PT84898B

PT84898B - Processo para a a preparacao de composicoes farmaceuticas que contem 2-fenil-1,2-benzisoselenazol-3(2h)-ona apropriadas para o tratamento de doencas provocadas por stress oxidativo

Info

Publication number: PT84898B
Application number: PT84898A
Authority: PT
Inventors: Michael John Parnham
Original assignee: Nattermann A & Cie
Priority date: 1986-05-20
Filing date: 1987-05-19
Publication date: 1990-02-08
Also published as: EP0249735A3; US4757063A; DK254787D0; JPS62294613A; DK254787A; PT84898A; EP0249735A2; DE3616923A1

Description

Descrição Detalhada

A presente invenção diz respeito a uma nova utilização da 2-fenil-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona (nome genérico:Ebselen), isto é, a sua utilização no tratamento de doenças provocadas por stress oxidativo e a composições farmacêuticas que contêm este princípio activo e que se utilizam com a mesma finja 1 idade.

A 2-fenil-l,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona ê um composto conhecido que se utiliza no tratamento de doenças reumáticas (patente de invenção alemã DE-PS 3027073 e patente de invenção norte-americana N9 4352799) e se prepara de acordo com o proces_ so escrito por R. Weber e M. Renson em Bulletin de la Soc, Chim, de France 1976 (7/8), pg 1124-1126, fazendo reagir a 2-meti1 seieno-2-fenil-benzamida com pentacloreto fosforoso e hidrolisando posteriormente,

Stress oxidativo

Todos os organismos aerõbios utilizam oxigénio para pro duzir energia. Existe contudo um grande numero de indícios de que ãs vantagens da utilização de oxigénio se associa igualmein

te ο risco do processo oxidativo poder prejudicar as pessoas tratadas, Diversos metabolitos de oxigénio activos participam nestes processos de oxidação e atacam, simultaneamente, as varias classes de materiais biológicos. Quase todas as classes de compostos químicos estão sujeitas a alterações oxidativas provocadas por estes compostos de oxigénio. Por exemplo, os ãcidos nucleicos, as proteínas e os aminoacidos livres, os lípidos e os hidrocarbonetos são influenciados pela toxicidade I devida ao oxigénio. 0 organismo humano possui o mais aperfeiçoado, difundido e obviamente, o mais importante sistema que;permite equilibrar os seus processos de oxidação e antioxidação (ver H. Sies, Oxidative Stress pg, 2-4, 1985), deslocamento deste equilíbrio na direcção dos proces_ sos oxidativos pode ter duas causas:

1. sobrecarga do sistema antioxidativo provocada pela produção de um metabolito de oxigénio activo e/ou } 2. insuficiência do sistema antioxidativo.

A expressão stress oxidativo resume as consequências destas situações, Sabe-se hoje que este deslocamento do equilíbrio pode ser provocado por muitas perturbações diferentes , especialmente processos inflamatórios como a hepatite, doenças do sistema nervoso central (SNC) como a epilepsia ou a doença de rarkinson, doenças que afectam a região pulmonar como a asma, psoríase, efeitos secundários devidos a agentes anti-cance rígenos, compostos químicos como, por exemplo, o paraquat, e efeitos secundários provocados por radiações bem como doenças

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da circulação coronária tal como o enfarte cardíaco,

Surpreendentemente, observou-se que a 2-feni1-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona e um composto uti1 no tratamento de do enças provocadas por stress oxidativo como demonstram os ensaios seguintes realizados in vitro,

1. Quimioluminescência

Frequentemente, avalia-se a produção , por células actj_ vadas, de formas de oxigénio reactivas medindo a luminescência provocada por acção química (quimioluminescência) (QL). Os radicais produzidos reagem com um composto capaz de emitir fotões (por exemplo o luminol) e a emissão de luz resultante e medida com uma fotocelula, A quimioluminescência é detectavel, como um resultado da estimulação de leucócitos e representa o valor da sua actividade citotoxica oxidativa (Ver R. C. Allen et al., 'Eiochem. Biophys. Res. Commun. 47, 679, 1972), Plaquetas humanas (ver

K. Van Dyke et al., Michrochem. J. 25, 514, 1980) e linfõcitos (D. A. Humes et al. , Biochem. J,” 198, 661 , 1 981 ) estimul^ das, bem como, o fígado, o cérebro e o tecido pulmonar submetidos a stress oxidativo (ver C. Cadenas et al., Biochem, J , 192, 303, 1980; A. Boveris et al., Fed. Proc, 40, 195, 19.81] também provocam quimioluminescência.

A quimioluminescência pode, consequentemente, considerar-se uma resposta de uma célula ou tecido ao stress oxidativo. Demonstrou-se que o composto Ebselen inibe a quimioluminescência Droveniente de macrófagos de murganho estimulados (ver Quadro 1] ou de microsomas.de fígado. Consequentemente, deve consi

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derar-se o composto Ebselen como um inibidor dos produtos stress oxidativo nas células ou tecidos.

Quadro 1 Inibição in vitro pelo Ebselen da QL provocada pelos macrÕfagos peritoneais de murganho estimulados por acetato miristico de forbol ou zymosan opsonizado

Estimulantes	Células (lxlO⁵/ml)	Ebselen Cone. (jumol /Ί),	Inibição [%)
Zymosan Op.	MacrÕfagos	0,6	12
	residentes	1,8	40
		6,0.	53
		18,3	9.7
AMF	activados de	0,1	0
	C. parvum	1,0	17
		10,0	76

composto Ebselen fornece assim os fundamentos para o tratamento de um grande numero de situações nas quais o stress oxidative se torna excessivo como, por exemplo, radiações- ou to xicidade química.

2. Toxicidade celular induzida pela doxorubicina

No tratamento do cancro utilizam-se muitos compostos ci_ totoxicos (ver R. C. Young et al., J, Med. 305, 139, 1981 ) . Devido a sua citotoxicidade, estes compostos produzem um grande numero de efeitos secundários. Pensa-se que um destes compos, tos, a doxorubicina, induz efeitos secundários mediante a form£ ção de radicais reactivos Q ver T. R. Tritton e G. Yee, Scierce I 217, 248, 1982), Demonstra-se, in vitro, que o composto Ebselen impede a morte das células provocadas pela doxorubicina (ver Quadro 2). 0 composto de referência catalase, um expurgador de (água oxigenada), também ê eficaz.

Quadro 2 Inibição pelo Ebselen, em células MCF-7, da morte destas células provocada pela doxorubicina

Composto	°Z em relação ao controlo fs/DOX)
	DOX 0,4 jumol/1	DOX 0,5 /jmo 1/1	DOX 0,75 jumol/1
Nenhum	60	49	42
Ebselen	-	74	-
(5 jumol/1)
Catalase	91	87	69
(3000 U/ml)

Estes elementos indicam que o composto Ebselen tem capa cidgde para proteger as células dos danos provocados pelos comrepostos químicos que induzem a formação de radicais. Uma vez que se conhece um grande numero de compostos químicos, incluindo toxinas do ambiente capazes de induzir o stress oxidativo provocado pelos radicais, os ensaios citados antes indicam que o Ebselen ê, de um modo geral, útil no tratamento destas reacções de stress oxidativo.

3. Citotoxicidade induzida pelo diquat

Para investigar o mecanismo de citotoxicídade do diquat, um bipiridílio conhecido por tomar parte no ciclo redox, usa-se um sistema hepatocito isolado comprometido. Como consequência da redução e oxidação cíclicas do diquat no interior deste modelo hepatécito produzem-se iões superoxido 0? e agua oxigenada (Η₂θ2^· Preparam-se estes hepatÕcitos comprometidos mediante pré-tratamento com 1,3-bis-(2-cloroetil)-1-nitroureia para inibir a actividade da redutase da glutationa, A adição de diquat aos hepató eitos comprometi dos diminuiu rapidamente os níveis de glutationa na célula (GSH), aumentou a formação de GSSG e produziu, no perro do de uma hora, um importante numero de mortes entre as· células, Quando adicionado aos hepatÕcitos não tratados previamente com 1,3-bis-(2-cloroetil)-l-nitroso ureia o diquat não alterou os ní veis celulares de GSH/GSSG nem provocou a morte das células, o que demonstra a importância do sistema enzimatico peroxidase/re^ dutase da glutationa na protecção contra a agua oxigenada (Η,,Ο.?) produzida pelo diquat. A adição de glutationa (GSH) ou N-acetil-cisteína ãs incubações não protegeu os hepatÕcitos· comprometidos contra a citotoxicidade do diquat, 0 composto Ebselen, que actua como a peroxidase da glutationa também falhou na protecção contra a citotoxicidade mas inibiu a peroxidação dos iTpidos associados com o diquat. Contudo, quando se adicionou o composto Ebselen em associação com GSH ou com N-aceti 1 -cisteína a deplecção dos níveis de GSH nas células relacionadas com o diquat foi significativamente retardada e a morte das células não foi perceptível ate, pelo menos, aos iíltimos vinte minutos da hora de incubação. Estes resultados sugerem que o composto Ebselen tain bêm pode ser eficaz na protecção contra o diquat e outras situa, ções patológicas durante as quais o stress oxidativo induzido pe los radicais de oxigénio e hidroperõxidos e o processo fundamejn tal.

4. Peroxidação dos lípidos in vitro

Nos ensaios utilizou-se fêmeas adultas- de ratos Wistar, pesando cerca de 200 g cada. Manteve-se os animais utilizados na experiência em condições standard, isto ê, durante períodos de 12 horas em gaiolas Makrolon com iluminação de nêon e 30$ de humidade no ar e fornecendo-lhes para beber agua vulgar e alimeji tos Altromin.

Extraíu-se o fígado dos animais anestesiados com uret£ no [administrou-se por via intraperitoneal 5 ml de uma solução aquosa a 25% Çp/vJ por Kg de peso do corpoj , depois do que se retirou todo o sangue dos fígados e se lavou tn situ com uma solução fisiológica de cloreto de sodio através da veia corta , Preparou-se os microsomas do fígado pelo processo convencional por ultracentrifugação. Em todos os ensaios utilizou-se uma sus.

pensão de microsomas preparados recentemepte. Suspendeu-se a fracção contendo os microsomas em uma solução tampão de fosfato de pH 7,4· Utilizando uma técnica convencional realizou-se nos microsomas do fígado o ensaio respeitante a peroxidação dos 11pidos estimuladas durante 1 hora por acido ascorbico. Uma hora depois avaliou-se, por espectrofotometria , o dialdefdo malÕnico produzido durante a peroxidação dos lipidos. A sua concentra^ ção utiliza-se como uma medida indirecta da peroxidação dos H pidos. As amostras ensaiadas (5 ml com 5 mg de protefna microso mal) adicionou-se os produtos a ensaiar sob a forma de soluções em 10 pl de etanol. Esta diminuta concentração de etanol não tem influencia na peroxidação dos lipidos.

Como controlo considera-se 100% a concentração de dialdeido malÕnico resultante da estimulação pelo ãcido ascorbico . Compara-se cada amostra contendo os compostos a ensaiar com este controlo A partir dos elementos- obtidos calcula-se um valor mj? dio + SEM. Calcula-se as diferenças significativas pelo ensaio t de Student. Considera-se significativa uma diferença com um p<0,05. Uma hora depois (controlos) do estímulo pelo ãcido ascorbico a formação de dialdefdo malÕnico elevava-se a 84,6 + + 14,7 nM/ml (média + SEM; n: todos os controlos, valores- normais, valor 100%), Quando a cada uma das amostras submetidas a ensaio se adicionou, depois da iniciação da formação do dialdefdo malÕnico, o composto Ebselen numa concentração compreendida entre 36 e 360 uM/ml da amostra a ensaiar, a formação do dialdefdo malÕnico diminuiu substancialmente ( de 76 para 90%) ; p < 0,001 em cada um dos casos) relativamente a todas as concentrações dos compostos a ensaiar.

Quando adicionado em concentrações- compreendidas' entre e 360 nM por ml da amostra a ensaiar, 30 minutos antes de se iniciar a reacção com acido ascorbico, a concentração de 36 nM/ml do composto Ebselen por volume do ensaio não impediu a formação do dialdeido malonico, enquanto a adição de 72 e 360 nM por ml do volume a ensaiar resultou numa iniciação completa da formação de dialdeído malonico ( p <0,001).

composto Ebselen, em concentrações diminutas, inibe assim a peroxidação dos lipidos e de certeza absoluta, na fase inicial da reacção em cadeia , actua como um agente expurgador de radicais. Consequentemente considera-se o composto Ebselen apropriado para inibir e tratar as situações patológicas causadas- por um stress oxidativo sob a forma de peroxidação de lipidos em excesso.

5, Propriedade da peroxidase da glutationa

Os ensaios in yitro demonstraram a capacidade da 2-fe nfl-l,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona (Ebselen) para catalisar a decomposição dos perÕxidos quando utilizada na presença de tiôts.

RSH + h₂o₂

ROOft

Ebselen ------>

RS SR

Í2H₂0

ROH+H-O \ a

Esta propriedade do Ebselen e semelhante a da enzima pe roxidase da glutationa existente nos mamíferos (GSH-Px), Cons£ quentemente, o Ebselen actua como um pseudo-enzima.

Avalia-se a reactividade dos tiÕis pelo método de A. Wen

dei [A. Wendel, Methods in Enzymology, vol. 77, pg 325-333 (1981)21 · Determinou-se os valores que se seguem da actividade pseudo-enzimãtica utilizando glutationa (GSH) coroo substrato (1 mmol/1), expressa em unidades de peroxidase de glutationa (U) Δ log GSH/min por mol/1 de selenio equivalente a Ebselen.

1,1 x 10 com agua oxigenada (H₂0₂)

1,17x 10θ com hidroperoxido de butiln terc, (t-BuOOH) I 1,7 x 10θ com hidroperoxido de cumol (CuOOH).

Nestas condições o enzima peroxidase da glutationa (GSH-Px) puro proveniente de glóbulos vermelhos de boi mostrou uma actividade de ΊΟ^θ U por mole de selenio ligado ao enzima.

composto Ebselen e o complexo seieno-enzima peroxidase da glutationa existente nos mamíferos catalisam a reacção quer dos hidroperóxidos inorgânicos quer dos orgânicos. Contudo o Ebselen difere do enzima natural pelo facto de este apresentar uma elevada especificidade para a glutationa (GSH) como substra to, enquanto o Ebselen catalisa também a reacção com muitos outros ttõis.

Actividades do pseudo-enzima em relação a diversos tiois.

( t-BuOOH, Ebselen Δ log R S H em vez de Alog GSH)/ glutationa cisteína

N-acetfl -cistefna acido 3-roercaptopropfónico ester etílico do acido 2-mercaptoacetico eritro-1,4-drmercapto-2,3-butanodiol

1,17 x 10⁶

2.5 x 1Q⁶0,47x10⁶

1,05xlQ⁶

3,8 x 1Q⁵

4.6 x 10⁶

A partir destes ensaios conclui-se que se pode utilizar o composto Ebselen como um importante agente profiláctico e/ou terapêutico nas situações de doença provocadas por stress oxidjj tivo como, por exemplo, nas perturbações do sistema brõnquico incluindo o distress-sTndrome respiratório do adulto (ARDS) ou nos efeitos secundários provocados pelos compostos anticancerige nos, nas perturbações do sistema nervoso central (SNC1 tais como a epilepsia ou a doença de Parkinson, nos danos provocados pelas radiações ou nos efeitos tóxicos de compostos químicos como o paraquat, nas doenças de fígado, nas perturbações cardio-circula tõrias como, por exemplo, no enfarte do coração ou na psoriase.

A presente invenção diz ainda respeito a composições far maceuticas contendo Ebselen como agente activo. As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção destinam-se a ser administradas por via enteral, oral ou rectal, bem como por via parenterica. Estas composições contêm como ingrediente act/ vo sob o ponto de vista terapêutico o composto Ebselen indi vi dualmente ou em associação com veículos convencionais sob o ponto de vista farmacêutico. De preferência, estas composições farmacêuticas contêm de acordo com o tratamento pretendido, o ingredieji te activo sob a forma de dose individual como, por exemplo, comprimidos, drageias, capsulas, supositórios, granulados, soluções, emulsões ou suspensões. De uma maneira geral, as dosagens de Ebselen estão compreendidas· entre 10 e 2000 rog/dia, de preferên cia entre 30 e 300 mg/dia, e podem ser administradas sob a forma de doses individuais ou doses parciais múltiplas, de preferência sob a forma de 2 ou 3 doses parei ais/dia.

Os exemplos seguintes ilustram a preparação de composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção.

Exemplo 1

Comprimidos

2-feni1-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona	30 mg
1actose	15Q mg
celulose cristalina	50 mg
carboximeti1celulose cálcica	7 mg
estearato de magnésio	3 mg

Utilizando uma técnica convencional mistura-se os· componentes citados antes e comprime-se. Eventualmente pode drageifi^ car-se os comprimidos resultantes.

Exemplo 2

Comprimi dos
2-feni1-1,2-benzisosel enazol-3Q2H)-ona	50 mg
celulose microcristalina	150 mg
Cu ti na® HR	1 5mg
ftal ato de hidroxipropilmeti1 celulose	20 mg
Exemplo 3
Capsulas
2-fenil-l,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona	30 mg
lactose	102 mg
celulose cristalina	56 mg
dióxido de silício coloidal	2 mg

-13Utilizando uma técnica convencional, misturou-se os com ponentes citados antes, granulou-se e acondicionocnse em cápsulas de gelatina dura.

Claims

Reivindicação

Processo para a preparação de composições farmacêuticas para administração por via oral, rectal ou parentêrica, apropriadas para o tratamento de doenças provocadas por stress oxidativo, caracterizado pelo facto de se converter em uma forma de dosagem galénica uma mistura constituída por uma quantidade efectiva, geralmente compreendida entre 10 e 2000 mg, de preferência entre 30 e 300 mg de 2-fenil-l,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona, como ingrediente activo, e um veículo aceitável em farmácia.