JP4234799B2 - 新規な1又は6−ヒドロキシル化ステロイド、それらの製造法、それらの薬剤としての使用及びそれらを含む製薬組成物 - Google Patents
新規な1又は6−ヒドロキシル化ステロイド、それらの製造法、それらの薬剤としての使用及びそれらを含む製薬組成物 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
この発明は、ステロイド化合物に関する。
【0002】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な1又は6−ヒドロキシル化ステロイド、それらの製造法、それらの薬剤としての使用及びそれらを含む製薬組成物を提供することを目的とする。
【0003】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明の主題は、次の一般式(I)
【化3】
(ここで、
R1 は水素原子であり且つR2 はOR6 基であるか、又は
R1 はOR6 基であり且つR2 は水素原子であるかのいずれかであり、R6 は1個以上のハロゲン原子により置換されていてもよい1〜12個の炭素原子を含有するアシル基又は水素原子を表わし、
R3 は1〜12個の炭素原子を含有するアルキル基であり、
R4 は1〜4個の炭素原子を含有するアルキル基であり、
R5 はR6 と同一であっても異なっていてもよく、R6 と同じ意味を有し、
波線はR1 又はR2 がα又はβ位にあること及びOR5 が21R又は21S位にあることを示す。)
の化合物にある。
【0004】
式(I)の化合物とは、その取り得る個々の全ての異性体又はそれらの異性体の混合物を意味するものとする。
【0005】
1〜12個の炭素原子を含有するアルキル基とは、次の基:メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシル、2−メチルペンチル、2,3−ジメチルブチル、n−ヘプチル、2−メチルヘキシル、2,2−ジメチルペンチル、3,3−ジメチルペンチル、3−エチルペンチル、n−オクチル、2,2−ジメチルヘキシル、3,3−ジメチルヘキシル、3−メチル−3−エチルペンチル、ノニル、2,2−ジメチルヘプチル又はn−デシルを意味する。
【0006】
1〜4個の炭素原子を含有するアルキル基とは、次の基:メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はt−ブチルを意味する。
【0007】
1〜12個の炭素原子を含有するアシル基とは、次の基:ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、スクシニル、ピバロイル又はベンゾイルを意味する。
【0008】
これらの基がハロゲン原子により置換されているときは、そらは好ましくは塩素、沃素又は弗素原子である。クロルアセチル、ジクロルアセチル、トリクロルアセチル又はトリフルオルアセチルが挙げられる。
【0009】
【発明の実施の形態】
第一の好ましい態様では、本発明の主題は、R3 及びR4 がメチルである式(I)の化合物にある。
第二の好ましい態様では、本発明の主題は、R1 が水素原子であり、R2 がヒドロキシル基である式(I)の化合物にある。
第三の好ましい態様では、本発明の主題は、R1 がヒドロキシル基であり、R2 が水素原子である式(I)の化合物にある。
【0010】
第四の好ましい態様では、本発明の主題は、化合物名が
・[17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン(化合物A)、又は
・[17β−(S)]−6−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン(化合物B)
であり、それらの立体異性体配置:1α−OH、1β−OH、6α−OH若しくは6β−OHのいずれか単独の形態で又はそれらの混合物の形態にある前記の式(I)の化合物にある。
【0011】
また、本発明の主題は、式(I)の化合物の製造法にある。
【0012】
本発明に従うこの製造法は、次の一般式(II)
【化4】
(ここで、R3 、R4 及び波線は前記の意味と同じ意味を有する。)
の化合物の生物学的転化を糸状菌の培養によって行い、次いで適当ならば1−ヒドロキシル化化合物と6−ヒドロキシル化化合物との分離及び(又は)遊離ヒドロキシル基のエステル化を行うことを特徴とする。
【0013】
当業者に知られた糸状菌のうちでも、特に下記の菌類が選択される。
【表1】
【0014】
菌株の出所
ATCC:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州、米国。
MMP:ミコセク・ドゥ・ミュゼーム・ディストワール・ナチュレル、パリ。NRRL:ノーザン・ユーチリゼーション・リサーチ・アンド・デベロプメント・デビジョン、ペオリア、イリノイ州、米国。
【0015】
ヒドロキシル化の実施は、菌類の培養を使用するステロイドの微生物学的ヒドロキシル化を一般に利用する方法(“ステロイド及びアルカロイドの微生物学的転化”、H.イシズカ及びA.ナイトウ、発行所:東京大学印刷所、スプリンガー・フェルラーク、ベルリン、1981を参照。)に従って行われる。従って、最も好ましい発酵条件は、まず、一般的な普通の予備試験、例えば、栄養培地の最も望ましい選定、適当な基質溶媒、基質の濃度、温度、曝気、pH及び発芽の最適な期間のような技術条件、基質の添加並びに基質と微生物との接触のような予備試験において分析的なルートで、特に薄層クロマトグラフィー又はHPLCによって決定される。
【0016】
栄養培地1リットル当たりほぼ40〜2,000mgの基質の濃度を使用するこが有利であることがわかった。pH値は、好ましくは5〜7程度の値に調節される。培地の温度は、20〜40℃程度、好ましくは25〜35℃である。曝気のためには、培地ブイヨン1リットル当たり毎分ほぼ1リットルの空気が提供される。基質の転化は、抽出された試料を薄層クロマトグラフィーを使用して又はHPLCを使用して分析することにより有利にモニターされる。一般に、24〜144時間後に、十分な量のヒドロキシル化ステロイドが形成された。
【0017】
本発明の製造法の生成物の単離、分離及び精製は、それ自体知られた態様で行われる。例えば、製造法の生成物は酢酸エチルのような有機溶媒により抽出し、抽出物を蒸発し、分離し、生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【0018】
本発明のさらに特定の主題は、糸状菌が下記の菌株:
【表2】
から選択される前記の製造法にある。
【0019】
さらに、本発明の特定の主題は、式(II)の化合物がトリメゲストン:
・[17β−(S)]−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
である前記の製造法にある。
【0020】
また、本発明の全く特定の主題は、糸状菌がクニンガメラ・バイネリ、モルチエレラ・イサベリナ又はフザリウム・ロゼウムであり、式(II)の化合物がトリメゲストンであり、これにより1−ヒドロキシル化及び6−ヒドロキシル化誘導体:
・[17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン、及び
・[17β−(S)]−6−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
を得、次いでこれらを分離することを特徴とする、前記の製造法にある。
【0021】
さらに、本発明の全く特定の主題は、糸状菌がクニンガメラ・バイネリ ATCC9244であり、式(II)の化合物がトリメゲストンであり、これにより1−ヒドロキシル化誘導体:
・[1α,17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン、又は
・[1β,17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
を単独で又は混合物として得ることを特徴とする、前記の製造法にある。
【0022】
遊離ヒドロキシル基の場合により行う次のエステル化は、ステロイドの化学において第二及び第三ヒドロキシル基をエステル化するのに普通に使用されている方法に従って行われる。適当なエステル化法としては、例えば、塩基性触媒、例えば、重炭酸ナトリウム若しくはカリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム若しくはカリウム、ピリジン、ルチジン、コリジン又は4−ジメチルアミノピリジンのような塩基の存在下にステロイドと酸無水物又はクロリドとを反応させることが挙げられる。
【0023】
一般式(I)の化合物は、有用な薬理学的性質、特に黄体ホルモン様活性を有する。
さらに、これらの化合物は、エストロゲン、アンドロゲン、グルココルチコイド及びミネラロコルチコイド受容体に対して親和性を有しない。
【0024】
一般式(I)の化合物は、黄体不全に起因する婦人科の障害:
・排卵障害に起因する月経の不規則、
・月経困難症、
・月経前症候群、
・乳房痛、
・線維腫、閉経障害の機能性出血及び月経過多、
・不妊症、
・卵巣の不活性による卵巣ジストロフィー
の治療に、又は乳房及び子宮の癌の治療に使用することができる。
【0025】
一般式(I)の化合物とエストロゲンとの組合せは、新規であって、本発明の主題の一つを構成する。これは、閉経と関係するホルモン補充治療において、特に骨粗鬆症の予防に又は治療に有用性を有する。
好ましいエストロゲンのうちでも、17β−エストラジオール及びそのエステル類、たとえばエストラジオールバレレート、カプリオネート、デカノエート及びアセテート、エチニルエストラジオール、エストロン、“エキニン起源”のエストロゲン、例えばプレマリン(登録商標)、又はこれらの化合物の組合せが挙げられる。
【0026】
また、エストロゲンと一般式(I)の化合物との組合せは、避妊薬としての用途も有する。この場合に、好ましいエストロゲンは、エチニルエストラジオールである。
【0027】
従って、本発明の主題は、一般式(I)の化合物からなる薬剤にある。
また、本発明の主題は、エストロゲンと一般式(I)の化合物との組合せからなる薬剤にある
さらに、本発明の特定の主題は、前記のような化合物A及びBからなる薬剤にある。
【0028】
したがって、次の化合物:
・[17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン、又は
・[17β−(S)]−6−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
(これらの化合物は、それらの立体異性体配置:1α−OH、1β−OH、6α−OH若しくは6β−OHのいずれか単独の形態又はそれらの混合物の形態にあり得る。)
は、17−エストラジオールと組合せることができ、しかしてこれは本発明の特定の主題を構成する。
従って、本発明のさらに特定の主題は、このような組合せからなる薬剤にある。
【0029】
有効薬量は、治療すべき疾病及び投与経路によって変わる。これは、例えば、成人の場合に指示に従って経口投与で1日当たり1mg〜1000mgであろう。
【0030】
本発明は、前記のような薬剤の少なくとも1種を活性成分として含有する製薬組成物まで及ぶ。
これらの製薬組成物は、消化器経路で、非経口的に又は局所経路で、例えば皮下経路で使用することができる。
これらの製薬組成物は、固体でも液体でもよく、人の医薬として慣用されている製剤形状で、例えば無味の若しくは糖衣錠剤、カプセル、顆粒、座薬、丸薬、注射用調合剤、軟膏、クリーム、ゲル、微小球、ナノスフィアー、インプラント、パッチの形状で提供できる。活性成分は、これらの製薬組成物に通常使用される補助剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性若しくは非水性のビヒクル、動物性若しくは植物性の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール類、各種の湿潤、分散若しくは乳化剤、保存剤と配合することができる。
【0031】
本発明に従う製造法の出発物質として使用される一般式(II)の化合物は、既知である(ヨーロッパ特許出願公開第0007823号明細書)。
本発明に従う製造法の過程で使用される菌株も既知である。
【0032】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、これを制限するものではない。
【0033】
例1:1α−OH−トリメゲストンの産生/精製
蒸留水1リットル当たり、20gのグルコース、5gのすい臓ペプトン、5gの酵母エキス、5gのモルトエキス及び20gのバクトアガールよりなる固形栄養培地にクニンガメラ・バイネリ(Cuninghamella baineri)ATCC9244の凍結乾燥菌株を接種する。全体を加熱室において無菌条件下で25℃で7日間インキュベートする。
7日後に、胞子を収穫する。次いで、これらの新鮮な胞子を使用して、2個の2リットルのエーレンメイヤーフラスコであってそれぞれにオートクレーブで30分間滅菌した800mlの栄養溶液を入れたものに接種する。
この栄養培地は、900mlの蒸留水に対して10gのコーンスティープ、2gのNaNO3 、0.5gのMgSO4 ・7H2 O、0.02gのFeSO4 ・7H2 O、0.5gのKClを含有した。接種の時点で、無菌の燐酸塩緩衝溶液(40mlの水に2gのK2 HPO4 及び1gのKH2 PO4 を含有)、そして30gのグルコースを含有する60mlの無菌の水溶液としての栄養補給物を添加する。
培養物を回転振盪機において200rpmで撹拌しながら27℃で発育させる。65時間後に、400mgのトリメゲストンを5mlの99%エタノールに溶解してなる溶液をそれぞれのエーレンメイヤーフラスコに添加する。
【0034】
使用した基質が全部転化した(72時間の接触)後、インキュベート媒質をろ過し、次いでこのろ液を大過剰のNaClの添加により飽和させる。次いでNaClで飽和された溶液を250mlの酢酸エチルを使用して撹拌しながら3回抽出する。MgSO4 で乾燥した後、抽出物を40℃の浴温度で真空下に蒸発させ、965mgの黄色油状物を得た。
この油状物を塩化メチレン/イソプロパノール混合物(95:5)を使用して60Hシリカゲルカラム(メルク社、70〜230メッシュ)でクロマトグラフィーする。5個の主要画分を得た。化合物Aの大部分を含有する209mgの画分を、セミ分取高圧液体クロマトグラフィー(250×21.2mm)によりC18結合逆転相でメタノール/水混合物(50/50)を使用して精製する。
40℃の浴温度で溶媒を真空下に蒸発させた後、84mgの[1α,17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン(化合物A)を96%よりも高いクロマトグラフィー純度で得た。
1H及び13CNMR分析は、後記の表1及び表2を参照されたい。
【0035】
例2:6β−OH−トリメゲストンの産生/精製
蒸留水1リットル当たり、20gのグルコース、5gのすい臓ペプトン、5gの酵母エキス、5gのモルトエキス及び20gのバクトアガールよりなる固形栄養培地にモルチエレラ・イサベリナ(Mortierella isabellina)(NRRL1757)の凍結乾燥菌株を接種する。
全体を加熱室において無菌条件下で25℃で7日間インキュベートする。
7日後に、胞子を収穫する。次いで、これらの新鮮な胞子を使用して、5個の240mlのエーレンメイヤーフラスコであってそれぞれにオートクレーブで30分間滅菌した100mlの栄養溶液を入れたものに接種する。
この栄養培地は、900mlの蒸留水に対して10gのコーンスティープ、2gのNaNO3 、0.5gのMgSO4 ・7H2 O、0.02gのFeSO4 ・7H2 O、0.5gのKClを含有した。接種の時点で、無菌の燐酸塩緩衝溶液(40mlの水に2gのK2 HPO4 及び1gのKH2 PO4 を含有)、そして30gのグルコースを含有する60mlの無菌の水溶液としての栄養補給物を添加する。
培養物を回転振盪機で撹拌しながら27℃で発育させる。60〜66時間後に、50mgのトリメゲストンを1mlの99%エタノールに溶解してなる溶液をそれぞれのエーレンメイヤーフラスコに添加する。
【0036】
使用した基質が全部転化した(48時間の接触)後、インキュベート媒質を布フィルターでろ過して発酵ブイヨンの菌糸を分離する。次いで、菌糸を蒸留水により十分に洗浄する。次いで、洗浄のろ液とろ過された発酵ブイヨンを一緒にする。洗浄のろ液とろ過された発酵ブイヨンとの混合物を大過剰のNaClの添加により飽和させる。
次いで、NaClで飽和された溶液を250mlの酢酸エチルを使用して撹拌しながら3回抽出する。抽出物を40℃の浴温度で真空下に蒸発させる。
発酵から生じた第二生成物の抽出物を清浄にするために、塩化メチレン/メタール混合物(95:5)を使用して60Hシリカゲルカラム(メルク社、230〜400メッシュ)でクロマトグラフィーを行う。得られた画分を油状物の外観を有する単一の画分として集める。
最後に、メタノール/水混合物(60/40)を使用してセミ分取高圧液体クロマトグラフィー(250×21.2mm)によりC18結合逆転相で精製を行う。
有用画分の溶媒を40℃の浴温度で真空下に蒸発させた後、21mgの[6β,17β−(S)]−6−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン(化合物B)を90%よりも高いクロマトグラフィー純度で得た。
1H及び13CNMR分析は、後記の表1及び表2を参照されたい。
【0037】
例3:1α−OH−トリメゲストン及び6β−OH−トリメゲストンの産生/精製
それぞれが90mlの栄養溶液No.1を入れてある5個の500mlのエーレンメイヤーフラスコを用意する。この栄養培地は、10gのコーンスティープ、2gのNaNO3 、0.5gのMgSO4 ・7H2 O、0.02gのFeSO4 ・7H2 O、0.5gのKCl及び900mlとするに要する量の蒸留水を含有する。同様に、10gのK2 HPO4 、5gのKH2 PO4 及び200mlにするのに要する量の脱塩水を含有する栄養溶液No.2を入れたショットフラスコを用意する。また、150gのグルコースと300mlにするに要する量の脱塩水を含有する栄養溶液No.3を入れたショットフラスコを用意する。実施するには、150gのグルコースを150mlの脱塩水に強く撹拌しながら加温しながら溶解する。完全に溶解した後、容積を300mlの試験容積に調節する。5個のエーレンメイヤーフラスコ及び2個のショットフラスコをオートクレーブで121℃で30分間滅菌する。
90mlの栄養栄養溶液No.1を入れてあるエーレンメイヤーフラスコのそれぞれに、予備培養物を播種する直前に、4mlの栄養溶液No.2及び6mlの栄養溶液No.3を無菌状態で添加する。次いで、1mlの菌株フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum )(ATCC14717)の冷凍接種物により接種を行う。
5個のエーレンメイヤーフラスコを、2.5cmの軌道寸法を有する軌道型振盪機において27℃の温度で200rpmで48時間撹拌する。
【0038】
次いで、この予備培養物を使用して、栄養溶液A、即ち、30gのコーンスティープ理カー、6gのNaNO3 、1.5gのMgSO4 ・7H2 O、0.06gのFeSO4 ・7H2 O、1.5gのKCl及び2650mlとするに要する量の蒸留水を入れてある3リットルの発酵器に接種する。次いで、発酵器をオートクレーブで121℃で45分間滅菌する。
次いで、30mlの溶液Bを入れた500mlの導入フラスコを準備する。これは、次のように調製する。150mlの蒸留水を磁気撹拌機を収納した500mlのビーカーに入れ、加温しながら撹拌する。次いで、90gのグルコースをゆっくりと導入する。完全に溶解した後、6gのK2 HPO4 、次いで3gのKH2 PO4 を添加する。蒸留水により容積(試験)を300mlにする。次いで、フラスコをオートクレーブで121℃で30分間滅菌する。
播種する前に、300mlの溶液Bを発酵器に無菌状態で導入する。次いで、接種用フラスコを使用して50mlの予備培養物によって接種を行う。発酵は、27℃の温度に、0.3バールの圧力、200rpmの初期撹拌及び90nl/h、即ち0.50vvmの曝気量で行う。酸素の分圧は50%に調節し、pHは1M硫酸を使用して28時間まで6.5に調節する。次いで、生物学的転化の終了まで自由に発育させる。
【0039】
46時間の活発な増殖過程の後に、6gのトリメゲストンを70mlのアセトンに溶解し、次いでこれを無菌状態で細胞懸濁液に添加する。次いで、培養を同じ条件下で継続させる。
96時間後に、発酵を止める。次いで、布フィルターによりろ過して発酵ブイヨンから菌糸体を分離する。次いで菌糸体を蒸留水で十分に洗浄する。次いで、洗浄のろ液とろ過された発酵ブイヨウンを一緒にする。次いで、NaClにより飽和させた溶液を500mlの酢酸エチルで3回、次いで500mlの塩化メチレンにより1回抽出する。有機画分を集め、40℃の浴温度で真空下に蒸留乾固させる。
得られた乾燥抽出物を、塩化メチレン/メタノール混合物(95−5)を使用して、10μの球状シリカで分取高圧液体クロマトグラフィーにより正常相で精製する。
いくつかの画分を得たが、そのうちの2個が化合物A及び化合物Bを含有する。溶媒を40℃の浴温度で真空下に蒸発させた後、次の物質:
・[1α,17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン/17β−エストラジオール(組成物A)、及び
・[6β,17β−(S)]−6−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン/17β−エストラジオール(組成物B)
が90%よりも高いクロマトグラフィー純度で得られた。
1H及び13CNMR分析は、後記の表1及び表2を参照されたい。
【0040】
下記の表1は、トリメゲストンの2個の代謝産物の 1HNMR(250MHz、CDCl3 、ppmで表わしたd、Hzで表わしたJ)を示す。この表は、得られた結果を要約する。記載した大部分の帰属化は、2D 1H−1H又は1H−13Cの相関関係の研究の後に行った。
【0041】
【表3】
【0042】
下記の表2は、トリメゲストンの2個の代謝産物の 13 CNMR(250MHz、CDCl3)を示す。
【0043】
【表4】
【0044】
本発明の化合物の薬理学的研究
1)ホルモン受容体に対する本発明の化合物の活性の研究
ヒト組替え型受容体(HGR、HPR、HAR、HMR、HER)を使用する。
【0045】
ヒトプロゲステロン受容体(HPR)
N.R.ウエッブ他により報告された一般的方法論(J. of Methods in Cell and Molecular Biology (1990), Vol.2, No.4, 173-188) に従って、昆虫−バキュロウイルスの細胞系において過剰発現させることによって組替え型ヒトプロゲストゲン受容体を得る。その応用がヒトホルモン受容体、例えばヒトグルココルチコイド受容体の発現について報告されている(G.スリニバサン他、Molecular Endocrinology (1990), Vol.4, NO.2, 209-216)。バキュロゴールド・トランスフェクション・キット(ファーミンゲン社、参照番号21000K)を使用してヒトプロゲストゲン受容体をコードする部位を含有するP.カストナー他により報告されたcDNA断片(The EMBO Journal (1990), Vol.9, No.5, 1603-1614 )をインサートし、相当する組替え型ウイルスを調製する。
【0046】
この方法で得られた組替え型ウイルスを使用して、上記の知られた方法に従って、SF9昆虫細胞(ATCC CRL1711)にプロゲストゲン受容体を発現させる。
2×107 個〜2.5×107 個のSF9細胞を、175cm2 のファルコンフラスコにおいて10%の胎児牛血清(FSC)及び50μg/mlのゲンタマイシンを補給したTNM−FH培地で培養する。感染させ、次いで27℃で40〜42時間インキュベートした後、細胞を1mlの溶解用緩衝液(1)に採り、2回の凍結−融解サイクル(−80℃/0℃)によって溶解させ、次いで4℃で20900Gで30分間遠心分離する。組替え型ヒトプロゲストゲン受容体を含有する上層液を1mlの量で液体窒素中に貯蔵する。
上層液を使用時に、0.1%のゼラチンを含有する10mMのトリス緩衝液(0.25Mのサッカロース、HCl、pH7.4)により希釈し、次いで増大する濃度の未標識プロゲステロン(0〜25000×10-9M)か又は未標識被検化合物(1〜25000×10-9M)のいずれかの存在下に一定濃度(T)のトリチウム化17α,21−ジメチル−19−ノルプレグナ−4,9−ジエン−3,20−ジオンと共に0℃で24時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化17,21−ジメチル−19−ノルプレグナ−4,9−ジエン−3,20−ジオン(B)の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【0047】
ヒトグルココルチコイド受容体(HGR)
ヒトグルココルチコイド受容体をコードする部位を有するS.M.ホレンベルグ他により報告されたcDNA断片(Nature (1985), Vol.318, No.19/26 635)を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型ヒトグルココルチコイド受容体を含有するSF9細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液(2)により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識デキサメタゾン(0〜1000×10-9M)か又は未標識被検化合物(1〜25000×10-9M)のいずれかの存在下に一定濃度(T)のトリチウム化11β,17β−ジヒドロキシ−6,21−ジメチルプレグナ−1,4,6−トリエン−20−イン−3−オンと共に0℃で24時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化11β,17β−ジヒドロキシ−6,21−ジメチルプレグナ−1,4,6−トリエン−20−イン−3−オン(B)の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【0048】
ヒトエストロゲン受容体(HOR)
位置440にグリシンを有する“野生型”のヒトエストロゲン受容体をコードするL.トーラ他により報告された発現ベクターHEGO(The EMBO Journal (1989) Vol.8, No.7, 1981-1986)に記載されたcDNA断片を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型エストロゲン受容体を含有するSF9細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液(1)により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識エストラジオール(0〜1000×10-9M)か又は未標識被検化合物(1〜25000×10-9M)のいずれかの存在下に一定濃度(T)のトリチウム化エストラジオールと共に0℃で24時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化エストラジオール(B)の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【0049】
ヒトアンドロゲン受容体(HAR)
ヒトアンドロゲン受容体をコードする部位を含有するcDNA断片を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型ヒトアンドロゲン受容体を含有するSF9細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液(3)により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識テストステロン(0〜1000×10-9M)か又は未標識被検化合物(1〜25000×10-9M)のいずれかの存在下に一定濃度(T)のトリチウム化テストステロンと共に0℃で24時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化テストステロン(B)の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【0050】
ヒトミネラロコルチコイド受容体(HMR)
ヒトミネラロコルチコイド受容体をコードする部位を含有するE.E.ボリウ他により報告されたcDNA断片(Proc. Natl. Acad. Sci., (1991) Vol.88, 10681-10685)を使用して、プロゲストゲン受容体について前記した方法に従って、組替え型ミネラロコルチコイド受容体を含有するSF9細胞の上層液を得る。得られた細胞を溶解用緩衝液(4)により溶解させる。
上層液を、増大する濃度の未標識アルドステロン(0〜1000×10-9M)か又は未標識被検化合物(1〜25000×10-9M)のいずれかの存在下に一定濃度(T)のトリチウム化アルドステロンと共に0℃で24時間インキュベートする。次いで、各インキュベート中の結合したトリチウム化アルドステロン(B)の濃度を活性炭−デキストラン吸着技術を使用して測定する。
【0051】
細胞溶解用緩衝液
(1)トリス−HCl、pH8 20mM
EDTA 0.5mM
KCl 400mM
グリセリン 20%
同時に添加
DTT 2mM
PIC* 混合物 1%
(2)KH2 PO4 −NaOH、pH7 50mM
グリセリン 20%
同時添加
DTT(ジチオトレイット) 5mM
モリブデン酸ナトリウム 20mM
PIC* 混合物 0.1%
(3)トリス−HCl、pH7.5 20mM
EDTA・2H2 O 1mM
グリセリン 10%
同時に添加
PMS
(弗化フェニルメチルスルホニル)0.1mM
モリブデン酸ナトリウム 20mM
PIC* 混合物 0.1%
(4)トリス−HCl、pH7.4 20mM
EDTA・2H2 O 1mM
グリセリン 10%
同時に添加
タングステン酸ナトリウム 20mM
PIC* 混合物 0.1%
*PIC* 混合物:ロイペプチン、ペプスタチンA、アプロチニン、アンチペイン、キモスタチン(2.5μg/mlの最終濃度の各ペプチド)
【0052】
結果の表出及び計算方法
・相対的結合親和性(RBA)の計算
相対的結合親和性(RBA)の計算は全ての受容体につき同じである。
次の2つの曲線を描く。未標識の参照ホルモンの濃度の対数の関数としての結合トリチウム化ホルモンB/B0 の%、及び未標識の被検化合物の濃度の対数の関数としてのB/B0 。次の方程式:
【数1】
I50=100(B0 /B0 +Bmin/B0 )/2、即ち
I50=100(1+Bmin/B0 )/2=50(1+Bmin/B0 )
の直線を決定する。
ここで、B0 =どの未標識化合物も存在しないときの結合トリチウム化ホルモンの濃度。
Bmin=最高濃度の未標識参照ホルモンの存在下での結合トリチウム化ホルモンの濃度。
直線I50と曲線との交点は、受容体へのトリチウム化ホルモンの特異的結合を50%抑止する未標識参照ホルモンの濃度(CH)と未標識被検化合物を濃度(CX)を評価するのを可能にさせる。
試験化合物の相対的結合親和性(RBA)は次式によって決定される。
【数2】
RBA=100(CH)/(CX)
【0053】
参照物質のエストラジオール、プロゲステロン、デキサメタゾン、テストステロン及びアルドステロンのRBAは、任意に100に等しいものとみなす。
得られたRBAの結果を下記の表に示す。
【表5】
RBAが0に等しい化合物は、250000nMよりも大きいIC50を有する。
【0054】
・結論
化合物A(1α−OH)はヒトプロゲステロン受容体に対して良好な相対的結合親和性を有するが、これはトリメゲストンの親和性よりも9倍弱い。他方、化合物B(6−OH)のみがこの受容体に対して中程度のRBAを有する。
ヒトグルココルチコイド及びミネラロコルチコイド受容体に対して中程度のRBA並びにヒトアンドロゲン受容体に対して弱いRBAを示すトリメゲストンとは対照をなして、これらの二つの化合物のみがこれらの受容体に対してRBAを有しないか又は無視できるRBAを有する。
ヒトエストロゲン受容体に対するRBAは、トリメゲストン並びに化合物A及びBについて0である。
【0055】
2)本発明の化合物の黄体ホルモン様活性の決定:ウサギでの子宮内膜の変化
a)方法
使用する動物は、生後40〜45日の性的未成熟の雌のウサギである。動物は、エストラジオール(ウサギ1頭当たり5μg/0.2mlのコーンオイル溶液、10%のエタノールを含有)により第1日から第5日まで皮下経路で毎日処理し、次いで被検化合物を第8日から第11日まで投与する。第12日目に、動物を犠牲にし、各動物から子宮角を切除し、組織学的研究のためにブアン氏液中で固定させる。固定させた後、試料を脱水し、包み込み、切断し、載せ、パラフィンを除き、次いで試料をヘマラム−エオシン−サフロンにより染色する。
【0056】
b)組織学
切片を光学顕微鏡の下で、まず、低倍率で切片の間に形態学的な変化が存在しないことを確認するために検査し、次いで子宮角のそれぞれについて子宮内膜の増殖(子宮レース)の半定量的な評価を0〜4(0.5の中間値として)のマックファイルスケールに従って行い、二つの数字を平均する。同様に、子宮角の肥大の程度を同じスケールに従って評価する。場合により、最高の倍率で粘膜又は子宮筋層の形態学的な観察を行うことができる。
【0057】
c)維持されたプロトコール
1−OH代謝産物(化合物A)を皮下経路で10、100及び1000μg/kgの薬量で又は経口で1000μg/kgの薬量で試験した。また、6−OH代謝産物(化合物B)を皮下経路で100、1000及び10000μg/kgの薬量で試験した。対照例として、プロゲステロンを皮下経路で100及び1000μg/kgの薬量で投与した。
【0058】
d)参照文献
C.クラウベルグ
“性ホルモン、特に黄体ホルモンの生理学及び病理学1:性的未成熟なウサギにおける黄体ホルモンのための生物学的試験”、Zetralbl. Gynakol.,1930, 54, 2757-70
M.K.マックファイル
“プロゲスチンの検定法”、J. Physiol.(London)、 1934, 83, 145-56
【0059】
注:トリメゲストンは、この試験において、1μg/kgの薬量から始まって黄体ホルモン様活性を、また経口投与で3及び10μg/kgの薬量で並びに皮下経路で3μg/kgの薬量で強い活性を有する。他方、子宮レースへのプロゲステロンの最高活性は皮下経路で1000μg/kgに位置している(4のマックファイル指数)。
【0060】
結果
得られた結果を以下の表に示す。
【表6】
平均は子宮レースについて得た(マックファイル指数)。
【0061】
結論
このクラウベルグ−マックファイル試験は、1mg/kgで化合物Bについて良好な黄体ホルモン様活性を示す(マックファイル指数:3.8)。
同様に、化合物Aは、0.01mg/kgの薬量から始まって活性であり(マックファイル指数:3.8)、1mg/kgの薬量で経口投与で皮下経路よりも良好な活性を表わす(マックファイル指数は3.8に対して4である。子宮角の強い肥大)。
さらに、子宮の切片の組織学的観察は、形態学的な異常を示さない。
Claims (16)
- R3 及びR4 がメチルである請求項1に記載の式(I)の化合物。
- R1 が水素原子であり、R2 がヒドロキシル基である請求項1に記載の式(I)の化合物。
- R1 がヒドロキシル基であり、R2 が水素原子である請求項1に記載の式(I)の化合物。
- 化合物名が
・[17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン、又は
・[17β−(S)]−6−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
であり、それらの立体異性体配置:1α−OH、1β−OH、6α−OH若しくは6β−OHのいずれか単独の形態又はそれらの混合物の形態にある請求項1〜4のいずれかに記載の式(I)の化合物。 - エストロゲン化合物と請求項1に記載の式(I)の化合物を含有する組成物。
- 17β−エストラジオールと請求項5に記載の式(I)の化合物を含有する組成物。
- 糸状菌が下記の菌株:
クニンガメラ・バイネリ ATCC9244
モルチエレラ・イサベリナ NRLL1757又はMMP108
フザリウム・ロゼウム ATCC14717
から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の製造法。 - 式(II)の化合物がトリメゲストン:
[17β−(S)]−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
であることを特徴とする、請求項8に記載の製造法。 - 糸状菌がクニンガメラ・バイネリ、モルチエレラ・イサベリナ又はフザリウム・ロゼウムであり、式(II)の化合物がトリメゲストンであり、これにより1−ヒドロキシル化及び6−ヒドロキシル化誘導体:
・[17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン、及び
・[17β−(S)]−6−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
を得、次いでこれらを分離することを特徴とする、請求項8に記載の製造法。 - 糸状菌がクニンガメラ・バイネリ ATCC 9244であり、式(II)の化合物がトリメゲストンであり、これにより1−ヒドロキシル化誘導体:
・[1α,17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン、又は
・[1β,17β−(S)]−1−ヒドロキシ−17−(2−ヒドロキシ−1−オキソプロピル)−17−メチルエストラ−4,9−ジエン−3−オン
を得ることを特徴とする、請求項8に記載の製造法。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の一般式(I)の化合物からなる薬剤。
- 請求項5に記載の一般式(I)の化合物からなる薬剤。
- 請求項6又は7に記載の組合せからなる薬剤。
- 請求項13〜15のいずれかに記載の薬剤の少なくとも1種を含有する製薬組成物。
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