JPS6349086A - ストレプトミセテスプラスミドでの色素マ−カ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子ｍｅｌは、チロシナーゼをコードし、したがって
中間産物を経て着色物質メラニン産生の要因となるので
、現在は、ストレプトミセスでのクローニングのための
色素（ｃｏｆｏｒ）マーカーとして知られている（Ｅ、
ＫａＬｚ　ｅＬ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉ２９：２７０３．１９８３　）
　、この遺伝子は、例えばＪｏｈｎ　　Ｉｎｎｅｓ　　
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　）から得られる市販のプラスミドｐｌＪ７０２に
も含まれており、それについての記載は例えば″Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｔｒｅ
ｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ　’　　（Ｄ、Ａ、ＩＩｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ　
ａｌ、、ＴｈｅＪｏｈｎ　１ａｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔ
ｉｏｎ、１９８５）の２９２ページ以下にみられる。し
かしながら、このマーカーは、産生された着色物質が周
囲の培地に拡散してしまうという欠点がある。

ストレブトミセテスで発現し、培地中に濃厚な深青色又
は黒色の着色を生じ、しかも固形培地に於ては殆んど拡
散しない色素マーカーか見出された。このマーカーをイ
ンアクチベーションマーカーとして使用すれば、きわめ
て低頻度で生じる事象についても検出が可能となる。

本発明は、ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏａ＋ｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ）　Ｄ　Ｓ
　Ｍ　３０３０の全ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、約５
．５ｋｂの大きさのフラグメントを分離、着色物質産生
について選別して得られる、ストレブトミセテスの青色
着色物質をコードする遺伝子に関するものである。

この遺伝子は、第１図に示した制限地図により詳細に特
徴づけられている。出発株のストレプトミセス・ケリカ
ラーＤＳＭ３０３０は、ヨーロッパ特許出願公開第０１
８１５６２号明細書中にバクテリア溶解酵素産生菌とし
て述べられている。

本発明は、さらに、ストレプトミセテスプラスミドのマ
ーカーとして、特にインアクチベーションマーカーとし
て、本発明に従ってこの遺伝子を使用することに関する
ものである。

本発明のさらに詳細な様相及び好ましい具体例は、以下
の記述及び本特許請求の範囲から明らかである。

マーカー遺伝子を分離するために、ストレプトミセスφ
ケリカラーＤＳＭ３０３０の全ＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで切断して分離し、適切なベクターでショットガン
・クローニングを行ない、ストレブトミセテスの当該ベ
クター受容法を形質転換し、着色物質の産生について選
別を行なう。

陽性クローンは、ＤＳＭ３０３０からのおよそ５．５ｋ
ｂの大きさのＤＮＡフラグメントを含む。

野性法でつくられる水溶性染色物質とくらべて、本発明
によってつくられる青色着色物質は水に不溶で、しかも
水中に容易に拡散しうる。第２図は、水性培養上清のＵ
Ｖ吸収スペクトラムを示す。最大吸収は６６０ｎｍにあ
り最少吸収は４６０ｎｍにある。コロニーは、着色物質
の濃度が高いので殆んど黒色にみえる。固形培地では大
部分の；色物質は菌糸体に結合したままであり、はんの
わずかが培地中に拡散する。顕微鏡下での様相は特徴的
である。すなわち、着色物質は菌糸体上のしっかりと包
みこまれた球状体に存在し、その結果コロニーは殆んど
黒色にみえる。液体培地では（トリプシン分解大豆ブロ
ース、“Ｌｙｓｉｓ　、１ｅｄｌｕ■Ａ”、ヨーロッパ
特許出願公開第０１５８８７２号明細書、第６ページ）
、深青色の培養上清はおよそ３目後にえられる。固形培
地でも又、芒色物質の産生は使用培地にかかわりなく生
じる。（“Ｒ２ＹＥ”（ｉｌｏｐｗｏｏｄ　ｃｔ　ａｌ
、、上掲書）、胞子形成培地（ドイツ公開公報第３３３
１８６０号明細書、例１、第３培地）、“Ｐｃｎａｓｓ
ａｙ”　、抗生物質添加”　Ｐｃｎ−ａｓｓａｙ”）。

青色着色物質はコロニー発育の開始時点に於てすら形成
されるので、二次代謝産物でないことは明白である。

第１図に示されているこの５．５ｋｂフラグメントは、
サブクローニングに適切な多くの切断部位をＨする。こ
のフラグメントは、制限酵素Ｂｃｌ’ｌＳＢｇｌＩＩ、
Ｈｉｎｄｍ、Ｈｐａｌ。

ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ及びＣ１ａｌについては切断部
位をもたず、Ｓｓ　ｔＩＩ及びＰｖｕＩ［については４
ケ所より多い切断部位をもつ。

クローニング実験のための適切な宿主株は、すべてのこ
れまで検討されたストレブトミセテスの種のものである
。もっとも、産生される着色物質の量は種の違いによっ
てだけでなく、株の違いによっても変化する。しかしな
がら、着色が濃厚であることから、本発明によるこのマ
ーカー系は、発現のより少ない株に於ても非常に適して
いる。

上に述べた利点により、本発明のマーカーは一般的にク
ローニング実験のためだけでなく、特にストレブトミセ
テス（これは、他の代謝産物と同様に抗生物質の重要な
産生菌であることが知られているものである）に於る代
謝経路を追跡するためにも適切である。

本発明は、下記の実験例に於て詳細に説明されている。

特に記載がなければ、これらの実験では、百分率及び割
合は重量によるものである。

図は、ポリリンカー領域をのぞいて実際の大きさを示し
ている。

例１：ベクターｐＧＭ４の調製 プラスミドｐＧＭ１（ヨーロッパ特許出願公開第０１５
８８７２号明細書中の第２図）をＳｓｔ■で部分消化し
て、３．Ｏｋｂ大のフラグメントを得る。プラスミドｐ
ｓＬＥ１６　（ヨーロッパ特許出願公開第０１５８２０
１号明細書中の第１８図）をＳｓ　ｔＩＩで切断して、
ネオマイシン耐性遺伝子ａｐｈｌを含んでいるｌｋｂの
フラグメントを得る。この２つのフラグメントの連結に
より、プラスミドｐＧＭ３　（第３図）ができる。

さらに、ｐｓＬＥ４１　（、ヨーロッパ特許出願第Ａ２
　０１５８２０１号明細書の第２０図）をＢｃｌＩで切
断して、ｌｋｂフラグメントを分離する。このフラグメ
ントの突出末端は、クレノウボリメラーゼで埋填する。

ｐ　Ｇ　Ｍ　３を今度はｐｖｕＩＩで切断して、０．３
ｋｂフラグメントを除く。残存のプラスミドを、平滑末
端としておいたＢｃｌｌフラグメントと連結して、プラ
スミドｐＧＭ４　（第４図）を生成させる。

例２：ジーンバンクの調製 ストレプトミセス・ケリカラーＤＳＭ３０３０を溶菌し
、既知方法でＤＮＡを分離する。このＤＮＡをＢａｍＨ
Ｉで完全に消化する。プラスミドｐＧＭ４（第４図）を
ＢａｍＨＩで切断し、アルカリフォスファターゼで処理
し、上記のＢａｍＨＩフラグメントと連結する。この方
法で得られるプラスミドの集団で受容菌株ストレプトミ
セスψリビダンスＴ　Ｋ　２　Ｂ　（Ｊｏｔｌｎ　Ｉｎ
ｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎより得ることができる）
を形質転換する。上記の連結混合物１μｇを使用したと
き、およそ２００００個のチオストレプトン耐性形質転
換細胞が得られる。そのうちの８０％がネオマイシンに
感受性があり、従って挿入部を含んでいる。

例３：マーカー遺伝子の分離 濃厚な青黒色の形質転換細胞コロニーを分離して、これ
らのクローンからプラスミドＤＮＡを分離した。続いて
、ストレプトミセス−リビダンスＴＫ２３を再びこのＤ
ＮＡで形質転換すると、青黒色のコロニーのみが生じた
。

このプラスミドＤＮＡの特徴をしらべると、５．５ｋｂ
のＢａｍＨＩフラグメント（この特徴は第１図に示され
ている）が、ｐＧＭ４のａｐｈＩ遺伝子中に挿入されて
いた。このプラスミドを、ｐＧＭ９８と呼んだ。

例４：他のストレプトミセス種の形質転換プラスミドｐ
ＧＭ９８は、Ｓ、ｐｒａｓｉｎｕｓ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ４０
０９９　）　、Ｓ、ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｃｎｅ
ｓ　　（Ｄ　Ｓ　Ｍ４０７３６−ＤＳＭ４１１２）及び
Ｓ、ｇｈａｎａｃｎｓｉｓ（ＤＳＭ２９３２、ＡＴＣＣ
１４６７２）の様々の株を形質転換した。着色物質の形
成は、すべての株でみとめられた。しかしこの石仏物質
形成は、ｓ、ｐｒａｓ＋ｎｕｓに於てＳ、　Ｉ　１ｖｉ
ｄａｎｓに於けるよりもいくタナなく　、Ｓ、ｇｈａｎ
ａｃｎｓｉｓよりもいく分強かった。

いずれの場合に於ても、プラスミドの損失はみとめられ
なかった。

プラスミドｐＧＭ９８は又Ｓ、ｃｏｅｌ　［ｃｏｌｏｒ
Ｄ　Ｓ　Ｍ３０３０を形質転換した。この場合、着色物
質の形成は直ちに開始した。一方、最初の株（野性株）
に於ては、三日経過以前には着色物質の形成はみとめら
れない。さらに、着色物質の産生は培地上にも生じるが
、野性株では培地上には青色着色物質は生じない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による遺伝子の制限地図である。 第２図は、水性培養上清のＵＶ吸収スペクトラムを示す
図である。 第３図は、プラスミドｐＧＭ３の制限地図である。 第４図は、プラスミドｐＧＭ４の制限地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｒｅｐ−ｔｏ
   ｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ＤＳＭ３０３０の全
   ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、約５．５ｋｂの大きさの
   フラグメントをクローニングし、着色物質産生について
   選別を行なって得られる、ストレプトミセテスの青色着
   色物質をコードする遺伝子。 ２、第１図に示した制限地図であらわされる、特許請求
   の範囲第１項に記載した遺伝子。 ３、特許請求の範囲第１項または第２項に記載した遺伝
   子のストレプトミセテスプラスミドのマーカーとしての
   使用。 ４、特許請求の範囲第１項または第２項に記載した遺伝
   子のストレプトミセテスプラスミドのインアクチベーシ
   ョンマーカーとしての使用。 ５、特許請求の範囲第１項または第２項に記載した遺伝
   子で得られる、青色着色物質。