PT808845E - Novos esteroides 1 ou 6-hidroxilados, processo para a sua preparacao, sua aplicacao como medicamento e composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NOVOS ESTERÓIDES 1 OU 6-HIDROXILADOS, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO, SUA APLICAÇÃO COMO MEDICAMENTOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM" A presente invenção tem por objecto novos compostos esteróides 1 ou 6-hidroxilados, o seu processo de preparação, a sua aplicação como medicamento e as composições farmacêuticas que os contêm. A invenção tem por objecto os compostos com a fórmula geral (I):

na qual: ou Ri é um átomo de hidrogénio e R2 é um radical ORe, ou Ri é um radical ORô e R2 é um átomo de hidrogénio, R6 representa um radical acilo tendo 1 a 12 átomos de carbono, eventualmente substituído por um ou mais átomos de halogénio, ou um átomo de hidrogénio, R3 é um radical alquilo tendo 1 a 12 átomos de carbono, R4 é um radical alquilo tendo 1 a 4 átomos de carbono, e R5, igual ou diferente de R6 tem os mesmos valores que R6, os traços ondulados indicam que R* ou R2 estão na posição α ou β e ORs está na posição 21R ou 21S. 1 r

Por composto com a fórmula geral (I), designam-se todos os isómeros possíveis tomados individualmente ou em mistura.

Por radical alquilo tendo 1 a 12 átomos de carbono, entendem-se os radicais seguintes: metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, 2-metilpentilo, 2,3-dimetilbutilo, n-heptilo, 2-metilhexilo, 2.2- dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 3-etilpentilo, n-octilo, 2.2- dimetilhexilo, 3,3-dimetilhexilo, 3-metil-3-etilpentilo, nonilo, 2,4-dimetilheptilo ou n-decilo.

Por radical alquilo tendo 1 a 4 átomos de carbono entendem--se os radicais metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo ou terc-butilo.

Por radical acilo tendo 1 a 12 átomos de carbono entendem--se os radicais seguintes: formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, valerilo, isovalerilo, succinilo, pivaloílo ou benzoilo.

Quando são substituídos por um átomo de halogénio, trata-se de preferência de um átomo de cloro ou de iodo ou de flúor. Podem citar-se os radicais cloroacetilo, dicloroacetilo, tricloroacetilo ou triflúoroacetilo.

Num primeiro grupo preferido, a invenção tem por objecto os compostos com a fórmula (I) tal como definida anteriormente na qual R3 e R4 são radicais metilo.

Num segundo grupo preferido a invenção tem por objecto tem por objectivo os compostos com a fórmula (I) tal como definido 2 1 anteriormente na qual Ri é um átomo de hidrogénio e R2 é um grupo hidroxilo.

Num terceiro grupo preferido, a invenção tem por objectivo os compostos com a fórmula (I) tal como definida anteriormente na qual Rx é um grupo hidroxilo e R2 é um átomo de hidrogénio.

Num quarto grupo preferido, a invenção tem por objecto os compostos com a fórmula (I) tal como definida anteriormente com os nomes seguintes: [17β- (S)]-l~hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona (produto A), [17(5- (S)]-6-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona (produto B), podendo estes compostos estar em quaisquer das suas configurações estereoisómeras 1α-0Η, 1β-ΟΗ, βα-ΟΗ, 6β-0Η, sós ou em mistura. A invenção tem igualmente por objecto um processo para a preparação de produtos com a fórmula (I). 0 processo de acordo com a invenção, para a preparação de compostos com a fórmula geral (I) é caracterizado por se efectuar uma bioconversão do composto com a fórmula geral (II) :

3 na qual R3, R4 e os traços ondulados têm as mesmas definições que as dadas anteriormente, com uma cultura de cogumelos filamentosos, e depois em caso de necessidade se proceder a uma separação dos produtos 1-hidroxilados e 6-hidroxilados e/ou a uma esterificação dos grupos hidroxilo livres.

Entre os cogumelos filamentosos conhecidos do especialista na matéria, escolheram-se especialmente os cogumelos seguintes:

Para a produção de 1 OH ou de 6 OH:

Aspergillus terreus MMP 2296 Cuninghamella baineri ATTC 9244 Cuninghamella elegans ATTC 26269 Cuninghamella elegans ATTC 36112 Mortierella isabellina NRRL 1757 Mortierella isabellina MMP 108 Rhizopus arrhizus ATCC 11145 Thamnostylum piriforme ATCC 8992 Fusarium roseum ATTC 14717

Para a produção preferencial de 1-OH:

Cuninghamella baineri ATTC 9244

Mortierella isabellina MMP 108

Para a produção preferencial de 6-OH:

Mortierella isabellina NRRL 1757

Fusarium roseum ATTC 14717

Origem das castas: ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, Md, USA. 4 r MMP: Mycothèque du Muséum d'Histoire Naturelle, Paris, NRRL: Northern Utilisation Research and Development

Division, Peoria, 111, USA. A realização da hidroxilação é feita de acordo com os métodos que se aplicam correntemente para a hidroxilação microbiológica dos esteróides com a ajuda de culturas de cogumelos (ref.: "Microbial conversions of steroids and alkaloids", H. Iizuka et A. Naito éditeurs, University of Tokyo Press, Springer Verlag, Berlin, 1981).

Assim, determina-se por via analítica, em particular por cromatografia em camada fina ou HPLC, nos ensaios prévios geralmente correntes, as condições de fermentação mais favoráveis, como por exemplo a escolha do meio nutritivo mais favorável, do solvente de substrato apropriado, da concentração do substrato, das condições técnicas como a temperatura, o arejamento, o pH, e os períodos óptimos para a germinação, a adição de substrato e o contacto do substrato com o microorganismo.

Pareceu vantajoso utilizar concentrações de aproximadamente 40 a 2000 mg de substrato por litro de meio nutritivo. Ajusta- -se o valor de pH de preferência para um valor da ordem de 5 a 7. A temperatura da cultura é da ordem de 20 a 40°C, de preferência de 25 a 35°C. Para o arejamento, utiliza-se aproximadamente 1 litro de ar por minuto por litro de caldo de cultura. A transformação do substrato é vantajosamente seguida por análise por cromatografia em camada fina de amostras extraídas ou por HPLC. Em geral após 24 a 144 horas formam-se quantidades suficientes de esteróide hidroxilado. 5

f 0 isolamento, a separação e a purificação dos produtos do processo fazem-se de uma forma conhecida. Por exemplo, podem extrair-se os produtos do processo com um solvente orgânico como o acetato de etilo, evaporar o extracto, separar e purificar os produtos por cromatografia sobre coluna. A invenção tem mais particularmente por objecto um processo tal como definido anteriormente, no qual os cogumelos filamentosos são escolhidos entre as castas seguintes: Cuninghamella baineri ATTC 9244

Mortierella isabellina NRLL 1757 ou MMP 108

Fusarium roseum ATTC 14717 A invenção tem mais particularmente por objecto um processo tal como definido anteriormente, no qual o produto com a fórmula (II) é a Trimegestona: [17β- (S))-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil-estra-4, 9-dien-3-ona. A invenção tem particularmente por objecto um processo tal como definido anteriormente, caracterizado por o cogumelo filamentoso ser: 0 Cuninghamella baineri, o Mortierella isabellina ou o Fusarium roseum e o produto com a fórmula (II) ser a Trimegestona, a fim de se obterem os derivados 1-hidroxilados e 6-hi-droxilados: [17β- (S)]-l~hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona, 6 [17β- (S)]-6-hidroxi-17-(2-hidroxi-l-oxopropil)-17-metil estra-4,9-dien-3-ona, que são em seguida separados. A invenção tem muito particularmente por objecto um processo tal como definido anteriormente, caracterizado por o cogumelo filamentoso ser o Cuninghamella baineri ATCC 9244 e o produto com a fórmula (II) ser a Trimegestona, a fim de se obter o derivado 1-hidroxilado: - [Ια, 17β- (S)]-l-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona ou [1β, 7β- (S) ]-6~hidroxi-17-(2-hidroxi-l-oxopropil)-17-metil estra-4,9~dien-3-ona, sós ou em mistura. A esterificaçâo posterior eventual dos grupos hidroxilo livres faz-se seguindo os processo que se utilizam correntemente na química dos esteróides para a esterificaçâo dos grupos hidroxi secundários e terciários. Como processo de esterificaçâo apropriado, pode por exemplo citar-se a reacção dos esteróides com os anidridos ou os cloretos de ácido, na presença de catalisadores básicos, tais como o bicarbonato de sódio ou de potássio, o carbonato de potássio, o hidróxido de sódio ou de potássio, a piridina, a lutidina, a colidina ou a 4-dime-tilaminopirídina.

Os compostos com a fórmula geral (I) apresentam propriedades farmacológicas interessantes, especialmente uma actividade progestomimética.

Os compostos não apresentam por outro lado qualquer afinidade em relação aos receptores estrogénios, androgénios, glucocorticóides e mineralocorticóides. r'

Os compostos com a fórmula geral (I) podem ser utilizados a titulo de medicamentos no tratamento dos distúrbios ginecológicos devidos a uma insuficiência luteal: - irregularidade menstrual devido a distúrbios na ovulação, - dismenorreias, - síndroma pré-menstrual, - mastodinia, - hemorragias funcionais e menorragias dos fibromas, distúrbios da menopausa, - esterilidade, - distrofias ováricas por os ovários não trabalharem, ou no tratamento de tumores da mama e do útero. A associação dos produtos com a fórmula geral (I) com os estrogénios é nova e constitui igualmente um dos objectivos da presente invenção; tem uma aplicação no tratamento hormonal substitutivo da menopausa e em particular na prevenção ou no tratamento da osteoporose.

Entre os estrogénios preferidos pode citar-se o 17P-es-tradiol e os seus ésteres tais como o valerato, o ciprionato, o decanoato e o acetato de estradiol, o etinil estradiol, a ΛΛ oestrona, o estrogenio "de origem equina" tal como o Premarin , ou uma combinação destes compostos. A associação estrogénio/produto com a fórmula geral (I) tem igualmente aplicação como contraceptivo. O estrogénio será então de preferência o etinil estradiol. A invenção tem portanto por objecto os produtos com a fórmula geral (I) como medicamentos. 8

A invenção tem igualmente por objecto a associação de estrogénio/produtos com a fórmula geral (I)-como medicamentos. A invenção tem mais particularmente por objecto como medicamento, os produtos A e B tais como os descritos anteriormente.

Os compostos, [17β- (S)]-l-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona, [17β- (S)]-6-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona, podem estar sob qualquer das suas configurações estereoisómeras 1α-0Η, 1β-0Η, 6a-0H, 6β-0Η, sós ou em mistura, podem portanto estar associados com o 17p-estradiol e constituem assim um aspecto particular da invenção. A invenção tem portanto igualmente mais particularmente por objecto como medicamentos as associações tais como as definidas acima. A posologia varia em função da afecção a tratar e da via de administração: esta pode variar por exemplo de 1 mg a 1000 mg por dia para o adulto por via oral de acordo com a indicação. A invenção estende-se às composições farmacêuticas contendo como principio actlvo pelo menos um medicamento tal como o definido acima.

Os compostos com a fórmula (I) são utilizados por via dige3tiva, parcntoral ou local, por exemplo por via perentânea. 9

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Podem ser prescritos sob a forma de comprimidos simples ou sob a forma de drageias, de geleias, de grânulos, de supositórios, de óvulos, de preparações injectáveis, de pomadas, de cremes, de géis, de microsferas, de nanosferas, de implantes, de emplastros, os quais são preparados de acordo com os métodos usuais. 0 ou os princípios activos podem ser aí incorporados com os excipientes habitualmente empregues nestas composições farmacêuticas, tais como o talco, a goma arábica, a lactose, o amido, o estearato de magnésio, a manteiga de cacau, os veículos aquosos ou não, os corpos gordos de origem animal ou vegetal, os derivados parafínicos, os glicóis, os diversos agentes molhantes, dispersantes ou emulsionantes, os conservantes.

Os compostos com a fórmula geral (II) utilizados como produtos de partida do processo de acordo com a invenção são conhecidos (patente europeia EP. 0 007 823).

As castas utilizadas de acordo com o processo de acordo com a invenção são conhecidas.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem contudo a limitarem. EXEMPLO 1; Produção/purificação da la-OH-trimegestona

Inocula-se com uma casta liofilizada de Cuninghamella baineri (ATCC 9244) um meio nutritivo sólido constituído, por 1 litro de água destilada, 20 g de glucose, 5 g de peptona pancreática, 5 g de extracto de levedura, 5 g de extracto de 10 malte e 20 g de bactoagar. Incuba-se o todo esterilmente durante 7 dias a 25°C, numa estufa.

Ao fim de 7 dias, recolhem-se os esporos. Estes esporos frescos são então utilizados para semear 2 frascos de Erlenmeyer de 2 litros que contêm cada um 800 ml de uma solução nutritiva esterilizada durante 30 minutos numa autoclave.

Este meio nutritivo contém: 10 g de milho demolhado, 2 g de NaN03/ 0,5 g de MgS04, 7H20, 0,02 g de FeS04, 7H20, 0,5 g de KC1 para 900 ml de água destilada. No momento da sementeira junta-se uma solução estéril de tampão de fosfato (K2HP04, 2g; KH2P04, 1 g em 40 ml de água) e um complemento nutritivo sob a forma de 60 ml de uma solução aquosa estéril contendo 30 g de glucose.

Deixa-se a cultura desenvolver a 27°C, sob agitação a 200 rotações/minuto num crivo de batedor rotativo. Após 65 h, junta--se, em cada erlenmeyer, uma solução de 400 mg de trimegestona em 5 ml de etanol a 99%.

Após transformação total do substrato trabalhado (72 horas de contacto), o meio de incubação é filtrado e este filtrado é em seguida saturado por junção de um grande excesso de NaCl. A solução saturada em NaCl é então extraída três vezes sob agitação com 250 ml de acetato de etilo. Após secagem sobre MgS04, evapora-se o extracto sob vácuo a uma temperatura de banho de 40°C e obtêm-se 965 mg de um óleo amarelado.

Este óleo sofre cromatografia sobre uma coluna de gel de sílica 60H (Merck, 70-230 Malhas) com uma mistura de cloreto de metileno/isopropanol (95:5). Obtêm-se 5 fracções principais. A fracção de 209 mg contendo maioritariamente o produto A é 11 ft” u K- •t purificada por cromatografia líquida de alta pressão semi preparativa (250 x 21,2 mm), em fase inversa enxertada C18, com uma mistura de metanol/água (50/50).

Após evaporação sob vácuo do solvente a uma temperatura de banho de 40°C, obtém-se 84 mg de [Ια, 17β-(S)]-l-hidroxi-17-(2-hi-droxi-l-oxopropil)-17-metil estra-4,9-dien-3-ona (produto A), com uma pureza cromatográfica superior a 96%.

Análises RMN 'Ή e 13C: ver tabelas 1 e 2. EXEMPLO 2: Produção/purif i cação da 6P-OH-trimegestona

Inocula-se com uma casta liofilizada de Mortierella isabellina (NRRL 1757) um meio nutritivo sólido constituído, por 1 litro de água destilada, 20 g de glucose, 5 g de peptona pancreática, 5 g de extracto de levedura, 5 g de extracto de malte e 20 g de bactoagar.

Incuba-se o todo esterilmente durante 7 dias a 25°C, numa estufa.

Ao fim de 7 dias, recolhem-se os esporos. Estes esporos frescos são então utilizados para semear 5 frascos de Erlenmeyer de 240 ml que contêm cada um 100 ml de uma solução nutritiva esterilizada durante 30 minutos numa autoclave.

Esto maio nutritivo contém: 10 q de milho demolhado, 2 g de NaN03, 0,5 g de MgS04, 7H2O, 0,02 g de FeS04, 7H20, 0,5 g de KC1 para 900 ml de água destilada. No momento da sementeira junta-se uma solução estéril de tampão de fosfato (K2HP04, 2g; KH2P04, 1 g 12

em 40 ml de água) e um complemento nutritivo sob a forma de 60 ml de uma solução aquosa estéril contendo 30 g de glucose.

Deixa-se a cultura desenvolver a 27 °C, sob agitação a 200 rotações/minuto num crivo de batedor rotativo. Após 60-66 h, junta-se, em cada erlenmeyer, uma solução de 50 mg de trimegestona em 1 ml de etanol a 99%.

Após transformação total do substracto trabalhado (48 horas de contacto), filtra-se sobre um filtro de tecido para separar o micélio do caldo de fermentação. 0 micélio é em seguida bem lavado com água destilada. 0 filtrado de lavagem e o caldo filtrado de fermentação são então reunidos. Depois satura-se a mistura "filtrado de lavagem/caldo filtrado" por junção de um grande excesso de NaCl. A solução saturada em NaCl é então extraída por três vezes sob agitação com 250 ml de acetato de etilo. Depois evapora-se o extracto sob vácuo a uma temperatura de banho de 40°C.

Para lavar o extracto de produtos secundários provenientes da fermentação, faz-se uma cromatografia sobre uma coluna de gel de sílica 60H (Merck, 230-400 Malhas) com a ajuda de uma mistura de cloreto de metileno/metanol (95-5). As fracções obtidas são reagrupadas numa fracção única, tendo um aspecto oleoso.

Finalmente purifica-se por cromatografia líquida de alta pressão semi preparativa (250 x 21,2 mm), em fase inversa enxertada C18, com uma mistura de metanol/água (60/40).

Após evaporação sob vácuo do solvente da fracção interessante, a uma temperatura de banho de 40°C, obtém-se 21 mg 13 t r— Li de [6β, 17β- (S)l-6-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona (produto B), com uma pureza cromatográfica superior a 90%.

Análises RMN XH e 13C: ver tabelas 1 e 2. EXEMPLO 3: Produção /purificação de la-OH-trimegestona e de ββ-ΟΗ-trimegestona

Preparam-se cinco frascos de Erlenmeyer de 500 ml que contêm cada um 90 ml de uma solução nutritiva n°l. Este meio nutritivo contém: 10 g de licor de milho demolhado, 2 g de NaN03, 0,5 g de MgS04, 7H20, 0,02 g de FeS04, 7H20, 0,5 g de KC1 e QSP 900 ml de água destilada. Da mesma forma, prepara-se um frasco de Schott contendo uma solução nutritiva n° 2, compreendendo: 10 g de K2HP 04, 5 g de KH2P04 e QSP 200 ml de água desmineralizada. Prepara-se também um frasco de Schott contendo uma solução nutritiva n° 3, compreendendo 150 g de glucose e QSP 300 ml de água desmineralizada. Na prática, dissolve-se a quente sob agitação forte em 150 ml de água desmineralizada 150 g de glucose. Após dissolução completa ajustar o volume para 300 ml com proveta.

Os 5 erlenmeyers e os 2 frascos Schott são esterilizados durante 30 minutos a 121°C numa autoclave.

Antes de semear as pré-culturas, junta-se esterilmente, em cada erlenmeyer contendo 90 ml dc solução nutritiva n° 1, 4 ml da solução n° 2 e 6 ml da solução n° 3. Depois inocula-se com 1 ml de inócuo congelado da casta de Fusarium roseum (ATCC 14717) . 14

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Durante 48 h, agitam-se os 5 erlenmeyers a 200 rotações/minuto, a uma temperatura de 27°C num agitador orbital, tendo uma excentração de 2,5 cm.

Com esta cultura prévia, inocula-se um fermentador de 3 litros que contém a solução nutritiva A, a saber: 30 g de licor de milho demolhado, 6 g de NaNCb, 1,5 g de MgS04, 7H20, 0,06 g de FeS04, 7H20, 1,5 g de KC1 e QSP 2650 ml de água desmineralizada. O fermentador é em seguida esterilizado numa autoclave 45 minutos a 121°C.

Prepara-se em seguida um balão de introdução de 500 ml contendo 300 ml da solução B. Esta é preparada como se segue: num copo de 500 ml contendo uma barra magnética, coloca-se 150 ml de água destilada e agita-se a quente. Depois introduz-se lentamente 90 g de glucose. Após dissolução completa, junta-se 6 g de K2HP04 e depois 3 g de KH2P04. Ajusta-se o volume para 300 ml com água destilada (com proveta) . 0 balão é em seguida esterilizado numa autoclave 30 minutos a 121°C.

Após a sementeira, introduz-se esterilmente os 300 ml no ^ fermentador. Depois inocula-se com 50 ml da pré-cultura com a ajuda de um balão de inoculação. A fermentação é conduzida a uma temperatura de 27°C, com uma pressão de 0,3 bar, uma agitação inicial de 200 rpm e um arejamento de 90 nl/h ou seja 0,50 m. A pressão parcial em oxigénio é regulada para 50% e o pH é regulado para 6,5 com ácido sulfúrico 1M até 28 h. Em seguida evolui livremente até ao fim da bioconversão.

Ao fim de 46 h, após a fase de crescimento activo, dissolveram-se 6 g de trimegestona em 70 ml de acetona juntos 15 ll LCj •t depois esterilmente à suspensão celular. A cultura segue depois nas mesmas condições.

Após 96 h, termina a fermentação. Filtra-se então sobre um filtro de tecido para separar o micélio do caldo de fermentação. 0 micélio é em seguida bem lavado com água destilada. 0 filtrado de lavagem e o caldo filtrado de fermentação são então reunidos. A solução saturada em NaCl é então extraída três vezes sob agitação com 500 ml de acetato de etilo e uma vez com 500 ml de cloreto de metileno. As fracções orgânicas são reunidas e destiladas a seco sob vácuo a uma temperatura de banho de 40°C.

Purifica-se o extracto seco obtido por cromatografia líquida de alta pressão preparativa, em fase normal, sobre sílica esférica 10 μ numa mistura de cloreto de metileno/metanol (95-5).

Obtêm-se várias fracções, em que 2 contêm o produto A e o produto B. Após evaporação sob vácuo do solvente, a uma temperatura de banho de 40°C, obtém-se: - ο [Ια, 17β-(S)]-l-hidroxi-17-(2-hidroxi-l-oxipropil)-17-me-til-estra-4,9-dien-3-ona/173-estradiol (produto A), - e ο [6β, 17β- (S)]-6-hidroxi~17- (2-hidroxi-l-oxopropil)-17--metil-estra-4,9-dien-3-ona/17β-estradiol (produto B) com uma pureza cromatográfica superior a 90%.

Análises RMN e 13C: ver tabelas 1 e 2. 16 Γ

Tabela 1: RMN 1H de 2 metabolitos da trimegestona (250 MHz, CDC13; d em ppm, J em Hz). Esta tabela mostra os resultados obtidos. A maior parte das atribuições descritas foram feitas após estudo das correlações 2D 1H-1H ou 1H-13C.

Trimegestona 6β-ΟΗ. Trimegestona Produto B la-OH Trimegestona Produto A la 2,6 (m) - e e 5,10 ΐβ 2,9 (m) (br.s) 2a 2,6 (m) e 2,5 (m) e 2β 2,7 (m) 4 5,67 (s) 5,82 (s) 5,76 (s) 6a 2,4 (m) e 4,37 (dd) e 6β J = 3,5 2,6 (m) 7a 1,5 (ddd) 1,45 (m) e e e 7β 2,1 (m) 1,9 8β 2,6 (m) 2,3 (m) 11a 2,2 (dt) 2,4 (m) e e e 11β 2,8 (m) 3,0 (dm) 12a 1,7 (m) 1,7 (m) e e e 12β 2,0 (m) 2,05 (m) 14β 1,68 (m) 1,80 (m) 15a 1,4 (m) 1,4 (m) e e e 15β 2,7 (m) 2,7 (m) 16a 1,4 (m) 1,4 (m) e e e 16β 1,8 (m) 1,8 (m) 18 0,81 (s) 0,84 (s) 0,85 (s) 19 1,16 (s) 1,15 (s) 1,16 (s) 21 4,41 (q) 4,40 (q) 4,40 (q) J = 6,4 J = 6,4 J = 6,4 22 1,31 (d) 1,30 (d) 1,31 (d) J = 6,4 J = 6,4 J = 6,4 17 t

Lc,

Tabela 2: RMN 13C dos 2 metabolitos da trimegestona (69,2 MHz, CDCls)

Carbono n° Trimegestona 6β-ΟΗ Trimegestona Produto B la-OH Trimegestona Produto A 1 25,6 25,9 65,9 2 36,9 37,3 45,5 3 199, 5 200,2 197,6 4 122,1 122,3 121,5 5 156, 9 155,4 154,3 6 30,7 68,4 31, 0 7 27, 6 34,3 27,3 8 39, 4 34,6 39,7 9 145,4 145,3 150, 6 10 125,5 122,7 127,9 11 25,7 25,7 25,4 12 32,8 33,0 33,0 13 45,1 45, 4 45,1 14 51,0 50, 6 51,4 15 24,0 30,7 30,3 16 30, 8 24,0 23,9 17 60, 0 60,0 60, 0 18 15,7 15, 8 15,8 19 21,5 21,7 21,6 20 217,0 217,2 217,1 21 69, 6 69,7 69,7 22 22,0 22,1 21, 6 18 Γ L-Zj

Estudo farmacológico dos produtos da invenção 1 - Estudo da actividade dos produtos da invenção sobre os receptores hormonais.

Utiliza-se o receptor humano recombinante (RGH, RPH, RAH, RMH, REH) .

Receptor de proqesterona humana (RPH): O receptor progestogénio humano recombinante é obtido por sobrexpressão num sistema de células de insectos Baculo-vírus, de acordo com a metodologia geral descrita por N.R. WEBB et al. (Journal of Methods in Cell and Molecular Biology, (1990) Vol 2 n° 4, 173-188) em que a aplicação é descrita pela expressão dos receptores hormonais humanos, por exemplo o receptor glucocorticóide humano (G. SRINIVASAN et al. Molecular Endocrinology (1990) vol 4 n° 2 209-216).

Utiliza-se o "kit" "BaculoGold Transfection kit" (PharMingen, referência 21000K) para inserir o fragmento de ADNc descrito por P. KASTNER et al. (The EMBO Journal (1990) vol 9 n° 5^ 1603-1614), compreendendo a região codante para o receptor progestogénio humano e para preparar o virus recombinante correspondente. 0 virus recombinante assim obtido é utilizado para exprimir o receptor progestogénio nas células de insectos SF9 (ATCC CRL1711), de acordo com a metodologia conhecida citada anteriormente. 19 de vitela fetal (SVP) e com 50 microgramas/ml de gentamicina. Após infecção mais incubação a 27°C durante 40 a 42 horas, as células são retomadas em 1 ml de tampão de lise (1), Usadas por 2 ciclos de congelação-descongelação (-80°C/0aC) e depois centrifugadas a 4°C durante 30 minutos a 20 900 g. 0 sobrenadante, contendo o receptor progestogénio humano recom-binante é conservado em azoto liquido por quantidade de 1 ml. 0 sobrenadante é diluído no momento da utilização com tampão Tris 10 mM, sacarose 0,25 M, HC1 pH 7,4 contendo 0,1% de gelatina, e depois incubado a 0°C durante 24 horas com uma concentração constante (T) de 17a,21-dimetil 19-norpregna 4,9-dien-3,20-diona titulada na presença de concentrações crescentes quer de progesterona fria (0-2500 x 10-9), quer do produto frio a ensaiar (1 a 25000 x 10-9 M) . A concentração de 17,21-dimetil 19-nor-4,9-pregnano-3,20-diona titulada ligada (B) é em seguida medida em cada incubado pela técnica de adsorção em carbono dextrano.

Recéptor glucocortocóide humano (RGH):

Obteve-se um sobrenadante de células SF9 contendo o receptor glucocortocóide humano recombinante de acordo com o processo descrito acima para o receptor progestogénio utilizando o fragmento de ADNc descrito por S.M. HOLLENBERG et al. (Nature (1985) vol. 318 n° 19/26 635) compreendendo a região codante para o receptor glucocorticóide humano. As células obtidas são lisadas num tampão de lise (2). 0 sobrenadante é incubado a 0°C durante 24 horas com uma concentração constante (T) de 11β,17p-dihidroxi-6,21-dimetil pregna 1,4,6-trien-20-in-3-ona titulada na presença de 20 p L· ^^ concentrações crescentes quer de dexametasona fria (0-1000 x 10”9 M), quer de produto frio a ensaiar (1 a 25000 x IO-9 M) . A concentração de 11β,17p-dihidroxi-6,21-dimetil pregna 1,4,6-trien-20-in-3-ona titulada ligada (B) é em seguida medida em cada incubado pela técnica de adsorção em carbono dextrano.

Receptor oestrogénio humano (REH):

Obteve-se um sobrenadante de células SF9 contendo o receptor oestrogénio humano recombinante de acordo com o procedimento descrito acima para o receptor progestogénio utilizando o fragmento de ADNc descrito no vector de expressão HEGO por L. TORA et al. (The EMBO Journal (1989) vol. 8 n° 7 1981-1986), compreendendo a região codante para o receptor oestrogénio humano do "tipo selvagem" com uma glicina em posição 4000. As células obtidas são lisadas num tampão de lise (1). 0 sobrenadante é incubado a 0°C durante 24 horas com uma concentração constante (T) de oestradiol titulado na presença de concentrações crescentes quer de oestradiol frio (0-1000 x 1CT9 M), quer de produto frio a ensaiar (1 a 25000 x IO-9 M) . A concentração de oestradiol titulado ligado (B) é em seguida medida em cada incubado pela técnica de adsorção em carbono dextrano.

Receptor androgénio humano (RAH):

Obteve-se um sobrenadante de células SF9 contendo o receptor androgénio humano recombinante de acordo com o procedimento descrito acima para o receptor progestogénio utilizando o fragmento de ADNc compreendendo a região codante 21 obtidas são para o receptor androgénio humano. As células lisadas num tampão de lise (3). 0 sobrenadante é incubado a 0oC durante um tempo de incubação de 24 horas com uma concentração constante (T) de testosterona titulada na presença de concentrações crescentes quer de testostrona fria (0-1000 x 10“9 M), quer de produto a ensaiar (1 a 25000 x 10"9 M) . A concentração de testosterona titulada ligada (B) é em seguida medida em cada incubado pela técnica de adsorção em carbono dextrano.

Receptor mineralocorticóide humano (RMH):

Obteve-se um sobrenadante de células SF9 contendo o receptor mineralocortocóide humano recombinante de acordo com o procedimento descrito acima para o receptor progestogénio utilizando o fragmento de ADNc descrito por E.E. BAULIEU et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. (1991) Vol. 88, 10681-10685) compreendendo a região codante para o receptor mineralocortocóide humano. As células obtidas são lisadas num tampão de lise (4). O sobrenadante é incubado a 0°C durante 24 horas com uma concentração constante (T) de aldosterona titulada na presença de concentrações crescentes quer de aldosterona fria (0-1000 x 10'9 M), quer de produto frio a ensaiar (1 a 25000 x 10'9 M) . A concentração de aldosterona titulada ligada (B) é em seguida medida em cada incubado pelo método de adsorção em carbono dextrano.

Tampões de lise: 1) Tris-HCl pH 8 20 mM EDTA 0,5 mM KC1 400 mM Glicerol 20 % Extemporaneamente, juntar: DTT 2 mM Mistura PIC* 1 % 2) KH2P04, NaOH pH 7 50 mM Glicerol 20 % Extemporaneamente, juntar: DTT (Ditiotreitol) 5 mM Molibdato de sódio 20 mM Mistura PIC* 0,1 % 3) Tris-HCl pH 7,5 20 mM EDTA, 2H20 1 mM Glicerol 10 %

Extemporaneamente, juntar: PMSF (Fluoreto de fenil metil sulfonilo) 0,1 mM Molibdato de sódio 20 mM Mistura PIC* 0,1 % Tris-HCl pH 7,4 20 mM EDTA, 2H20 1 mM Glicerol 10 % Extemporaneamente, juntar: Tungstato de sódio 20 mM Mistura PIC* 0,1 %

Mistura PIC: Leupeptina, Pepsatina A, Aprotinina, Antipaína, Cimostatina (Cada peptídeo está na concentração final de 2,5 μς/ιαΐ) .

Expressão dos resultados e métodos de cálculo - Cálculo da afinidade relativa de ligação (ARL).

Traçam-se as 2 curvas seguintes: percentagem de hormona titulada ligada B/BO em função do logaritmo da concentração da hormona de referência fria ou em função do logaritmo da concentração do produto frio ensaiado.

Determina-se a parte direita da equação seguinte: [1 + Bmin/Bc)/2 I50 = 100 (Bo/Bo + Bmin/Bo) /2 deve I50 =50 (1 + Baán/Bo) B0 = Concentração de hormona titulada ligada na ausência de qualquer produto frio,

Bmin = Concentração de hormona titulada ligada na presença da concentração mais elevada em hormona fria de referência.

As intersecções da parte direita I50 e das curvas, permitem avaliar as concentrações da hormona de referência fria (CH) e do produto frio ensaiado (CX) que inibem 50% da ligação específica de hormona titulada sobre o reoeptor. A afinidade relativa da ligação (ARL) do produto ensaiado é determinada pela equação: 24 ARL = 100 (CH)/(CX)

As ARL dos produtos de referência Estradiol, Progesterona, Dexametasona, Testosterona e Aldosterona são tomadas arbitrariamente iguais a 100.

Os resultados das ARL obtidas são os seguintes:

Produtos Receptor Glucocor-ticóide Humano 24 h a 0°C Dexametasona = 100 Receptor Progestogénio Humano 24 h a 0°C Progesterona = 100 Receptor Androgénio Humano 24 h a 0°C Testosterona = 100 Receptor Mineralocorticóide Humano 24 h a 0°C Aldosterona = 100 Receptor Estrogénio Humano 24 h a 0°C Estradiol = = 100 Trimegesto- Na 14 588 2,5 28 0 la-OH Produto A 0,06 64 0,04 0,1 0 6β-ΟΗ Produto B 0,05 12 0 0,3 0

Os produtos em que a ARL é igual a 0 têm uma ICso superior a 25000 nM.

Conclusão : 0 produto A (Ια-OH) apresenta uma boa afinidade relativa de ligação (ARL) para o receptor progestogénio humano, pois esta é 9 vezes mais baixa que a da Trimegestona. Pelo contrário o produto B (Gp-OII) apreoenta apenas uma ARL moderada para o receptor.

Contrariamente à Trimegestona que apresenta ARL moderadas para os receptores g.lur.ocorticóide e mineralocorticóide humanos, 25

e uma ARL baixa para o receptor androgénio humano, estes 2 produtos apresentam apenas ARL negligenciáveis ou nulas para os receptores.

As ARL para o receptor estrogénio humano, são nulas para a Trimegestona e para os produtos A e B. 2.- Determinação da actividade progestomimética dos produtos da invenção : Transformação endométrica na coelha a) Método

Os animais utilizados foram coelhos fêmeas impúberes com idade de 40-45 dias. Os animais foram tratados diariamente com oestradiol (5 μg/0,2 ml/coelho em solução em óleo de gérmen de milho, 10% de etanol) por via subcutânea do dia 1 ao dia 5, depois o produto a estudar foi administrado do dia 8 ao dia 11. Ao dia 12, os animais foram sacrificados, e em cada animal, uma porção mediana de cada uma das trompas uterinas foi retirada e fixada num liquido de Bouin para um estudo histológico. Após fixação, as amostras foram desidratadas, encerradas, cortadas, montadas, desparafinadas e depois coradas com hémalun-Eosina--Safran. b) Histologia

Os cortes foram examinados ao microscópio óptico, portanto com uma baixa ampliação, para aoocgurar que não existiam variações morfológicas de uma para outra, para cada uma das trompas, uma apreciação semi-quantitativa da proliferação endométrica (renda uterina) foi feita de acordo com a escala de Mc Phail de 0 a 4 com os intermédios de 0,5 e os dois númaros 26 t Γ são médias. Da mesma forma, o grau de hipertrofia das trompas foi avaliado de acordo com a mesma escala. Com uma ampliação maior, as observações morfológicas sobre a mucosa ou o miométrio podem eventualmente ser formuladas. c) Protocolo retido o metabolito 1-OH (produto A) foi ensaiado com doses de 10, 100, 1000 μg/kg por via subcutânea assim como por via oral com a dose de 1000 μg/kg. O metabolito 6-OH (produto B) foi ensaiado com doses de 100, 1000 e 10000 μg/kg por via subcutânea. Em controlo, a progesterona foi administrada em doses de 100 e 1000 μρ/kg por via subcutânea. d) Referências

Clauberq, C.

Zur Physiologie und Pathologie des Sexual Hormone, im besonderen des Hormons des Corpus Luteum 1. Mitt.: Der biologishe Test fur das luteohormon am infantilen Kaninchen.

Zentralbl. Gynakol. 1930, 54: 2757-70.

Mc Phail, M.K.

The assay of progestins J. Physiol (London) 1934, 83: 145-56.

Nota: a Trimegestona apresenta uma actividade progestomimética, no ensaio, a partir da dose de 1 μg/kg e uma forte actividade nas doses de 3 a 10 μρ/^ por via oral e 3 por via percutânea. Por outro lado, a actividade máxima da 27 progesterona sobre a renda uterina situa-se em 1000 μg/kg por via subcutânea (indice de Mc Phail de 4).

Resultados:

Ensaios Média HM + 10 % etanol, s/c 0 Progesterona 0,1 mg/kg, s/c 1,8 Progesterona 1 mg/kg, s/c 3, 8 Trimegestona 0,003 mg/kg, s/c 3,8 Produto B 0,01 mg/kg, s/c 1,4 Produto B 0,1 mg/kg, s/c 2 Produto B 1 mg/kg, s/c 3,8 Produto A 0,01 mg/kg, s/c 3, 8 Produto A 0,1 mg/kg, s/c 3,8 Produto A 1 mg/kg, s/c 3,8 Produto A 1 mg/kg, per os 4

As médias foram feitas para a renda uterina (índice de Mc Phail).

Conclusão: 0 ensaio de Clauberg-Mac Phail mostra uma boa actividade progestomimética do Produto B a 1 mg/kg (índice de Mac Phail : 0 produto A é também activo a partir da dose de 0,01 mg/kg (indice de Mac Phail : 3,8) e a 1 mg/kg por via p/o exprime uma melhor actividade que s/c (índice de Mac Phail : 4 em relação a 3,8 e maior hipertrofia das trompas).

Por outro lado, a observação histológica dos cortes do útero não revelou anomalias morfológicas.

Lisboa, 20 de Novembro de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES Compostos com a fórmula geral (I): 0 0

   (I) na qual: ou Ri é um átomo de hidrogénio e R2 é um radical 0R6, ou Ri é um radical 0R6 e R2 é um átomo de hidrogénio, representando R6 um radical acilo tendo 1 a 12 átomos de carbono, eventualmente substituído por um ou mais átomos de halogénio, ou um átomo de hidrogénio, R3 é um radical alquilo tendo 1 a 12 átomos de carbono, R4 é um radical alquilo tendo 1 a 4 átomos de carbono, e R5, igual ou diferente de R6, tem os mesmos valores que R6, os traços ondulados indicam que Ri ou R2 estão na posição α ou β e OR5 está na posição 21R ou 21S. Compostos com a fórmula (I) tal como definida na reivindicação 1, na qual R3 e R4 são radicais metilo. Compostos com a fórmula (I) tal como definida na reivindicação 1, na qual Ri é um átomo de hidrogénio e R2 é um grupo hidroxilo. Compostos com a fórmula (I) tal como definida na reivindicação 1, na qual Ri é um grupo hidroxilo e R2 é um átomo de hidrogénio. »

   O
2. 5. Compostos com a fórmula (I) de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, cujos nomes se seguem: [17β- (S)]-l-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona, [17β- (S)]-6-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona, podendo estes compostos estar em quaisquer das suas configurações estereoisómeras 1α-0Η, 1β-0Η, 6a-0H, 6β-0Η, sós ou em mistura.
3. 6. Compostos com a fórmula (I) tal como definida na reivindicação 1, associados a um composto estrogénio.
4. 7. Compostos tais como definidos na reivindicação 5, associados o 170-estradiol.
5. 8. Processo para a preparação de compostos com a fórmula geral (I) tais como definidos na reivindicação 1, caracterizado por se fazer uma bioconversão do composto com a fórmula geral (II): (II) na qual R3, R4 e os traços ondulados têm as mesmas definições que as dadas anteriormente, com uma cultura de cogumelos filamentosos, e depois em caso de necessidade se proceder a uma separação dos produtos 1-hidroxilados e 2

   u β-hidroxilados e/ou a uma esterificação dos grupos hidroxilo livres.
6. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o cogumelo filamentoso ser escolhido entre as castas seguintes: Cuninghamella baineri ATTC 9244 Mortierella isabellina NRLL 1757 ou MMP 108 Fusarium roseum ATTC 14717
7. 10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o produto com a fórmula (II) ser a Trimegestona: [17β-(S)]-17-(2-hidroxi-l-oxopropil)-17-metil-estra-4,9--dien-3-ona.
8. 11. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o cogumelo filamentoso ser: 0 Cuninghamella baineri, o Mortierella isabellina ou o Fusarium roseum e o produto com a fórmula (II) ser a Trimegestona, a fim de se obterem os derivados 1-hidroxilados . e 6-hidroxilados: [17β- (S)]-l-hidroxi-17-(2-hidroxi-l-oxopropil)-17-metil estra-4,9-dien-3-ona, [17β- (S) ]-6-hidroxi-17-(2-hidroxi-l-oxopropil)-17-metil estra-4,9-dien-3-ona, que são em seguida separados.
9. 12. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o cogumelo filamentoso ser o Cuninghamella baineri ATCC 9244, e o produto com a fórmula (II) ser a Trimegestona, 3 * * « a fim de se obter o derivado 1-hidroxilado: - [Ια, 17β- (S)]-l-hidroxi-17- (2-hidroxi-l-oxopropil) -17-metil estra-4,9-dien-3-ona ou [1β, 17β- (S)]-l-hidroxi-17-(2-hidroxi--1-oxopropil)-17-metil estra-4,9-dien-3-ona.
10. 13. Como medicamento, compostos com a fórmula geral (I) tal como definida em qualquer das reivindicações 1 a 4.
11. 14. Como medicamento, compostos com a fórmula geral (I) tal como definidos na reivindicação 5.
12. 15. Como medicamentos as associações tais como as definidas em qualquer das reivindicações 6 e 7.
13. 16. Composições farmacêuticas contendo como principio activo pelo menos um dos medicamentos tais como definidos em qualquer das reivindicações 13 a 15. Lisboa, 20 de Novembro de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUS TRIAL

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