PT685235E - Extractos de piliostigma thonningii, sua utilizacao e formulacoes que os contem - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

“EXTRACTOS DE PILIOSTIGMA THONNINGII, SUA UTILIZAÇÃO E FORMULAÇÕES QUE OS CONTÊM” A Piliostigma thonningii Schum, uma planta disseminada no continente africano, é uma planta leguminosa de tronco curto típica da savana; no Tanganica e na Rodésia utiliza-se a casca da raiz desta planta, fervida em leite, para o tratamento da tosse; os Swahilis comem as folhas em pequenas quantidades para tratar complicações pulmonares e os Has mastigam folhas frescas como remédio contra a tosse. Em muitos outros países africanos há outros tipos de utilizações. Ainda em África, há diferentes partes da planta que são utilizadas para curar as gengivas inflamadas e para a medicação de feridas e diversas ulcerações.

No decorrer das pesquisas experimentais para a verificação das propriedades da planta, descobriu-se surpreendentemente que os ex-tractos preparados de acordo com a invenção possuem actividade antiviral sobre vírus patogénicos humanos recentemente isolados a partir de pessoas infectadas.

Sob o ponto de vista químico, pouco se sabe acerca da composição das raízes, dos ramos e das folhas da planta Piliostigma thonningii. 0 produto extraído a partir da casca dos ramos continha até cerca de 20% de tanino, mas a sua composição não foi esclarecida, ao passo que nas folhas foram identificados alguns flavonóides e terpenos, tais como o ácido lambertiânico e o lambertianol.

Os extractos da presente invenção são preparados extraindo todas as partes da planta, separada ou conjuntamente, com cetonas ou álcoois alifáticos de baixo peso molecular, diluídos com água. As cascas da raiz e do tronco são extraídas principalmente com uma solução aquosa de acetona numa concentração compreendida entre 9:1 e 2:8 e de preferência de 6:4, a uma temperatura compreendida ente 25°C e 60°C e de preferência a 40°C. As folhas, pelo contrário, são 1

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extraídas principalmente com misturas de álcoois ou cetonas, normalmente com acetona, numa proporção entre solvente/água de 4:6, para evitar a extracção de clorofila e de substâncias lipofílicas indesejáveis que demonstraram ser inactivas ao longo da pesquisa. Os extractos resultantes, tal como adiante ilustrado nos exemplos, são submetidos aos passos de tratamento seguintes: a) eliminação do solvente mediante concentração a uma temperatura inferior a 40°C; b) filtração ou centrifugação para remover dos resíduos gomosos as substâncias indesejadas que se formam durante a eliminação do solvente; c) extracção do próprio extracto aquoso límpido com acetato de etilo, até se esgotar completamente a existência de substâncias extraíveis, e eliminação dos extractos orgânicos; d) cromatografia da fase aquosa numa coluna de resina de adsorção, tal como os produtos ‘XAD-4’, ‘XAD-2’, ‘Duolite’ e outras resinas de matriz de polistireno; repetição da eluição com cetonas ou álcoois alifáticos de baixo peso molecular, diluídos com água, de preferência com uma solução aquosa de acetona em percentagens diferentes e normalmente com uma solução aquosa de acetona a 40%; e) concentração parcial do produto de eluição proveniente da coluna, sob vácuo e a uma temperatura não superior a 60°C; f) evaporação do concentrado até à secura, sob vácuo; g) dissolução do resíduo num pequeno volume de metanol; e h) tratamento da solução com uma quantidade de cloreto de meti-leno suficiente para precipitar o ingrediente activo.

Obtém-se um precipitado avermelhado abundante, solúvel em água e insolúvel em todos os solventes apróticos, que possui actividade antiviral. Este produto pode ser utilizado tal qual ou pode ainda ser fraccionado numa coluna, por exemplo, de ‘Sephadex LH 20’ ou sobre matrizes equivalentes, em conformidade com o protocolo seguinte: faz-se adsorver o extracto, dissolvido em etanol a 95%, sobre a Γ matriz, seguindo-se a eluição das substâncias indesejáveis de baixo peso molecular, utilizando para tal o mesmo solvente; a eluição prossegue com misturas de etanol/água, de preferência entre 30% e 60% num solvente orgânico, ou preferencialmente com misturas de acetona/água entre 29% e 70% num solvente orgânico, de preferência entre 35% e 45%. Os produtos dè eluição em solução aquosa de álcool ou acetona são recolhidos em fracções que, após confirmação por passagem através de gel, são reunidas em função da semelhança de pesos moleculares, seguindo-se a concentração, para eliminar o solvente, e a liofilização. As fracções com pesos moleculares compreendidos entre 1500 e 2500 dalton, e de preferência com um peso molecular de cerca de 2100 dalton, demonstraram ser particularmente activas.

Em alternativa, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de extractos de Piliostigma thonningil, o qual consiste em extrair todas as partes da planta, separada ou conjun-tamente, com cetonas ou álcoois alifáticos de baixo peso molecular, diluídos com água, submetendo depois os extractos resultantes a vim tratamento que consiste nos passos seguintes: a) eliminação do solvente por concentração a uma temperatura inferior a 40°C; b) filtração ou centrifugação para remover dos resíduos gomosos as substâncias indesejadas que se formam durante a eliminação do solvente orgânico; c) extracção do próprio extracto aquoso límpido com acetato de etilo, até se esgotar completamente a existência de substâncias extraíveis, e eliminação dos extractos orgânicos; d) extracção da solução aquosa obtida no passo c) com misturas a 95:5 de n-butanol/tolueno, seguindo-se a concentração e o tratamento com cloreto de metileno para dar origem a vim precipitado. Testou-se a actividade antiviral recorrendo a métodos convencionais descritos na literatura ou parcialmente modificados pela requerente. A título de exemplo, criou-se em cultura células de macaco (células de macaco verde africano (VERO), Fl.ow Laboratories 3

Ltd., Irvine, Escócia) em meio TC-199 contendo 1% de glutamina, ao qual se adicionou soro de vitelo (5% nas culturas não infectadas e 2,5% nas infectadas), contendo ou não o vírus que se pretende testar e na presença ou na ausência da substância activa que se pretendia testar.

Para avaliar os extractos da presente invenção foram efectuados dois tipos diferentes de contraprovas: uma delas correspondente à actividade antiviral real e a outra relativa à citotoxicidade das substâncias, por forma a definir a relação entre actividade/toxi-cidade. As células VERO, numa concentração de 2 x 10-% foram depositadas em camadas numa placa; após 24 horas de incubação, infectou-se as monocamadas celulares com o vírus seleccionado e imediatamente a seguir tratou-se com diversas concentrações à escala dos derivados de Piliostigma thonningii·, decorridas 24 horas procedeu-se à avaliação da actividade específica, utilizando para tal um microscópio.

Para avaliar a citotoxicidade, as células VERO, numa concentração de 1 x 105, foram depositadas em camadas; decorridas 24 horas separou-se as células do meio de cultura que, por sua vez, foi substituído por outro meio de cultura que continha diferentes concentrações dos extractos que se pretendia testar. Ao fim de 48 horas, efectuou-se a fixação das células com 1% de glutaraldeído em solução de Hank, lavou-se as placas com água desionizada durante 15 minutos e secou-se ao ar; extraiu-se o corante (Violeta de Cristal) que estava adsorvido nas células, utilizando para tal uma solução a 0,2% de ‘Triton X-100 2’, e depois analisou-se por via espectrofoto-métrica. A citotoxicidade foi mais facilmente testada por incubação das células, tal como indicado antes, com uma densidade de 2 x 104 por cavidade; decorridas 24 horas removeu-se o meio e tratou-se as células com as substâncias de ensaio; depois de se incubar durante 48 horas, adicionou-se às células ^-timidina à razão de 0,5 mCi/placa. Incubou-se as células durante mais 16 horas, em atmosfera de C02, e depois efectuou-se a medição quantitativa da incorporação, utilizando para tal um contador de cintilação. Deste modo, avaliou--se a grandeza CC5o (concentração que reduz em 50% a absorção de timidina em comparação com as contraprovas). 4 Γ L-Cj A pesquisa efectuada sobre os derivados de Piliostigma thonningii permitiu identificar substâncias que possuem actividade antiviral para os vírus do herpes humano (Herpes simplex 1 e 2), para o citomegalovírus e para os HSV-1 e HSV-2; além disso, os extractos demonstraram ser activos sobre diferentes estirpes de vírus da gripe e sinciciais. A título de exemplo, com o vírus do herpes, utilizando o extracto por fraccionar (exemplo I) numa concentração de 15,6 μg/mL, obteve-se uma redução de 100% na formação das placas, comparativamente com as contraprovas, e uma citotoxicidade de 62,5 pg/mL; a relação entre actividade/toxicidade é nitidamente a favor da actividade, pelo que o composto é pois possuidor de um índice terapêutico valioso. Os valores CE50 do mesmo produto, no que diz respeito à replicação dos vírus HSV-1 e HSV-2, foram respecti-vamente de 22,4 pg/mL e 36,2 μg/mL. As fracções deste extracto, tal como as dos extractos descritos nos exemplos III e IV, evidenciaram uma actividade específica superior à do extracto de partida, aumentando ainda mais a relação actividade/toxicidade. Os valores CE5o face aos vírus do herpes foram, por exemplo, respectivamente de i 5,1 μg/mL e 6,4 pg/mL, com uma citotoxicidade acima de 100 pg/mL.

Relativamente ao vírus para-gripal, os extractos revelaram uma actividade surpreendentemente elevada em todos os testes, demonstrando deste modo que são valiosos para o tratamento das mais variadas formas de gripe.

Até ao presente momento, muito pouco se sabe acerca do mecanismo de acção ou da identificação correcta dos princípios activos. Os princípios activos dos extractos da presente invenção são parcialmente de natureza polifenólica e são provavelmente activos (vírus VIH) para reduzir a expressão do antigénio em cultura e para reduzir a formação de sincícios. Neste sentido, verificou-se que os extractos são particularmente activos nos diversos modelos celulares utilizados, quando o produto é adicionado à cultura simultaneamente com a entrada do vírus, e não depois de o vírus já ter entrado. A partir destes dados é possível inferir que o extracto, ou as suas fracções, actua nas primeiras fases da infecção, embora não possa

Γ ser excluído o facto de a sua actividade poder inibir a acção enzi-mática da transcriptase reversa e/ou da protease.

Os extractos da presente invenção são activos nos seres humanos, partindo de doses compreendidas entre 10 mg-, e 5 g por dia, em função da via de administração e da gravidade da doença que se pretende tratar. Para o tratamento de herpes é possível administrar os extractos e as suas fracções sob a forma de unguentos ou formulações para aplicação tópica, conforme necessário para este tipo de terapia, ou pelas vias oral ou intravenosa; para todos os outros tipos de vírus, os extractos são administrados principalmente por via oral e intravenosa ou sob a forma de aerossóis, simplesmente dissolvidos em água ou então transportados por excipientes convencionais .

De acordo com outro objecto da presente invenção, as formulações orais dos extractos da presente invenção são preparadas com fosfolípidos, tanto naturais como sintéticos. De preferência, a proporção entre o fosfolípido e o extracto (ou as fracções de extracto) varia entre 1 e 3 partes em peso; as misturas destes extractos com fosfolípidos são normal e preferencialmente administradas em cápsulas de gelatina mole, na presença de veículos, tais como migliol e semelhantes, em cápsulas de gelatina dura ou em comprimidos.

Os extractos da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento de casos agudos ou crónicos, dependendo da patologia; nem o extracto nem as suas fracções provocam nenhuns efeitos tóxicos particularmente notáveis quando administrados por via oral, numa dose até 5 g/kg, aos ratos e aos murganhos, sendo tolerados numa dose até 500 mg/kg ao serem administrados por via intravenosa.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem contudo a limitarem. EXEMPLO I - Preparação do extracto total purificado de casca da raiz de Piliostigma thonningii

Efectua-se a extracção de 5 kg de casca da raiz de Piliostigma thonningii, à temperatura de 40°C, finamente triturada, utilizando 6

para tal 10 volumes de uma mistura a 60% (p/p) de acetona/água; a extracção é realizada sob agitação e repete-se três vezes. Concentra--se os extractos em solução aquosa de acetona para eliminar completamente a acetona; durante o passo de concentração tem lugar a precipitação dos materiais insolúveis em água, os quais são rigorosamente removidos por centrifugação. Depois de se extrair com acetato de etilo, faz-se passar a solução aquosa límpida muito lentamente através de uma coluna que contém 5 kg de resina de adsorção XAD4; após a passagem do extracto, a eluição da coluna prossegue com água desmineralizada até se obter água incolor ou eventualmente com uma quantidade de resíduos inferior a 0,001%. A seguir efectua-se a eluição da resina com uma solução aquosa de acetona a 40%. A eluição prossegue até se obter um líquido incolor. Concentra-se o produto de eluição proveniente da coluna até se obter um volume de 5 L, a uma temperatura não superior a 40°C; filtra-se o concentrado para remover quaisquer resíduos insolúveis e seca-se em aspersão para se obter 250 g de extracto seco que pode ser utilizado tal qual ou então pode ser novamente purificado, em conformidade com o exemplo II. Este extracto possui um valor El% de 690 a 260 nm em MeOH. O produto é solúvel em água, álcool e acetona, sem restrições, e é insolúvel em solventes clorados e éteres. É possível utilizá-lo para o tratamento de doenças de origem virai. EXEMPLO II - Purificação do extracto de Piliostigma thonningii

Dissolve-se 200 g do extracto de Piliostigma thonningii, preparado de acordo com o Exemplo I, em 1 L de acetona anidra e depois de se completar a dissolução verte-se sobre 5 L de cloreto de metileno, sob agitação vigorosa; forma-se um precipitado abundante que é recolhido por centrifugação, lava-se novamente com cloreto de metileno até se obter águas-mãe incolores e finalmente seca-se, sob vácuo e à temperatura de 40°C, até se remover completamente o solvente. Obtém-se 170 g de um composto avermelhado que pode ser utilizado para o tratamento de doenças virais. n ^~v ^ Ο espectro de cromatografia SEC do extracto tem o perfil ilustrado na figura anexa. EXEMPLO III - Fraccionamento do extracto de casca da raiz de Piliostigma thonningii

Dissolve-se 20 g do extracto, preparado em conformidade com um dos exemplos I ou II, em 500 mL de etanol a 95% e submete-se a cromatografia, utilizando uma coluna que contém 350 g de ‘Sephadex LH20’, previamente equilibrada com o mesmo solvente. Após a adsorção da solução, efectua-se a eluição da coluna com etanol até se esgotar a existência de.substâncias solúveis. Elimina-se o produto de eluição com etanol e depois efectua-se a eluição da coluna com uma solução aquosa de acetona a 40%. Concentra-se a solução aquosa de acetona sob vácuo, até se obter um volume de 200 mL, e liofiliza-se o concentrado. Obtém-se 6 g de um produto com uma coloração vermelho--tijolo, com um peso molecular médio de 2018 dalton e que pode ser utilizado, sem mais purificação, como agente antiviral. EXEMPLO IV - Preparação de um extracto de casca do tronco de Piliostigma thonningii

Em conformidade com o procedimento descrito no exemplo I, procede-se à extracção de 5 kg de casca do tronco de Piliostigma thonningii, finamente triturada; após a filtração dos materiais insolúveis, extrai-se o concentrado aquoso com 20 L de acetato de etilo; elimina-se a fase orgânica e extrai-se a fase aquosa com uma mistura a 95:5 de n-butanol/tolueno até se esgotar a existência de substâncias que são extraiveis com este solvente. Seca-se os ex-tractos combinados sobre Na2S04 e concentra-se sob vácuo até se obter o volume de 1 L. Verte-se o concentrado sobre 5 L de cloreto de metileno, sob agitação vigorosa. Lava-se muito bem o precipitado que se forma, utilizando para tal cloreto de metileno, e seca-se sob vácuo à temperatura de 40°C. Obtém-se 150 g de um produto que possui actividade antiviral. Este produto pode ser purificado em conformidade com o procedimento descrito no exemplo III. 8 EXEMPLO V - Formulação para aplicação tópica que contém um extracto de Piliostigma thormingii

Mistura-se 20 g de extracto purificado de Piliostigma thormingii, preparado de acordo com o exemplo III, com 40 g de fosfatidil--colina da soja e dissolve-se tudo em 600 mL de uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 9:1; após a completa dissolução dos dois produtos, remove-se o solvente sob vácuo. Efectua-se a micro-dispersão do sólido resultante, sob agitação vigorosa, em 1200 mL de água desionizada. Gelifica-se a microdispersão aquosa por adição de carboximetil-celulose a 1%. Este gel aquoso é utilizado para o tratamento tópico de doenças herpéticas. EXEMPLO VI - Preparação de cápsulas de gelatina mole que contêm 150 mg de uma fracção purificada de Piliostigma thonningii

Mistura-se 20 g de extracto purificado de Piliostigma thonningii, preparado de acordo com o exemplo III, com 40 g de fosfatidil--colina da soja e dissolve-se tudo em 600 mL de uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 9:1; após a completa dissolução dos dois produtos, remove-se o solvente sob vácuo. Com o sólido resultante prepara-se uma suspensão em 180 mL de migliol e procede-se ao enchimento de cápsulas de gelatina mole com uma quantidade de 450 mg da mistura de extracto/fosfolipido.

Lisboa, 14 de Fevereiro de 2000

AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE LNDUSTRIAL

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Claims (16)

1. V U. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de extractos de Piliostigma thormingii, o qual consiste em extrair todas as partes da planta, separada ou conjuntamente, com cetonas ou álcoois alifáticos de baixo peso molecular, diluídos com água, submetendo-se depois os extractos resultantes a um tratamento caracterizado pelos passos seguintes: a) eliminação do solvente mediante concentração a uma temperatura inferior a 40°C; b) filtração ou centrifugação para remover dos resíduos gomosos as substâncias indesejadas que se formam durante a eliminação do solvente orgânico; c) extracção do extracto aquoso límpido com acetato de etilo até se esgotar completamente a existência de substâncias extraíveis e eliminação dos extractos orgânicos; d) cromatografia da fase aquosa numa coluna de resina de adsor-ção; repetição da eluição com cetonas ou álcoois alifáticos de baixo peso molecular, diluídos com água; e) concentração parcial do produto de eluição proveniente da coluna, sob vácuo e a uma temperatura não superior a 60°C; f) evaporação sob vácuo do concentrado, até à secura; g) dissolução do resíduo num pequeno volume de metanol; e h) tratamento da solução com uma quantidade de cloreto de meti-leno suficiente para precipitar o ingrediente activo que é um precipitado avermelhado, solúvel em água e insolúvel em solventes apróticos, o qual possui actividade antiviral e é parcialmente de natureza polifenólica.
2. 2. Processo para a preparação de extractos de Piliostigma thormingii, o qual consiste em extrair todas as partes da planta, separada ou conjuntamente, com cetonas ou álcoois alifáticos de baixo peso molecular, diluídos com água, submetendo-se depois os extractos resultantes a um tratamento caracterizado pelos passos seguintes: 1 V r a) eliminação do solvente mediante concentração a uma temperatura inferior a 40°C; b) filtração ou centrifugação para remover dos resíduos gomosos as substâncias indesejadas que se formam durante a eliminação do solvente orgânico; c) extracção do extracto aquoso límpido com acetato de etilo até se esgotar completamente a existência de substâncias extraíveis e eliminação dos extractos orgânicos; d) extracção da solução aquosa obtida no passo c) com misturas de n-butanol/tolueno a 95:5, seguindo-se a concentração e o tratamento com cloreto de metileno para proporcionar um precipitado.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a repetição da eluição do passo d) se efectuar com uma solução aquosa de acetona a 40%.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se efectuar a extracção do passo c) com acetato de etilo.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se efectuar a concentração do passo e) a uma tempe ratura não superior a 60°C.
6. 6. Extractos de Piliostigma thonningii susceptíveis de serem obtidos de acordo com os processos das reivindicações 1 a 5.
7. 7. Processo para a preparação de fracções do extracto susceptível de ser obtido em conformidade com os processos das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de complementarmente se fraccio-nar o extracto numa coluna, de acordo com os passos seguintes: i) dissolução do extracto em etanol a 95%; l) adsorção sobre uma matriz; m) eluição das substâncias indesejáveis de baixo peso molecular com etanol a 95%; 2 n) eluição subsequente com misturas de etanol/água ou acetona/ /água; o) reunião das fracções consoante o seu peso molecular, concentração e liofilizaçâo.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a matriz do passo 1) ser de ‘Sephadex LH 20’.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se utilizar no passo n) as misturas de etanol/água em concentrações compreendidas entre 30% e 60% num solvente orgânico e se utilizar as misturas de acetona/água em concentrações compreendidas entre 29% e 70% e de preferência entre 35% e 45% num solvente orgânico.
10. 10. Fracções de extractos susceptiveis de serem obtidos de acordo com os processos das reivindicações 7 a 9, caracterizadas pelo facto de possuírem pesos moleculares compreendidos entre 1500 e 2500 dalton.
11. 11. Composições farmacêuticas para o tratamento de doenças herpé-ticas, imunodeficiência adquirida associada aos VIH, gripe e constipações, que incorporem como ingrediente activo os extractos de acordo com a reivindicação 6.
12. 12. Composições farmacêuticas para o tratamento de doenças herpé-ticas, imunodeficiência adquirida associada aos VIH, gripe e constipações, que incorporem como ingrediente activo as fracções dos extractos de acordo com a reivindicação 10.
13. 13. Composições farmacêuticas de acordo com uma qualquer das reivindicações 11 e 12, que incorporem como veículos fosfolípidos, tanto naturais como sintéticos. 3
14. 14. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 13, nas quais a proporção entré o fosfolipido e o ingrediente activo está compreendida entre 1 e 3 partes em peso.
15. 15. Utilização dos extractos de acordo com a reivindicação 6 para a preparação de medicamentos que possuam actividade antiviral.
16. 16. Utilização das fracções de acordo com a reivindicação 10 para a preparação de medicamentos que possuam actividade antiviral. Lisboa, 14 de Fevereiro de 2000 AGF.NTC OFICIAL DA rROPRJEDADE INDUSTRIAL

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