JPH0286780A - ピクロマイシン耐性付与遺伝子 - Google Patents
ピクロマイシン耐性付与遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、ｐｉｃ八と命名した新規なピクロマイシン耐
性付与遺伝子、ｐｉｃＡ遺伝子を誘導する方法、この新
規な遺伝子を含有する組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー、およびこのビクロマイノン耐性付与ヘクターを含有
する形質転換体に関する。
性付与遺伝子、ｐｉｃＡ遺伝子を誘導する方法、この新
規な遺伝子を含有する組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー、およびこのビクロマイノン耐性付与ヘクターを含有
する形質転換体に関する。
［従来技術とその課題１
ストレプトマイセス・フェレウス（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｆｅｌｌｅｕｓ、） ［Ｎ ＲＲＬ ２２
５１ ］は、ピクＣｆｆ？イ７ン、即ちＩ４員環ラクト
ンおよび１つの糖残基から構成されるマタロライド抗生
物質を産生ずる。このビクロマイシンの抗菌活性は、他
のマタロライド系抗生物質のそれと同様に、タンパク質
合成の阻害に基づくものであり、その機序はピクロマイ
シンがリホソームに結合することに関係している。
ｙｃｅｓ ｆｅｌｌｅｕｓ、） ［Ｎ ＲＲＬ ２２
５１ ］は、ピクＣｆｆ？イ７ン、即ちＩ４員環ラクト
ンおよび１つの糖残基から構成されるマタロライド抗生
物質を産生ずる。このビクロマイシンの抗菌活性は、他
のマタロライド系抗生物質のそれと同様に、タンパク質
合成の阻害に基づくものであり、その機序はピクロマイ
シンがリホソームに結合することに関係している。
本発明は、ストレプトマイセスおよび他の宿主細胞に使
用できるピクロマイシン耐性付与クローニングベクター
を提供するものである。ストレプトマイセスに係る組換
えＤＮＡ工学の発展および発達は、適当なりローニング
ベクターに対する選択遺伝子マーカーの入手可能性に１
衣存している。
用できるピクロマイシン耐性付与クローニングベクター
を提供するものである。ストレプトマイセスに係る組換
えＤＮＡ工学の発展および発達は、適当なりローニング
ベクターに対する選択遺伝子マーカーの入手可能性に１
衣存している。
ナカニン（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）のプラスミド（Ｐｌａ
ｓｍｉｄ）、 １５２１７−２２９（１９８６）を参照
。しかし、このような発達は、ストレプトマイセスに使
用できる、現在入手可能な選択マーカーの数か少ないこ
とから若干遅れをとっている。本発明は、このような用
途に適した選択マーカーの数を増やす上で有用であり、
極めて重要なものである。
ｓｍｉｄ）、 １５２１７−２２９（１９８６）を参照
。しかし、このような発達は、ストレプトマイセスに使
用できる、現在入手可能な選択マーカーの数か少ないこ
とから若干遅れをとっている。本発明は、このような用
途に適した選択マーカーの数を増やす上で有用であり、
極めて重要なものである。
本発明のベクターは、小さく、使用し易く、さらに各種
のヒリロマイシン感受性ストレプトマイセス細胞を形質
転換でき、選択できることから特に有用である。ストレ
プトマイセスからは臨床的に重要な抗生物質の大半か得
られるので、それは商業的に意義のある属である。本発
明は、この産業的に重要な属にとって有用かつ新規なり
ローニング系およびベクターを提供し、既知の抗生物質
の収１を増大させると共に、新規な抗生物質およびその
抗生物質誘導体を生産させることを可能にするものであ
る。
のヒリロマイシン感受性ストレプトマイセス細胞を形質
転換でき、選択できることから特に有用である。ストレ
プトマイセスからは臨床的に重要な抗生物質の大半か得
られるので、それは商業的に意義のある属である。本発
明は、この産業的に重要な属にとって有用かつ新規なり
ローニング系およびベクターを提供し、既知の抗生物質
の収１を増大させると共に、新規な抗生物質およびその
抗生物質誘導体を生産させることを可能にするものであ
る。
［課題解決の手段Ｊ
さらに、本発明は、ストレプトマイセス形質転換体の同
定を可能ならしめるベクターを提供するものである。選
択できないＤＮＡを本発明のベクターに付加した後、得
られた修飾ベクターでストレブＩ・マイセスを形質中云
（負すれば、そのビクロマイノン耐性の表現型によって
形質転換体を同定することかできる。形質転換は比較的
低い頻度の事象であるので、このような機能試験は、多
数の細胞の中からどの細胞か形質転換ＤＮＡを獲得した
かを決定する」−で実際上必須のものである。
定を可能ならしめるベクターを提供するものである。選
択できないＤＮＡを本発明のベクターに付加した後、得
られた修飾ベクターでストレブＩ・マイセスを形質中云
（負すれば、そのビクロマイノン耐性の表現型によって
形質転換体を同定することかできる。形質転換は比較的
低い頻度の事象であるので、このような機能試験は、多
数の細胞の中からどの細胞か形質転換ＤＮＡを獲得した
かを決定する」−で実際上必須のものである。
本明細書に開示し、特許請求している本発明の目的から
、以下に用語を定義する： ＡｍＲ：アプラマイシン耐性表現型またはアンビンノン
耐性を付与する遺伝子。
、以下に用語を定義する： ＡｍＲ：アプラマイシン耐性表現型またはアンビンノン
耐性を付与する遺伝子。
ＡＰＲ，アンピシリン耐性表現型またはアンビンノン耐
性を付与する遺１云子。
性を付与する遺１云子。
Ｃａｒ：カルホマイシン。
Ｅ ｒｙ ：エリスロマインン。
１、、ｉｎｃ・リンコマイシン。
ｍｅｌ チロシナーセノ貴（云子。
Ｐｃ・ピクロマイシン。
ｐ１ｃΔ ピクロマイシン耐性付与遺伝子。
ファスミド・ファー／としてまたはプラスミドとして作
用する組換えＤＮＡベクター 組換えＤＮＡクローニングベクター、１つ若しくはそれ
以上の付加的なりＮＡ上セグメント付加し得るＤＮＡ分
子、または既にそれが付加されている１つＮＡ分子を含
有する自律的に復製可能な、または組込み可能な物質で
あって、これにはプラスミドが包含されるかこれに限定
されない。
用する組換えＤＮＡベクター 組換えＤＮＡクローニングベクター、１つ若しくはそれ
以上の付加的なりＮＡ上セグメント付加し得るＤＮＡ分
子、または既にそれが付加されている１つＮＡ分子を含
有する自律的に復製可能な、または組込み可能な物質で
あって、これにはプラスミドが包含されるかこれに限定
されない。
制限フラグメン］・〜１つまたはそれ以上の制限酵素め
作用によって生成された線状ＤＮＡ分子。
作用によって生成された線状ＤＮＡ分子。
Ｒｏｓ ロサロマインン。
感受性宿主細胞 ある特定の抗生物質のＵ注下では、こ
れに対する耐性を付与するＤ Ｎ Ａセグメントか無け
れば発育できない宿主細胞。
れに対する耐性を付与するＤ Ｎ Ａセグメントか無け
れば発育できない宿主細胞。
Ｓｐｉ スピラマインン。
Ｔｃｌ″：テトラサイクリン耐性表現型またはテトラサ
イクリン耐性を付与する遺（分子。
イクリン耐性を付与する遺（分子。
１ト工質転換体 形質転換を受けた受容宿主１１１１胞
。
。
形質転換 受容宿主細胞にＤＮＡを導入し、遺伝子型を
変えて受容細胞に変化をもたらすこと。
変えて受容細胞に変化をもたらすこと。
ｔｓｒｌｌ：チオストレプトン耐性表現型またはチオス
トレプトン耐性を付与する遺伝子。
トレプトン耐性を付与する遺伝子。
Ｔｙトタイロンン。
第１図はプラスミドｐＯＪ３２１の制限部位および（幾
能地図である。本明細書の開示の目的に応し、図面は等
尺で描かれていない。
能地図である。本明細書の開示の目的に応し、図面は等
尺で描かれていない。
第２図はプラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１の
制限部位および機能地図である。
制限部位および機能地図である。
第３図はプラスミドｐ Ｆ Ｊ ３７２およびｐ Ｆ
Ｊ３７３の制限部位および機能地図である。
Ｊ３７３の制限部位および機能地図である。
第４図はプラスミドｐＦＪ３７４およびｐＦＪ３７５の
制限部位および機能地図である。
制限部位および機能地図である。
第５図はファーンｐＦＪ３７６およびｐ Ｆ Ｊ ３７
７の制限部位および機能地図である。
７の制限部位および機能地図である。
本発明は、
（ａ）復’に２起点および組込み配列からなる群から選
ばれるＤＮＡ配列、および （ｂ）抗生物質ピクロマイシンに対する耐性を付与する
ピクロマイシン耐性遺伝子 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターを提１１
（する。たたし、該復・！＋２起点および組込み配列か
ストレプトマイセスおよびノカル／ア内で機能するもの
であることを条件とする。
ばれるＤＮＡ配列、および （ｂ）抗生物質ピクロマイシンに対する耐性を付与する
ピクロマイシン耐性遺伝子 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターを提１１
（する。たたし、該復・！＋２起点および組込み配列か
ストレプトマイセスおよびノカル／ア内で機能するもの
であることを条件とする。
本発明は、ピクロマイシン耐性遺伝子（１）ｉｃＡ）を
含有する、プラスミドｐＯＪ３２１の〜２゜８ｋｂＰｖ
ｕＩＩフラグメントをＰｖｕ１１部分消化プラスミｌ’
ｐｏ Ｊ ｌ （３０ｆこライケート（ｉ古合）するこ
と（こよりｐ ｉ ｃ 、Ａ遺伝子の方向のみか異なる
プラスミドｐＦ Ｊ ３７０およびｐＦＪ３７１を形成
することによって構築される。プラスミドｐＦＪ３７０
およびｐＦＪ３７１の制限部位および機能地図を添１：
ｊの第２図に示す。プラスミドｐＯＪ３２１は、ノーサ
ン・レジオナル・リサーチ・ラボラトリ−ＥＮｏｒｔｈ
ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ｉ、ａ
ｂｏｒａＬｏｒｙ（Ｎ ＲＲＬ）、アグリ力ルチャル・
リサーチ・サービス、＋８］５ ／−ス・ユニバーン
イテイー・ストリート、米国１１ｐ務局、ペオリア、＋
＋−６１６０４］のパーマ不／１・・ストック・カルチ
ャー・コレクシヨン（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ５ｔｏｃｋ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）として寄託
され（１９８８年７月２２日）、そのコレク／ヨンの一
部を構成している菌株である大腸菌（Ｅ、ｃ。
含有する、プラスミドｐＯＪ３２１の〜２゜８ｋｂＰｖ
ｕＩＩフラグメントをＰｖｕ１１部分消化プラスミｌ’
ｐｏ Ｊ ｌ （３０ｆこライケート（ｉ古合）するこ
と（こよりｐ ｉ ｃ 、Ａ遺伝子の方向のみか異なる
プラスミドｐＦ Ｊ ３７０およびｐＦＪ３７１を形成
することによって構築される。プラスミドｐＦＪ３７０
およびｐＦＪ３７１の制限部位および機能地図を添１：
ｊの第２図に示す。プラスミドｐＯＪ３２１は、ノーサ
ン・レジオナル・リサーチ・ラボラトリ−ＥＮｏｒｔｈ
ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ｉ、ａ
ｂｏｒａＬｏｒｙ（Ｎ ＲＲＬ）、アグリ力ルチャル・
リサーチ・サービス、＋８］５ ／−ス・ユニバーン
イテイー・ストリート、米国１１ｐ務局、ペオリア、＋
＋−６１６０４］のパーマ不／１・・ストック・カルチ
ャー・コレクシヨン（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ５ｔｏｃｋ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）として寄託
され（１９８８年７月２２日）、そのコレク／ヨンの一
部を構成している菌株である大腸菌（Ｅ、ｃ。
１ｉ）ＫＩ２ ＪＭ１０９／ｐＯＪ３２１から入手す
ることかできる。、これは、受託１イ号Ｎ ＲＲｌ−１
３−１８３８９の下で、−に記のプラスミドの１１．給
源および保γ１貯；１：ｙ物（ストック・リサ−！・−
）として一般にｔり用可能である。プラスミドｐＯＪ１
６０は、これｔ、受託許可ＮＲＲＬ Ｂ−１８０８８の
下でＮ ＲＲＬから人手可能なＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １２
ＪＭ１０９／ｐＯＪ １６０ （寄託日１９８６年
７月２９日）から単離することができる。
ることかできる。、これは、受託１イ号Ｎ ＲＲｌ−１
３−１８３８９の下で、−に記のプラスミドの１１．給
源および保γ１貯；１：ｙ物（ストック・リサ−！・−
）として一般にｔり用可能である。プラスミドｐＯＪ１
６０は、これｔ、受託許可ＮＲＲＬ Ｂ−１８０８８の
下でＮ ＲＲＬから人手可能なＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １２
ＪＭ１０９／ｐＯＪ １６０ （寄託日１９８６年
７月２９日）から単離することができる。
当業者であれば、特定の目的、および特定の条（’Ｉ下
−Ｃは、クローニングベクターを増殖させる上でストレ
プトマイセスおよびその関連微生物よりｂＥ、ｃｏｌｉ
のほうか簡便であることは容易に理解するであろう。従
って、本発明のベクターを改変することによって、Ｅ、
ｃｏｌｉおよびストレプトマイセスの両者で使用１．１
１能な２代能性ンヤトルヘクターを得ることかできる。
−Ｃは、クローニングベクターを増殖させる上でストレ
プトマイセスおよびその関連微生物よりｂＥ、ｃｏｌｉ
のほうか簡便であることは容易に理解するであろう。従
って、本発明のベクターを改変することによって、Ｅ、
ｃｏｌｉおよびストレプトマイセスの両者で使用１．１
１能な２代能性ンヤトルヘクターを得ることかできる。
このことは、スＩ・レフトマイセスのピクロマイシン耐
性付与ベクターに、適当なＥ、ｃｏｌｉのｔｑ製起点お
よび選択可能な配列を付与することによって行える。こ
のように、本発明は、 （ａ）Ｅ、ｃｏｌｉの複製起点、および（ｂ）Ｅ、ｃｏ
ｌｉ内で選択可能な表現型を付与するＤＮＡ配列、をさ
らに含有する組換えＤＮＡクロニングヘクターを提供す
るものでもある。プラスミドｐＯＪ３２１は、ｐｉｃＡ
、ストレプトマイセスレプリコン、Ｅ、ｃｏｌｉ レ
プリコン、第３上ひストレプトマイセスとＥ、ｃｏｌｉ
の両者で選択可能な表現型を付与するアブラマイシン耐
性遺伝子を含有している例示の２機能性シャトルベクタ
ーである。これは、」二記のＮ ＲＲＬ に寄託された
Ｅ、ｃ。
性付与ベクターに、適当なＥ、ｃｏｌｉのｔｑ製起点お
よび選択可能な配列を付与することによって行える。こ
のように、本発明は、 （ａ）Ｅ、ｃｏｌｉの複製起点、および（ｂ）Ｅ、ｃｏ
ｌｉ内で選択可能な表現型を付与するＤＮＡ配列、をさ
らに含有する組換えＤＮＡクロニングヘクターを提供す
るものでもある。プラスミドｐＯＪ３２１は、ｐｉｃＡ
、ストレプトマイセスレプリコン、Ｅ、ｃｏｌｉ レ
プリコン、第３上ひストレプトマイセスとＥ、ｃｏｌｉ
の両者で選択可能な表現型を付与するアブラマイシン耐
性遺伝子を含有している例示の２機能性シャトルベクタ
ーである。これは、」二記のＮ ＲＲＬ に寄託された
Ｅ、ｃ。
ｌｉ Ｋ Ｉ ２ ＪＭＩ ０９／ｐＯＪ ３２１か
ら入手可能である。プラスミドｐＯＪ３２１の制限部位
および機能地図を添付の第１図に示す。
ら入手可能である。プラスミドｐＯＪ３２１の制限部位
および機能地図を添付の第１図に示す。
本発明のベクタτは、既知の菌株であるストレプトマイ
セス・フエレウス（ＮＲＲＬ ２２５１）から７１１
離された折用なピクロマイシン耐性遺伝子を含有してい
る。このノ責（云子は、マタロライド系抗生物質ピクロ
マイ／ンに対する耐性を付与すると同時に、ある場合に
は曲の抗生物質に対する耐性をも同様に付与する。この
ような特定の抗生物質耐性遺伝子の交差ｊ耐性は周知の
現象であり、フジサワ（Ｆｕｊｉｓａｗａ）およびワイ
スプラム（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ）らの川３ａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ ＋４６：６２１（１９８１）に報告されてい
る。
セス・フエレウス（ＮＲＲＬ ２２５１）から７１１
離された折用なピクロマイシン耐性遺伝子を含有してい
る。このノ責（云子は、マタロライド系抗生物質ピクロ
マイ／ンに対する耐性を付与すると同時に、ある場合に
は曲の抗生物質に対する耐性をも同様に付与する。この
ような特定の抗生物質耐性遺伝子の交差ｊ耐性は周知の
現象であり、フジサワ（Ｆｕｊｉｓａｗａ）およびワイ
スプラム（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ）らの川３ａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ ＋４６：６２１（１９８１）に報告されてい
る。
上記の〜２．８ ｋｂ ｐｉｃＡＪ貴（云子念汀；１川
恨フラグメントは、ストレプトマイセスレプリコンのみ
を３白する通常のストレプトマイセスヘクターにもクロ
ーン慣ることかできる。例えば、′ＦｌｌＤＮｌ＼ポリ
メラーセを（吏用して最？刀にプラスミドｐｌＪ ７０
２の１つのＢｇ１１１部位の５“突出部を充填した後、
〜２．８ｋｂ ＰｖｕｌｌフラグメントをそのＢｇｉ１
１部位にライゲートすればよい。この反応により、ｐｉ
ｃＡフラグメントの方向のみが５間なるプラスミドｐＦ
Ｊ３７２およびｐＦＪ３７３が形成される。ストレゾ１
−マイセスｓｐｐに形質転換した場合、これらのプラス
ミドはヒリロマイ／ン巷受性宿主にピクロマイシン１ｎ
ｉＪ性を付与することができる。プラスミドｐ Ｉ Ｊ
７０２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ＡＴＣＣ１口。
恨フラグメントは、ストレプトマイセスレプリコンのみ
を３白する通常のストレプトマイセスヘクターにもクロ
ーン慣ることかできる。例えば、′ＦｌｌＤＮｌ＼ポリ
メラーセを（吏用して最？刀にプラスミドｐｌＪ ７０
２の１つのＢｇ１１１部位の５“突出部を充填した後、
〜２．８ｋｂ ＰｖｕｌｌフラグメントをそのＢｇｉ１
１部位にライゲートすればよい。この反応により、ｐｉ
ｃＡフラグメントの方向のみが５間なるプラスミドｐＦ
Ｊ３７２およびｐＦＪ３７３が形成される。ストレゾ１
−マイセスｓｐｐに形質転換した場合、これらのプラス
ミドはヒリロマイ／ン巷受性宿主にピクロマイシン１ｎ
ｉＪ性を付与することができる。プラスミドｐ Ｉ Ｊ
７０２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ＡＴＣＣ１口。
クビレ、メリーランド、２０８５２）のパーマ°不ント
・ストック・ノノルチセー・コレク／ヨンの一部として
寄託（１９８２年７月６日）されている菌株、ストレブ
Ｉ・マイセス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ＞／
ｐＩ Ｊ ７０２から入手することかできる。
・ストック・ノノルチセー・コレク／ヨンの一部として
寄託（１９８２年７月６日）されている菌株、ストレブ
Ｉ・マイセス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ＞／
ｐＩ Ｊ ７０２から入手することかできる。
これは受託番号ＡＴＣＣ３９１５５の下て上記プラスミ
ドの１４給源およびストック・リサーハーとして一般に
入手可能である。プラスミ）ｐＦＪ３７２およびｐＦＪ
３７３の制限部位および機能地図を添付の第３図に示す
。
ドの１４給源およびストック・リサーハーとして一般に
入手可能である。プラスミ）ｐＦＪ３７２およびｐＦＪ
３７３の制限部位および機能地図を添付の第３図に示す
。
〜２．８ｋｂｐｉｃＡ遺伝子−含有制限フラグメントは
さらに、宿主のゲノムへのホモローカスな組換えおよび
組込みを介してピクロマイ／ン耐性を感受性宿主に付与
するのに使用することができる。
さらに、宿主のゲノムへのホモローカスな組換えおよび
組込みを介してピクロマイ／ン耐性を感受性宿主に付与
するのに使用することができる。
例えば、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Ｓ、
ｇｒｉｓｅｏｒｕｓｃｕｓ）染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ
２３９１６）をＭｂｏｌ制限酵素て部分消化した後、得
られた５′突出部を′「、１Ｄ Ｎ Ａポリメラーセで
充填することかできろ。次いて、この１．） Ｎ Ａを
ＩεｃｏＲＩ 切断し、充填したプラスミドｐ１３Ｒ３
２２（Ｂ１＜１、）にライケートし、Ｅ 、 ｃｏｌｉ
２９４１１１］月包（こ坏３質転換し、テトラサイ
クリン耐性によって選択する。次いで、１１１られたプ
ラスミドをＰ ｖｕ ｌ］制限酵素で部分消化し、１）
ＯＪ３２１山来の〜２８ｋｂｐＩＣＡ遺伝子含有フラグ
メントをそのＰｖｕｌＪ部位にライケートする。次に、
ライケートしたプラスミドてＥ、ｃｏｌｉ ’：形質転
換し、テトラサイクリンプレート」−で選択する。得ら
れた形質転換体をプールし、ｐｉｃＡフラグメントの方
向のみか異なるプラスミドを１％、それらをｐＦＪ３７
４およびｐＦＪ３７５と命名する。ストレプ！・マイセ
ス・グ１ノセオフスカスに再度形質転換し直すと、これ
らのプラスミドはストレプトマイセスレプリコンをａ
Ｙ了していないので、自律的に復ルンすることかできな
い。従って、生した１硝性コロニーたけか、ホモローが
スな組換えおよびその後に組込みか起こった細胞由来の
生育コロニーである。ブラスミ］・ｐＦＪ３７４および
ｐＦＪ３７５の制限部位および機能地図を添付の第４図
に示す。ｐｉｃＡ遺伝子か、ストレプトマイセスレプリ
コンを含有するプラスミドに含有されている場合でさえ
、どの培養物においても少数であるか、依然検出可能な
組込みが起こり得ることに注意すべきである。従って、
自律的に複製するベクターも低い頻度ではあるが、「組
込む」可能性がある。
ｇｒｉｓｅｏｒｕｓｃｕｓ）染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ
２３９１６）をＭｂｏｌ制限酵素て部分消化した後、得
られた５′突出部を′「、１Ｄ Ｎ Ａポリメラーセで
充填することかできろ。次いて、この１．） Ｎ Ａを
ＩεｃｏＲＩ 切断し、充填したプラスミドｐ１３Ｒ３
２２（Ｂ１＜１、）にライケートし、Ｅ 、 ｃｏｌｉ
２９４１１１］月包（こ坏３質転換し、テトラサイ
クリン耐性によって選択する。次いで、１１１られたプ
ラスミドをＰ ｖｕ ｌ］制限酵素で部分消化し、１）
ＯＪ３２１山来の〜２８ｋｂｐＩＣＡ遺伝子含有フラグ
メントをそのＰｖｕｌＪ部位にライケートする。次に、
ライケートしたプラスミドてＥ、ｃｏｌｉ ’：形質転
換し、テトラサイクリンプレート」−で選択する。得ら
れた形質転換体をプールし、ｐｉｃＡフラグメントの方
向のみか異なるプラスミドを１％、それらをｐＦＪ３７
４およびｐＦＪ３７５と命名する。ストレプ！・マイセ
ス・グ１ノセオフスカスに再度形質転換し直すと、これ
らのプラスミドはストレプトマイセスレプリコンをａ
Ｙ了していないので、自律的に復ルンすることかできな
い。従って、生した１硝性コロニーたけか、ホモローが
スな組換えおよびその後に組込みか起こった細胞由来の
生育コロニーである。ブラスミ］・ｐＦＪ３７４および
ｐＦＪ３７５の制限部位および機能地図を添付の第４図
に示す。ｐｉｃＡ遺伝子か、ストレプトマイセスレプリ
コンを含有するプラスミドに含有されている場合でさえ
、どの培養物においても少数であるか、依然検出可能な
組込みが起こり得ることに注意すべきである。従って、
自律的に複製するベクターも低い頻度ではあるが、「組
込む」可能性がある。
ｐｉｃＡ遺Ｅ子はさらに、プラスミド以外の例示ベクタ
ーを構築するのにも使用することができる。
ーを構築するのにも使用することができる。
例えば、ファージφＣ３１は、周７．ｌ］のストレプト
マイセスファージであり、これはある種の他の組込みベ
クターの構築における優れた出発物質である。ファージ
φＣ３１の誘導体であるファスミドｐＫＣ３３１は、こ
のような組込みベクターの構築には特に好ましいもので
あり、これは、受託番号ＮＲＲ１，，Ｂ−１５８２８の
下、上述のノーサン・リージオナル・リサーチ・ラボラ
トリ−のパーマネント・ストック・カルチャー・コレク
ンヨンの一部を形成している菌株、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２ ＢＦ２４７／ｐＫＣ３３１（受託日１９８４年
８月３日）から入手することかできる。ファスミドｐ
ＫＣ３３１の〜３７ ｋｂ Ｐｓｔ ｌ制限フラグメン
トをプラスミドｐＯＪ３２’ｌの〜２．８ｋｂ ヒリロ
マインン耐性付与Ｐ ｖｕ ＩＩ 制限フラグメントに
ライケートする（Ｐｓｔｌフラグメントの３′突出部を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーセで修正（ｃｈｅｗ ｂａｃｋ）
した後）ことにより、ｐｉｃＡ遺伝子の方向のみが異
なる誘導ファージｐＦＪ３７６およびｐＦＪ３７７か得
られる。これらのファー／はビクロマインン耐性をスト
レプトマイセスに付与する組込みベクターであり、従っ
てこれも本発明を例示するものである。ファージｐ Ｆ
Ｊ ３７６およびｐＦＪ３７７の制限部位および機能
地図を添付の第５図に示す。
マイセスファージであり、これはある種の他の組込みベ
クターの構築における優れた出発物質である。ファージ
φＣ３１の誘導体であるファスミドｐＫＣ３３１は、こ
のような組込みベクターの構築には特に好ましいもので
あり、これは、受託番号ＮＲＲ１，，Ｂ−１５８２８の
下、上述のノーサン・リージオナル・リサーチ・ラボラ
トリ−のパーマネント・ストック・カルチャー・コレク
ンヨンの一部を形成している菌株、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２ ＢＦ２４７／ｐＫＣ３３１（受託日１９８４年
８月３日）から入手することかできる。ファスミドｐ
ＫＣ３３１の〜３７ ｋｂ Ｐｓｔ ｌ制限フラグメン
トをプラスミドｐＯＪ３２’ｌの〜２．８ｋｂ ヒリロ
マインン耐性付与Ｐ ｖｕ ＩＩ 制限フラグメントに
ライケートする（Ｐｓｔｌフラグメントの３′突出部を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーセで修正（ｃｈｅｗ ｂａｃｋ）
した後）ことにより、ｐｉｃＡ遺伝子の方向のみが異
なる誘導ファージｐＦＪ３７６およびｐＦＪ３７７か得
られる。これらのファー／はビクロマインン耐性をスト
レプトマイセスに付与する組込みベクターであり、従っ
てこれも本発明を例示するものである。ファージｐ Ｆ
Ｊ ３７６およびｐＦＪ３７７の制限部位および機能
地図を添付の第５図に示す。
ｐｉｃＡ遺伝子含有制限フラグメントは特定のベクター
、またはクローニングベクター上の特定の位置に限定さ
れるものでないことは理解できるであろう。例えば、ピ
クロマイシン耐性遺伝子は、池の既知のベクター、例え
ばｐｓｃＰ１０３−誘導プラスミｌ＜’ ｒＬｙｄｉａ
ｔｅらの１９８５．ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ３５：２２
３］ 、Ｉ）Ｆ Ｊ ｌ ０３−誘導プラスミドｊＲｉ
ｃｈａｒｄｓｏｎらの１９８２． ジーン、２０：４５
１］ 、およびｐＨＪＬ ４００ Ｊｌｌｃｒｓｈｂ
ｅｒｇｅｒらの１９８６．プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ
）、 １５：１９９−２０９］なとにサブクローンする
ことかできる。当業者であれば、どのベクターか特定の
目的にとって望ましく、またハククー上のとの位置かあ
るピクロマイシン耐性遺伝子含有制限フラグメノトのラ
イケートまたは挿入に有利であるかを、理解しているか
、または容易に決定できる。
、またはクローニングベクター上の特定の位置に限定さ
れるものでないことは理解できるであろう。例えば、ピ
クロマイシン耐性遺伝子は、池の既知のベクター、例え
ばｐｓｃＰ１０３−誘導プラスミｌ＜’ ｒＬｙｄｉａ
ｔｅらの１９８５．ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ３５：２２
３］ 、Ｉ）Ｆ Ｊ ｌ ０３−誘導プラスミドｊＲｉ
ｃｈａｒｄｓｏｎらの１９８２． ジーン、２０：４５
１］ 、およびｐＨＪＬ ４００ Ｊｌｌｃｒｓｈｂ
ｅｒｇｅｒらの１９８６．プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ
）、 １５：１９９−２０９］なとにサブクローンする
ことかできる。当業者であれば、どのベクターか特定の
目的にとって望ましく、またハククー上のとの位置かあ
るピクロマイシン耐性遺伝子含有制限フラグメノトのラ
イケートまたは挿入に有利であるかを、理解しているか
、または容易に決定できる。
さらに、分子リンカ−を得ることかできるので、Ｄ Ｎ
Ａをサブクローンするための特異的な部位を作成する
ことができ、あるいは幾つかのヌクレオチドを付加、切
除または置換してそのＤＮＡフラグメントを改変するこ
とによってその特性を変化させ、さらにＤＮＡのライケ
ートのための様々な制限部位を作成することかできる。
Ａをサブクローンするための特異的な部位を作成する
ことができ、あるいは幾つかのヌクレオチドを付加、切
除または置換してそのＤＮＡフラグメントを改変するこ
とによってその特性を変化させ、さらにＤＮＡのライケ
ートのための様々な制限部位を作成することかできる。
当業者ならば、ヌクレオチド化学と遺伝子暗号に精通し
ているので、とのＤＮＡの改変か特定の目的にかなう所
望のものであるかは理解できるものである。
ているので、とのＤＮＡの改変か特定の目的にかなう所
望のものであるかは理解できるものである。
例示したプラスミドｐＯＪ３２１は、ｐＨＪＬ４００か
ら構築されたコスミド由来の５ＣＰ２！ストレプトマイ
セス′ｆυ製中位（レプリコン）を含有しているか、各
種の他のストレプトマイセスレプリコンを置換しても同
（ηのベクターを構築することかできる。第１表は、付
加的かつ機能的なストレプトマイセスレプリコン類を得
ることのできるストレプトマイセスプラスミドを一覧に
して例小したちのであるか、これらは包括的なものでは
ない。当業者ならば、レプリコンの機能か破壊されない
限り、第１表のプラスミドのすべてまたは一部を使用し
て、本発明を例示するベクターを溝築することができる
ことは理解されるであろう。
ら構築されたコスミド由来の５ＣＰ２！ストレプトマイ
セス′ｆυ製中位（レプリコン）を含有しているか、各
種の他のストレプトマイセスレプリコンを置換しても同
（ηのベクターを構築することかできる。第１表は、付
加的かつ機能的なストレプトマイセスレプリコン類を得
ることのできるストレプトマイセスプラスミドを一覧に
して例小したちのであるか、これらは包括的なものでは
ない。当業者ならば、レプリコンの機能か破壊されない
限り、第１表のプラスミドのすべてまたは一部を使用し
て、本発明を例示するベクターを溝築することができる
ことは理解されるであろう。
第１表には、プラスミド含有宿主および寄託機関の受託
番号も共に示す。
番号も共に示す。
第１表
ストレプトマイセスプラスミド
プラスミド 宿 主 受託番号Ｓ Ｃ
Ｐ ２ Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ
３（２） ＮＲＲＬ １５０４２ｐ１号 ［−７Ｓ
、ａｍｂｏｒａｃｉｅｎｓ ＮＲＲＬ
１２５２３Ｓ１、ＰＩ Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ
ＮＣＩ［３”１１４１７ｐＮＭ Ｉ ＯＯＳ
、ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ＮＲＲＬ １５１５
６ｐＥ Ｌ １０３ Ｓ、 ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂ
ｅｒ ＮＲＲＬ １２５４９Ａ３９９１２．１３／
ｐＥＬ１０３ ｐＩＪ７０２ Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ Ａ
ＴＣＣ”３９１５５ＳＬＰ１．２［ホリノウチ（ｌｌｏ
ｒｉｎｏｕｃｈｉ）らのＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１
６２：４０６（１９８５）］、ｐｓＲｃｌ−ｂ［シント
ン（Ｓｈｉｎｄｏｎ）らのＪ、 Ａｎｔｉｂｉｏｔ、
３７：５１２（１９８４）］、ｐＳＬｌ［ナカノ（Ｎａ
ｋａｎｏ）らのＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔ
ｔ１３：２７９（１９８２）］、およびｐｓＦ７６５［
ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）らのＪ、 Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔ、 ３６：４２９（１９８３）ｌなとの池のレプリ
コンも１吏用することかてき、これらも本発明の範囲内
に属される。
Ｐ ２ Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ
３（２） ＮＲＲＬ １５０４２ｐ１号 ［−７Ｓ
、ａｍｂｏｒａｃｉｅｎｓ ＮＲＲＬ
１２５２３Ｓ１、ＰＩ Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ
ＮＣＩ［３”１１４１７ｐＮＭ Ｉ ＯＯＳ
、ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ＮＲＲＬ １５１５
６ｐＥ Ｌ １０３ Ｓ、 ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂ
ｅｒ ＮＲＲＬ １２５４９Ａ３９９１２．１３／
ｐＥＬ１０３ ｐＩＪ７０２ Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ Ａ
ＴＣＣ”３９１５５ＳＬＰ１．２［ホリノウチ（ｌｌｏ
ｒｉｎｏｕｃｈｉ）らのＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１
６２：４０６（１９８５）］、ｐｓＲｃｌ−ｂ［シント
ン（Ｓｈｉｎｄｏｎ）らのＪ、 Ａｎｔｉｂｉｏｔ、
３７：５１２（１９８４）］、ｐＳＬｌ［ナカノ（Ｎａ
ｋａｎｏ）らのＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔ
ｔ１３：２７９（１９８２）］、およびｐｓＦ７６５［
ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）らのＪ、 Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔ、 ３６：４２９（１９８３）ｌなとの池のレプリ
コンも１吏用することかてき、これらも本発明の範囲内
に属される。
ａ）ナショナル・コレクション・オブ・インクストリア
ル・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ 。
ル・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ 。
１’ Ｉｎ（ｌｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ）
（ＮＣＩ Ｂ） 、英国、スフノドラント、アヘルティ
ーン／Ｍ３９８ＤＧ、アヘイ・ロート川３５、トリー・
リサーチ・ステー７フン（Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ ５ｔａｔｉｏｎ）、ポスト０オフイス・ホックス３
１゜ ｂ）アメリカン・タイツ・カルチャー・コレクション（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ、 ＡＴＣＣ）、アメリカ合衆国、メ
リーランド ２０５８２、ロックビレ、１２３０１バー
クローン・トライフ。
（ＮＣＩ Ｂ） 、英国、スフノドラント、アヘルティ
ーン／Ｍ３９８ＤＧ、アヘイ・ロート川３５、トリー・
リサーチ・ステー７フン（Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ ５ｔａｔｉｏｎ）、ポスト０オフイス・ホックス３
１゜ ｂ）アメリカン・タイツ・カルチャー・コレクション（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ、 ＡＴＣＣ）、アメリカ合衆国、メ
リーランド ２０５８２、ロックビレ、１２３０１バー
クローン・トライフ。
本発明のベクターは、ストレプトマイセスレフリコン、
ピクロマイノン耐性付与制限フラグメント、ならびに仕
怠にＥ、ｃｏｌｉ レプリコンおよび選択可能な配列を
含んでいる。プラスミ］・の増幅および操作はストレブ
）・マイセスよりも大腸菌に於いて、より迅速かつ効率
的に実施できるので、ＩＥｃｏｌｉ レプリコンが存在
することは有利であり、かつ本発明の例示ベクターの一
般的利用度を増大させる。実際に、大腸菌に関する遺伝
的および生化学的な情報のおかげで、大腸菌は本発明の
目的に好都合な宿主である。しかし、本発明は、いずれ
の種または株に限定されるものではなく、Ｅ、ｃｏｌｉ
レプリコンか機能するあらゆる微生物に使用すること
か可能である。特定のＥ 、 ｃｏｌ ｉ レプリコン
の存在は本発明ベクターの重要な構成要素でないので、
大腸菌プラスミド、例えばｐｃＺＩｏｌ［５ｃｈｏｎｅ
ｒらのＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ｌｌ５Ａ ８１ ：５４０３（１９８４）］、ｐＡｃ
Ｙｃ１８４、ｐＢＲ３２５、ｐ１３Ｒ３２８なと由来の
、機能的なレプリコンを含有し、かつ所望であれば抗生
物質耐性を付与する制限フラグメントによって置換する
こと（ま、本発明の範囲に含まれる。池にちム々多くの
宿主１１１胞か当業界で自明である。
ピクロマイノン耐性付与制限フラグメント、ならびに仕
怠にＥ、ｃｏｌｉ レプリコンおよび選択可能な配列を
含んでいる。プラスミ］・の増幅および操作はストレブ
）・マイセスよりも大腸菌に於いて、より迅速かつ効率
的に実施できるので、ＩＥｃｏｌｉ レプリコンが存在
することは有利であり、かつ本発明の例示ベクターの一
般的利用度を増大させる。実際に、大腸菌に関する遺伝
的および生化学的な情報のおかげで、大腸菌は本発明の
目的に好都合な宿主である。しかし、本発明は、いずれ
の種または株に限定されるものではなく、Ｅ、ｃｏｌｉ
レプリコンか機能するあらゆる微生物に使用すること
か可能である。特定のＥ 、 ｃｏｌ ｉ レプリコン
の存在は本発明ベクターの重要な構成要素でないので、
大腸菌プラスミド、例えばｐｃＺＩｏｌ［５ｃｈｏｎｅ
ｒらのＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ｌｌ５Ａ ８１ ：５４０３（１９８４）］、ｐＡｃ
Ｙｃ１８４、ｐＢＲ３２５、ｐ１３Ｒ３２８なと由来の
、機能的なレプリコンを含有し、かつ所望であれば抗生
物質耐性を付与する制限フラグメントによって置換する
こと（ま、本発明の範囲に含まれる。池にちム々多くの
宿主１１１胞か当業界で自明である。
本発明の組換えＤ Ｎ Ａクローニングヘクターは、ス
トーブ！・マイセスの単一の種または味での使用に限定
されるものでもない。これとは反対に、本発明のベクタ
ーは広範に使用することかでき、多くのストレプトマイ
セス類のマタロライド’Ｆ！’、 受性宿主細胞で、特
にアミノグリコ／１・、マタロライド、β−ラクタム、
ポリエーテル、およびグリコペプチド抗生物質などの抗
生物質を産生ずる経済的に重要な菌類の非制限性菌株（
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｅｓｓｓｔｒａｉｎｓ）て（
重用することかできる。このような非制限性菌株は、当
業界周知の方法によってストレプトマイセス類から容易
に選択、単離される［１゜ｏｍｏｖｓｋａｙａらのＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４：２０６
（１９８０）］。非制限性菌株の宿主細胞は制限酵素を
欠いているので、形質転換時にプラスミドＤＮＡを切断
または分解しない。本発明の目的にとっては、本発明の
ベクターのとの制限部位をも切断しない制限酵素をβ１
イ了している借主；ｉｌｌ胞０、非制限性宿主とみなす
。
トーブ！・マイセスの単一の種または味での使用に限定
されるものでもない。これとは反対に、本発明のベクタ
ーは広範に使用することかでき、多くのストレプトマイ
セス類のマタロライド’Ｆ！’、 受性宿主細胞で、特
にアミノグリコ／１・、マタロライド、β−ラクタム、
ポリエーテル、およびグリコペプチド抗生物質などの抗
生物質を産生ずる経済的に重要な菌類の非制限性菌株（
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｅｓｓｓｔｒａｉｎｓ）て（
重用することかできる。このような非制限性菌株は、当
業界周知の方法によってストレプトマイセス類から容易
に選択、単離される［１゜ｏｍｏｖｓｋａｙａらのＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４：２０６
（１９８０）］。非制限性菌株の宿主細胞は制限酵素を
欠いているので、形質転換時にプラスミドＤＮＡを切断
または分解しない。本発明の目的にとっては、本発明の
ベクターのとの制限部位をも切断しない制限酵素をβ１
イ了している借主；ｉｌｌ胞０、非制限性宿主とみなす
。
ｐｉｃＡ遺伝子を使用すれば、各種のピクロマイノン感
受性微生物にビクロマイシン耐性を導入することかでき
る。ビクロマイシンなとのマクロライＩ・抗生物質に天
然で感受性を示す微生物では、ｐ ｉ ｃ Ａを遺伝子
マーカーとして使用することかできる。１つまたはそれ
以上のマタロライド抗生物質を産生ずるか依然として低
レベルのマタロライド抗生物質に感受性である微生物に
、本発明のベクターを使用すれば、その微生物の自然耐
性を増大、増加させることができる。さらに、ｐｉｃΔ
遺伝子は、広範な池の抗生物質、例えばスピラマイ／ン
、ロサロマインン、リンコマインン、エリスロマイシン
、カルホマイシン、およびタイロンンに対する耐性ら付
与する。本発明のベクターて形質転換することのできる
、ヒリロマイノン感受性ストレプトマイセス類の非制限
性菌株の好ましい宿主♀口Ｉ胞としては、例えばＳ ｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ ｃｏｃｌｉｃｏｌｏｒ（ストレ
プトマイセス・コエリコロル）、Ｓ、ｇｒａｎｕｌｏｒ
ｕｂｅｒ（Ｓ 、グラヌロルバー）、Ｓ 、 ｒｏｓｅ
ｏｓｐｏｒｕｓ（Ｓ 、 ｏセオスポルス）、Ｓ 、
ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ（Ｓ 、アクノマイシンズ）、Ｓ
、 ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ（Ｓ 、グラウセスセン
ス）、Ｓ、ｐａｒｖｉｌｉｎ（Ｓ、パルビリン）、Ｓ、
ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ（Ｓ 、プリスチ
ナエスビラリス）、５ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ（Ｓ
、ビオラセオルベル）、Ｓ 、 ｖｉｎａｃｅｕｓ（
Ｓ ビナセウス）、Ｓ 、 ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ（Ｓ
、スピノスス）、Ｓ 、 ａｚｕｒｅｕｓ（Ｓ 、ア
ズレウス）、Ｓ 、 ｇｒ：５ｅｏｆｕｓｃｕｓ（Ｓ
グリセオフスカス）、Ｓ ｒｒａｄｉａｅ（Ｓ 、
７ラジアエ）、およびＳ 、 ｔｏｙｏｃａｅｎｓ
ｉｓ （Ｓ 、 トヨカエンシス）なとの非制限性細胞
が挙げられる。
受性微生物にビクロマイシン耐性を導入することかでき
る。ビクロマイシンなとのマクロライＩ・抗生物質に天
然で感受性を示す微生物では、ｐ ｉ ｃ Ａを遺伝子
マーカーとして使用することかできる。１つまたはそれ
以上のマタロライド抗生物質を産生ずるか依然として低
レベルのマタロライド抗生物質に感受性である微生物に
、本発明のベクターを使用すれば、その微生物の自然耐
性を増大、増加させることができる。さらに、ｐｉｃΔ
遺伝子は、広範な池の抗生物質、例えばスピラマイ／ン
、ロサロマインン、リンコマインン、エリスロマイシン
、カルホマイシン、およびタイロンンに対する耐性ら付
与する。本発明のベクターて形質転換することのできる
、ヒリロマイノン感受性ストレプトマイセス類の非制限
性菌株の好ましい宿主♀口Ｉ胞としては、例えばＳ ｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ ｃｏｃｌｉｃｏｌｏｒ（ストレ
プトマイセス・コエリコロル）、Ｓ、ｇｒａｎｕｌｏｒ
ｕｂｅｒ（Ｓ 、グラヌロルバー）、Ｓ 、 ｒｏｓｅ
ｏｓｐｏｒｕｓ（Ｓ 、 ｏセオスポルス）、Ｓ 、
ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ（Ｓ 、アクノマイシンズ）、Ｓ
、 ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ（Ｓ 、グラウセスセン
ス）、Ｓ、ｐａｒｖｉｌｉｎ（Ｓ、パルビリン）、Ｓ、
ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ（Ｓ 、プリスチ
ナエスビラリス）、５ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ（Ｓ
、ビオラセオルベル）、Ｓ 、 ｖｉｎａｃｅｕｓ（
Ｓ ビナセウス）、Ｓ 、 ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ（Ｓ
、スピノスス）、Ｓ 、 ａｚｕｒｅｕｓ（Ｓ 、ア
ズレウス）、Ｓ 、 ｇｒ：５ｅｏｆｕｓｃｕｓ（Ｓ
グリセオフスカス）、Ｓ ｒｒａｄｉａｅ（Ｓ 、
７ラジアエ）、およびＳ 、 ｔｏｙｏｃａｅｎｓ
ｉｓ （Ｓ 、 トヨカエンシス）なとの非制限性細胞
が挙げられる。
以下の表によって、ｐｉｃＡ遺伝子を使用することかで
きる他の各種の抗生物質産生微生物のうち代表的な例を
示す。
きる他の各種の抗生物質産生微生物のうち代表的な例を
示す。
（以下余白）
可２青
ノサイクリト−ル系抗生物質産生微生物抗生物質
アミ
双朱惣
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
様々な種
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ
様々な種
５ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ
様々な種
Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ
ａｌｂｕｓ ｖａｒ、ｍｅｔａｍｙｃｉｎｕｓａｑｕａ
ｃａｎｕｓ ａｔ ｒｏｆ ａｃ １ｅｎｓ ｂ＋ｋｉｎｉｅｎｓｉｓ ｂｌｕｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｂｌｕｅｎｓｉｓａｎｕｓ ｃａｔｅｎｕＩａｅ ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔ １ｃｕｓ ｃｒｙｓｔａｌ １ｉｎｕｓ 様々なアミノサイクリトール類 ゲンタマイ／ン類 様々なアミンサイクリトール類 ネオマインン類 メタマイシン Ｎ−メチルハイグロマイシンＢ ハイグロマイシン類 ストレプトマイシン プルエンソマイシン リポンル・パロムアミン カテヌリン アミノンジン ハイグロマイシンＡ ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓｖａｒ、ｎａｒ
ｕｔｏｅｎｓｉｓ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｒｒａｄｉａｅ ｆｒａｄｉａｅ ｖａｒ、１ｔａｌｉｃｕｓａｌｂｕｓ ｇｒ＋ｓｅｕｓ ｇｒ＋ｓｅｏｆｌａｖｕｓ ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔ ｉｃｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕｓ ストレプトマイシン Ａ１６３１６−Ｃ ハイブリマイ７ン類および ネオマイノン類 アミノンジン ストレプトマイシン ストレプトマイシン Ａｌ２６７ セルドマイシン；夏合体 ハイグロマイシン類、 ロイカニシジンおよび ハイグロリジン ｒｏｒｍａ ｇｌｅｂｏｓｕｓ グレホマインンｖ
ａｒ、 Ｉｉｍｏｎｅｕｓ ハリダマインン類ｖａ
ｒ、 ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ スペクチノマイシン
カナマイシンＡおよびＢ カスカマインン（頁 カス力マイシン頌 １ａｖｅｎｄｕｌａｅ ｖｉｄｕｓ ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ ｍ＋ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ ａｍｅｕｓ ｒ １ｂｏｓ ｉｄ ｉ ｆ ｉｃｕｓｒｉｍｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ｒ＋ｍｏｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｓｐｅｃｔａｂ＋ｌ１ｓ ｔｃｎｅｂｒａｒｉｕｓ 不才マイシン リビドマイシン ストレプトマイシン ＳＦ〜７６７ ＬＬ−ＡＭ３］ ハイグロマイシン類 ストレプトマイシン ｖａｒ、 ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｓ テストマ
インンＡストレプトマイ／ン ストレプトマイシン Ｆ７３３ デストマイシンＡ ｐａｒｏｍｏｍｙｃ １ｎｕｓ バロモマインン項
およびカテヌリン スペクチノマインン トブラマイシンおよび アフラマイシン Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｆｌａｖｏｐ
ｅｒｓ １ｃｕｓ スペクチノマイ／ン 第３表 アンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎ）系抗生物質産生
微生物微生物 抗生物質 Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ 様々な種 様々なアンサマイシン類Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ リファマイシン
ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ アンサトリエン類および ナプトマイシン類（ｎａｐｔｈ ｏｍｙｃｉｎｓ） アンサトリエン類および ナブトマインン類 ｇｒ １ｓｅｏｓｐｏｒｅｕｓナプトマイシンＢヘルビ
マインン ｖａｒ、 ｇｅｌｄａｎｕｓ ケルタマイ／ン（ｇｅ
ｌｄａｍｙｃ ｉ ｎ） ２１−ヒドロキシ−２５−ンメ チル−２５−メチルチオプロ トストレプトバリンン ｄｉａｓｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｇａｌｂｕｓ ５ｕｂｓｐ １＋ｙｇｒｏｓｃｏｐ＋ｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ＋ｃｕｓ ｖａｒ、ｎｏｖａ ｎｉｇｅｌｌｕｓ ｒｉｓｈｉｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ、 Ｅ／７８４ ｓｐ、 Ｅ８８ ｓｐｅｃｔａｂｉ １ｉｓ ｔｏｌｙｐｏｐｈｏｒｏｕｓ マイコトリエン類 アクタマイシンおよびマ イコトリエン頌 マイコトリエン類 （ｍｙｃｏｔｒｉｅｎｅｓ） ストレプトバリシン類 （ｓｔｒｅｐｔｏｖａｒｉｃｉｎｓ） トリボマイシン （ｔｏｌｙｐｏｍｙｃｉｎ） （以下余白） 第４表 アントラサイクリン（へｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）お
よびキノン（Ｑｕｉｎｏｎｅ）系抗生物質産生微生物微
生物 抗生物質 Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐ＋Ｌｏｓｕｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｉｃｕｓ ＣＹ ａ Ｉｔ ｅ ｌｌ Ｓ ｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ ｇａｌｉｌａｅｕｓ ｌｕｓ＋ｔａｎｕｓ ｐｅｕｃｅｔ ｉｃｕｓ ｖｉｏｉｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（！ｓ マイトマインンＡ、Ｂお よびＣ アクチノロンン（ａｃｔｉｎｏｒ ｂｏｄｉｎ） タウ／マイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）ントリスアル
ビシン （ｄｉＬｒｉｓａｒｕｂｉｃｉｎ） ンアノサイクリンＡ アクランノマイシンＡ１ アンサマイシン類および スルフルマインン類 ナプチリティノマ・イシン タウ／マイシンおよびア ドリアマイシン アルコマイノン 可避に ラクタム系抗生物質産生微生物 抗生物質 β 畝生惣 Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ 様々な種 Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔ、ｐ々な種 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔ １ｂｉｏｔ ｉｃｕｓ ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ ｃａｔ口ｅｙａ ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ ＣｌｎｎａｍＯｎｅｎＳＩＳ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ 様々なβ−ラクタム類 セファマイシンＣ 様々なβ−ラクタム類 クラプラン酸 アスバレ／マインンＡ１ Ｍ Ｍ ４５５０わよひＭＭ１３９０２チェナマインン
（ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ）Ｓ Ｆ １６２３および セファマイシンＡおよびＢ セファマイシンＡおよび１３ Ｐ、’ｌ−３２４１３−１、セファマイシンＣ１Ａ １
６１！８６Ａ、クラプラン酸および別のクラハム類 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ ｆＩａｖｏｖｉｒｅｎｓ ｌａｖｕｓ ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ ｇｒｌｓｅＬｌｓ ｈａｌｓｔｅｄｉ ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ １ｉｐｍａｎ目 ０ １Ｖａｃｅｌｌｓ ｐａｎａ）’ｅｎＳＩｓ ｐｌｕｒａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓｏｃｈｅｉ セファマイシンＡおよびＢ Ｍ Ｍ ４５５０およびＭＭ１３９０２ＭＭ４５５０お
よびＭＭ１３９０２ Ｍ Ｍ ４５５０およびＭＭ １３９０２セフアマイシ
ンＡおよびＢ セファマイシンＡおよびＢ Ｃ２０１！ＩＸおよび セファマイシンＡおよびＢ デアセトキシセファロスポリンＣ ペニンリンＮ１ ７−メドキ／セファロスポリンｃ１ Ａ １６１！ｔ８４、Ｍ Ｍ ４５５０およびＭＭ１３
９０２ （Ｍｔｖ１１７８８０） エリスロマイシンＦ１ Ｍ Ｍ ４５５０およヒＭＭＩ３９０２Ｃ２０ｇ１Ｘお
よび セファマイシンＡおよびＢ プルラント゛マインンＡ セファマイシンＡおよびＢ ｓ＋ｏｙａｅｎｓ＋ｓ ｓｐ、０Ａ−６１２９ ｓｐ、 ＫＣ−６６４３ ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓ ｉｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｗａｄａｙａｍｅｎｓ １５ ＭＭ４５５０およヒＭＭ１３９０２ ＯＡ−６１２９Ａ カルベチマイ７ンＡ アスパレノマイシンＡ セファマイシンＡおよびＢ ＷＳ −３４４２−Ｄ （以下余白） 第６表 マタロライド系、リンコサミＩ・系およびストレプトグ
ラミン系抗生物質産生微生物微生物
抗生物質 ’ｌｌｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ ロサラマインン（ｒｏ
ｓａｒａｍｉｃｉｎ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ（！５ ａｌｂｉｒｃ’ｔｉｃｕｌｉ カルボマイノ
ンａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ ミフノ゛マ
インンａｌｂｕｓ アルボマイセチン
ａｌｂｕｓ ｖａｒ、ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
コレイマイシンａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ス
ピラマイシンおよびフォロマシティンＤ ａｎｔ １ｂｉｏｔ １ｃｕｓ オレアンドマ
イシンａｖ＋：ｒｍｉＬｉｌｉｓ アベルメ
クチン類ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ カルコマ
インンｂｒｕｎｃｏｇｒｉｓｅｕｓ アルホサ
イタリンｃａｃｌｅｓｔ ｉｓ Ｍ １ｇ
ｇおよびセレスチセチン（ｃｅｌｅｓｊ １ｃｅｔ ｉ
ｎ）ＣｌｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅＳ／不ロマイシ
ンＢｃ＋ｒｒａｔｕｓ ｅｌｔａｅ ｄ、＋ａｋａｒｔｅｎｓｉｓ ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ｅｕｒｏｃ＋ｄｉｃｕｓ ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ ｆｅｌ Ｉｅｕｓ ｆ ｉｍｂｒｉａｔｕｓ ｒ ｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ。
ｃａｎｕｓ ａｔ ｒｏｆ ａｃ １ｅｎｓ ｂ＋ｋｉｎｉｅｎｓｉｓ ｂｌｕｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｂｌｕｅｎｓｉｓａｎｕｓ ｃａｔｅｎｕＩａｅ ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔ １ｃｕｓ ｃｒｙｓｔａｌ １ｉｎｕｓ 様々なアミノサイクリトール類 ゲンタマイ／ン類 様々なアミンサイクリトール類 ネオマインン類 メタマイシン Ｎ−メチルハイグロマイシンＢ ハイグロマイシン類 ストレプトマイシン プルエンソマイシン リポンル・パロムアミン カテヌリン アミノンジン ハイグロマイシンＡ ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓｖａｒ、ｎａｒ
ｕｔｏｅｎｓｉｓ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｒｒａｄｉａｅ ｆｒａｄｉａｅ ｖａｒ、１ｔａｌｉｃｕｓａｌｂｕｓ ｇｒ＋ｓｅｕｓ ｇｒ＋ｓｅｏｆｌａｖｕｓ ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔ ｉｃｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕｓ ストレプトマイシン Ａ１６３１６−Ｃ ハイブリマイ７ン類および ネオマイノン類 アミノンジン ストレプトマイシン ストレプトマイシン Ａｌ２６７ セルドマイシン；夏合体 ハイグロマイシン類、 ロイカニシジンおよび ハイグロリジン ｒｏｒｍａ ｇｌｅｂｏｓｕｓ グレホマインンｖ
ａｒ、 Ｉｉｍｏｎｅｕｓ ハリダマインン類ｖａ
ｒ、 ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ スペクチノマイシン
カナマイシンＡおよびＢ カスカマインン（頁 カス力マイシン頌 １ａｖｅｎｄｕｌａｅ ｖｉｄｕｓ ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ ｍ＋ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ ａｍｅｕｓ ｒ １ｂｏｓ ｉｄ ｉ ｆ ｉｃｕｓｒｉｍｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ｒ＋ｍｏｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｓｐｅｃｔａｂ＋ｌ１ｓ ｔｃｎｅｂｒａｒｉｕｓ 不才マイシン リビドマイシン ストレプトマイシン ＳＦ〜７６７ ＬＬ−ＡＭ３］ ハイグロマイシン類 ストレプトマイシン ｖａｒ、 ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｓ テストマ
インンＡストレプトマイ／ン ストレプトマイシン Ｆ７３３ デストマイシンＡ ｐａｒｏｍｏｍｙｃ １ｎｕｓ バロモマインン項
およびカテヌリン スペクチノマインン トブラマイシンおよび アフラマイシン Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｆｌａｖｏｐ
ｅｒｓ １ｃｕｓ スペクチノマイ／ン 第３表 アンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎ）系抗生物質産生
微生物微生物 抗生物質 Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ 様々な種 様々なアンサマイシン類Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ リファマイシン
ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ アンサトリエン類および ナプトマイシン類（ｎａｐｔｈ ｏｍｙｃｉｎｓ） アンサトリエン類および ナブトマインン類 ｇｒ １ｓｅｏｓｐｏｒｅｕｓナプトマイシンＢヘルビ
マインン ｖａｒ、 ｇｅｌｄａｎｕｓ ケルタマイ／ン（ｇｅ
ｌｄａｍｙｃ ｉ ｎ） ２１−ヒドロキシ−２５−ンメ チル−２５−メチルチオプロ トストレプトバリンン ｄｉａｓｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｇａｌｂｕｓ ５ｕｂｓｐ １＋ｙｇｒｏｓｃｏｐ＋ｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ＋ｃｕｓ ｖａｒ、ｎｏｖａ ｎｉｇｅｌｌｕｓ ｒｉｓｈｉｒｉｅｎｓｉｓ ｓｐ、 Ｅ／７８４ ｓｐ、 Ｅ８８ ｓｐｅｃｔａｂｉ １ｉｓ ｔｏｌｙｐｏｐｈｏｒｏｕｓ マイコトリエン類 アクタマイシンおよびマ イコトリエン頌 マイコトリエン類 （ｍｙｃｏｔｒｉｅｎｅｓ） ストレプトバリシン類 （ｓｔｒｅｐｔｏｖａｒｉｃｉｎｓ） トリボマイシン （ｔｏｌｙｐｏｍｙｃｉｎ） （以下余白） 第４表 アントラサイクリン（へｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）お
よびキノン（Ｑｕｉｎｏｎｅ）系抗生物質産生微生物微
生物 抗生物質 Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐ＋Ｌｏｓｕｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｉｃｕｓ ＣＹ ａ Ｉｔ ｅ ｌｌ Ｓ ｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ ｇａｌｉｌａｅｕｓ ｌｕｓ＋ｔａｎｕｓ ｐｅｕｃｅｔ ｉｃｕｓ ｖｉｏｉｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（！ｓ マイトマインンＡ、Ｂお よびＣ アクチノロンン（ａｃｔｉｎｏｒ ｂｏｄｉｎ） タウ／マイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）ントリスアル
ビシン （ｄｉＬｒｉｓａｒｕｂｉｃｉｎ） ンアノサイクリンＡ アクランノマイシンＡ１ アンサマイシン類および スルフルマインン類 ナプチリティノマ・イシン タウ／マイシンおよびア ドリアマイシン アルコマイノン 可避に ラクタム系抗生物質産生微生物 抗生物質 β 畝生惣 Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ 様々な種 Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔ、ｐ々な種 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔ １ｂｉｏｔ ｉｃｕｓ ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ ｃａｔ口ｅｙａ ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ ＣｌｎｎａｍＯｎｅｎＳＩＳ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ 様々なβ−ラクタム類 セファマイシンＣ 様々なβ−ラクタム類 クラプラン酸 アスバレ／マインンＡ１ Ｍ Ｍ ４５５０わよひＭＭ１３９０２チェナマインン
（ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ）Ｓ Ｆ １６２３および セファマイシンＡおよびＢ セファマイシンＡおよび１３ Ｐ、’ｌ−３２４１３−１、セファマイシンＣ１Ａ １
６１！８６Ａ、クラプラン酸および別のクラハム類 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ ｆＩａｖｏｖｉｒｅｎｓ ｌａｖｕｓ ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ ｇｒｌｓｅＬｌｓ ｈａｌｓｔｅｄｉ ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ １ｉｐｍａｎ目 ０ １Ｖａｃｅｌｌｓ ｐａｎａ）’ｅｎＳＩｓ ｐｌｕｒａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓｏｃｈｅｉ セファマイシンＡおよびＢ Ｍ Ｍ ４５５０およびＭＭ１３９０２ＭＭ４５５０お
よびＭＭ１３９０２ Ｍ Ｍ ４５５０およびＭＭ １３９０２セフアマイシ
ンＡおよびＢ セファマイシンＡおよびＢ Ｃ２０１！ＩＸおよび セファマイシンＡおよびＢ デアセトキシセファロスポリンＣ ペニンリンＮ１ ７−メドキ／セファロスポリンｃ１ Ａ １６１！ｔ８４、Ｍ Ｍ ４５５０およびＭＭ１３
９０２ （Ｍｔｖ１１７８８０） エリスロマイシンＦ１ Ｍ Ｍ ４５５０およヒＭＭＩ３９０２Ｃ２０ｇ１Ｘお
よび セファマイシンＡおよびＢ プルラント゛マインンＡ セファマイシンＡおよびＢ ｓ＋ｏｙａｅｎｓ＋ｓ ｓｐ、０Ａ−６１２９ ｓｐ、 ＫＣ−６６４３ ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓ ｉｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｗａｄａｙａｍｅｎｓ １５ ＭＭ４５５０およヒＭＭ１３９０２ ＯＡ−６１２９Ａ カルベチマイ７ンＡ アスパレノマイシンＡ セファマイシンＡおよびＢ ＷＳ −３４４２−Ｄ （以下余白） 第６表 マタロライド系、リンコサミＩ・系およびストレプトグ
ラミン系抗生物質産生微生物微生物
抗生物質 ’ｌｌｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ ロサラマインン（ｒｏ
ｓａｒａｍｉｃｉｎ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ（！５ ａｌｂｉｒｃ’ｔｉｃｕｌｉ カルボマイノ
ンａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ ミフノ゛マ
インンａｌｂｕｓ アルボマイセチン
ａｌｂｕｓ ｖａｒ、ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
コレイマイシンａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ス
ピラマイシンおよびフォロマシティンＤ ａｎｔ １ｂｉｏｔ １ｃｕｓ オレアンドマ
イシンａｖ＋：ｒｍｉＬｉｌｉｓ アベルメ
クチン類ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ カルコマ
インンｂｒｕｎｃｏｇｒｉｓｅｕｓ アルホサ
イタリンｃａｃｌｅｓｔ ｉｓ Ｍ １ｇ
ｇおよびセレスチセチン（ｃｅｌｅｓｊ １ｃｅｔ ｉ
ｎ）ＣｌｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅＳ／不ロマイシ
ンＢｃ＋ｒｒａｔｕｓ ｅｌｔａｅ ｄ、＋ａｋａｒｔｅｎｓｉｓ ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ｅｕｒｏｃ＋ｄｉｃｕｓ ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ ｆｅｌ Ｉｅｕｓ ｆ ｉｍｂｒｉａｔｕｓ ｒ ｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ。
ｅｓｐ＋ｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ
ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ
ｇｒ＋ｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ
ｇｒ＋５ｅｏｆｌａｖｃ＋ｓ
／ルラマイ／ン
デルタマインン領
ニトラマイシン
エリスロマイシン類
メチマインン
アンコラマイノン
アマロマイ／ン
アルボフィシンおよびピ
クロマインン
アマロマインン
アマロマイ／ンおよびノ
ンコマインン類
チロシン
Ａ−１８１
ニスピノマイノン頓
マイテカマイ／ン
ハンタマインン
ＰＡＩ３３ＡおよびＩ３
アクマイ／ン
ｇｒ＋ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ
ｇｒ＋ｓｅｏｌｕｓ
ｇｒ＋５ｅｏｓｐ＋ｒａｌｉｓ
ｇｒ＋ｓｅｕｓ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒ＋５ｅｕｓ ｓｓｐ、５ｕｌｐｈｕｒｕｓｈａｌｓ
ｔａｄｉ ブンドリン グリセオマインン レロマインン ポルレリジン パフゴロマイシン類 カルボマイシンおよびロ イカニシジン チロシン ミルヘマイ／ン類 ロイコマイシンＡ３およ び／ヨサマイシン アルドガマイシン ノンコマイソン ヘルナマイシンＡおよびＢ カルボマイシン インゲラマイシン アセチル−ロイコマイン ン及ヒエスヒリマインン ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐａｕｒｅｏｌ
ａｃｒｉｍｏｓｕｓ ｋ＋ｔａｓｔｏｅｎｓｉｓ Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ ＋ｎｃｏｌｒ＋Ｏｒ＋ｓｉｓ Ｉｏｉｄｅｎｓｉｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ｍａ＋ｚｅｕｓ ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ ｎａｒｂｏｎｃｎｓｉｓ ｎａｒｂｏｎｃｎｓ ｉｓ ｖａｒ。
ｔａｄｉ ブンドリン グリセオマインン レロマインン ポルレリジン パフゴロマイシン類 カルボマイシンおよびロ イカニシジン チロシン ミルヘマイ／ン類 ロイコマイシンＡ３およ び／ヨサマイシン アルドガマイシン ノンコマイソン ヘルナマイシンＡおよびＢ カルボマイシン インゲラマイシン アセチル−ロイコマイン ン及ヒエスヒリマインン ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐａｕｒｅｏｌ
ａｃｒｉｍｏｓｕｓ ｋ＋ｔａｓｔｏｅｎｓｉｓ Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ ＋ｎｃｏｌｒ＋Ｏｒ＋ｓｉｓ Ｉｏｉｄｅｎｓｉｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ｍａ＋ｚｅｕｓ ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ ｎａｒｂｏｎｃｎｓｉｓ ｎａｒｂｏｎｃｎｓ ｉｓ ｖａｒ。
３ｏｓａｍｙｃｅＬ＋ｃｕｓ
ｏｌ ｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
ｐｌａＬａｎｓｉｓ
ｒ＋ｍＱ！；ｕｓ
ｏｃｈｅｉ
ジコサマイシンおよびナ
ルボマイシン
ロイコマイシンＡ、およ
びジョサマイ／ン
オレアンドマイシン
ブラテノマイシン
チロシンおよびノイトラ
マイシン（ｎｅｕｔｒａｍｙｃｉｎ）
ランカシジンおよびポル
レリジン
アルボサイクリン
アルボサイクリン
ｖａｒ、クジマイシン類
（ｋｕｊ ｉｍｙｃｉｎｓ）
カルボマイシン
カルボマイシン
メチマイシン類
ランカシジン類およびラ
ンカマイシン
ｒｏｃｈｅ＋ ｖａｒ、ｖｏｌｕｂｉｌｉｓｒｏｓｃ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｓｕｒａｇａｏｅｎｓ＋ｓ ｅｎｄａｅ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ ｖｃｎｃｚｕｅｌａｅ ｖ＋ｏｌａｃｅｏｎ＋ｇｅｔ 第７表 種々雑多な抗生物質産生ストレプトマイセス抗生物質型
ストレプトマイセス挿 区先復質アミノ酸 ｓ
ｐ、 シクロセリン同族体 ／クロペンタ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ メチレ
ノマイシンＡン環含有 ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓサルコマインンｖ＋ｏｌａｃｅｏｒｕｂｅ
ｒ メチレノマイシフＡニトロ含有 ｖｅｎｅ
ｚｕｅｌａｅ り６ラムフエニコール ポリエンＥＡＴ ｇｒｉｓｅｕｓ カ
ンジンジンｎｏｄｏｓｕｓ アンホテリシ
ンＢｎｏｕｒｓｅｉ ナイスクチンテトラ
サイク ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ テトラサ
イクリン、リン類 クロロ
テトラサイクリン、デメチルテト ラサイクリンおよび デメチルクロロテト ラサイクリン ｒ１ｍＯ５Ｌｌｓ オキシテトラサイクリ
ン 第８表 ヌクレオン！・系抗生物質産生微生物 欧併抱 抗生物質 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ ｐｖ、 ｒａｔｈａｙｉＮｏ
ｃａｒｄｉａ ｃａｎｄｉｄｕｓ ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ ｇｒｉｓｅｏ「１ａｖｕｓ ツニカマイシン同族体 ビラソフラン アラ−Ａ ツニカマイシン ｖａｒ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ストレプ
トビリタン類 ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ ／不ファンキン
１ｙｓｏｓｕｐｅｒｉｒｉｃｕｓ ツニカマ
イシン（以下余白） 第９表 ペプチド系抗生物質産生微生物 ■生物 抗生物質 Ａｎｔ ｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｔｓｓｏｕｒ＋ｅｎｓ＋ｓ アクタブラ
ニンｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔ １ｃｕｓ テ
コグラ１ンＢａｃｉｌｌｕｓ 様々な種 パンドラシン、ポリミキシン
およびコ ノスチン Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｎｄｉｄｕｓ ｕｒｉｄａ □ｒ＋ｅｎｔａｌ＋ｓ Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｕｒｅｕｓ ａｎｕｓ ｅｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ｈａｒａｎｏｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ ｐｒ＋ｓｔ＋ｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ Ａ’−３５５１２およびアホバル／ン ノストセチン パンツマイシン アクチノマイ／ン チオストレプトン アムホマイシン ＬＬ−ＡＭ３７４ パンツマイシン プリスチナマイシン ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ Ｖｌｒｇｌｎｌａｅ Ａ ２１９７８Ｃの様な ノボペプチド類 Ａ ４７９３４ （以下余白） 第１０嚢 ポリエーテル系抗生物質産生微生物 微生り 抗生物質 Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ 様々な種 ｏｆ ：ｇｏｓｐａｒｕｓ Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ 様々な種 Ｎｏｃａｒｄｉａ 様々な種 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｂｕｓ 様々なポリエーテル類 様々なポリエーテル類 嘩々なポリエーテル類 Ａ２０４、Ａ２８６９５ ＡおよびＢ１およびサリ ノマイシン（ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）ナラジン（ｎａ
ｒａｓｉｎ） リソセリン（ｌｙｓｏｃｅｌ ｔｉｎ）Ａ、２３１８７ モネンンン イオノマイシン レイドロマイシン ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ＣａＣａＯＩ Ｖａｒ、ａＳＯｅｎＳＩＳｃｈａｒｔ
ｒｅｕｓｉｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ ａＳｔｅｒｏｃ＋ｄｉｃｕｓ ｒｌａｖｅｏｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ ｇｒ＋ｓｅｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｌａｓａｌ １ｅｎｓ ｉｓ １ｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓ ｉ ｓ ｍｕｔａｂｉｌｉｓ ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ ｖ＋ｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ様々な種 ＣＰ３８９３６ ＲＰ ３０５０４ グリソリキノン Ａ２１８、エメリント、 ＤＥ３９３６．Ａｌ２０ Ａ、Ａ２８６９５／入およ びＢ１エテロマインンお よびジア不マイ／ン ラサロシド リソセリン Ｓ−１１７４３ａ ロノマイシン ニケリシン 様々なポリエーテル類 （以下余白） 本発明のベクターは、ピクロマイシン感受性ストレプト
マイセスおよび上述の近縁の宿主細胞にピクロマイシン
耐性を付与する。これらのベクターはまた、マタロライ
ド抗生物質：ロサロマイシン、スピラマイシン、エリス
ロマイシン、およびリンコマイシンに対する耐性をも付
与する。２０μｇ／、１ピクロマイシンはピクロマイシ
ン感受性ストレプトマイセスにとっては一般に毒性であ
るか、本発明のベクターはこれよりも高いレベルのマタ
ロライドに対する耐性を付与する。例えば、Ｓ グリセ
オフスカスは通常２５μｇ／ｍ（ｌのタイロシンに感受
性であるが、そのｐｉｃＡ遺伝子を有するベクターで形
質転換すると、そのＳ、グリセオフスカスは５０μｇ／
ｕＱまでのタイロシンレベルに耐えることができる。こ
の形質転換細胞を〜０１−〜１０μｇ／ｍ（ｌピクロマ
イシンで前もって処理すると、５００μｇ／＋Ｃまでの
タイロシンに耐性を示すよう誘導することができる。さ
らに、このような誘導は、低濃度のエリスロマイシンお
よびロサロマイシンの存在下でも起こる。種々のａ＝
＋９および耐性パターンを第１１表および第１２表に示
す。スｉ・レブトマイセス種を選択するための好ましい
ビクロマイシン濃度は、当業界周知の操作法によって容
易に決定される。本発明の態様はすへて有用であるが、
好ましいベクターおよび形質転換体かいくつかある。即
ち、ストレプトマイセス・グリセオフスカスが、好まし
いプラスミドｐＯＪ３２１、ｐＦＪ３７０およびｐＦＪ
３７１にとって好ましい宿主である。
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｓｕｒａｇａｏｅｎｓ＋ｓ ｅｎｄａｅ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ ｖｃｎｃｚｕｅｌａｅ ｖ＋ｏｌａｃｅｏｎ＋ｇｅｔ 第７表 種々雑多な抗生物質産生ストレプトマイセス抗生物質型
ストレプトマイセス挿 区先復質アミノ酸 ｓ
ｐ、 シクロセリン同族体 ／クロペンタ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ メチレ
ノマイシンＡン環含有 ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓサルコマインンｖ＋ｏｌａｃｅｏｒｕｂｅ
ｒ メチレノマイシフＡニトロ含有 ｖｅｎｅ
ｚｕｅｌａｅ り６ラムフエニコール ポリエンＥＡＴ ｇｒｉｓｅｕｓ カ
ンジンジンｎｏｄｏｓｕｓ アンホテリシ
ンＢｎｏｕｒｓｅｉ ナイスクチンテトラ
サイク ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ テトラサ
イクリン、リン類 クロロ
テトラサイクリン、デメチルテト ラサイクリンおよび デメチルクロロテト ラサイクリン ｒ１ｍＯ５Ｌｌｓ オキシテトラサイクリ
ン 第８表 ヌクレオン！・系抗生物質産生微生物 欧併抱 抗生物質 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ ｐｖ、 ｒａｔｈａｙｉＮｏ
ｃａｒｄｉａ ｃａｎｄｉｄｕｓ ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ ｇｒｉｓｅｏ「１ａｖｕｓ ツニカマイシン同族体 ビラソフラン アラ−Ａ ツニカマイシン ｖａｒ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ストレプ
トビリタン類 ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ ／不ファンキン
１ｙｓｏｓｕｐｅｒｉｒｉｃｕｓ ツニカマ
イシン（以下余白） 第９表 ペプチド系抗生物質産生微生物 ■生物 抗生物質 Ａｎｔ ｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｔｓｓｏｕｒ＋ｅｎｓ＋ｓ アクタブラ
ニンｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔ １ｃｕｓ テ
コグラ１ンＢａｃｉｌｌｕｓ 様々な種 パンドラシン、ポリミキシン
およびコ ノスチン Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｎｄｉｄｕｓ ｕｒｉｄａ □ｒ＋ｅｎｔａｌ＋ｓ Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｕｒｅｕｓ ａｎｕｓ ｅｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ｈａｒａｎｏｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ ｐｒ＋ｓｔ＋ｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ Ａ’−３５５１２およびアホバル／ン ノストセチン パンツマイシン アクチノマイ／ン チオストレプトン アムホマイシン ＬＬ−ＡＭ３７４ パンツマイシン プリスチナマイシン ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ Ｖｌｒｇｌｎｌａｅ Ａ ２１９７８Ｃの様な ノボペプチド類 Ａ ４７９３４ （以下余白） 第１０嚢 ポリエーテル系抗生物質産生微生物 微生り 抗生物質 Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ 様々な種 ｏｆ ：ｇｏｓｐａｒｕｓ Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ 様々な種 Ｎｏｃａｒｄｉａ 様々な種 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｂｕｓ 様々なポリエーテル類 様々なポリエーテル類 嘩々なポリエーテル類 Ａ２０４、Ａ２８６９５ ＡおよびＢ１およびサリ ノマイシン（ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）ナラジン（ｎａ
ｒａｓｉｎ） リソセリン（ｌｙｓｏｃｅｌ ｔｉｎ）Ａ、２３１８７ モネンンン イオノマイシン レイドロマイシン ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ＣａＣａＯＩ Ｖａｒ、ａＳＯｅｎＳＩＳｃｈａｒｔ
ｒｅｕｓｉｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ ａＳｔｅｒｏｃ＋ｄｉｃｕｓ ｒｌａｖｅｏｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ ｇｒ＋ｓｅｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｌａｓａｌ １ｅｎｓ ｉｓ １ｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓ ｉ ｓ ｍｕｔａｂｉｌｉｓ ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ ｖ＋ｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ様々な種 ＣＰ３８９３６ ＲＰ ３０５０４ グリソリキノン Ａ２１８、エメリント、 ＤＥ３９３６．Ａｌ２０ Ａ、Ａ２８６９５／入およ びＢ１エテロマインンお よびジア不マイ／ン ラサロシド リソセリン Ｓ−１１７４３ａ ロノマイシン ニケリシン 様々なポリエーテル類 （以下余白） 本発明のベクターは、ピクロマイシン感受性ストレプト
マイセスおよび上述の近縁の宿主細胞にピクロマイシン
耐性を付与する。これらのベクターはまた、マタロライ
ド抗生物質：ロサロマイシン、スピラマイシン、エリス
ロマイシン、およびリンコマイシンに対する耐性をも付
与する。２０μｇ／、１ピクロマイシンはピクロマイシ
ン感受性ストレプトマイセスにとっては一般に毒性であ
るか、本発明のベクターはこれよりも高いレベルのマタ
ロライドに対する耐性を付与する。例えば、Ｓ グリセ
オフスカスは通常２５μｇ／ｍ（ｌのタイロシンに感受
性であるが、そのｐｉｃＡ遺伝子を有するベクターで形
質転換すると、そのＳ、グリセオフスカスは５０μｇ／
ｕＱまでのタイロシンレベルに耐えることができる。こ
の形質転換細胞を〜０１−〜１０μｇ／ｍ（ｌピクロマ
イシンで前もって処理すると、５００μｇ／＋Ｃまでの
タイロシンに耐性を示すよう誘導することができる。さ
らに、このような誘導は、低濃度のエリスロマイシンお
よびロサロマイシンの存在下でも起こる。種々のａ＝
＋９および耐性パターンを第１１表および第１２表に示
す。スｉ・レブトマイセス種を選択するための好ましい
ビクロマイシン濃度は、当業界周知の操作法によって容
易に決定される。本発明の態様はすへて有用であるが、
好ましいベクターおよび形質転換体かいくつかある。即
ち、ストレプトマイセス・グリセオフスカスが、好まし
いプラスミドｐＯＪ３２１、ｐＦＪ３７０およびｐＦＪ
３７１にとって好ましい宿主である。
本発明の組換えＤＮＡベクターは広範に利用でき、スト
レプトマイセスおよび近縁微生物に使用できる適当なり
ローニングビヒクルの必要性を充たすのに役立つ。さら
に詳細には、本発明のベクターは、組換えＤＮＡ含有ス
トレプトマイセス宿主を選択するための手段として使用
される。このことは、ピクロマイシン感受性の、好まし
くは制限性を欠いたストレプトマイセス宿主を例えばｐ
ＦＪ３７０などのいずれかの本発明ベクターで形質転換
し、得られた形質転換細胞をピクロマイノン１ＷｉＪ性
または他のマタロライド耐性について選択するのに適し
た条件下で培養することによって実施される。さらに、
本発明ベクターがピクロマイシン耐性を付与できること
により、形質転換体を選択するのに機能的な手段か提供
される。このことは、ベクターＤＮＡを獲得した明々の
細胞を決定、選択するこ七が実際上必須であるのて重要
である。また、存在を調べるための機能試験のない付加
的なりＮＡ上セグメント、それを本発明のベクターに挿
入し、次いでこの選択できないＤＮＡを含有する形質転
換体をピクロマイシンによって選択すれば、単離するこ
とができる。このような選択できないＤＮＡセグメント
は、プラスミドが機能し、’ｆＨ’Ｊするのに必要な領
域内、またはピクロマイシン耐性付与遺伝子の内部でな
ければ、いずれの部位に挿入してもよく、このようなセ
グメントの例としては抗生物質（龜飾酵素を特定する遺
（公子、およびすへてのタイプの調節遺１云子か挙げら
れるか、これらに限定されない。
レプトマイセスおよび近縁微生物に使用できる適当なり
ローニングビヒクルの必要性を充たすのに役立つ。さら
に詳細には、本発明のベクターは、組換えＤＮＡ含有ス
トレプトマイセス宿主を選択するための手段として使用
される。このことは、ピクロマイシン感受性の、好まし
くは制限性を欠いたストレプトマイセス宿主を例えばｐ
ＦＪ３７０などのいずれかの本発明ベクターで形質転換
し、得られた形質転換細胞をピクロマイノン１ＷｉＪ性
または他のマタロライド耐性について選択するのに適し
た条件下で培養することによって実施される。さらに、
本発明ベクターがピクロマイシン耐性を付与できること
により、形質転換体を選択するのに機能的な手段か提供
される。このことは、ベクターＤＮＡを獲得した明々の
細胞を決定、選択するこ七が実際上必須であるのて重要
である。また、存在を調べるための機能試験のない付加
的なりＮＡ上セグメント、それを本発明のベクターに挿
入し、次いでこの選択できないＤＮＡを含有する形質転
換体をピクロマイシンによって選択すれば、単離するこ
とができる。このような選択できないＤＮＡセグメント
は、プラスミドが機能し、’ｆＨ’Ｊするのに必要な領
域内、またはピクロマイシン耐性付与遺伝子の内部でな
ければ、いずれの部位に挿入してもよく、このようなセ
グメントの例としては抗生物質（龜飾酵素を特定する遺
（公子、およびすへてのタイプの調節遺１云子か挙げら
れるか、これらに限定されない。
上述のビクロマインン耐性の機能試験は、個々の抗生物
質耐性付与遺伝子のコントロール因子として働き、かつ
その発現を指令するＤＮＡセグメントの位置を探るのに
も使用される。このようなセグメント、例えばプロモー
ター、アテニュエークー、リプレッサー、インデューサ
ー リホソーム結合部位なとは、ストレプトマイセスお
よび近縁微生物内で他の遺伝子の発現をコントロールす
るのに使用される。
質耐性付与遺伝子のコントロール因子として働き、かつ
その発現を指令するＤＮＡセグメントの位置を探るのに
も使用される。このようなセグメント、例えばプロモー
ター、アテニュエークー、リプレッサー、インデューサ
ー リホソーム結合部位なとは、ストレプトマイセスお
よび近縁微生物内で他の遺伝子の発現をコントロールす
るのに使用される。
本発明のピクロマイシン耐性付与ベクターは、連結され
たＤＮＡセグメントを多くの世代にわたって宿主細胞内
で安定に維持させるのにも有用である。ピクロマイノン
耐性付与ＤＮＡと共有結合し、ストレプトマイセス内で
増殖した上記の遺伝子またはＤＮＡフラグメントは非−
形質転換細胞にとっては毒性レベルのピクロマイシンに
形質転換体を暴露させることにより、維持される。従っ
て、ベクターを喪失した形質転換体、即ら共有結合した
ＤＮＡを喪失した形質転換体は増殖することができず、
培養物から排除される。このように、本発明のベクター
により、目的のＤＮＡ配列が安定（ヒされ、〒［［持さ
れる。
たＤＮＡセグメントを多くの世代にわたって宿主細胞内
で安定に維持させるのにも有用である。ピクロマイノン
耐性付与ＤＮＡと共有結合し、ストレプトマイセス内で
増殖した上記の遺伝子またはＤＮＡフラグメントは非−
形質転換細胞にとっては毒性レベルのピクロマイシンに
形質転換体を暴露させることにより、維持される。従っ
て、ベクターを喪失した形質転換体、即ら共有結合した
ＤＮＡを喪失した形質転換体は増殖することができず、
培養物から排除される。このように、本発明のベクター
により、目的のＤＮＡ配列が安定（ヒされ、〒［［持さ
れる。
本発明のクローニングベクターおよび形質転換体により
、ストレプトマイセスおよびその関連細胞において一般
に産生されている各種の産物の収量を高めるための遺伝
子のクローニングを可能にするビヒクルが得られる。こ
のような産物の例としては、ストレプトマイシン、タイ
ロシン、セファロスポリン類、アクタプラニン、ナラジ
ン、モネンシン、トフラマイシン、エリスロマイシンナ
トが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はさ
らに、例えばヒトインスリン、ヒトプロインスリン、グ
ルカコン、インターフェロン、なとの商業的に重要なタ
ンパク質、商業的に重要な反応および化合物を導く代謝
経路の酵素機能、または遺伝子発現を改善するコントロ
ール因子をコードしているＤＮＡ配列をクローニングし
、特性化し、そして再構築するのに有用な選択可能なベ
クターをも提供するものである。これら所望のＤＮＡ配
列にはさらに、誘導抗生物質、例えばストレプトマイシ
ン、セファロスポリン、タイロシン、アクタプラニン、
ナラジン、モ不ン／ン、およびエリスロマイシンなとの
誘導体の合成を触媒する酵素、または抗生物質もしくは
他の産物の生物学的産生を仲介し、増大させる酵素をコ
ードしているＤＮＡが挙げられるか、これらに限定され
ない。このようなりＮＡ上セグメント単離し、使用する
ことが可能となることにより、ストレプトマイセスおよ
び関連微生物から産生される抗生物質の収量および利用
性が増大される。
、ストレプトマイセスおよびその関連細胞において一般
に産生されている各種の産物の収量を高めるための遺伝
子のクローニングを可能にするビヒクルが得られる。こ
のような産物の例としては、ストレプトマイシン、タイ
ロシン、セファロスポリン類、アクタプラニン、ナラジ
ン、モネンシン、トフラマイシン、エリスロマイシンナ
トが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はさ
らに、例えばヒトインスリン、ヒトプロインスリン、グ
ルカコン、インターフェロン、なとの商業的に重要なタ
ンパク質、商業的に重要な反応および化合物を導く代謝
経路の酵素機能、または遺伝子発現を改善するコントロ
ール因子をコードしているＤＮＡ配列をクローニングし
、特性化し、そして再構築するのに有用な選択可能なベ
クターをも提供するものである。これら所望のＤＮＡ配
列にはさらに、誘導抗生物質、例えばストレプトマイシ
ン、セファロスポリン、タイロシン、アクタプラニン、
ナラジン、モ不ン／ン、およびエリスロマイシンなとの
誘導体の合成を触媒する酵素、または抗生物質もしくは
他の産物の生物学的産生を仲介し、増大させる酵素をコ
ードしているＤＮＡが挙げられるか、これらに限定され
ない。このようなりＮＡ上セグメント単離し、使用する
ことが可能となることにより、ストレプトマイセスおよ
び関連微生物から産生される抗生物質の収量および利用
性が増大される。
ストレプトマイセスは、各種の異なる培地のいずれかを
使用し、多くの方法で培養することかできる。培養培地
中に存在させるのに好ましい炭水化物供給源は、例えば
糖蜜、グルコース、デキストリン、およびグリセロール
である。窒素供給源は、例えば大豆粉末、アミノ酸混合
物、およびペプトン類である。栄養性無機塩類も加えら
れ、これにはナトリウム、カリウム、アンモニウム、カ
ルンウム、リン酸、塩素、硫酸、などのイオンを生成す
ることのできる通例の塩類などが挙げられる。池の微生
物が発育、成長するために必要であるように、必須微量
元素も加える。このような微量元素は、通常、培地に他
の構成成分を添加する時に一緒に、不純物として供給さ
れる。
使用し、多くの方法で培養することかできる。培養培地
中に存在させるのに好ましい炭水化物供給源は、例えば
糖蜜、グルコース、デキストリン、およびグリセロール
である。窒素供給源は、例えば大豆粉末、アミノ酸混合
物、およびペプトン類である。栄養性無機塩類も加えら
れ、これにはナトリウム、カリウム、アンモニウム、カ
ルンウム、リン酸、塩素、硫酸、などのイオンを生成す
ることのできる通例の塩類などが挙げられる。池の微生
物が発育、成長するために必要であるように、必須微量
元素も加える。このような微量元素は、通常、培地に他
の構成成分を添加する時に一緒に、不純物として供給さ
れる。
ストレプトマイセスは、温度約１５℃から４０°Ｃの範
囲、ｐＨ約５から９の比較的広いｐ［（域で好気的条件
下に発育することができる。プラスミドの安定性および
維持のためには、ｐＨ約７．２の培養培地から始め、培
養温度を約３０°Ｃに維持することか望ましい。
囲、ｐＨ約５から９の比較的広いｐ［（域で好気的条件
下に発育することができる。プラスミドの安定性および
維持のためには、ｐＨ約７．２の培養培地から始め、培
養温度を約３０°Ｃに維持することか望ましい。
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。
但し、本発明の範囲は、以下に記載の実晦例のいずれに
よっても限定されない。例えば試薬若しくは装置の供給
元は便宜的に示したにすぎず、本発明を限定するもので
はない。尚、本発明を構築するための説明および実際の
操作法を共に適宜記載する。
よっても限定されない。例えば試薬若しくは装置の供給
元は便宜的に示したにすぎず、本発明を限定するもので
はない。尚、本発明を構築するための説明および実際の
操作法を共に適宜記載する。
実施例１
７０２の培養
プラスミドｐ ｌ Ｊ ７０２は、米国特許筒４，６６
６．８４６号に開示されている。ストレプトマイセス・
リビダンス／ｐ Ｉ Ｊ ７０２ （ＮＲＲＬ３９１５
５）の胞子約１０’個を、２５μｇ／ｕｃチオストレプ
トンを含有するＴＳＢ培地（トリフチカーゼ大豆ブロス
”）ｌＯｚ（！中に接種し、２９°Ｃて通気下、初期定
常期に到達するまで培養した。
６．８４６号に開示されている。ストレプトマイセス・
リビダンス／ｐ Ｉ Ｊ ７０２ （ＮＲＲＬ３９１５
５）の胞子約１０’個を、２５μｇ／ｕｃチオストレプ
トンを含有するＴＳＢ培地（トリフチカーゼ大豆ブロス
”）ｌＯｚ（！中に接種し、２９°Ｃて通気下、初期定
常期に到達するまで培養した。
次いて、この培養物をホモジナイズし、そのホモジナイ
ズした培養物５Ｈｒ２を使用して、これもチオストレプ
トンを含有するＴＳＢ１００１？Ｃに接種した。ストレ
プトマイセス・リビダンス／ｐＩＪ７０２細胞が定常期
に達するまで、得られた培養物１００ａＱを２９°Ｃに
おいて通気下にインキュベートした。
ズした培養物５Ｈｒ２を使用して、これもチオストレプ
トンを含有するＴＳＢ１００１？Ｃに接種した。ストレ
プトマイセス・リビダンス／ｐＩＪ７０２細胞が定常期
に達するまで、得られた培養物１００ａＱを２９°Ｃに
おいて通気下にインキュベートした。
注）” ： Ｔ Ｓ Ｂ （Ｔｒｙｐｒｉｃａｓｅ Ｓ
ｏｙ Ｂｒｏｔｈ）は３０ｇ／Ｑに調製した。これはホ
ルチモア・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｂａｌｔ
ｉｍｏｒｅ １３ｉｏ１ｏｇｉｃａｌ ＬａｂｏｒａＬ
ｏｒｉｅｓＸＰ、Ｏボックス２４３、コツキスビル、メ
リーランド２１０３１）（Ｂ１３Ｌ）から人手した。
ｏｙ Ｂｒｏｔｈ）は３０ｇ／Ｑに調製した。これはホ
ルチモア・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｂａｌｔ
ｉｍｏｒｅ １３ｉｏ１ｏｇｉｃａｌ ＬａｂｏｒａＬ
ｏｒｉｅｓＸＰ、Ｏボックス２４３、コツキスビル、メ
リーランド２１０３１）（Ｂ１３Ｌ）から人手した。
Ｂ、プラスミドの単離
細胞を採取し、これをｌ０８３％ショ糖溶液で１回洗浄
した。次いで、得られた細胞を１０．３％ショ糖２４
Ｍ（ｌ中に懸濁し、５×リゾチーム溶液（１２５ｍＭ）
リス／ＨＣ（！ｐＨ８，１２５ｍＭ Ｎａ２Ｅ ＤＴ
Ａ ｐ Ｈ８： １０ｊ１ｇ／肩Ｃリゾチーム、およ
び１０．３％ショ糖）６ｍ１２を加えた。得られた溶液
を混合し、３０°Ｃで３０−６０分間インキュベートし
、次いで前もって５０°Ｃに加熱しておいた０、３Ｍ水
酸化ナトリウム、１％ＳＤＳの溶液約１８ｄを加え、混
合し、得られた混合物を８０°Ｃで１０分間インキュベ
ートした。次いで、この混合物を室温にまで冷却し、フ
ェノール５００ｇおよび水２００ｆｆ１２中クロロホル
ム５００ｇを混合して調製した溶液１２ｉ（！を加え、
細胞抽出物と共に十分に混合した。６０００−８０００
ｒｐｍで１０分間遠心することによって層を分離し、
得られた上層約４５ｍρをきれいなボトルに移した。
した。次いで、得られた細胞を１０．３％ショ糖２４
Ｍ（ｌ中に懸濁し、５×リゾチーム溶液（１２５ｍＭ）
リス／ＨＣ（！ｐＨ８，１２５ｍＭ Ｎａ２Ｅ ＤＴ
Ａ ｐ Ｈ８： １０ｊ１ｇ／肩Ｃリゾチーム、およ
び１０．３％ショ糖）６ｍ１２を加えた。得られた溶液
を混合し、３０°Ｃで３０−６０分間インキュベートし
、次いで前もって５０°Ｃに加熱しておいた０、３Ｍ水
酸化ナトリウム、１％ＳＤＳの溶液約１８ｄを加え、混
合し、得られた混合物を８０°Ｃで１０分間インキュベ
ートした。次いで、この混合物を室温にまで冷却し、フ
ェノール５００ｇおよび水２００ｆｆ１２中クロロホル
ム５００ｇを混合して調製した溶液１２ｉ（！を加え、
細胞抽出物と共に十分に混合した。６０００−８０００
ｒｐｍで１０分間遠心することによって層を分離し、
得られた上層約４５ｍρをきれいなボトルに移した。
次ぎに、３Ｍ酢酸ナトリウム４５ｍ（！およびイソプロ
パツール５０ｆｆ１２をこの上清に加え、得られた溶液
を混合し、室温に３０分間放置した。
パツール５０ｆｆ１２をこの上清に加え、得られた溶液
を混合し、室温に３０分間放置した。
次いで、この溶液を遠心（８０００ｒｐｍ、３０分間）
し、上清を捨てた。得られたベレットを、Ｃ５ｃＱ９．
５ｇを含有するｒＥｌ衝液（ｌｏｍＭ トリス／ＨＣ
ρｐ Ｈ８、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍＱ中に再
懸濁した。５ｍｇ／ｉＱの臭化エチジウム溶液約１１Ｃ
を上記の溶液に加え、最終容量１２．５ｍｆ！とした。
し、上清を捨てた。得られたベレットを、Ｃ５ｃＱ９．
５ｇを含有するｒＥｌ衝液（ｌｏｍＭ トリス／ＨＣ
ρｐ Ｈ８、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍＱ中に再
懸濁した。５ｍｇ／ｉＱの臭化エチジウム溶液約１１Ｃ
を上記の溶液に加え、最終容量１２．５ｍｆ！とした。
次いで、得られた溶液を５２００Ｏｒｐｍ、２０℃で４
８時間遠心した（定角度ローター（ｒｉｘｅｄ−ａｎｇ
ｌｅ ｒｏｔｏｒ）を備えたベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）Ｔ ｉ−７５を使用）。プラスミドバンドを含有・
したフラクションを、２０ｘＳＳＣ（０，３ＭＮａ（Ｊ
！および０．３Ｍ クエン酸ナトリウム）で飽和させた
イソプロパツールで５回抽出し、臭化エチジウムを除去
した。抽出後、試料を１０００容量の水に対して透析し
、次ぎに１５００容量のＴＥ緩衝液に対して透析した。
８時間遠心した（定角度ローター（ｒｉｘｅｄ−ａｎｇ
ｌｅ ｒｏｔｏｒ）を備えたベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）Ｔ ｉ−７５を使用）。プラスミドバンドを含有・
したフラクションを、２０ｘＳＳＣ（０，３ＭＮａ（Ｊ
！および０．３Ｍ クエン酸ナトリウム）で飽和させた
イソプロパツールで５回抽出し、臭化エチジウムを除去
した。抽出後、試料を１０００容量の水に対して透析し
、次ぎに１５００容量のＴＥ緩衝液に対して透析した。
上記の操作により、濃度〜０．２μｇ／μρでプラスミ
ドｐｌＪ７０２ ＤＮＡ１００μｇを得、それを４°
Ｃｃ（８’＃し実施例ａ プラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１のＭ箪 Ａ、プラスミドｐＯＪ １６０の単離 プラスミドｐＯＪ １６０は、ノーザン・レジオナル・
リサーチ・センターの受託番号ＮＲＲＬＩ３−１８０８
８のＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０９から人手てきる
。Ｅ、ｃｏｌｉ ＫＬ２ ＪＭ１０９／ｐＯＪ １６
０の凍結乾燥品を、２００ｔｔｇ／ｍＱアブラマイシン
を含有したし一寒天平板（１リツトル当たり、バンド（
Ｂａｃｔｏ） −トリプトン１０ｇ１Ｎａ（１２１０ｇ
、バンド−酵母エキス５ｇ、および寒天１５ｇを含有）
によってプレート（平板培養）し、その菌株の単一コロ
ニー分離体を得た。
ドｐｌＪ７０２ ＤＮＡ１００μｇを得、それを４°
Ｃｃ（８’＃し実施例ａ プラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１のＭ箪 Ａ、プラスミドｐＯＪ １６０の単離 プラスミドｐＯＪ １６０は、ノーザン・レジオナル・
リサーチ・センターの受託番号ＮＲＲＬＩ３−１８０８
８のＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０９から人手てきる
。Ｅ、ｃｏｌｉ ＫＬ２ ＪＭ１０９／ｐＯＪ １６
０の凍結乾燥品を、２００ｔｔｇ／ｍＱアブラマイシン
を含有したし一寒天平板（１リツトル当たり、バンド（
Ｂａｃｔｏ） −トリプトン１０ｇ１Ｎａ（１２１０ｇ
、バンド−酵母エキス５ｇ、および寒天１５ｇを含有）
によってプレート（平板培養）し、その菌株の単一コロ
ニー分離体を得た。
このコロニーを、２００μｇ／、ｗ１２アブラマイシン
を含有するしブロス（寒天を除いたし一寒天）約５００
、ｗ（ｌに接種し、細胞が定常期に達するまで、この
培養物を通気下、３７°Ｃでインキュベートした。
を含有するしブロス（寒天を除いたし一寒天）約５００
、ｗ（ｌに接種し、細胞が定常期に達するまで、この
培養物を通気下、３７°Ｃでインキュベートした。
これらの細胞からプラスミドＤＮＡを得、以下に記載の
操作法に従い、プラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３
７１の構築に使用した。この操作法は、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 １９８２ ［
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）］の改変法である。
操作法に従い、プラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３
７１の構築に使用した。この操作法は、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 １９８２ ［
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）］の改変法である。
これと同じ操作法であるが、これよりも小規模で、１５
リフエノール抽出の後にクロロホルム抽出スる代わりに
超遠心分離を行う操作法により、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２
２９４／ｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１形質転換体の
同定に使用するプラスミドＤＮＡを調製した。
リフエノール抽出の後にクロロホルム抽出スる代わりに
超遠心分離を行う操作法により、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２
２９４／ｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１形質転換体の
同定に使用するプラスミドＤＮＡを調製した。
４°Ｃの４０００ｘ９．１０分間の遠心によッテ定常期
のＥ、ｃｏｌｉ／ｐ ＯＪ ｌ ６０細胞約５００ｆｆ
Ｃを収穫し、上清を捨てた。得られた細胞ペレットを氷
冷ＳＴＥ緩衝液（０，ＩＭ ＮａＣρ、１０ｍＭトリス
ＨＣＱ （ｐＨ７，８）および１ｍＭＥＤＴＡ）１００
ｉ１２で洗浄した。細胞ペレットを洗浄した後、このペ
レットを、５ｍｇ／ｐＱ、リゾチームを含む溶液１（５
０ｍＭグルコース、２５ｍＭｈリスＨＣＩ）ｐＨ＝８．
０および１０ｍＭＥＤＴＡ）に再懸ン局し、室温に１０
分間放置した。次いで、このリゾチーム処理細胞に、溶
液Ｉｆ （０，２Ｎ ＮａＯＨおよび１％５Ｄｓ）２０
１１Ｑ を加ｔ、得うした溶液を反転法によって穏やか
に混合した。この混合物を水上で１０分間インキュベー
トした。
のＥ、ｃｏｌｉ／ｐ ＯＪ ｌ ６０細胞約５００ｆｆ
Ｃを収穫し、上清を捨てた。得られた細胞ペレットを氷
冷ＳＴＥ緩衝液（０，ＩＭ ＮａＣρ、１０ｍＭトリス
ＨＣＱ （ｐＨ７，８）および１ｍＭＥＤＴＡ）１００
ｉ１２で洗浄した。細胞ペレットを洗浄した後、このペ
レットを、５ｍｇ／ｐＱ、リゾチームを含む溶液１（５
０ｍＭグルコース、２５ｍＭｈリスＨＣＩ）ｐＨ＝８．
０および１０ｍＭＥＤＴＡ）に再懸ン局し、室温に１０
分間放置した。次いで、このリゾチーム処理細胞に、溶
液Ｉｆ （０，２Ｎ ＮａＯＨおよび１％５Ｄｓ）２０
１１Ｑ を加ｔ、得うした溶液を反転法によって穏やか
に混合した。この混合物を水上で１０分間インキュベー
トした。
細胞溶解された細胞の混合物に、水冷した３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ＝４．８）１５ｖ（！を加え、得られた溶
液を反転法によって混合した。この溶液を水上で６０分
間インキュベートした。この３Ｍ酢酸ナト：功ム溶液は
、３Ｍ酢酸と３Ｍ酢酸ナトリウムとを等量混合すること
によって調製される。
リウム（ｐＨ＝４．８）１５ｖ（！を加え、得られた溶
液を反転法によって混合した。この溶液を水上で６０分
間インキュベートした。この３Ｍ酢酸ナト：功ム溶液は
、３Ｍ酢酸と３Ｍ酢酸ナトリウムとを等量混合すること
によって調製される。
得られた溶解細胞混合物を、ベックマン５Ｗ２７０−タ
ー（またはそれと同等の装置）を使用して４°Ｃに於け
る２ ０ 、 ＯＯＯｒｐｍ、 ２０分間の遠心分離に
かける。上清約３６ｍＱを回収し、エタノール２．５容
量を加え、混合し、得られた溶液を水上に１５分間放置
した。室温、１２，０ＯＯＸ？、３０分間の遠心分離に
よってプラスミドＤＮＡを採取した。上清を捨て、室温
にて、ＤＮＡペレ、トを７０％エタノールで洗浄した。
ー（またはそれと同等の装置）を使用して４°Ｃに於け
る２ ０ 、 ＯＯＯｒｐｍ、 ２０分間の遠心分離に
かける。上清約３６ｍＱを回収し、エタノール２．５容
量を加え、混合し、得られた溶液を水上に１５分間放置
した。室温、１２，０ＯＯＸ？、３０分間の遠心分離に
よってプラスミドＤＮＡを採取した。上清を捨て、室温
にて、ＤＮＡペレ、トを７０％エタノールで洗浄した。
エタノール洗浄液をデカントし、得られたペレットを減
圧デシケータ−中で乾燥した。次いで、このペレットを
ＴＥ緩衝液８１１（ｌに再懸濁した。
圧デシケータ−中で乾燥した。次いで、このペレットを
ＴＥ緩衝液８１１（ｌに再懸濁した。
このＤＮＡＹａ液にＣｓＣ０８ｇを加えた。１１０ｆｆ
／ｍＱの臭化エチジウム水溶成約０゜８ｍ（ｌをＣｓＣ
ｄ−ＤＮＡ溶液１０ｆｆｆ２に対して各々加える。この
溶液の最終密度は約１．５５ｇ／ｘＱであり、臭化エチ
ジウムの濃度は約８００μｇ／ｘρであった。この溶液
をベックマン５０型遠心管に移し、１．５５ｇ／ｚ１２
のＣ５（Ｊｊを含有したＴＥ緩衝液でその上端まで満た
し、栓をして２０°Ｃ５４５０００ｒｐｍで２４時間遠
心した。遠心した後、常光下でＤＮＡの２つのバンド（
帯）が観察され、これらはＵ■光線下でより顕著になっ
た。遠心管からキャップを取り外し、＃２１皮下注射針
を付けた注射器を遠心管の側面から挿入し、下方のＤＮ
Ａバントを回収した。
／ｍＱの臭化エチジウム水溶成約０゜８ｍ（ｌをＣｓＣ
ｄ−ＤＮＡ溶液１０ｆｆｆ２に対して各々加える。この
溶液の最終密度は約１．５５ｇ／ｘＱであり、臭化エチ
ジウムの濃度は約８００μｇ／ｘρであった。この溶液
をベックマン５０型遠心管に移し、１．５５ｇ／ｚ１２
のＣ５（Ｊｊを含有したＴＥ緩衝液でその上端まで満た
し、栓をして２０°Ｃ５４５０００ｒｐｍで２４時間遠
心した。遠心した後、常光下でＤＮＡの２つのバンド（
帯）が観察され、これらはＵ■光線下でより顕著になっ
た。遠心管からキャップを取り外し、＃２１皮下注射針
を付けた注射器を遠心管の側面から挿入し、下方のＤＮ
Ａバントを回収した。
プラスミドＤＮＡの溶液を水飽和ｌ−ブタノールで数回
抽出することで臭化エチジウムを除去し、さらにＴＥ緩
衝液に対して透析することによってＣｓＣσを除去した
。緩衝化フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで抽
出した後、７０％エタノールでＤＮＡを沈澱させ、エタ
ノールで洗浄し、乾燥した。この操作により、プラスミ
ドｐｏｌ１６０ＤＮＡ約０．５ｍｇを得ることができた
。
抽出することで臭化エチジウムを除去し、さらにＴＥ緩
衝液に対して透析することによってＣｓＣσを除去した
。緩衝化フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで抽
出した後、７０％エタノールでＤＮＡを沈澱させ、エタ
ノールで洗浄し、乾燥した。この操作により、プラスミ
ドｐｏｌ１６０ＤＮＡ約０．５ｍｇを得ることができた
。
実施例２Ａの教示に実質的にしたがって、プラスミドｐ
ＯＪ３２１をＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭＩＯ９／ｐ
ＯＪ３２１から単離した。５．ｃｏｌｉ Ｋ ｌ ２Ｊ
Ｍ１０９／ｐＯＪ ３２１の培養物は、ナショナル・リ
ージオナル・リサーチ・ラボラトリ−（イノノイス、ペ
オリア）に受託番号ＮＲＲＬ Ｂ１８３８９の下で寄
託されている。プラスミドｐＯＪ ３２１の制限部位お
よび機能地図を添付の第１図に示す。
ＯＪ３２１をＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭＩＯ９／ｐ
ＯＪ３２１から単離した。５．ｃｏｌｉ Ｋ ｌ ２Ｊ
Ｍ１０９／ｐＯＪ ３２１の培養物は、ナショナル・リ
ージオナル・リサーチ・ラボラトリ−（イノノイス、ペ
オリア）に受託番号ＮＲＲＬ Ｂ１８３８９の下で寄
託されている。プラスミドｐＯＪ ３２１の制限部位お
よび機能地図を添付の第１図に示す。
プラスミドＩ）ＯＪ ３２１ＤＮＡ約１０μｇ（１０μ
のを、１０ｘＰｖｕｌ１ｍ衝液（１００ｍＭ トリス
／１ｉＣ１２，ｐＨ８，０： ０．５Ｍ ＮａＣＱ：お
よび１００ｍＭ ＭｇＣ（！−） ２ ｕ（１、水７μ
Ｑ、および制限酵素ＰｖｕＩＩｌμＱ（〜１５単位：本
明細書では、「単位」は特に断らない限り、ニュー・イ
ングランド・バイオラプス（ＭＡ ０１９１５−９９９
０ベベリー トラニー・ロー１’Ｆ２番）の規定に対応
している）に加えた。得られた反応物を３７°Ｃで２時
間インキュベートした。この反応混合物をフェノール
クロロホルム（１・１）の溶液１００μρで抽出し、次
ぎにクロロホルム１００μｇで抽出した。反応混合物の
酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）濃度を０．３０Ｍに調節
し、エタノール２．５容量を加え、−７０℃に冷却し、
そして遠心して沈澱したＤＮＡをペレット化し、Ｐｖｕ
ｌｌ消化ＤＮＡを採取した。このＰｖｕｌＩ消化プラス
ミドｐＯＪ ３２ ＬＤＮＡを水１μＱに再１ｕ濁した
。
のを、１０ｘＰｖｕｌ１ｍ衝液（１００ｍＭ トリス
／１ｉＣ１２，ｐＨ８，０： ０．５Ｍ ＮａＣＱ：お
よび１００ｍＭ ＭｇＣ（！−） ２ ｕ（１、水７μ
Ｑ、および制限酵素ＰｖｕＩＩｌμＱ（〜１５単位：本
明細書では、「単位」は特に断らない限り、ニュー・イ
ングランド・バイオラプス（ＭＡ ０１９１５−９９９
０ベベリー トラニー・ロー１’Ｆ２番）の規定に対応
している）に加えた。得られた反応物を３７°Ｃで２時
間インキュベートした。この反応混合物をフェノール
クロロホルム（１・１）の溶液１００μρで抽出し、次
ぎにクロロホルム１００μｇで抽出した。反応混合物の
酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）濃度を０．３０Ｍに調節
し、エタノール２．５容量を加え、−７０℃に冷却し、
そして遠心して沈澱したＤＮＡをペレット化し、Ｐｖｕ
ｌｌ消化ＤＮＡを採取した。このＰｖｕｌＩ消化プラス
ミドｐＯＪ ３２ ＬＤＮＡを水１μＱに再１ｕ濁した
。
ＴＥ緩衝ｔ＆、１００μρ中、プラスミドｐＯＪ１６０
約１０μｇを、１ＯＸＰｖｕＩｌ緩衝液１３ ｕ ｔ）
、、水１３ｕＱ、および制限酵素Ｐｖｕｌｌ ４ ｔ
ｔ（１（〜６Ｏ単位）に加えた。得られた反応物を３７
°Ｃで５分間インキュベートした。これにより、プラス
ミドが制限酵素ＰｖｕＩＩで部分消化された。この反応
混合物は、切断されていないプラスミドｐＯＪ１６０、
完全に消化されたプラスミドｐＯＪ １６０、および４
つのＰｖｕ１１部位のうち唯１つ、２つまたは３つのＰ
ｖｕ１１部位が開裂されたプラスミドｐＯＪ１６０を含
有していた。既述のように、この反応混合物を抽出し、
ＤＮＡを沈澱させた。次いで、得られたＤＮＡを再び水
に溶解し、これに１０×ＢＡＰ緩衝液（０，５Ｍ ）
リス／ｌ（Ｃρｐ）１８０．０．５Ｍ ＮａＣ１２）２
０１１Ｑ、およびＩＩＩＩ菌性アルカリフォスファター
ゼ（ＢＡＰ、２４μ／！（りを加えた。７０°Ｃに１時
間放置し、脱リン酸させた。既述のように、得られたＤ
Ｎ Ａを抽出し、沈、機させ、水１０μＱに再懸濁し
た。
約１０μｇを、１ＯＸＰｖｕＩｌ緩衝液１３ ｕ ｔ）
、、水１３ｕＱ、および制限酵素Ｐｖｕｌｌ ４ ｔ
ｔ（１（〜６Ｏ単位）に加えた。得られた反応物を３７
°Ｃで５分間インキュベートした。これにより、プラス
ミドが制限酵素ＰｖｕＩＩで部分消化された。この反応
混合物は、切断されていないプラスミドｐＯＪ１６０、
完全に消化されたプラスミドｐＯＪ １６０、および４
つのＰｖｕ１１部位のうち唯１つ、２つまたは３つのＰ
ｖｕ１１部位が開裂されたプラスミドｐＯＪ１６０を含
有していた。既述のように、この反応混合物を抽出し、
ＤＮＡを沈澱させた。次いで、得られたＤＮＡを再び水
に溶解し、これに１０×ＢＡＰ緩衝液（０，５Ｍ ）
リス／ｌ（Ｃρｐ）１８０．０．５Ｍ ＮａＣ１２）２
０１１Ｑ、およびＩＩＩＩ菌性アルカリフォスファター
ゼ（ＢＡＰ、２４μ／！（りを加えた。７０°Ｃに１時
間放置し、脱リン酸させた。既述のように、得られたＤ
Ｎ Ａを抽出し、沈、機させ、水１０μＱに再懸濁し
た。
次に、ＰｖｕＩＩ消化プラスミドｐＯＪ３２１ＤＮＡを
１％アカロースゲルの電気泳動に洪し、所望の〜２．８
ｋｂ Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントを他の消化生成物か
ら明確に分離した。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（
０，５μｇ／ｍ（１’）で染色し、染色したゲルに長波
長ＵＶ光を照射することで、電気泳動にかけたＤＮＡを
観察した。所望のフラグメントの位置を確認した後、そ
のケル上において、フラグメントの前に小スリットを製
し、ンユレイン＋ −（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）および
ジュール（Ｓｃｈｕｅｌ ｌ）［Ｋｅｅｎｅ、 Ｎｌｌ
０３４３１］Ｎ Ａ −４５Ｄ Ｅ Ａ Ｅ膜の小片
をそのスリｙｈ中に入れた。さらに電気泳動を行い、〜
２．８ｋｂ Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントをそのＤＥＡ
Ｅ膜に非共有結合的に結合させた。所望のフラグメント
がＤＥＡＥ膜に結合したら、その膜を取り出し、低塩緩
ｗｒ液（１５０ｍＭ ＮａＣ（、Ｏ，１ｍＭＥＤＴＡ、
および２０ｍＭ トリス／ＨＣｉ！ｐＨ８）で洗浄した
。次に、この膜を小試験管中に入れ、高鳴緩衝液（ＩＭ
ＮａＣ（！、０．１ｍＭ ＥＤＴＡｌおよび２０ｍＭ
トリス／ＨＣρｐＨ８）に浸漬させた後、６５°Ｃ
で１時間インキュベートし、ＤＥＡＥ紙からＤＮＡを溶
出させた。６５°Ｃてインキュベートした後、インキュ
ベ−１・緩衝液を捕集し、高鳴緩衝液で膜を洗浄した。
１％アカロースゲルの電気泳動に洪し、所望の〜２．８
ｋｂ Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントを他の消化生成物か
ら明確に分離した。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（
０，５μｇ／ｍ（１’）で染色し、染色したゲルに長波
長ＵＶ光を照射することで、電気泳動にかけたＤＮＡを
観察した。所望のフラグメントの位置を確認した後、そ
のケル上において、フラグメントの前に小スリットを製
し、ンユレイン＋ −（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）および
ジュール（Ｓｃｈｕｅｌ ｌ）［Ｋｅｅｎｅ、 Ｎｌｌ
０３４３１］Ｎ Ａ −４５Ｄ Ｅ Ａ Ｅ膜の小片
をそのスリｙｈ中に入れた。さらに電気泳動を行い、〜
２．８ｋｂ Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントをそのＤＥＡ
Ｅ膜に非共有結合的に結合させた。所望のフラグメント
がＤＥＡＥ膜に結合したら、その膜を取り出し、低塩緩
ｗｒ液（１５０ｍＭ ＮａＣ（、Ｏ，１ｍＭＥＤＴＡ、
および２０ｍＭ トリス／ＨＣｉ！ｐＨ８）で洗浄した
。次に、この膜を小試験管中に入れ、高鳴緩衝液（ＩＭ
ＮａＣ（！、０．１ｍＭ ＥＤＴＡｌおよび２０ｍＭ
トリス／ＨＣρｐＨ８）に浸漬させた後、６５°Ｃ
で１時間インキュベートし、ＤＥＡＥ紙からＤＮＡを溶
出させた。６５°Ｃてインキュベートした後、インキュ
ベ−１・緩衝液を捕集し、高鳴緩衝液で膜を洗浄した。
所望のＤ Ｎ Ａフラグメントを採取する前に、その洗
液とインキュへ−１・緩神ｉ液とを一緒にした。
液とインキュへ−１・緩神ｉ液とを一緒にした。
その高鳴ＤＮＡ溶液に冷無水エタノール約３容量を加え
た。得られたｊｇ液を混合し、水上にｌ０＝２０分放置
した後、１５．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心した。再度
沈澱させて残った塩を除去した後、得られたＤＮＡペレ
、トをエタ／−ルて洗浄し、乾燥し、ＴＥｖ：衝液５０
μｇに再懸濁した。
た。得られたｊｇ液を混合し、水上にｌ０＝２０分放置
した後、１５．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心した。再度
沈澱させて残った塩を除去した後、得られたＤＮＡペレ
、トをエタ／−ルて洗浄し、乾燥し、ＴＥｖ：衝液５０
μｇに再懸濁した。
同様にして、プラスミドｐＯＪ１６０の部分消化Ｐｖｕ
［Ｉフラグメントを電気泳動にかけ、得られた線状化Ｄ
ＮＡを単離、精製した。この線状化ＤＮＡは、プラスミ
ドｐＯＪ１６０において可能な４つのＰｖｕｌＩ部位の
うちの１部位のみが開裂され、プラスミドに対応してい
た。次いて、その精製された線状化、部分消化プラスミ
ドｐＯＪ １６０をＴＥ緩衝液５０μＱに再懸濁した。
［Ｉフラグメントを電気泳動にかけ、得られた線状化Ｄ
ＮＡを単離、精製した。この線状化ＤＮＡは、プラスミ
ドｐＯＪ１６０において可能な４つのＰｖｕｌＩ部位の
うちの１部位のみが開裂され、プラスミドに対応してい
た。次いて、その精製された線状化、部分消化プラスミ
ドｐＯＪ １６０をＴＥ緩衝液５０μＱに再懸濁した。
得られたＰｖｕＴ１部分消化プラスミドｐＯＪ １６０
ＤＮＡ （１μＱ）をプラスミドｐＯＪ３２１の〜２．
８ｋｂのｐｉｃＡ含有Ｐｖｕｉｌ制限フラグメント１０
μＱ（〜０．５μｇ）、ｔＯＸリノＪ−ゼ緩衝液（６６
０ｍＭ トリス／ＨＣρｐ ］（３，６６ｍＭＭｇＣ
Ｌ、ｌｏｎ＋Ｍ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、お
よびＩ ＯｍＭ ＡＴＰ） ２μＱ、および水６μＱに
加えた。′ｒ４ＤＮＡリカーゼ約１μＱ（〜１００単位
）をそのＤＮＡ溶液に加え、得られた反応物を１５°Ｃ
で一晩（〜１６時間）インキュベートした。このライケ
ート反応によって、プラスミドｐＯＪ３２１の〜２．８
ｋｂ ＰｖｕＩＩフラグメントを含有する各種の構築物
および形成物を得た。２つの特別な構築物か、プラスミ
ドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１を構成していた。プ
ラスミｌ’ ｐ ＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１の制限
部位および機能地図を添付の第２図に示す。
ＤＮＡ （１μＱ）をプラスミドｐＯＪ３２１の〜２．
８ｋｂのｐｉｃＡ含有Ｐｖｕｉｌ制限フラグメント１０
μＱ（〜０．５μｇ）、ｔＯＸリノＪ−ゼ緩衝液（６６
０ｍＭ トリス／ＨＣρｐ ］（３，６６ｍＭＭｇＣ
Ｌ、ｌｏｎ＋Ｍ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、お
よびＩ ＯｍＭ ＡＴＰ） ２μＱ、および水６μＱに
加えた。′ｒ４ＤＮＡリカーゼ約１μＱ（〜１００単位
）をそのＤＮＡ溶液に加え、得られた反応物を１５°Ｃ
で一晩（〜１６時間）インキュベートした。このライケ
ート反応によって、プラスミドｐＯＪ３２１の〜２．８
ｋｂ ＰｖｕＩＩフラグメントを含有する各種の構築物
および形成物を得た。２つの特別な構築物か、プラスミ
ドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１を構成していた。プ
ラスミｌ’ ｐ ＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１の制限
部位および機能地図を添付の第２図に示す。
形質転換に感受性を有するＥ、ｃｏｌｉ Ｋ Ｉ ２
２９４細胞を調製するため、ＡＴＣ，Ｃ（受託番号ＡＴ
ＣＣ３１４４６）から入手可能なＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １
２２９４の凍結乾燥品を再構成し、単一のコロニーを単
１ｉｉｌｔ した。２９４の１つの単一コロニー単１η
１［物を、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４およびｌＱｍＭＭｇｃ
Ｑ２を含有した１７ブロス（１リツトル当たり、ハクト
ートリプトンｌＱｇ、ＮａＣ（！ ｌｏｇ、およびバク
トー酵母エキス５ｇ）５ｍ４中に接種し、得られた培養
物を通気下に３７℃で一部インキユベートした。この−
夜培養物５０μＱを、ｌｏｍＭＭｇＳＯ，およびｌ Ｑ
ｍＭ ＭｇＣ１２ｔを含有したしブロスＦｌ１２に接種
した。得られた培養物を通気下に３７°Ｃで一部インキ
ユベートした。翌朝、この培養物を、］ ＯｍＭ Ｍｇ
５Ｏ４およびｌＯｍＭＭｇＣ（１２を含有したしブロス
２００１１１＆まで希釈した。
２９４細胞を調製するため、ＡＴＣ，Ｃ（受託番号ＡＴ
ＣＣ３１４４６）から入手可能なＥ、ｃｏｌｉ Ｋ １
２２９４の凍結乾燥品を再構成し、単一のコロニーを単
１ｉｉｌｔ した。２９４の１つの単一コロニー単１η
１［物を、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４およびｌＱｍＭＭｇｃ
Ｑ２を含有した１７ブロス（１リツトル当たり、ハクト
ートリプトンｌＱｇ、ＮａＣ（！ ｌｏｇ、およびバク
トー酵母エキス５ｇ）５ｍ４中に接種し、得られた培養
物を通気下に３７℃で一部インキユベートした。この−
夜培養物５０μＱを、ｌｏｍＭＭｇＳＯ，およびｌ Ｑ
ｍＭ ＭｇＣ１２ｔを含有したしブロスＦｌ１２に接種
した。得られた培養物を通気下に３７°Ｃで一部インキ
ユベートした。翌朝、この培養物を、］ ＯｍＭ Ｍｇ
５Ｏ４およびｌＯｍＭＭｇＣ（１２を含有したしブロス
２００１１１＆まで希釈した。
この希釈培養物を通気下に３７°Ｃて、５５０ｎｍ（Ａ
５５０）の吸光度が約０．５となるまで（これは細１泡
密度かｌＸ］、ｏ８細胞個／ｍ（ｌであることを示す）
インキュベートした。この培養物を氷水浴中で１０分間
冷却し、次いで遠心（４°Ｃ１４０００Ｘｈ、１０分間
）して細胞を採取した。得られた細胞ベレットを冷１０
ｍＭ ＮａＣＱｌ ００ｍＱに再懸濁した後、素早く遠
心して再度ペレット化した。この細胞ペレットを３０ｍ
Ｍ ＣａＣＬ １００ｍＱに再懸濁し、水上で２０分間
インキュベートした。
５５０）の吸光度が約０．５となるまで（これは細１泡
密度かｌＸ］、ｏ８細胞個／ｍ（ｌであることを示す）
インキュベートした。この培養物を氷水浴中で１０分間
冷却し、次いで遠心（４°Ｃ１４０００Ｘｈ、１０分間
）して細胞を採取した。得られた細胞ベレットを冷１０
ｍＭ ＮａＣＱｌ ００ｍＱに再懸濁した後、素早く遠
心して再度ペレット化した。この細胞ペレットを３０ｍ
Ｍ ＣａＣＬ １００ｍＱに再懸濁し、水上で２０分間
インキュベートした。
遠心によって細胞を再び採取し、３０ｍＭＣａＣ（！、
ｌｏ＋ｆ２に再１ヒ濁した。この細胞標本１．５ｘａを
既述のように調製した、ライケートしたＤＮＡに加えた
。この細胞−ＤＮＡ［合物を水上で１時間インキュベー
トし、４２°Ｃで９０秒間熱処理（ヒートショック）を
行った後、氷上で２分間冷却した。この細胞−Ｄ Ｎ
Ａ ｉ１合物を遠心し、得られた細胞ベレットを１．５
ｗＣ管中のＬブロス０５１１（ｌに再１び濁し、３７°
Ｃで１時間インキュベートした。
ｌｏ＋ｆ２に再１ヒ濁した。この細胞標本１．５ｘａを
既述のように調製した、ライケートしたＤＮＡに加えた
。この細胞−ＤＮＡ［合物を水上で１時間インキュベー
トし、４２°Ｃで９０秒間熱処理（ヒートショック）を
行った後、氷上で２分間冷却した。この細胞−Ｄ Ｎ
Ａ ｉ１合物を遠心し、得られた細胞ベレットを１．５
ｗＣ管中のＬブロス０５１１（ｌに再１び濁し、３７°
Ｃで１時間インキュベートした。
この形質転換混合物の一部を、２００μｇアプラマイン
ン／ｍＱのＬ−寒天（ｌリットル寒天当たり、１５ｇを
Ｌブロスに加える）平板にプレートした。この平板を３
７°Ｃて一部インキュベー１・した。アブラマインン耐
性コロニーを幾つか選択し、次いで〜２．８ｋｂ Ｐｖ
ｕｆｆ制限フラグメントの存在についてこれらプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素分析することによってスクリーニン
グした。既述のプラスミドｐＯＪ １６０ＤＮＡの単離
操作に従って、プラスミドＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ Ｋ
ｌ ２ ２９４ｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１形質転
換体から得た。プラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦ Ｊ
３７１ ＤＮＡを使用すれば、以下の実施例３に記載
のように、ストレプトマイセス・グリセオフスカスＣ５
８１をピクロマイシン耐性に形質転換することかできる
。
ン／ｍＱのＬ−寒天（ｌリットル寒天当たり、１５ｇを
Ｌブロスに加える）平板にプレートした。この平板を３
７°Ｃて一部インキュベー１・した。アブラマインン耐
性コロニーを幾つか選択し、次いで〜２．８ｋｂ Ｐｖ
ｕｆｆ制限フラグメントの存在についてこれらプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素分析することによってスクリーニン
グした。既述のプラスミドｐＯＪ １６０ＤＮＡの単離
操作に従って、プラスミドＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ Ｋ
ｌ ２ ２９４ｐＦＪ３７０およびｐＦＪ３７１形質転
換体から得た。プラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦ Ｊ
３７１ ＤＮＡを使用すれば、以下の実施例３に記載
のように、ストレプトマイセス・グリセオフスカスＣ５
８１をピクロマイシン耐性に形質転換することかできる
。
実施例３
Ａ、溶液の一覧
本実施例を通じて使用している溶液を以下に明示する。
１、 Ｐ培地（〜１００ｍの：
成分 含有量
ショ糖 １０．３ｇＫ２ＳＯ４０，
０２５ｇ 微量元素溶液 ０．２ｍＱ（Ｎｏ、３参
照） ＭｇＣＬ・６Ｈ２００２０３ｇ 水 ８０屑Ｑオートク
レーブ処理後、以下を加える Ｋ１１２ＰＯ４（０，５％） ＣａＣＩ２２・ ２＋−１，０（３，６８％）（Ｎ−ト
リス−（ヒトロキ／ メチル）メチル−２−アミ フェノン・スルホン酸）、 ｒＴＥｓＪ緩ｉΦｊ液、０２５Ｍ、 ｐＨ＝７．２ ２、微量元素溶液（〜ｌリットル） 成分 ＺｎＣ（！。
０２５ｇ 微量元素溶液 ０．２ｍＱ（Ｎｏ、３参
照） ＭｇＣＬ・６Ｈ２００２０３ｇ 水 ８０屑Ｑオートク
レーブ処理後、以下を加える Ｋ１１２ＰＯ４（０，５％） ＣａＣＩ２２・ ２＋−１，０（３，６８％）（Ｎ−ト
リス−（ヒトロキ／ メチル）メチル−２−アミ フェノン・スルホン酸）、 ｒＴＥｓＪ緩ｉΦｊ液、０２５Ｍ、 ｐＨ＝７．２ ２、微量元素溶液（〜ｌリットル） 成分 ＺｎＣ（！。
ＦｅｃＱ３・６［（２０
ＣｕＣＱ＝ ・２ Ｈ２０
Ｍ ｎＣ１２２・４ Ｈ２Ｏ
Ｎａ２Ｂ４０７・Ｉ ０１（２０
（Ｎ Ｉ−１、）ｅＭｏ、０２４・４１−１２０水
３、Ｒ，２再生培１’［！ （〜１リットル）成分
ショ糖
に、ＳＯ。
ｆｆ１ｆ２
１Ｑｙ＋り
０ｘＣ
含有量
０ｍｇ
００ｍｇ
０ｍｇ
ＩＱ皮ｇ
０ｕｇ
ｌＯ究ｇ
１リットル
１よ
０３ｇ
０、２５ｇ
微量元素溶液 ２１ＭｇＣρ、・６
Ｈ２０１０，１２ｇ グルコース ＩＯｇＬ−アスパラギ
ン・ｌＨ３Ｏ２，０ｇ カサミノ酸 ０．１ｇ寒天
２２ｇ水を加えて７００ｚＱ、に
する。
Ｈ２０１０，１２ｇ グルコース ＩＯｇＬ−アスパラギ
ン・ｌＨ３Ｏ２，０ｇ カサミノ酸 ０．１ｇ寒天
２２ｇ水を加えて７００ｚＱ、に
する。
オートクレーブ処理の前にｐＨをｐＨ７，２に調節し、
該処理後、以下を加える ＫＨ２ＰＯ，（０，０５ｇ／ １００ｍＣ） １０
０ ｍ（ＩＣａＣＬ（２，２２ｇ／ １００ｚｃ）
ｌ ＯＯｍ（ＩＴＥＳ緩衝液（５，７３ｇ／ １
００７Ｉρ、 １００ｆｆＣｐＨ＝ ７．２） ４ 軟普通寒天（ＳＮＡ、〜ｌリットル）：成分
含有量 デイフコ・バット栄養性ブロス ８ｇ寒天
５ｇ５、Ｒ２ＹＥ培地。
該処理後、以下を加える ＫＨ２ＰＯ，（０，０５ｇ／ １００ｍＣ） １０
０ ｍ（ＩＣａＣＬ（２，２２ｇ／ １００ｚｃ）
ｌ ＯＯｍ（ＩＴＥＳ緩衝液（５，７３ｇ／ １
００７Ｉρ、 １００ｆｆＣｐＨ＝ ７．２） ４ 軟普通寒天（ＳＮＡ、〜ｌリットル）：成分
含有量 デイフコ・バット栄養性ブロス ８ｇ寒天
５ｇ５、Ｒ２ＹＥ培地。
１リツトル当たり２５％酵母エキス２ＯＮＣを加えたＲ
２培地。
２培地。
６、酵母二キスー麦芽エキス（〜１ｏｆｔ Ｅｘｔｒａ
ｃｔ）（ＹＥＭＥ、 〜 １ リ ） トル） 成分 含有量 酵母エキス ３ｇペプトン
５ｇ麦芽エキス
３ｇグルコース １０ｇ７、
ＹＥＭＥ＋３４％ショ糖液完全培地：ショ糖を３４０ｇ
／リットルで加えたＹＥＭＥ０ ８、ＹＭＸ培地（〜１す、トル） 成分 含有量 酵母エキス ３ｇ麦芽エキス
３ｇグルコース
２ｇ寒天 ２０ｇ９、
ＹＭＸ寒天 ０．３％酵母エキス、０，３％麦芽エキス、０２％デキ
ストロース、および２０％寒天。
ｃｔ）（ＹＥＭＥ、 〜 １ リ ） トル） 成分 含有量 酵母エキス ３ｇペプトン
５ｇ麦芽エキス
３ｇグルコース １０ｇ７、
ＹＥＭＥ＋３４％ショ糖液完全培地：ショ糖を３４０ｇ
／リットルで加えたＹＥＭＥ０ ８、ＹＭＸ培地（〜１す、トル） 成分 含有量 酵母エキス ３ｇ麦芽エキス
３ｇグルコース
２ｇ寒天 ２０ｇ９、
ＹＭＸ寒天 ０．３％酵母エキス、０，３％麦芽エキス、０２％デキ
ストロース、および２０％寒天。
形質転換
ストレプトマイセス・グリセオフスノＪスＣ５８１（Ａ
ＴＣＣ２３９１６）をＹＭＸ寒天上にプレートし、３０
°Ｃて約７２時間インキュベートした。
ＴＣＣ２３９１６）をＹＭＸ寒天上にプレートし、３０
°Ｃて約７２時間インキュベートした。
ｔ：ｌＩＩ １１包のプラグ（ｐｌｕｇ）を平板から取
り出し、それをＴＳＢｌｏｆｆ（に接種した。この培養
物をホモジナイズし、３０°Ｃて〜３０時間インキユヘ
ートした。この培養物約４アクをホモジナイズし、０．
４％グリシンを含有するＴＳＢｌｏｏＩＣに接種□した
。この培養物を３０°Ｃで約２４時間インキュベ−１〜
した。この培養物４ｍ１２を再び、ホモジナイズし、０
．４％グリシン含有のＴＳＢｌｏｏｚＣに接種した。得
られた培養物を３０°Ｃで約１６時間インキュベートし
た。細胞を採取し、１０．３％／ヨ糖て３回洗浄した。
り出し、それをＴＳＢｌｏｆｆ（に接種した。この培養
物をホモジナイズし、３０°Ｃて〜３０時間インキユヘ
ートした。この培養物約４アクをホモジナイズし、０．
４％グリシンを含有するＴＳＢｌｏｏＩＣに接種□した
。この培養物を３０°Ｃで約２４時間インキュベ−１〜
した。この培養物４ｍ１２を再び、ホモジナイズし、０
．４％グリシン含有のＴＳＢｌｏｏｚＣに接種した。得
られた培養物を３０°Ｃで約１６時間インキュベートし
た。細胞を採取し、１０．３％／ヨ糖て３回洗浄した。
この細胞をＬｍｇ／ｙｐＱ リソチームを含有するＰ培
地ｔｏｏｚｃに再懸濁し、得られた溶液を３０’Ｃで２
時間インキュベートした。このプロトプラスト化工程の
間中、細胞をピペットで吸引および排出し、集塊を分散
させた。
地ｔｏｏｚｃに再懸濁し、得られた溶液を３０’Ｃで２
時間インキュベートした。このプロトプラスト化工程の
間中、細胞をピペットで吸引および排出し、集塊を分散
させた。
得られたプロトプラストを集め、Ｐ培地で３回洗浄した
。次いて、このプロトプラストをＰ培地１０Ｒ（ｌに懸
濁した。通常、この操作により、溶液１５０μσ当たり
約２−５×ｌＯ７個のプロトプラストか生成される。
。次いて、このプロトプラストをＰ培地１０Ｒ（ｌに懸
濁した。通常、この操作により、溶液１５０μσ当たり
約２−５×ｌＯ７個のプロトプラストか生成される。
調製したプロトプラスト溶成約１５０μｇを、形質転換
用ＤＮＡ （ライゲーションまたは’ＦＥ 緩衝液のい
ずれかの中でｌＯμのに加え、混合した。次いて、Ｐ培
地中、５０％ポリエチレングリコール１０００ 約１０
０μ夕を加え、混合した。
用ＤＮＡ （ライゲーションまたは’ＦＥ 緩衝液のい
ずれかの中でｌＯμのに加え、混合した。次いて、Ｐ培
地中、５０％ポリエチレングリコール１０００ 約１０
０μ夕を加え、混合した。
室温で手垢にインキュベートしく１−２分）、この細胞
−ＤＮＡ混合物にＰ培地を加えて容量しσとした。この
細胞懸濁液をＲ２培地上にプレートした（Ｒ２平板１個
当たりに細胞約０．１ｚ（！を接種した）。この平板を
３０’Ｃで一晩（〜１６時間）インキュベートし、次い
で、拡散後の終濃度か２５μｇ／ｍ０となるのに十分な
量のチオストレプトンを含有したＲ２−改良寒天（ｌす
Ｚｌ−ル当たり、シヨ糖１０３ｇ、ＭｇＣＬ Ｉ ０
．１２ｇ、ＣｇＣ（！、２．２２ ｇｌおよびＴＥ３５
．７２ｇ、ｐＨ＝７．２）〜３ｘＣを重層した。次いで
、この平仮を３０°Ｃて約４日間インキユヘートすると
、肉眼でコロニーか観察できるようになった。
−ＤＮＡ混合物にＰ培地を加えて容量しσとした。この
細胞懸濁液をＲ２培地上にプレートした（Ｒ２平板１個
当たりに細胞約０．１ｚ（！を接種した）。この平板を
３０’Ｃで一晩（〜１６時間）インキュベートし、次い
で、拡散後の終濃度か２５μｇ／ｍ０となるのに十分な
量のチオストレプトンを含有したＲ２−改良寒天（ｌす
Ｚｌ−ル当たり、シヨ糖１０３ｇ、ＭｇＣＬ Ｉ ０
．１２ｇ、ＣｇＣ（！、２．２２ ｇｌおよびＴＥ３５
．７２ｇ、ｐＨ＝７．２）〜３ｘＣを重層した。次いで
、この平仮を３０°Ｃて約４日間インキユヘートすると
、肉眼でコロニーか観察できるようになった。
スピラマイ／ン耐性の形質転換体を、再生されたプロト
プラストを２５μｇ／ｍ（ｌスピラマインンを含有する
Ｒ２培地にパッチして選択した。この平板には、２５μ
ｇ／ｖｒＱエリスロマイシン（シグマ・ケミカルＣｏ、
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、ミズーリ６
３１７８．セント・ルイス、 ｐ、 ｏ、ホックス１４
５０８）から入手可能）、またはロサロマイシン（シェ
ーリング舎コーポレインョン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏ
ｒｐ、、ニューンヤーシ−０７０３３，ケニルワース、
キャロノピング・ヒル・ロード）から人手可能）のいず
れかを含有させてもよい。あるいは、得られた再生プロ
トプラストを、０５μｇ／ｉＱピクロマイシンを含有す
るＴＳＢ中に接種してビクロマイ／ン耐性の形質転換体
を選択することもてきる。ヒリロマインンは、米国特許
第２，６９３，４３３号に教示のように、生産、精製す
ることができる。細胞を、１０μｇ ／ ｖｔＱ ピク
ロマイシンを含有する培地上にプレートする前に、得ら
れた培養物を３０°Ｃて１６２２時間インキユヘートし
た。プラスミドｐＦＪ３７０およびＩ）ＦＪ３７１はチ
オストレプトン耐性付与遺伝子をも含有しているので、
形質転換体の選択には、終濃度２０μｇ／ｍＱのチオス
トレプトンをも使用する。
プラストを２５μｇ／ｍ（ｌスピラマインンを含有する
Ｒ２培地にパッチして選択した。この平板には、２５μ
ｇ／ｖｒＱエリスロマイシン（シグマ・ケミカルＣｏ、
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、、ミズーリ６
３１７８．セント・ルイス、 ｐ、 ｏ、ホックス１４
５０８）から入手可能）、またはロサロマイシン（シェ
ーリング舎コーポレインョン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏ
ｒｐ、、ニューンヤーシ−０７０３３，ケニルワース、
キャロノピング・ヒル・ロード）から人手可能）のいず
れかを含有させてもよい。あるいは、得られた再生プロ
トプラストを、０５μｇ／ｉＱピクロマイシンを含有す
るＴＳＢ中に接種してビクロマイ／ン耐性の形質転換体
を選択することもてきる。ヒリロマインンは、米国特許
第２，６９３，４３３号に教示のように、生産、精製す
ることができる。細胞を、１０μｇ ／ ｖｔＱ ピク
ロマイシンを含有する培地上にプレートする前に、得ら
れた培養物を３０°Ｃて１６２２時間インキユヘートし
た。プラスミドｐＦＪ３７０およびＩ）ＦＪ３７１はチ
オストレプトン耐性付与遺伝子をも含有しているので、
形質転換体の選択には、終濃度２０μｇ／ｍＱのチオス
トレプトンをも使用する。
ピクロマイシン（１０μｇ／ｘのを加えたＲ２寒天上で
形質転換体を培養し、単一コロニーを得た。
形質転換体を培養し、単一コロニーを得た。
これらの単一コロニーを、ピクロマイシンおよびチオス
トレプトン（２５μｇ／ｚＱ）を含有するＴＳＢ培養培
養物１０セＱ種した。この培養物をホモジナイズした後
、３０°Ｃにおいて回転振盪機で一晩培養した。
トレプトン（２５μｇ／ｚＱ）を含有するＴＳＢ培養培
養物１０セＱ種した。この培養物をホモジナイズした後
、３０°Ｃにおいて回転振盪機で一晩培養した。
分析用にプラスミドを単離するには、実施例１のプロト
コールを小規模で行う。即ち、実施例１のＣ３Ｃ（２グ
ラ／エンドをエタノール沈、骨に置き換えた。菌糸体を
遠心によって採取し、１０３％ショ糖で２回洗浄した後
、１０．３％ンヨ糖１２ｍＱに再懸濁した。この細胞混
合物１１００μ夕を小管に移し、５Ｘリゾチーム溶液（
実施例１）１００μＱを加えた。この懸濁液を３０°Ｃ
で３０６０分間インキユヘートした後、１％ＳＤＳを含
有した０、３Ｍ ＮａＯＨ３００μ＆を加え、混合した
。この溶液は、細胞ミックスに加える前に、５０°Ｃで
保存しておく。得られたｌ１ｌｌ胞混合物を８０°Ｃで
１０分間放置し、室温に冷却し、次いてフェノール：ク
ロロホルム（５０：５０）で抽出した。
コールを小規模で行う。即ち、実施例１のＣ３Ｃ（２グ
ラ／エンドをエタノール沈、骨に置き換えた。菌糸体を
遠心によって採取し、１０３％ショ糖で２回洗浄した後
、１０．３％ンヨ糖１２ｍＱに再懸濁した。この細胞混
合物１１００μ夕を小管に移し、５Ｘリゾチーム溶液（
実施例１）１００μＱを加えた。この懸濁液を３０°Ｃ
で３０６０分間インキユヘートした後、１％ＳＤＳを含
有した０、３Ｍ ＮａＯＨ３００μ＆を加え、混合した
。この溶液は、細胞ミックスに加える前に、５０°Ｃで
保存しておく。得られたｌ１ｌｌ胞混合物を８０°Ｃで
１０分間放置し、室温に冷却し、次いてフェノール：ク
ロロホルム（５０：５０）で抽出した。
水層をきれいな試験管に移し、酢酸ナトリウム０３Ｍと
した後、インプロパツールｌ容量を加えた。得られたＤ
ＮＡを室温で５分間インキュベートし、次いて遠心によ
ってペレット化した。このペレットをＴＥ緩衝液５００
μσに溶解し、０゜１Ｍスペルミン約２５μｇをそのＤ
Ｎ Ａ 溶液に加え、得られた混合物を室温で５分間
インキユヘートシた。遠心した後、得られたＤＮＡペレ
ットを７５％エタノールで洗浄し、次いてＱ、３Ｍ酢酸
ナトリウムに再懸濁し、エタノールを使用して再度沈澱
させた。この最後の沈澱操作の後に、プラスミドＤＮＡ
をＴＥ緩衝液５０μｇに！び濁した。
した後、インプロパツールｌ容量を加えた。得られたＤ
ＮＡを室温で５分間インキュベートし、次いて遠心によ
ってペレット化した。このペレットをＴＥ緩衝液５００
μσに溶解し、０゜１Ｍスペルミン約２５μｇをそのＤ
Ｎ Ａ 溶液に加え、得られた混合物を室温で５分間
インキユヘートシた。遠心した後、得られたＤＮＡペレ
ットを７５％エタノールで洗浄し、次いてＱ、３Ｍ酢酸
ナトリウムに再懸濁し、エタノールを使用して再度沈澱
させた。この最後の沈澱操作の後に、プラスミドＤＮＡ
をＴＥ緩衝液５０μｇに！び濁した。
この反応生成物を制限酵素で切断し、電気泳動にかけて
分析することで、プラスミドの構造を決定した。
分析することで、プラスミドの構造を決定した。
実施例ｔ
ｐＦＪ３７２およびｐＦＪ３７３の溝築プラスミドｐｌ
Ｊ７０２（実施例１で単離）杓１μｇ、水２５μρ、Ｂ
Ｓ Ａ （ｌｉｇ／ｚ＋２） ５ ｔｔＯ１１０ＸＢ
ｇＩ１１制限緩衝液（２００ｍＭｈリス／１］Ｃｉ！ｐ
ｌ（８，０，１Ｍ ＮａＣＱ、７０ｍＭ ＭｇＣＬ、お
よび２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）５μρ、お
よびＢｇｌ ＩＩ制限酵素２ＩＩＱ（〜２０単位）を混
合し、３７°Ｃで１時間インキュへ一トシた。
Ｊ７０２（実施例１で単離）杓１μｇ、水２５μρ、Ｂ
Ｓ Ａ （ｌｉｇ／ｚ＋２） ５ ｔｔＯ１１０ＸＢ
ｇＩ１１制限緩衝液（２００ｍＭｈリス／１］Ｃｉ！ｐ
ｌ（８，０，１Ｍ ＮａＣＱ、７０ｍＭ ＭｇＣＬ、お
よび２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）５μρ、お
よびＢｇｌ ＩＩ制限酵素２ＩＩＱ（〜２０単位）を混
合し、３７°Ｃで１時間インキュへ一トシた。
次いで、このヘクターＤＮＡを沈、殿させ、洗浄し、乾
燥した。実質上、マニアチスＱｌａｎｉａｔｉｓ）（１
９８２）ら記載のＤＮＡポリメラーセｌ操作法によって
、５”突出部を充填した。次いで、得られたＢｇｌＩＩ
切断、充填プラスミドを実施例２Ｂの教示に実質的に従
い、脱リン酸化した。次きに、プラスミドｐＯＪ３２１
の〜２．８ｋｂ Ｐｖｕ［Ｉ切断制限フラグメントを、
実施例２Ｂの教示に実質的に従い、３ｇ１■切断、充填
、脱リン酸化プラスミドｐｌＪ７０２にライゲートした
。次いて、得られたライゲート？ｆｉ合物を用い、実施
例３の方法に実質的に従ってストレプトマイセス 形質転換した。ピクロマイシン耐性付与遺伝子フラグメ
ントの方向のみか異なるプラスミドｐＦＪ３７２および
ｐＦＪ３７３は、ストレプトマイセス・グリセオフスカ
スにピクロマイシン耐性を付与した。プラスミドｐＦＪ
３７２およびｐＦＪ３７３の制限部位および機能地図を
添付の第３図に示す。
燥した。実質上、マニアチスＱｌａｎｉａｔｉｓ）（１
９８２）ら記載のＤＮＡポリメラーセｌ操作法によって
、５”突出部を充填した。次いで、得られたＢｇｌＩＩ
切断、充填プラスミドを実施例２Ｂの教示に実質的に従
い、脱リン酸化した。次きに、プラスミドｐＯＪ３２１
の〜２．８ｋｂ Ｐｖｕ［Ｉ切断制限フラグメントを、
実施例２Ｂの教示に実質的に従い、３ｇ１■切断、充填
、脱リン酸化プラスミドｐｌＪ７０２にライゲートした
。次いて、得られたライゲート？ｆｉ合物を用い、実施
例３の方法に実質的に従ってストレプトマイセス 形質転換した。ピクロマイシン耐性付与遺伝子フラグメ
ントの方向のみか異なるプラスミドｐＦＪ３７２および
ｐＦＪ３７３は、ストレプトマイセス・グリセオフスカ
スにピクロマイシン耐性を付与した。プラスミドｐＦＪ
３７２およびｐＦＪ３７３の制限部位および機能地図を
添付の第３図に示す。
実施例句
組込み用プラスミドｐＦＪ３７４およびｐＦＪ３７５の
構築 Ａ ストレプトマイセス・フェレシスＤＮＡの調製 ストレプトマイセス・グリセオフスカス（ＡＴＣＣ
２３９１６）の新鮮な一晩培養物約２．５ａＱをＴＳＢ
（トリブチカーセ犬豆ブロス）５０ｉＱに接種した。こ
の培養物を激しく振盪させながら、３０−３２°Ｃて一
晩培養した。遠心によって細胞を採取し、リソチーム（
５１Ｒｇ／ｉのを加えた細胞溶解緩衝ｉ１’ｉ （ １
５％ショ糖、２５ｍＭ トリス／ＨＣＱｐＨ８．Ｏ、
５０ｍＭ ＥＤＴＡ）ｌｏｉＱにｊｊ％濁し、３７°
Ｃで１５分間インキユヘートした。次いて、１０μｇ／
＊ＱプロテイナーゼＫ（細胞溶解緩衝液中に新しく調製
）０．１ｍρを、１０％ドテシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ） １．ｏｍ（ｌと共に加えた。この混合物を７０
°Ｃで１５分間素早くインキュベートした後、水上で冷
却した。次ぎに、５Ｍ酢酸カリウム２．５ｍρを加え、
穏やかに旋回させて混合し、１５分間氷上に放置した。
構築 Ａ ストレプトマイセス・フェレシスＤＮＡの調製 ストレプトマイセス・グリセオフスカス（ＡＴＣＣ
２３９１６）の新鮮な一晩培養物約２．５ａＱをＴＳＢ
（トリブチカーセ犬豆ブロス）５０ｉＱに接種した。こ
の培養物を激しく振盪させながら、３０−３２°Ｃて一
晩培養した。遠心によって細胞を採取し、リソチーム（
５１Ｒｇ／ｉのを加えた細胞溶解緩衝ｉ１’ｉ （ １
５％ショ糖、２５ｍＭ トリス／ＨＣＱｐＨ８．Ｏ、
５０ｍＭ ＥＤＴＡ）ｌｏｉＱにｊｊ％濁し、３７°
Ｃで１５分間インキユヘートした。次いて、１０μｇ／
＊ＱプロテイナーゼＫ（細胞溶解緩衝液中に新しく調製
）０．１ｍρを、１０％ドテシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ） １．ｏｍ（ｌと共に加えた。この混合物を７０
°Ｃで１５分間素早くインキュベートした後、水上で冷
却した。次ぎに、５Ｍ酢酸カリウム２．５ｍρを加え、
穏やかに旋回させて混合し、１５分間氷上に放置した。
得られた物質をＴＥ飽和フェノールで穏やかに抽出した
後、遠心（ｌ Ｏ， Ｏ Ｏ Ｏｒｐｍて１０分間）に
よって層を分離し、先を割ったピペットで得られた水層
を新しい試験管に移した。それを等量のセバーグ液（
Ｓ ｅｖａｇ）で穏やかに抽出した後、再び層を分離し
、水層を新しい試験管に移し、室６品にてエタノール（
２容量）でＤＮＡを沈澱させた。得られた沈澱物を７０
％エタノールで’ｆｒＥ浄し、Ｔ ＩＥ５ｍＱに溶解し
た。ＲＮアーセＡ（終濃度５０μｇ，／ｍのおよびＲＮ
アーゼＴ １ （ＩｂｉＪ度１ ｔｔ ｇ ／究のを加
え、得られた溶液を３７°Ｃて３０分間インキユヘート
した。フェノールで２回、セハーグ、１ｙで２回抽出し
、エタノール（２容量）で沈澱させた（糸、得られたＤ
Ｎ Ａを減圧下に乾燥させ、ＴＥ（培養物５０．７Ｑ
当たりしｉｃ）に再度溶解した。
後、遠心（ｌ Ｏ， Ｏ Ｏ Ｏｒｐｍて１０分間）に
よって層を分離し、先を割ったピペットで得られた水層
を新しい試験管に移した。それを等量のセバーグ液（
Ｓ ｅｖａｇ）で穏やかに抽出した後、再び層を分離し
、水層を新しい試験管に移し、室６品にてエタノール（
２容量）でＤＮＡを沈澱させた。得られた沈澱物を７０
％エタノールで’ｆｒＥ浄し、Ｔ ＩＥ５ｍＱに溶解し
た。ＲＮアーセＡ（終濃度５０μｇ，／ｍのおよびＲＮ
アーゼＴ １ （ＩｂｉＪ度１ ｔｔ ｇ ／究のを加
え、得られた溶液を３７°Ｃて３０分間インキユヘート
した。フェノールで２回、セハーグ、１ｙで２回抽出し
、エタノール（２容量）で沈澱させた（糸、得られたＤ
Ｎ Ａを減圧下に乾燥させ、ＴＥ（培養物５０．７Ｑ
当たりしｉｃ）に再度溶解した。
このＤＮＡを０．３％アノノロースゲル上でサイズ分画
した。、 次いで、ストレプトマイセス・グリセオフスカス東色体
ＤＮＡ２００μｇを、ＢＳＡＩＱＱμＱ１〜Ｉｂｏｌ制
限緩衝液（５ ０ ０ ｍＭ トリス／’ＨＣ１２ｐ
Ｈ８．０、１ ０ ０ｍＭ ＭｇＣ０．２、５ ０ ｍ
Ｍ Ｎ ａＣの１００μ（！、および水〜８００μρ中
、Ｍｂｏ１８５単位（１０μのと共に、３７°Ｃで３分
間インキュベートした。この特別な条件か部分消化ＤＮ
Ａの所望の分配を得るのに適していることを経験的に見
いたした。得られたＤＮＡをフェノール、セハーグ液で
抽出し、エタノール（１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、３容量のエタノール、７０°Ｃ、３０分間）で沈，
殿させた。エソペンドルフ遠心機で遠心（１５分）して
化１張物を採取した１糸、得られたＤ Ｎ Ａを水１２
５μＱに溶解した。
した。、 次いで、ストレプトマイセス・グリセオフスカス東色体
ＤＮＡ２００μｇを、ＢＳＡＩＱＱμＱ１〜Ｉｂｏｌ制
限緩衝液（５ ０ ０ ｍＭ トリス／’ＨＣ１２ｐ
Ｈ８．０、１ ０ ０ｍＭ ＭｇＣ０．２、５ ０ ｍ
Ｍ Ｎ ａＣの１００μ（！、および水〜８００μρ中
、Ｍｂｏ１８５単位（１０μのと共に、３７°Ｃで３分
間インキュベートした。この特別な条件か部分消化ＤＮ
Ａの所望の分配を得るのに適していることを経験的に見
いたした。得られたＤＮＡをフェノール、セハーグ液で
抽出し、エタノール（１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、３容量のエタノール、７０°Ｃ、３０分間）で沈，
殿させた。エソペンドルフ遠心機で遠心（１５分）して
化１張物を採取した１糸、得られたＤ Ｎ Ａを水１２
５μＱに溶解した。
その後の脱リン酸化反応か完全に行われたか否かを調べ
るのに使用するためのＤＮＡを〜５μｇ取って置き、残
りのＤＮＡを１０×♀［■菌性アリカリフｔスファター
セ（Ｂ Ａ Ｐ）緩衝液２０μりおよび［３ＡＰ（２４
単位，／ＩＣ）８０μ夕に加えた。このｌ捏合物を７０
°Ｃで１時間インキュベートした後、１３ ＡＰ ８
０μＱを加え、さらに１時間インキュへ−１〜した。得
られたＤＮＡを既述のようにフェノール、セハーグ液で
抽出、沈澱させ、ＴＥ ５ＱμＱに溶解した。このＤ
ＮＡのサイズを０ ３％アカロースゲル上で評価した。
るのに使用するためのＤＮＡを〜５μｇ取って置き、残
りのＤＮＡを１０×♀［■菌性アリカリフｔスファター
セ（Ｂ Ａ Ｐ）緩衝液２０μりおよび［３ＡＰ（２４
単位，／ＩＣ）８０μ夕に加えた。このｌ捏合物を７０
°Ｃで１時間インキュベートした後、１３ ＡＰ ８
０μＱを加え、さらに１時間インキュへ−１〜した。得
られたＤＮＡを既述のようにフェノール、セハーグ液で
抽出、沈澱させ、ＴＥ ５ＱμＱに溶解した。このＤ
ＮＡのサイズを０ ３％アカロースゲル上で評価した。
実施例５Ａで単離された染色体ＤＮＡの５°突出部を、
マニアチスらのポリメラーゼ１操作法（１９８２）に実
質的に従って充填した。次いで、１０ＸＥｃｏＲ１緩衝
液（ＩＭ トリス／Ｉ−１（Ｊ ｐ＋（７．５、５ ０
０ｍＭ ＮａＣＱ，および５００ｍＭ ＭｇＣ（Ｌ）
を使用する以外は、実施例２の記・１・、（に実質的に
従い、Ｉ）ＢＲ３２２（ＢＲＬ）約２μｇをＥｃｏＲ［
制限酵素を使用して完全に消化した。このＥｃｏＲＩ切
断ｐＢＲ３２２の５′突出部を上記のＤＮＡポリメラー
ゼＩ操作法によって充填した。次いで、Ｍｂｏｌ切断し
、充填した染色体ＤＮＡ、およびＥｃｏＲＩ切断し、充
填したｐＢＲ３２２を、実質上、実施例２Ｂに記載の方
法に従い、互いにライゲートした。実質上、実施例２Ｂ
の記載に従い、このライゲートミックスを用いて受容能
を有するＥ、ｃｏｌｉ ２９４細胞を形質転換し、テト
ラサイクリン耐性に関して選択した。次いで、実施例２
の操作法に実質的に従って、中間体プラスミドｐＦＪ３
７８を形質転換細胞から抽出した。
マニアチスらのポリメラーゼ１操作法（１９８２）に実
質的に従って充填した。次いで、１０ＸＥｃｏＲ１緩衝
液（ＩＭ トリス／Ｉ−１（Ｊ ｐ＋（７．５、５ ０
０ｍＭ ＮａＣＱ，および５００ｍＭ ＭｇＣ（Ｌ）
を使用する以外は、実施例２の記・１・、（に実質的に
従い、Ｉ）ＢＲ３２２（ＢＲＬ）約２μｇをＥｃｏＲ［
制限酵素を使用して完全に消化した。このＥｃｏＲＩ切
断ｐＢＲ３２２の５′突出部を上記のＤＮＡポリメラー
ゼＩ操作法によって充填した。次いで、Ｍｂｏｌ切断し
、充填した染色体ＤＮＡ、およびＥｃｏＲＩ切断し、充
填したｐＢＲ３２２を、実質上、実施例２Ｂに記載の方
法に従い、互いにライゲートした。実質上、実施例２Ｂ
の記載に従い、このライゲートミックスを用いて受容能
を有するＥ、ｃｏｌｉ ２９４細胞を形質転換し、テト
ラサイクリン耐性に関して選択した。次いで、実施例２
の操作法に実質的に従って、中間体プラスミドｐＦＪ３
７８を形質転換細胞から抽出した。
プラスミドｐＦＪ３７８ 約１０μρ（〜５μｇ）、水
２６ｔｔ（１，Ｂ５Ａ３μＱ、１０ＸＰｖｕＩＩ制限緩
衝液（］ＯＯｍＭｈリス／ＨＣｆｆ ｐＨ８，０，０，
５Ｍ ＮａＣＱ、 １００ｍＭ ＭｇＣＱ、ｔ、およ
び２０ｍＭ２−メルカプトエタノール）５μｇ、および
Ｐｖｕ１１酵素１μａを混合し、３７°Ｃで４−５分間
インキユヘートした。ｌＯμＱ部分量を取り出し、水４
０μａと混合し、７０’Ｃに１０分間加熱し、酵素を不
活化させた。このプロトコールにより、ＰＶＬＩＩＩ制
限酵素によっては開裂されなかった分子から、Ｐｖｕｌ
ｌ制限酵素によって完全に消化された分子までのすべて
の可能な反応生成物か得られた。
２６ｔｔ（１，Ｂ５Ａ３μＱ、１０ＸＰｖｕＩＩ制限緩
衝液（］ＯＯｍＭｈリス／ＨＣｆｆ ｐＨ８，０，０，
５Ｍ ＮａＣＱ、 １００ｍＭ ＭｇＣＱ、ｔ、およ
び２０ｍＭ２−メルカプトエタノール）５μｇ、および
Ｐｖｕ１１酵素１μａを混合し、３７°Ｃで４−５分間
インキユヘートした。ｌＯμＱ部分量を取り出し、水４
０μａと混合し、７０’Ｃに１０分間加熱し、酵素を不
活化させた。このプロトコールにより、ＰＶＬＩＩＩ制
限酵素によっては開裂されなかった分子から、Ｐｖｕｌ
ｌ制限酵素によって完全に消化された分子までのすべて
の可能な反応生成物か得られた。
その一部を１／１０容量の酢酸ナトリウム（ｐＨ８０）
および２容量のエタノールで沈、殿させた後、−７０°
Ｃて１時間凍結した。次いで、このＰｖｕ１１部分消化
プラスミドを、実施例２Ｂの教示に実質的に従って、プ
ラスミドｐＯＪ３２１の〜２８ｋｂＰｖｕＵ制限フラグ
メント（実施例２て単離）にライケートした。次ぎに、
実質上、実施例２Ｂ記載の方法に従い、このライゲート
混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ２９４細胞を形質転換し
、得られた形質転換体をアンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性に関して選択した。すへての形質転換体をプ
ールし、実施例２に記載のようにプラスミＩ’ＤＮＡを
抽出した。得られたプラスミド（ｐＦＪ３７４およびｐ
ＦＪ３７５と命名）は、ｌ） ｉ ｃ Ａフラグメント
の方向性に関してのみ異なっていた（これらを添付の第
４図に示す）。
および２容量のエタノールで沈、殿させた後、−７０°
Ｃて１時間凍結した。次いで、このＰｖｕ１１部分消化
プラスミドを、実施例２Ｂの教示に実質的に従って、プ
ラスミドｐＯＪ３２１の〜２８ｋｂＰｖｕＵ制限フラグ
メント（実施例２て単離）にライケートした。次ぎに、
実質上、実施例２Ｂ記載の方法に従い、このライゲート
混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ２９４細胞を形質転換し
、得られた形質転換体をアンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性に関して選択した。すへての形質転換体をプ
ールし、実施例２に記載のようにプラスミＩ’ＤＮＡを
抽出した。得られたプラスミド（ｐＦＪ３７４およびｐ
ＦＪ３７５と命名）は、ｌ） ｉ ｃ Ａフラグメント
の方向性に関してのみ異なっていた（これらを添付の第
４図に示す）。
実質上、実施例３Ｂ記載の方法に従い、プラスミドｐＦ
Ｊ３７４ 約２μりを用いてストレプトマイセス・グ
リセオフスカスのプロトプラストを形質転換した（ただ
し、プロトプラストに、終濃度２５μｇ／ｍ（ｌとなる
のに十分な量のピクロマイシンを含有したＲ ２ ）
ｙプ寒天（ｔｏｐ ａｇａｒ）を重層した）。プラスミ
ドｐＢＲ３２２はストレプトマイセスレプリコンを含有
していないので、得られた耐性コロニーのみか、細胞か
交差、ホモローカス（同種）組換えを受け、その後にｐ
ｉｃＡ遺伝子がストレプトマイセスのゲノムに組み込ま
れているコロニーである。
Ｊ３７４ 約２μりを用いてストレプトマイセス・グ
リセオフスカスのプロトプラストを形質転換した（ただ
し、プロトプラストに、終濃度２５μｇ／ｍ（ｌとなる
のに十分な量のピクロマイシンを含有したＲ ２ ）
ｙプ寒天（ｔｏｐ ａｇａｒ）を重層した）。プラスミ
ドｐＢＲ３２２はストレプトマイセスレプリコンを含有
していないので、得られた耐性コロニーのみか、細胞か
交差、ホモローカス（同種）組換えを受け、その後にｐ
ｉｃＡ遺伝子がストレプトマイセスのゲノムに組み込ま
れているコロニーである。
実施例６
組込みファージｐＦＪ３７６およびｐＦＪ３７７のＦＭ
築 Ａ、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３
■の培養 Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３
１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８２８）の培養物２ｆｆＱを
、細胞か定常期に至るまでＴＹ培地（１％トリプトン、
０５％Ｎａ（１２および０．５％ｔ＋ｙ＋ｒｔエキス、
ｐ Ｈ７、４）中、５０Ｍｇ ／ ｖｔ０アンビンリン
の存在下で培養する。次に、得られた培養物２ｍＱを、
フラスコ内の５０Ｍｇ／ｍＴ２アンピンリンを含んた′
Ｆ）′培地１．２に接種し、５５０ｎｍでの培養物の光
学密度か０．５０〜０７５吸光単位になるまで培連を続
ける。Ｏ，Ｄ、５５０か０，５０〜０．７５に達した時
、ウリジンＩｇを加え、さらに１５分後、クロラムフェ
ニコール１７０πｇを加える。次いで、インキュベーシ
ョンおよび培養を１６時間続ける。
築 Ａ、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３
■の培養 Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３
１（ＮＲＲＬ Ｂ−１５８２８）の培養物２ｆｆＱを
、細胞か定常期に至るまでＴＹ培地（１％トリプトン、
０５％Ｎａ（１２および０．５％ｔ＋ｙ＋ｒｔエキス、
ｐ Ｈ７、４）中、５０Ｍｇ ／ ｖｔ０アンビンリン
の存在下で培養する。次に、得られた培養物２ｍＱを、
フラスコ内の５０Ｍｇ／ｍＴ２アンピンリンを含んた′
Ｆ）′培地１．２に接種し、５５０ｎｍでの培養物の光
学密度か０．５０〜０７５吸光単位になるまで培連を続
ける。Ｏ，Ｄ、５５０か０，５０〜０．７５に達した時
、ウリジンＩｇを加え、さらに１５分後、クロラムフェ
ニコール１７０πｇを加える。次いで、インキュベーシ
ョンおよび培養を１６時間続ける。
Ｂ、ファスミドｐＫｃ３３１の単離
培養物を遠心にかけ、細胞ペレットを、２５％ｗ／ｖシ
ョ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣ１２ｐＨ８、および１ｍＭ
ＥＤＴＡの溶液１０．ｖ（！にｉｍ！璽ｉ蜀する。
ョ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣ１２ｐＨ８、および１ｍＭ
ＥＤＴＡの溶液１０．ｖ（！にｉｍ！璽ｉ蜀する。
次に、０．２５Ｍ＋−リスートＩＣＱｐＨ８中、０５Ｍ
ＥＤＴＡ ２Ｒ（ｌおよび５１ｇ／ｍ（リソチーム
溶ｒｌ’ｉ、 ２ ｍＱ、を加え、得られた混合物を室
温で１５分間インキユヘートする。インキュベートした
後、５０ｍＭ トリス−ｔ（Ｃ夕ｐ ！−１８； ６
ｍＭ Ｅ ＤＴ ｒ〜および０．１％ トリトンＸ１０
０を含有する溶成約１４ｆｆρを加える。次に、す゛ノ
チームで処理された細胞を反転させて混合する。
ＥＤＴＡ ２Ｒ（ｌおよび５１ｇ／ｍ（リソチーム
溶ｒｌ’ｉ、 ２ ｍＱ、を加え、得られた混合物を室
温で１５分間インキユヘートする。インキュベートした
後、５０ｍＭ トリス−ｔ（Ｃ夕ｐ ！−１８； ６
ｍＭ Ｅ ＤＴ ｒ〜および０．１％ トリトンＸ１０
０を含有する溶成約１４ｆｆρを加える。次に、す゛ノ
チームで処理された細胞を反転させて混合する。
細胞残骸が緩いペレットを形成するまで、上記の細胞溶
解した細胞ミックスを遠心にかける。その細胞残骸ペレ
ットを捨て、上澄液を緩衝化フェノール（ｐＨ８）で抽
出し、水層を０．２５ＭＮａＣσに調節し、次いで２容
量のエタノールを加える。得られた混合物を一７０°Ｃ
て冷却し、得られた核酸を遠心によりベレット化する。
解した細胞ミックスを遠心にかける。その細胞残骸ペレ
ットを捨て、上澄液を緩衝化フェノール（ｐＨ８）で抽
出し、水層を０．２５ＭＮａＣσに調節し、次いで２容
量のエタノールを加える。得られた混合物を一７０°Ｃ
て冷却し、得られた核酸を遠心によりベレット化する。
さらに、エチジウムプロミドを加えたセンウムクロリド
による勾配遠心（２０°Ｃ１１６時間で４５． ＯＯＯ
ｒｐｍ）を行い、ファスミドＤＮＡを精製する。次いで
、所望のファスミドｐＫｃ３３１ ＤＮＡを収集し、
エチジウムプロミドおよびセンウムクロリドを通常の方
法で、取り除く。この方法で得られたファスミトｐＫｃ
３３１ ＤＮＡ約１ｚｇをＴＥ緩衝液（ｌｏｍ’Ｍ）
リス−ＨＣ（！Ｔ）Ｈ８および１ｍＭＥＤＴＡ）ｌｉθ
に溶解し、−２０°Ｃて１早存する。
による勾配遠心（２０°Ｃ１１６時間で４５． ＯＯＯ
ｒｐｍ）を行い、ファスミドＤＮＡを精製する。次いで
、所望のファスミドｐＫｃ３３１ ＤＮＡを収集し、
エチジウムプロミドおよびセンウムクロリドを通常の方
法で、取り除く。この方法で得られたファスミトｐＫｃ
３３１ ＤＮＡ約１ｚｇをＴＥ緩衝液（ｌｏｍ’Ｍ）
リス−ＨＣ（！Ｔ）Ｈ８および１ｍＭＥＤＴＡ）ｌｉθ
に溶解し、−２０°Ｃて１早存する。
び〜３７ｋｂＰｓｔｌ制限フラグメントの単離実施例６
Ｂで単離したファスミドｐＫｃ３３１約１０μ５（ｌＯ
μのを１０ＸＰｓｔ［塩１０μＱ、制限酵素ＰｓＬＩ２
μａ（〜１０ユニット）および水７８μＱに加える。穏
やかに混合した後、この消化物を３７°Ｃで２時間反応
させ、次いて消化後、ファーンφＣ３１配列を含有する
〜３７ｋｂＰｓｔＩフラグメントを通常のゲル電気泳動
法により精製する。得られた精製フラグメント（〜５μ
ｇ）をＴＥ緩衝液５μρ中に懸濁する。
Ｂで単離したファスミドｐＫｃ３３１約１０μ５（ｌＯ
μのを１０ＸＰｓｔ［塩１０μＱ、制限酵素ＰｓＬＩ２
μａ（〜１０ユニット）および水７８μＱに加える。穏
やかに混合した後、この消化物を３７°Ｃで２時間反応
させ、次いて消化後、ファーンφＣ３１配列を含有する
〜３７ｋｂＰｓｔＩフラグメントを通常のゲル電気泳動
法により精製する。得られた精製フラグメント（〜５μ
ｇ）をＴＥ緩衝液５μρ中に懸濁する。
ファスミドｐＫｃ３３１の〜３７ｋｂＰｓｔｌ制限フラ
グメントの両側末端における３″突出を、実質的にはマ
ニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８２年版に記載
されている通りのＴ４ ＤＮＡポリメラーセ操作法に
よってかみ砕く （修正する）。次いで、ファスミドｐ
Ｋｃ３３１の〜３７ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ制限フラグメン
トを、実質的に実施例２Ｂの方法に従って脱リン酸化す
る。次に、プラスミドｐＯＪ３２１由来の〜２．８ｋｂ
ＰｖｕＩＩ制限フラグメントを、実質的に実施例２Ｂ
に従って、ｐＫＣ３３１の〜３７ ｋｂフラグメントに
ライケートする。このライケートにより、〜２．８ ｋ
ｂ ｐｉｃＡフラグメントの方向に関してのみ異なる、
所望のファージｐＦＪ３７６およびｐＦＪ３７７が得ら
れる。ファージｐｐ、＋３７６およびｐＦＪ３７７の制
限部位および機能地図を添付の第５図に示す。ライケー
トシたＤＮＡを用いてストレプトマイセスを形質転換し
、感染性ファージ粒子を得、次に、そのファージを使用
し、ベクターの染色体組込みによってヒリロマインン耐
性ストレプトマイセスを、調製する。
グメントの両側末端における３″突出を、実質的にはマ
ニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８２年版に記載
されている通りのＴ４ ＤＮＡポリメラーセ操作法に
よってかみ砕く （修正する）。次いで、ファスミドｐ
Ｋｃ３３１の〜３７ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ制限フラグメン
トを、実質的に実施例２Ｂの方法に従って脱リン酸化す
る。次に、プラスミドｐＯＪ３２１由来の〜２．８ｋｂ
ＰｖｕＩＩ制限フラグメントを、実質的に実施例２Ｂ
に従って、ｐＫＣ３３１の〜３７ ｋｂフラグメントに
ライケートする。このライケートにより、〜２．８ ｋ
ｂ ｐｉｃＡフラグメントの方向に関してのみ異なる、
所望のファージｐＦＪ３７６およびｐＦＪ３７７が得ら
れる。ファージｐｐ、＋３７６およびｐＦＪ３７７の制
限部位および機能地図を添付の第５図に示す。ライケー
トシたＤＮＡを用いてストレプトマイセスを形質転換し
、感染性ファージ粒子を得、次に、そのファージを使用
し、ベクターの染色体組込みによってヒリロマインン耐
性ストレプトマイセスを、調製する。
実施例７
０．４％グリシンを加えたＴＳＢ中、液中条件下で、３
０°Ｃ，２０時間、ストレプトマイセス・グリセオフス
カスＣ５８１（ＡＴＣＣ２３９１６）を培養することに
より、常法通り増殖型接種物（Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ
ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を調製する。Ｓ、グリセオフスｈス
のプロトプラスト化は、一般に以下の如くに行われてい
る。Ｓ４グリセオフスカスの培養物を、ＹＭＸ寒天を含
んだ平板上に広げ、３０°Ｃて約４８時間インキュベー
トする。次に、その平板からの単一の細菌コロニーをＴ
ＳＢＩＱｉσに接種する；得られた培養物をホモジナイ
ズした後、晩、３０°Ｃでインキュベートする。その−
晩培養物約４ｍＱをホモジナイズし、０４％グリシンを
含むＴＳＢ１００ｆｆ１２に加え、次に３０°Ｃで一部
インキユヘートする。この手順を、新鮮な一晩培養物を
使って繰り返す。次に、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール
約５０１１ｆ２を得られた培養物に加え、１５ｍ（ｌ試
料７１丁を冷凍し、−２０°Ｃで６力月に及んで保存す
る。得られた凍結細胞を解凍するため試験管を室温でビ
ーカー内の水中に放置する。次いで、細胞をヘンチート
ップ遠心分離機で収穫し、０．３％ショ糖 １０２ρで
３回洗浄する。得られた細胞ベレットを、リソチーム（
Ｉｙｔｔｇ／ｍＱ）を加えたＰ培地１０１１（！中に再
懸濁し、３０°Ｃて２時間インキュベートする。次に、
その混合物を遠心にかけ、得られたプロトプラストをベ
レット化する。洗ｆＰｆｉ￥に溶液中でペレットを旋回
させることにより、ペレットをＰ培Ｉｔ！！ ｌ Ｏｔ
ｔｒＱで３回〆先浄する。得られたプロトプラストをそ
の後の形質転換のためにＰ培地２１に再１び濁する。
０°Ｃ，２０時間、ストレプトマイセス・グリセオフス
カスＣ５８１（ＡＴＣＣ２３９１６）を培養することに
より、常法通り増殖型接種物（Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ
ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を調製する。Ｓ、グリセオフスｈス
のプロトプラスト化は、一般に以下の如くに行われてい
る。Ｓ４グリセオフスカスの培養物を、ＹＭＸ寒天を含
んだ平板上に広げ、３０°Ｃて約４８時間インキュベー
トする。次に、その平板からの単一の細菌コロニーをＴ
ＳＢＩＱｉσに接種する；得られた培養物をホモジナイ
ズした後、晩、３０°Ｃでインキュベートする。その−
晩培養物約４ｍＱをホモジナイズし、０４％グリシンを
含むＴＳＢ１００ｆｆ１２に加え、次に３０°Ｃで一部
インキユヘートする。この手順を、新鮮な一晩培養物を
使って繰り返す。次に、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール
約５０１１ｆ２を得られた培養物に加え、１５ｍ（ｌ試
料７１丁を冷凍し、−２０°Ｃで６力月に及んで保存す
る。得られた凍結細胞を解凍するため試験管を室温でビ
ーカー内の水中に放置する。次いで、細胞をヘンチート
ップ遠心分離機で収穫し、０．３％ショ糖 １０２ρで
３回洗浄する。得られた細胞ベレットを、リソチーム（
Ｉｙｔｔｇ／ｍＱ）を加えたＰ培地１０１１（！中に再
懸濁し、３０°Ｃて２時間インキュベートする。次に、
その混合物を遠心にかけ、得られたプロトプラストをベ
レット化する。洗ｆＰｆｉ￥に溶液中でペレットを旋回
させることにより、ペレットをＰ培Ｉｔ！！ ｌ Ｏｔ
ｔｒＱで３回〆先浄する。得られたプロトプラストをそ
の後の形質転換のためにＰ培地２１に再１び濁する。
実帷例６に記載のライケート化Ｄ Ｎ Ａ、ストレプト
マイセス・グリセオフスカスのプロトプラス１−２００
μＱ、ストレプトマイセス・グリセオフスカスの胞子１
０８個、およびＰ培地中５５％ボッエチレングリコール
５００μＱを旋回させ、２５μＱおよび２５０μＱの試
料をＲ２Ｙ Ｅ ｌ・。
マイセス・グリセオフスカスのプロトプラス１−２００
μＱ、ストレプトマイセス・グリセオフスカスの胞子１
０８個、およびＰ培地中５５％ボッエチレングリコール
５００μＱを旋回させ、２５μＱおよび２５０μＱの試
料をＲ２Ｙ Ｅ ｌ・。
プ寒天３，１を含むＲ２ＹＥ平板上にプレートする。そ
の平（反を３７°Ｃてインキュベートする。プラークは
、たいてい〜２０時間後から認められる。
の平（反を３７°Ｃてインキュベートする。プラークは
、たいてい〜２０時間後から認められる。
プラーク発現後、それらを平板から取り出し、ファーン
粒子を寒天からＴＳＢ培地中に洗いｄｔす。このファー
／ｌ′ヒ濁液の連続希釈物を調製し、試料を取り出し、
ストーブＩ・マイセス・グリセオフスカスの胞子１０８
個と混合する。このような希釈物は、平板上でプラーク
をうまく分配させるために調製された。得られた混合物
をＹＭＸ平板にプレートシ、胞子が形成されるまで、約
４日かけて３０′Ｃでインキュベートする。胞子形成の
後、平板を２５μｇ／ｘＱ、スビロマインンまたはピク
ロマイシンを含んだ調製したばかりのＹＭＸ平板平板−
プリカ平板法に付す。次いで、得られたレプリカ平板を
３０°Ｃで３〜４日間日間インキュトートＳ、グリセオ
フスカス／ｐＦＪ３７６またはＳ グリセオフスカス／
ｐＦＪ３７７ピクロマイ／ン耐性コロニーを周知の方法
で単偏し、培養し、同定する。
粒子を寒天からＴＳＢ培地中に洗いｄｔす。このファー
／ｌ′ヒ濁液の連続希釈物を調製し、試料を取り出し、
ストーブＩ・マイセス・グリセオフスカスの胞子１０８
個と混合する。このような希釈物は、平板上でプラーク
をうまく分配させるために調製された。得られた混合物
をＹＭＸ平板にプレートシ、胞子が形成されるまで、約
４日かけて３０′Ｃでインキュベートする。胞子形成の
後、平板を２５μｇ／ｘＱ、スビロマインンまたはピク
ロマイシンを含んだ調製したばかりのＹＭＸ平板平板−
プリカ平板法に付す。次いで、得られたレプリカ平板を
３０°Ｃで３〜４日間日間インキュトートＳ、グリセオ
フスカス／ｐＦＪ３７６またはＳ グリセオフスカス／
ｐＦＪ３７７ピクロマイ／ン耐性コロニーを周知の方法
で単偏し、培養し、同定する。
実施例８
ｐｉｃＡ遺伝子を使用する多音り耐性の誘導ストレプト
マイセスまたはノカルデイアの抗生物質感受性株にｐｉ
ｃＡ遺伝子を形質転換し、および／または組込めば、ｐ
ｉｃＡ遺伝子か誘導され、カルボマインン、チロンンお
よびスピラマイシンに対するより高いレベルの耐性を付
与することができる。この誘導は、ｐｉｃＡを含む細胞
が〜０，１〜１０μｇ／辺ρのビクロマイシン、ロサロ
マインンまたはエリスロマイシンを加えた培地中で増殖
するときに起こる。次の第１１表にｐｉｃＡ遺伝子の誘
導パターンを示す。
マイセスまたはノカルデイアの抗生物質感受性株にｐｉ
ｃＡ遺伝子を形質転換し、および／または組込めば、ｐ
ｉｃＡ遺伝子か誘導され、カルボマインン、チロンンお
よびスピラマイシンに対するより高いレベルの耐性を付
与することができる。この誘導は、ｐｉｃＡを含む細胞
が〜０，１〜１０μｇ／辺ρのビクロマイシン、ロサロ
マインンまたはエリスロマイシンを加えた培地中で増殖
するときに起こる。次の第１１表にｐｉｃＡ遺伝子の誘
導パターンを示す。
（以下余白）
さらに、誘導されたｐｉｃＡｊｉｆｆｆ云子は、誘導さ
れ公子場合よりも、高しヘルの抗生物質耐性を付与する
。第１２表は、ｐｉｃＡｊｎｆ云子によって公子される
耐性の増加を示している。
れ公子場合よりも、高しヘルの抗生物質耐性を付与する
。第１２表は、ｐｉｃＡｊｎｆ云子によって公子される
耐性の増加を示している。
（以下余白）
第１図はプラスミドＴ）ＯＪ３２１の制限部位および機
能地図、第２図はプラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ
３７１の制限部位および機能地図、第３図はプラスミＩ
−ｐＦＪ３７２およびｐ Ｆ Ｊ ３７３の制限部位お
よび機能地図、第４図はプラスミドｐＦＪ３７４および
ｐＦＪ３７５の制限部位および機能地図、ならびに第５
図はファー／ｐＦＪ３７６およびｐＦＪ３７７の制限部
位および機能地図をそれぞれ表す模式図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カッパ代 理
人 弁理士 青白 葆 く外１名）ＦＩＧ、１ ＮｄｅＩ ０Ｊ３２１ ＦＩＧ、３ ＦＪ３７２ ＦＪ３７３ ＦＩＧ、２ ＦＪ３７０ ＦＪ３７１ ＦＩ Ｇ、 ４ ｃｏＲＩ ＦＪ３７５
能地図、第２図はプラスミドｐＦＪ３７０およびｐＦＪ
３７１の制限部位および機能地図、第３図はプラスミＩ
−ｐＦＪ３７２およびｐ Ｆ Ｊ ３７３の制限部位お
よび機能地図、第４図はプラスミドｐＦＪ３７４および
ｐＦＪ３７５の制限部位および機能地図、ならびに第５
図はファー／ｐＦＪ３７６およびｐＦＪ３７７の制限部
位および機能地図をそれぞれ表す模式図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カッパ代 理
人 弁理士 青白 葆 く外１名）ＦＩＧ、１ ＮｄｅＩ ０Ｊ３２１ ＦＩＧ、３ ＦＪ３７２ ＦＪ３７３ ＦＩＧ、２ ＦＪ３７０ ＦＪ３７１ ＦＩ Ｇ、 ４ ｃｏＲＩ ＦＪ３７５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）複製起点および組込み配列からなる群から選
択されるＤＮＡ配列、および （ｂ）抗生物質ピクロマイシン、およびその他のマタロ
ライド系抗生物質に対する耐性を付与するピクロマイシ
ン耐性付与遺伝子 を含有する組替えＤＮＡクローニングベクターであって
、該複製起点および組込み配列がストレプトマイセスお
よびノカルジア内で機能するものであるベクター。 ２、プラスミドである請求項１に記載のベクター。 ３、第３図に示されるプラスミドｐＦＪ３７２およびｐ
ＦＪ３７３からなる群から選択される請求項２に記載の
プラスミド。 ４、ストレプトマイセスのゲノムに組込み可能な請求項
２に記載のプラスミド。 ５、第４図に示されるプラスミドｐＦＪ３７４およびｐ
ＦＪ３７５からなる群から選択される請求項４に記載の
プラスミド。 ６、ファージである請求項１に記載のベクター。 ７、第５図に示されるファージｐＦＪ３７６およびｐＦ
Ｊ３７７からなる群から選択される請求項６に記載のフ
ァージ。 ８、（ａ）大腸菌複製起点、および （ｂ）大腸菌内で適当な表現型を付与するＤＮＡ配列 をさらに含有する請求項１に記載の組換えＤＮＡクロー
ニングベクター。 ９、プラスミドである請求項８に記載のベクター。 １０、第１図に示されるプラスミドｐＯＪ３２１、第２
図に示されるｐＦＪ３７０および第２図に示されるｐＦ
Ｊ３７１からなる群から選択される請求項９に記載のプ
ラスミド。１１、ストレプトマイセス・フェレウスのピ
クロマイシン耐性遺伝子を含有する組換えＤＮＡ配列構
築物。 １２、プラスミドｐＯＪ３２１の〜２．８ｋｂＰｖｕI
I制限フラグメント。 １３、請求項１、請求項２、請求項６または請求項９に
記載の組換えＤＮＡクローニングベクターで形質転換さ
れたストレプトマイセス、ノカルジアまたは大腸菌の宿
主細胞。 １４、請求項１１に記載のピクロマイシン耐性遺伝子の
プロモーターを誘導する方法であって、 （ａ）該耐性遺伝子を含有する細胞を、エリスロマイシ
ン、ロサロマイシンおよびビクロマイシンからなる群か
ら選択される抗生物質を低濃度で含有する培地で増殖さ
せ、次いで、 （ｂ）誘導された細胞を、リンコマイシン、スピラマイ
シン、カルボマイシンおよびタイロシンからなる群から
選択される抗生物質を含有する培地に移す、 ことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US226360 | 1988-07-29 | ||
| US07/226,360 US5057425A (en) | 1988-07-29 | 1988-07-29 | Picromycin resistance-conferring gene, designated pica, for use in streptomyces and other organisms |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0286780A true JPH0286780A (ja) | 1990-03-27 |
Family
ID=22848628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1197911A Pending JPH0286780A (ja) | 1988-07-29 | 1989-07-28 | ピクロマイシン耐性付与遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5057425A (ja) |
| EP (1) | EP0359379A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0286780A (ja) |
| DK (1) | DK369589A (ja) |
| IL (1) | IL91124A0 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69233336T2 (de) * | 1991-02-26 | 2005-03-31 | Astrazeneca Ab | Vektor |
| US6265202B1 (en) | 1998-06-26 | 2001-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA encoding methymycin and pikromycin |
| US20030194784A1 (en) * | 2001-04-17 | 2003-10-16 | Sherman David H. | DNA encoding methymycin and pikromycin |
| US20040161839A1 (en) * | 2001-10-05 | 2004-08-19 | Hung-Wen Liu | Method to alter sugar moieties |
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|---|---|---|---|---|
| US4704362A (en) * | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
| US4680265A (en) * | 1984-09-25 | 1987-07-14 | Eli Lilly And Company | Method of selecting recombinant DNA-containing streptomyces |
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