PT799027E - Composicoes lipossomais de interferao hibrido - Google Patents

Description

vi DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES LIPOSSOMAIS DE INTERFERÃO HÍBRIDO"

Este invento está relacionado com composições farmacêuticas lipossomais contendo um interferão α híbrido, particularmente para o tratamento de doença do fígado de origem virai.

Ensaios clínicos recentes com interferões demonstraram a sua utilidade no tratamento de várias doenças, particularmente como agentes antiproliferativos no tratamento de vários tipos de cancro e como agentes antivirais no tratamento de, por exemplo, hepatite e sarcoma de Kaposi. No entanto, quando administrados terapeuticamente através do sistema circulatório, podem dar origem a vários efeitos secundários tóxicos. Ainda, os interferões recombinantes frequentemente induzem a produção de anticorpos neutralisantes. Tem sido proposta a encapsulação do interferão em lipossomas para ultrapassar estas desvantagens.

Journal of Interferon Research, vol. 2, n° 1, 1982, pp. 117-125 descreve lipossomas tendo uma composição lipídica de EPC/Col/PS = 4:5:1 e ainda compreendendo interferão alfa humano. No entanto não é ali especificamente referido um híbrido B/D do interferão a. Híbridos B/D do interferão α humano são particularmente interessantes como agentes antitumorais e antivirais. Em EP 0 331 635 descreve-se uma composição farmacêutica para o tratamento de cancro da bexiga compreendendo o híbrido BBDD ou BBDB do interferão α contido cm lipossomas formados por palmitoil-(9-cis-octadecenoil)-3-sn-fosfatidilcolina (POPC) e l,2-di-(9-cis-octadecenoil)-3-sn-fosfatidil-(S)-serina (OOPS).

Existe a necessidade de composições lipossomais de híbridos do interferão α tendo maior estabilidade, i.e. menor tendência para a saída da proteína, em particular composições lipossomais que sejam capazes de dirigir um híbrido do interferão α na forma protegida para as células do fígado como população celular alvo, particularmente no tratamento de doença do fígado de origem virai.

Encontrou-se agora que os lipossomas contendo um híbrido do interferão α encapsulado numa combinação particular de lípidos possui boa estabilidade, com retenção da actividade antiviral do híbrido de interferão a, e apresentam uma capacidade elevada para se associar às células do fígado.

Assim, o presente invento proporciona num aspecto uma composição farmacêutica compreendendo um híbrido B/D do interferão α contido em lipossomas, formados a partir de uma mistura de lípidos compreendendo 50 a 75 mol % de fosfolípido neutro, 20 a 40 mol % de colesterol e 5 a 10 mol % de fosfolípido carregado.

Num outro aspecto o presente invento proporciona a utilização de um híbrido do interferão α contido em lipossomas, como aqui definido anteriormente, na preparação de um medicamento para o tratamento de doença do fígado de origem virai. O híbrido de interferão α é um híbrido B/D do interferão α. A preparação de tais híbridos está descrita em US 4 414 150 e EP 0 205 404. Um híbrido especificamente preferido é o interferão <x BDBB, a prepração do qual -3-

r está descrita cm EP 0 205 404. O componente lipídico dos lipossomas, i.e. a mistura lipídica como

aqui descrita anteriormente, preferencialmente tem uma temperatura de transição de fase de 20 a 30°C. O principal componente da mistura de lípidos é preferencialmente o componente fosfolipídico neutro, o qual está preferencialmente presente numa quantidade de pelo menos 50 mol % da mistura lipídica. Para a membrana lipídica possuir uma temperatura de transição de fase dentro da gama preferida de 20 a 30°C, o componente fosfolípido neutro, que preferencialmente compreende uma ou mais fosfatidilcolinas, deverá preferencialmente ter uma temperatura de transição de fase de 20 a 30°C. Isto pode ser conseguido usando, como componente fosfolipídico neutro, (a) um fosfolípido simples, preferencialmente uma fosfatidilcolina como seja dimiristoilfosfatidilcolina ou 1-miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina tendo uma temperatura de transição de fase dentro desta gama, (b) uma mistura de dois ou mais fosfolípidos, preferencialmente fosfatidilcolinas como as aqui mencionadas, pelo menos uma delas tendo uma temperatura de transição de fase dentro desta gama ou (c) uma mistura de um fosfolípido, preferencialmente uma fosfatidilcolina, tendo uma temperatura de transição de fase superior a 30°C com um fosfolípido, preferencialmente uma fosfatidilcolina, tendo uma temperatura de transição de fase abaixo de 20°C.

Num modelo de realização preferido do invento, o fosfolípido neutro é dimiristoilfosfatidilcolina ou uma mistura dela com uma outra fosfatidilcolina neutra, a referida mistura tendo uma temperatura de transição de fase de 20 a 30°C. Em modelos de realização especialmente preferidos, dimiristoilfosfatidilcolina é usada como componente fosfolipídico neutro. O(s) fosfolípidos(s) é (são) preferencialmente carregado(s) negativamente. Fosfolípidos adequados carregados negativamente incluem fosfatidilse- ruías tais como dimiristoilfosfatidilscrina, dipalmitoilfosfatídilscrina ou dioleoil-fosfatídilserina, fosfatidilgiiceróis, ácidos fosfatídicos e fosfatidiletanolaminas. São preferidas as fosfatidilserinas, especialmente dioleoilfosfatidilserina. A mistura de lípidos como aqui definida compreende preferencial-mente compreende 50 a 75 mol % de fosfolípido neutro, 20 a 40 mol% de colesterol e 5 a 10% de fosfolípido carregado, mais preferencialmente 55 a 70 mol % de fosfolípido neutro, 25 a 35 mol% de colesterol e 5 a 10 mol % de fosfolípido carregado. Numa mistura lipídica especialmente preferida, a proporção molar de fosfolípido neutro:colesterol:fosfolípido carregado é de 9:5:1.

Os lipossomas deverão, preferencialmente, ter um tamanho médio das partículas não superiores a 200 nanómetros, especialmente 80 a 180 nanómetros.

De um modo geral é desejável ter uma proporção por peso de híbrido do interferão α para lípido tão alta quanto possível, desde que consistente com a estabilidade dos lipossomas. O máximo para esta proporção por peso pode variar, dependendo da natureza e composição do componente lipídico, mas em geral é provavelmente cerca de 1:200. No entanto, encontrou-se que se pode obter bons resultados com lipossomas em que esta proporção varia entre 1:400 e 1:300.

Os lipossomas contendo o híbrido de interferão α do invento podem ser preparados usando métodos conhecidos para a preparação de lipossomas contendo drogas. De acordo com o invento, um método preferido para a preparação de uma composição do invento, como aqui definida, compreende remoção do solvente, preferencialmente por liofilização, a partir de uma solução de uma mistura de lípidos, como aqui definida anteriormente, num solvente ✓*> -5- /<\V ¥J*~ f ' [ orgânico para dar- um resíduo de lípidos, mistura do resíduo de lípidos com um meio aquoso contendo o híbrido de interferão a, agitação da mistura resultante para obter uma suspensão aquosa de lipossomas contendo no seu interior o híbrido de interferão α e extrusão da suspensão obtida, facultativamente após diluição com um meio aquoso, através de um ou mais filtros de membrana.

Solventes orgânicos adequados para usar no método acima incluem alcoóis, éteres, hidrocarbonetos, halo-hidrocarbonetos e suas misturas. Têm sido obtidos bons resultados com alcoóis, especialmente tert-butanol. O meio aquoso contendo o híbrido de interferão α geralmente contem um tampão para manter o meio entre pH 7,0 e 8,0, preferencialmente entre 7,5 e 7,7. A agitação da mistura deste meio com o resíduo lipídico pode ser realizada de forma convencional, por exemplo usando um misturador Vortex ou agitando a alta velocidade. Os filtros de membrana adequados para a extrusão da suspensão aquosa de lipossomas, para obter o tamanho de partículas pretendido, incluem filtros de policarbonato convencionais tendo um tamanho de poro definido. A suspensão aquosa de lipossomas obtida após extrusão pode ser ainda tratada de forma convencional para separar os lipossomas do híbrido de interferão α não encapsulado, por exemplo por cromatografia seguido de diálise contra uma fase aquosa sem interferão.

Para fins de armazenamento, após a sua preparação, os lipossomas podem ser desidratados para se obter uma forma de pó. Esta desidratação é preferencialmente efectuada de forma convencional por liofilização de uma suspensão aquosa dos lipossomas. A liofilização é geralmente efectuada na presença de um crioprotector, preferencialmente um açúcar como seja sucrose, 6 - k*- Ϋ ^ maltosc, trcalosc ou, cspccialmente, lactose, para dar um pó compreendendo lipossomas desidratados misturados com crioprotector. Os lipossomas podem ser reconstituídos quando necessário por tratamento do pó desidratado com água de forma convencional. A composição farmacêutica do invento pode ser administrada parentericamente, por exemplo intramuscularmente, intradermicamente ou, preferencialmente, intravenosamente. A composição pode ser esterilizada e pode conter excipientes convencionais, tais como preservativos, estabilizantes, emulsionantes, solubilizantes ou tampões. A dose diária pode variar de acordo com a idade e peso do doente a ser tratado e com a doença em questão.

Experiências in vivo com ratos, usando a composição farmacêutica do invento, demonstraram um elevado grau de intemalização do híbrido de interferão α pelas células do fígado após administração intravenosa, indicando a adequação da composição para o tratamento de doenças do fígado de origem virai tais como hepatite B e hepatite C. O invento é ilustrado pelos Exemplos que se seguem.

Exemplo 1

Uma solução de uma mistura de dimiristoilfosfatidileolina, colesterol e dioleoilfosfatidilserina numa proporção molar de 9:5:1 (lg) em tert-butanol (10 ml) é aquecida a 50°C com agitação constante. Alíquotas (1 ml) foram transferidas para fiascos de vidro de 7 ml, os quais foram mantidos em azoto líquido até os seus conteúdos serem congelados e depois colocados num excicador metálico, pré-arrefecido, ligado a uma bomba de vácuo através de uma armadilha para solventes arrefecida. Os conteúdos dos fiascos foram liofilizados durante 24 horas numa câmara fria e o bolo de lípido resultante foi guardado a - O híbrido de interferão α rIFN-aBDBB (0,64 mg, 160 x 106 UI) em manitol aquoso 200 mM tamponado com fosfatos (pH 7,6) (5 ml) foi adicionado ao bolo de lípidos a 30°C e a mistura foi agitada suavemente num agitador Vortex durante 3 a 10 segundos. A suspensão de lipossomas resultante foi diluída para 50 ml com manitol tamponado com fosfatos e extrudido dez vezes a 30°C através de filtros de policarbonato, tendo um poro de 0,2 pm, sob pressão de azoto. A suspensão resultante, contendo lipossomas com um tamanho médio de 180 nm, foi cromatografada numa coluna de Sepharose CL-6B. As ffacções contendo os lipossomas foram recuperadas, reunidas e concentradas para 50 mg/ml de lípido usando ultrafiltração. A suspensão resultante foi dialisada durante a noite contra uma solução aquosa de lactose 0,26 M tamponada com fosfatos, depois filtrada, distribuída por frascos estéreis e liofilizada num lofilizador Lyovac GT-4 usando um programa de 24 horas.

Os lipossomas foram reconstituídos por tratamento dos conteúdos com água estéril apirogénica e cromatografados numa coluna de Sepharose L-6B; não foi detectada fuga do híbrido de interferão α dos lipossomas.

As experiências in vitro usando células WISH infectadas com vírus Semliki Forest mostra que o híbrido de interferão α encapsulado reteve a sua actividade antiviral nos lipossomas reconstituídos.

Exemplo 2 O Exemplo 1 foi repetido usando rIFNa-BDBB marcado com 125I. Os lipossomas obtidos foram sujeitos a estudos de farmacocinética in vivo, em que foram comparados com o híbrido de interferão α livre, num modelo de rato. -8-

Ratos machos Wistar foram injectados intravenosamente numa veia da cauda com o híbrido de interferão α lipossomal e livre, a dose do híbrido de IFN α sendo a mesma nos dois casos. Alguns animais foram sacrificados 15 minutos após injecção e outros foram sacrificados 2 horas após injecção. A radioactividade nos fígados dos animais sacrificados foi determinada por contagem gama e calculada a percentagem do híbrido de IFN α no fígado. Os resultados são os seguintes: % de Dose no fíeado 15 min 2 horas Híbrido de IFN α lipossomal 39,5 19,3 Híbrido de IFN oc livre 26,32 7,27

Lisboa, 4 de Maio de 2001 /fcllu/K'

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (11)

1. -1 - REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica compreendendo um híbrido B/D do interferão oc contido em lipossomas formados a partir de uma mistura de lípidos compreendendo 50 a 75 mol % de fosfolípido neutro, 20 a 40 mol % de colesterol e 5 a 10 mol % de fosfolípido carregado.
2. 2. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que o híbrido de interferão α é o híbrido BDBB do interferão a.
3. 3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o principal componente da mistura de lípidos é o componente de fosfolípidos neutros tendo uma temperatura de transição de fase de 20 a 30°C.
4. 4. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, em que o componente de fosfolípidos neutros compreende uma ou mais fosfatidilcolinas.
5. 5. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, em que o componente de fosfolípidos neutros é dimiristoilfosfatidilcolina ou uma sua mistura com uma outra fosfatidilcolina neutra, a referida mistura tendo uma temperatura de transição de fase de 20 a 30°C.
6. 6. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o componente de fosfolípidos carregados compreende um ou mais fosfatidilserinas.
7. 7. Uma composição de acordo com a reivindicação 6, em que o componente de fosfolípidos carregados é dioleoilfosfatidilserina. -2-
8. 8. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os lipossomas possuem um tamanho médio das partículas até 200 nanómetros.
9. 9. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proporção por peso do híbrido de interferão <x para a mistura de lípidos é entre 1:400 e 1:300.
10. 10. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os lipossomas estão na forma desidratada.
11. 11. A utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores na preparação de um medicamento para o tratamento de doença do fígado de origem virai. Lisboa, 4 de Maio de 2001

    1 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA