PT697885E - Factor de crescimento ii semelhante a insulina como agente anti-tumor - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO “FACTOR DE CRESCIMENTO Π SEMELHANTE À INSULINA, COMO AGENTE ANTI-TUMOR" A presente invenção refere-se ao-uso de IGF-II para a produção de um medicamento para o tratamento de tumores e especialmente para o tratamento de melanomas cutâneos. A incidência de melanomas cutâneos no Reino Unido é de aproximadamente 8000 por ano e tem vindo a aumentar; o tratamento da doença é normalmente ineficaz. Os melanomas primários podem ser removidos por meio cirúrgico e ser submetidos a bioquimioterapia, mas tal constitui apenas uma margem de sucesso. Estudos recentes provaram que os regimes de tratamento à base de interleucina-2 podem representar uma taxa de cerca de 20 por cento de resposta parcial/completa, havendo contudo necessidade de desenvolver novas terapias para tratamento de tumores disseminados.

Os melanomas do corpo ciliar e da coróide são a malignidade intra-ocular primária mais comum nos adultos e são fatais para aproximadamente metade dos doentes. A incidência no Reino Unido é de sete em um milhão, por ano. A morte verifica-se num período de 15 anos após o tratamento inicial e as metástases, quase exclusivamente no fígado, são responsáveis por praticamente todas as mortes relacionadas com o tumor. A sobrevivência média é inferior a seis meses. Apesar do desenvolvimento de técnicas que possam preservar a visão, afastando a necessidade de enucleação ou remoção local, a sobrevivência do doente em geral, permaneceu inalterada. Na maioria dos casos fatais, a disseminação do tumor ocorreu provavelmente antes do doente se apresentar para tratamento. O reconhecimento do alastramento precoce do tumor, ou a identificação dos doentes com maior risco de desenvolver metástases, juntamente com, até à data, formas de tratamento indefinidas que visam a destruição de doenças metastáticas ocultas 2

permanecem a nossa melhor esperança para a forma de lidar futuramente com tais tumores. O factor II de crescimento, semelhante à insulina (IGF-II) consiste num péptido presente no plasma e outros fluidos corporais. Este compreende 67 aminoácidos, incluindo 3 ligações dc dissulfureto c a sua sequência primária rcvcla-sc homóloga ao IGF-1, em 64%. Pode estimular o crescimento de uma grande variedade de tipos de , .células. . O IGF-II foi purificado a partir do plasma humano e a sequência· completa de aminoácido é conhecida. As sequências com homologia extensiva ao IGF-II humano estão presentes no IGF-II purificado a partir do plasma de outras espécies. O IGF-II possui tanto efeitos sistémicos como locais e parece estar maioritariamente associado a diferentes proteínas de ligação específica, seis das quais formam uma sequência e são designadas por IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5 e IGFBP6. Estas parecem modular as funções biológicas e a disponibilidade do IGF-Π, quer que forma positiva, quer de forma negativa. O IGF-II parece actuar principalmente por interacções com o receptor IGF de tipo 1 exposto na superfície exterior das membranas de plasma, em muitos tipos de células diferentes - embora a especificidade de acção relativa possa ser encontrada devido à influência das proteínas de ligação. O IGF-II pode também ter acções distintas, quando se liga a um receptor de tipo 2, distinto e não relacionado, também existente nas membranas celulares. O IGF-II foi apresentado para reduzir, a título experimental, o estado catabólico em animais famintos e para antagonizar algumas acções metabólicas do IGF-1 (“Koea et al. Endocrinology” 1992,130,2423-2425).

Os factores de crescimento IGF-I e IGF-II semelhantes à insulina revelaram ser polipéptidos mitogénicos homólogos à insulina, a nível estrutural e funcional. São capazes de sustentar a diferenciação em muitos tipos de células fetais e embrionárias, e para determinados cancros o padrão de crescimento pode reflectir a expressão do gene de IGF-Ie IGF-II. 3

^einze-Erian et al., Endocrinology“, (1991) Vol 129, No.4,1769, relata que existe um papel essencial para ambos os receptores IGF, na regulação ila iriilogénese e no crescimento da célula. A produção comercial de IGF-Π em grande escala pode, hoje em dia, ser prontamente alcançada, utilizando técnicas de recombinação do DNA. É apresentada uma revisão por Schofíeld e Engstrom in “The Insulin like growth factors Structure and biological fíinctions, pages 240-57 (1992, OUP)” relativamente à expressão do IGF-Π por uma grande variedade de tumores humanos. A razão para o elevado grau de interesse na expressão do IGF-II no tumor deve-se ao facto de: 1) os tecidos adultos extra-hepáticos não produzirem normalmente grandes quantidades de IGF-Π e 2) o IGF-II ser mitogénico para muitos tipos de células. A conclusão lógica é a de que o IGF-Π pode actuar para produzir a proliferação não planeada da célula, que poderá ou não iniciar ou promover o crescimento do tumor. Embora a informação varie, de sistema para sistema, e embora seja possível demonstrar o crescimento auto/paracrinia, quer potencial quer efectivo, a partir de dados descritivos, dados experimentais, dependentes da cultura da célula ou da cultura xenográfica, existe divergência quanto à estimativa sobre o efeito limitador do grau de potencial do IGF-Π no crescimento do tumor. “Schofíeld et al (Brit. J. Câncer, 63, 687-692 (1991))”, de forma a examinar o potencial papel do IGF-II no crescimento do tumor, produziu um retrovírus recombinante contendo e expressando um IGF-Π cDNA e usou-o para infectar uma linha celular fibroblástica clonada do rato cancerígeno. Quando as células foram infectadas no interior de ratos atímicos, tais clones que expressam IGF-II a partir da construção de DNA deram início a tumores com um período de latência muito maior do que a linha celular parental, não expressiva do IGF. A interpretação da experiência publicada está aberta à discussão. A experiência não demonstrou que o efeito anti-proliferação 4 observado foi directamente interposto pelo IGF-Π e pode ser devido a outro aspecto da construção, à linha celular (por exemplo, a variação interdunal cm capacidade de crescimento) ou ao procedimento inventado para levar a cabo a experiência.

Os nossos estudos revelaram agora que o IGF-II exógeno, ou seja o IGF-II administrado directamente ao tumor sob tratamento, possui um efeito inibidor ou retardatário no crescimento do tumor, mas que o IGF-I não tem este efeito. Tal é inesperado e surpreendente e nãopoderiater sido previsto por resultados publicados anteriormente. Q..e IGF-Π é tradicionalmente considerado mitogénico, ao invés de agente cdtostático ou citocidal.

Consequentemente, este resultado é totalmente contra-intuitivo. Não houve até à data qualquer relatório prévio de um efeito anti-proliferativo do IGF-II. A fim de demonstrar um efeito directo do péptido IGF-Π na proliferação, foi necessária uma entrega directa, sem qualquer processo intermediário. Relatamos na presente os resultados de tal experiência com a informação de apoio, mostrando que independentemente de um mecanismo directo ou indirecto, o efeito anti-proliferativo é consistente com o efeito do próprio péptido. A presente invenção refere-se ao uso do IGF-II para a produção de um medicamento para o tratamento de tumores, especialmente para o tratamento de melanomas cutâneos e para inibição do crescimento de células do melanoma. O IGF-II é administrado sistematicamente ou localmente e pode ser administrado de modo tópico.

Figura 1: Efeitos da co-inoculação da latência

Figura 2: Efeitos do IGF-II exógeno na latência do tumor. O IGF-II utilizado foi produzido pela Kabi Pharmacia. 5 EXEMPLO 1

Efeitos inibidores do crescimento do IGF-II in vitro

Numa série de experiências designadas para avaliar o efeito do IGF-Π no crescimento da linha celular (A375) do melanoma humano, observou-se em estudos preliminares, que o IGF-II era inibidor do crescimento. a) Adicionou-se IGF-II a três linhas celulares, nomeadamente às células da linha celular -M-..A375 do melanoma humano, a uma sublinha - NUPRI, resultantedapassagem in-vivo da A375 e as células melanosa da úvea posterior - Mel 66. As linhas celulares foram desenvolvidas em pratos microtitre, num agente isento de soro e as sínteses de DNA foram estabelecidas a 48 horas, ao fazer vibrar as células com 3H-timidina. Numa série extensiva de experiências, 10 ng/ml de IGF-II ou concentrações maiores foram apresentadas para inibir a proliferação da célula, conforme avaliado pela captação de 3H-timidina. Consultar a tabela 1.

Tabela 1

Efeitos do factor de crescimento na proliferação da célula do melanoma

Efeito no crescimento celular de Factor de Crescimento A375 NUPRI Mel66 Ocular IGF-I Sem efeito Não efectuado Sem efeito IGF-II Inibição Inibição Sem efeito b) O efeito anti-proliferativo do IGF-II foi mediado, quer durante a fase “S” tardia, quer na fase G2/M precoce, conforme alcançado por meio de análise de citometria de fluxo. Nestas experiências, as células A375 tratadas com o IGF-II foram coradas com mitromicina e brometo de etídio e a fase proliferativa foi analisada.

Os resultados são sugestivos de um bloco G2/M no ciclo celular. Em estudos posteriores, utilizando três outras linhas celulares do melanoma (um sub-clone do A375, NUPRI e Mel66), revelou-se que duas das três linhas também tinham predisposição 6

para a inibição do crescimento por meio do IGF-II. Ver a tabela 2 para conhecer os resultados com ο A375.

Tabela 2

Factor Células em Células em Células em de Crescimento Go/Gi Fase “S” g2/m Controlo 52,5 23,8 11,7 IGF-Π 23,0 -- ^54,0- · 9,5

O Controlo consiste no diluente, sem o IGF-II

Os nossos resultados revelam que o crescimento das linhas celulares do melanoma cutâneo é modulado pelo IGF-II e que este efeito ocorre possivelmente por intermédio do local de ligação do receptor do tipo 2. É também revelado que o IGF-II e a transdução do sinal subsequente à ligação deste ligando às células do melanoma influenciam a proliferação do sinal, e claramente esta descoberta tem um potencial significado terapêutico. EXEMPLO 2

Efeito Trans de expressar o péptido em tumores mistos.

Investigar se a repressão do crescimento da célula do tumor foi interposta por um sinal segregado, conforme poderia esperar-se do IGF-Π, ou se a expressão da construção estava a afectar a propriedade autónoma da célula.

Este exemplo confirma os estudos iniciais de Schofield et al e demonstra que o efeito de expressar o IGF-Π pode ser em trans (ou seja, através de um factor difusível) e está sujeito a uma resposta da dose.

As células que contêm uma construção cancerígena e não cancerígena em diferentes proporções foram misturadas antes de serem injectadas no interior de um rato atímico. O número de células cancerígena manteve-se em 5xl06 por enxerto e reprimiu células adicionadas até 20x este número. As experiências de controlo demonstraram que, 7 / enquanto que isto reduziu efectivamente a latência do tumor nas células reprimidas, de um modo inócuo dependente do tamanho, o aumento da latência da célula não transfectada foi desproporcionado.

Um número constante de células cancerígenas (5x106) foi inoculado para um local único, juntamente com um número igual ou superior de células reprimidas, aos níveis apresentados na Figura 1. ” · *C“' ·/ .......-»·

Balb/c significa uma célula de clone cancerígena parental Bali 2 significa uma célula que expressa IGF-II Balb/c / Bal 12 significa uma mistura de tais células.

Bal 9 significa uma célula que expressa um nível reduzido de IGF-Π Balb 9 / Bal 12 significa uma mistura de tais células. A Bal 12, com inóculos divergentes, foi utilizada como controlo, ou seja, o mesmo número de células que o existente nos enxertos misturados foi colocado individualmente dentro de cada local.

Na figura 1 é apresentado o número de dias de latência, na altura em que as células cancerígenas foram inoculadas juntamente com células normais, a diferentes níveis. A informação apresentada na figura 1 indica que o número crescente de células segregadas de IGF-II reprimidas tem capacidade para reduzir a percentagem cancerígena da linha celular parental. Tal pode dever-se, tanto às interacções de inibição metabólica, não relacionadas com a síntese do IGF, ou a uma propriedade de combinação das células que contêm a construção de IGF-II. A utilização da linha celular B 9 que expressa uma percentagem reduzida de IGF-II indicou que os enxertos menos cancerígenos são mais susceptíveis aos efeitos repressivos de serem co-enxertados com células reprimidas, a uma entrada muito inferior de células reprimidas, quando comparados com a linha parental balb/c. Isto sugere que o efeito trans é uma consequência, directa ou indirecta, da expressão do IGF-Π. EXEMPLO 3

Efeitos do IGF-II exógeno na latência do tumor

As células 5x106 foram transplantadas para os ratos na zona supra-escapular e uma mini-bomba osmótica de Alzet foi cheia de IGF-II dissolvido em salina tamponada com fosfato / 50pg/ml BSA, “Bovine Serum Albumin” - Albumina de Soro de Bovino, (Grau RIA), e implantado próximo. Em alguns casos, um pequeno tubo dc cateter foi ligado à extremidade da bomba e foi ligado, por meio de uma sutura única, à camada de músculo inferior para o estabilizar. Em cada um dos casos, a. orientação e proximidade da saída da bomba, relativamente ao enxerto, foi verificada 12 horas depois e em dias subsequentes, por forma a garantir que não tinha havido deslocamento. Passados 7 dias a bomba foi removida, fazendo uma incisão por detrás da parte posterior do implante e a zona do tumor foi observada por palpação, em intervalos de 24 horas. A formação de tumores foi calculada como o primeiro de dois dias sucessivos, em que poderia ser palpado um inchaço subcutâneo. Durante a ressecção, verificou-se que este compreendia uma pequena massa tumoral distinta, com cerca de 2-4 mm de diâmetro. A Bal 12* consiste numa linha de Bal 12 que perde espontaneamente a sua estrutura de IGF-II, seguindo-se uma passagem contínua na cultura, na ausência de meios selectivos. A latência é expressa em dias, entre o enxerto e a primeira palpação. Cada ponto de informação consiste na latência média dos tumores em 5 ratos individuais. A variação entre latências dentro de um grupo situava-se, em cada caso, em 10% da média.

As células parentais 5x106 foram inoculadas no interior de 7 ratos, no dia 0. Em dois destes foram colocadas mini-bombas osmóticas (0,47 μΐ/hora, cheias para administrar 21,5 ng/ de IGF-II/hora), dois receberam bombas que administravam 42 ng/hora, e apenas um rato recebeu uma bomba que administrava 83 ng/hora. Os ratos foram observados diariamente por palpação, tendo a duração da primeira palpação do tumor sido anotada, como anteriormente.

Na figura 2, o efeito do IGF-II exógeno na latência do tumor é apresentado quando um número constante de células cancerígenas (5x1o6) foi inoculado para um local único, juntamente com um número igual ou superior de células suprimidas, nos níveis 9

4 ? '· ·· - , apresentados. Como forma de controlo (Ba 12) o mesmo número de células que as existentes nos enxertos misturados foi colocada isoladamente no interior de cada local.

Temos tido a oportunidade de demonstrar uma dependência da dose da latência de IGF-II administrada decorridos 7 dias. Com uma elevada correlação (^=0,753 e um coeficiente da correlação, de 0,868), as doses aumentadas dc IGF-II resultam na decrescente probabilidade de tumor na linha celular parental.

Lisboa, j y DEZ. U.

Maria Silvina Ferreira

ADVOGADA

Agente Oficiai de Propriedade Industrial R. Castilho. 50-5!- 1250 - 071 LISBOA Tel. 2138150 50 - Fax. 21383 1150

Claims (5)

1 \ REIVINDICAÇÕES ( \ 1. Utilização de IGF-II para a produção de um medicamento para o tratamento de tumores.

2. Utilização de IGF-Π de acordo com a reivindicação 1, para a produção de um medicamento para inibição do crescimento das células do melanoma. ·· ..t V' t* , v 5> * ·

3. Utilização de IGF-II de acordo com a reivindicações 1 e 2, para a produção de um medicamento para o tratamento de melanomas cutâneos.

4. Utilização de IGF-Π de acordo com a reivindicação 3, para produção de um medicamento para administração sistémica, destinado ao tratamento de melanomas cutâneos.

5. Utilização de IGF-Π de acordo com a reivindicação 3, para produção de um medicamento para administração local, destinado ao tratamento de melanomas cutâneos. Lisboa, 1 2 DEZ. 2001

Maria Silvina Ferreira ADVOGADA Aijenle Oficiãl de Pr opriedade Industrial K. Casiilho, 50-5?- 1250 - 071 LISBOA Tel. 21 38150 50 - Fax. 21383 1150