PT85526B - Processo para a preparacao de marcadores corados para plasmideos para estreptomicetes - Google Patents

Description

Até agora conhecia-se como marcador corado pa ra a clonagem em estreptomicetes o gene mel (e. Katz et el.,

J. Gen. Microbiol. 129 (1983) 2703)), o qual codifica para a tirosinase e deste modo é responsável — através de fases intermediárias _ pela produção do corante melanina. Este gene está contido por exemplo no plasmídeo comercial pIJ7O2 que po de ser obtido da John Innes Foudation, Norwich, Inglaterra, e se encontra descrito por exemplo por D. A. Hopwood et al. em Genetic Manipulation of Streptomyces — A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, 1985, pág. 292 f. Este marcador tem, no entanto, o inconveniente de que o corante formado se difunde facilmente no meio circundante.

Descobriu-se agora um marcador corado que se

- 1 expressa em estreptomicetes e que provoca no meio uma coloração intensa de azul escura a negra, a qual no entanto apenas apresenta uma difusão reduzida em meios sólidos. Deste modo é possível reconhecer facilmente mesmo ocorrências muito raras em preparações em que seja usado como marcador de inactivação.

A presente invenção refere-se portanto a um processo para a preparação de um gene que codifica para um co rante azul em estreptomicetes caracterizado por se cortar com BamHI o DNA completo de Streptomyces coelicolor DSM 3030, se isolar um fragmento de cerca de 5»5 kb de dimensão e se selec cionar em relação a produção de corante. Este gene encontra-se caracterizado mais exactamente no mapa de restrição da Fd. gura 1. A estirpe de partida S. coelicolor DSM 3030 é conheci da a partir do pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 181 562 como produtor de uma enzima lisogénica de bactérias.

gene obtido pelo processo da presente inven ção é útil como marcador, especialmente como marcador de inactivação em plasmídeos de estreptomicetes.

Na descrição que se segue bem como nas reivin dicações são apresentados aspectos adicionais da presente invenção no seu modo de concretização preferido.

A fim de isolar o gene marcador isola-se o ADN integral a partir da estirpe Streptomyces coelicolor DSM 3030 por corte com a enzima de restrição BamHI e por clonagem por shot gun num vector apropriado, transformação de uma estirpe destinatária de estreptomicetes e selecção em relaçãoàpro dução de corante. Os clones positivos contêm um fragmento de ADN de cerca de 5»5 kb a partir da estirpe DSM 3030· corante azul formado é insolúvel em água_ao contrário do corante solúvel em água formado pelo tipo selva•| gem — mas é facilmente dispersável em água. A Figura 2 mostra • i •'o «spectro de absorção de UV de um sobrenadante aquoso duma cultura. 0 máximo de absorção situa-se a 660 nm e o mínimo a 46o nm. A característica morfológica que consiste na coloração quase negra resulta de uma alta concentração do corante. Num meio sólido a maior parte do corante fica ligada ao micélio e só uma fracção reduzida se difunde no meio. Ao microscó pio observa-se um quadro característicoi o corante situa-se em particulas esféricas aglomeradas em conjuntos densamente acumulados no micélio e deste modo as colónias tomam um aspec to quase negro. Em cultura líquida (meio de soja de tripsina, meio lisogénico A, pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 158 872, pág. 6) obt ém-se após cerca de 3 dias um sobrenadante da cultura córado de azul intenso. Também em meio sólido, a produção de córante tem lugar independentemente do meio utilizado (R2YE (Hopwood et al. op. cit.), meio de esporulação, (publicação de pedido de Patente Alemã 3 33186¾ Exemplo 1, terceiro meio), Penassay com adição de antibióti cos). 0 corante azul forma-se logo no início do crescimento das colónias e portanto torna-se evidente que não se trata de um produto do metabolismo secundário.

fragmento de 5,5 kb de acordo com a Figurai apresenta uma série de sítios de corte que são apropriados pa ra experiências de sub-clonagem. Este fragmento não contém qualquer sítio de corte para as enzimas Bcll, BglII, HindIII, Hpal, EcoRI, EcoRV e Ciai e contém mais de 4 sítios de corte para SstII e PvuII.

Todas as espécies de estreptomicetes até agora investigadas são apropriadas como estirpes hospedeiras para as experiências de clonagem, podendo no entanto verificar-se variações da quantidade do corante produzido não só de es pécie para espécie mas também de estirpe para estirpe. Em vir tude da intensidade da coloração o sistema de marcação dcaoor do com a presente invenção é òptimamente apropriado também pa ra as estirpes que apresentam uma expressão reduzida.

Através das vantagens indicadas, o marcador obtido de acordo com o processo da presente invenção é apropriado não apenas em geral para experiências de clonagem mas também em especial para traçagem das vias metabólicas em estreptomicetes, os quais são, como se sabe, importantes produtores de antibióticos e também de outros peodutos do metabolismo .

Nos exempos que se seguem elucida-se a presen invenção em mais pormenor. Os dados em percentagem e as propor ções referem-se a peso sempre que nada em contrário for indicado .

As figuras estão à escala, com excepção da re gião dos ligantes poliméricos.

Exemplo 1: Preparação do vector pGM4

A partir do plasmídeo pGMl (Pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 158 872, Figura 2) obtém-se por digestão parcial com SstII um fragmento de 3,0 kb. A partir do plasmídeo pSLEló (Pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 158 201, Figura 18) obtém-se por cor te com SstII o fragmento de 1 kb que contém o gene aphl de re sistência à neomicina. Por ligação dos dois fragmentos obtém-se o plasmídeo pGM3 (Figura 3)·

A partir do plasmídeo pSLE41 (EP-A2 0 158 201, Fig. 2θ) isola-se ainda por corte com Bcll um fragmento de 1 kb cujas extremidades salientes são preenchidas com polímerase de Klenow.

Corta-se então o plasmídeo pGM3 com PvuII e elimina-se o fragmento de 0,3 kb. Liga-se em seguida o plasmí deo restante com o fragmento proveniente do corte com Bcll a que se preencheram as extremidades, obtendo-se deste modo o plasmídeo pGM4 (Figura 4).

Exemplo 2: Preparação dum banco de genes

Lisa-se S. coelicolor DSM 3030 e isola-se o ADN do modo conhecido. Digere-se integralmente com BamHIo ADN isolado. Corta-se o plasmídeo pGM4 (Figura 4) com BamHI, trata-se com fosfatase alcalina e liga-se com o fragmento proveniente do corte com BamHI. Transforma-se a população de plasmídeos assim obtida na estirpe receptora S, lividans TK (obte nível na John Innes Fbuadation). Por acção de 1 pg de mistura de ligação obtém-se cerca de 20 000 transformantes resistentes à tiostreptona, dos quais 80% são sensíveis à neomicina e por conseguinte contém uma inserção.

Exemplo 3* Isolamento do gene de marcação

Separaram-se as colónias tranaíbrmantes coradas de azul-negro intenso e isolou-se o ADN dos plasmideos destes clones. Uma retransformação efectuada em seguida em S. lividans TK 23 deu origem apenas a colónias coradas de azul-negro.

Por meio duma caracterização do ADN do plasmí deo verificou-se que um fragmento de 5»5 kb proveniente de tratamento por BamHI, que é caracterizado através da Figura 1, estava inserido no gene aphl do plasmídeo pGM4. Este plasmídeo recebeu a designação de pGM98.

Exemplo 4: Transformação de outras esécies de estreptomicetes

Transformou-se o plasmídeo pGM98 em diferentes estirpes de S. prasinus (DSM 40099MeS. viridochromogenes (DSM 40736 = DSM 4112) e de S, ghanaensis (DSM 2932, ATCC 14672).

Em todas as estirpes foi possível observar uma formação de còrante, a qual, no entanto, era um pouco mais reduzida em S. prasinus do que em S. lividans, mas um pouco mais intensa que em S. ghanaensis. Em nenhum caso se observou perda de plasmideos.

Transformou-se o plasmídeo pGM98 também em S. coelicolor DSM 3030. Neste caso desencadeou-se imediatamente a formação do corante, enquanto que na estirpe de partida (ti po selvagem) aquela só se observou após três dias. Além disso também teve lugar a produção de corante em meios nos quais o tipo selvagem não dera lugar à formação de qualquer cor.

Processo para a preparação de um gene que codifica para um corante azul em estreptomicetes caraeterizado por se cortar com BamHI o color DSM 3θ3θ, se clònar dimensão e se seleccionar

DNA completo um fragmento em relação à de Streptomyces coelide cerca de 5»5 kb de produção de corante.

Claims (1)

1. Processo de acordo com a reivindicação 1, racterizado por se clonar o fragmento definido pelo mapa restrição de acordo com a figura seguinte:

   cade

   PstI

   BamHI

   PstI

   Xhol SstI

   Ss Sall.

   PstI

   Sall BamHI

   0 1

   FIG.1

   XI

   5 kb

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em