PT853487E

PT853487E - Anticorpos monoclonais neutralizantes para o virus dos sincicios respiratorios

Info

Publication number: PT853487E
Application number: PT96933810T
Authority: PT
Inventors: Robert Merritt Chanock; James Earl Crowe; Glenn R Pilkington; Page S Gilmour; Brian R Murphy
Original assignee: Intracel Corp; Us Health
Priority date: 1995-09-18
Filing date: 1996-09-18
Publication date: 2000-11-30
Also published as: CA2230127A1; ATE194291T1; WO1997010846A1; US20090110684A1; US20120087909A1; US20040005324A1; GR3034349T3; AU7240096A; DK0853487T3; EP0851924A1; WO1997011177A1; EP0853487A1; EP0853487B1; ES2148799T3; CA2230116A1; DE69609188T2; US8221759B2; AU7075496A; US7488477B2; DE69609188D1

Description

DESCRIÇÃO “Anticorpos monoclonais neutralizantes para o vírus dos sincícios respiratórios”

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se genericamente ao campo da imunologia e especificamente a anticorpos monoclonais que se ligam e que neutralizam o vírus do sincício respiratório (RSV).

ANTECEDENTES DO INVENTO O RSV representa um dos principais problemas de saúde em todo o mundo. Só nos Estados Unidos existem presentemente aproximadamente 250000 recém-nascidos e crianças por ano que podem desenvolver doença de RSV grave ou fatal. O RSV é, em todo o mundo, a principal causa de doenças pediátricas graves do tracto respiratório inferior, tais como pneumonia e bronquiolite. Resulta também numa elevada taxa de morbilidade e mortalidade em bebés ou crianças pequenas com doença cardiopulmonar ou uma imunodeficiência.

Além da população infantil em risco (Mclntosh e Chanock (1990) Virology, 2a ed. (Fields and Knipe, eds) Raven Press, Ltd., New York, págs. 1045-1072), existe uma população consideravelmente grande e crescente de adultos imunossuprimidos em risco devido à aplicação cada vez mais abrangente de transplantes de órgãos, terapias de cancro/leucemia tais como transplantação de medula óssea e a proliferação de infecções por HIV na população. O HIV é actualmente o principal assassino de homossexuais no grupó etário dos 25-40 anos, nos EUA. Os idosos, os quais representam uma população crescente em países em desenvolvimento, estão também em risco devido a deficiências imunitárias resultantes dos seus sistemas imunitários envelhecidos e o RSV pode ser endémico em populações de lares de 3a idade, particularmente durante a época do Inverno.

Embora a terapia antibiótica de infecções bacterianas tenha tido sucesso em muitas doenças, poucos antibióticos estão disponíveis para a terapia de infecções virais e nenhum está presentemente disponível para o tratamento eficaz da infecção por RSV. No entanto a gravidade das infecções virais está habitualmente também correlacionada com o estado imunitário do doente. Por exemplo, existe uma correlação entre os níveis de anticorpos IgG matemos para RSV e a resistência dos bebés à infecção durante os primeiros meses de vida, quando o risco de doença grave é maior (Ogilvie, etaL.J. Med. VooI. 7: 263,1981). A gama-

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EP Ο 853 487/PT globulina humana de amostras reunidas com título elevado de anticorpos neutralizantes para RSV ou anticorpos monoclonais de murídeo neutralizantes para RSV podem proteger animais pequenos de infecção pulmonar com RSV e, quando administrados terapeuticamente, podem ser eficazes em animais pequenos e primatas no pico da infecção por RSV (Walsh, et ai, Infection and Immunity, 43: 756, 1984; Prince, et al., J. Virol., 55: 517, 1985; Prince, et ai, Virus Research, 3: 193, 1985 Prince, et ai, J. Virol.. 61: 1851, 1987; Hemming, et al, J. Inf. Dis., 152: 1083, 1985). As IgG humanas reunidas contendo anticorpos neutralizantes para RSV foram também utilizadas clinicamente, para um efeito terapêutico, num estudo de doença grave de RSV em bebés e crianças pequenas (Hemming, et al., Antimicrob. Agnts. Chemotherap., 31: 1882, 1987). No entanto a utilização de soros humanos reunidos para o tratamento de infecção por RSV tem várias desvantagens. A disponibilidade é limitada. Os lotes não são reprodutíveis. Os títulos são de 100 a 1000 vezes inferiores do que para os títulos de anticorpo monoclonal e o risco de infecção iatrogénica está sempre presente quando se utiliza soro humano devido à resistência variável de microorganismos aos procedimentos de esterilização utilizados.

Uma vacina de RSV para imunização activa, se disponível, não podia ser utilizada para o tratamento de bebés recém-nascidos com sistemas imunitários imaturos ou de doentes que estejam imunossuprimidos. Em doentes em que é necessária imunoterapia profiláctica passiva, como resultado de uma forma mais crónica da doença, a terapia vulgar é mediada através da inoculação periódica intravenosa de IgG humana preparada a partir de plasmas reunidos. Este tipo de terapia, devido aos baixos títulos de anticorpos neutralizantes anti-RSV, envolve uma grande quantidade de globulina (p. ex., 0,75 g por kg) e consequentemente requer a administração intravenosa, numa clínica ou hospital, durante um longo período (de 2 a 4 horas), mensalmente durante os meses de alto risco (Outono, Inverno e início da Primavera). O componente neutralizante das preparações de anticorpos humanos anti-RSV, derivadas de plasmas humanos reunidos, é apenas uma pequena fracção do anticorpo total presente. O desenvolvimento da tecnologia de anticorpos monoclonais de ratinho proporcionou assim anticorpos neutralizantes clonados com maior actividade específica que as preparações de plasmas humanos reunidos. No entanto problemas que resultam de respostas imunitárias aos anticorpos de ratinho, em doentes humanos, excluíram a aplicação geral destas preparações para imunoterapia passiva em humanos. O desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos para RSV tem sido contrariado, até recentemente, pela malograda adaptação da tecnologia monoclonal ao sistema humano. Os hibridomas humanos e as linhas celulares B-linfoblastóides imortalizadas transformadas por EBV, bem como

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84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ hibridomas de ratinho/humano são geralmente produtores instáveis de anticorpos, mesmo após múltiplos passos de clonagem. A clonagem e expressão de anticorpos monoclonais humanos, em E. coli utilizando fagos (Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989; Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991: Barbas et al., Proc. Natl. Acacl. Sei. (USA) 88: 7978-7982, 1991), obviaram este problema. O anticorpo monoclonal humano específico para RSV está agora disponível com uma concentração 100 a 1000 vezes superior de anticorpo específico que nas preparações de plasmas reunidos. A utilização destas preparações de anticorpo monoclonal humano diminuirá correspondentemente o volume das preparações de anticorpo necessário para profilaxia ou terapia na mesma ordem de grandeza. Doses eficazes de anticorpo monoclonal podem agora ser administradas intramuscularmente (i.m.), reduzindo deste modo o período de tempo necessário. A profilaxia em bebés recém-nascidos ou crianças pode agora ser efectuada em casa, em vez de ser em clínicas ou hospitais, reduzindo a inconveniência e eliminando o risco da doença de RSV adquirida em hospitais. Isto é adicional à redução inerente da variação de lote para lote das preparações de anticorpo monoclonal e à redução do perigo de infecções iatrogénicas em comparação com a globulina humana reunida. De facto, os reduzidos volumes das preparações de anticorpo necessários para terapia permitirão, em geral, o tratamento de doentes com doença de RSV através da administração de anticorpos intramuscularmente. A terapia por aerossol é outra forma de tratamento tomada possível como resultado da actividade específica aumentada dos anticorpos monoclonais e está também associada a uma diminuição da quantidade de anticorpos necessária. Este tipo de terapia é altamente eficiente devido à introdução de anticorpos directamente no local de infecçâo nos pulmões. A capacidade neutralizante dos fragmentos Fab dos anticorpos monoclonais para RSV in vivo, através de aplicação em aerossol ou terapia sistémica, foi bem demonstrada.

Os epítopos de neutralização no vírus RSV estão principalmente confinados aos principais antigénios de superfície: a glicoproteína F (fusão virai) e a glicoproteína G (ligação virai). O anti-soro preparado contra a glicoproteína F ou contra a glicoproteína G pode neutralizar o RSV com elevada eficiência (Walsh, et al., J. Gen. Microbiol., 67: 505, 1986). No entanto os anticorpos para a glicoproteína F são mais ffequentemente neutralizantes para RSV. O anti-soro para a glicoproteína F também inibe a fusão de células infectadas com RSV com células vizinhas não infectadas. Para fins terapêuticos, as preparações de anticorpos devem neutralizar uma grande variedade de isolados de RSV, incluindo os de ambos os sub-grupos antigénicos. Existem dois sub-grupos antigénicos de RSV, A e B, os quais estão ambos presentes em qualquer altura na população mas que variam em proporção a qualquer dado momento. Os sub-grupos A e B estão 50% relacionados na glicoproteína F ao nível da sequência de ADN, mas parecem estar mais 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 4

altamente relacionados nas regiões de epítopos de neutralização. Em contraste, os sub-grupos A e B estão apenas 10% relacionados na glicoproteína G (Mclntosh e Chanock, supra). Durante os últimos anos, a eficiência da imunoterapia tópica para a infecção de RSV foi aumentada através de duas modificações da metodologia anterior. Primeiro, uma mistura de anticorpos monoclonais imunes a RSV F dirigidos aos principais epítopos de neutralização conservados nesta glicoproteína mostrou-se ser eficaz em imunoterapia tópica da infecção de RSV no rato do algodão. Segundo, a distribuição de anticorpos policlonais para RSV directamente nos pulmões num aerossol de pequenas partículas (inferiores a 2 μιη) foi também terapeuticamente eficaz. A utilização de anticorpos monoclonais deve diminuir a quantidade de IgG necessária para terapia em pelo menos 2 ordens de grandeza. Noutros estudos em ratos do algodão, também se mostrou que os anticorpos do vírus parainfluenza tipo 3 (PIV3) eram terapêuticos contra PIV3 quando administrados directamente no tracto respiratório. Esta forma de imunoterapia tópica tem aplicação geral para patogénios virais respiratórios que causam doenças nas células que forram o lúmen do tracto respiratório inferior.

Os anticorpos monoclonais (MAb) de ratinho humanizados, devido à contribuição de sequências das CDR de ratinho enxertadas, retêm um proporção significativa da sequência de ratinho, representando 25-30% das regiões V. Não existem provas que sugiram qualquer relação entre o RSV19 de ratinho (Taylor et al., ímnnmology 52: 137-142, 1984) e as sequências de CDR da região V do anticorpo humano publicadas (Winter et al., Eur. J. Immunol. 21: 985-991, 1991) e por isso a administração repetida de MAb de ratinho humanizado, como consequência da localização à superfície das regiões CDR na molécula dò anticorpo, é provável que resulte numa resposta humana anti-MAb de ratinho (HAMMA). Esta resposta excluiria então outras utilizações terapêuticas do MAb de ratinho humanizado e excluiria em particular qualquer utilização destas sequências de MAb de ratinho humanizado para terapia génica de anticorpos, situação em que a terapia não poderia ser retirada e poderia afectar adversamente a saúde do doente. As respostas HAMMA são vulgares em doentes que recebem terapia sistémica convencional com MAb de ratinho, resultando em até 50% dos doentes a responderem após a primeira dose e até 95% dos doentes a responderem após a segunda dose. A utilização de globulina gama humana reunida foi universal para profilaxia em hepatite e para tratamento em hepatite, febre hemorrágica induzida pelo vírus Junin e infecção por RSV, sem efeitos secundários suficientemente graves para excluir esta forma de imunização passiva. Por isso, por inferência, a aplicação de um FAb monoclonal humano a esta forma de terapia não deve ter consequências graves tais como as induzidas através da resposta HAMMA ao anticorpo de ratinho ou seus fragmentos.

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Para profilaxia a longo prazo da infecção por RSV em doentes imunossuprimidos ou em crianças recém-nascidas sem um sistema imunitário completo, seria preferível aplicar uma preparação de imunoglobulina para imunização passiva a qual inclua mais que um epítopo de neutralização na glicoproteína F de RSV. Isto deve-se à taxa de mutação da glicoproteína F de RSV para um único local de neutralização variar de 10"* a 10'5, a taxa para dois locais de neutralização ser assim de 10 * a 10 '°. para três locais de neutralização ser de IO'12 a IO13 e assim sucessivamente. A administração de anticorpos anti-RSV ou de fragmentos destes, ao longo de um período de tempo significativo em múltiplos doentes ou em múltiplos períodos de tratamento num único doente, criaria uma pressão selectiva significativa para o desenvolvimento de mutantes fugitivos. Por isso, para contrariar esta pressão selectiva, é preferível a inclusão de anticorpos ou fragmentos para dois ou mais epítopos de neutralização em qualquer preparação a ser utilizada para imunização passiva. No entanto, antes do presente invento, apenas se conhecia um outro anticorpo monoclonal humano neutralizante para RSV ou fragmento deste. O Fab humano RSVI9 de Barbas et al. (Proc. Nati Acad. Sei. (USA) 89: 10164-10168, 1992), incluído no Pedido Internacional PCT N° WO 94/06448, possui uma sequência de aminoácidos totalmente não relacionada com as dos anticorpos anti-RSV do presente invento. Mais importante, o Fab RSV19 humano liga-se a um epítopo de neutralização não relacionado no epítopo da glicoproteína F de RSV, que representa o epítopo “B” ou local antigénico, reconhecido pelo MAb 1269 de ratinho (Taylor et al., Immunology 52: 137-142, 1984). Por este motivo a singularidade dos anticorpos anti-RSV do presente invento e do Fab humano RSV 19, tanto na sequência de aa como no local epitópico, possui importantes aplicações para a concepção de vacinas imunoterapêuticas ou de modalidades para o tratamento da doença de RSV.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a anticorpos monoclonais que se ligam a um epítopo na glicoproteína F de RSV que incluiem o resíduo de aminoácido (aa) número 429 ou que se ligam a um epítopo afectado conformacionalmente por uma mudança de um único aa nesta posição e os quais neutralizam com elevada eficiência os sub-grupos antigénicos A e B do vírus do sincício respiratório (RSV). São também descritas as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da região V da cadeia leve da imunoglobulina humana que conferem a função de neutralização ao paratopo destes anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais do invento possuem especial utilidade como substâncias farmacêuticas e reagentes para a imunoprofilaxia, imunoterapia e diagnóstico da doença de RSV. O presente invento proporciona também linhas celulares e vectores que produzem ou que codificam os anticorpos monoclonais do invento. 84 977 Εΐ> Ο 853 487/ΡΤ 6

Uma vantagem principal dos anticorpos monoclonais do invento deriva do facto de estes incluírem as sequências CDR3 humanas e, nalgumas concretizações, poderem ser anticorpos monoclonais inteiramente humanos. Por esse motivo, a utilização in vivo dos anticorpos monoclonais completamente humanos do invento para imunoprofilaxia e imunoterapia da doença de RSV reduz grandemente o problema da resposta imunitária do hospedeiro a anticorpos administrados passivamente. Este problema é vulgarmente encontrado quando são utilizados os anticorpos monoclonais da arte anterior de derivação xenogénica ou quimérica. Um segundo aspecto importante desta vantagem é a potencial segurança destes anticorpos monoclonais humanos para aplicações de terapia génica, em que a expressão de proteínas xenogénicas ou quiméricas contendo sequências não humanas não pode ser terminada.

Os anticorpos do invento são particularmente eficazes para imunoterapia da doença de RSV quando administrados directamente nos pulmões na forma de fragmentos Fab. A distribuição tópica dos anticorpos para RSV directamente nos pulmões possui uma vantagem principal sobre a administração parentérica de anticorpos para terapia da doença de RSV. Os anticorpos policlonais distribuídos pela via anterior são aproximadamente de 80 a 160 vezes mais eficazes em terapia, diminuindo assim a quantidade de anticorpo necessária para terapia pór um factor de 80 a 160. Outra redução na quantidade de anticorpo necessária para terapia, por um factor de 25 a 50, pode ser alcançada através da utilização de anticorpos monoclonais em vez de policlonais. Isto significa que a quantidade total de anticorpo necessária para terapia através de tratamento parentérico pode ser reduzida por um factor de 2000 a 8000 quando são administrados anticorpos monoclonais directamente nos pulmões para tratamento de infecção por RSV. A capacidade para utilizar fragmentos Fab ou Fd in vivo para infecções virais respiratórias proporciona vantagens significativas sobre a utilização de moléculas de anticorpo inteiras incluindo: (1) maior penetração tissular; (2) evitar as funções efectoras associadas a Fc tais como inflamação; e (3) rápida eliminação. A eficácia terapêutica in vivo de fragmentos Fab no tratamento de infecção virai foi demonstrada para RSV e coronavírus. Isto é apesar do facto de os Fab serem mono valentes, excluindo a ligação cruzada de antigénios, o que vulgarmente se pensava ser necessário para a neutralização virai; e de se pensar que a porção Fc era necessária para a eliminação virai corno consequência da activação do complemento e da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

Em particular, o presente invento proporciona polipéptidos substancialmente puros

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 7 compreendendo anticorpos que se ligam selectivamente a um epítopo da glicoproteína F de RSV, em que os anticorpos incluem uma região CDR3 da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de CDR3 da cadeia pesada de RSVF2-5 da SEQ ID NO: 7. Tais anticorpos incluem anticorpos fragmento que são fragmentos Fd, Fv e Fab. Este invento proporciona ainda os anticorpos que incluem a região CDR2 da cadeia pesada de SEQ ED NO: 5, e/ou a região CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3. Em concretizações particularmente preferidas, os anticorpos do invento incluem toda a sequência de Fd da cadeia pesada de RSVF2-5 de SEQ ID NO: 1.

Nalgumas concretizações, os anticorpos do invento são fragmentos Fab e incluem ainda a região CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 15, a região CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 13, e/ou a região CDR1 da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em concretizações particularmente preferidas os anticorpos do presente invento incluem toda a sequência da cadeia leve de RSVF2-5 da SEQ ID NO: 9.

Porque o principal domínio de ligação ao antigénio dos anticorpos é a região CDR3 da cadeia pesada, o presente invento também proporciona polipéptidos que consistem na, ou consistem essencialmente na, região CDR3 da cadeia pesada do anticorpo RSVF2-5 divulgado como SEQ ID NO: 7. O presente invento proporciona também preparações farmacêuticas compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e qualquer um ou mais dos anticorpos acima descritos.

Noutra série de concretizações, o presente invento proporciona também ácidos nucleicos isolados compreendendo sequências nucleotídicas codificando os anticorpos acima descritas. Em particular, o presente invento proporciona tais ácidos nucleicos na forma de vectores incluindo sequências reguladoras operativamente ligadas às referidas sequências nucleotídicas. O presente invento proporciona também preparações farmacêuticas compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável; e qualquer um ou mais dos ácidos nucleicos acima descritos.

Noutro conjunto de concretizações, o presente invento proporciona um método para o tratamento da doença de RSV compreendendo a administração a um sujeito humano ou outro animal a necessitar de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz das

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ER Ο 853 487/PT 8 composições farmacêuticas de anticorpo e/ou de ácido nucleico acima descritas. Os métodos podem ser para profilaxia da infecção por RSV ou para tratamento da doença de RSV activa.

Em ainda outro conjunto de concretizações, o presente invento proporciona um método de detecção da presença de RSV numa amostra biológica compreendendo colocar em contacto essa amostra com qualquer um ou mais dos anticorpos acima descritos. Noutro conjunto de concretizações, o invento proporciona um método de detecção da presença de RSV in vivo compreendendo o contacto de um sujeito com uma quantidade eficaz de qualquer um ou mais dos anticorpos acima descritos, estando os anticorpos contidos num transportador farmaceuticamente aceitável. A ligação dos anticorpos a RSV pode então ser détectada como uma determinação da presença de RSV. O invento envolve também a utilização dos anticorpos e/ou ácidos nucleicos acima descritos na preparação de um medicamento. 0 medicamento pode ser para qualquer um dos fins de diagnóstico e/ou terapia aqui discutidos. .Finalmente, o presente invento proporciona células hospedeiras incluindo um vector compreendendo um ácido nucleico codificando um dos anticorpos do presente invento.

DESCRICÀO DETALHADA DO INVENTO

Definições

Tal como aqui se utiliza, o termo “anticorpo” significa uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento de uma molécula de imunoglobulina possuindo a capacidade de se ligar especificamente a um determinado antigénio. Os anticorpos são bem conhecidos dos peritos na arte da imunologia. Tal como aqui se utiliza, o termo “anticorpo” significa não só moléculas intactas de anticorpo mas também fragmentos de moléculas de anticorpo que retêm a capacidade de ligação ao antigénio. Tais fragmentos são bem conhecidos na arte e são regularmente empregues tanto in vitro como in vivo. Em particular, tal como aqui se utiliza, o termo “anticorpo” significa não só moléculas intactas de imunoglobulina como também fragmentos activos de ligação ao antigénio tal como os fragmentos activos bem conhecidos F(ab’)2, Fab, Fv e Fd.

Tal como aqui se utiliza, a expressão “doença de RSV” significa qualquer doença causada, directa ou indirectamente, por um Vírus do Sincício Respiratório (RSV) bem como doenças ou condições que predispõem um doente à infecção por RSV. Exemplos de doenças 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 9

que caem na primeira categoria incluem a pneumonia e a broquiolite. As doenças e condições nesta última categoria (i.e., as que colocam o doente em risco de infecçào grave por RSV) incluem a fibrose quística, doença cardíaca congénita, cancro, imunossupressão relacionada com a idade e, geralmente, qualquer condição que cause um estado de imunossupressão ou função diminuída do sistema imunitário tal como regimes pós-operatórios de transplantação de órgãos ou parto prematuro.

Tal como aqui se utiliza em relação a polipéptidos, o termo “substancialmente puro” significa que os polipéptidos estão essencialmente isentos de outras substâncias com as quais podem ser encontrados na natureza ou em sistemas in vivo até uma extensão prática e apropriada para a utilização pretendida. Em particular, os polipéptidos são suficientemente puros e estão suficientemente isentos de outros constituintes biológicos das suas células hospedeiras de forma a serem úteis, por exemplo, na criação de anticorpos, sequenciação ou produção de preparações farmacêuticas. Através de técnicas bem conhecidas na arte, os polipéptidos substancialmente puros podem ser produzidos à luz das sequências de ácidos nucleico e de aminoácidos aqui divulgadas. Porque um polipéptido substancialmente purificado do invento pode ser misturado com um transportador farmaceuticamente aceitável numa preparação farmacêutica, o polipéptido pode constituir apenas uma pequena percentagem em peso da preparação. O polipéptido é todavia substancialmente puro uma vez que foi substancialmente separado das substâncias com as quais pode estar associado em sistemas vivos.

Tal como aqui se utiliza em relação a ácidos nucleicos, o termo “isolado” significa: (i) amplificado in vitro através de, por exemplo, reacção em cadeia com polimerase (PCR); (ii) produzido recombinantemente através de clonagem; (iii) purificado, tal como através de clivagem e separação em gel; ou (iv) sintetizado através de, por exemplo, síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que é prontamente manipulável através de técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na arte. Assim, uma sequência nucleotídica contida num vector no qual os locais restrição 5’ e 3’ são conhecidos ou para a qual foram divulgadas as sequências de iniciadores para reacção em cadeia com polimerase (PCR), é considerada isolada mas uma sequência de ácido nucleico que exista no seu estado nativo no seu hospedeiro natural não é. Um ácido nucleico isolado pode ser substancialmente purificado, mas não precisa de o ser. Por exemplo, um ácido nucleico que está isolado num vector de clonagem ou de expressão não é puro por poder compreender apenas uma pequena percentagem do material na célula em que reside. Tal ácido nucleico está, no entanto, isolado conforme o termo é aqui utilizado porque é prontamente manipulável através de técnicas padrão conhecidas dos peritos na arte.

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Tal como aqui se utiliza, uma sequência de codificação e sequências reguladoras dizem-se estar “operativamente ligadas” quando estão ligadas covalentemente de forma a colocarem a expressão ou transcrição da sequência de codificação sob a influência ou controlo das sequências reguladoras. Se for desejado que as sequências de codificação sejam traduzidas numa proteína funcional, duas sequências de ADN dizem-se estar operativamente ligadas se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5’ resultar na transcrição da sequência de codificação e se a natureza da ligação entre as duas sequências de .ADN não (1) resultar na introdução de uma mutação de desvio de enquadramento, (2) interferir com a capacidade da região promotora para dirigir a transcrição das sequências de codificação, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de ARN correspondente ser traduzido numa proteína. Assim, uma região promotora estaria operativamente ligada a uma sequência de codificação se a região promotora fosse capaz de efectuar a transcrição dessa sequência de .ADN de tal forma que o transcrito resultante pudesse ser traduzido na proteína ou polipéptido desejados. A natureza exacta das sequências reguladoras necessárias para expressão génica pode variar entre espécies ou tipos celulares, mas deve em geral incluir, conforme o necessário, sequências 5’ que não se transcrevem e 5’ que não se traduzem envolvidas na iniciação da transcrição e tradução, respectivamente, tais como uma caixa TATA, uma sequência de remate, uma sequência CAAT e semelhantes. Especialmente, tais sequências reguladoras 5’ que não se transcrevem incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controlo da transcrição do gene operativamente ligado. As sequências reguladoras pòdem também incluir sequências estimuladoras ou sequências activadoras a montante, conforme desejado.

Tal como aqui se utiliza, um “vector” pode ser um qualquer de vários ácidos nucleicos no qual pode ser inserida uma sequência desejada através de restrição e ligação para transporte entre diferentes ambientes genéticos ou para expressão numa célula hospedeira. Os vectores são tipicamente compostos de ADN embora também estejam disponíveis vectores de ARN. Os vectores incluem, mas não se limitam a, plasmídeos e fagemídeos. Um vector de clonagem é um vector que é capaz de replicar numa célula hospedeira e que se caracteriza ainda por um ou mais locais de restrição por endonucleases nos quais o vector pode ser cortado de um modo determinável e nos quais pode ser ligada uma sequência de ADN desejada de tal forma que o novo vector recombinante mantém a sua capacidade de se replicar na célula hospedeira. No caso dos plasmídeos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer muitas vezes à medida que o plasmídeo aumenta em

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ número de cópias dentro da bactéria hospedeira ou apenas uma única vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso dos fagos, a replicação pode ocorrer activamente durante uma fase lítica ou passivamente durante uma fase lisogénica. Um vector de expressão é um vector no qual pode ser inserida uma sequência de ADN desejada através de restrição e ligação de tal forma que esta seja operativamente ligada a sequências reguladoras e possa ser expressa como um transcrito de ARN. Os vectores podem ainda conter uma ou mais sequências de marcação adequadas para utilização na identificação de células que foram ou não transformadas ou transfectadas com o vector. Os marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas as quais aumentam ou diminuem a resistência ou a sensibilidade a antibióticos ou outros compostos, genes que codificam enzimas cujas actividades são detectáveis através de ensaios padrão conhecidos na arte (p. ex., β-galactosidase ou fosfatase alcalina) e genes que afectam visivelmente o fenótipo de células, hospedeiros, colónias ou placas, transformados ou transfectados. Os vectores preferidos são os capazes de replicação autónoma e de expressão dos produtos génicos estruturais presentes nos segmentos de ADN aos quais estão operativamente ligados.

Novos Anticorpos Monoclonais Anti-RSV O presente invento deriva, em parte, do isolamento e caracterização de um novo anticorpo monoclonal totalmente humano que se liga selectivamente a, e neutraliza, RSV e o qual designámos RSVF2-5. Tal como descrito mais completamente abaixo, mostrou-se que este novo anticorpo monoclonal se liga à glicoproteína F de RSV e neutraliza RSV in vivo. O paratopo do fragmento Fab de RSVF2-5 associado ao epítopo de neutralização na subunidade F1 da glicoproteína F de RSV é definido pelas sequências de aminoácidos (aa) das regiões V das cadeias pesada e leve da imunoglobulina representadas na Tabela 5 e em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 9. As sequências de ácido nucleico que codificam para estas sequências de aa foram identificadas como descrito no Exemplo 1, através de sequenciação a partir de ambas as extremidades 5’ e 3’ do fragmento Fd da cadeia pesada e da cadeia leve. Estas sequências de ácido nucleico foram depositadas no National Center for Genome Resources (números de acesso L41061 e L41062) e são aqui divulgadas como SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22. No entanto, devido á degenerescência do código do ADN, o paratopo é definido mais apropriadamente pelas sequências de aa derivadas representadas na Tabela 5, em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 9.

Os anticorpos do presente invento ligam-se selectivamente a um epítopo na glicoproteína F de RSV que inclui o resíduo de aminoácido (aa) número 429 ou que é afectado conformacionalmente por uma mudança de um único aa nesta posição. Isto é

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 12 demonstrado pela capacidade dos anticorpos do presente invento para neutralizarem estirpes de RSV nas quais a posição 429 da glicoproteína F de RSV é ocupada por um resíduo de arginina mas não uma estirpe de RSV na qual esta posição é ocupada por um resíduo de serina (ver Exemplo 3, Tabela 4). Um anticorpo de murídeo e anticorpos humanizados de murídeo específicos para um epítopo de RSV semelhante, se não idêntico, foram descritos no Pedido Internacional PCT Número WO 92/04381. De particular importância, os anticorpos do presente invento são específicos para, e neutralizam, ambos os subgrupos antigénicos A e B do vírus do sincício respiratório.

Num conjunto de concretizações, o presente invento proporciona o anticorpo monoclonal RSVF2-5 intacto, totalmente humano na forma isolada e em preparações farmacêuticas. Semelhantemente, tal como descrito abaixo, o presente invento proporciona ácidos nucleicos isolados, células hospedeiras transformadas com ácidos nucleicos e preparações farmacêuticas incluindo ácidos nucleicos isolados, codificando o anticorpo monoclonal RSVF2-5 intacto, totalmente humano. Finalmente, o presente invento proporciona métodos, tal como descrito de forma mais completa abaixo, empregando estes anticorpos e ácidos nucleicos no diagnóstico in vitro e in vivo e na terapia de doença de RSV.

Significativamente, tal como é bem conhecido na arte, apenas uma pequena porção de uma molécula de anticorpo, o paratopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu epítopo (ver, em geral, Clark, W.R. (1986) The Experimental Founclations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essencial Immunology, T Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc’ e Fc, por exemplo, são efectoras da cascata do complemento mas não estão envolvidas na ligação ao antigénio. Um anticorpo do qual a região pFc’ foi enzimaticamente clivada, ou que foi produzido sem a região pFc\ designado fragmento F(ab’)2, mantém ambos os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo intacto. Semelhantemente, um anticorpo do qual a região Fc foi enzimaticamente clivada, ou que foi produzido sem a região Fc, designado fragmento Fab, mantém um dos locais de ligação ao antigénio de uma molécula de anticorpo intacta. Prosseguindo, os fragmentos Fab consistem numa cadeia leve do anticorpo ligada covalentemente e numa porção da cadeia pesada do anticorpo designada Fd. Os fragmentos Fd são o principal determinante da especificidade do anticorpo (um único fragmento Fd pode ser associado com até dez cadeias leves diferentes sem alterar a especificidade do anticorpo) e os fragmentos Fd mantêm a capacidade de ligação ao epítopo quando isolados.

Na porção de ligação ao antigénio de um anticorpo, tal como é bem conhecido na arte, existem regiões determinantes de complementariedade (CDR), que interagem

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 13 directamente com ο epítopo do antigénio, e regiões estruturais (FR), que mantêm a estrutura terciária do paratopo (ver, em geral, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto no fragmento Fd da cadeia pesada como na cadeia leve das imunoglobulinas IgG, existem quatro regiões estruturais (FR1 até FR4) separadas respectivamente por três regiões determinantes de cómplementariedade (CDR1 até CDR3). As CDR, e em particular as regiões CDR3, e mais particularmente a CDR3 da cadeia pesada, são grandemente responsáveis pela especificidade do anticorpo.

As sequências de aminoácidos completas da porção Fab de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal RSVF2-5 bem como as regiões FR e CDR relevantes são aqui divulgadas. A SEQ ID NO: 1 divulga a sequência de aminoácidos do fragmento Fd de RSVF2-5. As sequências de aminoácidos das regiões FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 da cadeia pesada são divulgadas como SEQ ID NO: 2 até SEQ ID NO: 8, respectivamente. A SEQ ID NO: 9 divulga a sequência de aminoácidos da cadeia leve de RSVF2-5. As sequências de aminoácidos das regiões FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 da cadeia leve são divulgadas como SEQ ID NO: 10 até SEQ ID NO: 16, respectivamente.

Está agora bem estabelecido na arte que as regiões não CDR de um anticorpo de mamífero podem ser substituídas por regiões semelhantes de anticorpos conspecíficos ou heterospecíficos mantendo a especificidade epitópica do anticorpo original. Isto manifesta-se mais claramente no desenvolvimento e utilização de anticorpos “humanizados” nos quais as CDR não humanas estão covalentemente ligadas às regiões FR e/ou Fc/pFc’ humanas para produzir um anticorpo funcional. Assim, por exemplo, o Pedido Internacional PCT Número WO 92/04381 ensina a produção e utilização de anticorpos para RSV humanizados de murídeo nos quais pelo menos uma porção das regiões FR de murídeo foram substituídas por regiões FR de origem humana. Tais anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos intactos com capacidade de ligação ao antigénio, são frequentemente referidos como anticorpos “quiméricos”.

Assim, tal como será aparente para um vulgar perito na arte, o presente invento proporciona também fragmentos F(ab’);, Fab, Fv e Fd do anticorpo monoclonal RSVF2-5; anticorpos quiméricos nos quais as regiões Fc e/ou FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve do anticorpo RSVF2-5 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; anticorpos quiméricos de fragmentos F(ab7)2 nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve do anticorpo RSVF2-5 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; anticorpos quiméricos de fragmentos Fab

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 14 nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; e anticorpos quiméricos de fragmentos Fd nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas. Assim, os peritos na arte podem alterar o anticorpo RSVF2-5 através da construção de anticorpos enxertados com CDR ou quiméricos ou de fragmentos de anticorpo contendo, toda ou parte de cada uma das sequências de aa das CDR das regiões V da cadeia pesada e leve divulgadas (Jones et al., Nature 321: 522, 1986; Verhoeyen et al., Science 39: 1534, 1988 e Tempest et al., Bio/Technology 9: 266, 1991), sem destruir a especificidade dos anticorpos para o epitopo da glicoproteína F de RSV. Tais anticorpos enxertados com CDR ou quiméricos ou fragmentos de anticorpo podem ser eficazes na prevenção e tratamento da infecção por RSV em animais (p. ex., gado) e no homem.

Em concretizações preferidas, os anticorpos quiméricos do invento são anticorpos monoclonais totalmente humanos incluindo pelo menos a região CDR3 da cadeia pesada do anticorpo RSVF2-5. Tal como observado acima, podem ser produzidos tais anticorpos quiméricos nos quais algumas ou todas as regiões FR de RSVF2-5 foram substituídas por outras regiões FR humanas homólogas. Adicionalmente, as porções de Fc podem ser substituídas de forma a produzir anticorpos. IgA ou IgM bem como IgG possuindo algumas ou todas as CDR do anticorpo RSVF2-5. De particular importância é a inclusão da região C.DR3 da cadeia pesada de RSVF2-5 e, num menor grau, as outras CDR de RSVF2-5. Tais anticorpos quiméricos totalmente humanos terão particular utilidade por não suscitarem uma resposta imunitária contra o próprio anticorpo. É também possível, de acordo com o presente invento, produzir anticorpos quiméricos incluindo sequências não humanas. Assim, pode-se utilizar, por exemplo, sequências de Fc ou FR de murídeo, ovino, equino, bovino ou de outro mamífero, para substituir algumas ou todas as regiões Fc ou FR do anticorpo RSVF2-5. Algumas das CDR podem também ser substituídas. Novamente, no entanto, é preferível que pelo menos a região CDR3 da cadeia pesada do anticorpo RSVF2-5 seja incluída em tais anticorpos quiméricos e, num grau menor, é também preferível que algumas ou todas as outras CDR de RSVF2-5 sejam incluídas. Tais anticorpos quiméricos possuindo sequências de imunoglobulina não humanas misturadas com as CDR do anticorpo monoclonal humano RSVF2-5 não são preferidos para utilização em humanos e particularmente não são preferidos para utilização alargada porque podem suscitar uma resposta imunitária contra as sequências não humanas. Podem, evidentemente, ser utilizados durante períodos breves ou em indivíduos imunossuprimidos mas, novamente, os anticorpos totalmente humanos são

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ preferidos. Porque, no entanto, o RSV também infecta animais tais como gado e porque tais anticorpos podem ser utilizados durante períodos breves ou em sujeitos imunossuprimidos, os anticorpos quiméricos possuindo sequências de Fc e de FR não humanas de mamífero mas incluindo pelo menos a CDR3 da cadeia pesada de RSVF2-5 estão contemplados como concretizações alternativas do presente invento.

Para inoculação ou utilizações profiláticas, os anticorpos do presente invento são de preferência moléculas de anticorpo intactas incluindo a região Fc. Tais anticorpos intactos terão semi-vidas maiores que anticorpos fragmentos mais pequenos (p. ex. Fab) e são mais adequados para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavemosa, subcutânea ou transdérmica.

Quando administrados topicamente ao forro do lúmen dos pulmões, tal como através de aerossol, os fragmentos Fab. incluindo fragmentos Fab quiméricos, são preferidos. Os Fab oferecem várias vantagens sobre os F(ab’), e moléculas inteiras de imunoglobulina para esta modalidade terapêutica. Primeiro, porque os Fab possuem apenas um local de ligação para o seu antigénio cognato, a formação de complexos imunitários é excluída enquanto que tais complexos podem ser gerados quando moléculas bivalentes de F(ab’): e inteiras de imunoglobulina encontram o seu antigénio alvo. Isto tem alguma importância porque a deposição de complexos imunitários nos tecidos pode produzir reacções inflamatórias adversas. Segundo, porque os Fab não possuem uma região Fc não podem despoletar reacções inflamatórias adversas que são activadas através de Fc, tais como activação da cascata do complemento. Terceiro, é provável que a penetração tissular da pequena molécula de Fab seja muito melhor que a do anticorpo inteiro maior. Quarto, os Fab podem ser facilmente produzidos e com custos reduzidos em bactérias, tais como E. coli, enquanto que as moléculas de anticorpo, imunoglobulina inteiras requerem células de mamífero para a sua produção em quantidades úteis. O último vincula a transfecção de sequências de imunoglobulina para células de mamífero com a resultante transformação. A amplificação destas sequências tem então que ser alcançada através de procedimentos selectivos rigorosos e os transformantes estáveis têm de ser identificados e mantidos. As moléculas de imunoglobulina inteiras têm de ser produzidas através de células de mamífero transformadas de forma estável e de elevada expressão em cultura com os problemas concomitantes do meio de cultura conter soro. Em contraste, a produção de Fab em E. coli elimina estas dificuldades e toma possível produzir estes fragmentos de anticorpo em fermentadores maiores que são menos dispendiosos que os produtos derivados de culturas celulares.

Adicionalmente aos Fab, são também contemplados pelo presente invento 16 34 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ fragmentos de anticorpo menores e péptidos de ligação a epítopos possuindo especificidade de ligação para o epítopo de RSVF2-5 de RSV e podem também ser utilizados para neutralizar o vírus. Por exemplo, podem ser construídos anticorpos de cadeia única de acordo com o método de US. Pat. No. 4946778, de Ladner et cil., que é aqui incorporada por referência. Os anticorpos de cadeia única compreendem as regiões variáveis das cadeias leve e pesada ligadas através de uma porção ligante flexível. Ainda menor é o fragmento de anticorpo conhecido como anticorpo de domínio único ou Fd, que compreende um domínio único VH isolado. As técnicas para a obtenção de um anticorpo de domínio único com pelo menos alguma da especificidade de ligação do anticorpo intacto do qual este é derivado são conhecidas na arte. Por exemplo, Ward et al., Natare 341: 644-646 (1989), divulgam um método de pesquisa para identificar uma região variável da cadeia pesada do anticorpo (anticorpo de domínio único VH) com afinidade suficiente para que o seu epítopo alvo se ligue a este na forma isolada. É possível determinar, sem experimentação excessiva, se um anticorpo alterado ou quimérico possui a mesma especificidade que o anticorpo RSVF2-5 do invento, avaliando se o primeiro impede que o último se ligue a RSV. Se o anticorpo monoclonal a ser testado compete com o anticorpo RSVF2-5, tal como mostrado através de uma diminuição na ligação do anticorpo RSVF2-5, então é provável que os dois anticorpos monoclonais se liguem ao mesmo epítopo ou a um intimamente relacionado. Ainda outra maneira de determinar se um anticorpo monoclonal tem a especificidade do anticorpo RSVF2-5 do invento consiste em pré-incubar o anticorpo RSVF2-5 com RSV, com o qual este é normalmente reactivo, e depois adicionar o anticorpo monoclonal a ser testado para determinar se o anticorpo monoclonal a ser testado é inibido na sua capacidade de se ligar a RSV. Se o anticorpo monoclonal a ser testado for inibido então, com toda a probabilidade, tem o mesmo epítopo, ou um funcionalmente equivalente, e a mesma especificidade que o anticorpo RSVF2-5 do invento. A pesquisa de anticorpos monoclonais do invento pode também ser efectuada utilizando RSV e determinando se o anticorpo monoclonal neutraliza RSV.

Através da utilização dos anticorpos do invento, é agora possível produzir anticorpos aiiti-idiotípicos que podem ser utilizados para pesquisar outros anticorpos monoclonais para identificar se o anticorpo possui a mesma especificidade de ligação que um anticorpo do invento. Adicionalmente, tais anticorpos anti-idiotípicos podem ser utilizados para imunização activa (Herlyn, et al., Science, 232: 100, 1986). Tais anticorpos anti-idiotípicos podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma bem conhecidas (Kohler e Milstein, Nature, 256: 495, 1975). Um anticorpo anti-idiotípico é um anticorpo que reconhece

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 17 determinantes únicos presentes no anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de interesse. Estes determinantes localizam-se na região hipervariável do anticorpo. E esta região que se liga a um dado epítopo sendo assim responsável pela especificidade do anticorpo. Um anticorpo anti-idiotípico pode ser preparado através da imunização de um animal com o anticorpo monoclonal de interesse. O animal imunizado reconhecerá e responderá aos determinantes idiotípicos do anticorpo de imunização e produzirá um anticorpo para estes determinantes idiotípicos. Através da utilização dos anticorpos anti-idiotípicos do animal imunizado, os quais são específicos para os anticorpos monoclonais do invento, é possível identificar outros clones com o mesmo idiotipo que o anticorpo do hibridoma utilizado para imunização. A identidade idiotípica entre anticorpos monoclonais de duas linhas celulares demonstra que os dois anticorpos monoclonais são o mesmo em relação ao seu reconhecimento do mesmo determinante epitópico. Assim, através da utilização de anticorpos anti-idiotípicos, é possível identificar outros hibridomas que expressem anticorpos monoclonais possuindo a mesma especificidade epitópica. É também possível utilizar a tecnologia anti-idiotípica para produzir anticorpos monoclonais que imitam um epítopo. Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-idiotípico feito para um primeiro anticorpo monoclonal terá um domínio de ligação na região hipervariável que é a imagem do epítopo ligado ao primeiro anticorpo monoclonal. Assim, o anticorpo monoclonal anti-idiotípico pode ser utilizado para imunização, uma vez que o domínio de ligação do anticorpo monoclonal anti-idiotípico actua eficazmente como anti génio.

Ácidos Nucleicos que Codificam Anticorpos Anti-RSV

Dada a divulgação inclusa das sequências de aminoácidos de Fd da cadeia pesada e dos domínios variáveis da cadeia leve do anticorpo anti-RSV RSVF2-5, um vulgar perito na arte é agora capaz de produzir os ácidos nucleicos que codificam este anticorpo ou que codificam os vários anticorpos fragmento ou anticorpos quiméricos acima descritos. Está contemplado que tais ácidos nucleicos estarão operativamente ligados a outros ácidos nucleicos formando um vector recombinante para clonagem ou para expressão dos anticorpos do invento. O presente invento inclui qualquer vector recombinante contendo as sequências de codificação, ou parte destas, para transformação, transfecção, quer procarióticas quer eucarióticas, ou terapia génica. Tais vectores podem ser preparados utilizando técnicas convencionais de biologia molecular, conhecidas dos peritos na arte e compreenderiam sequências de codificação de ADN para as regiões V da imunoglobulina RSVF2-5 incluindo regiões estruturais e CDR ou parte destas e um promotor adequado com 84:977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 18

(Whittle et al., Protein Eng. 1: 499, 1987 e Burton et al., Science 266: 1024-1027, 1994) ou sem (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 90: 7889. 1993 e Duan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 91: 5075-5079, 1994) uma sequência sinal para exportação ou secreção. Tais vectores podem ser transformados ou transfectados em células procarióticas (Huse et al., Science 246: 1275, 1989, Ward et al., Nature 341: 644-646, 1989; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991 e Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 88: 7978, 1991) ou eucarióticas (Whittle et al., 1987 e Burton et al., 1994) ou utilizados para terapia génica (Marasco et al., 1993 e Duan et ai, 1994) através de técnicas convencionais, conhecidas dos peritos na arte.

Os vectores de expressão do presente invento incluem sequências reguladoras operativamente ligadas a uma sequência nucleotídica codificando um dos anticorpos do invento. Tal como aqui se utiliza, a expressão “sequências reguladoras” significa sequências nucleotídicas que são necessárias para, ou que conduzem à transcrição de uma sequência nucleotídica a qual codifica um polipéptido desejado e/ou que são necessárias para, ou que conduzem à tradução do transcrito resultante no polipéptido desejado. As sequências reguladoras incluem, mas não se limitam a, sequências a 5’ tais como operadores, promotores e sequências de ligação a ribossomas e sequências a 3’ tais como sinais de poliadenilação. Os vectores do invento podem incluir opcionalmente sequências de comando ou sinal a 5’, sequências a 5’ ou 3’ codificando produtos de fusão para auxílio na purificação proteica e vários marcadores que auxiliam na identificação ou selecção de transformantes. A escolha e concepção de um vector apropriado está dentro da capacidade e discernimento de um perito na arte. A purificação subsequente dos anticorpos pode ser alcançada através de qualquer um de vários meios padrão conhecidos na arte.

Um vector preferido para pesquisa de anticorpos monoclonais, mas não necessariamente preferido para a produção em massa dos anticorpos do invento, é uma molécula de ADN recombinante contendo uma sequência nucleotídica que codifica para, e que é capaz de expressar, um polipéptido de fusão contendo, no sentido do terminal amino para o terminal carboxi, (1) um domínio de sinal de secreção procariótico, (2) um polipéptido do invento e, opcionalmente, (3) um domínio proteico de fusão. O vector inclui sequências de ADN reguladoras para expressão do polipéptido de fusão, de preferência sequências reguladoras procarióticas. Tais vectores podem ser construídos pelos peritos na arte e foram descritos por Smith et al. (Science 228: 1315-1317, 1985), Clackson et al. (Nature 352: 624-628, 1991); Kang et al. (em “Methods: A Companion to Methods in Enzymology: Vol. 2”, R.A. Lemer e D.R. Burton, ed. Academic Press, NY, págs. 111-118, 1991); Barbas et al. {Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 88: 7978-7982, 1991), Roberts et al. {Proc. Natl. Acad. Sei.

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 19 (USA) 89: 2429-2433, 1992).

Um polipéptido de fusão pode ser útil para a purificação dos anticorpos do invento. O domínio de fusão pode, por exemplo, incluir uma cauda poli-His que permite a purificação em colunas de Ni- ou a proteína de ligação à maltose do vector comercialmente disponível pMAL (New Hngland BioLabs, Beverly, VIA). Um domínio de fusão presentemente preferido, mas de modo nenhum necessário, é uma âncora membranar de um fago filamentoso. Este domínio é particularmente útil para pesquisar bibliotecas de apresentação em fagos de anticorpos monoclonais mas pode ser de menor utilidade para a produção em massa de anticorpos. A âncora membranar de fagos filamentosos é de preferência um domínio da proteína da cápside cpIII ou cpVIII capaz de se associar à matriz de uma partícula de um fago filamentoso, incorporando deste modo o polipéptido de fusão na superfície do fago, para permitir uma ligação de fase sólida a antigénios ou epítopos específicos e deste modo permitir o enriquecimento e a selecção dos anticorpos ou fragmentos específicos codificados pelo vector fagemídico. O sinal de secreção é um domínio peptídico de comando de uma proteína que tem como alvo a membrana proteica da célula hospedeira, tal como a membrana periplasmática de bactérias gram-negativas. Um sinal de secreção preferido para E. coli é um sinal de secreção pelB. A sequência de resíduos de aminoácidos prevista do domínio sinal de secreção de duas variantes produtoras do gene pelB de Erwinia carotova está descrita em Lei et al. {Nature 381: 543-546, 1988). A sequência de comando da proteína pelB foi anteriormente utilizada como sinal de secreção para proteínas de fusão (Better, et al., Science 240: 1041-1043, 1988; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86: 5728-5732, 1989; e Mullinax, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 87: 8095-8099, 1990). Sequências de resíduos de aminoácidos para outros domínios polipeptídicos sinal de secreção de E. coli úteis neste invento podem ser encontradas em Oliver, In Neidhard, F.C. (ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1: 56-69 (1987).

Para alcançar níveis elevados de expressão génica em E. coli, é necessário utilizar não só promotores fortes para gerar grandes quantidades de ARNm, mas também locais de ligação a ribossomas para assegurar que o ARNm é traduzido eficazmente. Em E. coli, o lócal de ligação ao ribossoma inclui um codão de iniciação (AUG) e uma sequência de 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação (Shine, et al., Nature 254: 34, 1975). A sequência, AGGAGGU, que é designada sequência de Shine-Dalgamo (SD), é complementar à extremidade 3’ do ARNr 16S de E. coli. A

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 20 ligação do ribossoma ao ARNm e a sequência na extremidade 3’ do ARNm pode ser afectada por vários factores: (i) O grau de complementariedade entre a sequência SD e a extremidade 3’ do ARNr 16S. (ii) O espaçamento e possivelmente a sequência de ADN que fica entre a sequência SD e o AUG (Roberts, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76: 760.. 1979a: Roberts, et al., Pr.oc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76: 5596, 1979b; Guarente, et al., Science 209: 1428, 1980; e Guarente, et al., Cell 20: 543, 1980). A optimização é alcançada medindo o nível de expressão dos genes em plasmídeos nos quais este espaçamento é sistematicamente alterado. A comparação de diferentes ARNm mostra que existem sequências estatisticamente preferidas desde as posições -20 a +13 (onde a A do AUG é a posição 0) (Gold, et al., Annu. Rev. Microbiol. 35: 365, 1981). Mostrou-se que as sequências de comando influenciam drasticamente a tradução (Roberts, et al., 1979a, b supra). (iii) A sequência nucleotídica após o AUG, que afecta a ligação ao ribossoma (Taniguchi, et al., J. Mol. BioL, 118: 533, 1978).

As sequências reguladoras a 3’ definem pelo menos um codão de terminação (stop) enquadrado com, e operativamente ligado ao polipéptido de fusão heterólogo.

Em concretizações preferidas com um hospedeiro de expressão procariótico, o vector utilizado inclui uma origem de replicação procariótica ou replicão, i.e., uma sequência de ADN possuindo a capacidade de dirigir a replicação autónoma e a manutenção da molécula de ADN recombinante extracromossomicamente numa célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hospedeira bacteriana, transformada com esta. Tais origens de replicação são bem conhecidas na arte. As origens preferidas de replicação são as que são eficientes no organismo hospedeiro. Uma célula hospedeira preferida é E. coli. Para a utilização de um vector em E. coli, uma origem de replicação preferida é ColEl que se encontra em pBR322 e em vários outros plasmídeos vulgares. Também preferida é a origem de replicação pl5A que se encontra em pACYC e seus derivados. Os replicões ColEl e pl5A foram extensivamente utilizados em biologia molecular, estão disponíveis numa variedade de plasmídeos e são descritos por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Adicionalmente, as concretizações que incluem um replicão procariótico de preferência incluem também um gene cuja expressão confere uma vantagem selectiva, tal como resistência a fármacos,. a um hospedeiro bacteriano transformado com este. Os genes bacterianos típicos de resistência a fármacos são os que conferem resistência à ampicilina,

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 21 teíraciclina, neomicina/canamicina ou cloranfenicol. Os vectores também contêm tipicamente locais de restrição convenientes para a inserção de sequências de ADN tradutíveis. Vectores ilustrativos são os plasmídeos p(JC18 e pUC19 e vectores derivados tais como pcDNAII disponíveis de Invitrogen, (San Diego, CA).

Quando o anticorpo do invento inclui ambas as sequências da cadeia pesada e da cadeia leve, estas sequências podem ser codificadas em vectores separados ou, mais convenientemente, podem ser expressas através de um único vector. A cadeia pesada e a leve podem, após tradução ou após secreção, formar a estrutura heterodimérica das moléculas de anticorpo naturais. Tal anticorpo heterodimérico pode ser estabilizado ou não através de pontes de dissulfureto entre as cadeias pesada e leve.

Um vector para expressão de anticorpos heterodiméricos, tais como os anticorpos intactos do invento ou os anticorpos fragmento F(ab’):, Fab ou Fv do invento, é uma molécula de ADN recombinante adaptada para receber e expressar a primeira e segunda sequências de ADN tradutíveis. Isto é, um vector de expressão de ADN para expressão de um anticorpo heterodimérico proporciona um sistema para clonar independentemente (inserindo) as duas sequências de ADN tradutíveis em duas cassetes separadas presentes no vector, para formarem dois cistrões separados para a expressão do primeiro e segundo polipéptidos de um anticorpo heterodimérico. O vector de expressão de ADN para expressão de dois cistrões é designado por vector de expressão bicistrónico.

De preferência, o vector compreende uma primeira cassete que inclui sequências de ADN reguladoras a montante e a jusante, operativamente ligadas através de uma sequência nucleotídica adaptada para ligação direccional a um ADN inserido. A sequência tradutível a montante codifica de preferência o sinal de secreção tal como acima descrito. A cassete inclui sequências de ADN reguladoras para a expressão do primeiro polipéptido do anticorpo que é produzido quando uma sequência de ADN tradutível inserida (ADN inserido) é direccionalmente inserida na cassete através da sequência nucleotídica adaptada para ligação direccional.

O vector de expressão bicistrónico contém também uma segunda cassete para a expressão do segundo polipéptido do anticorpo. A segunda cassete inclui uma segunda sequência de ADN tradutível que de preferência codifica um sinal de secreção, tal como acima descrito, operativamente ligada no seu terminal 3’ através de uma sequência nucleotídica adaptada para ligação direccional a uma sequência de ADN a jusante do vector que tipicamente define pelo menos um codão stop no enquadramento de leitura da cassete. A

84;977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ segunda sequência de ADN tradutível é operativamente ligada no seu terminal 5’ às sequências de ADN reguladoras formando os elementos a 5’. A segunda cassete é capaz, após a inserção de uma sequência de ADN tradutível (ADN inserido), de expressar o segundo polipéptido de fusão compreendendo um sinal de secreção com um polipéptido codificado pelo ADN inserido.

Os anticorpos do presente invento também podem, evidentemente, ser produzidos por células eucarióticas tais como células CHO, hibridomas humanos, células B-linfoblastóides imortalizadas e semelhantes. Neste caso, é construído um vector no qual as sequências reguladoras eucarióticas são operativamente ligadas às sequências nucleotídicas codificando o polipéptido ou polipéptidos do anticorpo. A concepção e selecçào de um vector eucariótico apropriado está dentro da capacidade e discernimento de um vulgar perito na arte. A subsequente purificação dos anticorpos pode ser alcançada através de qualquer um de uma variedade de meios padrão conhecidos na arte.

Noutra concretização, o presente invento proporciona células hospedeiras, tanto procarióticas como eucarióticas, transformadas ou transfectadas com, e portanto incluindo, os vectores do presente invento.

Preparações de Anticorpo Anti-RSV de Diagnóstico e Farmacêuticas O invento refere-se também a um método para a preparação de composições de diagnóstico e farmacêuticas compreendendo os anticorpos monoclonais do invento ou sequências polinucleotídicas codificando os anticorpos do invento ou parte deste, sendo as composições farmacêuticas utilizadas para imunoterapia de doença de RSV. A preparação farmacêutica inclui um transportador farmaceuticamente aceitável. Tais transportadores, tal como aqui se utilizam, significam um material não tóxico que não interfira com a eficácia da actividade biológica dos ingredientes activos. A expressão “fisiologicamente aceitável” refere-se a um material não tóxico que seja compatível com um sistema biológico tal como uma célula, cultura celular, tecido ou organismo. As características do transportador dependerão da via de administração. Transportadores fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis incluem diluentes, agentes de enchimento, sais, tampões, estabilizantes, solubilizadores e outros materiais que são bem conhecidos na arte.

Uma concretização preferida do invento refere-se a anticorpos monoclonais cujas cadeias pesadas compreendem na CDR3 o polipéptido PVANIDY e/ou cujas cadeias leves compreendem na CDR3 o polipéptido QSYDSENPWV e variações conservativas destes 23 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ péptidos. Estão também englobadas pelo presente invento certas sequências de aminoácidos que se ligam a sequências epitópicas na glicoproteína F de RSV as quais incluem o resíduo de aa número 429 ou as quais são conformacionalmente afectadas por uma única alteração no resíduo de aa número 429 de arginina para serina e que conferem neutralização de RSV quando ligadas a este. O termo “variação conservativa” tal como aqui se utiliza denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante. Exemplos de variações conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de lisina por arginina, ácido aspártico por glutâmico, ou asparagina por glutamina e semelhantes. A expressão “variação conservativa” inclui também a utilização de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido progenitor não substituído desde que os anticorpos que possuem o polipéptido substituído também neutralizem RSV. Analogamente, outra concretização preferida do invento refere-se a polinucleótidos que codificam o polipéptido da cadeia pesada acima observado e as sequências polinucleotídicas que são complementares a estas sequências polinucleotídicas. As sequências polinucleotídicas complementares incluem as sequências que hibridam com as sequências polinucleotídicas do invento sob condições rigorosas de hibridação.

Os anticorpos anti-RSV do invento podem ser marcados através de uma variedade de meios para utilização em aplicações de diagnóstico e/ou farmacêuticas. Existem muitos marcadores e métodos de marcação diferentes conhecidos dos vulgares peritos na arte. Exemplos de tipos de marcadores que podem ser utilizados no presente invento incluem enzimas, radioisótopos, compostos fluorescentes, metais coloidais, compostos quimioluminescentes e compostos bioluminescentes. O vulgares peritos na arte conhecerão outros marcadores adequados para a ligação aos anticorpos monoclonais do invento ou serão capazes de avaliá-los, utilizando experimentação de rotina. Para além disso, a ligação destes marcadores aos anticorpos monoclonais do invento pode ser feita utilizando técnicas padrão usuais para os vulgares peritos na arte.

Outra técnica de marcação que pode resultar em maior sensibilidade consiste no acoplamento de anticorpos a haptenos de baixo peso molecular. Estes haptenos podem então ser especifícamente alterados através de uma segunda reacção. Por exemplo, é usual utilizar haptenos tais como a biotina, a qual reage com a avidina, ou dinitrofenol, piridoxal ou fluoresceína, os quais reagem com anticorpos específicos anti-haptenos.

Os materiais para utilização no ensaio do invento são idealmente adequados para a preparação de um estojo. Tal estojo pode compreender um meio transportador a ser

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 24 compartimentado para receber em compartimentos isolados um ou mais meios contentores tais como frascos, tubos e semelhantes, compreendendo cada um dos meios contentores um dos elementos separados a ser utilizado no método. Por exemplo, um dos meios contentores pode compreender um anticorpo monoclonal humano do invento que é, ou pode ser, marcado de forma detectável. O estojo pode também ter contentores contendo tampão ou tampões e/ou um contentor compreendendo um meio repórter tal como uma proteína de ligação à biotina, tal como avidina ou estreptavidina, ligado a uma molécula repórter, tal como um marcador enzimático ou fluorescente.

Detecçào e Diagnóstico in vitro

Os anticorpos monoclonais do invento são adequados para a utilização in vitro, por exemplo, em imunoensaios nos quais podem ser utilizados em fase líquida ou ligados a um transportador de fase sólida. Adicionalmente, os anticorpos monoclonais nestes imunoensaios podem ser marcados de forma detectável de várias maneiras. Exemplos de tipos de imunoensaios que podem utilizar os anticorpos monoclonais do invento são os imunoensaios competitivos e não competitivos num formato directo ou indirecto. Exemplos de tais imunoensaios são o radioimunoensaio (RIA) e o ensaio sanduíche (imunométrico). A detecçào de antigénios utilizando os anticorpos monoclonais do presente invento pode ser feita utilizando imunoensaios que correm nos modos directo, inverso ou simultâneo, incluindo ensaios imuno-histoquimicos em amostras fisiológicas. Os peritos na arte conhecerão, ou podem prontamente discernir, outros formatos de imunoensaios sem experimentação excessiva.

Os anticorpos monoclonais do invento podem ser ligados a muitos transportadores diferentes e utilizados para detectar a presença de RSV. Exemplos de transportadores bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilase, celulose natural e modificada, poliacrilamida, agarose e magnetite. Para os fins do invento a natureza do transportador pode ser solúvel ou insolúvel. Os peritos na arte conhecerão outros transportadores adequados para ligação a anticorpos monoclonais, ou serão capazes de avaliá-los, utilizando experimentação de rotina.

Para os fins do invento, o RSV pode ser detectado através dos anticorpos monoclonais do invento quando presente em fluídos biológicos e tecidos. Qualquer amostra contendo uma quantidade detectável de RSV pode ser utilizada. Uma amostra pode ser líquida tal como urina, saliva, fluído cerebrospinal, sangue, soro ou semelhantes; sólida ou semi-sólida tal como tecidos, fezes ou semelhantes; ou, altemativamente, um tecido sólido

84 977 ΕΡ, Ο 853 487/ΡΤ 25 tal como os usualmente utilizados em diagnóstico histológico.

Deteccão in vivo de RSV

Na utilização dos anticorpos monoclonais do invento para a detecção in vivo do antigénio, o anticorpo monoclonal marcado de forma detectável é dado numa dose que é diàgnosticamente eficaz. A expressão “diagnosticamente eficaz” significa que a quantidade de anticorpo monoclonal humano marcado de forma detectável administrada é uma quantidade suficiente para permitir a detecção do local que possui o antigénio de RSV para o qual os anticorpos monoclonais são específicos. A concentração de anticorpo monoclonal marcado de forma detectável que é administrada deve ser suficiente para que a ligação a RSV seja detectável em comparação com o fundo. Ainda, é desejável que o anticorpo monoclonal marcado de forma detectável seja rapidamente eliminado do sistema circulatório para dar a melhor razão do sinal alvo-fundo.

Como regra, a dosagem de anticorpo monoclonal humano marcado de forma detectável para o diagnóstico in vivo variará dependendo de factores tais como a idade, o sexo e a extensão da doença do indivíduo. A dosagem de anticorpo monoclonal pode variar de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, de preferência de 0,1 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, sendo preferível de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Tais dosagens podem variar, por exemplo, dependendo de se as múltiplas injecções são dadas no tecido a ser ensaiado e de outros factores conhecidos dos peritos na arte.

Para imageologia de diagnóstico in vivo, o tipo de instrumento de detecção disponível é um factor principal na selecção de um radioisótopo apropriado. O radioisótopo escolhido tem de ter um tipo de decaimento que seja detectável para o dado tipo de instrumento. Ainda outro factor importante na selecção de um radioisótopo para diagnóstico in vivo é que a semi-vida do radioisótopo seja suficientemente longa para que seja ainda detectável no momento de maior captação pelo alvo, mas suficientemente curta para que a radiação prejudicial em relação ao hospedeiro seja aceitável. Idealmente, um radioisótopo utilizado para imageologia in vivo não terá uma emissão de partículas mas produzirá um grande número de fotões no intervalo de 140-250 keV, que pode ser prontamente detectado através de câmaras gama convencionais.

Para o diagnóstico in vivo, os radioisótopos podem ser ligados à imunoglobulina 84 977 ΕΡ:0 853 487/ΡΤ 26

directa ou indirectamente utilizando um grupo funcional intermediário. Os grupos funcionais intermediários que são frequentemente utilizados para se ligarem a radioisótopos que existem como iões metálicos são os agentes quelantes bifuncionais tais como o ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA) e o ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e moléculas semelhantes. Exemplos típicos de iões metálicos que podem ser ligados aos anticorpos monoclonais do invento são '"In. 9'Ru, h7Ga, MGa, '2As, 89Zr e 201T1.

Os anticorpos monoclonais do invento podem também ser marcados com um isótopo paramagnético para fins de diagnóstico in vivo, tal como na imageologia de ressonância magnética (MRI) ou ressonância do spin electrónico (RSE) (ESR). Em geral, qualquer método convencional para imageologia de diagnóstico de visualização pode ser utilizado. Habitualmente os radioisótopos emissores de gama e de positrões são utilizados para imageologia de câmara e os isótopos paramagnéticos para MRI. Elementos que são particularmente úteis em tais técnicas incluem l:,'Gd, "‘'Mn, l62Dy, 32Cr e 56Fe. O anticorpo monoclonal humano do invento pode ser utilizado in vitro e in vivo para monitorizar o decurso da terapia de doença de RSV. Assim, por exemplo, através da medição do aumento ou diminuição do número de células infectadas com RSV ou de mudanças na concentração de RSV presente no corpo ou em vários fluídos corporais, será possível determinar se um determinado regime terapêutico orientado para o melhoramento de doença de RSV é eficaz.

Profilaxia e Terapia de Doença de RSV

Os anticorpos monoclonais podem também ser utilizados imunoterapeuticamente para a doença de RSV em humanos e noutros animais. Os termos, “imunoterapeuticamente” ou “imunoterapia” tal como aqui se utilizam em conjunto com os anticorpos monoclonais do invento denotam a administração profilática bem como terapêutica e a imunização passiva com produtos polipeptídicos substancialmente purificados, bem como terapia génica através de transferência de sequências polinucleotídicas codificando o produto ou parte deste. A.ssim, os anticorpos monoclonais podem ser administrados a sujeitos de alto risco para reduzir a probabilidade e/ou a gravidade da doença de RSV ou administrados a sujeitos que já evidenciam infecção activa por RSV. No presente invento, os fragmentos Fab também neutralizam RSV tanto in vitro como in vivo e podem portanto ser utilizados terapeuticamente para tratar a infecção por RSV in vivo. Tal como acima explicado, os fragmentos Fab são preferidos para administração tópica ao forro do pulmão mas as moléculas intactas dos anticorpos são preferidas noutras situações.

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Tal como aqui se utiliza, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” dos anticorpos monoclonais do invento é uma dosagem suficientemente grande para produzir o efeito desejado no qual os sintomas da doença de RSV são melhorados ou a probabilidade de infecção é diminuída. Uma quantidade terapeuticamente eficaz não é, no entanto, uma dosagem tão grande que cause efeitos secundários adversos, tais como síndromas de hiperviscosidade, edema pulmonar, paragem cardíaca congestiva e semelhantes. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com a idade, a condição e o sexo do sujeito bem como com a extensão da doença no sujeito e pode ser determinada por um perito na arte. A dosagem pode ser ajustada pelo médico ou veterinário no caso de qualquer complicação. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 500 mg/kg, de preferência de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, sendo preferível de cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, numa ou mais administrações diárias da dose, durante um ou vários dias. É preferida a administração do anticorpo durante 2 a 5 ou mais dias consecutivos para evitar que ocorra “ressalto” da replicaçào do vírus.

Os anticorpos monoclonais do invento podem ser administrados através de injecção ou através de infusão gradual no tempo. A administração dos anticorpos monoclonais do invento pode, por exemplo, ser intravenosa, intraperitonial, intramuscular, intracavemosa, subcutânea ou transdérmica. Quando utilizados terapeuticamente, uma via de administração preferida dos anticorpos monoclonais do invento é através de aerossol pulmonar. As técnicas para a preparação de sistemas de distribuição por aerossóis contendo anticorpos são bem conhecidas dos peritos na arte. Geralmente, tais sistemas devem utilizar componentes que não vão enfraquecer significativamente as propriedades biológicas dos anticorpos, tais como a capacidade de ligação do paratopo (ver, por exemplo, Sciarra e Cutie, “Aerosols”, em Remington’s Pharmciceutical Sciences, 18a edição, 1990, págs. 1694-1712; incorporado por referência). Os peritos na arte podem prontamente determinar os vários parâmetros e condições para a produção de aerossóis de anticorpo sem recurso a experimentação excessiva.

As preparações para administração parentérica incluem soluções aquosas e não aquosas, suspensões e emulsões estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são o propilenoglicol, o polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis tais como etiloleato. Os transportadores aquosos incluem água, soluções álcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soluções salinas e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos fixados ou lactados de Ringer. Os veículos intravenosos incluem

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ reconstitui dores de fluídos e de nutrientes, reabastecedores de electrólitos (tais como os baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes. EXEMPLO 1 ISOLAMENTO DO FRAGMENTO Fab DO ANTICORPO MONOCLONAL RSVF2-5

Amplificação por PCR de Fab e construção de uma biblioteca. Foram purificados lihfócitos de sangue periférico a partir de 50 ml de sangue heparinizado completo de um dador infectado com HIV-1, através de um único passo de gradiente de densidades utilizando Histopaque-1077 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e foram lavados uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) de Dulbecco. O ARN total (30 mg) foi purificado a partir dos linfócitos de sangue periférico utilizando uma técnica rápida de isolamento de ARN de um único passo baseada em isotiocianato de guanidínio/fenol-clorofórmio (Stratagene, La Jolla, CA) e foi gerado ADNc através da transcriptase inversa (RT) utilizando Superscript RNase H‘ (Gibco-BRL, Grand Island, ΝΎ). A amplificação por PCR dos fragmentos Fd da cadeia pesada e das cadeias leves de IgG, foi efectuada durante 35 ciclos de 94°C x 1 min, 54°C x 1 min, 72°C χ 3 min. Isto foi seguido por um única incubação a 72°C durante 10 min. Os iniciadores 5’ para cada família de genes da região H e V da cadeia leve, e os iniciadores 3’ da região constante para IgG,, k ou 1 tal como descrito anteriormente (Kang et ai, em “Methods, A Companion to Methods in Enzymology: Vol. 2”, R.A. Lemer e D.R. Burton, ed. Academic Press. NY, págs. 111-118, 1991), foram Obtidos de Operon (Alameda, CA). Os iniciadores continham locais de enzimas de restrição para permitir a ligação sequencial das bibliotecas de Fd e da cadeia leve no vector de apresentação em fagos. O ADN do fragmento Fd, de aproximadamente 699 pares de bases, foi amplificado com locais para as enzimas de restrição, Xho I na extremidade 5’ do domínio VH e Spe I na extremidade 3’ do domínio CH1, para ligação com o ADN que codifica a proteína de remate, ou com o produto do gene III. O ADN da cadeia leve, de aproximadamente 639 pares de bases, foi amplificado com locais para as enzimas de restrição, Sac I na extremidade 5’ do domínio VL e Xba I na extremidade 3’ do domínio CL. O vector, pAbClone, foi construído a partir de pcDNAII (Invitrogen, San Diego, CA) e pET20b (Novagen, Madison, WI) (comandos pelB), para conter ADN codificando a proteína de remate do fago filamentoso M13, derivado de M13mpl8 (Stratagene, La Jolla, CA), com um local de restrição para Spe I na extremidade 5’ para ligação à extremidade 3’ do ADN codificando o fragmento Fd, essencialmente tal como descrito por Barbas et al. (Proc. Natl.

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Acad. Sei. (USA) 88: 7978-7982, 1991). A infecção de E. coli possuindo o fagemídeo, com o fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) permitiu a produção de uma biblioteca empacotada em fagos, com o fago a expressar simultaneamente moléculas de Fab na cabeça do fago e possuindo ADN codificando as moléculas de Fab dentro do corpo do fago.

Clonagem e expressão de moléculas de Fab. A partir de uma biblioteca empacotada em fagemídeos de 107 clones, os Fab que se ligam às proteínas da estirpe Long de RSV (ATCC VR-26) (Resposta Imunitária de abV, Derry, NH) foram enriquecidos através de 4 ciclos de “panning”. As proteínas de RSV foram ligadas a placas de microtítulo de 96 poços (Costar, Cambridge, MA) a 1 mg;poço em 25 ml de NaHCCf 0,1 M, de um dia para o outro a 4°C, tal como descrito anteriormente (Burton D.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 88: 10134-10137, 1991). A amplificação do fago eluído entre cada ciclo foi efectuada através da infecção de células de E. coli XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) e empacotamento com o fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, La Jolla, CA). O "panning’' resultou num aumento de 100 vezes no rendimento relativo de fago eluído quando comprado com o segundo “panning”. O ADN codificando a proteína de remate do fago foi então excisado através de digestão com Nhel e Spel e as extremidades compatíveis do vector foram re-ligadas para permitir a produção de moléculas de Fab solúveis. Os clones que produziam Fab solúvel que se ligava às proteínas de RSV foram então identificados através de ELISA, utilizando F(ab’)2 de Ig de cabra anti-humano conjugado com fosfatase alcalina (Pierce, Rockford, IL).

Produção e purificação de Fab. Para a pesquisa de clones produtores de Fab solúvel, foram induzidas culturas da véspera de 10 ml em super-caldo (“super broth”) (24)/50 pg de cárbenicilina/ml (SB/Carb) com isopropil-(beta)-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. Na manhã seguinte as culturas foram centrifugadas (4000g durante 10 min) e os sedimentos celulares foram congelados/descongelados três vezes em PBS/PMSF 200 mM /NaN3 a 0,01% (PBS/PMSF/Azida). Os lisados foram centrifugados (lOOOOOg durante 5 min) e foram utilizados volumes de 50 pl dos sobrenadantes no lugar de diluições de soro, tal como acima, para testes de ELISA. Os Fab purificados foram produzidos a partir de sedimentos celulares de culturas de 1 litro em SB/Carb, tal como acima descrito. Os sedimentos foram congelados/descongelados,. tal como acima, em 25 ml de PBS/PMSF/Azida e centrifugados a 14000g durante 40 min, filtrados através de um filtro de 0,22 mm e aplicados numa coluna de afinidade de 10 ml de Sepharose-4B (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)/F(ab’)2 de cabra anti-humano (Pierce, Rockford, IL) equilibrada com PBS. Após lavagem com 700 ml de PBS, os Fab foram eluídos em 50 ml de glicina 0,2 M (pH 2,5), neutralizados através da adição de 1/10 de um volume de Tris 1 M (pH 9,0) e concentrados para 1 ml num concentrador Centriprep 30 (Amicon, Beverly, MA). Os Fab purificados e concentrados 30 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ foram analisados em geles de SDS-PAGE corados com Azul de Coomassie, corridos sob condições redutoras, a 1-10 pg por pista e foram em todos os casos mais de 95% puros.

Isolamento e caracterização de Fab humano que se liga às proteínas de RSV. Após 4 ciclos de “panning” a biblioteca de 10' clones com proteínas de RSV (Tabela 1), foram isolados oito clones, que produziam Fab humanos solúveis que se ligam a proteínas de RSV. Os Fab que se ligam às proteínas de RSV foram purificados a partir de extractos periplasmáticos de sedimentos de células lisadas a partir de culturas de 1 litro de XLl-Blue, através de cromatografia de afinidade. As constantes de ligação aproximadas foram determinadas para estes clones através de ELISA utilizando o Fab purificado. Apenas um destes clones de Fab, designado RSVF2-5, era específico para as proteínas de RSV e não reagia com BSA ou outras proteínas virais. O nível de expressão proteica para o Fab de RSVF2-5 variou de 500-700 mg de proteína purificada·'! de cultura. As sequências de ADN foram determinadas para o Fd e para a cadeia leve para permitir a clonagem em vectores para terapia génica (apresentadas como SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22) e as sequências de aminoácidos traduzidas são apresentadas na Tabela 5 e como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 9. A análise do tamanho da inserção de ADN, dos pesos moleculares das proteínas expressas purificadas em geles de SDS-PAGE e das sequências de ADN traduzidas revelou que RSVF2-5 consiste num fragmento Fd e numa cadeia leve (fragmento Fab). O alinhamento das sequências de .ADN com a base de dados do Genbank identificou o fragmento Fd como pèrtencendo à família de genes VH3 e a cadeia leve como sendo uma cadeia lambda da família de genes VL6 (Tabela 5). Uma predominância das cadeias leves lambda na biblioteca original (razão l:k do ADN foi « 9:1) foi o resultado de constrangimentos impostos pelo rendimento inicial de ARN total e de um rendimento limitado do ADN de cadeia k a partir da amplificação por PCR.

Determinações das constantes de ligação do Fab. As proteínas de RSV foram ligadas a placas de ELISA a 0,1 mg/ml e bloqueadas com BSA a 3%/PBS, tal como acima. Foram adicionadas aos poços diluições em série de duas vezes de Fab humano purificado em BSA a 1%/PBS (50 μΐ/poço), e foram incubadas e lavadas, tal como para as titulações de ELISA acima. Foram então adicionados sequencialmente conjugado de F(ab’)2 de cabra anti-humano com fosfatase alcalina (Pierce, Rockford, IL) e solução de fosfato de p-nitrofenilo com lavagem pelo meio, tal como acima descrito. As constantes de ligação foram determinadas como concentração de Fab (g/1) a 50% da ligação dividida pelo peso molecular aproximado do Fab (5x104). As determinações da constante de ligação foram efectuadas pelo menos duas vezes, em dois lotes separados de Fab purificado.

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A constante de ligação aproximada para o Fab RSVF2-5 humano anti-proteína de RSV foi determinada como sendo 8,7 χ IO'0 M a partir da titulação por ELISA do Fab purificado.

Sequenciacão do ADN. O ADN plasmídico de cadeia dupla foi purificado através do estojo de maxiprep de plasmídeo Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA). A sequenciação foi então efectuada num sequenciador de ADN automático 373A (Applied Biosystems, Inc. (ABI), Foster City, CA), utilizando um estojo de sequenciação de ciclos de terminação didesoxi Taq fluorescente (ABI). Foram empregues tanto as sequências 5’ flanqueadoras do vector específicas para os comandos de Fd (SEQ ID NO: 17, T3, 5’-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3’) ou da cadeia leve (SEQ ID NO: 18, KEF, 5’-GAA TTC TAA ACT AGC TAG TCG-3’) como os iniciadores 3? (SEQ ID NO: 19, SeqGz 5’-GAA GTA GTC CTT GAC CAG-3’) para os domínios CHI ou (SEQ ID NO: 20, SeqLb 5’-GAA GTC ACT TAT GAG AC A CAC-3’) para CL, respectivamente,. As sequências derivadas para os fragmentos Fd da cadeia pesada e para as cadeias leves foram alinhadas utilizando MacVector e a base de dados do Genbank (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT). O Fab F2-5 de RSV liga-se especificamente à glicoproteína F de RSV. A especificidade de RSVF2-5 para a glicoproteína F de RSV foi demonstrada através de ligação em ELISA utilizando as glicoproteínas F ou G de RSV purificadas, preparadas tal como descrito anteriormente (Walsh, et al., J. Gen. Virol. 65: 761-767, 1984 e Walsh, et al., ./. Gen. Virol. 66: 409-415, 1985). Uma preparação purificada de 1 pg/ml de RSVF2-5 apresentou um título de >1:16384, enquanto que uma suspensão preparada de forma semelhante de um Fab de hepatite B (também a 1 pg/ml) tinha um título de 1:2 no mesmo teste. Esta preparação de Fab RSVF2-5 não se liga à glicoproteína G purificada, tal como evidenciado através de um título de ELISA de <1:2, enquanto que um soro de controlo de um adulto positivo para RSV apresentou um título de 1:4096 no mesmo teste.

Ensaio de neutralização do vírus. A neutralização de isolados de vírus de RSV, representando 10 isolados de cada um dos subgrupos antigénicos A e B, isolados ao longo de um período de 31 anos a partir de vários centros nacionais e internacionais, foram testados através de um ensaio de neutralização de redução de placas (Coates, et al., J. Epid. 83: 299, 1966), utilizando culturas em monocamada de células Vero. O título de neutralização do anticorpo foi expresso como a maior diluição de Fab purificado por afinidade que reduzia o número de placas em 60%. Os resultados dos testes de neutralização do Fab de RSVF2-5 purificado por afinidade, contra estes isolados de RSV, são mostrados na Tabela 2. A neutralização eficiente destes isolados de RSV foi observada entre 0,2 e 3,0 pg/ml para todos

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ os vários isolados dos subgrupos A e B. Por este motivo, RSVF2-5 tem larga reactividade e é altamente eficiente na actividade de neutralização, contra os dois subgrupos antigénicos de RSV. Estes dados também indicam que a estabilidade temporal do epítopo de neutralização, identificado pelo Fab RSVF2-5 humano, é muito elevada, sendo estável ao longo de um período de 31 anos. A titulação da mesma preparação de Fab purificado utilizada para os testes dos subgrupos, com a estirpe RSV A2, no mesmo teste in vitro, indicou um título de neutralização de redução de 60% das placas de 1:803471 e por isso uma actividade específica de 0,005 Lig/ml. Os lisados brutos de E. coli não foram testados neste ensaio, devido aos resultados não específicos frequentemente obtidos com este tipo de preparação bruta de Fab. EXEMPLO 2

A EFICÁCIA TERAPÊUTICA DO Fab RSVF2-5 MONOCLONAL HUMANO NO TRATAMENTO DE RATINHOS INFECTADOS POR RSV

Eliminação de RSV dos pulmões de ratinhos infectados por Fab RSVF2-5 purificado. Foram infectados grupos de seis ratinhos intranasalmente (i.n.) com 10' pfu da estirpe A2 de RSV, em 100 μΐ de PBS estéril, sob anestesia leve com metoxiflurano, no dia 0. Quatro dias após a infecção, representando o pico da infecção, diferentes grupos foram tratados com a dose indicada (Tabela 3) de Fab purificado por afinidade em 100 μΐ de PBS estéril, instilado intranasalmente sob as mesmas condições de anestesia que para a inoculação com vírus. O título de ELISA desta preparação de Fab purificado, a uma concentração de 3,6 mg/ml, foi de 1/60000, o título de neutralização foi de 1/803471 (Exemplo 1) e a pureza foi superior a 99%. Os ratinhos de controlo foram tratados com PBS ou com um Fab monoclonal humano (HBVc41) isolado a partit da mesma biblioteca combinatória de Fab, que se liga ao antigénio do núcleo do vírus da hepatite B (HBV) (Tabela 3). Foram preparados homogenatos de tecido pulmunar e turbinados nasais para a quantificação do vírus no dia 5 (18 horas após o tratamento com Fab) (Murphy et cil., Vciccine 8: 497-502, 1990 e Prince et al., Am. J. Path. 93: 771-792, 1978) e foram armazenados congelados até serem titulados quanto a RSV em monocamadas de células Vero através do ensaio de redução de placas (Coates, et al., J. Epid. 83: 299, 1966). As placas foram detectadas através de marcação com imunoperoxidase tal como descrito por Murphy et al. (1990). O Fab RSVF2-5 humano anti-RSV foi altamente eficaz na eliminação de uma infecção estabelecida de RSV nos pulmões de ratinhos (Tabela 3). O vírus detectável era evidente nos pulmões de apenas 1 dos 6 ratinhos tratados com 4,0 mg/kg de peso corporal

84| 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ com uma redução média de mais de 3 logl0 pfu em comparação com a produzida através de tratamento com o Fab para o antigénio do núcleo de HBV (HBVc41) ou PBS. EXEMPLO 3 IDENTIFICAÇÃO DO EPÍTOPO DE LIGAÇÃO DE RSVF2-5 O seguinte exemplo demonstra que o Fab RSVF2-5 humano, que neutraliza RSV in vitro e que cura ratinhos com infecção por RSV, identifica um epítopo (linear ou conformacional) que inclui o resíduo de aminoácido (aa) número 429 da glicoproteína F ou que é conformacionalmente afectado por este resíduo.

Neutralização de mutantes fugitivos da estime A2 de RSV. Mutantes fugitivos do anticorpo monoclonal de RSV (MARM) foram testados quanto à neutralização in vitro através do Fab monoclonal humano RSVF2-5, utilizando o ensaio de redução de placas descrito no Exemplo 1 (Coates, et ai, J. Epid. 83: 299, 1966), em monocamadas de células Vero. O título de anticorpo neutralizante foi expresso como a maior diluição do Fab purificado por afinidade que reduzia o número de placas em 60%. Os resultados do teste de neutralização do Fab RSVF2-5 purificado, contra estes RSV estão expressos na Tabela 4. O Fab RSVF2-5 anti-RSV purificado por afinidade não neutraliza o MARM v324 de RSV do Dr. G. Taylor, gerado utilizando o anticorpo monoclonal de ratinho (MAb) RSV19 (Taylor et al., Immunology 52: 137-142, 1984). Em contraste, o Fab RSVF2-5 neutralizou todos os outros mutantes fugitivos e a estirpe selvagem A2 de RSV com títulos neutralizantes no mesmo intervalo que para os isolados de RSV dos subgrupos A e B testados no Exemplo 1 (Tabela 2). O mutante fugitivo MARM v324 de RSV possui uma única substituição de aa (arginina para serina) no resíduo 429 na subunidade F1 da glicoproteína F de RSV. No entanto as sequências de aa das regiões VH e VL do Fab RSVF2-5 humano (Tabela 5) são únicas e não estão relacionadas com as do MAb RSV 19 ou com a forma humanizada deste anticorpo de ratinho (ver, p. ex.. Pedido Internacional PCT Número WO92/04381).

Assim o presente invento reconhece um epítopo de neutralização na subunidade F1 da glicoproteína F de RSV que inclui o resíduo de arginina 429 ou que está afastado deste resíduo mas que é afectado conformacionalmente por uma substituição nesta posição. O paratopo associado do Fab RSVF2-5 humano definido pelas regiões CDR, em particular a GDR3 das regiões VH e VL é adequado para a preparação de agentes protectores e terapêuticos que neutralizem RSV, em particular, para a preparação de anticorpos monoclonais contra o epítopo associado da glicoproteína F de RSV. O conhecimento deste 84.977 EP:0 853 487/ΡΤ 34

paratopo permite a um perito na arte produzir péptidos sintéticos ou anticorpos anti-idiotípicos que também possam ser adequados como vacinas contra RSV. O epítopo incluindo, ou conformacionalmente afectado por, uma substituição no resíduo 429 na subunidade F1 da glicoproteína F de RSV, identificado pelo Fab RSVF2-5 humano, é um alvo adequado para a pesquisa de outros epítopos de neutralização e para a produção de anticorpos monoclonais úteis para a terapia e profilaxia de infecções por RSV em humanos. O RSVF2-5 foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, Marvland sob a Designação ATCC 69909. O fascículo que se escreveu deve ser considerado como suficiente para permitir a um perito na arte colocar em prática o invento. O presente invento não deve ser limitado em âmbito pela linha celular depositada, uma vez que se pretende que a concretização depositada seja apenas uma ilustração de um aspecto do invento e quaisquer linhas celulares que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito do invento. Semelhantemente, as sequências nucleotídicas e os anticorpos específicos aqui divulgados não devem ser entendidos como limitantes do invento uma vez que se pretende que sejam apenas ilustrativos de concretizações particulares do invento tal como aqui possibilitadas. De facto, várias modificações do invento adicionalmente às aqui mostradas e descritas tomar-se-ão aparentes para os peritos na arte a partir da descrição precedente e cairão no âmbito das reivindicações anexas. (Segue Tabela 1)

84,977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 35 TABELA 1

ENRIQUECIMENTO DO FAGO A PARTIR DE “PANNING” DA BIBLIOTECA CARU COM PROTEÍNAS DE RSV

Ciclo de “pansing” Fago aplicado" Fago eluído" Rendimento relativo 1 2,4 x 10i2 3,3 x 107 1,2 x 10° 2 1,1 x IO13 9,1 x 106 8,0 x IO'7 o J 1,4 x 10i: 7,1 x 107 4,9 x 10'5 4 3,0 x 10" 2,6 x 107 8,5 x 10'5 * Número total de cfu em 200 μΐ de PBS/BSA a 1%

I

84' 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 36 TABELA 2 NEUTRALIZAÇÃO DE ESTIRPES DE RSV DOS SUBGRUPOS ANTIGÉNICOS A E B, ATRAVÉS DO Fab RSVF2-5 MONOCLONAL HUMANO #Isolados do Actividade de neutralização Vírus RSV específica (Lig/ml)‘

Subgrupo A

3,0 1,6 0.6 0,2 0,9 0,4 1.4 2.4 1,9 U SW/669/’59

Wash/11657/’60

Wash/Bem/’65 SL/863/’84 SL/10849/’84 SL/10865/’84 OK/9970/’85

Bir/6190/’89

New/RSS-2/’76

Bir/1734/’89

Subgrupo B WV/474R/’90 0,9 WV/1293/’75 1,0 WV/4843/’80 0,5 Wash/18537/’62 0,5 WV/14617/’85 2,6 WV/17154/’85 2,1 WV/20323/’87 0,8 WV/285R/’90 0,6 WV/401R/’90 0,7 WV/2B/’87 0,3 ‘Quantidade de Fab purificado necessária, para pré-incubação com vírus, para efectuar uma redução de 60% nas placas induzidas por RSV, produzidas em monocamadas de células Vero #Abreviaturas: Bir (Birmingham), New (Newcastle), OK (Oklahoma), SL (St. Louis), SW (Suécia), Wash (Washington), Wash/Bem (Washington/Bem) e WV (West Virgínia). (Estirpes de West Virgínia proporcionadas por Μ. A. Mufson, M.D.).

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 37 TABELA 3

EFEITO TERAPÊUTICO DO Fab HUMANO ANTI-RSV DE RSVF2-5 EM RATINHOS INFECTADOS POR RSV

Tratamento Dose (mg de Fab/kg de peso corporal) Título de RSV em homogenado de tecido* (média log10pfu/g de tecido) Turbinados nasais Pulmões Fab RSVF2-5 4,0 3.2 1,9# 1,0 oo 3,3 0,25 4,4 4,3 0,0625 4,2 4,0 0,0156 5,0 4,9 0,0039 4,9 5,2 Fab HBVc41 4,0 4,7 5,3 1,0 4,7 5,3 PBS n.a. 4,5 5,2 "Título de vírus recuperado dos homogenados de tecido 4 dias após a infecção com RSV e 18 horas após o tratamento com o Fab purificado por afinidade ou com PBS #Vírus recuperado a partir de 1 dos 6 animais a 1,7 log10 pfu/g detectável. Média calculada utilizando 1,7 para os 5 animais sem vírus detectáveis.

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 38 TABELA 4

CAPACIDADE NEUTRALIZANTE DE RSVF2-5 PARA MUT ANTES FUGITIVOS DE ANTICORPO MONOCLONAL DE RSV MARM dè RSV* Dose para 60% de redução de placas (pg/ml) Local antigénico Aminoácido substituído# vl237 <0,3 A 276 v 12.14 0,1 A 276 vl 129 0,5 A 275 vN151 0,4 A 272 vl200 0,3 A 272 vl 153 0,9 A 262 vi 269 <0,3 B 389 V1308F 1,0 C 241/421 V1302A/1 1,4 C 241/421 V1302A/6 <0,3 C 241/421 v324+ >18 outro 429 A2t.s.** 0,1 na na 'Mutantes fugitivos de anticorpo monoclonal de RSV (MASM) criados a partir da estirpe A2 dè RSV pela DiA Geraldine Taylor. #Substituições de aminoácidos (aa) na glicoproteína F de RSV responsáveis pela resistência à neutralização. *v324 é um MARM resistente ao Mab RSV 19 de ratinho de Geraldine Taylor, cuja forma humanizada é o objecto do pedido de patente internacional número WO92/04381. O MARM possui uma mudança de um único aminoácido na posição 429 (subunidade Fl). "Estirpe A2 de tipo selvagem de RSV.

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 39 TABELA 5 SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS REGIÕES V DE Fd E DA CADEIA LEVE DE RSVF2-5

Região Sequência de VH3 da Cadeia Pesada Sequência de VL6 da Cadeia Leve FR1 LEESGGDLVQ LTQPHSVSES PGRSLRLSCS TSGFSFG LGKTVTISC CDR1 DYPVN TRAGGRIASN YVQ FR2 WFRQAPGKGL VVYQQRPGSSP EWLG TTVIY : CDR2 IVRSRLYGGT LQYAASVEG EDNQRPF FR3 RFTISRDDSK GVPDRFSGSI SIAYLHMNSL DTSSNSASLT KSEDTAVYYC ISGLKTEDEA GV DYYC CDR3 PVANIDY QSYDSENPWY FR4 WGQGTLVTVS FGGGTKLTVL SASTKGPSS G

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 40

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE:

(A) NOME: INTRACEL CORPORATION (B) RUA: 359 Allston Street

(C) CIDADE: CAMBRIDGE

(D) ESTADO: MASSACHUSETTS

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 02139 (i) REQUERENTE: (A) NOME: GOVERNMENT OF THE UNITED STATES Representado pelo Secretário do Department of Health and Human Services (B) RUA: 6011 Executive Boulevard. Suite 325

(C) CIDADE: ROCKVILLE

(D) ESTADO: MARYLAND

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 20852 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: PILKINGTON, GLENN R. (B) RUA: 58 Wintrop Street

(C) CIDADE: WEST NEWTON

(D) ESTADO: MASSACHUSETTS

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 02165 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: GILMOUR, PAGE S. (B) RUA: 46- 1B Garden Circle

(C) CIDADE: WALTHAM

(D) ESTADO: MASSACHUSETTS

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 02154 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: CHANOCK, ROBERT M. (B) RUA: 7001 Longwood Drive

(C) CIDADE: BETHESDA

(D) ESTADO: MARYLAND

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 20817 (i) REQUERENTE/INVENTOR:

84 977 EP O 853 487/ΊΡΤ 41 (Α) ΝΟΜΕ: CROWE JR., JAMES Ε. (Β) RUA: 1535 Aberdeen Drive

(C) CIDADE: BRENTWOOD

(D) ESTADO: TENNESSEE

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 37027 (i) REQUERENTE/INVENTOR: (A) NOME: MURPHY, BRIAN R. (B) RUA: 5410 Tuscarawas Road

(C) CIDADE: BETHESDA

(D) ESTADO: MARYLAND

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 20816 (ii) TÍTULO DO INVENTO: ANTICORPOS MONOCLONAIS NEUTRALI-

ZANTES PARA O VÍRUS DO SINCÍCIO RESPIRATÓRIO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 22 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: WOLF, GREENFIELD & SACKS, P.C. (B) RUA: 600 Atlantic Avenue

(C) CIDADE: BOSTON

(D) ESTADO: MASSACHUSETTS

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 02210 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE \PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 60/003931 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 18-SET-1995 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: GATES, EDWARD R. (B) NÚMERO DE REGISTO: 31616

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/RECIBO: A0558/7008WO 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 42 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-720-3500 (B) TELEFAX: 617-720-2441 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ui) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: RSVF2-5 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: DOMÍNIO (B) LOCALIZAÇÃO: 1..123 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= HEAVY_CHAIN_VH3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Leu Glu Giu Ser Gly Glv Asp Leu Vai Gin Pro Gly Arg Ser Leu Are

Leu Ser Cys Ser Thr Ser Gly Phe Ser Fhe Gly Aso Tvr ?rc Vai Asr. 20 25 30

Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lvs Gly Leu Glu Trp Leu Gly lie Vai 35 40

Arg Ser Arg Leu Tvr Gly C-iy Thr Leu Gin Tyr Ala Ala Ser Vai Glu 50 =5 50

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lvs Ser lie Ala Tyr Leu 65 70 75 3q

His Met Asn Ser Leu Lvs Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tvr Tyr Cys Gly 35 90 95

Vai Pro Vai Ala Asr. Ile Asp Tyr Trp Gly Gin Glv Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lvs Gly Pro Ser Ser 120

115

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 43 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..27 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/marca=VH3_FRl (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Leu 1 Glu Glu Ser Gly 5 Gly Asp Leu Vai Gin 10 Pro Gly Arg Ser Leu Arg 15 Leu Ser Cys Ser 20 Thr Ser Gly Phe Ser 25 Phe Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..5

84' 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 44 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VH3_CDR1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Asp Tyr Pro Vai Asn 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: LA4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /'marca= VH3_FR2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCLA: SEQ ID NO: 4:

Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno 84 '911 ΕΡ'Ο 853 487/ΡΤ 45

(vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..19 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VH3_CDR2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: íle Vai Arg Ser Arg Leu Tyr Gly Gly Thr Leu Gin Tyr Ala Ala Ser l Vai Glu Gly 5~ 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..32 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VH3_FR3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Arg 1 Phe Thr Ile Ser 5 Arg Asp Asp Ser Lys 10 Ser Ile Ala Tyr Leu 15 His Met Asn Ser Leu 20 Lys Ser Glu Asp Thr 25 Ala Vai Tyr Tyr Cys 30 Gly Vai (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 46

(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÀO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VH3_CDR3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Pro Vai Ala Asn Ile Asp Tyr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..19 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VH3_FR4 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 15 10 15

Pro Ser Ser 47 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: RSVF2-5 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Domínio (B) LOCALIZAÇÃO: 1..109 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca* LIGHT_CHAIN_VL6 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Hi.s Ser Vai Ser Giu Ser Leu. Glv Lvs

lie Ser Cys Thr Arg Ala Glv Giy Arg lie Ala Ser Asr. Tvr Vai Gir. 20 25 30

Tro Tyr Gin Gin Arg Pro Glv Ser Ser Pro Thr Thr Vai lie Tvr Glu 35 40 45

Asp Asn Gin Arg Pro Phe Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile 50 55 60

Aso Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lvs Thr .65 70 75 80

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 48

Vr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser GIu Asr. ?rc 90 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1M9 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca- VL6_FR1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Leu Thr Gin Pro His Ser Vai Ser Glu Ser Leu Gly Lys Thr Vai Thr 1 5 10 15

Ile Ser Cys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

84:977 ΕΡ. Ο 853 487/ΡΤ 49 (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VL6_CDR 1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

Gin

Tlir Arg Ala Gly Glv Arg Ile Ala Ser Asn Tyr Vai 1 õ" 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1Π5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VL6_FR2 50 84;977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Vai Ile Tyr 1 " 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VL6_CDR2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

Glu 1

Asp Asn Gin Arg Pro Phe 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 amino ácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens

84:977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 51 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (Β) LOCALIZAÇÃO: 1..34 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VL6_FR3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 14:

Gly 1 Vai Pro Asp Arg 5 Phe Ser Gly Ser Ile 10 Asp Thr Ser Ser Asn 15 Ser Ala Tyr Ser Cys Leu Thr 20 íle Ser Gly Leu Lys 25 Thr Glu Asp Glu Ala 30 Asp Tyr (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1..10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VL6_CDR3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

Gin Ser Tyr Asp Ser Glu Asn Pro Trp Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 52 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-termmal (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo scipiens (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 11 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /marca= VL6_FR4 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: INICIADOR SINTÉTICO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: ATTAACCCTC ACTAAAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 53 841977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: INICIADOR SINTÉTICO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

GAATTCTAAA CTAGCTAGTC G (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: INICIADOR SINTÉTICO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: GAAGTAGTCC TTGACCAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: INICIADOR SINTÉTICO 54 84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ (χϊ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 20: GAAGTCACTT ATGAGACACAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 369 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: CTCGAGGAGT CTGGGGGAG.-. CTTCG7ACAG CCAGGGCGGT CCCTGAGACT CTCCIGr"' ^ \2'f’’ ^ 'Τ' / «> 1 I 1 I ! » _> _ i _ ^ T- τ i i . _ λ. _ . * "> ^i1 i'! 'y

GGGCTGGnGT GGCTAGGLAT CGTTA2AAGC AGACITIATG GTGGGACACT TCAATàC

GCG7CTGTGG AAGGCAGATT CACCATCTCA ΑΞΑΟΑΤΟΑΤ""1 CCAA^-jGC?'7’ CGCCTAT

C*GATG?iACA GTCTGSAATC CGAGGACACG GCCGDGTATT ATTGTGGTGT ACCAGTG

AACAiiv^ACI ACTTGGGGCCA GGGAA.CCCTG GTCACCGTCT CTTCAGCCTC CACCAAG

CCATCGTCT 55

A 84 977 EP 0 853 487/PT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 330 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22: •'“•Λ ι·τνν-»·^ /-»λ .-λ! v«-^2rtL-r.w

:G.--GGACG AGGCIGACTA CrACIUrCyG TCTZA-GA-A ZJLhACCC TT< Í.V*

GGCGG3GGGA CC^CTGAC CGTCCTAGGT

Lisboa, til 2009

Por INTRACEL CORPORATION e THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, representado pelo THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES - O AGENTE OFICIAL -

Claims

84 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 1/2

REIVINDICAÇÕES 1. Preparação farmacêutica compreendendo um transportador famaceuticamente aceitável; e um anticorpo susbtancialmente puro que se liga selectivamente a um epítopo da glicoproteína F de RSV, em que o referido anticorpo inclui uma região CDR3 da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
2. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o referido anticorpo compreende um fragmento Fd.
3. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o referido anticorpo compreende um fragmento Fab.
4. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o referido anticorpo inclui uma região CDR2 da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
5. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o referido anticorpo inclui uma região CDR1 da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
6. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o referido anticorpo inclui uma região Fd da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
7. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 em que o referido anticorpo inclui uma região CDR3 da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
8. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 em que o referido anticorpo inclui uma região CDR2 da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
9. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 em que o referido anticorpo inclui uma região CDR1 da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. 84' 977 ΕΡ Ο 853 487/ΡΤ 2/2
10. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 em que o referido anticorpo inclui uma região da cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
11. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que o referido anticorpo tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
12. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 11 em que o referido anticorpo consiste essencialmente na SEQ ID ΝΌ: 7.
13. Preparação farmacêutica compreendendo uma transportador famaceuticamente aceitável; e um vector incluindo uma sequência reguladora operativamente ligada a um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um anticorpo seleccionado a partir do grupo que consiste no anticorpo de acordo com a reivindicação 1, no anticorpo de acordo com a reivindicação 2, no anticorpo de acordo com a reivindicação 3, no anticorpo de acordo com a reivindicação 4, no anticorpo de acordo com a reivindicação 5, no anticorpo de acordo com a reivindicação 6, no anticorpo de acordo com a reivindicação 7, no anticorpo de acordo com a reivindicação 8, no anticorpo de acordo com a reivindicação 9, no anticorpo de acordo com a reivindicação 10. no anticorpo de acordo com a reivindicação 11, e no anticorpo de acordo com a reivindicação 12.
14. Preparação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 para utilização num método de tratamento de doença activa de RSV.
15. Preparação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 para utilização num método de profilaxia de uma infecção por RSV. Lisboa, -1. SEI 2000 Por INTRACEL CORPORATION e THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, representado pelo THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES

Ag. Of. Pr. In d. Rua das Flores, 74 - 4.® 1SQO LISBOA ΘΑ CUNHA FERRES KA