PT85130B - Processo para a analise de sequencias peptidicas imunogenicas comportando um epitope caracteristico de uma proteina estranha ao organismo de um hospedeiro vivo com vista a produccao de vacinas - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A ANÃLISE DE SEQUÊNCIAS PEPTÍDICAS IMUNOGÉNICAS COMPORTANDO UM EPITOPE CAR4CTERISTICO DE Um·!; PROTEÍNA ESTRANHA AO ORCtA

NISMO DE U:.I HOSPEDEIRO VIVO, COM VIS

TA A PRODUÇÃO DE VACINAS

A oresente invenção diz respeito a um processo para a análise destes epitopes ou determinantes antigénicas que, no seio de uma proteína antigénica, se podem considerar responsáveis pela acção imunogénica desta proteína em relação a um determinado hosoedeiro vivo.

Ê bem conhecido que uma das funções essenciais do sistema imunitário consiste em reconhecer o que lhe é estranho, para, o eliminar, sem, contudo, atacar as proteínas do hosoedeiro. Estas ou o conjunto dos péptidos que resultam da fragmentação ao acaso das proteínas do hospedeiro serão designadas na descrição que se segue pela expres são o ele somático.

Uma forma de defesa corrente pela qual o sistema imunitário se manifesta em relação a uma proteína estranha consiste na capacidade que ele tem de produzir anticorpos, reconhecendo especifieamente certos sítios antigénicos ou epitopes desta proteína. Estes epitopes são frequentemente transportados por sequências peptídicas particulares relativamente pequenas, as quais constituem quase sempre partes muito pequenas da sequência de aminoácidos

- 2 da proteína antigénica inteira.

Poucos meios estão actualmente disponíveis para determinar a posição e a natureza do epitope ou dos epitopes portadores da imunogenicidade da proteína, mesmo quando a sequência inteira desta proteína é conhecida ou se pode deduzir da sequência nucleotídica do ADN que codifica para esta proteína, quando este ADN particular foi identifi. cado. Mencionar-se-à para memória as medidas ou apreciações clássicas que são feitas dos graus de hidrofilia de certas regiões da sequência peptídica total da proteína referida ou as tentativas que se fazem, por vezes, para os situar s£ bre os arcos em que se pensa que eles poderão estar expostos à superfície do antigene, Os resultados obtidos mediante estes métodos são quase sempre enganadores. Enquanto não se disposer de processos de análise mais rápidos e/ou eficazes dos epitopes característicos destas proteínas, o desenvolvimento de vacinas sintéticas corre o risco de ser trava do.

Sabe-se que numerosos péptidos, cuja sequência de aminoácidos está contida na da proteína contra a qual se procura uma protecção, foram sintetizados e ensaiados em reacções imunológicas, utilizando anticorpos previamente formados contra a proteína. Embora se tenha constatado muitas vezes que estes anticorpos reconhecem estes polipéptidos sintéticos, a capacidade que possuem estes últimos de induzir in vivo anticorpos protectores contra a proteína natural só foi comprovada em um reduzido número de casos e, mesmo assim, só quando estes polipéptidos foram previamente dotados de eficácia imunogénica, por exemplo, mediante fixa ção sobre um suporte macromolecular apropriado.

- 3 A presente invenção tem por objectivo remediar as dificuldades encontradas até agora, na ocasião da análise das sequências peptídicas eventualmente responsáveis pela imunogenicidade de uma proteína antigénica em relação a um determinado hospedeiro, desde que a sua sequência de aminoácidos se tenha realizado ou possa ser deduzida da sequência nucleotídica do ADN correspondente, no caso desta ter sido determinada previamente.

A presente invenção resulta de uma maneira diferente de encarar os problemas da imunidade. De um modo geral, admite-se que os epitopes das proteínas antigénicas, susceptíveis de induzir anticorpos in vivo correspondendo às porções de moléculas normalmente expostas à superfície destas proteínas ou de células, em particular quando o antigene é constituído por um microrganismo ou qualquer tipo celular estranho. Estas teorias assentam sobre a hipótese de que, para ser reconhecidos pelo sistema imunitário, os epitopes deviam estar expostos à superfície do antigene e ao contacto de fluídos biológicos circulantes.

A aproximação diferente utilizada na presente invenção relaciona-se com uma nova interpretação que os inventores fazem dos importantes progressos que recentemente foram realizados ao nível da compreensão da apresentação dos an.tigen.es por moléculas da classe I e da classe II codificadas pelo complexo maior da histocomoatibilidade. Verificou-se,inicialmente, que os antigenes da classe II expostos à superfície dos macrófagos são capazes de apresentar, de uma certa maneira, péptides das células auxiliares T (ref. 8). Assim, a lisozima da clara de ovo é convertida em péptidos,

- 4 ( podendo alguns ser apresentados por antigenes da classe II (ref. 2). Demonstrou-se igualmente que a nucleoproteína da gripe é provavelmente apresentada sob a forma de pequenos péptides aos linfócitos T citotóxicos, em associação com moléculas da classe I (ref. 12 e 13). Nos dois casos, péptidos correspondentes foram sintetizados in vitro e colocados em contacto com células apresentando antigenes da classe I ou da classe II à sua superfície. Deveria então verificar-se que estes pêptidos adequirem a capacidade de ser apresen tados de um modo específico tornando-se reconhecíveis pelo sistema imunitário.

A interpretação que os autores deram a esta experiência é que com efeito a lisozima e a nucleoproteína da gripe teriam sofrido uma degradaçao intracelular, que se havia manifestado pela produção de pêptidos. Estes foram então transferidos para a superfície das células em causa para ser apresentados sob a forma apropriada ao sistema imunitário pelos antigenes de classe II e de classe I. Daí resulta a hipótese suplementar formulada pelos inventores de que o conjunto das proteínas celulares, estranhas ou nao, pode sofrer esta degradação em pêptidos, seguida da sua apre sentação à superfície. Daí resulta que o sistema imunitário deve ser capaz de reconhecer sequências peptídicas estranhas ao conjunto das sequências peptídicas pertencentes ao ele somático do hospedeiro.

A presente invenção baseia-se então no princípio de uma pesquisa na proteína antigénica em relação à qual se pode investigar uma vacinação destes pêptidos que, por exemplo, no fim de um processo compreendendo a introdução

do complexo proteína antigene-anticorpo, nos linfócitos B, a fragmentação ao acaso da proteína em pequenos pêptidos e a transferência destes últimos para a superfície destas cê. lulas, possam ser reconhecidos pelas células que possuem receptores T, como estranhos em relação ao conjunto dos péjo tidos do ele somático.

Por outras palavras, a presente invenção po_ de ser considerada como resultante da hipótese de que a antigenicidade da proteína antigénica se devia a pêptidos que o sistema imunitário não tinha até aí aprendido a reconhecer como pertencendo ao ele somático do hospedeiro.

processo de acordo com a presente invenção, para análise no seio de uma proteína estranha ao organismo de um hospedeiro pertencente a uma determinada espécie da sequência peptídica comportando o epitope responsável pela imunogenicidade, que se poderá utilizar para a preparação ulterior de pêptidos ou polipéptidos imunogéneos ten do propriedades vacinantes contra a proteína estranha ou con tra o antigene que a comporta, é caracterizado pela combinação das seguintes fases ;

- determinação e identificação da família dos oligopéptidos tendo um determinado comprimento, compreendidos na sequência de aminoácidos que constituem esta proteína estranha,

- comparação de cada um dos oligopéptidos desta família com cada um dos oligopéptidos do mesmo comprimento do conjunto das famílias de oligopéptidos contidos nas proteínas cujas sequências de aminoácidos sao conhecidas e que estão disponíveis num catálogo pré-estabelecido destas proteínas, sendo todas estas proteínas características do ele somático da espécie correspondente,

- identificação daqueles oligopéptidos (oligopéptidos não coincidentes) da família da proteína estranha para os quais existem apenas poucas coincidências e, de preferência, nenhu ma coincidência com os oligopéptidos disponíveis no catalogo,

- pesquisa, no seio da proteína estranha de sequências formadas de oligopéptidos não coincidentes que se cruzam mutuamente e

- análise entre estas sequências de oligopéptidos não coincidentes e sobrepondo-se pelo menos em uma sequência de aminoácidos comportando o epitope requerido para a preparaçao do polipéptido vacinante.

Deve entender-se, no que se refere anteriormente como oligopéptido tendo um determinado comprimento, se faz referência a um péptido tendo um determinado número de aminoácidos, naturalmente quaisquer que sejam as suas naturezas respectivas. Nos exemplos que se seguem, os 'Oligopéptidos possuem respectivamente 4 aminoácidos.

catálogo a que igualmente se faz referência antes, corresponde a todas as bases de dados nos quais estão registadas as sequências de aminoácidos de proteínas em número cada vez maior. A expressão aplica-se igualmente às bases de dados em que estão reunidas todas as informações relativas às sequências nucleotídicas dos fragmentos de ADN_g sequênciados, entre os quais numerosos ADN_ que codificam s proteínas cujas sequências de aminoácidos se podem então deduzir por meio de código genético.

Compreender-se-á que qualquer proteína formada por um número X de aminoácidos contém X - 3 tetrapéptidos, de acordo com a definição dada na presente invenção.

- 7 Se se parte da extremidade N-terminal da proteína, o primei, ro dos tetrapéptidos do género em questão será formado a partir dos quatro primeiros aminoácidos a contar da extremi. dade N-terminal, o segundo oligopéptido ou tetrapéptido situar-se-à entre o segundo e o quinto aminoácido da sequência o da proteína total, etc. e o último entre o(X-3)^_ β o aminoácido C-terminal. 0 que evidentemente será igual para as diferentes famílias de oligopéptidos, mais particularmente de tetrapéptidos que se poderão identificar em cada uma das proteínas pertencentes a determinada espécie estudada, cujas sequências de aminoácidos são conhecidas e estão arquivadas na base de dados utilizada.

A escolha dostetrapéptidos·' nos exemplos descritos adiante explica-se pela grande quantidade de tetrapéptidos que já se podem deduzir das sequências de aminoácidos do conjunto das proteínas cujas estruturas são já conhecidas e que provêm todas de uma mesma espécie,. Existem, com efeito, 20^ ₌ 160 000 combinações diferentes de aminoácidos num tetrapéptido.

Partindo destes dados, foi importante verificar, relativamente a certos polipéptidos sintéticos em que já fora demonstrada a capacidade de induzir in vivo anticorpos que reconhecem a proteína inteira correspondente, que estes polipéptidos contêm oligopéptidos, mais particularmente tetrapéptidos, que não têm o seu equivalente no seio dos conjuntos das famílias de oligopéptidos contidos nas proteínas, cujas sequências estão disponíveis na base de dados, que foi utilizada nos exemplos descritos adiante. Verificou-se mesmo que esta ausência de identidade entre oligopéptidos

- 8 da proteína antigénica considerada e oligopéptidos, particularmente tetrapéptidos, das proteínas referenciadas na base de dados se estende quase sempre aos oligopéptidos sucessivos sobrepondo-se mutuamente, quer dizer, distanciados na sequência da proteína de um aminoácido de cada vez, um em relação ao outro. Esta constatação deu então um fundamen to razoável à hipótese de que as sequências peptídicas não coincidentes correspondentes podem corresponder àqueles oligopéptidos que podem resultar da fragmentação ao aca so da proteína antigénica, na ocasião do processo referido antes da detecção da proteína antigénica in vivo com vista à sua destruição.

A escolha de tetrapéptidos para a realização dos ensaios descritos a seguir foi essencialmente determinada pela extensão da informação disponível actualmente relativa às sequências de aminoácidos de proteínas pertencentes a uma dada espécie. Mencionar-se-á, por exemplo, que o total dos aminoácidos contidos nas sequências das proteínas de murganho arquivadas na base de dados utilizada era de 26 000 para as proteínas somáticas do murganho e de 16 000 para as proteínas somáticas do coelho.

Deve referir-se que quando os dados relativos às sequências de aminoácidos das proteínas disponíveis nas bases de dados forem suficientemente aumentados, os oli. gopéptidos utilizáveis para a realização do processo de acordo com a presente invenção poderão ser constituídos por pentapéptidos, hexapéptidos, até mesmo oligopéptidos de maiores comprimentos. Actualmente, as sequências disponíveis nas bases de dados são ainda insuficientes para permi

- 9 tir uma análise estatisticamente significativa da distribui ção ou, ao contrário, da ausência de distribuição de certos pentapéptidos ou hexapéptidos entre a proteína estudada, por um lado e, por outro lado o conjunto das famílias de oligopéptidos contidos nas proteínas somáticas do hospedeiro, Inversamente, a utilização de sequências tripeptídicas já não permitia evidenciar de modo significativo tripéjo tidos não coincidentes na proteína antigénica estudada e não presente entre as proteínas somáticas do hospedeiro.

As famílias de oligopéptidos do ele somático, disponíveis nas bases de dados e em relação às quais se efectuou a comparação indicada antes é efectuada, podem pr£ vir da totalidade das proteínas do hospedeiro disponíveis nestas bases de dados, ou eventualmente privados das protejí nas que intervêm directamente ao nível do sistema imunitário : sequências conhecidas dos anticorpos, receptores de células T, moléculas de classe I e da classe II, etc.. Veri ficou-se, com efeito, que este último tipo de proteínas con tém numerosos tetrapéptidos não coincidentes com os de outras proteínas dentro da mesma espécie. Esta observação dá por conseguinte uma certa credibilidade à noção que em qual_ quer indivíduo existe um ele somático e um ele imunitário que não coincidem.

O princípio de acordo com a presente invenção será agora ilustrado pela descrição de alguns exemplos. Far-se-á referência aos desenhos em que :

- A fig. 1 fornece um gráfico representativo da frequência de distribuição comum aos mesmos tetrapéptidos de uma nucleoproteína da gripe, por um lado, e ao conjunto das proteínas sequenciadas de murganho que, no momento em que o

ensaio foi realizado, estavam disponíveis na base de dados NBRF - PIR.

- A fig. 2 representa curvas dando as mesmas informações comparativas, desta vez, por um lado entre os tetrapéptidos presentes na estrutura de uma lisozima e, por outro lado, ao conjunto das proteínas da base de dados referida antes.

- A fig. 3 fornece os mesmos dados comparativos, por um lado entre a sequência de um fragmento N-terminal da proteína VP1 do polivírus de tipo 1 e, por outro lado, os dados disponíveis relativos às proteínas do coelho na mesma base de dados.

Finalmente, as fig. 4 e 5 fornecem dados comparativos entre moléculas das classes I e II do murganho e a base de dados relativos às famílias de oligopéptidos que podem ser deduzidas das sequências das proteínas do mur ganho da mesma base de dados.

EXEMPLO 1 ; Estudo de um péptido imunogénio da nucleopro teína A/MT/óO/68 da gripe em relação a uma base de dados relativa ao ele somático do murganho.

A fig. 1 permite avaliar a frequência de existência na base de dados de cada um dos tetrapéptidos que estão incluídos na nucleoproteína da gripe e isso a par tir da primeira sequência tetrapeptídica a contar do aminoá eido N-terminal da nucleoproteína (posição 0.00 no eixo das abscissas). A frequência de aparecimento das frequências correspondentes é apreciável em relação ao eixo das ordenadas. As variações relativas que aparecem na fig. 1 correspondem à frequência de detecção na base de dados de cada um

Ζ dos tetrapéptidos que se sobrepõem distanciados, uns em relação aos outros, de um aminoácido da sequência de nucleoproteínas. Avaliou-se assim as frequências de aparecimento dos tetrapéptidos LWV ã , VV/íA , VHAC ....... a partir de uma sequência LVWMAC ........ ela própria contida na nucleoproteína da gripe. Os números que aparecem sob o eixo das abscis. sas correspondem às numerações dos aminoácidos N-terminais sucessivos dos tetrapéptidos sucessivos em relação ao aminoácido N-terminal da nucleoproteína.

A fig. 1 representa 25 regiões da sequência da nucleoproteína em que se verifica a presença de pelo menos 7 tetrapéptidos cujos primeiros aminoácidos respectivos se seguem uns e outros, todos ausentes dí conjunto dos tetrapéptidos que é possível deduzir da base de dados. A este respeito é interessante notar que duas regiões da sequência (assinaladas na fig. 1 por setas e estendendo-se entre os resíduos 335 e 349, por um lado e ainda 3^5 e 379, por outro lado) coincidem com duas regiões da sequência onde primeiramente fora demonstrada a capacidade de intervir ao nível do reconhe. cimento oelos linfócitos T citotóxicos do murganho.

Estas partes da sequência de aminoácidos apa recem igualmente no quadro I adiante (alínea a) ). Como se p£ derá verificar, 0 quadro I ilustra:

1) uma parte da sequência de aminoácidos da nucleoproteína (estendendo-se entre os resíduos 328 e 3θ5) utilizando 0 código por uma letra para a designação dos aminoácidos : em letras maiúsculas;

2) Em traços interrompidos os péptidos de síntese referidos antes, entendendo-se que cada uma das tiri- nhas dos traços interrompidos corresponde aos mesmos aminoáci- 12 dos que os situados em posições verticais correspondentes na primeira linha ;

3) as sequências não coincidentes resultantes da comparação efectuada pelo processo de acordo com a presente invenção, entre estes péptidos de síntese e as sequências peptídicas deduzíveis da base de dados, utilizando igualmente o mesmo código de uma letra para a designação dos aminoácidos : em letras minúsculas.

È interessante verificar que as sequências em letras minúsculas correspondem a tetra^éptidos que se sobrepoêm sucessivamente, não tendo sido encontrado, até agora, nenhum equivalente na base de dados respeitante às proteínas do murganho.

Por outras palavras, os péptidos em relação aos quais já se demonstrou a intervenção dos linfócitos T citotóxicos e as sequências não coincidentes com as do ele somático testemunham pelo contrário uma notável coincidência entre elas.

I EXEMPLO II : a lisozima da clara de ovo

Como já se mencionou antes, a imunização de murganhos com lisozima de clara de ovo de galinha compreende um processo de absorção da proteína pelos macrófagos e a apre sentação de um péptido (resíduos 45 a 61) pelos antigenes da classe II (ref. 2). 0 resultado das operações de comparação entre a sequência de aminoácidos e a base de dados do ele somático do murganho está representado na figura 2. Isto faz aparecer de novo uma sequência de 9 tetrapéptidos consecutivos não coincidentes com as sequências de referência do murganho. 0 péptido 45-61 revelou de novo apresentar um notável

grau de coincidência com uma sequência da lisozima não coincidente por si mesma com uma qualquer das sequências do ”ele somático” da base de dados.

EXEMPLO III : proteína M de Streptococcus pyrogenes

Um péptido obtido de acordo com o método do brometo de cianogánio a partir da proteína M24 é conhecido como sendo capaz de provocar uma resposta humoral e de desen cadear uma reacção dos linfócitos T citotóxicos no coelho (ref. 6). 0 menor dos péptidos sintéticos conhecido como pro vocando uma resposta da parte dos linfócitos T citotóxicos é de novo representado por um traço interrompido no quadro I, cada uma das tirinhas do traço interrompido identificando o aminoácido correspondente por referência à sequência mais longa representada utilizando um código de uma letra (letras maiúsculas). Como nos casos anteriores, este péptido que com porta 12 aminoácidos revelou incluir uma sequência de 9 resí^ duos de aminoácidos formados de 6 tetrapéptidos consecutivos sobrepondo-se mutuamente, tendo-se todos estes péptidos revje lado ausentes das informações contidas na base de dados quan to às sequências de aminoácidos das proteínas do ele somáti co do coelho.

EXEMPLO IV ;

péptidos sintéticos imunogéneos resultantes do antigene HB_Ag do vírus da hepati te B.

As sequências de dois péptidos imunogéneos do vírus da hepatite B estão indicados no quadro I junto, de acordo com a metodologia já descrita. Sabe-se que estes pép- 14 tidos são capazes de provocar uma resposta humoral no coelho, sendo o maior dos dois o mais imunogénico (ref. 3). Todavia, embora os dois pêptidos coincidentes com uma sequência feita de tetrapéptidos se sobreponham mutuamente, até agora não foram encontrados os equivalentes na base de dados do ele somático” do coelho. Verifica-se, por outro lado, que o péptido activo é igualmente aquele que compreende a sequência mais importante, em coincidência com uma sequência ausente do”ele somático.

EXEMPLO V :

pêptidos sintéticos correspondendo às s-e quências da proteína VP1 do poliovírus Vários pêptidos do fragmento N-terminal da proteína VP1 do poliovírus de tipo I foram reconhecidos como possuindo a capacidade de provocar uma resposta anti-VPl no coelho (ref. 7). A fig. 3 faz aparecer de novo uma notável coincidência entre as posições destes pêptidos sintéticos e as sequências mais longas actualmente ausentes da base de | dados do ele somático do coelho.

EXEMPLO VI : moléculas de classe I e de classe II do murganho.

As sequências de aminoácidos de linfócitos rl cl de classe I H-2K e de cadeia A do antigene de classe II (refs, 9 e 10) foram analisadas de acordo com o mesmo proces so. As figuras 4 e 5 fazem aparecer propriedades interessantes. Estas moléculas comportam regiões em comum com as sequências de proteínas conhecidas do ele somático. Tal é o caso para uma sequência sinal implicada no transporte destas

- 15 / * moléculas para a superfície da membrana através das regiões citoplasmáticas, assim como proteínas dos terceiros domínios extracelulares de H-2k (fig» 4). Pelo contrário, os outros domínios extracelulares, em particular as regiões NH2-terminais, destas duas moléculas apresentam um carácter notavelmen te estranho em relação ao conjunto dos oligopéptidos do ele somático do murganho, tais como resultam da base de dados,

As conclusões gerais que se podem tirar dos exemplos anteriores são as seguintes.

E notável que em todos os casos se tenha observado uma ausência de sobreposição ou uma não-coincidência significativa entre as sequências do péptido em que se reconheceu anteriormente o carácter imunogénico e as sequências de aminoácidos tais como resultam das figuras, que correspondem a sequências formadas de tetrapéptidos que se sobrepõem e que não se encontram nos bancos de dados referen tes às proteínas do ele somático do hospedeiro correspondente.

Os domínios extracelulares dos antigenes do complexo principal de histocompatibilidade do murganho de classe I e de classe II, que intervém sem dúvida no mecanismo de reconhecimento célula-célula, contêm sequências que também não são deduzíveis das famílias de tetraoéptidos do ele somático do murganho.

Ainda que os resultados tenham sido obtidos apenas por comparação com as sequências de um número limita do de proteínas disponíveis nas bases de dados (100 a 200 proteínas para o murganho e o homem), é legítimo pensar que

- 16 os epitopes característicos das proteínas antigénicas relativamente a um dado hospedeiro permanecerão constituídas pelas sequências de aminoácidos em que se não encontra equivalentes no conjunto das proteínas que formam o ele somático do hospedeiro. 0 desenvolvimento das informações relativas às sequências das proteínas do ele somático terá certamente por efeito reduzir o número das sequências contidas no interior das futuras proteínas antigénicas estudadas em que se não encontra o equivalente das proteínas do ele somático do hospedeiro correspondente. As hipóteses formuladas antes parecem, todavia, conservar o seu valor, quanto mais não seja pelo carácter estranho evidente que resulta da introdução no organismo do hospedeiro de uma sequência peptídica que lhe é manifestamente estranha.

processo de acordo com a presente invenção para detectar as zonas de uma proteína susceptíveis de trans portar um epitope característico completa-se com vantagem por fases suplementares consistindo na síntese dos péptidos correspondendo às sequências não comuns que se presume tran£ portarem o epitope referido antes, a sua utilização para a imunização de um hospedeiro vivo apropriado, estranho à esp£ cie estudada com estes péptidos sintéticos e a selecção entre eles dos péptidos sintéticos que tiverem mostrado a sua capacidade para induzir in vivo a produção de anticorpos capazes não somente de os neutralizar mas ainda de neutralizar as proteínas inteiras correspondentes. Estes polipéptidos poderão então ser considerados como contendo um epitope característico desta proteína.

Naturalmente o processo de acordo com a presente invenção pode ser igualmente associado a métodos de

- 17 reconhecimento já aplicados para identificar epitopes verosímeis ( por exemplo, apreciação dos graus de hidrófila das regiões em causa) que permitirão uma primeira selecção, no caso em que a comparação indicada antes fizer aparecer um número relativamente importante de sequências não coincidentes entre a proteína antigénica estudada e o conjunto das proteínas do ele somático disponíveis nas bases de dados.

Do exame das figuras resulta que o processo de acordo com a presente invenção permite, mediante o exame da sequência de aminoácidos de uma proteína antigénica de grande comprimento, situar rapidamente as regiões que poderão eventualmente conter um epitope característico da proteína, pelo menos eliminar com um grande nível de certeza as sequências em geral muito mais longas que não o deverão transportar.

A presente invenção será então de um uso particularmente vantajoso para o estudo das regiões susceptíveis de transportar epitopes de qualquer proteína antigénica sequenciada de novo.

Pelo contrário, a presente invenção permite determinar de qualquer modo mediante anticipação, quais sje rão as regiões susceptíveis de comportar o epitope em qualquer proteína cuja sequência de aminoácidos ainda não foi feita, na medida em que, contudo, se disponha da região do gene que codifica para esta proteína e/ou esta região do g£ ne tenha sido ela própria objecto de uma sequenciaçao quími ca e isto por intermédio do código genético.

De um modo geral, deve observar-se que eventualmente se poderá considerar como região nao coincidente ί ' preferida, aquela de entre elas que se revele formada por oligopéptidos sobrepondo-se e comportando ao todo 6 a 30 aminoácidos. Tais péptidos são facilmente obtidos mediante síntese química ou mediante processos de engenharia genética. Desde que eles revelem comportar um epitope característico da proteína estudada, poderão utilizar-se directamente na preparaçao de ingredientes activos imunogéneos, até mesmo vacinantes contra a proteína inteira correspondente, eventualmente depois da amplificação de seu carácter imunogéneo em condições bem conhecidas dos especialistas na matéria, por exemplo, mediante acoplamento com uma molécula portadora, tal como uma anatoxina tetânica ou diftérica ou uma sero albumina ou ainda mediante associação ou acoplamento com uma molécula possuindo propriedades de adjuvante imunológico.

Uma generalização do que se referiu antes resulta do facto de as moléculas do sistema imunitário, particularmente os anticorpos e os receptores das células T, poderem ser degradados em péptidos apresentados à superfície das células do sistema imunitário, onde desempenhariam um papel regulador por meio da sua intervenção nas interacções entre células. Assim, de acordo com as regiões variáveis das imunoglobulinas ou dos receptores de células T produzem péptidos que se assemelham ou não ao ”ele somático”, e obter-S£ -ão sinais reguladores de natureza muito diferente. A utilização de péptidos ou de polipéptidos assim definidos e sintetizados por via química (ou por técnicas de engenharia genética) é pois susceptíval de modular o equilíbrio do sistema, particularmente, por meio das regulações ditas idiotípicas. Por outras palavras, a presente invenção compreende também

os pêptidos ou polipéptidos tirados das moléculas do sistema imunitário que poderão servir, quer de vacinas, quer de adju vantes para vacinas, nas doenças ligadas quer a infecções por agentes externos (vírus, 'bactérias, parasitas), quer a desordens internas (doenças auto-imunes, cancros).

- 20 QUADRO I: Correlação das posições dos péptidos sintéticos imunogenes ou das sequências características ra ras ou ausentes nas famílias de proteínas somáticas do murganho e do coelho, respectivamente, tal como estão disponíveis na base de dados.

a) Nucléoproteina da gripe

330 340 350 360 370 380

1VWMACNSAAFED1RVLSFIRGTKVSPRGK1STRGVQIASNENMDAMESST1ELRSR rvlsfirgt asnenmdam

b) Lisozima da clara de ovo de galinha

60

RNTDGSTDYGIDQINSRWWCNDGRT

Iqinsrwwcndgr

c) Proteína M de Streptococcus pyrogenes

NPSTADDSAKIKTLEAEKAALAARKADLEKA1EGAM laarkadle

d) Antigéneo HBS

STGPSKTCMTTAQGTSMYPSC stgpsktcmtt

e) Proteína VP1 do poliovírus

GLGKMLESMIDNTVRETVGAATSRDALPNTEASGPTHSKEIPALTAVETGATNPLVPSDT gqmlesmidntvretvga

V QTRHVVQHRSRSESSIESFFARGACVTIMTVDNPASTTNKDKIFAVWKITYKDTVQIiRR vvqhrsrsessiesffarga ttnkdklfavwkitykdtvq p·-

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Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1, - Processo para a analise de sequências peptídicas comportando um epitope característico de uma proteína estranha ao organismo de um hospedeiro pertencente a uma determinada espécie, para a produção ulterior de péptidos ou de polipéptidos imunogénicos contendo estas sequências peptídicas e tendo propriedades vacinantes contra esta proteína estranha ou contra o antigénio que a comporta, caracterizado pelo facto de se realizar as seguintes fases:

   - determinação e identificação da família dos oligopéptidos com um determinado comprimento, contidos na sequência de aminoácidos que constituem esta proteína estranha,

   - comparação de cada um dos oligopéptidos desta família com cada um dos oligopéptidos com o mesmo comprimento do conjunto das famílias de oligopéptidos contidos nas proteínas cujas sequências de aminoácidos são conhecidas e que estão disponíveis em um catálogo pré-estabelecido destas proteínas, as quais são características do ”ele somático da espécie correspondente,

   - identificação dos oligopéptidos (oligopéptidos não coincidentes) da família da proteína estranha para os quais só existe pequenas coincidências e de preferência, nenhuma coincidência com os oligopéptidos disponíveis no catálogo,

   - pesquisa, no seio da proteína estranha de sequências formadas por oligopéptidos não coincidentes que se cruzam mutuamente e

   - análise entre as - sequências de oligopéptidos não coincidentes e que se cruzam de pelo menos uma sequência de aminoácidos comportan do o epítop® necessário para a preparação do polipéptido vacinante.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos oligopéptidos citados antes serem tetrapéptidos.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se determinar, na fase de pesquisa de sequências formadas por oligopéptidos que se cruzam, aqueles que compor tam entre 6 e 50 (particularmente entre 6 e 30) aminoãcidos.
4. 4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

   1 a 3, caracterizado pelo facto de se definir, na fase que determina e identifica a família dos oligopéptidos da proteína estranha citada antes, a sequenciação química desta proteína e de se identificar imédiájtameilte .depois a família de oligopéptidos também citada antes.
5. 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se estabelecer, na fase que determina a família dos oligopéptidos da proteína estranha citada antes, a sequenciação química da sequência polinucleotídica previamente reconhecida como codificando para a proteína estranha citada antes, e de se identificar imediatamente depois a família de oligopéptidos também citada antes, por intermédio do codigo genético.
6. 6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se realizar, na fase de pesquisa entre as sequências de oligopéptidos que coincidem e que não se cruzam, de uma ou mais sequências de aminoãcidos que presupostamente comportam o epitopo citado antes, a síntese química de uma ou de varias destas sequências de oligopéptidos que não se cruzam, de se imunizar um hospedeiro vivo apropriado, estranho ã espécie estudada, com estas sequências de oligopéptidos e de se seleccionar sequências que contenham o epitope estudado graças ã reacção imunologica de reconhecimento, até mesmo de neutralização, da proteína estranha pelos anticorpos neutralizantes induzidos por estas sequências de hospedeiro vivo.

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7. 7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se determinar simultaneamente com a analise das sequências de aminoácidos que comportam o epitope re querido para a preparação do polipéptido vacinante, o grau de hidro filia das sequências citadas antes, ou qualquer outra propriedade que indique a sua possível acessibilidade a um anticorpo.
8. 8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 j a 7, caracterizado pelo facto de a análise das sequências peptídi, cas do ej^p imunitário não presentes em o ele somático do mesmo ' hospedeiro, se aplicar às próprias moléculas do sistema imunitário f (particularmente anticorpos e receptores das células T), de modo a determinar a sequência dos peptidos derivados destas moléculas e susceptíveis de desempenhar um papel regulador no sistema imunitário, para em seguida sintetizar peptidos ou polipêptidos que possam ser utilizados como vacinas ou adjuvantes de vacinas no tratamento de ínfecçoes ou desordens internas do organismo do hospedeiro conhecido.