidor da agregação de plaquetas numa forma injectável i.e. ligado em série, via tubagem, ao acti vador de plasminogénio num segundo saco de infusão. Usando es. te sistema, o paciente pode receber uma injecção inicial, do tipo bolo, do inibidor e em seguida uma infusão do activador de plasminogénio.

Os exemplos que se seguem demonstram a utilidade do inveri to e as vantagens do presente invento sobre as terapias trombo, líticas existentes. Os Exemplos são ilustrativos e não limitai tivos.

Exemplo 1

Anestesiaram-se coelhos brancos, machos, da Nova Zelândia, pesando 0,6 a 1,5 kg, com 35 mg/kg de pentobarbital de s_ó dio, através da veia periférica do ouvido. Manteve-se a temp£ ratura do corpo a 39,53C com um controlador electrónico da tem peratura (Yellouj Spring Thermistemp, Model 71A, Yellow Spring Instrument Co., Yellouj Springs, Ohio) acoplado a uma lâmpada incandescente, A carótida fci canulada para se registar a pressão arterial do sangue com um transductor (Stratham P50, Gould/Stratham, Hato Rey, Puerto Rico). Ao mesmo tempo que se registava a pressão, fez-se a infusão de uma solução de pentobarbital de sódio através dessa cânula, a uma velocidade de 6 mg/kg/h num volume de 0,6 ml/h. Esta infusão foi necessária para manter o nível anestético do coelho e para manter a potêri cia da cânula.

A artéria femoral direita foi isolada distalmente ao ligamento inguinal e traumatizada, distalmente à artéria circun

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flexa lateral, friccionando a artéria na mandíbula de um fórcipe . Colocou-se ums sonda electromagnética de fluxo (Carolina Medicai Electronics, King, North Carolina) na posição distai em relação à artéria circunflexa lateral para monitorizar a circulação sanguínea da artéria femoral. Canulou-se a artéria epigástrica superficial para indução de um trombo e subsequente infusão de agentes trombolíticos. Os trombos foram localizados distalmente à artéria circunflexa lateral com ansas distando umas das outras 10 mm e induzidos por injecção sequencial de 5 Unidades de trombina humana (5 ycl), 5 jul de CaCl₂ 0,5 M e 10 e 20yul de sangue arterial suficiente para distender a arté ria. Após 30 minutos libertaram-se as ansas e monitorizou-se a circulação durante 30 minutos para confirmar a obstrução total da circulação pelo trombo.

Administrou-se intravenosamente, via veia periférica do ouvido, heparina de sódio (300 Unidades/kg), 5 minutos antes do início de cada infusão de 30 mn com tPA, via artéria epigás. trica superior. 0 tPA foi dissolvido em tampão de acetato de amónio 0,1 M (pH 4) e diluído com solução salina a 0,9/ até ao volume apropriado. A velocidade da infusão local com tPA foi de 0,052 ml/mn. No final da infusão de 30 minutos com tPA administrou-se uma segunda dose de heparina (100 Unidades/kg). A seguir à administração de tPA monitorizou-se durante 60 mn a circulação sanguínea da artéria femoral para observar os efeitos residuais do regime de tratamento. No final do estudo, a artéria estava obliterada e o trombo foi excisado, corado e pesado.

tratamento: 1) con ι seis grupos de

2) tPA 0,01^Mg/kg/mn intra-aórtico

3) tPA 0,10 yUg/kg/mn i.a.,

4) t-PA 1,0 ytg/kg/ estudo consistiu em trolo com solução salina, (i.a.) durante 30 minutos, 3) tPA 0,10 ^ug/kg/mn i.a., durante 30 minutos, 4) t-PA 1,0 ytg/kg/mn i.a., durante 30 minutos, 5) CGS 13080 2,0 mg/kg intrav enosamente (i.v.) + tPA 0,01 yw/ /kg/mn i.a. durante 30 minutos e 6) CGS 13080 2,0 mg/kg i.v. + + tPA 0,10 y^g/kg/mn i.a. durante 30 minutos. Nos grupos 5 e 6, o CGS 13080 (2,0 mg/kg, i.v.) foi administrado duas vezes numa injecção de bolo, uma vez 5 minutos antes e depois do final de cada infusão de 30 minutos com tPA.

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Os resultados estio ilustrados nos Quadros 1-3 que se sje guem e nas Figuras 1-3. A signif icancia estatística (P <C,05) das diferenças entre tratamentos foi determinada por análise de variância de medições repetidas e do teste do t de Student.

de tPA no res. femoral do

A Fig. 1 ilustra o efeito da infusão local tabelecimento da circulação sanguínea na artéria coelho. As doses de tPA mais elevadas (0,1 e 1,0 jug/kg/mn) fo ram mais eficazes como trombolíticos do que a dose mais baixa (0,01 y^g/kg/mn), embora não exista uma diferença nítida entre as doses mais elevadas.

que se formaram antes do te entre estes grupos de tados. Ver Quadro 1 que do trombo. A incidência 33%, 75% e 83% para 0,01 2) téria femoral, a partir da Fig. dia era de 67 para uma dose baixa de tPA, média de tPA e de 270 para uma dose elevada de tPA (Quadro 2). Assim, 0,1 jug/kg/mn de tPA teve como resultado uma maior incidência de reperfusão e uma melhor circulação na artéria femoral z

quando comparada com a dose de 0,01 juug/kg/mn. E interessante o facto do peso do trombo determinado no final de cada experiAs circulações de controlo em repouso trombo não diferiram significativameri animais e quaisquer outros grupos tes. mostra a circulação sanguínea antes de reperfusão foi de, respectivamente, , u/o b μαία u, ux, 0,1 e 1,0 yxg/kg/mn de tPA (Ver Quadro Quando se calculou a área sob a curva da circulação da a_r 1, verificou-se que a área méde 284 para uma dose ência não diferir significativamente dos controlos com solução salina (Quadro 3).

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-14QUADRO 1

Circulação sanguínea em repouso da artéria fenoral(ml/mn)

0,01 mg/kg/mn de tPA	0,1 mg/kg/mn de tPA	1,0 mg/kg/mn de tPA	2,0 mg/kg de CGS + + 0,01 de tPA	2,0 mg/kg de CGS + + 0,1 de tPA	Solução salina
5,3	6,4	7,9	5,6	7,8	6,0
5,3	9,8	9,6	5,3	5,6	4,5
4,5	8,3	5,6	6	6,6	7,5
7,1	7,9	9,8	12,0	6,4	3,8
11,3	10,5	13,2	5,3	12,0	2,3
8,3	9,6	7,1
	9,5
	5,6

N	6	8	6	5	5	5
Média	7,0	8,5	8,9	6,8	7,7	4,8
(S.E.M.)	1,0	0,6	1,1	1,3	1,1	0,9

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-15Grupo

QUADRO 2

Incidência de Reperfusão e área sob a curva de circulação ^Femoral

0,01 mg/kg/mn de tPA

0,1 mg/kg/mn de tPA

1,0 mg/kg/mn de tPA mg/kg de CGS 13080 + 0,01 de tPA mg/kg de CGS 13080 + 0,1 de tPA

Solução

Saline

No. Reperfusado/ %

No. Testado

2/633

6/875

5/683

4/580

5/5100

0/50

Area média sob a curva de circulação femoral

66,8 (42,2)

283.8 (111,2)

270,4 (109,7)

185,3 (56,0)

558.9 (120,1)*'**

0,0 (0,0) * p < 0,05 vs. 0,01 de tPA ** p <0,05 vs. CGS 13080 + 0,01 de tPA

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-16qUADRO 3

Pesos dos trombos (mg)

	0,01 mg/kg/mn de tPA	0,1 mg/kg/mn de tPA	1,0 mg/kg/mn de tPA	2,0 mg/kg de CGS + .+ 0,01 de tPA	2,0 mg/kg de CGS + + 0,1 de tPA	Solução salina
	2,7	4,5	5,8	4,8	1,9	6,6
	2,4	3,3	5,6	0,5	5,1	8,4
	4,4	2,7	-	0,0	6,0	11,4
	5,3	10,8	3,0	5,4	1,5	2,5
	14,6	4,7	4,1	0,3	8,3	9,2
	2,5	4,9	3,4
		7,7
		9,5
N	6	8	6	5	5	5
Média	5,3	6,0	4,4	Z j Z	4,6	7,6
(S.E.M.)	1,9	1,1	0,6	1,2	1,3	1,5

p <0,05 vs. solução salina

KX p <0,05 vs. 0,1 de tPA

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efeito do pré-tratamento com o inibidor de tromboxano-sintase, CGS 13080, na eficácia trombolítica de tPA é demonstrada na Figura 2. 0 tPA, em ambas as doses testadas, foi muito mais eficaz no restabelecimento da circulação sanguínea na artéria femoral na presença de CGS 13080 do que o tinha sido na ausência da inibição de tromboxano-sintase. Não só foi mai. or o nível de restabelecimento da circulação sanguínea na arté ria femoral nos grupos pré-tratados com CGS 13080 como foi tam bém maior a incidência de reperfusão (Quadro 2) e o tempo de reperfusão (Fig. 2).

sou 2 de 6 animais enquanto que na presença de CGS 13080, 4 de animais foram reperfusados. De igual modo, o tPA a dose média (0,1 j^g/kg/mn) teve como resultado 6 de 8 reperfusães sem inibição de tromboxano-sintase e 5 de 5 com pré-tratamento com

CGS 13080. A inspecção da área sob a curva da circulação da artéria femoral (Quadro 2) indica também uma maior eficácia de tPA na presença de CGS 13080. 0 peso do trombo na presença de CGS 13080 te^e tendência a ser menor mas não diferiu significa tivamente do/tratamento só com tPA (Quadro 3).

Os resultados indicam que o tPA é um agente trombolítico mais eficaz na presença de inibição de tromboxano-sintase. De facto, na presença de CGS 13080, são necessárias doses de tPA muito mais pequenas para produzir um efeito semelhante ao conseguido apenas com tPA. Este ponto é ilustrado na Fig. 3, na qual a circulação sanguínea média na artéria femoral, como pej? centagem de controlo, é representada para tPA a 1,0 jug/kg/mn em contraposição com tPA a 0,01 e 0,10 jug/kg/mn na presença de CGS 13080. Estes valores indicam que

J^g/kg/mn, na presença de um inibidor de tromboxano-sintase muito mais eficaz no restabelecimento do que o tPA sozinho a 1,0 y^g/kg/mn. jlg/kg/mn, ao do tPA a 1,0 yig/kg/mn. cia de uma sinergia de 10 de tromboxano-sintase com da

De o tPA a uma dose de 0,10 , é circulação sanguínea facto, o tPA a 0,01 na presença de CGS 13080 tem um efeito comparável

Estes resultados indicam a existêna 100 vezes entre o tPA e a inibição base no restabelecimento da circulação sanguínea da artéria femoral.

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-18Esta é uma importante descoberta porque se podem utilizar doses de tPA mais baixas em combinação com um inibidor da agre gação de plaquetas, induzida por tromboxano, para conseguir o ponto final trombolítico que anteriormente necessitava de doses de tPA muito superiores. Baixar a dose trombolítica eficaz de tPA é clinicamente importante por se evitarem efeitos moderados de hemorragia sistémica que foram observados em paci. entes com regimes de dose de tPA mais elevada. Para além do problema da hemorragia sistémica, as doses de tPA mais baixas visto qu.e são desejâveis/as necessidades que este material tem de outro composto, podem agora ser drasticamente reduzidas. Mais ainda, a inibição da agregação de plaquetas reduz a incidência de reoclusão.

Exemplo 2

Anestesiaram-se com pentobarbital de sódio (30 mg/kg i.

v.) vinte e quatro cães híbridos de ambos os sexos (9 a 18 kg), intubaram-se e ventilaram-se com ar corrente ambiente de 20 ml/ /kg e a uma frequência de 12 insuflações/mn (respirador Harvard, Aparelho Harvard, S. Natick, Massachusetts). Expôs-se a artéria e a veia femorais e inseriu-se catéteres para respecti vamente monitorizar a pressão sanguínea arterial (transductor de pressão Stratham P23 ID) e para administração das drogas. A veia jugular externa esquerda e a veia safena esquerda foram também expostas e inseriram-se catéteres para respectivamente infusão contínua de 5/> de dextrose em solução salina e infusão de drogas. Realizou-se uma toracotomia esquerda no quinto espaço intercostal e suspendeu-se o coração num suporte pericárdico. Isolou-se uma secção de 20 mm da artéria circunflexa co ronária esquerda proximal ao primeiro ramo periférico obtuso e instrumentou-se da posição proximal para a distai como se segue: sonda electromagnética de circulação (Modelo 501, Caroli. na Medicai Electronics, Inc., King, North Carolina), eléctrodo de estimulação, oclusor mecânico ajustâvel (Goldblatt et al., 3. Exp. Med. 59:347 (1934)) e uma ansa de seda. 0 eléctrodo de estimulação foi construído a partir de uma ponta de agulha hipodérmica 26 gauge ligada a um arame de cobre revestido a

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-19prata isolado com fluropolímero de TEFLON 30 gauge. 0 oclusor mecânico foi construído em aço inoxidável com um parafuso de aço inoxidável (diâmetro de 2 mm) que pode ser manipulado para controlar a circunferência do vaso. 0 oclusor foi ajustado pja ra eliminar a resposta hiperémica reactiva sem afectar a circu lação sanguínea coronária em repouso.

Obtiveram-se registos contínuos de pressão sanguínea e de circulação sanguínea média e fásica na artéria circunflexa coronária esquerda num polígrafo modelo 70 (Grass Instruments Co., Quincy, Massachusetts). Determinou-se a circulação zero e as circulações hiperémicas ocluindo a artéria circunflexa co ronária na posição distai em relação à sonda de circulação, du rante 20 segundos. Trinta minutos depois da preparação cirúrgica iniciou-se uma estimulação de corrente directa anódica contínua de 150^A e manteve esta até que a circulação sanguínea da artéria circunflexa coronária esquerda (LCX) diminuisse e se mantivesse a 0 ml/minuto durante 30 minutos.

A estimulação eléctrica directa foi aplicada com uma uni. dade de corrente constante Grass (Modelo CCUIA), uma unidade de isolamento de estímulo Grass (Modelo S1U5B) e um estimular Grass (Modelo 548) ao eléctrodo da artéria coronária intralumi nal (Grass). Administrou-se heparina de sódio, 300 U/kg, i.v., trinta minutos depois da oclusão de LCX, e em seguida de hora a hora 100 U/kg, i.v.. Os cães foram distribuídos aleatoriamente a um dos dois grupos. No Grupo I administrou-se placebo para BM 13177 durante 120 minutos, 45 minutos após a oclusão de LCX. Os animais do Grupo II receberam BM 13177 numa dose de 10 mg/kg i.v. sob a forma de bolo, 45 minutos após a oclusão de LCX e em seguida 10 mg/kg/mn i.v. durante 120 minutos. Quinze minutos após a administração do veículo ou da drooa aca , tiva fez-se/infusão de tPA (de células recombinantes de ovário de hamster chinês) a 10 y^g/kg/mn, i.v., durante até 90 minutos, se for necessário para conseguir a reperfusão. Em ambos os Grupos I e II, deixou-se a infusão de tPA prosseguir durante pelo menos 30 mn, independentemente da reperfusão. Se a repej? fusão ocorreu antes de 30 mn, a infusão foi terminada aos 30

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-20inn enquanto que quando a reperfusão ocorreu para além dos 30 mn, a infusão terminou nesse ponto. A reperfusão foi avaliada em termos de pelo menos um retorno de 50% da circulação sanguí nea coronária comparada com a circulação sanguínea coronária do controlo. Além disto, teve que se manter este nível de cir culação sanguínea durante pelo menos 5 mn antes do final da in fusão com tPA,

Depois da estimulação eléctrica do eléctrodo da circunflexa coronária ocorreu a oclusão completa a 37 + 4 mn para o Grupo I e a 32 + 6 mn para o Grupo II (Quadro 4). Assim, os animais do Grupo I e do Grupo II não diferiram em peso corporal, na circulação sanguínea coronária em repouso ou no tempo de oclusão trombótica induzido electricamente.

A trombólise coronária induzida por tPA foi conseguida a uma dose de 10 j^cg/kg/mn, i.v., em todos os 26 animais estudados de ambos os Grupos I e II. No entanto, o tempo de trombólise diferiu muitíssimo entre os animais do Grupo I e os do Grupo II (Quadro 4). A reperfusão no Grupo I ocorreu aos 32 +_ 6 mn enquanto que a reperfusão no Grupo II ocorreu aos 11 +_ mn (p <0,05). Assim, a administração de BM 13177 a uma dose, em bolo, de 10 mg/kg seguida da infusão de 10 mg/kg/h, 15 mn antes da administração de tPA, teve como resultado um tempo de restabelecimento da circulação sanguínea coronária significati vamente mais pequeno.

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3UADR0 4

Características do fluxo da circulação sanguínea coroná. ria em resposta a trombose, trombólise e retrombosewcão

Grupo I Grupo II (n=15) (n=ll)

T empo	de	oclusão (mn)	37+4	32 .
T empo	de	reperfusão (mn)	32+6	11 .
T empo	de	reoclusão (mn)	39 +. 12	35 .
Número	reocludido	12/15	1/9

p <0,05 vs. controlo

Reoclusão definida como fluxc de circulação sanguínea coroná ria nulo após tPA de natureza permanente ou não permanente.

Nos valores de reoclusão são apenas incluídos 9 cães uma vez que 2 dos 11 cães sofreram fibrilhação a 27 e 30 mn depois da trombólise e foram excluídos.

Depois do final da infusão de tPA, ocorreu reoclusão em 12 dos 15 animais do Grupo I (80$) e em apenas 1 dos 9 animais (Grupo II) (11$). Dois dos animais do Grupo II foram excluídos dos valores de reoclusão porque fibrilharam 27 e 30 mn depois do final da infusão de tPA. No entanto, estes animais tinham circulações sanguíneas coronárias de respectivamente 10 e 12 ml/mn, imediatamente antes de fibrilharem mas sofriam de grave arritmia de reperfusão induzida por tPA. A reoclusão foi detej? minada em termos de circulação sanguínea nula depois do final da infusão de tPA de natureza permanente ou não permanente. A maioria dos animais que tiveram reoclusão, exibiu variaçães cíclicas na circulação sanguínea coronária depois de tPA, de tal modo que ao longo do período de observação de 2 horas, de66 742

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-22pois do final de tPA, a circulação chegou ao zero e em seguida se restabeleceu espontaneamente. A oclusão completa permanente ocorreu em apenas 2 dos 12 cães do Grupo I e em 1 de 9 do Grupo II. 0 tempo para o primeiro zero oclusivo depois de tPA foi de 39 +_ 12 mn no Grupo I e de 35 _+ 0 mn no Grupo II (Quadro 4).

A circulação sanguínea coronária de controlo foi semelhante nos dois grupos. A circulação sanguínea coronária com reperfusão foi superior para o Grupo II embora não fosse signi ficativamente diferente da do Grupo I. No entanto, a circulação sanguínea coronária determinada no final da experiência era significativamente maior para os animais do Grupo II, em relação aos do Grupo I (p <0,05).

Exemplo 3

Retirou-se sangue da artéria carótida de um cão com uma seringa de plástico contendo uma parte de citrato trissódico a 3,8$ para nove partes de sangue. Por centrifugação desta mis. tura, a 200xg durante 10 mn e à temperatura ambiente, obteve-se plasma rico em plaquetas (PRP). Ajustou-se a contagem de plaquetas a 300 000/mm\ Todos os estudos de agregação foram realizados num agregómetro Chrono-Log (Chrono-Log Corporation, Havertown, Pennsylvania) usando 0,3 ml de PRP numa cuvette si. liconizada, agitada a 1100 rpm. Pré-aqueceu-se o PRP durante dois minutos a 3750 antes da adição do agonista. Adicionaram-se à cuvette agonistas com diferentes concentrações molares e mediu-se a variação da transmissão de luz até ao momento em que o traçado alcançou um patamar. A função de plaquetas foi determinada no PRP via agregometria de transmissão de luz depois de i.v. BM 13177 e foi comparada com a de preparações PAP sem BM 13177.

Os agonistas foram especificamente U-46619 (Upjohn Diagnostics, Kalamazoo, Michigan) (1,0 jllM) e colagénio (Hormon-Chemie, Munique, República Federal da Alemanha), (5,0jug/ml). Adicionaram-se estes agonistas às preparações de PRP de teste 5 mn e 2 h depois do tratamento com BM 13177.

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-230 BM 13177 (10 mg/kg mais 10 mg/kg/h) inibiu completameri te tanto a agregação induzida com U-46619 como a induzida com colagénio, 30 mn e 2 h depois da administração inicial.

Os exemplos 2 e 3 demonstram assim que a terapia trombolítica empregando um activador de plasminogénio e um antagonis. ta do receptor de tromboxano produz fibrinólise e reperfusão mais rápidas do que essa terapia usando apenas um activador de plasminogénio.

A descrição anterior descreve completamente a realização e utilização do invento incluindo as suas concretizações prefe ridas. No entanto, o invento não está limitado às concretizações precisas descritas aqui, mas pelo contrário, engloba todas as modificações no âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims

1 - Processo para a preparação de uma composição trombolítica que se destina a ser administrada parenteralmente para efectuar a trombólise e reperfusão de uma oclusão trombótica num mamífero, processo esse que compreende adicionar um activa. dor de plasminogénio, numa quantidade eficaz para efectuar a lise do coágulo, a um inibidor da agregação plaquetária induzi da por tromboxano, numa quantidade eficaz para inibir a reoclu são.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o inibidor ser um inibidor de tromboxano sintetase ou um antagonista do receptor de tromboxano.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o activador de plasminogánio ter afinidade pela fibri. na.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o activador de plasminogênio ser tPA, UK ou SK (activador do tecido de plasminogánio, uroquinase ou estreptoquinase).

5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o inibidor ser CGS 13080.

6 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri. zado por o inibidor ser BM 13177 ou BM 13505.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o activador de plasminogénio ser tPA ou UK.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri zado por o activador de plasminogénio ser tPA ou UK.

9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o activador de plasminogénio ser tPA, numa quantidade eficaz para efectuar a reperfusão do vaso ocluso e por o inibi.

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-25dor ser um inibidor da tromboxano sintetase, numa quantidade eficaz para inibir a reoclusão que se segue à reperfusão.

10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o activador de plasminogénio ser tPA, numa quantidade eficaz para efectuar a reperfusão do vaso ocluso e por o inibidor ser um antagonista do receptor de tromboxano, numa quantidade eficaz para inibir a reoclusão que se segue à reperfusão.

11 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a composição compreender 0,1 a 10 mg de CGS 13080 ela 150 mg de tPA por unidade de dosagem.

12 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a composição compreender 0,1 a 100 mg de BM 13177 ela 150 mg de tPA por unidade de dosagem.