JPS63279793A - スピラマイシン耐性を付与するクローニングベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ＳｒｍＣと命名した新規のスピラマイシン耐
性付与遺伝子、該遺伝子を含有する組換えＤＮＡクロー
ニングベクター、および該スピラマイシン耐性付与ベク
ターを含有する形質転換体に関する。ストレプトマイセ
ス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）は、スピラマイシン、すなわ
ち１６員環のラクトンおよび３種類の糖残基（ミカミノ
ーゼ、ミカローゼおよびフォロサミン）からなるマクロ
ライド系抗生物質を産生じ、この物質は臨床用および獣
医学用薬物として用いられている。スピラマイシンの抗
生物質活性は、他のマクロライド類と同様、スピラマイ
シンのリポソームへの結合を含む機序によって、タンパ
ク質の合成が阻害されることによるものである。

また、本発明は、ストレプトマイセス属およびその関連
微生物で用いるためのスピラマイシン耐性付与クローニ
ングベクターに関する。ストレプトマイセス属において
組換えＤＮＡ法を開発するのは、適当なりローニングベ
クターにおいて選択可能な遺伝子マーカーを利用するこ
とができるかどうかにかかっている。現在ストレプトマ
イセス属に使用することができる選択可能なマーカー数
が少ないことから、この開発は幾分遅れている。

本発明は、このような用途に適した選択可能なマーカー
の数を増加させるという点で有用であるとともに特に重
要である。

本発明のベクターは、多用途であり、選択可能であり、
そしてスピラマイシンに感受性であるとともにストレプ
トマイセス・レプリコンあるいはベクターの組込み配列
に許容性であるあらゆるストレプトマイセス属細胞に導
入することができる一３＝ か、またはコンジュゲート化することができるので、特
に有用である。さらに、本ベクターは、大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などの他のもっと都合の
よい宿主細胞中で機能的かつ二官能性にすることができ
る。ストレプトマイセス属は臨床的に重要な抗生物質の
半数以上を提供しており、従って産業上重要な群である
。本発明は、この産業上重要な群のための新規かつ有用
なりローニングベクターを提供し、そして既知の抗生物
質の収量を増加させるため、ならびに新規抗生物質およ
び抗生物質誘導体を製造するための遺伝子のクローニン
グを可能にするものである。

さらに、本発明は、形質転換されていない細胞群からス
トレプトマイセス属形質転換体を選択するための方法に
関する。この方法を用いると、非選択性のＤＮＡを本ベ
クターに付加し、得られた修飾ベクターでストレプトマ
イセス属を形質転換することにより、この方法を用いな
ければ選択することができないこのＤＮＡを含んでいる
スピラマイシン耐性の形質転換体を選択することができ
る。形質転換は極めて頻度の低い現象であるので、この
ような機能試験は、無数の細胞の中でどの細胞が形質転
換ＤＮＡを獲得したかを決定するのに実際上必要である
。

語句の定義 本明細書中に開示した発明のために以下の語句を定義す
°る。

組換えＤＮＡクローニングベクター：あらゆる自律的に
複製するか、または組込む媒体であり、これには１また
はそれ以上の付加的なりＮＡ上セグメント付加したか、
または付加することができるＤＮＡ分子からなるプラス
ミドが含まれるが、これに限定はされない。

レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自律的な
複製を可能にし、そしてコントロールするＤＮＡ配列。

組込み配列二組換えＤＮＡクローニングベクターまたは
ベクターの一部が宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組込まれ
、そしてその一部となるように導＜ＤＮＡ配列。

プラスミド：ファージとして働くこともあり、またプラ
スミドとして働くこともある組換えＤＮＡベクター。

形質転換：受容細胞の遺伝子型を変化させ、該細胞に変
化をもたらすことになる、受容宿主細胞へのＤＮＡの導
入。

形質転換体：形質転換を受けた受容宿主細胞。

トランスフェクタント：ファージＤＮＡによる形質転換
を受けた受容宿主細胞。

感受性宿主細胞：選択可能な耐性の性質をコードしてい
るＤＮＡセグメントなしでは生育することができない宿
主細胞。

制限フラグメント：１またはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成するあらゆる直線状のＤＮＡ分子。

Ａ♂：アンピシリン耐性の表現型。

ＡｐＨ：アンピシリン耐性の表現型。

ｃｏｓ　：ファージ・ラムダの付着末端配列。図面にお
いて、ｒｃＪは左ｃｏｓを、「、」は右ｃｏｓ末喘を表
す。

Ｎ　ｍＲ：ネオマイシン耐性の表現型。

ｏｒｉ　ニブラスミドの複製起源。

ＳｍＲ；スピラマイシン耐性の表現型。

ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性の表現型。

Ｔｓ”：チオストレプトン耐性の表現型。

ＳｒｍＣニスピラマイシンＣ耐性を付与する遺伝子。　
　　　・ 図面の説明 第１図は、プラスミドｐＫＣ５９２の制限部位および機
能地図を示す模式図である。本出願用の、第１図および
それに続くすべての図面は正確な縮尺では描かれていな
い。

第２図は、ニスミドｐＫＣ５０５およびストレプトマイ
セス・アンボファシエンスＤＮＡを用いる、ゲノムＤＮ
Ａライブラリー作成の工程図である。

第３図は、コスミドｐＫＣ５０５作成の工程図である。

第４図は、プラスミドｐＨＪ　Ｌ　２２５の制限部位お
よび機能地図を示す模式図である。

第５図は、プラスミドｐＨＪＬ４００の制限部位および
機能地図を示す模式図である。

第６図は、プラスミドｐＫＣ６３１の制限部位および機
能地図を示す模式図である。

第７図は、プラスミドｐＫＣ６８１の制限部位および機
能地図を示す模式図である。

第８図は、プラスミドｐＫＣ６８２の制限部位および機
能地図を示す模式図である。

第９図は、プラスミドｐＫＣ１００１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。

第１０図は、プラスミドｐＫＣ１００２の制限部位およ
び機能地図を示す模式図である。

第１１図は、プラスミドｐＫＣ３３１の制限部位および
機能地図を示す模式図である。

第１２図は、ファージｐＫＣ１００３の制限部位および
機能地図を示す模式図である。

第１３図は、ファージｐＫＣ１００４の制限部位および
機能地図を示す模式図である。

発明の目的および構成 本発明は、 一８＝ ａ）複製起源および組込み配列からなる群から選ばれる
ＤＮＡ配列、 ｂ）抗生物質スピラマイシンに対する耐性を付与するス
ピラマイシンＣ耐性遺伝子、 を含有することを特徴とする組換えＤＮＡクローニング
ベクターを提供するものである（ただし、この複製起源
および組込み配列がストレプトマイセス属およびノカル
ジア属中で機能し得るという限定のもと）。

本発明のベクターは、プラスミドｐＫＣ５９２のスピラ
マイシンＣ耐性遺伝子（Ｓ　ｒｎ＋Ｃ）含有ノ〜２．９
ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ消化した
プラスミドｐＨＪＬ４００にライゲートし、プラスミド
ｐＫＣ６３１を生成させることによって組立てることが
できる。プラスミドｐＫＣ５９２は、ノーザン・リージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリ−［ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
。

ｒａｔｏｒｙ（Ｎ　ＲＲＬ）、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ＋　１８１５
　Ｎｏｒｔｈ　ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ
、　Ｌｌ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｐｅｏｒｉａ、　　ＩＬ　６１６
０４コに寄託され、その永久保存培養物コレクションの
一部を成している株である、大腸菌に１２ＤＨ５／ｐＫ
Ｃ５９２から得ることができる。この株は、受入れ番号
ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１８６のもと、プラスミドの供給源
および貯蔵体として一般に入手可能である。プラスミド
ｐＨＪＬ４００は、実施例９の詳細な教示に従って作成
される。

ある種の目的のためには、そしである種の条件下では、
ストレプトマイセス属およびその関連微生物中でよりも
大腸菌中でクローニングベクターを増殖させる方がもっ
と都合がよいことは当業者の容易に理解するところであ
ろう。従って、本発明のベクターを修飾して大腸菌およ
びストレプトマイセス属の両者の中で機能的な二官能性
のシャトルベクターとしてもよい。これは、適当な大腸
菌の複製起源および選択可能な配列を、上記のストレプ
トマイセス属のスピラマイシン耐性ヲ付与するベクター
に付加することによって行われる。

すなわち、本発明は、 ａ）大腸菌の複製起源、および ｂ）大腸菌に選択可能な表現型を付与するＤＮＡ配列、 をさらに含有する組換えＤＮＡクローニングベクターを
も含むものである。

プラスミドｐＫＣ５９２は、ＳｒｍＣ，ストレプトマイ
セス・レプリコン、大腸菌レプリコン、ならびにストレ
プトマイセス属および大腸菌の両者において選択可能な
表現型を付与するアブラマイシン耐性遺伝子を含有する
二官能性シャトルベクターの例である。このプラスミド
は、上記のＮＲＲＬに寄託されている大腸菌Ｋ　１２　
ＤＨ５／ｐＫＣ５９２から入手することができる。

本ベクターは、既知のストレプトマイセス・アンポファ
シエンス株（ＮＲＲＬ　　１５２６３）から単離した新
規のスピラマイシンＣ耐性遺伝子を含有している。その
他のスピラマイシン耐性遺伝子も知られているが（すな
わち、スピラマイシンＡおよびスピラマイシンＢ）、ス
ピラマイシンＣとの有意の相同性を有していない；従っ
て、これらは本発明の範囲内に含まれない。本遺伝子は
、マクロライド系抗生物質スピラマイシンに対して、お
よびある場合には同時に他の抗生物質に対しても耐性を
付与する。ある種の抗生物質耐性遺伝子のこのような交
差耐性は、フジサワおよびウニイスプラム［Ｆｕｊｉｓ
ａｗａ　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ。

■」郵：６２１（１９８１）］を含む何人かの著者によ
って報告されている既知の現象である。

このスピラマイシンＣ耐性遺伝子は、部分消化の条件下
でＳ、アンボファシエンスＤＮＡをＭｂ。

Ｉ制限酵素で処理して平均の大きさが〜３０ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントを生成させることによって、ストレプト
マイセス遺伝子バンクから単離される。

次いで、このフラグメントをコスミドｐＫ　Ｃ５０５中
にライゲートして、本発明の例示ベクターを誘導する。

コスミドｐＫＣ５０５およびＳ、アンボファシエンスＤ
ＮＡを用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作成工程の概
略を添付の第２図に示した。

コスミドｐＫＣ５０５は、大腸菌レプリコン、５ＣＰ２
★ストレプトマイセス・レプリコンおよび生殖機能、３
つのバクテリオファージλｃｏｓ部位、ならびにアブラ
マイシン耐性遺伝子を含有する二官能性のシャトルベク
ターである。このベクターは、前記の誘導体１）ＫＣ５
９２のようなＳｒｍＣ含有の誘導体プラスミドを組立て
るのに理想的なベクターである。

コスミドｐＫＣ５０５を制限酵素Ｈｐａｌで処理して直
線状の平滑末端フラグメントを生成させることによって
これを行った。得られたＨｐａｌ末端を脱ホスホリル化
し、次いでこのフラグメントをＢａｍＨＩ制限酵素で切
断して、λｃｏｓ部位を１つだけ有する小さいフラグメ
ントとλＣｏＳ部位を２つ有する比較的大きいフラグメ
ントを得た（詳細については添付の第２図を参照）。従
って、この両フラグメントは脱ホスホリル化した平滑末
端を１つ（ライゲートすることができない）とそれとは
別のホスホリル化されている付着性のＧＡＴＣ末端（Ｍ
ｂｏｌ消化によって生成した末端にライゲートすること
ができる）を有している。

ｐＫＣ５０５からのＤＮＡフラグメントとストレプトマ
イセス・アンボファシエンスからのそれとを混合し、Ｔ
４　　ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートした。従って
、挿入Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌ：２つのベクターフラグメントと
境界を接しており、ライゲートされたＤＮＡはインビト
ロでバクテリオファージλ粒子（コスミド）にパッケー
ジされる。次いで、このパッケージされたコスミドを大
腸菌に１２ＳＦ８に導入してアブラマイシン耐性につい
て選択し、得られた大腸菌の形質転換体を集めて一部プ
ラスミドプールを作成した。この−次ブール（ライブラ
リー）からのＤＮＡを構造分析してクローンしたライブ
ラリーが所望の配列を含んでいることを確かめ、また適
当なストレプトマイセス属宿主に導入することによって
機能的に分析した。すなわち、プールしたプラスミドＤ
ＮＡを用いてＳ。

グリセオフスカスを形質転換し、アブラマイシン耐性に
ついて選択し、次いで耐性コロニーのすべてを集め、液
体培地で増殖させ、プレートし、そしてスピラマイシン
耐性の表現型について選択した。スピラマイシン耐性コ
ロニーからのプラスミドは同一であることがわかり、制
限酵素分析した上で、ｐＫＣ５９２と命名した。

例示したプラスミドｐＫＣ５９２をＢａｍＨＩ制限酵素
で消化し、得られた〜１．５、〜１．７、〜１．８、〜
２．１、〜２．９、〜５．５および〜９゜４ｋｂフラグ
メントを前記ｐＨＪＬ４００のＢａｍＨ１部位にライゲ
ートすることによって、多種の誘導体ベクターを組立て
た。得られたベクターを用いてストレプトマイセス・グ
リセオフスカスを形質転換し、ＳｒｍＣ遺伝子が〜２．
９ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメント中に位置していること
を明らかにした。

この〜２．９ｋｂを含有している誘導体プラスミドをプ
ラスミドｐＫＣ６３１と命名した。上記ベクターはＳ’
ｒｍＣ遺伝子を含有しており、従って本発明をさらに例
示するものである。プラスミドｐＫＣ６３１の制限部位
および機能地図を添付の第６図に示す。

また、〜２．９ｋｂのＳｒｍＣ遺伝子を含有している制
限フラグメントを、ストレプトマイセス・レプリコンだ
けを含有している通常のストレプトマイセス属ベクター
にクローンすることもできる。

〜１５− 例えば、〜２．９ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントをプラ
スミドｐｌＪ７０２の唯一のＢａｍＨＴ部位にライゲー
トして、ＳｒｍＣフラグメントの配向だけが異なってい
るプラスミドｐＫＣ’６８１およびｐＫＣ５８２を得る
ことができる。これらのプラスミドをストレプトマイセ
ス種中に導入すると、それ以前はスピラマイシン感受性
であった宿主にスピラマイシン耐性を付与することがで
きる。プラスミドｐｌＪ’７０２は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー０コレクシヨン［ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ）、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌ
ａｎｄ、　２０８５２］に寄託されてその永久保存培養
物コレクションの一部を成している株であるストレプト
マイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１
ｉｖｉｄａｎｓ）／ｐｌ　Ｊ７０２から入手することが
できる。この株は、受入れ番号ＡＴＣＣ３９１５５のも
と、プラスミドの供給源および貯蔵体として一般的に入
手可能である。プラスミドｐＫＣ６８１およびｐＫＣ６
８２の制限部位および機能地図を添付の第７図および第
８図に示す。

さらに、この〜２．９ｋｂのＳｒｍＣ遺伝子含有制限フ
ラグメントを用い、宿主ゲノムへのホモローガスな組換
えおよび組込みによって、感受性宿主にスピラマイシン
耐性を付与することができる。

例えば、ストレプトマイセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔ
。

ｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ；　ＡＴＣＣ１９６０９）
をＭｂｏＩ制限酵素で部分的に消化し、次いで５゛突出
をＤＮＡポリメラーゼＩで充填することができる。

次いでこのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断して充填しておい
たプラスミドｐＢＲ３２２（ＢＲＬ）にライケートし、
大腸菌ＪＭ１０９細胞［ストラドジエン（Ｓｔｒａｔｏ
ｇｅｎｅ）］に導入し、テトラサイクリン耐性について
選択する。次いで、得られたプラスミドをＢａｍＨＩ制
限酵素で部分的に消化し、このＢａｍＨＩ部位にｐＫＣ
５９２由来の〜２．９ｋｂ　ＳｒｍＣ遺伝子含有フラグ
メントをライゲートする。大腸菌に導入してテトラサイ
タリン・プレートで選択すると、Ｓ、フラジよりＮＡ中
にクローンされたＳｒｍＣ遺伝子を有するプラスミドだ
けが生存する。

この生存形質転換体を集め、ＳｒｍＣフラグメントの配
向だけが異なっているこれらのプラスミドをｐＫＣｌｏ
ｏｌおよびｐＫＣ１００２と命名した。

ストレプトマイセス・フラジエに逆導入すると、これら
のプラスミドはストレプトマイセス・レプリコンを含有
していないので自律的に複製することができない。従っ
て、生成した耐性コロニーだけが、ホモローガスな組換
えおよびそれに続く組込みが起こった細胞から増殖した
コロニーである。

プラスミドｐＫＣ１００１およびｐＫＣ１００２の制限
部位および機能地図を添付の第９図および第１０図にそ
れぞれ示す。この５ｒＩＩＩＣ遺伝子がストレプトマイ
セス・レプリコンを含有するプラスミド上に存在すると
きであっても、低頻度ではあるが検出しうる組込みがあ
らゆる培養物中でなお起こりうろことに注意すべきであ
る。すなわち、自律的に複製するベクターは低頻度では
あるが「組込む」こともある。

また、このＳｒｍＣ遺伝子を用いてプラスミド以外の例
示ベクターを組立てることもできる。例えば、ファージ
φＣ３１は、よく知られたストレプトマイセス・ファー
ジであり、ある種の他の組込みベクターを組立てるため
の優れた出発物質である。ファージφＣ３１の誘導体で
あるプラスミドｐＫＣ３３１は、このような組込みベク
ターの組立てに特に好ましく、受入れ番号ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５８２８のもとて前記のノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリ−に寄託されてその永久保存培養
物コレクションの一部を成している株である大腸菌に１
２　ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３１から入手することができ
る。プラスミドｐＫＣ３３１の制限部位および機能地図
を添付の第１１図に示す。

プラスミドｐＫＣ３３１の〜３７ｋｂＰｓｔＩ制限フラ
グメントをプラスミドｐＫＣ５９２の〜２．９ｋｂのス
ピラマイシン耐性を付与するＢａｍＨＩ制限フラグメン
トにライゲートすると（ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて
両フラグメントの５”突出部を充填した後に）、誘導体
ファージｐＫＣ１００３およびｐＫＣ１００４（これら
はＳｒｍＣ遺伝子の配向だけが異なっている）が得られ
る。これらのファージは、ストレプトマイセスにスピラ
マイシン耐性を付与する組込みベクターであり、従って
本発明をさらに例示するものである。ファージｐＫＣ１
００３およびｐＫＣ１００４の制限部位および機能地図
を添付の第１２図および第１３図にそれぞれ示す。

ＳｒｍＣ遺伝子を含有している制限フラグメントが特定
のベクターまたはクローニングベクター上の位置に限定
されないことは理解されよう。例えば、スピラマイシン
耐性遺伝子をその他の既知ベクター、その名をいくつか
挙げると、ｐｓｃＰ１０３由来のプラスミド［リジエー
ト等（Ｌｙｄｉａｔｅ　ｅｔａｌ、、　１９８５．　Ｇ
ｅｎｅ　３５：　２２３）］、ｐＦＪ１０３由来のプラ
スミド［リチャードソン等（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　ｅ
ｔａｔ、、　　１９８２．　Ｇｅｎｅ　２０：　４５１
）コ、およびｐ）（、Ｔｂ２Ｏ３［バーシュバーガー等
（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８Ｂ
、　Ｐｌａｓｍｉｄ　１５　：　１９９−２０９）］な
どにサブクローンすることができる。当分野の技術者で
あれば、どのベクターが特定の目的に望ましいか、およ
びベクターのどの部位が特定のスピラマイシン耐性遺伝
子を含有している制限フラグメントのライデートあるい
は挿入に有利であるかを知っているか、または容易に決
定することができる。さらに、分子リンカ−を供してＤ
ＮＡのサブクローニング用の特異的な部位を創製するこ
とができるか、またはある種のヌクレオチドの付加、削
除あるいは置換によってフラグメントを修飾してその性
質を変え、種々のＤＮＡライゲート用制限部位を提供す
ることができる。当分野では、ヌクレオチドの化学およ
び遺伝子のコードが知られており、従ってどのＤＮＡ修
飾が特定の目的のために望ましいかが知られている。

例示したプラスミドｐＫＣ５９２はコスミドｐＫＣ５０
５から誘導した５ＣＰ２★ストレプトマイセス・レプリ
コンを含有しているが、その他多数のストレプトマイセ
ス・レプリコンに置換して同様のベクターを組立てるこ
ともできる。第１表は、別の機能的なストレプトマイセ
ス・レプリコンを入手することができるストレプトマイ
セス属プラスミドの例を挙げるものであるが、これは包
括的なものではない。レプリコン機能が破壊されないか
ぎり、プラスミドの全部または一部を用いて本発明の例
示ベクターを組立てることができることは当分野で理解
されるところであろう。プラスミドを含有している宿主
および寄託の受入れ番号も第１表に挙げている。

第１表ストレプトマイセス属プラスミド５ＣＰ２　　　
　ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）　Ａ３（２）　　
　ＮＲＲＬ　　１５０４２ｐＥＬ７　　　　ストレプト
マイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）　　　ＮＲＲＬ　　１
２５２３ＳＬＰＩ　　　　ストレプトマイセス・リビダ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ）
　　　　　　　　ＮＣＩＢ’　１１４１７１）ＮＭｌｏ
ｏ　　　ストレプトマイセス・バージニエ（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）　　　　　　　
ＮＲＲＬ　　１５１５６ｐＥＬ１０３　　　ストレプト
マイセス・グラニュロラバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ）Ａ３９９１２．１３／
ｐＥＬ１０３　　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　　１２
５４９ｐｌＪ７０２　　　ストレプトマイセス・リビダ
ンス１ナシヨナル・コレクション・オブ・インダストリ
アル・バクテリア［Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ａ（ＮＣＩＢ）。

Ｔｏｒｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ、　Ｐ
ｏ５ｔ　０ｆｆｉｃｅ　Ｂｏｘ　３１．１３５　Ａｂｂ
ｅｙＲｏａｄ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ　ＡＢ９ｇＤＧ、　
５ｃｏｔｌａｎｄ、　ｌ１ｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ
］２アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、　１２３０１　Ｐａｒｋｌ
ａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０５８２
．　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃ
ａ］その他のレプリコン、例えば５ＬＰ１．２［ホリノ
ウチ等（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９
８５．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１６２　：　
４０６）］、ｐｓＲｃ１−ｂ［シンドー等（Ｓｈｉｎｄ
ｏｈ　ｅｔ　ａｔ、、　　１９８４．　　Ｊ、　　Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔ、　　３７：　５１２）］、ｐｓ　Ｌ　１
　［ナカノ等（Ｎａｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８
２＋　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　
１３：　２７９）］およびｐＳＦ７６５［ムラカミ等（
Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｊ、
　Ａｎｔｉｂｉｏｔ。

３６　：　４２９）］なども用いることができ、これら
も本発明の範囲内に含まれる。

本発明のベクターは、ストレプトマイセス舎レプリコン
、スピラマイシン耐性を付与する制限フラグメント、な
らびに所望により大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）レプリコン
および選択しうる配列を含有している。

プラスミドの操作および増幅はストレプトマイセス中よ
りも大腸菌中での方がより早く、かつより効率的に行わ
れるので、大腸菌レプリコンが存在することは有利であ
り、本例示ベクターの全般的な用途を増加させる。事実
、大腸菌に関する遺伝子的なおよび生化学的な情報が豊
富であるということにより、この菌が本発明にとって都
合のよい宿主細胞となっている。しかし、本発明はいず
れかの種または株に限定されるものではなく、大腸菌レ
プリコンが機能するあらゆる微生物を用いて行うことが
できる。特定の大腸菌レプリコンの存在が本ベクターの
必須成分ではないので、大腸菌プラスミド、例えばｐｃ
Ｚｌｏｌ［ショーナー等（Ｓｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ。

ＩＪＳＡ　ａｔ　：　５４０３）］、ｐＡｃＹｃ１８４
、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８などからの、機能的なレ
プリコンを含有している制限フラグメント、および所望
により、抗生物質耐性を付与する制限フラグメントを置
換することは本発明の範囲内に含まれる。多数のその他
の宿主細胞が本明細書中に例示されているが、これらは
当分野では周知であろう。

また、本発明の組換えＤＮＡクローニングベクターは、
ストレプトマイセス属の単一の種あるいは株で使用する
ことに限定されない。対照的に、本ベクターは適用範囲
が広く、多数のストレプトマイセス群のスピラマイシン
感受性宿主細胞、特に抗生物質、例えばアミノ−グリコ
シド、マクロライド、β−ラクタム、ポリエーテルおよ
びグリコペプチド系抗生物質を産生ずる産業上重要な群
の非制限株に用いることができる。このような非制限部
は、当分野でよく知られた通常の方法［ロモフスカヤ等
（Ｒｏｍｏｖｓｋａｙ・ａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０
．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、４４
　：　２０６）］によって、ストレプトマイセス群から
容易に選択され、単離される。非制限部の宿主細胞は制
限酵素を欠いているので、形質転換時にプラスミドＤＮ
Ａを切断しないか、または減成しない。本発明の応用か
らすると、本ベクターのいずれの制限部位をも切断しな
い制限酵素を含んでいる宿主細胞も非制限性であるとみ
なされる。

ＳｒｍＣ遺伝子を用いて、多種類のスピラマイシン感受
性の微生物をスピラマイシン耐性に形質転換することが
できる。スピラマイシンを包含するマクロライド系抗生
物質に元来感受性である微生物においては、このＳｒｍ
Ｃ遺伝子を遺伝子マーカーとして用いることができ、一
方、１またはそれ以上のマクロライド系抗生物質を産生
ずるがそれでもなお低レベルのマクロライド系抗生物質
に感受性である微生物においては、本発明のベクターを
用いて微生物の天然の耐性を増加または増強することが
できる。本ベクターを導入することができる、スピラマ
イシン感受性のストレプトマイセス群の非制限部の好ま
しい宿主細胞には、例えばストレプトマイセス・コエリ
カラ−（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌ
ｏｒ）、Ｓ、グラニュロラバー（Ｓ、　ｇｒａｎｕｌ。

ｒｕｂｅｒ）、Ｓ、ロセオスポラス（Ｓ、　ｒｏｓｅｏ
ｓｐｏｒｕｓ）、Ｓ。

アクリマイシンス（Ｓ、　ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ）、Ｓ
、グラウセスセンス（Ｓ、　ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）
、Ｓ、パルビリン（Ｓ、　ｐａｒｖｉｌｉｎ）、Ｓ、プ
リスチナエスピラリス（Ｓ、　ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐ
ｉｒａｌｉｓ）、Ｓ、ビオラセオラバ−（Ｓ、　ｖｉｏ
ｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、Ｓ、ピナセウス（Ｓ、　ｖｉ
ｎａｃｅｕｓ）、Ｓ、ニスピノサス（Ｓ、　ｅｓｐｉｎ
ｏｓｕｓ）、Ｓ、アズレウス（Ｓ、　ａｚｕｒｅｕｓ）
、Ｓ、グリセオフスカス（Ｓ、　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃ
ｕｓ）、Ｓ、フラジエ（Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ）および
Ｓ、）ヨカエンシス（Ｓ、　ｔｏｙｏｃａｅｎｓ　ｉｓ
）などの非制限細胞が含まれる。

ＳｒｍＣ遺伝子を用いることが可能な、種々の他の抗生
物質を産生ずる微生物の代表的な例を以下の表に挙げる
。

−２７−’ 多数の種　　　　　　　　　　　　　　　種々のアミノ
サイクリトール類 ミクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）
多数の種　　　　　　　　　　　　　　　ゲンタマイシ
ン類すツカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｐｏｌｙｓｐ
ｏｒａ）多数の種　　　　　　　　　　　　　　　種々
のアミノサイクリトール類 ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ア
ルボグリセオラス（ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）　　
　ネオマイシン類アルプス変種メタマイシヌス（ａｌｂ
ｕｓｖａｒ、　ｍｅｔａｍｙｃｉｎｕｓ）　　　　　　
　　　　　メタマイシンアクアカヌス（ａｑｕａｃａｎ
ｕｓ）　　　　　　　　　Ｎ−メチルハイグロマイシン
Ｂ アトロファシェンス（ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）　　　
　ハイグロマイシン類ビキニエンシス（ｂｉｋｉｎｉｅ
ｎｓｉｓ）　　　　　　ストレプトマイシンプルエンシ
ス変種プルエンシス （ｂｌｕｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｂｌｕｅｎｓｉｓ）　
　　　　　　　プルエンソマイシンカヌス（ｃａｎｕｓ
）　　　　　　　　　　　　　リボシルパロマミン力テ
ヌラエ（ｃａｔｅｎｕｌａｅ）　　　　　　　　　カテ
ヌリンタレストマイセチクス（ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅ
ｔ　１ｃｕｓ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ア
ミノシジンクリスタリヌス（ｃｒｙｓｔａｌ　１ｉｎｕ
ｓ）　　　　　　ハイグロマイシンＡエリスロクロモゲ
ネス変種ナルトエ ンシス（ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ｖａ
ｒ；ｎａｒｕｔｏｅｎｓｉｓ）　　　　　　　　　　　
　　　ストレプトマイシン、−２８− エウロシジクス（ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ）　　　　　
　　Ａ　１６３１６　　Ａフラジエ（ｆｒａｄｉａｅ）
　　　　　　　　　　　ハイブリマイシン類およびネオ
マイシン類 フラジエ変種イタリクス（ｆｒａｄｉａｅｖａｒ、　１
ｔａｌｉｃｕｓ）　　　　　　　　　　　　　７ミ／シ
シ；ｔガルブス（ｇａｌｂｕｓ）　　　　　　　　　　
　　ストレプトマイシングリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ）
　　　　　　　　　　　ストレプトマイシングリセオフ
ラバス（ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ）　　　　　ＭＡ　
　１２６７ホフエンシス（ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ）　　　
　　　　　セルドマイシン複合体バイグロスコピカス（
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）　　　　ハイグロ・マイ
シン類、ロイカニシジン、およ びハイグロリジン パイグロスコピカス品種グレボサス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｆｏｒｍａ　ｇｌ’ｅ
ｂｏｓｕｓ）　　　　　グレボマイシンハイグロスコピ
カス変種すモ不ウス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ、　　ｌｉｍｏ
ｎｅｕｓ）　　　　　　バリダマイシン類バイグロスコ
ピカス変種すガミエンシス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
ｓ　ｖａｒ、　ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ）　　　　スペ
クチノマイシンカナマイセチカス（ｋａｎａｍｙｃｅｔ
　１ｃｕｓ）　　　　カナマイシンＡおよびＢ カスガエンシス（ｋａｓｕｇａｅｎｓ　ｉｓ）　　　　
　　カスガマイシン類力スガスピナス（ｋａｓｕｇａｓ
ｐｉ　ｎｕｓ）　　　　　　カスガマイシン類うベンデ
ュラエ（ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）　　　　　　　ネオマ
イシンリビダス（１１ｖｉｄｕｓ）　　　　　　　　　
　　　リビドマイシン類ミクロスポレウス（ｍｉｃｒｏ
ｓｐｏｒｅｕｓ）　　　　　Ｓ　Ｆ　−７６７ネトロプ
シス（ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ）　　　　　　　　　Ｌ　Ｌ
−ＡＭ３１ノボリドエンシス（ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓ
ｉｓ）　　　　ハイグロマイシン類オリバセウス（ｏｌ
　１ｖａｃｅｕｓ）　　　　　　　　　ストレプトマイ
シンオリボレチクリ変種セルロフィラス （ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ　ｖａｒ、　ｃｅｌｌｕ
ｌｏｐｈｉｌｕｓ）　　　デストマイシンＡポーレンシ
ス（ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ）　　　　　　　　　ストレプ
トマイシンラメウス（ｒａｍｅｕｓ）　　　　　　　　
　　　　ストレプトマイシンリボシジフィクス（ｒｉｂ
ｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）　　　　　Ｓ　Ｆ　７３３リモ
フアシエンス（ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）　　　　　　
デストマイシンＡリモサス品種パロモマイシヌス （ｒｉｍｏｓｕｓ　ｆｏｒｍａ　ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉ
ｎｕｓ）　　　　　バロモマイシン類およびカテヌリン スペクタビリス（ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）　　　　　
　　スベクチノマイシンテネブラリウス（ｔｅｎｅｂｒ
ａｒｉｕｓ）　　　　　　　）ブラマイシンおよびアク
タマイシン メジテラネイ（ｍｅｄｆｔｅｒｒａｎｅｉ）　　　　　
　リファｖイシンナプトマイシン類 ジアストクロモゲネス （ｄｉａｓｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）　　　　　　
　　　アンサトリエン類およびナプトマイシン類 ガルブス亜種グリセオスボレウス （ｇａｌｂｕｓ　５ｕｂｓｐ、　ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒ
ｅｕｓ）　　　　ナプトマイシンＢバイグロスコピカス
（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）　　ハービマイシンハ
イクロスコピカス変種ゲルダヌス 変種ツバ（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ。

ｇｅｌｄａｎｕｓ　ｖａｒ、　ｎｏｖａ）　　　　　　
　　　ゲルダマイシンニゲラス（ｎｉｇｅｌｌｕｓ）　
　　　　　　　　　　２１−ヒドロキシ−２５−ゾメチ
ル２５−メチル チオプロトストレプト バリシン リシリエンシス（ｒｉｓｈｉｒｉｅｎＳｉｓ）　　　　
　マイコトリエン類種Ｅ／７８４　　　　　　　　　　
　　アクタマイシンおよびマイコトリエン類 種Ｅ８，８　　　　　　　　　　　　　　　　マイコト
リエン類スペクタビリス（ｓｐｅｃｔａｂｉ　１　ｉｓ
）　　　　　ストレプトバリシン類箪土人アントラサイ
クリンおよびキノン系抗生物質を産生カエスビトサス（
ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）　　　　ミドマイシンＡ、　
ＢおよびＣ コエリカラ−（ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ）　　　　　ア
クチノロジンコエルレオルビジクス （ｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｉｃｕｓ）　　　　　　
　　ダウノマイシンサイアネウス（ｃｙａｎｅｕｓ）　
　　　　　　ジトリサルビシンフラボグリセウス（ｆ　
ｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）　　サイアノサイクリンＡカ
’Ｊ　し’ｙ　ス（ｇａｌ　１ｌａｅｕｓ）　　　　　
　　アクラシノマイシンＡ１アウラマイシン類および スルフルマイシン類 ルシタナス（ｌｕｓｉｔａｒ＋ｕｓ）　　　　　　　ナ
プチリジノマイシンペウセチカス（ｐｅｕｃｅｔ　１ｃ
ｕｓ）　　　　　　ダウノマイシンおよびアドリアマイ
シン ビオロクロモゲネス 多数の種　　　　　　　　　　　　　種々のβ−ラクタ
ム類ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ） ラクタマデュランス （ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ）　　　　　　　　　　
　セファマイシンＣペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ）多数の種　　　　　　　　　　　　　種々のβ
−ラクタム類ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）アンチビオチカス（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ
ｓ）　　　クラプラン酸アルゲンチオラス（ａｒｇｅｎ
ｔｅｏｌｕｓ）　　　アドリアマイシンＡ１ＭＭ４５５
０、および ＭＭ１３９０２ カトレヤ（ｃａｔ　ｔ　１ｅｙａ）　　　　　　　　　
チェナマイシンチャルトレウシス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓ
ｉｓ）　　　Ｓ　Ｆ　　１６２３、およびセファマイシ
ンＡおよびＢ シンナモネンシス（ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）　　
セファマイシンＡおよヒＢクラブリゲラス（ｃｌａｖｕ
ｌｉｇｅｒｕｓ）　　　　ＰＡ−３２４１３−Ｉ、セフ
ァマイシンＣ１ Ａ１６８８６Ａ。

クラプラン酸、および その他のフラバム類 フィムブリアツス（ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）　　　　セ
ファマイシンＡおよびＢフラボビレンス（ｆｌａｖｏｖ
ｉｒｅｎｓ）　　　　ＭＭ　４５５０、およびＭＭ１３
９０２ フラバス（ｆｌａｖｕｓ）　　　　　　　　　ＭＭ　４
５５０．および第５表（続き） フルボビリシス（ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）　　　　
ＭＭ　４５５０、およびＭＭ１３９０２ グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ）　　　　　　　　セファ
マイシンＡおよびＢハルステジ（ｈａｌｓｔｓｄｉ）　
　　　　　　　セファマイシンＡおよびＢヘテロモルフ
ス（ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ）　　　Ｃ２０８１Ｘ
ｓおよびセファマイシンＡおよびＢ ハイグロスコピクス （ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）　　　　　　　　　　
　デアセトキシセファロスポリンＣ リプマニイ（ｌ　ｉｐｍａｎｉ　ｉ）　　　　　　　　
ペニシリンＮ、７−メドキシセフ１０スポリンＣ１ Ａ１６８８４、ＭＭ４５５ ０およびＭＭ１３９０２ オリバセウス（ｏｌ　１ｖａｃｅｕｓ）　　　　　　　
（ＭＭ　１７８８０　）エピチェナマイシンＦ、ＭＭ４
５ ５０およびＭＭ１３９０２ バナエンシス（ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ）　　　　　　Ｃ
２０８１ＸおよびセファマイシンＡおよびＢ プルラシドマイセチカス （ｐｌｕｒａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）　　　　　
　　　プルラシドマイシンＡロチェイ（ｒｏｃｈｅｉ）
　　　　　　　　　　セファマイシンＡおよびＢシオヤ
エンシス（ｓｉｏｙａｅｎｓｉｓ）　　　　　ＭＭ　４
５５０、およびＭＭ１３９０２ 種○Ａ−６１２９ｏＡ−６１２９Ａ トクノメンシス（ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓｉｓ）　　　　
アスパレノマイシンＡピリドクロモゲネス （ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）　　　　　　
　　　セファマイシンＡおよび８ｍ１マクロライド、リ
ンコサミド、およびストレプトロザリア（ｒｏｓａｒｉ
ａ）　　　　　　　　　　　　ロザラミシンストレプト
マイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）アルビレチク
１バａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ）　　　　　カルボマイ
シンアルボグリセオラス（ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ
）　　　ミコノマイシンアルプス（ａｌｂｕｓ）　　　
　　　　　　　　　アルボマイセチンアルプス変種コイ
ルマイセチカス （ａｌｂｕｓ　ｖａｒ、　ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
）　　　　　　コレイマイシンアンボファシエンス（ａ
ｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）　　　スピラマイシンおよびフ
ォロマシジンＤ アンチビオチカス（ａｎｔ　１ｂｉｏｔ　１ｃｕｓ）　
　　　オレアンドマイシンアベルミチリス（ａｖｅｒｍ
ｉｔｉｌｉｓ）　　　　　アベルメクチン類ビキニエン
シス（ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）　　　　　カルコマイ
シン第６表（続き）　　　′ カエレスチス（ｃａｅｌｅｓｔｉｓ）　　　　　　　　
Ｍ　１８８およびセレスチセチン シネロクロモゲネス （ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）　　　　　　
　　　　　シネロマイシンＢシラツス（ｃｉｒｒａｔｕ
ｓ）　　　　　　　　　　　シラマイシンデルテ（ｄｅ
ｌｔａｅ）　　　　　　　　　　　　デルタマイシン類
ジャカルテンシス（ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ）　　　
　ニダマイシンエリスレウス（ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ）　
　　　　　　　エリスロマイシン類エウロシジカス（ｅ
ｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ）　　　　　　メチマイシンエウ
リテルマス（ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）　　　　　　ア
ンゴラマイシンファシクラス（ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ）
　　　　　　　アマロマイシンフェレウス（ｆｅｌｌｅ
ｕｓ）　　　　　　　　　　アルボマイシンおよびピク
ロマイシン フィムブリアタス（ｆ　ｉｍｂｒｉａｔｕｓ）　　　　
　アマロマイシンフラボクロモゲネス （ｆ　ｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）　　　　　　
　　　　　アマロマイシンおよびシンコマイレン類 フラジエ（ｆｒａｄｉａｅ）　　　　　　　　　　　チ
ロシンフンギシジカス（ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）　
　　　　　ＮＡ−１８１フンギシジ力ス変種エスピノマ
イ セチカス（ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ。

ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔ　１ｃｕｓ）　　　　　　　　
　　　　ニスピノマイシン類フルジシジカス（ｆｕｒｄ
ｉｃｉｄｉｃｕｓ）　　　　　マイデカマイシンゴシキ
エンシス（ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ）　　　　　パン
ダマイシンゲリセオフラパス（ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕ
ｓ）　　　　アクマイシングリセオフスカス（ｇｒｉｓ
ｅｏｆｕｓｃｕｓ）　　　　ブンドリングリセオラス（
ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）　　　　　　　　グリセオマイシ
ングリセオスピラリス（ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌ　ｉ
ｓ）　　レロマイシングリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ）　
　　　　　　　　　ボレリジングリセウス亜種スルフラ
ス（ｇｒｉｓｅｕｓｓｓｐ、　５ｕｌｐｈｕｒｕｓ）　
　　　　　　　　　　　パフィロマイシン類ハルステジ
（ｈａｌｓｔｓｄｉ）　　　　　　　　　　カルボマイ
シンおよびロイカニシジン ハイグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）　
　　チロシンバイグロスコピカス亜種アウレオラク リモサス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　５ｕｂｓｐ。

ａｕｒｅｏｌａｃｒｉｍｏｓｕｓ）　　　　　　　　　
　　　ミルベマイシン類キタストエンシス（ｋｉｔａｓ
ｔｏｅｎｓｉｓ）　　　　　ｏイコマイシンＡ３および
ジョサマイシン ラベンデュラエ（Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ）　　　　　　
　アルドガマイシンリンコルネンシス（ｌｉｎｃｏｌｎ
ｅｎｓｉｓ）　　　　　リンコマイシンロイデンシス（
ｌｏｉｄｅｎｓｉｓ）　　　　　　　　ベルナマイシン
ＡおよびＢ マクロスポレウス（ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）　　　
　カルボマイシンマイゼウス（ｍａｉｚｅｕｓ）　　　
　　　　　　　イングラマイシンマイカロファシエンス
（ｍｙｃａｒｏｆａｃ　１ｅｎｓ）　　アセチル−ロイ
コマイシンおよびニスピノ マイシン ナルボマイシン ナルボネンシス変種ジョサマイセ チカス（ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ。

ｊｏｓａｍｙｃｅｔ　１ｃｕｓ）　　　　　　　　　　
　　　ロイコマイシンＡ。

およびジョサマイシン オリボクロモゲネス（ｏｌ　ｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）　　オレアンドマイシンプラテンシス（ｐｌａｔ
ｅｎｓｉｓ）　　　　　　　　プラテノマイシンリモサ
ス（ｒｉｍｏｓｕｓ）　　　　　　　　　　　　チロシ
ンおよびノイトラマイシン ｏ　チｓ、　イ（ｒｏｃｈｅｉ）　　　　　　　　　　
　　ランカシジンおよびボレリジン ロチェイ変種ボルビリス （ｒｏｃｈｅｉ　ｖａｒ、　ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ）　　
　　　　　　　Ｔ　２６３６０セオクロモゲネス（ｒｏ
ｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）　　アルボサイタリン
ロセオシトレウス（ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ）　　　
　　アルボサイタリンスピニクロモゲネス変種スラガオ エンシス（ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ｖａｒ
。

ｓｕｒａｇａｏｅｎｓ　ｉｓ）　　　　　　　　　　　
　　　クジマイシン類テンダニ（ｔｅｎｄａｅ）　　　
　　　　　　　　　カルボマイシンサーモトレランス（
ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）　　　　カルボマイシ
ンベネズエラエ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）　　　　　　
　　メチマイシン類ビオラセオニゲル（ｖｉｏｌａｃｅ
ｏｎｉｇｅｒ）　　　　ランカシジン類およびランカシ
ジン シクロベンタン環　コエリカラー 含有型　　　　　　　（ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ）　　
　　　　　メチレノマイシンＡエリスロクロモゲネス （ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）　　サルコ
マイシンビオラセオラバー （ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）　　　　　メチレノマ
イシンＡ含窒素型　　　　　ベネズエラエ （ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）　　　　　　クロラムフェニ
コール ポリエン型　　　　グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ）　　
　カンジンジンノドサス（ｎｏｄｏｓｕｓ）　　　　ア
ンホテリシンＢノウルセイ（ｌｏｕｒｓｅｉ）　　　ナ
イスクチンテトラサイク　　　　アラレオフアシエンス
リン型　　　　　　　（ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）　
　　　　　テトラサイクリン、クロロテトラサイク リン、デメチルテト ラサイクリン、およ びデメチルクロロチ トラサイクリン リモサス（ｒｉｍｏｓｕｓ）　　　　オキシテトラサイ
クリン ミシガネゼ・ピーブイ・ラサイ （ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ　ｐｖ、　ｒａｔｈａｙｉ）
　　　　　　　チュニカマイシンカンジダス（ｃａｎｄ
ｉｄｕｓ）　　　　　　　　　　ピラシフリンストレプ
トマイセス属（Ｓｔｒｅｐｊｏｍｙｃｅｓ）アンチビオ
チカス（ａｎｔ　１ｂｉｏｔ　１ｃｕｓ）　　　　　ａ
ｒａ−Ａチャルトレウシス（ｃｈａｒｔｒｅｕｓ　ｉｓ
）　　　　　　チュニカマイシングリセオフラバス変種
スリンギエンシス（ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ　ｖａｒ
、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）　　　　ストレプト
ビリダンスグリセオラス（ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）　　　
　　　　　　シネフンギンミソウリエンシス（ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）　　　　アクタプラニンテイコマ
イセチカス（ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）　　テ
イコプラニンバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 多数の種　　　　　　　　　　　　　　　バシトラシン
、ポリミキシン、およびコリス チン ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ） カンジダス（ｃａｎｄｉｄｕｓ）　　　　　　　　　　
Ａ−３５５１２およびアボパルシン ルリダ（ｌｕｒｉｄａ）　　　　　　　　　　　　　リ
ストセチンオリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌ　ｉｓ）
　　　　　　　バンコマイシンストレプトマイセス属（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）アンチビオチカス（ａｎｔ
　１ｂｉｏｔ　１ｃｕｓ）　　　　　アクチンマイシン
アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）　　　　　　　　　　　チ
オストレブトンカヌス（ｃａｎｕｓ）　　　　　　　　
　　　　　　アンホマイシンエプロスポレウス（ｅｂｕ
ｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）　　　　　Ｌ　Ｌ−ＡＭ３７４ハ
ラノマチエンシス（ｈａｒａｎｏｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ
）　　パンコマイシンプリスチナエスピラリス （ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）　　　　　　
　　　　ブリスチナマイシンロセオスポラス（ｒｏｓｅ
ｏｓｐｏｒｕｓ）　　　　　　Ａ　２１９７８　Ｃなと
のりポベブチド類 トヨ力エンシス（ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ）　　　　　
　　Ａ　４７９３４多数の種　　　　　　　　　　　　
　　　種々のポリエーテル類ダクチロスポランギウム属
（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）多数の種　　
　　　　　　　　　　　　　種々のポリエーテル類ノカ
ルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ） 多数の種　　　　　　　　　　　　　　　種々のポリエ
ーテル類ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）アルプス（ａｌｂｕｓ）　　　　　　’　　　　
　　　Ａ　２０４、Ａ２８６９５ＡおよびＢ１および サリノマイシン アラレオファシェンス（ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）　
　　ナラシンカカオイ変種アソエンシス （ｃａｃａｏｉ　Ｖａｒ、　ａｓｏｅｎｓｉｓ）　　　
　　　　　　　リソセリンチャルトレウシス（ｃｈａｒ
ｔｒｅｕｓｉｓ）　　　　　　Ａ　２３１８７シンナモ
ネンシス（ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）　　　　モネ
ンシンコンブロバラス（ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）　　
　　　　イオノマイシンオイロシジカス変種アステロシ
ジカス （ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ、　ａｓｔｅｒｏｃ
ｉ市ｃｕｓ）　　　　ライドロマイシンフラベオラス（
ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）　　　　　　　　　ＣＰ　３８９
３６ガリナリウス（ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ）　　　　
　　　　ＲＰ−３０５０４バイグロスコピカス（ｈｙｇ
ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）　　　Ａ　２１８、エメリシト
、ＤＥ３９３６、Ａｌ２ ０Ａ、Ａ２８６９５Ａ およびＢ１ニーテロマ イシン、およびジア不 マイシン ラサリエンシス（ｌａｓａｌｉｅｎｓｉｓ）　　　　　
　ラサロシドロングウーブンシス（ｌｏｎｇｗｏｏｄｅ
ｎｓ　ｉｓ）　　　リソセリンムタビリス（ｍｕｔａｂ
ｉｌｉｓ）　　　　　　　　　Ｓ−１１７４３ａリボシ
ジフイカス（ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）　　　　ｏ
ノマイシンビオラセオニゲル（ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇ
ｅｒ）　　　　ニゲリシン４３一 本方法のベクターは、上記のスピラマイシン感受性のス
トレプトマイセス属およびその関連宿主細胞にスピラマ
イシン耐性を付与する。通常、２５μｇ／ｍ（ｌのスピ
ラマイシンはスピラマイシン感受性のストレプトマイセ
ス属にとって毒性であるが、本発明のベクターはほぼ１
００μ９／雇のスピラマイシンのレベルまで耐性を付与
する。ストレプトマイセス種の選択に好ましいスピラマ
イシン濃度は当分野でよく知られた方法によって容易に
決めることができる。本発明のすべての態様が有用であ
るが、いくつかのベクターおよび形質転換体が好ましい
。すなわち、ストレプトマイセス・グリセオフスカスが
、好ましいプラスミドであるｐＫＣ５９２およびｐＫＣ
６３１の両方に対して好ましい宿主である。

本発明の組換えＤＮＡベクターは用途が広く、ストレプ
トマイセス属およびその関連微生物で用いるのに適した
クローニングベクターが必要とされていることを満たす
のに役立つ。より詳しくは、本ベクターは組換えＤＮＡ
を含有しているストレフトマイセス属宿主細胞を選択す
るための手段として用いられる。これは、スピラマイシ
ン感受性であり好ましくは非制限性であるストレプトマ
イセス属宿主細胞を本発明ベクターの１つ（例えば、ｐ
ＫＣ６３１など）で形質転換し、そして形質転換細胞を
スピラマイシン耐性の選択に適した条件下で培養するこ
とによって行われる。さらに、本発明ベクターのスピラ
マイシン耐性を付与する能力は形質転換体を選択する機
能的な手段を与える。

ベクターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し、選別す
ることが現に必要とされていることから、これは重要で
ある。また、その存在を調べるための機能的な試験法が
ない別のＤＮＡセグメントを本ベクターに挿入し、次い
で選択不能のＤＮＡを含有している形質転換体をスピラ
マイシン選択によって単離することもできる。プラスミ
ドの機能および複製に必要な領域内、またはスピラマイ
シン耐性を付与する遺伝子内を除くあらゆる部位に、こ
のような選択不可能なりＮＡ上セグメント挿入すること
ができ、これにはあらゆる型の調節遺伝子および抗生物
質修飾酵素を指定している遺伝子が含まれるが、限定は
されない。

また、本発明のスピラマイシン耐性を付与するベクター
は、結合したＤＮＡセグメントが多世代にわたって宿主
細胞中に安定に保持されていることを確実なものにする
のにも有用である。スピラマイシン耐性を付与する制限
フラグメントに共有結合し、ストレプトマイセス戊申で
増殖するこれらの遺伝子またはＤＮＡフラグメントを、
非形質転換細胞にとって毒性であるレベルのスピラマイ
シンに形質転換体をさらすことによって維持する。

すなわち、ベクターを失い、従って共有結合ＤＮＡを失
った形質転換体は生育することができず、培養物から除
かれる。このように、本発明のベクターはあらゆる所望
のＤＮＡ配列を維持し、安定化することができる。

本発明の方法、ベクターおよび形質転換体は、現在スト
レプトマイセス属およびその関連細胞で製造されている
種々産物の収量を改善するための遺伝子クローニングを
与える。このような産物を例示すると、ストレプトマイ
シン、セファロスポリン、アクタプラニン、アブラマイ
シン、ナラジン、モネンシン、トブラマイシン、エリス
ロマイシンなどが挙げられるが、これらに限定はされな
い。また、本発明は、産業上重要なタンパク質（例えば
、ヒトインスリン、ヒトプロインスリン、グルカゴン、
インターフェロンなど）；産業上重要な方法および化合
物に導く、代謝経路の酵素機能；または遺伝子の発現を
改善するコントロール要素をコードしているＤＮＡ配列
をクローニングし、その特徴を調べ、そして再構築する
のに有用な、選択可能なベクターをも提供するものであ
る。これらの所望のＤＮＡ配列には、誘導体化した抗生
物質（例えば、ストレプトマイシン、セファロスポリン
、アブラマイシン、アクタブラニン、ナラジン、トブラ
マイシン、モネンシン、およびエリスロマイシンの誘導
体など）の合成を触媒する酵素、または抗生物質あるい
はその他の産物の生合成を媒介し増加させる酵素をコー
ドしているＤＮＡが含まれるが、これらに限定はされな
い。すなわち、このようなりＮＡ上セグメント挿入し、
安定化させることができることにより、ストレプトマイ
セス属およびその関連微生物が産生ずる抗生物質の収量
およびその利用を増大させることができる。

ストレプトマイセス属は、数種の異なる培地のいずれか
を用い、多数の方法で培養することができる。培養培地
に好ましい炭水化物供給源には、例えば糖蜜、グルコー
ス、デキストリンおよびグリセリンが含まれる。窒素供
給源には、例えば大豆粉、アミノ酸混合物およびペプト
ン類が含まれる。栄養無機塩をも加えるが、これにはナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン
酸、塩素、硫酸などのイオンを生成しうる通常の塩類が
含まれる。他の微生物の生育および成長に必要であると
きには、必須微量元素類を加えてもよい。通常、このよ
うな微量元素類は他の培地構成成分の添加に付随する不
純物として供給される。

特定の培養培地は実施例中に示し、既知のようにして、
ストレプトマイセス属を好気性の培養条件下、約５〜９
の比較的広いｐ）（範囲にわたり、約１５〜４０°Ｃの
温度範囲で生育させる。プラスミドの安定および維持用
にはＩ）Ｈ約７．２の培養培地で始め、培養温度を約３
０°Ｃに維持するのが望ましい。

また、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ
　ｌ　２株を数種の別種培地のいずれかを用いる多数の
方法で培養することができる。培養培地に好ましい炭水
化物供給源にはグルコースおよびグリセリンが含まれ、
窒素供給源にはアンモニウム塩、アミノ酸混合物および
ペプトン類が含まれる。栄養無機塩も添加するが、これ
にはストレプトマイセス属に対して挙げた塩類ならびに
マグネシウムイオンを生成する塩類が含まれる。大腸菌
は、好気性の培養条件下、ｐＨ範囲６．５〜７，５、温
度範囲約２５〜４２°Ｃで生育させることができる。プ
ラスミドの安定維持用にはｐＨ約７．２の培養培地で始
め、培養温度を約３０°Ｃに維持するのが望ましい。

実施例１大腸菌に１２　ＤＨＩ／ｐＫＣ４２０の培養お
よびコスミドｐＫＣ４２０の単離大腸菌に１２　ＤＨＩ
／ｐＫＣ４２０（ＮＲＲＬＢ−１５８３７）の培養物５
好を、通常の微生物学的な方法に従い、ＴＹ培地（１％
トリプトン、０゜５％酵母抽出物、０．５％塩化ナトリ
ウム、ｐＨ７゜４）中、選択条件下で増殖させた。この
細胞を卓上型遠心機で遠心し、ペレットを０．３Ｍスク
ロース、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ
アセテート）および２５ｍＭ）リス−ＨＣｌ２（ｐＨ８
）（溶液Ｉ　）　１　ｙｒＱに再懸濁した。エッペンド
ルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に移した後、細胞を約１
分間遠心し、ペレットを溶液■　０，５πｅに再懸濁し
た。新しく調製したリソチーム（２０ｍ９／　ｍ（ｌ水
溶液）約５０μρを加え、この溶液を３７℃で１０分間
インキュベートした。

新たに調製した溶菌混合液（２％ドデシル硫酸ナトリウ
ムおよび０．３Ｎ　Ｎａ０Ｈ）２’５０ｕＱを加えた後
、細胞を直ちに、そして完全に渦巻撹拌した。次いで、
この細胞を５０’Ｃで１０分間インキュベートし、冷却
し、フェノール−セバグ（ｐｈｅｎｏｌ−８ｅｖａｇ）
　（フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール
、２５−２４−１）１００μＱを加えた。この管を１分
間渦巻撹拌した。ＤＮＡをエッペンドルフ遠心機で２分
間遠心し、上清をピペットで取り、緩衝化していない３
Ｍ酢酸ナトリウム７０μＱおよびインプロパツール０．
７１１Ｑとともに別の管に移して、ＤＮＡを沈澱させた
。この溶液を室温で５分間インキュベートし、次いで２
分間遠心した。

この上清をそっと、かつ完全にデカンテーションして過
剰の液体のすべてを除いた。

このＤＮＡ沈澱物をＴＥ［１０ｍＭ）リス−ＨＣ（２（
ｐＨ８）および１ｍＭＥＤＴＡコ５００μＱに再溶解し
、１００ｍＭ　スペルミン（Ｓｐｅｒｍｉｎｅ）ＨＣＱ
　　１０μｅを加えた。この混合物を撹拌し、次いで室
温で５分間インキュベートし、エッベンドルフ遠心機で
５分間遠心した。この上清をもう一度完全にデカンテー
ションして捨て、沈澱しているＤＮＡを、３００ｕＣの
０．３Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウムお
よび７００μρの９５％エタノールと七もに撹拌した。

この溶液を室温で５分間インキュベートし、上記のよう
にしてＤＮＡを集めた。

このペレットは所望のクローニング媒体からなり、これ
をＴＥＩＯμｅに再溶解した。

実施例２　プラスミドｐＨＪＬ２０２の組立てプラスミ
ドｐＨＪＬ２０２は、プラスミド５ＣＰ２★由来のスト
レプトマイセテス　レプリコン［ビブ等（Ｂｉｂｂ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　　１９７７、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇ
ｅｎｅｔ、　　１５４：１５５）］、ならびにネオマイ
シン耐性およびアンピシリン耐性の遺伝子を含有してい
る。このｐＨＪＬ２０２の組立てを以下に記述する。

Ａ、プラスミドｐＪ　Ｌ　１９２の部分的なＫｐｎｌ消
化 実施例１の記載のようにして大腸菌に１２　Ｃ６０Ｃ６
００ＲＫ−／１）ＪＬ　１９２（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０
４０）から単離し、調製したプラスミドｐＪ　Ｌ　１９
２　ＤＮＡ約１３ｕ１２（〜３．２５ｕｇ）、水２５ｕ
１２゜ＢＳＡ（ウシ血清アルブミ７　１ｍ９／ｘの５μ
Ｌ　　Ｌ０ＸＫｐｎＩ制限緩衝液［６０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｆｆ（ｐＨ７，５）、６０ｍＭ　ＮａＣＱ、６０ｍＭ
　ＭｇＣＱ２］５μｅ１およびＫｐｎＩ酵素＊２μｅを
混合し、３７℃で４５分間インキュベートした。この１
０μρを取り、水４０μＱと混合し、１０分間７０’Ｃ
に加熱して酵素を不活性化した。このプロトコールによ
り、Ｋｐｎｌ制限酵素によって切断されなかった分子か
らＫｐｎｌ制限酵素によって完全に消化された分子に至
る、可能性ある反応生成物のすべてが得られる。

これを１／１０容量の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ（ｐＨ８）およ
び２容量のエタノールで沈澱させ、次いで一７０℃で１
時間凍結させた。

Ｂ、ライゲーション 沈澱を集め、２回洗浄し、風乾し、次いで水２０μＱに
再懸濁した。反応液的６μｇを取り、５×キナーゼ／リ
ガーゼ緩衝液［２５０ｍＭトリス−ＨＣ２（ｐＨ７，８
）、２５％グリセリン、２５ｍＭジチオトレイトール、
および５０　ｍＭ　ＭｇＣ＋２．］　２０　ｔｔＱ。

０．６６Ｍ　ＡＴＰ（ｐＨ７，４）４０μρ、水３３μ
ｆｆおよびＴ４　　ＤＮＡリガーゼ１μｅの溶液と混合
し、１５°Ｃで７２時間インキュベートして自己環化を
行わせた。インキュベート後、反応液から５０μρを取
り、温度を１０分間７０℃に上げることによって反応を
停止させた。この反応生成物を上記のようにして沈澱さ
せ、水１５μＱに再懸濁した。

＊制限酵素およびその他の酵素類は次の供給元から容易
に入手することができる： ニューイングランド・バイオラブズ社；　Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、、　３２　Ｔｏ
ｚｅｒ　Ｒｏａｄ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ　０１９１５、 ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社；　Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ、、　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　５７７、　Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０７６０、ベ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ；　Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ、　Ｐ、　０．　Ｂｏｘ　５０８１６゜Ｉｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ、　１ｎｄｉａｎａ　４６２５０゜
Ｃ１形質転換 凍結したコンピテントな大腸菌に１２　Ｃ６００ＲＫ−
ＭＫ−（ＡＴＣＣ３３５２５）細胞を水浴で解凍し、０
．１ｆｆＣの細胞と、０．０５１のプラスミドＤＮＡお
よび３７．５μρの０，１ｘ　　ＳＳＣ［０゜０１５Ｍ
　ＮａＣＱ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ
７）］の比で混合した。この形質転換混合物を氷上で２
０分間冷却し、４２°Ｃで１分間熱シヨツクを与え、氷
上でさらに１０分間冷却した。次いで、この試料をＴＹ
−ブロス０．８５ｍ１２で希釈し、３７°Ｃで１．５時
間インキュベートし、アンピシリン（５０μ９／酎）を
含有しているＴＹ−寒天＊上に蒔き、３７°Ｃで１８時
間インキュベートした。

得られた正しい表現型、すなわちアンピシリン耐性（Ａ
ｐＲ）およびテトラサイクリン感受性（Ｔｃ’）のコロ
ニーを、実質的にニックハルト等［Ｅｃｋｈａｒｄｔｅ
ｔ　ａｌ、、　１９７ｇ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　１：５８
４］記載のウェル内溶菌（ｉｎ−ｔｈｅ−ｗｅｌｌ−１
ｙｓｉｓ）法に従って、プラスミドの大きさについてス
クリーニングした。ｐＨＪＬ２０２と命名した所望の〜
１８ｋｂのプラスミドを含有しているアンピシリン耐性
およびテトラサイクリン感受性のコロニーを既知の方法
に従って単離し、培養し、そして構成成分プラスミドの
制限酵素およびアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）分析
によって常法通りに同定した。次いで、この同定した大
腸菌Ｋ　１２　’Ｃ６００ＲＫ−ＭＫ−／、ｐＨＪ　Ｌ
　２０２形質転換体を用い、実質的に実施例１の教示に
従って、プラスミドｐＨＪ　Ｌ　２０２を単離、調製し
た。

＊ＴＹ−寒天は、ＴＹブロスＩＱにバクト（Ｂａｃｔｏ
）−寒天１５ｇを加えてオートクレーブ処理することに
よって調製した。

実施例３　コスミドｐＫＣ４７３の組立てコスミドｐＫ
Ｃ４７３の組立てに用いるコスミド骨格を得るために、
ｐＫＣ４２０　ＤＮＡをＥｃ。

Ｒ１およびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。実施例１の
教示に従って調製したｐＫＣ４２０　ＤＮＡ約１０μ（
１，水２５μＬ　ＩＪＳＡ　５ｕＱ、　ｔｏｘ　Ｅｃｏ
ＲＩ制限緩衝液［１Ｍトリス−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）
、０．５Ｍ　ＮａＣＱ、Ｏ，１Ｍ　ＭｇＣ＋２２］　５
μｆｆ、およびＥｃｏＲＩ酵素２頭を混合し、３７°Ｃ
で１時間インキュベートし、次いで１０分間７０°Ｃに
加熱して酵素を不活性化した。この混合物を１／１０容
量の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ（ｐＨ８，０）および２容量のエ
タノールで沈澱させ、次いで一７０°Ｃで１時間凍結さ
せた。この沈澱を集め、２回洗浄し、風乾し、次いでＨ
２Ｏ１０μｇに再懸濁した。ＥｃｏＲＩ酵素および緩衝
液の代わりに１０ＸＢ１０ＸＢａ制限緩−５６＝ 衝液［０，２Ｍトリス−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）、ＩＭＮ
ａＣＱ、７０ｍＭ　ＭｇＣＱ、および２０ｍＭ２−メル
カプトエタノール］およびＢａｍＨＩ制限酵素２μｅを
用いること以外は、実質的に先の教示に従ってＢａｍＨ
Ｉ消化を行った。次いで、通常のよく知られた方法を用
いてこの混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ、コス
ミド骨格を精製した。

次に、実質的に前節の教示に従って、１０１１ｇのｐＢ
Ｒ３２２をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した
。実質的に実施例２Ｂおよび２Ｃの教示に従って、テト
ラサイクリン耐性遺伝子の部分を含む〜３７５ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ制限フラグメントをゲル−精製
し、コスミド骨格にライゲーションし、そしてこれを用
いて大腸菌を形質転換した。

アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性、アブラマイ
シン感受性の表現型を有する形質転換体を選別し、次い
で行うコスミドＤＮＡの調製および単離用に通常の培養
を行った。

次に、上で組立てた中間体コスミドに存在するアンピシ
リン耐性遺伝子の部分を含む〜７５２ｂｐのＥｃｏＲＴ
　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメントを削除した。この削除は、
ＢａｍＨＩ制限緩衝液およびＢａｍＨＩ制限酵素の代わ
りに１０ＸＰｓｔＩ制限緩衝液［５００ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃ４（ｐＨ８，０）、１００　ｍＭ　ＭｇＣＱ、および
５００ｍＭ　ＮａＣｆ２］およびＰｓｔｌ制限酵素を用
いることを除き、実質的に前節の教示に従って行った。

次いで、この消化物からのコスミド骨格をアガロースゲ
ル電気泳動で精製した。実質的に上記の方法に従って、
プラスミドｐＫＣ２２２（その組立ては米国特許Ｎ　ｏ
、　４．５５９．３０２に開示されている）からアブラ
マイシン耐性（ＡｍＲ）遺伝子を〜１５００ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ　−ＰｓｔＩ　７ラグメントで単離した。このフ
ラグメントを、上記中間体コスミドの削除ＥｃｏＲＩ　
−Ｐｓｔ　Ｉ領域にサブクローンし、置き換えた。得ら
れたコスミドをｐＫＣ４７３と命名し、これを用い、実
質的に実施例２Ｂおよび２Ｃの教示に従って大腸菌に１
２　　ＤＨＩ（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５０２１）を形質転換
した。所望の形質転換体については、始めにＴｃｌＩ表
現型について選択し、次いでこのＴｃＲコロニーを複製
してＡｍＲコロニーについて選択することによって常法
通り確認した。得られた大腸菌Ｋ　１２　ＤＨ１／ｐＫ
Ｃ４７３形質転換体を、後のコスミドｐＫＣ４７３の調
製および単離用に常法に従って培養した。

実施例４　コスミドシャトルベクターｐＫＣ５０５の組
立て コスミドｐＫＣ５０５を、実質的に実施例３の教示およ
び添付の第３図に示した工程図に従って、コスミドｐＫ
Ｃ４７３およびプラスミドｐＨＪ　Ｌ　２０２の制限フ
ラグメントから組立てた。普通には、２つのベクター、
すなわちｐＫＣ４７３およびｐＨＪＬ２０２を、Ｂａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素による二重消化反応でそ
れぞれに処理して直線状のフラグメントを得た。実質的
に実施例２Ｂの教示に従って、これらの消化産物を混合
し、フラグメントをライゲーションし、次いで実質的に
実施例５の教示に従って、これを用いてストレプトマイ
セス・アンボファシェンスを形質転換し、アブラマイシ
ン耐性について選択した。得られた〜１９ｋｂのプラス
ミド（ｐＫＣ５０５と命名）は、ｐＫＣ４７３ベクター
骨格ならびにプラスミドｐＨＪ　Ｌ２０２由来の５ｃｐ
２★複製機能および生殖機能をコードしている〜１２．
８ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲ■フラグメントを含有
している。この〜１２．８ｋｂのフラグメントは、もと
もと存在していたＴｃＲ遺伝子をコードしているｐＫＣ
４７３フラグメント中の〜３７５ｂｐを置換した。次い
で、コスミドｐＫＣ５０５を大腸菌に導入し、ストレプ
トマイセス・アンボファシエンスに逆導入し、そして制
限酵素分析でさらにその特徴を調べた。

実施例５　ストレプトマイセス・アンボファシエンス／
ｐＫ　Ｃ５０５の組立て 実施例４からのＤＮＡ約１μｇおよびストレプトマイセ
ス・アンボファシエンス（ＮＲＲＬ　　１５２６３）の
プロトプラスト２００μσを、５５％ポリエチレングリ
コール［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］　５００　ｐＱとＰ培
地［ホップウッドおよびライト（）ｌｏｐｗｏｏｄ　ａ
ｎｄｆｒｉｇｈｔ、　　１９７８．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１６２
：３０７）］中で混合撹拌し、次いでその一部２５ｕＱ
および２５０μ（！を、Ｒ２ＹＥ上部寒天３ｍＱを有す
るＲ２ＹＥ＊プレートに蒔いた。このプレートを３０°
Ｃで１８時間インキュベートし、次いで最終濃度を５０
μ９／１ｒｒ（ｌとするのに十分な量のアブラマイシン
＊＊を含有しているＲ２ＹＥ上部寒天３１１Ｑを上部に
加えた。次いで、このプレートを３０℃でさらに３日間
インキュベートした。常法によりアブラマイシン耐性に
ついて選択することによって所望の形質転換体を同定し
た。得られたＳ。

アンボファシエンス／Ｉ）Ｋ　Ｃ５０５アプラマイシン
耐性コロニーを既知の方法に従って単離し、培養し、そ
してこれをコスミドｐＫＣ５０５　　ＤＮＡの調製に用
いた。また、その特徴をさらに調べ、そして確認するた
めに、コスミドｐＫＣ５０５ＤＮＡを大腸菌にも導入し
た。

＊　Ｒ２ＹＥ培地はＩＱあたり次の組成となるように調
製したニ スクロース−１０３ｇ　　　微量元素混合物　　−２靜
２５％に２ＳＯ４１０ｔｒｒＱ　　　Ｏ，５％ＫＨ２Ｐ
Ｏ−−１０ｍ１１１ｇｃρｔ　　　　、　　１０．１ｇ
ＩＭＣａＣρｔ　　　　　　　２０１１ρグルコース−
１０９プロリン　　　　　−３９カザミノ−０，１ｉ　
　　０．２５Ｍ　ＴＥＳ　ｐＨ７，２−１００ｍ９酸　
　　　−１００ｍＱ　　　ＩＸ　１０％酵母抽出物−５
０ｘ（！＊＊抗抗生物質ダブラマイシン、シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはイーライ・リリー・アンド・
カンノ臂ニー（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎ
ａ）から入手することができる。

実施例６ゲノムライブラリーの作成 Ａ、ベクターｐＫＣ５０５　　ＤＮＡの調製ベクターｐ
ＫＣ５０５　　ＤＮＡ約５０μ９を、Ｂ５Ａ１０μ１２
．１０ＸＨｐａＩ制限緩衝液［２００ｍＭトリス−ＨＣ
ｆｆ（ｐＨ７，４）、２００ｍＭＫＣｌ２゜および１０
０　ｍＭ　ＭｇＣｃｔ］　１０　ｐＱおよび水７０μＱ
中、３７°Ｃで１時間、ＨｐａＩ　　５０単位（１０μ
ので消化した。完全に消化すると、０．３％アガロース
ゲルで１８．７ｋｂのところで移動する１つのバンドが
得られた。このＤＮＡを、ＴＥで飽和した等容量のフェ
ノールで、次いでセノ＜グ（Ｓｅｖａｇ）で抽出し、３
容量のエタノールで沈澱させた。工・ツペンドルフ管で
１０分間遠心した後、ＤＮＡを水１００μＱに再溶解し
、これにｌＱｘ　　ＢＡＰ緩衝液［０，５Ｍトリス−Ｈ
Ｃ（２（ＰＨ８，０）、０．５ＭＮａＣＱ］２０μＱお
よび細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ、２４μ／
酎）８０μＱを加えた。脱ホスホリル化を７０°Ｃで１
時間行った。このＤＮＡを上記のようにして抽出し、沈
澱させ、５ｍＭＮａ’ｃＱ５０ｔｔＱに溶解した。次い
で、このＤＮＡを、Ｂ５Ａ１０μＣ１１Ｃ１１ＯＸＢａ
制限緩衝液［２００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，
０）、１ＭＮａｃＩ２゜および７０　ｍＭ　ＭｇＣＬ］
　１０　ｐＱおよび水７５μＣ中、３７°Ｃで２時間、
ＢａｍＨＩ３０単位（５μので消化した。完全に消化す
ると、１６．７ｋｂおよび２゜Ｏｋｂの２つのバンドが
得られた。このＤＮＡを、もう一度フエノール、セバグ
で抽出し、エタノールで沈澱させ、ＴＥ　　５０μｇに
溶解した。ＤＮＡ約０．５μ９をリガーゼ反応中に用い
てＢａｍＨＩ末端のライゲーション性をチェックするこ
とができる。このライゲーションによって、３３．４ｋ
ｂ。

１８．７ｋｂ、および４．０ｋｂの３つのバンドが得ら
れる。

Ｂ、挿入ＤＮＡの調製 ストレプトマイセス・アンボファシエンスの新鮮な一夜
培養物約２．５πρをＴＳＢ（）ＩＪプチカ一ゼ大豆ブ
ロス＊）５０１１１２に接種した。この培養物を激しく
振盪しながら３０〜３２°Ｃで一晩増殖させた。細胞を
遠心して集め、リソチーム（５ｍ９／酎）を加えた溶菌
緩衝液１１５％スクロース、２５ｍＭ）リス−ＨＣｌ２
（ｐＨ８，０）、５０ｍＭＥＤＴＡ］Ｌｏｌ＋（！に懸
濁させ、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで
、１０ｍ９／ｍＱのプロテイナーゼＫ（溶菌緩衝液中で
新たに調製した）０．１Ｒ（２を１０％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤ’Ｓ）１．０ｍ１２とともに加えた。直
ちにこの混合物を７０°Ｃで１５分間インキュベートし
、次いで氷上で冷却した。

次に、５Ｍ酢酸カリウム２．５ｍＱを加え、穏やかに反
転させて混合し、そして水上に１５分間装いた。この物
質をＴＥ飽和のフェノールで穏やかに抽出した後、遠心
（ｌ　Ｏ，ＯＯＯｒｐｍ、　１０分間）して層を分け、
先を折ったピペットで水相を新しい管に移した。この物
質を等容量のセバグで穏やかに抽出した後、もう一度層
を分け、水相を新しい管に移し、２容量のエタノールを
用いて室温でＤＮＡを沈澱させた。この沈澱を７０％エ
タノールで洗浄し、次いでＴＥ　　５．ｗσに溶解した
。ＲＮアーゼＡ（最終濃度５０μｇ／ＭＱ）およびＲＮ
アーゼＴｌ（最終濃度　１μ９／ｍ（１”）を加え、こ
の溶液を３７°Ｃで３０分間インキュベートした。フェ
ノールで２回、セバグで２回抽出し、次いで２容量のエ
タノールで沈澱させた後、ＤＮＡを真空下で乾燥し、Ｔ
Ｅ（培養物５０１１ρに対して１１ＷＩ２）に再溶解し
た。このＤＮＡの大きさを０．３％アガロースゲルで調
べると、７０ｋｂの平均大きさを有していることがわか
った。

次に、ストレプトマイセス・アンポファシエンスの染色
体ＤＮＡ　２００μ９を、ＢＳＡ　　１００μＱ、Ｍｂ
ｏ１制限緩衝液［５００ｍＭトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ８
０）、１００ｍＭ’ＭｇＣρ２．５０ｍＭ　Ｎａ（ｊ２
］　１００μＱおよび水〜８００μｅ中、３７℃で３分
間、８５単位（１０μののＭｂｏｌとともにインキュベ
ートした。この特定の条件は、経験的に、部分消化ＤＮ
Ａの所望の適当な分布を与えることがわかった。このＤ
ＮＡをフェノール、セバグで抽出し、エタノールで沈澱
させた（１／１０容量の３ＭＮａＯＡｃ、３容量のエタ
ノール、−７０°Ｃで３０分間）。この沈澱をエッペン
ドルフ遠心管中で遠心（１５分間）して集め、次いでこ
のＤＮＡを水１２５μρに溶解した。次に行う脱ホスホ
リル化が完全かどうかを測定するのに用いるためにＤＮ
Ａ〜５μ９を取った後、ＤＮＡの残りを１０×細菌性ア
ルカリホスフアーゼ（ＢＡＰ）緩衝液２０μＱおよびＢ
ＡＰ　　８０μｇ（２４単位／ｍのに加えた。この混合
物を７０°Ｃで１時間インキュベートし、次いでＢＡＰ
　８０μρを加え、さらに１時間インキュベートした。

このＤＮＡをフェノール、セバグで抽出し、すぐ上に記
したようにして沈澱させ、ＴＥ５０μρに溶解した。こ
のＤＮＡの大きさを０．３％のアガロースゲルで調べる
と、〜３０ｋｂであることがわかった。

＊ＴＳＢは３０９／Ｃで調製し、バルチモア・バイオロ
ジカル・ラボラトリーズ［Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＢＬ）、
　Ｐ、ｏ、Ｂｏｘ　２４３．　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌ
ｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　２１０３１］から得られる。

Ｃ，ベクターＤＮＡの挿入ＤＮＡへのライゲーション 実施例６Ａからの、Ｈｐａｌ消化し、脱ホスホリル化し
、そしてＢａｍＨＩ消化したベクターｐＫＣ５０５ＤＮ
Ａ約２ｕ（１＜約１μｇ）、ならびに実施例６Ｂからの
、脱ホスホリル化した供与ＤＮＡＭｂｏ１部分体４μＱ
（約１．２μｇ）を、実質的に実施例２Ｂの教示に従っ
て、１０μρの反応液中、１６°Ｃで１６時間、Ｔ４　
　ＤＮＡリガーゼ４００単位でライゲーションした。ラ
イゲーション反応混合物５μＱをライゲーションしてい
ないＤＮＡの対照とともに０．３％アガロースゲルにか
けることによって、このライゲーションをモニターシた
。

Ｄ、インビトロでのパッケージング ライゲーション混合物的２．５μＱをギガバック（Ｇｉ
ｇａｐａｃｋ）＊凍結−解凍抽出物（１０μ（１）を含
有している管に加えることによってパッケージングを行
った。これに音波抽出物（Ｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔ
）　１５　ｕρを加え、この溶液を穏やかに混合し、短
時間遠心し、次いで室温（２４℃）で２時間インキュベ
ートした。この混合物にＳＭ［１０ＱｍＭ　ＮａＣＱ、
１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，５Ｑ　ｍＭ　トリス−ＨＣｌ２
（ｐＨ７゜５）、０．０２％ゼラチン］約０．５ｘＩ２
およびクロロホルム２５μｇを加え、混合し、そしてエ
ッペンドルフ遠心で１分間遠心して浄化した。生存して
いる細菌をすべて死滅させるためにクロロホルムを加え
た。この上清を大腸菌細胞の感染に用いた。

＊パッケージングキットはいくつかの製造元から入手す
ることができる。

ギガバック・ベクター・クローニング・システムズ：Ｇ
ｉｇａｐａｃｋ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、　３７７０　Ｔａｎ５ｙＳｔｒｅｅｔ、　
Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ　９２１２１プロメガ・バ
イオチック：　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　２８
００　Ｓ。

Ｆｉｓｈ　Ｈａｔｃｈｅｒｙ　Ｒｏａｄ、　Ｍａｄｉｓ
ｏｎ、　Ｗｌ　５３７１１Ｅ、大腸菌に１２　　ＳＦ８
の形質導入大腸菌に１２５Ｆ８（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８
３５）を、０．２％マルトースおよび１０＋＋＋Ｍ硫酸
マグネシウムを追加したトリプトン酵母抽出物（ＴＹＭ
Ｍ）５ｍ（！に接種した。この培養物を通気することな
く３７℃で一晩インキユベートした。この−晩培養物に
ＴＹＭＭをさらに５０ｍ１２加えた後、この＝６８− 培養物を通気することなく３７℃で３時間インキュベー
トした。この細胞を６．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心し、
ペレットをＴＭ［１０ｍＭトリス−ＨＣ（２（ｐＨ７，
６）、１０　ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ４］　３　ｍ（ｌに再懸
濁した。

細胞それぞれ約０．２Ｒρを、インビトロでパッケージ
ングしたファージ１０ｕＱまたは５０μρで感染させた
。３７°Ｃで１０分間吸着を行った。ＴＹブロス１酎を
加え、混合物を３０℃で２時間インキュベートした（ｐ
ＫＣ５０５またはその誘導体を含有している大腸菌培養
物はすべて３７〜４２℃よりむしろ３０〜３４°Ｃで増
殖させる）。その一部（０，１ｍρ）を、１００ｔｔ９
／ｍＱのアブラマイシンを追加したＴＹプレートに蒔き
、３０°Ｃで一晩インキニベートした。１０μσのパッ
ケージングした溶菌液に対する０、１ｍ（ｌあたりでは
約２７の形質導入体が、そして５０μｅのパッケージン
グした溶菌液に対する０、１ｄあたりでは１３０の形質
導入体が得られた。

また、残っているファージ溶菌液を用いてスケールアッ
プした反応を行った。すなわち、〜５００μＱのファー
ジ溶菌液を５０村のエルシンマイヤーフラスコ中のＴＭ
　　１．５πρに加え、３０℃で１５分間振盪して残存
のクロロホルムをすべて蒸発させた。ペレットをＴＭｏ
、５Ｈに再懸濁すること以外は上記と同様にしてＳＦ８
細胞を調製した。

この細胞をファージに加え、振盪することなく３７℃で
１０分間インキュベートした。ＴＹブロス１０１ｆｆを
加え、この細胞を振盪しなから３０°Ｃで９０分間イン
キュベートした。遠心（６，ＯＯＯｒｐｍ、　５分間）
した後、細胞をＴ　Ｍ　３　ｍＱに再懸濁し、アブラマ
イシンを追加した３０ＴＹプレートに蒔いた（Ｏｙｌｘ
Ｍプレート）。これらのプレートを３０℃で一晩インキ
ユベートした。約１．０’ＯＯコロニー／プレートが得
られた（合計３０，０００コロニー）。この大腸菌形質
転換体を集めて一部ライブラリーを創製し、これから−
次プラスミドブールを調製した。

Ｆ、ストレプトマイセス・グリセオフスカスの形策転携 ストレプトマイセス・グリセオフスカス（ＡＴＣＣ２３
９１６）の完全増殖の一晩培養物からの約０．５ＲＱを
、０．５％グリシンを加えたＴＳＢＩＯｌｌＱに接種し
た。３４°Ｃで２４時間インキュベートした後、組織粉
砕機を用いて培養物をホモジナイズし、このホモジネー
トｏ、５ｒａＱを、０６５％グリシンを含む新しいＴＳ
Ｂ培養液１０順に接種した。この培養物も３４℃で２４
時間インキュベートした。この時点で、細胞を一７０℃
で凍結させて保存することができる。次いで、この培養
物を１５Ｒ１２の滅菌ポリスチレン製遠心管に移し、５
゜０００　ｒｐｍで１０分間遠心した。回収したペレッ
トをＰ培地１０１１（！で１回洗浄し、次いで再ペレッ
ト化した。このペレットを、１　ｍｇ／　ｍρリソチー
ムを含むＰ培地１０ＭＱで洗浄し、３０°Ｃで０．５時
間インキュベートした。少量の試料を取り、相コントラ
スト顕微鏡で観察して球形細胞を含んでいる試料を同定
することによって、プロトプラストの生成をモニターす
ることができる。このプロトプラストを上記のようにし
て遠心し、Ｐ培地中で２回洗浄し、次いでＰ培地２祿に
再懸濁した。

１．５ＲＱのエッペンドルフ管中のプロトプラスト約１
５０頭を一部プラスミドブールＤＮ１２ｕＱに加え、穏
やかに混合した。直ちに、５０％ポリエチレングリコー
ル（ＭｗｌＯＯＯ１Ｐ培地中）１００μＱを加え、２分
間そのままにした。次いで、Ｒ２上部寒天４ＦＩＱ中の
形質転換混合物１００μｇを乾燥Ｒ２プレートに蒔き、
続いてａｏ’ｃで２０時間インキュベートした。２５μ
ｙ／ｍρの最終濃度を与えるに十分なアブラマイシンを
含有しているＲ２上部寒天を上層に加えた後、このプレ
ートを３０°Ｃでインキニベートした。上層添加の２〜
３日後に形質転換体が現れ、合計的５．０００のアブラ
マイシン耐性コロニーが得られた。

これらのコロニーをそぎ取って集め、振盪しなから３４
°Ｃで一晩、１００μ９／　ｍ（ｌのアブラマイシンを
加えたＴＳＢ　　１１２中で増殖させた。この培養物的
１００μσをスピラマイシン（２５μ９／１１の追加の
ＴＳＢ寒天に蒔いた。３４°Ｃて１週間後に形質転換体
が現れた。１２の形質転換体を取り、スピラマイシンを
加えた少量のＴＳＢ中で増殖させた。

実質的にキーザー（Ｋｉｅｓｅｒ、　１９８４．　Ｐｌ
ａｓｍｉｄ　１２：１９）の教示に従って、これらの細
胞から高速プラスミド小調製物を作成した。次いで、ｐ
ＫＣ５９２と命名したこのプラスミドＤＮＡを制限酵素
分析によって分析し、そして均質であることがわかった
。

プラスミドｐＫＣ５９２の制限部位地図を添付の第１図
に示す。

実施例７　コスミドｐＫＣ５９２のＢａｍＨＩによる消
化および〜２．９ｋｂフラグメントの単離ｐＫＣ５９２
ＤＮＡ約１μ９を、実質的に実施例３の教示に従って、
ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。この酵素は挿入体を６
つの異なる場所で切断し、〜１　、５　ｋｂ、〜１．７
ｋｂ、〜１．８ｋｂ、〜２．１ｋｂ、〜２　、９　ｋｂ
、〜５．５ｋｂ、および〜９．４ｋｂの７種類の異なる
フラグメントを生成する。これらのフラグメントを、通
常のよく知られた方法に従ってＡＧＥゲルから単離し、
そして〜２．９ｋｂのフラグメントが所望のスピラマイ
シン耐性遺伝子ヲ含んでいることがわかった。

実施例８大腸菌に１２　Ｃ６０Ｃ６００ＲＫ−／ｐＨＪ
　Ｌ　２２５の培養およびプラスミドＤＮＡの単離 所望の培養およびそれに続くプラスミドｐＨＪＬ２２５
の単離は、実質的に実施例１の教示に従って行った。大
腸菌株に１２　Ｃ６０Ｃ６００ＲＫ−／ｐＨＪ　Ｌ　２
２５は、このプラスミドの好ましい供給源および貯蔵体
として、受入れ番号ＮＲＲＬＢ−１’８０５２のもとで
たれでも入手することができる。プラスミドｐＨＪ　Ｌ
　２２５の制限部位および機能地図を添付の第４図に示
す。

実施例９中コピー数プラスミドｐＨＪ　Ｌ　４００およ
びｐＨＪＬ４０１の組立て Ａ、プラスミドｐＵｃ１９のＮｄｅｌ消化プラスミドｐ
Ｕｃ１９［ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　　
Ｉｎｃ、、　８００　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　Ｄｒ、、
　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ０８８５４）］約１μ
９を、実質的に実施例３の教示に従い、ＮｄｅＩ制限酵
素および１０ＸＮｄｅｌ制限緩衝液［５００１１１Ｍ　
　トリス−ＨＣｆｆ（ｐＨ８，０）、１００　ｍＭ　Ｍ
ｇＣ（１，および５００ｍＭＮａＣρ］を用いて完全に
消化し、直線状のベクターフラグメントを創製した。沈
澱させ、洗浄した後、これらの直線状フラグメントを、
実質的にマニアテイス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　１９８２）の教示に従い、ウシ腸アルカリホス
ファターゼを用いて脱ホスホリル化した。

Ｂ、　中間体プラスミドｐＨＪ　Ｌ　３９９の組立て実
質的に実施例３の教示に従ってプラスミド１）ＨＪＬ２
２５（実施例８で単離）約３５μｍ！（１７゜５μｇ）
をＢａｍＨＩ制限酵素で完全に消化し、５ＣＰ２★レプ
リコンを含有している所望の〜２．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ
フラグメントをＡＧＥで精製した。

次いで、プラスミドｐｌ　Ｊ　７０２（ＡＴＣＣＢ、−
３９１５５）約２０μｅ（１０μｇ）を、Ｂｃｌｌ制限
酵素１０単位および１０ＸＢＣ１ｌ制限緩衝液［５００
ｍＭ　トリス−ＨＣｆｆ（ｐＨ８，０）、ｌ　００　ｍ
Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｔおよび５００ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！］
を用いること以外は実質的に実施例３の教示に従って消
化した。チオストレプトン耐性を付与する遺伝子を含有
しているこの〜１．１ｋｂのＢａ１ｌフラグメントをＡ
ＧＥによって単離し、精製した。次いで、実質的に実施
例２Ｂの教示に従ってこれら２種類のフラグメントをラ
イゲーションしてプラスミドｐＨＪＬ３９９を組立て１
、これを実質的に実施例６Ｆの教示に従ってストレプト
マイセス・リビダンスＴＫ２３（ＮＲＲＬ　　１５８２
６）に導入した。この形質転換体をその構成プラスミド
の制限酵素分析によって分析し、次いでプラスミドｐＨ
ＪＬ４００および４０１の組立てに用いるためにプラス
ミドｐＨＪＬ３９９　ＤＮＡを単離した。

約３０μＣ（１μｇ）のプラスミドｐＨＪ　Ｌ　３９９
を、実質的に実施例９Ａの教示に従ってＮｄｅＩ制限酵
素で消化した。プラスミドｐＨＪＬ３９９にはＮｄｅ１
部位が１つしか存在していないので、直線状のフラグメ
ントが１つだけ生成し、これをＡＧＥで精製した。次い
で実質的に実施例２Ｂの教示に従い、このヘクター骨格
を、Ｎｄｅｌ消化して脱ホスホリル化したｐＵｃ１９フ
ラグメント（実施例９＝７６− Ａで単離）にライゲーションした。

Ｄ、大腸菌ＪＭＩ　０９の形質転換 実質的にマニアティス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　１９８２）記載の塩化カルシウム／塩化ルビジ
ウム法を用いて、コンピテントな大腸菌Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ
９細胞［ストラドジエン＊　（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ）
］を上記のライゲーション混合物で形質転換した。アン
ピシリン耐性およびＸ−ガルを含有している培地での青
色コロニーの生成によって形質転換体を同定し、これを
プラスミドＤＮＡの制限消化によって確認した。

プラスミドｐＨＪＬ４０１は、アンピシリン耐性遺伝子
の近くにＩ）ＨＪ　Ｌ３９９由来のチオストレプトン耐
性を付与するフラグメントを含んでおり、一方、ｐＨＪ
Ｌ４００は、アンピシリン耐性遺伝子からもっと遠いと
ころにチオストレプトン耐性を付与するフラグメントを
含んでいる。この両プラス゛ミドはＳ、グリセオフスカ
スおよびＳ、リビダンスをチオストレプトン耐性に形質
転換する。プラスミドｐＨＪＬ４００の模式図を添付の
第５図に示す。

実施例１０プラスミドｐＫＣ６３１の組立て約１０μｍ
２（１μ９）のｐＨＪＬ４００を、実質的に実施例３の
教示に従ってＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。次いで実
質的に実施例２Ｂの教示に従い、ｐＫＣ５９２由来のＢ
ａｍＨＩ消化したＤＮＡ（実施例７で単離）約０．１μ
２をｐＨＪＬ４００にライゲーションした。次いで実質
的に実施例９Ｄの教示に従い、このライゲーション混合
物を用いてコンピテントな大腸菌ＪＭＩ　０９細胞（ス
トラドジエン＊）を形質転換し、アンピシリン耐性につ
いて選択した。実質的に実施例１の教示に従い、この形
質転換体を集めてプラスミドＤＮＡを調製し、次いで集
めたＤＮＡをＳ、グリセオフスカスに導入した。実質的
に実施例６Ｆの教示に従って形質転換を行い、チオスト
レプトン耐性について選択し、そして形質転換体を集め
、２５μｇ／　＋１１１２のスピラマイシンを追加した
ＴＳＢ中で増殖させた。この培養物を増殖させた後、２
５μ９７７１（！のチオストレプトンを含むＴＳＡに細
胞をプレートし、このプレートに生成してきたスピラマ
イシン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。

このプラスミドＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９細胞の形質転
換に用い、アンピシリン耐性について選択した。白色コ
ロニーを取り、プラスミドＤＮＡを分析した。

分析したコロニーのすべては同一のプラスミドを有して
おり、ｐＫＣ６３１と命名したこれらのうちの１つをＳ
、グリセオフスカスに導入し、チオストレプトン耐性、
次いでスピラマイシン耐性について選択した。プラスミ
ドｐＫＣ６３１の制限部位地図を添付の第６図に示す。

＊ストラドジエン：　Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ、　３７７
０　Ｔａｎ５ｙ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａｌ汀ｏｒｎｉａ　９２１２
１実施例１１　プラスミドｐＫＣ６８１の組立て実質的
にキーザー（Ｋｉｅｓｅｒ、　１９８４．　Ｐｌａｓｍ
ｉｄ　１２：１９）の教示に従ってストレプトマイセス
・リビダンス（ＡＴＣＣ３９１，５５）から単離したｐ
ｌＪ７０２約１μ９、水２５μσ、１　ｙ、９／ｌｙ、
Ｑ　Ｂ　Ｓ　Ａ　５ｕＱ、１０Ｘ１０ＸＢａ制限緩衝液
［２００ｍＭトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）、ＩＭ　
ＮａＣＱ、７０ｍＭ　ＭｇＣＧおよび２０ｍＭ２−メル
カプトエタノール］−７９＝ ５μρ、およびＢａｍＨ１酵素２μρ（〜２ｏ単位）を
混合し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。次に、
このベクターＤＮＡを沈澱させ、洗浄し、そして乾燥し
た。次いで、実質的に実施例２Ｂおよび６Ｆの教示に従
って、このベクターに、ｐＫＣ５９２のＢａｍＨＩ消化
〜２．９ｋｂスピラマイシン耐性付与フラグメント（実
施例７で単離）約０．２μｇをライゲーションし、これ
をストレプトマイセス・グリセオフスカスに導入した。

得られたプラスミドｐＫＣ６８１およびｐＫＣ６８２は
、ＳｒｍＣ遺伝子の配向だけが異なっており、ストレプ
トマイセス・グリセオフスカスにスピラマイシン耐性を
与えた。プラスミドｐＫＣ６８１およびｐＫＣ（３８２
の制限部位地図を添付の第７図および第８図に示す。

実施例１２組込みプラスミドｐＫＣ１００１の組立て 実質的に実施例６Ｂの教示に従って、ストレプトマイセ
ス・フラジエ（ＡＴＣＣ１９６０９）から染色体ＤＮＡ
を単離し、次いで、実質的にマニ＝８０− アティス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９
８２）記載のＤＮＡポリメラーゼＩ法を用いて５°突出
部を充填した。次に、実質的に実施例３の教示に従い、
Ｅ、ｃ。

ＲＩ制限酵素を用いてｐＢＲ３２２（ＢＲＬ）約２μ２
を完全に消化し、そしてこのＥｃｏＲＩ切断したｐＢＲ
３２２の５゛突出を上述のＤＮＡポリメラーゼＩ法を用
いて充填した。次いで実質的に実施例２Ｂの教示に従っ
て、Ｍｂｏｌ切断して充填した染色体ＤＮＡ、およびＥ
ｃｏＲＩ切断して充填したｐＢＲ３２２をライゲーショ
ンした。このライゲーション混合物を、実質的に実施例
９Ｄの教示に従って、コンピテントな大腸菌ＪＭ１０９
細胞に導入し、テトラサイクリン耐性について選択した
。

次いで、この中間体プラスミドｐＫＣ１００１Ａを、実
質的に実施例１の方法に従って、形質転換細胞から取り
出した。

プラスミドｐＫＣ１００１Ａ　約１０μＱ（〜５μｇ）
、水２５ｉｔＱ’、　ＢＳＡ　５ｕ（２，１０Ｘ　、Ｂ
ａｍＨＩ制限緩衝液［２００ｍＭ）リス−ＨＣｆｆ（ｐ
Ｈ８，０）、ＬＭＮａＣρ、７０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ！９お
よび２０ｍＭ２−メルカブトエタノール］５μｅ１およ
びＢａｍＨＩ酵素１μＱを混合し、３７°Ｃで４５分間
インキュベートした。そのｌＯμｇを取り、水４０μρ
と混合し、そして１０分間７０℃に加熱して酵素を不活
性化した。このプロトコールにより、Ｂ　ａｍＨＴ制限
酵素によって切断されなかった分子からＢａｍＨＩ制限
酵素によって完全に消化された分子に至る、可能性のあ
るすべての反応生成物が得られた。その一部を、ｌ／１
０容量のＮａ０Ａｃ（ＰＨ８，０）および２容量のエタ
ノールで沈澱させ、−７０℃で１時間凍結させた。次い
で、この部分的にＢａｍＨＩ消化されたプラスミドを、
実質的に実施例２Ｂの教示に従って、コスミドｐＫＣ５
９２由来のＢａｍ’ＨＩ挿入体（実施例７で単離）にラ
イゲーションした。

次に、このライゲーション混合物を大腸菌ＪＭＩ０９細
胞に導入し、形質転換体をアンピシリンおよびテトラサ
イクリン耐性について選択した。形質転換体のすべてを
集め、実質的に実施例１の教示に従ってプラスミドＤＮ
Ａを取り出した。ｐＫＣｌｏｏｌおよびｐＫＣ１００２
と命名した生成プラスミドは、ＳｒｍＣフラグメントの
配向だけが異なっており、これらを添付の第９図および
第１０図に示す。

２５μｇ／ｍ（ｌの最終濃度を与えるに十分なスピラマ
イシンを含有しているＲ２上部寒天をプロトプラストに
かぶせること以外は実質的に実施例６Ｆの教示に従って
、プラスミドｐＫＣ１００１　約２μｅを用いてストレ
プトマイセス・フラジエのプロトプラストを形質転換し
た。プラスミドｐＢＲ３２２はストレプトマイセス　レ
プリコンを含有していないので、生成した耐性コロニー
だけが、細胞が二重交差、ホモローガスな組換え、およ
びそれに続＜ＳｒｍＣ遺伝子のストレプトマイセスゲノ
ムへの組込みを受けたものである。

実施例１３大腸閑に１２　　ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３１
の培養およびプラスミドｐＫＣ３３１の単離 Ａ、大腸菌Ｋｌ　２　　ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３’ｌの
抵秀 大腸菌Ｋ　１２　　ＢＥ４４７／ｐＫＣ３３１（ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１５８２８）の培養物２酎を、ＴＹ培地［１％
トリプトン、０．５％ＮａＣＱおよび０．５％酵母抽出
物（ｐＨ７，４）］中、５０Ｍｇ／１１１２のアンピシ
リンの存在下、細胞が定常期に達するまで増殖させた。

次いで、この２顧培養物を、５０μ９／１ｔｒＱのアン
ピシリンを含有しているＴＹ培地１１２を入れたフラス
コに接種し、培養物の５５’　Ｏｎｍでの光学密度（０
，Ｄ、）が０．５０〜０１７５吸収単位となるまで培養
を続けた。Ｏ，Ｄ、５５０が０，５０〜０．７５の範囲
内に到達したら、ウリジン１ｇを加え、１５分後にクロ
ラムフェニコール１７０ＩＩＩｇを加えた。次いで、イ
ンキュベートおよび培養を１６時間続けた。

Ｂ、プラスミドｐＫＣ３３１の単離 培養物を遠心し、その細胞ペレットを２５％（重量／容
量）スクロース、５０　ｍＭ　トリス−ＨＣｌ２（ｐＨ
＝８）、および１ｍＭＥＤＴＡの溶液１０酎に再懸濁し
た。次に、０．２５Ｍ　トリス−ＨＣＣ（ｐＨ−８）中
の５１１ＩＬｉＩ／ＩＩＱリソチームの溶液２Ｒ１２お
よび０゜５Ｍ　ＥＤＴＡ　２ｍρを加え、得られた混合
物を室温で１５分間インキュベートした。このインキュ
ベートの後、５０　ｍＭ　）リス−ＨＣＱ（ｐＨ＝８）
、６ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．１％トリトンｘ−ｔｏ
。

の溶液約１４ｆｆρを加えた。次いで、このリソチーム
処理した細胞を反転混合した。

細胞の残骸がゆるやかなペレットとなるまでこの溶菌細
胞混合物を遠心した。この細胞残骸ペレットを捨て、上
清を緩衝化フェノール（ｐＨ＝　８　）で抽出した後、
水相を０．２５ＭＮａＣｆ２にし、２容量のエタノール
を加えた。得られた混合物を一７０°Ｃまで冷却し、核
酸を遠心によってペレット化した。臭化エチジウムを含
む塩化セシウム勾配を用いてさらに遠心（４５，ＯＯＯ
ｒｐｍ、　２０°Ｃ，１６時間）を行ってプラスミドＤ
ＮＡを精製した。

次いで、所望のプラスミドｐＫＣ３３１　　ＤＮＡを集
メ、常法によって臭化エチジウムおよび塩化セシウムを
除去した。この方法によって得られたプラスミドｐＫＣ
３３１　　ＤＮＡ約１ｆｆ９をＴＥ緩衝液［１０ｍＭト
リス−ＨＣ（！（ｐＨ８）および１ｍＭＥＤＴＡ］ＩＭ
Ｑに溶解し、−２０°Ｃで保存した。ファスミドｐＫＣ
３３１の制限部位および機能地図を添付の第１１図に示
す。

実施例１４　ファージｐＫＣ１００３の組立て実施例１
３で単離したファスミドｐＫＣ３３１約１０μ９（１０
μのを、１０ＸＰｓｔｌ塩　Ｌｏｕｄ。

制限酵素ＰｓｔＩ　　２ｕ１２（〜１０単位）および水
７８ｐＱに加えた。穏やかに混合した後、この消化混合
物を３７°Ｃで２時間反応させ、消化の後、ファージ−
Ｃ３１配列を含有している〜３７ｋｂのＰｓｔｌフラグ
メントを通常のゲル電気泳動法によって精製した。得ら
れた精製フラグメント（〜５μｇ）をＴＥ緩衝液５μＱ
に懸濁させた。

ファスミドｐＫＣ３３１の〜３７ｋｂＰｓｔＩ制限フラ
グメント、およびｐＫＣ５９２の〜２．９ｋｂＢａｍＨ
Ｉスピラマイシン耐性付与フラグメント（実施例７で単
離）の両末端の５“突出部を、実質的にマニアティス等
（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２）記載
のＤＮＡポリメラーゼ■法を用いて充填した。次いで、
実質的に実施例２Ｂの教示に従ってこれらのフラグメン
トをライゲーションした。このライゲーションによって
、〜２．９ｋｂのＳｒｍＣフラグメントの配向だけが異
なっている所望のファージｐＫＣ１００３およびｐＫＣ
１００４が得られた（第１２図および第１３図を参照）
。このライゲーションしたＤＮＡを用いてストレプトマ
イセスを形質転換し、感染性のファージ粒子を得、次い
でこのファージを用い、ベクターの染色体組込みによっ
てスピラマイシン耐性のストレプトマイセスを調製した
。

実施例１５　ストレプトマイセス・リビダンス／ｐＫＣ
１００３の作成 Ａ、溶液のリスト 実施例１５中に記した溶液を以下に挙げ、それらを明示
する。

１、ＴＳＢ（１−リプチカーゼ大豆ブロス）ＴＳＢは３
０ｇ／ｆｆで作成され、ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ社（Ｂｅｔｂｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　８７１７　Ｇｒ
ｏｖｅｍｏｎｔＣｉｒｃｌｅ、　Ｐ、　０゜Ｂｏｘ　５
７７、　Ｇａｔｌｅｒｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　
２０７６０）から得られる。

２、ＹＭＸ寒天 ０．３％酵母抽出物 ０．３％麦芽抽出物 ０．２％デキストロース ２．０％寒天 ３、　　Ｐ培地（〜１００ｍの 軟量 スクロース　　　　　　　　　１０．３９に、ＳＯ４０
，０２５９ 微量元素溶液（＃４参照）０．２ｍ（ＩＭｇＣＩＬ・６
Ｈ２００，２０３ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　８０酎になるまで オートクレーブ処理後、次の成分を加える：ＫＨ，ＰＯ
，（０，５％）　　　　　　　　　１酎ＣａＣＱｔ・２
Ｈ！Ｏ（３，６８％）ｌＯＲＱ（Ｎ−トリス（ヒドロキ
シメチル） メチル−２−アミノエタンスル ホン酸）ｒＴＥｓＪ緩衝液、 ０、２５Ｍ、　ｐＨ７，２１０’ｍ（１４、微量元素溶
液（〜１の： 成分　　　　　　　　　　　　里 ＺｎＣＱ＊４０ｆｆ９ ＦｅＣＩ２ｔ”　６ｍｍＯ２００１１！９ＣｕＣ（ｌｔ
−２ＨｔＯ１０ｔｔｒ’ｉＭｕＣＱ２”　４１（ｓｏ　
　　　　　　　１０１Ｒ９ＮａＪ４０７”　ｌ　０Ｈ２
０１０ｙｎｇ（Ｎ　Ｈ、）、ＭＯ，０２４・４Ｈ，０１
ｏ即５、Ｒ２再生培地（〜１の； 軟量 スクロース　　　　　　　　　１０３９に、Ｓｏ、　　
　、　　　　　　　　　　　０．２５９微量元素溶液　
　　　　　　　　２Ｈ ＭｇＣＬ　＊　６　Ｈ２０１０、１２９グルコース　　
　　　　　　　　１０９Ｌ−アスパラギン・ｌ　Ｈ，０
２，０ｇカザミノ酸　　　　　　　　　　　０．１９寒
天　　　　　　　　　　　　　２２ｇ水　　　　　　　
　　　　　　　　７００叶になるまで オートクレーブ処理後、次の成分を加える二Ｋ　Ｈ、Ｐ
　Ｏ、（０，０５ｇ／１０釦の　　　１００ｘ（ＩＣａ
Ｃ１２ｔ（２，２２ｆＦ／１００ｍ１２）　　　　　　
１００　ｒｒｔＱＴＥＳ緩衝液（５，７３９／１００ｉ
（２゜ｐＨ７，２）　　　　　　　　　　　１００酎Ｎ
ａ０Ｈ（５Ｎ）　　　　　　　　　　　１ｍＱ６、Ｒ２
ＹＥ培地は、２５％酵母抽出物を１ρあたり２０肩σ加
えたＲ２培地である。

Ｂ、プロトプラスト調製用の培養物の増殖常法により、
０．４％グリシンを追加したＴＳＢ中、水没の条件下、
３０°Ｃで２０時間、ストレプトマイセス・リビダンス
１３２６（ＡＴＣＣ１５８２５＞を増殖させることによ
って、増殖期接種物を調製した。Ｓ、リビダンスをプロ
トプラスト化する操作は通常次のようにして行った。Ｓ
。

リビダンスの培養物をＹＭＸ寒天含有のプレートに蒔き
、３０°Ｃで約４８時間インキュベートした。

次に、このプレートの細菌コロニーを１つだけ１８８１
０ｍ１２に接種し、培養物をホモジナイズし、次いで３
０°Ｃで一晩インキニベートした。この−晩培養物的４
１をホモジナイズし、０．４％グリシンを追加したＴＳ
Ｂ　　１００ｍｆ２に加え、そして３０℃で一晩インキ
ユベートした。新鮮な一晩培養物を用いてこの操作を繰
り返した。次に、５０％（容量／容量）グリセリン約５
ＣＤＩＱを培養物に加え、１５ＲＱづつの試料を凍結さ
せ、−２０℃で６力月まで保存した。この管を室温で水
の入ったビーカーに入れることによって、この凍結細胞
を解凍した。次いで、細胞を卓上遠心機で集め、１０゜
３％スクロース１０ｍ１２中で３回洗浄した。この細胞
ペレットを、リソチーム（１ｍ９／ｘＩ２）を追加した
Ｐ培地１０友Ｑに再懸濁し、３０°Ｃで２時間インキュ
ベートした。次いで、この混合物を遠心してプロトプラ
ストをペレット化した。このペレットを３回洗浄した（
Ｐ培地を１０１１１２用い、各洗浄毎にペレットを溶液
中に混ぜ込んで）。このプロトプラストを、後に行う形
質転換用にＰ培地２１１Ｑに再懸濁した。

Ｃ、ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換実施例
１４のライゲーションしたＤＮＡ、ストレプトマイセス
・リビダンスのプロトプラスト２００μρ、ストレプト
マイセス・リビダンスの胞子１０８個、およびＰ培地中
の５５％ポリエチレングリコール５００μＱを混合し、
その一部２５μσおよび２５０μρをＲ２ＹＥ上部寒天
３Ｍρを含むＲ２ＹＥプレートに蒔いた。このプレート
を３７°Ｃでインキュベートした。通常、〜２０時間後
にプラークを観察することができる。プラークが現れた
後、これをプレートから取り、ファージ粒子を寒天から
ＴＳＢ培地に洗い出した。このファージ懸濁液の連続希
釈を作成し、その一部を取り、ストレプトマイセス・リ
ビダンスの胞子１０８個と混合した。プレート上の良好
なプラーク分布が得られるように希釈を作成した。この
混合物をＲ２−９２＝ ＹＥプレートに蒔き、胞子形成が起こるまで３００Ｃで
インキュベートした（約４日かかる）。胞子形成の後、
このプレートを２５μｇ／ｍＱスピラマイシン含有の新
鮮なＲ２ＹＥプレート上にレプリカ平板性処理した。次
いで、このレプリカ・プレートを３０°Ｃで３〜４日間
インキュベートし、得られたＳ、リビダンス／ｐＫＣｌ
ｏ０３スピラマイシン耐性コロニーを既知の方法に従っ
て単離し、培養し、そして同定した。

上記の教示に従って作成される代表的なトランスフェク
タントには、次の第１１表に挙げたトランスフェクタン
トが含まれるが、これらに限定されるものではない。

第１１表代表的なトランスフェクタント１、ストレプト
マイセスＲ／Ｒ’：ここで、Ｒはフラジエ、グリセオフ
スカスおよびリビダンスであり、Ｒ１は独立してｐＫＣ
１００３およびｐＫＣ１００４である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＫＣ５９２の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、第２図は、コスミドｐＫＣ
５０５およびストレプトマイセス・アンボファシエンス
ＤＮＡを用いる、ゲノムＤＮＡライブラリー作成の工程
図であり、第３図は、コスミドｐＫＣ５０５作成の工程
図であり、第４図は、プらスミドｐＨＪ　Ｌ　２２５の
制限部位および機能地図を示す模式図であり、第５図は
、プラスミドｐＨＪＬ４００の制限部位および機能地図
を示す模式図であり、第６図は、プラスミドｐＫＣ６３
１の制限部位および機能地図を示す模式図であり、第７
図は、プラスミドｐＫＣ６８１の制限部位および機能地
図を示す模式図であり、第８図は、プラスミドｐＫＣ６
８２の制限部位および機能地図を示す模式図であり、第
９図は、プラスミドｐＫＣ１００１の制限部位および機
能地図を示す模式図であり、第１０図は、プラスミドｐ
ＫＣ１００２の制限部位および機能地図を示す模式図で
あり、第１１図は、プラスミドｐＫＣ３３１の制限部位
および機能地図を示す模式図であり、第１２図は、ファ
ージｐＫＣ１００３の制限部位および機能地図を示す模
式図であり、第１３図は、ファージｐＫＣ１００４の制
限部位および機能地図を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、複製起源または組込み配列がストレプトマイセス属
   およびノカルジア属中で機能し得るという限定条件のも
   と、 ａ）このような複製起源または組込み配列であるＤＮＡ
   配列、 ｂ）抗生物質スピラマイシンに対する耐性を付与するス
   ピラマイシンＣ耐性遺伝子、 を含有することを特徴とする組換えＤＮＡクローニング
   ベクター。 ２、プラスミドまたはファージである請求項１記載のベ
   クター。 ３、プラスミドである請求項２記載のベクター。 ４、ｐＫＣ６８１またはｐＫＣ６８２である請求項３記
   載のベクター。 ５、ファージである請求項２記載のベクター。 ６、ｐＫＣ１００３またはｐＫＣ１００４である請求項
   ５記載のベクター。 ７、ａ）大腸菌の複製起源、および ｂ）大腸菌に選択可能な表現型を付与するＤＮＡ配列、 をさらに含有する請求項１記載の組換えＤＮＡクローニ
   ングベクター。 ８、ｐＫＣ５９２またはｐＫＣ６３１である請求項７記
   載のベクター。 ９、プラスミドｐＫＣ５９２にコードされている、スト
   レプトマイセス・アンボファシエンスのＳｒｍＣ遺伝子
   を含有する組立てられた組換えＤＮＡ配列。 １０、ｐＫＣ５９２の〜２．９ｋｂ　ＢａｍＨＩ制限フ
   ラグメント。 １１、ストレプトマイセス属、ノカルジア属または大腸
   菌である、請求項１、２、７または８のいずれかに記載
   のベクターで形質転換した宿主細胞。 １２、ストレプトマイセス・グリセオフスカス／ｐＫＣ
   ５９２である請求項１１記載の宿主細胞。 １３、ストレプトマイセス・グリセオフスカス／ｐＫＣ
   ６３１である請求項１１記載の宿主細胞。 １４、大腸菌／ｐＫＣ５９２である請求項１１記載の宿
   主細胞。 １５、大腸菌／ｐＫＣ６３１である請求項１１記載の宿
   主細胞。