PT826777E - Cronometro quimico para uma tira de teste visual - Google Patents

Description

» 4 8Ζ6 777- DESCRIÇÃO "CRONÓMETRO QUÍMICO PARA UMA TIRA DE TESTE VISUAL"

Antecedentes da Tnvencão 1 · Área da Invenção

Esta invenção relaciona-se com um dispositivo que determina quimicamente um intervalo de tempo; mais particularmente, um intervalo durante o qual uma tira de teste mede a concentração de um analito numa solução biológica. 2. Descrição da Arte Relacionada

Foram desenvolvidos muitos dispositivos de testes visuais para medir a concentração de certos analitos em soluções biológicas. Estes dispositivos têm medido, por exemplo, glucose, colesterol, proteínas, cetonas, fenilalanina, ou enzimas no sangue, urina, ou saliva.

As tiras reagentes de fase seca que incorporam composições à base de enzimas são largamente utilizadas em laboratórios clínicos, consultórios médicos, hospitais, e lares para testar amostras de fluidos biológicos quanto à concentração de glucose. De facto, as tiras reagentes tornaram-se numa necessidade diária para muitos dos milhões de diabéticos do país. Uma vez que a diabetes pode provocar anomalias perigosas na química do sangue, pode concorrer para a perda de visão, insuficiência renal, e outras consequências médicas graves. Para minimizar o risco destas consequências, a maioria dos diabéticos tem de se auto-testar periodicamente, depois ajustar a sua concentração de glucose de acordo com o resultado, por exemplo, através de 1 controlo da dieta e/ou com injecções de insulina. Alguns doentes têm de testar a sua concentração de glucose no sangue com a frequência de quatro vezes por dia ou mais. É especialmente importante para diabéticos que têm de controlar a sua dieta para regular o consumo de açúcar e/ou administrar injecções de insulina, e que precisam ser orientados a este respeito por testes frequentes da concentração de glucose no sangue, dispôr de tiras de teste rápidas, baratas, e exactas para determinação da glucose.

Conhece-se tiras reagentes que contêm um indicador que adquire uma tonalidade de cor diferente, dependendo da concentração da glucose num fluido biológico que foi aplicado à tira. Embora algumas dessas tiras utilizem reacções químicas de redução, mais vulgarmente envolvem um corante oxidável ou par corante. Algumas das tiras incluem uma enzima, tal como glucose oxidase, que é capaz de oxidar a glucose a ácido glucónico e peróxido de hidrogénio. Também contêm um corante oxidável e uma substância com actividade peroxidativa, que é capaz de catalisar selectivamente a oxidação do corante oxidável na presença de peróxido de hidrogénio. (Ver, por exemplo, Pat. U.S. Ns 5 306 623). A Pat. U.S. N2 3 964 871, publicada em 22 de Junho de 1976, de Hochstrasser, descreve uma tira indicadora descartável para medir directamente substâncias, tais como glucose, em fluidos biológicos. O indicador regista a concentração da substância pela inclusão tanto de um reagente indicador, que é oxidado e muda de cor ao reagir com a substância, como de um "antagonista" que de alguma forma impede a acumulação do indicador oxidado até que este tenha sido completamente consumido.

Palmer et al. descrevem um sistema de doseamento quantitativo "digital" para glucose e outros analitos na 2

Publicação do Pedido de Patente Europeia N2 0 317 070, publicado em 24 de Maio de 1989 (ver também Pat. U.S. Ne 5 036 000, publicada em 30 de Julho de 1991) . Este sistema mede a concentração de um composto orgânico num fluido biológico primeiramente oxidando o composto com uma enzima oxidase específica para o substrato para produzir peróxido de hidrogénio. O sistema inclui um cromogénio que é um redutor de peróxido de hidrogénio e redutor de peróxido de hidrogénio estável ao ar que tem um potencial de redução maior. O potencial de redução maior atrasa qualquer mudança de cor detectável pelo cromogénio até que o primeiro redutor de peróxido de hidrogénio estável ao ar tenha sido consumido. Deste modo não resulta mudança de cor se o peróxido de hidrogénio a ser medido for inferior a um nível pré-determinado correspondente à concentração do redutor de peróxido estável ao ar. Como resultado, o sistema mede a concentração quantitativamente, independente da intensidade da mudança de cor.

Ismail et al., Pat. U.S. N2 4 649 122, publicada em 10 de Março de 1987, descrevem um dispositivo de teste de viabilidade que confirma a viabilidade de uma composição de teste para determinar a concentração de um analito. A viabilidade é medida humedecendo o dispositivo. Quando humedecido com água, o teste muda de cor ou sofre alguma outra mudança para confirmar ao utilizador que a tira é viável.

White-Stevens e Stover, Clin. Chem. 28, 4, 589-595 (1982), discutem a interferência que pode ser causada pelo ácido ascórbico em testes de diagnóstico. O ácido ascórbico provoca um desfasamento no desenvolvimento da cor de testes baseados na utilização de indicadores de peroxidase e redox. A EP 735 369, publicada em 2 de Outubro de 1996, depois da data de prioridade deste pedido, descreve um cronómetro químico para uma tira de teste reagente de leitura directa para medir a concentração de qualquer analito num fluido biológico que é 3

aplicado na tira. 0 cronómetro compreende um revestimento seco de uma composição de indicador, um reagente que quando hidratado é capaz de reagir com glucose para mudar a cor do indicador, um inibidor para inibir a mudança de cor do indicador e glucose. As concentrações de inibidor e de glucose no revestimento seco são seleccionadas de modo a que a glucose reage com o reagente para mudar a cor do indicador durante período de tempo pré-determinado após a aplicação do fluido biológico na tira. A EP 759 555, publicada em 26 de Fevereiro de 1997, depois da data de prioridade deste pedido, descreve uma tira de teste reagente multicamadas para medir a concentração de um analito numa amostra de fluido biológico que é aplicado na tira. A amostra é guiada até várias áreas de doseamento dispostas ao longo da tira, onde o analito pode reagir com um reagente para provocar a mudança de cor. Cada área de doseamento inclui também um inibidor para a reacção de mudança de cor. A concentração do inibidor aumenta em áreas de doseamento sucessivas e portanto o número de áreas que mudam de cor é uma medida da concentração do analito.

Quer o teste seja realizado em casa, no consultório médico, clínica ou hospital, a exactidão e a reprodutibilidade da determinação de glucose são extremamente importantes. No caso de uma tira reagente indicadora de cor, é desejável que a mudança de cor seja acentuada e insensível a variações em compostos contidos no fluido biológico que não a glucose. No caso de uma tira reagente de leitura visual, é especialmente importante que os diabéticos, que podem estar a sofrer de visão deteriorada, tenham um reagente de teste que apresenta uma mudança significativa de cor dependente da concentração de glucose, embora a mudança de cor tal como apresentada por uma mudança de absorvância a um dado comprimento de onda também seja importante para a exactidão de tiras lidas com um medidor. 4

Uma vez que a mudança de cor envolve uma série de reacções químicas, não acontece instantaneamente. Assim, o utilizador tem de esperar durante um período de tempo - tipicamente um minuto ou menos - para que as reacções ocorram. Quando um medidor lê a tira, circuitos do cronómetro podem emitir vim sinal que indica que as reacções estão completas. No entanto, quando uma tira é lida visualmente, sem um medidor, o utilizador pode subestimar o tempo necessário, ler a tira prematuramente, e obter um resultado incorrecto. Alternativamente, o utilizador pode sentir a necessidade de esperar vim tempo excessivo antes de ler a tira, para se assegurar de que a reacção está completa, provocando um atraso desnecessário e a insatisfação do utilizador. Há por isso uma necessidade para de um cronómetro "químico"; i.e., de um elemento na tira que mudará de cor independentemente da concentração de glucose (ou de outro analito de interesse) na amostra, mas só o fará após ter passado tempo suficiente para completar as reacções formadoras de cor com a amostra.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, um cronómetro químico para uma tira de teste visual para medição da concentração de um analito num fluido biológico possibilita a vim utilizador da tira de teste assegurar-se de que ele ou ela esperou tempo suficiente para obter uma leitura adequada, sem necessidade de o utilizador esperar um tempo excessivamente longo. 0 cronómetro compreende um revestimento seco de a) uma composição de indicador corado; b) um reagente contendo uma enzima que, quando hidratado, é capaz de reagir com glucose para mudar a cor do indicador, c) um inibidor para inibir a mudança na cor do indicador; d) glucose, e 5

e) uma aldose que não reage substancialmente com a enzima no reagente, em que as concentrações de inibidor e de glucose no revestimento seco são seleccionadas de modo que a glucose, durante um período de tempo pré-determinado depois da aplicação da amostra do fluido biológico na tira, reage com o reagente para mudar a cor do indicador. Com a referência ao indicador como "corado", não significa que não é branco; de facto numa forma de realização preferida, branco é a cor do indicador antes da hidratação.

Noutra forma de realização desta invenção, um método para a preparação de um cronómetro para uma tira de teste visual para medição da concentração de um analito num fluido biológico que é aplicado na tira compreende os passos de a) revestimento de uma membrana porosa com uma solução de um reagente contendo uma enzima que, quando hidratado, é capaz de reagir com glucose para formar um produto de reacção; b) secagem do revestimento para formar uma primeira camada, e c) aplicação sobre a primeira camada de uma segunda camada que contém (i) vim indicador que pode reagir com o produto de reacção para provocar uma mudança de cor, (ii) um inibidor para inibir a mudança de cor do indicador, (iii) glucose, e (iv) uma aldose que não reage substancialmente com a enzima no reagente. A frase "não reage substancialmente com a enzima no reagente", quando utilizada nesta especificação e reivindicações, significa reagir relativamente muito menos com a 6

enzima do que a glucose; i.e., menos do que cerca de 10% da reactividade da glucose. A tira é do tipo que fornece uma indicação visível da concentração de um analito que está contido num fluido biológico aplicado no "lado da amostra" da tira. A indicação visível aparece no lado oposto (ou "do teste") da tira. Geralmente há uma demora entre o tempo no qual a amostra do fluido é aplicada no lado da amostra e aquele em que aparece no lado do teste uma indicação visível correspondente - tipicamente, uma mudança de cor. Assim, a menos que o utilizador espere durante pelo menos um intervalo de tempo mínimo antes de fazer uma leitura, a leitura pode dar um valor incorrecto. Além disso, o tempo de espera mínimo apropriado pode ser afectado por mudanças de ambiente ou da química da tira, por exemplo temperatura do ambiente ou efeitos de envelhecimento. O cronómetro químico da presente invenção fornece ao utilizador uma indicação visível quando transcorreu tempo suficiente desde que a amostra de fluido foi aplicada na tira. A composição química da tira de teste depende, naturalmente, do analito/fluido biológico a ser medido. As tiras de teste podem ser concebidas para detectar analitos tais como glucose ou outros açúcares, álcool, colesterol, proteínas, cetonas, ácido úrico, fenilalanina, ou enzimas em fluidos biológicos tais como sangue, urina, e saliva, bem como água. Um cronómetro químico para uma tira de teste reagente seria geralmente, mas não necessariamente, adaptada para responder à mesma combinação de analito/fluido biológico que a própria tira de teste reagente. Por exemplo, se uma tira de teste for concebida para medir álcool em sangue inteiro, pode não ser prático carregar um cronómetro químico com álcool e um inibidor de uma reacção formadora de cor entre o álcool e o reagente da tira. Neste caso, o cronómetro poderia incluir glucose, um reagente para reagir com glucose para formar uma cor distinguível, e um inibidor daquela reacção. Quando o sangue é 7

adicionado à tira, o cronómetro será hidratado e mudará de cor depois de um intervalo de tempo cuja duração depende da concentração de inibidor. É claro que, para um "cronómetro de glucose" ser adequado para utilização numa "tira para álcool", é essencial que o tempo para a reacção da glucose possa ser ajustado ao que for apropriado para a tira para álcool. No interesse da conveniência e da brevidade, o cronómetro e as tiras de testes reagente descritas com mais pormenor nesta especificação detectam glucose no sangue. Uma pessoa com conhecimentos correntes na arte poderia prontamente adaptar a informação desta descrição para a detecção de outras combinações analito/fluido biológico.

Uma tira indicadora da presente invenção proporciona uma determinação relativamente simples e rápida da concentração de glucose no sangue. A tira compreende uma matriz porosa tendo um lado da amostra e um lado de teste. A matriz é geralmente uma membrana e os dois termos são utilizados de modo intermutável na presente especificação e nas reivindicações anexas. Um reagente de teste é aplicado na matriz e, em maior ou menor grau, é impregnado nos poros da matriz. Para simplificar, descreve-se o reagente sobre a matriz como um "revestimento", nesta especificação e nas reivindicações anexas, reconhecendo-se que o revestimento reagente penetra naa matriz até um certo ponto. A matriz está adaptada para aceitar uma amostra não-medida de sangue inteiro, contendo glóbulos vermelhos e glucose, aplicados no lado da amostra. A porosidade da matriz permite que o fluido passe do lado da amostra para o lado de teste, por exemplo por acção capilar. Deste modo, o reagente de teste pode reagir com a glucose do sangue para provocar uma mudança de cor no lado de teste ou próximo dele. Uma vez que os glóbulos vermelhos fortemente corados podem tornar mais difícil detectar a mudança de cor, a matriz pode ter poros com tamanhas graduados desde poros grandes no lado da amostra até poros mais pequenos no lado de teste, a fim de reter as células vermelhas afastadas do lado de teste. Pode utilizar-se uma variedade de materiais para os 8

vários componentes da tira indicadora e cronómetro desta invenção. Alguns destes materiais estão descritos na Pat. U.S. N2 5 306 623, publicada em 26 de Abril de 1994, de Kiser et al., e aqui dada como incorporada por citação. O reagente de teste compreende um componente para converter a glucose em peróxido de hidrogénio, tal como glucose oxidase, e um ou mais componentes para detectar o peróxido de hidrogénio produzido a partir da glucose presente na amostra. Os componentes para detectar o peróxido de hidrogénio podem ser uma peroxidase, preferencialmente uma peroxidase de rábano, conjuntamente com um "indicador" que muda de cor durante o decurso da reacção. 0 indicador pode ser um corante oxidável ou um par corante. A peroxidase catalisa a oxidação do indicador na presença de peróxido de hidrogénio. O elemento final do revestimento da tira de teste reagente é um inibidor que retarda a oxidação que muda a cor do indicador.

Na forma de realização preferida, a tira indicadora é segmentada ao longo do seu comprimento de tal modo que segmentos adjacentes têm equilíbrios indicador/inibidor variados. Designa-se esses segmentos por "segmentos de resultados". Um determinado segmento de resultados só muda de cor se e quando estiver presente glucose suficiente para em primeiro lugar fazer com que todo o inibidor seja consumido e para depois oxidar o indicador e assim provocar a mudança de cor característica. Deste modo, uma mudança de cor num segmento de resultados particular evidencia uma concentração no limiar de glucose na amostra de sangue original. Ao longo da tira, numa determinada direcção, cada segmento de resultados sucessivo tem um equilíbrio inibidor/indicador que corresponde a um aumento escalonado da concentração no limiar de glucose. Isto pode ser realizado, por exemplo, se a concentração do indicador for a mesma para todos os segmentos e cada segmento sucessivo tiver uma concentração escalonada de inibidor maior do que a anterior. Evidentemente, também são possíveis outros equilíbrios inibidor/indicador. 9

Se os segmentos de resultados tiverem concentrações de indicador/inibidor na gama apropriada para uma determinada amostra de teste, os segmentos adjacentes reagem com o analito de tal modo que um segmento de resultados é corado e um adjacente não é. Esse resultado indica que a concentração de glucose na amostra é pelo menos igual à concentração no limiar necessária para mudar a cor de um semento, mas não tão grande quanto necessário para mudar a cor do segmento adjacente. 0 elemento de revestimento do cronómetro compreende os elementos da tira indicadora - uma matriz porosa revestida com um reagente de teste - e além disso, glucose. Preferencialmente a glucose está presente no cronómetro numa quantidade em grande excesso relativamente àquela que é necessária para superar o inibidor. Nesse caso, o tempo necessário para a mudança de cor (depois de a amostra hidratar o revestimento do cronómetro) é mais longo ou mais curto dependendo de se está presente mais ou menos inibidor. As mudanças de cor na tira e no cronómetro podem ser observadas tanto directamente a olho nú ou com um instrumento óptico que detecta alterações de reflectância.

Idealmente, a química reagente é inteiramente estável no estado seco e não é activada pela glucose no elemento de revestimento do cronómetro. Tal como descrito acima, no entanto, o cronómetro não é inteiramente estável, mesmo quando é mantido num estado seco. Pelo contrário, os compostos estáveis formam-se entre a glucose no cronómetro e proteínas de baixo peso molecular e também, talvez, entre a glucose e as enzimas do revestimento. Para evitar o consumo de glucose pelas reacções de glicosilação acima referidas, pode adicionar-se um estabilizador. 0 estabilizador glicosila mais eficazmente do que a glucose, mas não reage com glucose oxidase. O tempo necessário para surgir a indicação do cronómetro é afectado por parâmetros da tira que analogamente afectam o tempo necessário para que surja uma indicação visível da concentração 10

de glucose. Assim, se uma temperatura ambiente baixa ou o envelhecimento dos componentes da tira prolongam o tempo necessário para uma medição válida da concentração de glucose também aumenta o tempo para a indicação do cronómetro químico. Finalmente, se o manuseamento inadequado da tira - por exemplo exposição à humidade - fizer com que a mudança de cor que marca o termo da reacção química da reacção do cronómetro ocorra antes de uma tira ser utilizada, o utilizador é alertado para o facto de que a tira se tornou inexacta e saberá que não deve utilizá-la.

Breve Descricão dos Desenhos A FIG. 1 é uma vista em perspectiva da matriz de uma tira de teste reagente de leitura directa da presente invenção. A FIG. 2 é uma vista plana do lado de teste de uma tira de teste reagente de leitura directa da presente invenção. A FIG. 3 é uma vista plana do lado da amostra da tira da FIG. 2.

Descricão Pormenorizada da Invenção

Um cronómetro da presente invenção mede quimicamente um intervalo de tempo pré-determinado. Está particularmente adaptado para inclusão numa tira de teste visual para medição da concentração de um analito num fluido biológico. Essa tira de teste compreende uma matriz porosa que incorpora um reagente de teste que sofre uma mudança de cor em resposta ao analito numa amostra de um fluido biológico que é aplicado na tira. A matriz pode ter uma composição uniforme ou pode ser um substrato revestido e tanto pode ser isotrópica como anisotrópica. Possui um lado da amostra, em que é aplicada a amostra, e um lado de teste, onde é observada a mudança de cor. 11

Preferencialmente, a matriz é uma membrana anisotrópica; mais preferencialmente, uma membrana anisotrópica com uma gama larga de tamanhos de poro. Por exemplo, um gradiente de tamanhos de poro desde cerca de 0,1 micrometros até cerca de 150 micrometros pode estender-se através da matriz. Na extremidade com poros grandes, o tamanho de poro está mais preferencialmente na gama desde cerca de 30 micrometros até cerca de 40 micrometros. Na extremidade da matriz onde os poros são mais pequenos, o espaço vazio é relativamente pequeno, e o material da membrana é geralmente bastante denso, numa camada que pode constituir até 10%-20% da espessura da membrana. Nesta camada, o tamanho de poro está preferencialmente na gama desde cerca de 0,1 até cerca de 0,8 micrometros, com um tamanho de poro normal preferencialmente de cerca de 0,3 micrometros. Quando o fluido biológico é aplicado no lado da amostra, a amostra encontra poros cada vez mais pequenos à medida que penetra na membrana. Eventualmente, sólidos como glóbulos vermelhos do sangue atingem uma posição na membrana em que não podem penetrar mais. O restante da amostra, contendo ainda a glucose dissolvida, atravessa para o lado de teste. A natureza anisotrópica da membrana e/ou a utilização de um componente de separação (discutido adiante) na matriz permite caudais relativamente rápidos através da membrana, mesmo enquanto ocorre a filtração dos sólidos. À medida que a amostra passa através da matriz, a reacção com o reagente faz com que um corante que absorve luz seja formado ou decomposto no volume vazio próximo do lado de teste, afectando assim a reflectância da matriz.

As polissulfonas e poliamidas (nylons) são exemplos de materiais adequados para a matriz. Também podem ser utilizados outros polímeros com propriedades comparáveis. Os polímeros podem ser modificados para introduzir outros grupos funcionais que proporcionam estruturas carregadas, de modo que as 12

superfícies da matriz podem ser neutras, positivas, ou negativas.

Um método preferido para a preparação do material poroso que forma a matriz é moldar o polímero sem um núcleo de apoio. Esta matriz é, por exemplo, a membrana de polissulfona anisotrópica disponível de Memtec, Inc., Timonium, MD. É geralmente utilizada uma matriz com uma espessura de menos do cerca de 200 micrometros de espessura, sendo preferida com cerca de 1 5 até 155 micrometros. É mais preferida uma espessura de cerca de 130 até 140 micrometros, particularmente quando a matriz é de nylon ou de polissulfona anisotrópica. A matriz pode opcionalmente ser ligada a um suporte para lhe conferir forma física e rigidez, embora isto não seja essencial. Preferencialmente, o suporte é obtido colocando a matriz entre folhas termoplásticas. A folha no lado da amostra inclui uma abertura através da qual pode ser introduzida uma amostra. A folha no lado de teste permite que seja observada a cor do lado de teste da matriz. A membrana pode ser tratada com reagente de teste mergulhando-a numa mistura de componentes, saturando assim a matriz de membrana. O excesso de reagente pode ser removido por meios mecânicos tais como, por exemplo, uma lâmina ou vareta de vidro. A membrana é então seca. 0 reagente de teste compreende (i) um componente para converter glucose em peróxido de hidrogénio, (ii) um componente para detectar peróxido de hidrogénio, e (iii) um componente para inibir o componente que detecta o peróxido de hidrogénio. O reagente pode opcionalmente compreender ainda um componente de separação que faz com que os sólidos, como os glóbulos vermelhos do sangue, fiquem ligados ou retidos na matriz, efectivamente removendo os sólidos do fluido biológico. Também podem ser incluídos componentes adicionais tal como aqui descrito adiante e nos Exemplos. 13

Os componentes preferidos para a conversão de glucose em peróxido de hidrogénio incluem glucose oxidase, uma enzima que é geralmente obtida de Aspergillus niger ou de Penicillium. A glucose oxidase reage com glucose e oxigénio para produzir gluconolactona e peróxido de hidrogénio. A concentração óptima de glucose oxidase depende da composição do sistema indicador. Por exemplo, se o sistema indicador for MBTHSB-ANS (que está descrito adiante), então é adequada glucose oxidase na gama desde cerca de 500-10.000 U/mL, mais preferencialmente desde cerca de 700-2000 U/mL, e mais preferencialmente ainda cerca de 1000 U/mL. Geralmente, concentrações mais elevadas de glucose oxidase fazem com que a reacção decorra mais rapidamente e inversamente. 0 peróxido de hidrogénio assim produzido reage com o componente para a detecção de peróxido de hidrogénio, que compreende uma peroxidase que catalisa selectivamente uma reacção entre o peróxido de hidrogénio e um indicador. A peroxidase utiliza o peróxido de hidrogénio como um oxidante que é capaz de retirar átomos de hidrogénio de vários substratos. Uma peroxidase adequada pode conter ferriprotoporfirina, uma hemina vermelha obtida de plantas. As peroxidases obtidas de animais, por exemplo da glândula tiróide de animais, também são adequadas. A peroxidase de rábano (HRPO) é especialmente preferida como um constituinte do componente para detecção de peróxido de hidrogénio. O peróxido de hidrogénio, preferencialmente catalisado por uma peroxidase, reage quer directamente quer indirectamente para formar ou decompor um corante indicador que absorve luz numa gama pré-determinada de comprimentos de onda. Preferencialmente, o corante indicador absorve fortemente num comprimento de onda diferente daquele em que o reagente de teste absorve fortemente. A forma oxidada do indicador pode ser o produto final corado, de fracamente corado, ou incolor que evidencia uma mudança de cor no lado de teste da matriz. Quer isto dizer, o reagente de teste 14

pode indicar a presença de analito numa amostra pela descoloração de uma área corada ou, alternativamente, pelo desenvolvimento de cor numa área incolor.

Os indicadores que são úteis na presente invenção incluem (a) cloridrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH) combinado com ácido 3,3-dimetilaminobenzóico (DMAB); (b) MBTH combinado com ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzeno-sulfónico (DCHBS); (c) 4-aminoantipireno (4-AAP) e ácido 5-oxo-l-(p-sulfofenil)-2-pirazolino-3-carboxílico (OPSP); (d) 4-APP e N-(m-tolil)-dietanolamina (NDA); (e) ácido 2,2'-azino-di(3 -etilbenzotiazolino) sulfónico (ABTS); (f) 4-AAP e 4-metoxinaftol; (g) vermelho de pirogalhol (PGR); (h) vermelho de bromopirogalhol (BPR); (i) verde ácido 25 (AG); ou (j) [3-metil-2-benzotiazolinono hidrazono]N-sulfonil benzenossulfonato monossódico (MBTHSB), combinado com ácido 8-anilino-l-naftaleno sulfónico de amónio (ANS). É preferido MBTHSB-ANS. Informações adicionais relativas a MBTHSB-ANS surgem Pedido PCT co-pendente N2 de Série US95/12091, depositado em 7 de Setembro de 1995 e aqui dado como incorporado por citação. 0 componente inibidor retarda a reacção entre o peróxido de hidrogénio e o corante ou o precursor do corante, por exemplo por redução do peróxido de hidrogénio ou por redução do corante oxidado. Em princípio há dois modos diferentes de actuação para um inibidor. Em primeiro lugar, o inibidor poderia competir com o indicador e assim tornar mais lenta a velocidade à qual ocorre a mudança de cor no indicador. Alternativamente, o inibidor poderia ser não-competitivo, de modo que substancialmente todo o inibidor é consumido antes que ocorra qualquer alteração substancial de cor no indicador. Preferencialmente, inibidores da presente invenção actuam por este último mecanismo.

Entre a gama de inibidores adequados estão o ácido 2,3,4-trihidroxibenzóico; galhato de propilo; ácido 3,4-dihidroxi cinâmico; 3,4-dihidroxi benzaldeído; ácido gálhico; 5,6- 15

diaminouracilo; ácido ascórbico; e ácido isoascórbico. É preferido o ácido ascórbico; no entanto, o ácido ascórbico oxida em solução aquosa. Para reduzir a oxidação, pode utilizar-se outros solventes. Os solventes preferidos são álcoois primários, como tais como álcool etílico, metílico, ou isopropílico. É preferido o álcool etílico, principalmente soluções concentradas; i.e., soluções de etanol a 50% ou mais.

Embora a membrana anisotrópica que é a matriz preferida filtre os glóbulos vermelhos do sangue e os mantém afastados do lado de teste, opcionalmente o reagente de teste também pode conter um componente de separação. 0 componente de separação deve ser capaz de produzir um fluido relativamente incolor e límpido a partir do fluido que contém os glóbulos vermelhos do sangue, e.g., sangue integral, por sequestração dos glóbulos vermelhos do sangue na matriz. Componentes de separação para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a polietileno glicol, poli (éter metilvinílico/anidrido maleico), polipropileno glicol, ácido poliestireno sulfónico, ácido poliacrílico, álcool polivinílico, e ácido polivinil sulfónico a um pH de entre cerca de 4,0-8,0. Estes componentes de separação estão presentes na matriz em quantidades que variarão dependendo da sua carga e peso molecular, dos outros componentes incrustados na matriz, do pH da matriz e do tamanho de poro, e daa humidade residual da matriz depois da secagem. Estes parâmetros são prontamente determináveis por um especialista na matéria. Por exemplo, o polipropileno glicol é utilizado como o componente de separação (e.g., PPG-410 da BASF, Wyandotte, MI), está preferencialmente presente a cerca de 2-30% em peso por volume (p/v), e mais preferencialmente 8-10% p/v. Também podem ser utilizados outros componentes de separação numa concentração de cerca de 2-30% p/v. Os componentes de separação poliméricos podem estar impregnados ou incrustados na matriz. Alguns sais solúveis em água também podem efectuar essa separação. Entre os sais adequados para separação de componentes do sangue encontram-se citratos, formatos, e sulfatos, bem como certos 16

ácidos tais como amino ácidos, ácido cítrico, ácido fítico, e ácido málico. (Ver, e.g., Pat. U.S. 3 552 928, publicada em 5 de Janeiro de 1971, de M. C. Fetter). Uma vantagem da inclusão do componente de separação é que com sólidos tais como glóbulos vermelhos do sangue substancialmente removidos do fluido biológico, há menos cor de fundo no sítio de teste para obscurecer uma mudançade cor produzida pelo reagente de teste.

Podem ser incrustados na matriz outros componentes para acentuar a coloração e a capacidade de leitura das tiras reagentes e para conservar a uniformidade e integridade da matriz. Por exemplo, o reagente de teste pode incluir sais e/ou tampões para auxiliar na separação do corante na matriz. Esses tampões podem conter, por exemplo, ácido cítrico, presente em solução a desde cerca de 0,01 M até cerca de 1,0 M, e preferencialmente a cerca de 0,1 M. Também podem ser utilizados outros tampões ácidos.

Também podem ser utilizados compostos que tornam a matriz hidrófila ou compostos que podem actuar como estabilizadores, tais como proteínas hidrolizadas. Esses compostos incluem mas não se limitam a por exemplo, albumina do soro bovino, polipéptidos e a proteína de baixo peso molecular disponível como CROTEIN SPA (CRODA, Inc. Nova Iorque, N.Y.) . Esses compostos são utilizados em concentrações de por exemplo cerca de 1,0 mg/mL até cerca de 100,0 mg/mL. No caso do CROTEIN, é preferido cerca de 20 mg/mL.

Também podem ser incluídos no revestimento para a matriz outros estabilizadores e conservantes. Por exemplo pode utilizar-se ácido etileno diamino tetraacético (EDTA), ácido dietileno triamino pentacético (DTPA) e compostos relacionados, por exemplo, em concentrações de cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 10,0 mg/ mL. Entre as finalidades dos conservantes está auxiliar a estabilizar o inibidor. 17

Alguns dos indicadores (e.g., BPR) têm uma tendência indesejável para migrar na matriz. Quando se utiliza um desses indicadores, é incluído um agente de par iónico para impedir essa migração. Por exemplo, os derivados de polietileno glicol disponíveis comercialmente como POLYQUART (H) (Henkel, Inc. , Ambler, PA) são particularmente úteis pela sua aptidão para facilitar o emparelhamento iónico entre o indicador e outros substituintes da matriz.

Quando a presença de um analito é indicada por formação de cor (por exemplo, MBTHSB-ANS), pode adicionar-se tensoactivos para avivar a cor e acenturar o contraste com a área circundante.

Também se pode utilizar solventes orgânicos na prática desta invenção e podem ser incluídos na formulação do reagente de teste para a matriz, desde que, é claro, sejam compatíveis com a matriz e com as composições do reagente de teste. Solventes orgânicos potencialmente adequados incluem clorofórmio, acetona, álcoois, cloreto de metileno, éter dietílico e éteres de petróleo, acetonitrilos, e suas misturas. Na prática da presente invenção, é particularmente preferido 70% de etanol em água. 0 reagente de teste que é revestido sobre a matriz ou nela impregnado não é uniforme sobre a superfície da tira de teste. Em vez disso, o reagente é preferencialmente aplicado na matriz numa série de faixas paralelas, ou "segmentos de resultados", em que a composição em segmentos de resultados adjacentes aumenta, de forma escalonada, na concentração de inibidor. Assim, cada segmento subsequente necessita, de forma escalonada, de uma concentração maior de glucose na amostra para fazer com que o segmento mude de cor. O segmento do cronómetro da matriz é revestido ou impregnado com uma composição que consiste no reagente de teste 18

e, além disso, glucose e uma aldose que não reage com a enzima no reagente. A glucose é adicionada de modo. que o segmento do cronómetro mude de cor, ao longo do tempo, quando é hidratado pela adição de uma amostra aquosa à tira. A aldose é adicionada para estabilizar o segmento de cronómetro. Embora não se pretenda ficar ligado a qualquer teoria em particular, crê-se que a necessidade de aldose resulta do facto de muitos monossacáridos formarem complexos covalentes estáveis com os grupos amino de proteínas. Assim, uma parte da glucose no cronómetro poderia reagir com as proteínas de baixo peso molecular e, possivelmente, com enzimas no reagente de teste para formar complexos. Este processo ("glicosilação") decorre não-enzimaticamente em dois passos. 0 primeiro passo, que é prontamente reversível, é a formação de uma base de Schiff; uma aldimina no caso de açúcares aldose. Com o tempo esta desloca-se para uma forma de uma cetoamina, que é altamente estável, numa reacção irreversível.

Para evitar o consumo de glucose no processo de glicosilação, que se crê ocorrer no cronómetro, utiliza-se como estabilizador um açúcar que é um glicosilador mais eficaz e que compete com a glucose com sucesso para os grupos amino das proteínas. Por razões evidentes, também é necessário utilizar um açúcar que não reaja com a glucose oxidase.

Bunn e Higgins, Science 213, 222 (10 de Julho de 1981), verificaram que a eficácia de glicosilação de monossacáridos está relacionada com a proporção do açúcar na solução que está na configuração de aldeído de cadeia linear. A Tabela 1, adaptada do seu artigo, apresenta uma lista de níveis de reactividade com hemoglobina, k, de diversas aldoses, todas elas não-reactivas com glucose oxidase. Em princípio, o valor de k deveria ser tão mais elevado possível e, em qualquer caso, mais elevado do que o da glucose. Na prática, o estabilizador tem de reagir mais prontamente do que a glucose com as unidades que de outra forma reagiriam com a glucose e a consumiriam. Assim, deve 19

estar presente suficiente estabilizador para reagir com todas estas unidades (i.e., o estabilizador pelo menos equimolar com as unidades). Preferencialmente, é adicionado excesso de estabilizador, principalmente se o seu k é apenas ligeiramente mais elevado do que o da glucose. Neste caso, não há consumo apreciável de glucose. De acordo com o critério acima referido, determinou-se que a manose e a lactose são serem estabilizadores adequados. Por serem económicas e prontamente disponíveis, são preferidas.

Tabela 1

Aldose _Nível de Reactividade (k) D-Glucose 0,60 D-Manose 3,2 6-Desoxi-L-manose (fucose) 0,7 D-Alose 1,4 D-Galactose 2,8 D-Xilose 2,9 D-Talose 5,2 D-Altrose 5,0 D-Ribose 10,0 D-Idose 55 5,6-Di-O-metil-D-glucose 104 0 objectivo do reagente de teste é alterar a cor em resposta à glucose. Assim, a combinação de glucose e do reagente no cronómetro sem provocar a alteração de cor requer algum cuidado. Tem de estar presente uma quantidade de inibidor para além do que é necessário para funcionamento do cronómetro para compensar por este efeito. A velocidade à qual é seco o segmento de cronómetro, depois de ter sido aplicada a solução que contém glucose, é controlada. Na prática, a membrana é primeiramente revestida com uma solução contendo tampões e enzimas, e este revestimento é seco para formar uma primeira camada. Em seguida, a passagem de um segundo revestimento aplica uma solução 20

contendo indicador, inibidor, glucose, e uma aldose para formar uma segunda camada. Parâmetros tais como a velocidade da trama, temperatura do forno e caudal de ar, e quantidade de soluções de revestimento depositadas terão sido fixados antecipadamente e efectuados ajustes apropriados às concentrações de inibidor e/ou glucose. Em vez da segunda camada ser aplicada como um revestimento, uma alternativa, menos preferida, envolve a realização do segundo revestimento numa trama separada e em seguida a sua laminagem sobre a primeira camada.

Quando uma amostra é aplicada na tira, a hidratação da composição do segmento de cronómetro permite que decorra a reacção formadora de cor. 0 tempo que leva para que o segmento de cronómetro mude a cor é então determinado pela temperatura e pelas características do reagente de teste, principalmente a concentração de inibidor, a quantidade de glucose, e as velocidades de hidratação e de difusão de oxigénio. 0 tempo de mudança de cor do cronómetro pode ser feito de modo a depender da concentração de glucose na amostra ou, alternativamente, ser independente dessa concentração. Por incorporação de um grande excesso de glucose no cronómetro, o tempo é substancialmente independente da concentração de glucose na amostra. Por incorporação de menos glucose no cronómetro, o tempo pode ser tornado substancialmente dependente da glucose da cimostra; i.e., o cronómetro mudará de cor mais depressa se a concentração de glucose na amostra for maior. Preferencialmente, a concentração de glucose na solução de revestimento do cronómetro é superior a cerca de 1500 mg/dL, o que torna o cronómetro substancialmente independente da concentração de glucose da amostra na gama desejada desde cerca de 40-400 mg/dL bem como fora dessa gama. A composição do cronómetro deve então incluir pelo menos tanto, ou mais, inibidor do que o segmento de resultados que tem a concentração de inibidor mais elevada (que corresponde à leitura de glucose mais elevada). 21

0 cronómetro também desempenha uma importante função de controlo de qualidade, tornando evidente quando uma tira de teste foi contaminada pela exposição à humidade. A tira de teste tem permanecer seca até o momento de ser utilizada, uma vez que os componentes que convertem a glucose em peróxido de hidrogénio (geralmente enzimas) tendem a degradar-se por exposição à humidade. Assim, se a tira for prematuramente exposta à humidade, tornar-se-á falível. Porém, a infalibilidade da tira de teste não é evidente para um utilizador, que pode, portanto, utilizar essa tira e obter um resultado erróneo. No entanto, se a tira incluir um segmento de cronómetro, a exposição à humidade faz com que o cronómetro mude de cor, o que alerta o utilizador para o facto de a tira estar comprometida. A invenção será agora adicionalmente descrita com referência às Figuras. A FIG. 1 ilustra uma matriz 10 da presente invenção, para medir a quantidade de analito num fluido biológico. Embora ilustrada numa posição arqueada, a matriz 10 é flexível e está geralmente numa posição plana quando utilizada. A matriz inclui um lado da amostra 12, no qual é aplicado o fluido biológico, e um lado de teste 14, sobre o qual ou próximo do qual uma mudança de cor indica a presença do analito. A mudança de cor resulta da interacção do analito com o reagente impregnado nos poros 16. Preferencialmente, para medir a concentração de glucose no sangue, os tamanhos de poro são relativamente grandes próximo do lado da amostra 12 e diminuem de tamanho à medida que se aproximam do lado de teste 14. 0 gradiente de tamanhos de poro serve para reter os glóbulos vermelhos do sangue próximo do lado da amostra 12, de modo que a sua cor não interfira com a capacidade de observar a mudança de cor que indica a presença do analito.

Estão esquematicamente ilustrados quatro segmentos de resultados, a, b, c, e d. Cada segmento sucessivo tem mais inibidor do que o anterior, de forma escalonada. Assim, por exemplo, se uma amostra faz com que os segmentos a, b, e c mudem 22 /7

de cor, enquanto que d não muda (tal como ilustrado na FIG. 1), significa que a concentração de glucose naquela amostra é pelo menos tão elevada como a que é necessária para consumir o nível do inibidor do segmento c, mas não suficiente para superar o inibidor no segmento d. Uma vez calibrados os segmentos de resultados, aquele resultado dá uma medida quantitativa da concentração de glucose. 0 segmento t, o cronómetro, incorpora uma concentração elevada de glucose, além do reagente de teste impregnado nos segmentos de resultados. O inibidor no segmento t é pelo menos tão elevado quanto nos segmentos de resultados, e o tempo necessário para consumir o inibidor no segmento t é pelo menos tão elevado quanto o necessário para consumir o inibidor nos outros segmentos. Assim, quando o segmento t sofre uma mudança de cor (tal como ilustrado na FIG. 1) , decorreu tempo suficiente para provocar a mudança de cor em todos os segmentos de resultados cuja concentração de inibidor é suficientemente baixa para ser consumida pela concentração de glucose na amostra, e pode ser feita uma medição correcta sem mais delongas.

Numa tira de teste real, a matriz da membrana da FIG. 1 está colocada entre duas folhas de revestimento, que podem ser de qualquer película termoplástica adequada, bem conhecidas na arte. As FIGS. 2 e 3 são vistas planas do lado da amostra 22 e do lado de teste 24 de uma tira de teste 20, respectivamente. Em utilização, aplica-se uma amostra de sangue na abertura 26 no lado da amostra 22. A amostra espalha-se por acção capilar longitudinalmente na direcção da parte de cima e de baixo da tira e permeia a matriz na direcção do lado de teste 24. Aberturas de ventilação 28 opcionais facilitam a distribuição da amostra ao longo da tira. A aparência da amostra através de janela óptica transparente 30 confirma que foi fornecida amostra suficiente para uma medição. Os círculos de indicador no lado de teste 24 admitem oxigénio necessário para a reacção de formação de cor e estão rotulados para mostrar a concentração de glucose no sangue. À medida que o teste progride, os círculos de 23 indicador no lado de teste 24 mudam de cor sequencialmente se a concentração de glucose no sangue coincidir ou exceder a quantidade que corresponde a esse círculo. Assim, o resultado ilustrado na FIG. 3 indica que a concentração de glucose na amostra é pelo menos 12 0 mg/dL, mas inferior a 150 mg/dL. A leitura pode ser feita em qualquer altura depois de o círculo do cronómetro 32 mudar de cor. Note-se que nas FIGS. a mudança de cor provocada pela reacção com glucose é desde branco para corado. No entanto, o sistema poderia alternativamente operar com um corante indicador que é destruído pela oxidação induzida pela glucose, com uma mudança de cor correspondente de corado para branco.

Para uma melhor compreensão da presente invenção, os Exemplos a seguir ilustram adicionalmente várias formas de realização da invenção. Os Exemplos não pretendem ser limitativos.

EXEMPLO 1-INDICADOR DE BPR

Preparou-se a seguinte solução:

Agua destilada EDTA Na2 a 1% (p/p) 83,5 g Solução de Enzima 23,8 g 0,2 M de Ácido 27,0 g

Aconítico Ácido Aconítico NaOH (sólido)

CROTEIN SPA

Imidazole

Manitol SURFACTOL Q1 a 5% (p/p) Ajustar o pH a 4,80 Álcool Etílico PPG-410

Solução de Enzima 6.0 g Glucose Oxidase

2.2 g HRPO 4.2 g 0,6 g 3.0 g 3.0 g 40.0 g 5,6 g 28.0 g

165.000 U 340.000 U 24

Uma membrana Memtec BTSH 55 foi revestida por imersão nesta solução e o excesso foi retirado com varetas de vidro. A membrana revestida foi seca num secador de flutuação a 180F sob caudais de ar moderados de modo que a trama ficasse substancialmente seca dentro de 20 segundos. A trama foi canelada em preparação para o segundo revestimento, descrito a seguir.

Preparou-se as seguintes soluções:

Solução-mãe de Ascorbato Diluente (inibidor) Água Destilada 190 g 370 g EDTA Na2 a 1% 55 g 107 g BPR 0,36 g 0,71 g POLYQUART® H 6 g 11,8 g PPG-410410 14,2 g 27,8 g Ácido Ascórbico 1,37 g - Álcool Etílico 243 g 477 g Solução do Cronómetro Diluente (de acordo com a fórmula acima) 120 g Ácido Ascórbico 0,885 g Solução de Glucose* 17,25 g * A Solução de Glucose é uma solução a 16.000 mg/dL de glucose em água deixada em mutarrotação durante 24 horas, guardada com refrigeração.

Foram feitas as seguinte diluições da solução-mãe: 0,0405:1, 0,108:1, 0,236:1, 0,369:1, 0,569:1, 1,260:1. Este aumento escalonado da concentração do inibidor corresponde à maior concentração de glucose do escalonamento que os círculos de resultados indicam. Estas soluções, juntamente com a solução do cronómetro, foram revestidas lado a lado no lado sobre os poros grandes da membrana carregada com enzima de modo a 25

-~7 depositar aproximadamente 1 χ 10-^ mL por milímetro quadrado de membrana. A membrana foi humedecida aproximadamente quinze segundos antes de ser submetida às mesmas condições de secagem descritas acima para o passo de revestimento com enzima. Os resultados mostraram o cronómetro reagiu em cerca de 70 segundos com cerca de 95% dos resultados entre 64 e 79 segundos.

EXEMPLO 2 - INDICADOR DE MBTHSB-ANS

Preparou-se a seguinte solução:

Água para HPLC 1500 mL Ácido Cítrico 16,92 Citrato de Sódio 20,88 Manitol 15 g EDTA Dissódico 1,26 g GANTREZ S95 6,75 Crotein SPA 36 g Glicose Oxidase 1,69 MU HRPO 1,5 MU CARBOPOL 910* 75 mL Citrato Dissódico** 225 mL * Solução em Acetonitrilo a 11% ** 0,1M, pH 5,0

Uma membrana Memtec BTS 30 foi revestida numa cuba de modo que a superfície de poros grandes contactasse com a solução de revestimento; o excesso de solução foi removido com varetas de vidro como anteriormente. A membrana foi seca e canelada tal como no Exemplo 1. Foram feitas as seguintes soluções: 26

-~7

Solução A Solução B (Indicador) (Agente Molhante) Etanol a 70% (v/v) 2819 mL MAPHOS®A 41 g MBTHSB 2,98 g Etanol a 70% (v/v) 205 mL (NH4) ANS 25,83 g Solução B 205 mL DTPA a 2% 51,25 g Solução C Solução D (Base de Ascorbato) (Cronómetro) Água 115 mL Água 53 mL Ácido Ascórbico 4,58 g Ácido Ascórbico 8,75 g Etanol 267 mL Etanol 123 mL

Levar ο volume a 175 mL com EtOH a 70%

Solução de Glucose 40,5 mL

Para cada solução de inibidor, o volume da Solução A foi fixado em 263 mL. Para os vários círculos de resultado, a proporção de 70% de EtOH:Solução C foi variada desde 58,9 até 0,200 de modo que o volume de 70% de EtOH + Solução C adicionado à Solução A foi de 87,5 mL para todas as soluções de inibidor. Isto efectivamente alterou apenas a concentração de inibidor em cada solução. As soluções contendo a concentração de inibidor aumentada de forma escalonada e a solução do cronómetro (Solução D) foram revestidas lado a lado sobre o lado dos poros grandes da membrana. A velocidade de deposição foi ajustada para atingir ~8 X 10"5 mL de inibidor por milímetro quadrado de membrana. A membrana foi seca tal como acima, excepto que a demora entre o revestimento e a secagem foi de cerca de 1,6 minutos. Os resultados mostraram o cronómetro regiu em cerca de 60 segundos com pouco efeito de hematócrito sanguíneo desde 30 até 55% ou de glucose desde 78 até 420 mg/dL. 27 EXEMPLO 3

ESTABILIDADE ACRESCIDA DO CRONÓMETRO

Uma membrana de polissulfona anisotrópica, Memtec BTS-30, foi revestida com Reagente A. A membrana resultante foi seca num forno com circulação de ar mantido a 56°C durante 10 minutos. A membrana foi então revestida como Reagente B e foi seca nas condições acima referidas. À membrana foi então dada a forma de tiras para teste.

Reagente A

Peso (g) Água 3963 Ácido cítrico 45,12 Citrato trissódico 55,68 Manitol 40 EDTA 3,36 GANTREZ S95 18 CROTEIN SPA 57,72 Glucose oxidase (126 U/mg) 37,6 Peroxidase de rábano (410 U/mg) 12,25 CARBOPOL 910 em MeCN (0,55 mg/5 mL) 177,18 0,1 M de citrato dissódico 598,3

Reagente B 22.5 mL 2.5 mL 36,3 mg 472.5 mg

Solução de corante: Etanol Água MBTHSB (NH4)ANS

Soluções de glucose: (1) solução de 16.000 mg/dL de D-Glucose em água (2) solução de 16.000 mg/dL de D-Glucose + 16.000 mg/dL de Galactose em água 28

(3) solução de 16.000 Ribose em água mg/dL de D-Glucose + 16.000 mg/dL de (4) solução de 16.000 Manose em água mg/dL de D-Glucose + 16.000 mg/dL de

Glucose Glucose + Glucose + Glucose (Controlo) Galactose Ribose + Manose Solução de corante 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL Etanol 4,5 mL 4,5 mL 4,5 mL 4, 5 mL Água 0,06 mL 0,06 mL 0,06 mL 0,06 mL solução (1) 0,44 mL ___ ___ ___ solução (2) ___ 0,44 mL ___ ___ solução (3) ___ ___ 0,44 mL ___ solução (4)_ ___ ___ ___ 0,44 mL Ácido ascórbico 40 mg 40 mg 40 mg 40 mg

Dividiu-se tiras das quatro composições em dois grupos para armazenagem: • um grupo foi armazenado durante sete dias a 56°C - envelhecimento acelerado • o outro grupo foi armazenado durante sete dias a 5°C -controlo

Ao fim dos sete dias, as tiras foram testadas com sangue inteiro que continha 100 mg/dL de glucose, 42,5% de hematócrito.

As tiras "envelhecidas" que continham apenas glucose mostraram um tempo muito maior para desenvolver a coloração total ("Tempo Final da Reacção") do que as tiras "frescas" (i.e., armazenadas a 5°C) . As tiras que incluíam aldose mostraram uma extensão do tempo final da reacção significativamente menor. A Tabela 2 apresenta os resultados. 29

Tabela 2 Açúcar Diferença no Tempo Final da Reacção (56° vs. 5°C) Glucose (controlo) 28 segundos Galactose/Glucose 16 segundos Ribose/Glucose 14 segundos Manose/Glucose 12 segundos

Na especificação e Exemplos acima, surgem as seguintes marcas comerciais: CARBOPOL 910 polímero do ácido poliacrílico (B.F. Goodrich) CROTEIN SPA colagénio hidrolizado - PM 4000 (Croda Inc.) GRANTEZ 595 poli(éter metil vinílico/ácido maleico) (International Specialty Products) MAPHOS 60A ésteres fosfato orgânicos complexos (PPG Industries) POLYQUART H polietilenoglicol - 15 poliamina de sebo (Henkel Canada Ltd.) SURFACTOL Q1 óleo de rícino (CasChem, Inc.)

Será entendido pelos especialistas na matéria que a descrição e Exemplos anteriores são ilustrativas da prática da presente invenção mas não são de modo algum limitativos. Podem ser feitas variações dos pormenores aqui apresentados sem afastamento do âmbito e espírito da presente invenção.

isboa, 9 AGENTE OFICIAL

de Agosto de 2001 DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Cronómetro químico para uma tira de teste de leitura visual para medição da concentração de um analito num fluido biológico que é aplicado na tira, compreendendo o cronómetro um revestimento seco de: (a) uma composição indicadora de cor; (b) um reagente enzimático que, quando hidratado, é capaz de reagir com glucose para mudar a cor do indicador; (c) um inibidor para inibir a mudança de cor do indicador; (d) glucose, e (e) uma aldose que não reage substancialmente com a enzima no reagente.
2. 2. Cronómetro químico de acordo com a reivindicação 1 em que a aldose é manose ou galactose.
3. 3. Cronómetro químico de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que o reagente enzimático (b) preferencialmente contém uma enzima oxidase tal como glucose oxidase.
4. 4. Cronómetro químico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o analito é glucose.
5. 5. Cronómetro químico de acordo com a reivindicação 4, em que as concentrações de inibidor e de glucose no revestimento seco são seleccionadas de modo que a glucose, durante um período de tempo pré-determinado após a aplicação da amostra de fluido biológico na tira, reage com o reagente para mudar a cor do indicador. 1 /7

   Cronómetro químico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o inibidor compreende ácido ascórbico. Cronómetro químico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o inibidor é seleccionado do grupo que consiste em: (a) cloridrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH) combinado com ácido 3,3-dimetilaminobenzóico (DMAB) ; (b) MBTH combinado com ácido 3,5-dicloro-2- hidroxibenzeno-sulfónico (DCHBS); (c) 4-aminoantipireno (4-AAP) e ácido 5-oxo-l-(p-sulfofenil)-2-pirazolino-3-carboxílico (OPSP); (d) 4-AAP e N-(m-tolil)-dietanolamina (NDA); (e) ácido 2,2'-azino-di-(3-etilbenzotiazolino) sulfónico (ABTS); (f) 4-AAP e 4-metoxinaftol; (g) vermelho de pirogalhol (PGR); (h) vermelho de bromopirogalhol (BPR); (i) verde ácido 25 (AG); ou (j) [3-metil-2-benzotiazolinona-hidrazono]-N-sulfonil benzenossulfonato monossódico (MBTHSB), combinado com 8-anilino-l-naftaleno sulfónico de amónio (ANS), e preferencialmente é MBTHSB-ANS. Tira de teste de leitura visual, para medição da concentração de um analito num fluido biológico que é aplicado na referida tira, compreendendo o cronómetro químico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7. Método para a preparação do cronómetro químico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, que compreende os passos de: (1) revestimento de uma membrana porosa com uma solução do referido reagente (b) da reivindicação 1; 2 (2) secagem do revestimento para formar uma primeira camada; e (3) aplicação sobre a primeira camada de uma segunda camada que contém os restantes componentes do cronómetro químico listados na reivindicação 1. Lisboa, 9 de Agosto de 2001 C3\GENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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