KR100235685B1 - 필리오스티그마 톤닌지의 추출물, 그 이용방법 및 그것을 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항바이러스 활성을 가지고 있는 필리오스티그마 톤닌지의 새로운 추출물, 그 제조방법, 치료제로서의 용도 및 상기 추출물을 포함하고 있는 조성물에 관한 것이다. 이러한 새로운 추출물은 바이러스가 병의 원인인 허피스, 인플루엔자 및 기관지폐 질환같은 질병의 치료에 사용되고 또한 HIV 바이러스에도 활성이 있는 것으로 판명되었다.
Description
제1도는 본 발명에 따른 필리오스티그마 톤닌지 추출물의 SEC-크로마토그래피 프로파일을 보여주는 도면이다.
필리오스티그마 톤닌지 슘(Piliostigma thonningii schum)은 아프리카 대륙에 광범위하게 펴져 있는 식물로서, 낮은 줄기를 가지며 콩과 식물에 속하는 전형적인 대초원의 식물이다: 탕가니카와 로디지아에서는 이 식물의 뿌리 껍질을 우유와 함께 끓여서 기침 치료에 사용한다; 스와힐리 사람들은 그 잎을 소량 섭취하여 폐 합병증을 치료하고, 하스인들은 기침 치료제로 신선한 잎을 씹어 먹는다. 이와 유사한 용도는 아프리카의 많은 다른 나라에서도 보고되어있다. 또한 아프리카에서는 식물의 다른 부분들도 잇몸의 염증과 상처 및 여러가지 궤양의 약물 치료에 사용된다.
식물의 약물학적인 성질을 확증하기 위한 실험 연구중 놀랍게도 본 발명에 따라 제조된 추출물이 최근 감염된 사람으로부터 분리된 사람의 병원성 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 가지고 있다는 것이 발견되었다.
화학적인 관점으로 볼 때, 필리오스티그마 톤닌지의 뿌리, 가지 및 잎의 조성에 대해 알려진 바가 거의 없다. 20%까지 탄닌(tannin)이 나뭇가지 껍질로부터 회수되었지만 그 조성은 밝혀지지 않았으며, 램버티안산(lambertianic acid)과 램버티안올(lambertiol)같은 플라보노이드 및 테르펜은 나무잎으로부터 분리되었다.
본 발명의 추출물은 순수한 또는 물로 희석한 지방족 저분자량 알코올 또는 케톤을 사용하여 식물의 모든 부분을 추출해서 별개로 또는 그 혼합물 형태로 제조된다. 뿌리와 줄기의 나무 껍질은 주로 25 내지 60℃, 바람직하게는 40℃의 온도에서 9:1 내지 2:8, 바람직하게는 6:4의 수용성 아세톤을 사용하여 추출된다. 그와 반대로, 잎은 주로 알코올 또는 케톤 혼합물, 일반적으로 아세톤을 4:6 용매/물 비율로 사용하여 추출하는데, 스크리닝(screening)시 활성이 없는 것으로 입증된 엽록소와 바람직하지 않은 친유성 물질이 추출되지 않도록 한다. 하기 실시예에 설명되어 있는 바와 같이, 이러한 추출물은 다음이 처리 단계를 거친다:
a) 40℃ 이하의 온도에서 농축하여 용매를 제거한다;
b) 유기 용매 제거시 형성되는 바람직하지 않은 물질의 점착성 잔류물을 여과 또는 원심분리로 제거한다;
c) 맑은 수용성 추출물을 에틸 아세테이트를 사용, 추출하여 추출가능한 물질을 완전추출하고 유기 추출물을 제거한다;
d) 수용성 상을 XAD-2, XAD-4, 듀올라이트 또는 다른 폴리스티렌 매트릭스 수지같은 흡착 수지 컬럼을 이용하여 크로마토그래피를 실시한 다음; 물로 희석된 지방족 저분자량 알코올 또는 케톤, 바람직하게는 여러가지 퍼센트농도의 수용성 아세톤, 일반적으로 40% 수용성 아세톤으로 재용출시킨다;
e) 60℃ 이하의 온도와 감압조건하에서 컬럼으로부터의 용출액을 부분 농축한다;
f) 감압하에서 농축액을 증발, 건조시킨다;
g) 잔류물을 소량의 메탄올에 용해하고;
h) 용액을 활성 성분을 침전시킬 수 있을 만큼의 충분한 메틸렌 클로라이드로 처리한다.
붉은 색을 띠는 침전물이 많이 얻어지는데, 이 물질은 물에 녹고 모든 비프로톤성의 용매에는 불용성이면서 항바이러스 활성을 갖는다. 이 생성물은 그 자체로 또는 다음의 표준방법에 따라, 예를 들면 세파덱스 LH 20(Sephadex LH 20)같은 컬럼 또는 동일한 매트릭스상에서 더 분리된 형태로 사용될 수 있다: 95% 에탄올에 용해시킨 추출물을 매트릭스에 흡착시킨 후 같은 용매를 사용하여 저분자량의 바람직하지 않은 물질을 용출시킨다; 용출은 바람직하게는 30 내지 60% 범위의 유기 용매가 포함된 에탄올/물 혼합물을 또는 29 내지 70% 범위, 바람직하게는 35 내지 45% 범위의 유기용매가 포함된 아세톤/물 혼합물을 사용하여 계속된다. 하이드로알코올 또는 아세톤 용출액을 부분별로 모아서 겔 투과법으로 체크한 후, 유사한 분자량에 따라 모으고 용매를 제거하여 농축시킨 후, 냉동건조한다. 분자량이 1500 내지 2500 돌턴인 부분, 바람직하게는 2100돌턴의 분자량 부분이 특히 활성이 있는 것으로 판명되었다.
다른 방법으로서, 에틸아세테이트로 추출한 후(상기 c)단계 참조), 수용성 용액은 바람직하게는 9:1 비율의 n-부탄올/톨루엔 혼합물로 추출될 수 있는데; 부탄올 추출물은 후에 상기 기재된 실험 절차에 의해서 정제될 수 있다.
항바이러스 활성은 문헌에 보고되거나, 출원인에 의해 부분적으로 수정된 일반적인 방법에 의해서 테스트되었다. 예를 들어, 원숭이 세포(아프리카 그린 원숭이 세포(VERO) 플로 레보러토리이즈주식회사. 스코틀랜드 어바인)를 1% 글루타민을 포함하며 테스트 바이러스를 포함하고 있거나 그렇지 않은, 또한 테스트할 활성 물질이 존재하거나 그렇지 않은, 송아지 혈청(감염되지 않은 배양에서는 5%, 감염된 배양에서는 2.5%)이 첨가된 TC-199 배지에서 배양한다.
본 발명의 추출물을 평가하기 위해서 두가지 다른 종류의 콘트롤이 실시되었다: 하나는 실제의 항바이러스 활성에 관한 것이고 다른 하나는 물질의 세포독성에 관한 것인데, 이들은 활성/독성비를 정의하기 위한 것이다. 플레이트에 VERO 세포를 2×104농도로 접종하였다; 24시간 배양후 세포 단일층을 선택된 바이러스에 의해 감염시킨 후에 즉시 필리오스티그마 톤닌지 유도체의 스칼라 농도로 처리하였다; 24시간 후에 현미경을 통해서 비활성(specific activity)에 대해 평가되었다.
세포독성을 평가하기 위해서 VERO 세포를 1×105농도로 접종하였다; 24시간후에 배양 배지로부터 세포를 분리하여 이번에는 다른 농도의 테스트 추출물을 포함하고 있는 배양 배지로 대치하었다. 48시간후 세포는 1% 글루타르알데히드의 한크 용액(Hank′s solution)으로 고정되었고 플레이트는 15분동안 탈이온수로 세척되어 공기중에서 건조되었다; 세포에 흡착된 염료(크리스탈 바이올렛:Crystal Violet)는 0.2% 농도의 트리톤 X-1002 용액으로 추출되어 분광학적으로 체크되었다. 세포독성은 상기 나타낸 바아 같이 웰당 2×104밀도로 세포를 배양함으로써 보다 용이하게 테스트되었다; 24시간 후 배지가 제거되었고 세포는 테스트 물질로 처리되었다; 48시간동안 배양후 세포에3H-티미딘(thymidine)을 0.5mCi/플레이트 농도로 부가하였다. CO2분위기하에서 세포를 16시간동안 더 배양된 후,3H가 도입된 것에 대해 신틸레이터로 정량적으로 측정하였다. 이와 같은 방법으로 CC50(콘트롤 대비 주입된 티미딘양을 50%로 감소시킨 농도)이 측정되었다.
필리오스티그마 톤닌지 유도체에 대한 스크리닝을 통해 사람 허피스 바이러스(Herpes simplex 1, 2), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), HSV-1 및 HSV-2에 대해 항바이러스성 활성을 가지고 있는 물질이 확인될 수 있었다; 게다가 이 추출물은 인플루엔자와 합포체(合胞體) 바이러스(syncytial virus) 등의 다른 균주에 대해 활성이 있다는 것이 판명되었다. 예를 들어, 미분별 추출물(실시예 I)을 허피스 바이러스에 대해 15.6㎍/ml의 농도로 사용하면, 콘트롤에 비해 플라그의 형성이 100%로 감소하였고 62.5㎍/ml의 세포독성이 얻어졌다; 활성/세포독성비는 명백하게 활성이 우세하다는 것을 보여주는 것이므로 생성물은 높은 치료학상의 지수를 가진다. HSV-1과 HSV-2 바이러스의 복제에 대한 동일한 생성물의 EC50은 각각 22.4와 36.2㎍/ml였다. 실시예 III과 IV에 기재된 바와 같은 추출물 부분은 활성/독성 비율이 양으로 보다 증가함으로써, 출발 추출물보다 높은 특이 활성을 가지고 있다는 것이 명시되었다. 세포독성은 100㎍/ml보다 큰 값을 가지면서 허피스 바이러스 HSV-1 및 2에 대한 EC50은 예를 들면, 각각 5.1과 6.4㎍/ml였다.
본 발명의 추출물은 모든 테스트에서 파라인플루엔자 바이러스에 대해서 놀라울 만큼 높은 활성을 나타내는 것으로 증명됨으로써, 대부분의 다양한 인플루엔자 형태의 치료에 가치가 있음을 보여주었다.
활성 성분의 작용 메카니즘 또는 특정 발견에 관한 한, 현재까지 알려진 바가 거의 없다. 본 발명의 추출물의 활성 성분은 부분적으로 폴리페놀의 성질을 가지며 배양시 항원의 발현을 감소시키거나 합포체(syncytia)를 감소시키는 활성을 나타내는 것 같다. 이와 같은 의미에서 생성물이 바이러스 도입과 동시에 배지에 부가될 때 추출물은 사용된 여러가지 세포 모델에 대해 특히 활성이 있고 바이러스 도입후에 생성물이 부가되는 경우는 활성이 없는 것으로 판명되었다. 이러한 데이타로부터 비록 추출물 또는 추출물의 개별 부분들의 활성이 역전사효소(reverse transcriptase) 및/또는 단백분해효소(protease)의 효소 작용을 억제할 수 있다는 것을 배제할 수는 없다고 하더라도, 추출물 또는 추출 부분들이 감염 초기에 작용하는 것으로 추측될 수 있다.
본 발명의 추출물은 치료해야 할 질병의 고통뿐만 아니라 투여경로에 따라서, 하루에 10mg 내지 5g의 투여량으로 투여될 때 사람에게 활성이 있다. 허피스 치료시에는 추출물 및 그것의 개별 부분은 연고 형태나 이와 같은 종류의 치료시에 요구되는 국소 용도의 제형으로 또는 경구나 정맥내 경로로 투여될 수 있다; 모든 다른 형태의 바이러스의 경우는 추출물이 단지 물에 용해되거나 일반적인 부형제에 운반되어 경구, 정맥내 경로 또는 에어로졸에 의해 주로 투여된다.
본 발명의 다른 목적에 따르면, 본 발명의 추출물의 경구 투여용 조성물은 천연 및 합성 인지질에 의해 운반된다. 바람직하기로는 인지질 대 추출물(또는 추출물의 개별 부분)의 비는 중량부 비율로 1 내지 3배이다; 상기 추출물과 인지질의 혼합물은 일반적으로/바람직하게는 미그리올(migliol) 등과 같은 운반체의 존재하에서 소프트 젤라틴 캡슐, 하드 젤라틴 캡슐 또는 정제의 형태로 투여된다.
본 발명의 추출물은 병리에 따라서 급성 또는 만성 치료에 사용될 수 있다; 추출물과 그 개별 부분들은 사람과 쥐에 대해 정맥내로 투여했을 경우에는 500mg/kg까지 내성이 있는 반면에, 경구 투여시는 5g/kg까지도 특별히 현저한 독성 효과를 유발하지는 않는다.
다음 실시예들은 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 I-필리오스티그마 톤닌지의 뿌리 껍질로부터의 전부 정제된 추출물 시료]
곱게 같은 필리오스티그마 톤닌지의 뿌리 껍질(5kg)이 40℃에서 10배 용적의 60%(w/w) 아세톤/물 혼합물을 사용해서 추출된다; 추출은 교반하면서 실시되고 3회 반복된다. 하이드로아세톤 추출물을 농축하여 아세톤을 완전제거한다; 농축하는 물에 불수용성 물질이 침전되어 원심분리기로 정밀하게 제거된다. 에틸 아세테이트로 추출한 후 맑은 수용성 용액을 XAD-4 흡착 수지(5kg)를 포함하고 있는 컬럼에 매우 천천히 통과시킨다; 추출물이 통과된 후, 컬럼의 용출은 탈미네랄수를 사용하여 무색의 물 또는 잔류물이 0.001%보다 작아질 대까지 계속된다. 그 후에 수지는 40% 수용성 아세톤으로 용출시킨다. 용출은 무색의 액체가 나올 때까지 계속된다. 컬럼으로부터의 용출액은 40℃ 미만의 온도에서 5ℓ가 될 때까지 농축되고; 농축액을 여과하여 모든 불용성 잔류물을 제거하고 스프레이 건조시켜 얻어진 250g의 건조 추출물은 그 자체 또는 실시예 II의 방법에 따라 재정제하여 사용될 수 있다. 이 추출물은 메탄올, 260nm 조건하에서 E1% 690을 가진다. 생성물은 물, 알코올 및 아세톤에 무한정 용해될 수 있고 염소화된 용매와 에테르에는 불용성이다. 생성물은 바이러스가 질병의 원인인 병의 치료에 사용될 수 있다.
[실시예 II-필리오스티그마 톤닌지로부터의 추출물의 정제]
실시예 I에 의해 제조된 필리오스티그마 톤닌지로부터의 추출물(200g)을 무수 아세톤(1ℓ)에 첨가하여 완전히 용해시킨 다음 강하게 교반하면서 메틸렌클로라이드(5ℓ)에 첨가한다; 많은 침전 형태가 원심 분리에 의해서 모아지고, 메틸렌클로라이드로 재세척되어서 무색의 모액이 되고, 마지막으로 용매가 완전히 제거될 때까지 40℃에서 감압 건조시킨다. 붉은 색을 띠는 화합물 170g이 얻어지며, 이것은 바이러스 질병 치료에 사용될 수 있다.
추출물의 SEC-크로마토그래프는 제1도에 도시되어 있는 바와 같은 프로파일을 나타낸다.
[실시예 III-필리오스티그마 톤닌지 뿌리 껍질 추출물의 분별]
실시예 I 및 II에 따라 제조된 추출물(20g)이 95% 에탄올(500ml)에 용해되고, 동일한 용매에 의해 미리 평형화시킨, 세파덱스 LH20(350g)을 포함하고 있는 컬럼을 이용하여 크로마토그래피가 실시된다. 용액을 흡착시킨 후에 컬럼은 용해성 물질이 모두 추출될 때까지 에탄올로 용출된다. 컬럼은 계속하여 40% 수용성 아세톤을 사용하여 용출되는데, 에탄올 용출액은 폐기한다. 하이드로아세톤 용액은 감압하에서 200ml까지 농축되고 농축액은 동결건조된다. 평균분자량이 2018 돌턴이고 붉은 벽돌색을 띠는 생성물(6g)이 더 이상의 정제없이 항바이러스제로 사용될 수 있다.
[실시예 IV-필리오스티그마 톤닌지 줄기 껍질로부터의 추출물 시료]
곱게 같은 필리오스티그마 톤닌지의 줄기 껍질(5kg)이 실시예 I의 방법에 따라서 추출된다; 불용성 물질의 여과후, 수용성 농축물이 에틸 아세테이트(20ℓ)로 추출된다; 유기상은 폐기하고 수용액상을 95:5 n-부탄올/톨루엔 혼합물로 추출함으로써 이 혼합물에 추출가능한 물질을 제거한다. 모아진 추출물을 Na2SO4로 건조하고 감압하에서 1ℓ로 농축한다. 강하게 교반하면서 농축액을 메틸렌클로라이드(5ℓ)에 첨가한다. 형성된 침전물이 메틸렌클로라이드로 완전히 세척되고 40℃에서 감압건조된다. 항바이러스 활성을 가지고 있는 생성물(150g)이 얻어진다. 이 생성물은 실시예 III의 방법에 따라 더 정제될 수 있다.
[실시예 IV-국소용 필리오스티그마 톤닌지 추출물을 포함하고 있는 조성물]
실시예 III에 따라 제조된 필리오스티그마 톤닌지의 정제된 추출물 20g에 소이 포스파티딜콜린(40g)을 혼합하고 이것을 9:1 비율의 메틸렌클로라이드/메탄올 혼합물(600ml)에 용해시킨다; 두 생성물이 완전히 용해되면, 감압하에서 용매를 제거한다. 이렇게 얻어진 고체에 탈이온수(1200ml)을 넣고 강하게 교반하면서 미소분산시킨다. 수용성 미소분산물에 1% 카르복시메틸 셀룰로오즈를 부가하여 교질화시킨다. 이 수용성 겔이 허피스 질환의 국소 치료에 사용된다.
[실시예 IV-필리오스티그마 톤닌지의 정제된 부분(150mg)을 포함하고 있는 소프트 젤라틴 캡슐의 제조]
실시예 III에 따라 제조된 필리오스티그마 톤닌지의 정제된 추출물 20g에 소이 포스파티딜콜린 40g을 혼합하고 이것을 9:1 비율의 메틸렌클로라이드/메탄올 혼합물 600ml에 용해시킨다; 두 생성물이 완전히 용해되면 감압하에서 용매를 제거한다. 이렇게 얻어진 고체에 미글리올(180ml)에 넣어 현탁액으로 만들어, 추출물/인지질 혼합물 450mg의 양으로 소프트 젤라틴 캡슐에 채워진다.
Claims (13)
- 저분자량 지방족 알코올이나 케톤을 사용하여 식물의 모든 부분을 추출한 다음; 얻어진 추출물에 대해 다음의 a) 40℃ 이하의 온도에서 농축하여 용매를 제거하고; b) 유기 용매 제거시 형성되는 바람직하지 않은 물질의 점착성 잔류물을 여과 또는 원심분리로 제거하고; c) 맑은 수용성 추출물을 에틸 아세테이트를 사용, 추출하여 추출가능한 물질을 완전추출한 다음, 이 유기 추출물을 제거하고; d) 수용성 상을 XAD-2, XAD-4, 듀올라이트 또는 다른 폴리스티렌 매트릭스 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 흡착 수지 컬럼을 이용하여 크로마토그래피를 실시한 다음; 지방족 저분자량 알코올 또는 케톤으로 재용출시키고; e) 60℃ 이하의 온도와 감압조건하에서 컬럼으로부터의 용출액을 부분 농축하고; f) 감압하에서 농축액을 증발, 건조시키고; g) 잔류물을 소량의 메탄올에 용해하고; h) 용액을 활성 성분을 침전시킬 수 있을 만큼의 충분한 메틸렌 클로라이드로 처리하는 단계를 포함하는 후속 처리를 실시하는 것을 특징으로 하는 필리오스티그마 톤닌지 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 d)에서 크로마토그래피를 실시하기 전에, 상기 수용성상을 9:1 비율의 n-부탄올/톨루엔을 사용하여 추출 및 농축시킨 다음 메틸렌클로라이드로 희석하는 단계인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 d)의 재용출이 40% 수용성 아세톤을 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 추출이 에틸 아세테이트를 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 얻어진 필리오스티그마 톤닌지 추출물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 얻어지는 미정제된 상태의 추출물로부터 정제된 상태의 추출물을 제조하는 방법에 있어서, i) 미정제된 상태의 추출물을 95% 에탄올로 용해하고; l) 매트릭스에 흡착시키고; m) 바람직하지 않은 저분자량 물질을 95% 에탄올로 용출시키고; n) 계속하여 에탄올/물 또는 아세톤/물 혼합물로 용출시키고; o) 분자량에 따라서 추출물을 분리하여, 농축하여 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 단계 1)의 매트릭스가 세파덱스 LH 20인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 단계 n)에서 에탄올/물 혼합물의 에탄올 농도가 30-60%이고 아세톤/물 혼합물의 아세톤 농도가 29-70%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 얻어지는 1500-2500 돌턴의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 필리오스티그마 톤닌지의 정제된 추출물.
- 허피스 질환, HIV 바이러스와 관련되어 있는 후천성 면역결힙증, 인플루엔자 및 감기 치료제로서 제5항에 따른 추출물을 활성성분으로 포함하고 있는 약제학적 조성물.
- 허피스 질환, HIV 바이러스와 관련되어 있는 후천성 면역결핍증, 인플루엔자 및 감기 치료제로서 제9항에 따른 필리오스티그마 톤닌지의 정제된 추출물을 활성성분으로 포함하고 있는 약제학적 조성물.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 천연 및 합성 인지질이 운반체로서 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 인지질에 대한 활성 성분의 중량부 비율이 1 내지 3인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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