PT85527B - Processo para a preparacao de marcadores corados para clonagem em streptomyces lividans - Google Patents

Description

Memória descritiva

Até agora conhecia-se como mar cador corado para a clonagem em estreptomicetes o ge ne mel (E. Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129 (1983) 2703), o qual codifica para a tirosinase e deste modo é responsável - através de fases intermediárias - pela produção do corante melanina. Este gene está contido por exemplo no plasmídeo comercial pIJ7O2 que pode ser obtido da John Innes Foudation, Norwich, Inglaterra, e se encontra descrito por exemplo por D. A. Hopwood et al. em Genetic Manipulation of Streptomyces - A Labora tory Manual, The John Innes Foudation, 1985, pág. 292 f .

Descobriu-se agora um fragmento de ADN que se expressa em Streptomyces lividans e que provoca no meio uma coloração intensa vermelho púrpura, a qual apresenta uma difusão reduzida em meios sólidos.

A presente invenção refere-se portanto a um processo para a preparação de fragmentos de ADN que provocam a expressão de um corante vermelho em Streptomyces lividans. Este pode ser obtido a partir do ADN integral de Streptomyces coelicolor DSIí 303o por corte com BamHI, clonagem dos fragmentos num vector apropriado e selecção com respeito à produção do corante. A estirpe de partida S. coelicolor DSí-i 3030 é conhecida a partir do pedido de patente Europeia com o número de publicação 0 181 552 como produtor de uma enzima lisogénica de bactérias.

G. Habermehl et al., Z. Naturfor sch. 32b (1977) 119b, descrevem o isolamento, a degradação e a elucidação da estrutura do pigmento azul amilocj. anina do Streptomyces coelicolor Mueller, DSI4 40665. Além deste corante azul solúvel em água, são produzidos nas fases mais tardias do crescimento também outros pigmentos que não foram identificados mais em pormenor, entre os quais também substâncias de cor vermelha.

A presente invenção refere-se ainda a um processo no qual os fragmentos de ADN obtidos de acordo com o processo da presente invenção são usados como marcadores, especialmente como marcadores de inactivação em plasmídeos de estreptomicetes.

Na descrição que se segue bem como nas reivindicações são apresentados aspectos adicionais da presente invenção no seu modo de concretização preferido.

k fim de isolar o gene marcador isola-se o ADN integral a partir da estirpe Streptomyces coelicolor DSM 3030 por corte com a enzima de restrição BamHI e por clonagem por shot gun num vector apropriado, transformação de uma estirpe de estreptomicetes destinatária e selecção em relação à produção de corante. Os clones positivos contêm diferentes fragmen tos de ADN proveniente da estirpe DSK 3030 de cerca de 3,4 Kb até 9 Kb. Na figura 1 apresenta-se um mapa de restrição do fragmento de 3,4 Kb.

corante vermelho formado é mui to solúvel em água. A característica morfológica que consiste na coloração vermelho púrpura resulta de uma alta concentração do corante. Num meio sólido a maior parte do corante fica ligada ao micélio mas uma fracção difunde-se no meio. Ao microscópio observa-se um quadro característico; o corante situa-se em partículas esféricas aglomeradas em conjuntos densamente acumulados no micélio e deste modo as colónias tomam um aspecto vermelho púrpura intenso. Dm cultura líquida (meio de soja de tripsina, meio lisogénico A, pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 158 872, pág. 6) obtém-se após cerca de 3 dias um sobrenadante da cultura corado de vermelho intenso.

Também em mej.o sólido, a produção de corante tem lugar independentemente do meio utilizado (R2YE (Hopwood et al., op. cit.), meio de esporulação, (publicação de pedido de Patente Alemã 3 331 860, Exemplo 1, terceiro meio),

Penassay, Penassay com adição de antibióticos).

corante vermelho forma-se lo go no inicio do crescimento das colónias e portanto torna-se evidente que não se trata de um produto do metabolismo secundário. Em oposição a esta verificação, o tipo selvagem de S. lividans apenas produz um pigmento vermelho já próximo do fim do crescimento vege tativo (Horinouchi et al., Agric. Biol. Chem. 48 (1984)

2131).

C fragmento de 3,4 Kb de acordo com a Figura 1 apresenta uma série de sítios de corte que são apropriados para experiências de sub-clonagem. Este fragmento não contém qualquer sítio de corte para as enzimas Xhol, HindIII e PstI♦

C fenótipo vermelho das células hospedeiras contendo o plasmídeo é codificado pelo plasmídeo, como se pode demonstrar por meio de isolamento dos plasmídeos e retransformação.

Os fragmentos de ADN obtidos de acordo com o processo da presente invenção codificam seja directamente para a produção do corante vermelho seja para um gene de regulação que induz esta prociução em S. lividans. 0 facto de não se verificar qualquer produção de corante com as características indicadas em S. prasinus e em S. ghanaensis constitui um argumento a favor da existência dum gene de regulação. Deste modo os fragmentos de ADN da presente invenção não são apenas apropriados em geral para experiências de clonagem, são sim espe cialmente úteis para a detecção de genes de metabolismo em estreptomicetes. Também apontam neste sentido os resultados de Horinouchi et al., op. cit. e J. Bacteriol. 158 (1984), 481-487, os quais demonstraram que é possíveJ clonar um gene de regulação proveniente de S. bikiniensis que estimula a produção dum pigmento vermelho em S, lividans .

Nos exemplos que se seguem elucida-se a presente invenção em mais pormenor. OS dados em percentagem e as proporções referem-se a peso sempre que nada em contrário for indicado.

As figuras estão à escala, com excepção da região dos ligantes poliméricos.

Exemplo 1: Preparação do vector pGM4

A partir do plasmídeo pGlil (Pedido de patente Europeia com o número de publicação 0 158 872, Figura 2) obtém-se por digestão parcial com SstII um fragmento de 3,0 Kb. A partir do plasmídeo pSLΞ16 (Pedido de Patente Europeia com o número de publicação 0 158 201, Figura 18) obtém-se por corte com SstII o fragmento de 1 Kb que contém o gene aphl de resistência à neomicina. Por ligação dos dois fragmentos obtém-se ó plasmídeo pGM3 (Figura 2).

A partir do plasmídeo pSLE41 (BP-A2 0 158 201, Fig. 20) isola-se ainda por corte com Bcll um fragmento de 1 Kb cujas extremidades salientes são preenchidas com polimerase de Klenow.

Corta-se então o plasmídeo pGM3 com PvuII e elimina-se o fragmento de 0,3 Kb. Liga-se em seguida o plasmídeo restante com o fragmento proveniente do corte com Bcll a que se preencheram as extremidades, obtendo-se deste modo o plasmídeo pGl'-í4 (Figura 3).

Exemplo 2: preparação dum banco de genes

Lisa-se S. coelicolor DSM 3030 e isola-se o ADN do modo conhecido. Digere-se integralmente com BamHI o ADN isolado. Corta-se o plasmídeo pGM4 (Fignra 3) com BamHI, trata-se com fosfatase alcalina e liga-se com o fragmento proveniente do corte com BamHI. Transforma-se a população de plasmideos assim obtida na estirpe receptora S. lividans TK 23 (obtenível na John Innes Foudation). Por acção de 1 ug de mistura de ligação obtêm-se cerca de 20 OCO transformantes resis tentes à tiostreptona, dos quais 80% são sensíveis à neomicina e por conseguinte contêm uma inserção.

Verificou-se a existência de 500 transformantes no meio de uma colónia com uma colo ração intensa vermelho púrpura. Estas colónias foram separadas e isolou-se o ADN dos plasmídeos destes clones. Uma retransformação efectuada em seguida em S. lividans TK 23 deu origem apenas a colónias coradas de vermelho

Por meio duma caracterização do ADN do plasmídeo verificou-se que fragmentos de 3,4 a 9 Kb provenientes de tratamento por BamHI estavam inseridos no gene aphl do plasmídeo pGli4. 0 plasmídeo com a inserção de 3,4 Kb recebeu a designação de pGM97.

Exemplo 4; Transformação

Transformou-se

em diferentes estirpes de S. lividans . Em todas as estirpes foi possível observar uma expressão do corante vermelho, tanto em meios líquidos como também em meios médios.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ Processo para a preparação ôe fra gmentos de ADN que provocam a expressão de um corante ve melho em Streptomyces lividans caraeterizado por se cor tar com BamHI o DNA completo de Streptomyces coelicolor DSM 3030, se clonar o fragmento num vector apropria do, se transformar S» lividans com este vector e se seleccionar em relação à produção de corante.

   Processo de acordo com a reivindi cação 1, caraeterizado por se clonar o fragmento definido pelo mapa de restrição de acordo com a figura seguin-

   Ss II Eco RI BamHI 1____________________ EcoR SphJ 1 SstH L Sstn Bam HI 1 1

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 13 de Agosto de 1986, sob o n2 P 36 27 392.9.