PT619730E - Composicao de agentes anti-neoplasticos incorporados em micelas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO DE AGENTES ANTI-NEOPLÁSICOS INCORPORADOS EM MICELAS" A presente invenção refere-se a melhoramentos em composições ruruideéutieas e em particular melhoramentos em composições farmacêuticas utilizadas em quimioterapia.
Estão correntemente em utilização em quimioterapia um número de agentes anti-neoplásicos (ver na generalidade "Cutting's Handbook of Pharmacology, 7a Ed., Capitulo 13, Csáky and Barnes) e estão sob investigação muitos agentes adicionais.
Devido à sua estrutura frequentemente complexa, estes agentes podem exibir baixa estabilidade na corrente sanguínea. Muitos são extremamente insolúveis e possuem propriedades de transporte pobres em relação a membranas celulares. Adicionalmente, a ligação do agente anti-neoplásico a proteínas do plasma, bem como outras intoracçõca não copccíficaa na corrente sanguínea antes de alcançar o seu alvo, podem reduzir grandemente a quantidade eficaz realmente disponível para combater as células neoplásicas. Além disso, a resistência a múltiplos fármacos é frequentemente observada com tais agentes; i.e., observa-se que a sensibilidade das células neoplásicas ao agente diminui, frequentemente por um factor de 103, durante o decorrer do tratamento e essa resistência pode posteriormente manifestar-se mesmo em relação a agentes anti-neoplásicos estruturalmente diferentes.
De acordo com a presente invenção, o agente anti-neoplásico escolhido (que pode incluir uma mistura de vários agentes anti-neoplásicos distintos) é incorporado numa micela de um co-polímero em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) numa dispersão aquosa como aqui descrito adiante. 1 A utilização da micela de co-polímero em bloco na administração do agente anti-neoplásico proporciona solubilização não covalente, que reduz a instabilidade em água e aumenta a solubilidade do anti-neoplá3Íco.
Além disso, embora os co-polímeros em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) tenham sido utilizados como agentes tensioactivos não iónicos, os efeitos aqui observados estendem-se claramente para além da mera solubilização. Por exemplo, a ligação indesejada de proteína pré-alvo ao agente anti-neoplásico é reduzida; i.e., o agente anti-neoplásico parece estar "escudado" das proteínas que de outra forma se ligariam a ele. Também é observada a sensibilidade aumentada em relação às células anti-neoplásicas alvo. Finalmente, é observada uma regressão na resistência a múltiplos fármacos. Embora o fenómeno de resistência a múltiplos fármacos (MDR) não seja totalmente compreendido, é acompanhado por uma sobre-expressão de uma P-glicoproteína transmembranar de Mr de cerca de 170 kD (P-170) que medeia o fluxo dependente de ATP de numerosos fármacos de tais células (embora o fluxo do fármaco possa também envolver outros componentes de membrana de células MDR). As presentes composições parecem possuir actividade citotóxica aumentada em relação a células cancerosas MDR dependentes de P-170 e independentes de P-170, em comparação com células sensíveis, reduzindo assim o efeito de resistência a múltiplos fármacos.
Uma variedade de agentes anti-ncopláoicoo oão adequados para utilização na presente composição. Estes incluem alcaloides tais como vinblastina, colchicina e demecolina; antibióticos tais como os do grupo da rodomicina, como por exemplo daunorrubicina e doxorrubicina, os do grupo da mitomicina, como por exemplo mitomicina C e N-metilmitomicina C, e os do grupo da bleomicina tais como bleomicina A2; e antifolatos tais como 2 r\ metotrexato, aminopterina e ácido didesazatetrahidrofólico. Deve ser exileudidu que esLe melhoramento se estende a misturas de vários destes agentes. A presente invenção não se dirige à actividade anti-neoplásica subjacente desses agentes mas antes a um melhoramento na manifestação desta actividade através de formulação.
Os co-polimeros em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) geralmente são caracterizados pela fórmula estrutural: HO- -CH2CH20- -CH3 I chch2o- -ch2ch2o- -H z
I na qual tanto x como z, independentemente um do outro, possui um valor de cerca de 5 até cerca de 100 e y possui um valor de desde cerca de 20 até cerca de 80. Tais co-polímeros em bloco são conhecidos {ver Stanton, Am. Perfumer. Cosmet. 72(4), 54-59 (1958); Schmolka, Loc. cit. 82(7), 25-30 (1967); e Nonionic
Surtactants, Schick, Ed., (Dekker, NY, 1967) 300-371). Um número destes co-polímeros estão comercialmente disponíveis sob os nomes genéricos de "poloxameros" e "plurónicos".
As propriedades hidrofóbicas/hidrofílicas de um dado co-polímero em bloco depende da razão entre o número de grupos oxipropileno e o número de grupos oxietileno. Para uma composição contendo um único co-polímero em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno), por exemplo, esta relação, tendo em conta as massas moleculares do bloco hidrofóbico 3 central e dos blocos hidrofílicos terminais, pode ser expressa de forma seguinte: y n = - * 1,32 x + z em que y é o número de unidades de oxipropileno e x e z são o número de unidades de oxietileno. A selecção do co-polímero em bloco com o valor n apropriado depende das propriedades hídrofóbicas/hidrofílicas do agente anti-neoplásico especifico, ou as propriedades do compósito hidrofóbico/hidrofilico de uma mistura de agentes anti- neoplásicos a ser formuladus. Tipicamente, n variará em valor de cerca de 0,25 até cerca de 1,5. Este intervalo deverá ser encarado não como critico numericamente, mas como expressando o equilíbrio hidrofóbico-hidrofilico óptimo entre os blocos de poli(oxietileno) predominantemente hidrofílicos e os blocos de poli(oxipropileno) predominantemente hidrofóbicos.
Um aspecto importante da presente invenção envolve a utilização de uma mistura de diferentes co-polímeros em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno), para obter um equilíbrio hidrofóbico-hidrofílico mais especifico, adequado para um dado agente anti-neoplásico ou mistura de vários agentes anti- neoplásicos, preservando o tamanho óptimo das partículas. Por exemplo, um primeiro co polímero em bloco pode possuir um n de 1,00 enquanto que um segundo pode possuir um valor de 1,5. Se for desejado material possuindo um n de 1,3, pode ser empregue uma mistura de uma porção em peso do primeiro co-polímero em bloco e uma porção em peso de 1,5 do segundo co-polímero em bloco. 4
Uma relação mais generalizada para tais misturas pode por íogo acr expressa como se segue: ii*a y2*b N = - + - * 1,32 (xi + 2χ)*(3 + b) (x2 I z2)*(a + b) em que:
Yi e y2 são o número de unidades de oxipropileno no primeiro e segundo co-polimcroa em bloco, respectivamente; Χχ e ζχ são o número de unidades de oxietileno no primeiro co-polimero em bloco; x2 e z2 são o número de unidades de oxietileno no segundo co-polimero em bloco; a é a proporção em peso no primeiro co-polimero em bloco; e b é a proporção em peso no segundo co-polimero em bloco.
Se for apenas utilizado um co-polimero em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) , N será igual a n. Uma relação análoga será aplicável a composições empregando mais do que dois co-polimeros em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno).
Utilizando os parâmetros acima, um ou mais co-polimeros em bloco de poli (oxietileno)-po.l i (oxi prnpil.eno) são combinados de modo a possuírem um valor para N de cerca de 0,25 até cerca de 1,5. Os co-polimeros combinados formam micelas, afectando o valor de N, em parte, o tamanho das micelas então produzidas. Tipicamente, as micelas vão ter um diâmetro médio de cerca de 10 até cerca de 25 nm, embora este intervalo possa variar largamente. O diâmetro médio de qualquer dada preparação pode ser prontamente determinado através de técnicas de varrimento de luz quasi-elásticas. 5 o composto ou compostos anti-neoplásicos na micela de co~ polímero são administrados parentericamente em formulações aquooaa, iooladamcntc ou cm combinação com outroo agentes terapêuticos, incluindo outros agentes anti-neoplásicos, esteróides, etc., a um mamífero sofrendo de neoplasma e em necessidade de tratamento. Vias parentéricas de administração incluem intramuscular, intratecal, intraperitoneal, intravenosa e intra-arterial. A solução micelar isotónica de um ou mais co-polímeros em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) incorporando um ou mais agentes anti-neoplásicos é utilizada para administração parentérica. As dosagens tipicamente são as associadas com o agente anti-neoplásico específico, embora como em qualquer caso o regime deve ser titulado para o neoplasma particular, a condição do doente e a sua resposta. Por exemplo, uma solução micelar isotónica de daunorrubicina nas micelas de co-polímero em bloco é administrada de modo a proporcionar cerca de 1 mg de daunorrubicina por kg de peso corporal. Por outro lado, a vinblastina é administrada do mesmo modo, mas de acordo com utilização convencional a doses inferiores de cerca de 0,1 até cerca de 0,2 mg/kg. Frequentemente, a quantidade requerida pode ser reduzida.
Os exemplos seguintes servirão para tipificar melhor a natureza da invenção, mas não devem ser encarados como uma limilaçâo do âmbito desta, que é apenas definida através das reivindicações anexas.
Exemplo 1 A. Um co-polímero em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) no qual N = 0,25 (Pluronic F-68) é diluído com meio RPMI 1640 para uma concentração final de 2,0% a 4°C. A mistura é incubada durante 30 minutos a 37 °C e depois 6 esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. Um volume igual de uma solução de 200 μς de daunorrubicina em meio RPMI 1640 é adicionado e esta mistura é incubada durante 30 minutos a 37°C. B. Células de carcinoma ovárico humano (CRL157) são pré-cultivadas em solução a 1% do mesmo co-polímero em bloco, mas sem daunorrubicina, em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitela a 10%. A preparação da parte A c adicionada c a mistura é incubada durante 60 minutos a 37°C e as células são então lavadas três vezes com RPMI 1640 e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitela a 10% durante 3 dias (Prep. A) . A citotoxicidade é medida tanto para esta preparação como para uma preparação paralela de daunorrubicina livre (Prep. B) , utilizando o método de Alley et al., Câncer Res., 48, 589-601 (1988). Os resultados são os seguintes: |conc.(ng/mL) 50000 10000 2000 400 80 16 % de inibição Prep.A 100 100 92 24 6 2 1 Prep.B 100 81 53 38 20 1 1
Seguindo o mesmo procedimento, a citotoxicidade é determinada contra células de linfoma X humano (Jurkat): conc.(ng/mL) 50000 10000 2000 400 80 16 3,2 | % de inibição
Prep.A 100 100 100 100 92 33 3 1 Prep.B 100 100 100 84 51 44 22
Seguindo o mesmo procedimento, a citotoxicidade é determinada contra células pequenas de carcinoma de pulmão humano (H-69): 7 conc.(ng/mL) 50000 10000 2000 400 80 16 3,2 % de inibição Prep.A 100 100 100 100 100 42 12 1 Prep.B 100 100 100 91 69 42 20 Exemplo 2
Co-polimeros em bloco de poli(oxietileno)- poli (oxiproplleno) possuindo as ictzões de poli (oxipropileno) para poli(oxietileno) abaixo indicadas são dispersos em meio RPMI 1640 a uma concentração abaixo indicada. As misturas são incubadas durante 40 minutos a 30°C. O diâmetro médio da micela é medido por varrimento de luz quasi-elástica e o valor de N calculado como previamente indicado. Os resultados são os seguintes:
Nota 1: X = 80, y = 30, e Z = 80 Nota 2: x = /5/2, y = 55, e z = 75/2 Nota 3: x = 27/2, II u> O e z = 27/2 co-polímero conc. Diâmetro Méd. N F-681 1, 0% 726,0 nm 0,25 P-85“ 1,0% 18,0 nm 1,00 L-645 1, 0% 20,4 nm 1,50 1:1,5 P-85:L-64 0,01% 17,0 nm 1,30 1:2,5 F-68:L-64 1,0% 33,5 nm 1,38
Exemplo 3 A. Uma mistura a 1:1,5 de co-polimeros em bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) (Pluronics P-85 e L-64) possuindo razões individuais (n) de blocos de (oxipropileno) para blocos de (oxietileno) de 1,00 e 1,50, respectivamente, e um valor combinado (N) de 1,30, é diluída com meio RPMI 1640 para uma concentração final de 2,0% a 4°C. A mistura é incubada 8 durante 30 minutos a 37°C e depois esterilizada por filtração através de filtro de 0,22 μτη. Um volume igual de uma solução de 200 μς de daunorrubicina em meio RPMI 1640 é adicionado e esta mistura é incubada durante 30 minutos a 37°C. B. A citotoxicidade para células de cancro ovárico humano (CRL157) é medida tanto para esta preparação (Prep. A) como para a preparação paralela dc daunorrubicina livre (Prep. B) , como descrito no Exemplo 1B. Os resultados são os seguintes: conc.(ng/mL) 50000 10000 2000 400 80 16 3,2 % de inibição Prep.A 100 100 100 100 94 53 8 Prep.B 100 100 81 50 29 10 2
Exemplo 4 A daunorrubicina na composição do Exemplo 3 é avaliada quanto à citotoxicidade em (i) células de linfoma T humano (Jurkat), como descrito no Exemplo 1 e (ii) células mononucleares humanas normais. Os resultados são os seguintes : J conc.(ng/mL) 50000 10000 2000 400 80 16 3,2 I —1 Célula % de Inibição
Prep.A Jur. 100 100 100 100 100 74 28 Prep.B Jur. 100 100 100 83 59 36 21 I Prep.A Norm. 100 100 91 60 21 5 2 Prep.B Norm. 100 100 80 58 23 18 1 9 '7 *7
Exemplo 5
Os valores de IC5o para (i) células de linfoma T humano (Jurkat) c (ii) células mononuclcarco humanas normais são determinados para a composição de daunorrubicina do Exemplo 3 e comparados com os de daunorrubicina livre. As medições são realizadas a intervalos indicados do contacto do fármaco com as células, de 15 minutos a 12 horas. Os resultados são os seguintes:
Tempo (horas) 0,25 0,50 0,75 1,0 2,0 4,0 8,0 12 Célula IC50 (ng/mL)
Prep.A Jur. 150 46 25 17 9,0 0,80 0,50 0,30 Prep.B Jur. 120 68 35 25 19 16 3,0 5,2 Prep.A Norm. 3570 950 620 450 250 220 160 140 Prep.B Norm. 4900 980 405 310 290 275 280 240
Exemplo 6 0 agente anti-neoplásico vinblastina é incorporado na mistura de co-polímero em bloco descrita no Exemplo 3. A IC50 desta preparação contra células SKV03, uma linha de carcinoma ovárico humano sensível ao fármaco, foi determinada como sendo 0,121 pg/mL; a IC50 contra células SKVLB, uma sub-linha de MDR expressando níveis elevados de P-170, obtida através de cultivo em períodos longos de SKVO3 na presença de vinvlastina, é de 0,0012 μg/mL. A IC50 de vinblastina livre contra células SKV03 é determinada como sendo de 0,095 μg/mL; a IC50 contra células SKVLB é de 0,615 pg/mL. 10
Exemplo 7 0 agente anti-neoplásico mitomicina C é incorporado na mistura de co-polímero em bloco descrita no Exemplo 3. A IC50 desta preparação contra células SKVO3 é determinada como sendo de 0,265 pg/mT,; a TC50 contra c.élnl.a.s SKVLB é de 0,005 pg/mL. A IC50 de mitomicina livre contra células SKVO3 é determinada como sendo de 0,320 p.g/mT.; a ΤΠ50 contra células SKVLB é de 1,120 pg/mL.
Exemplo 8 0 agente anti-neoplásico metotrexato é incorporado na mistura de co-polimero em bloco descrita no Exemplo 3. A IC50 desta preparação contra células SKVO3 é determinada como sendo de 0,880 pg/mL; a IC50 contra células SKVLB é de 0,0175 pg/mL. A IC50 de metotrexato livre contra células SKV03 é determinada como sendo de 1,090 pg/mL; a IC50 contra células SKVLB é de 1,340 pg/mL.
Exemplo 9 O agente anti-neoplásico colchicina é incorporado na mistura de co-polimero em bloco descrita no Exemplo 3. A IC50 desLa preparação contra células SKVO3 é determinada como sendo de 0,720 pg/mL; a IC50 contra células SKVLB é de 0,045 pg/mL. A IC50 de colchicina livre contra células SKVO3 é determinada como sendo de 0,950 pg/mL; a IC50 contra células SKVLB é de 7,450 pg/mL.
Exemplo 10 O agente anti-neoplásico daunorrubicina é incorporado na mistura de co-polimero em bloco descrita no Exemplo 3. A ICSo desta preparação contra células SKVO3 é determinada como sendo de 0,600 pg/mL; a IC50 contra células SKVLB é de 0,0068 pg/mL. A IC50 11 de daunorrubicina livre contra células SKVO3 é determinada como sendo de 0, 620 μς/ιηΐι; a IC50 contra células SKVLB é de 5,850 μς/ιηΐι.
Exemplo 11 A 30 μΐ, de uma solução de albumina do soro bovino a 20 mg/mL em salino tamponado com fosfato sao adicionados 30 μΐ, de solução de daunorrubicina na mistura de co-polímero em bloco dcocrita no Exemplo 3 (Drep. A) . Uma segunda formulação (Prep. B) é preparada de um modo paralelo utilizando daunorrubicina livre.
As preparações são incubadas durante 10 minutos a 25°C e depois analisadas por HPLC numa coluna de filtração em gel TSK-3000 SW, em PBS contendo cloreto de sódio a 0,3 M e acetonitrilo a 5%. A detecção é realizada a 280 nm e 470 nm. A porção do fármaco ligado a BSA é determinada como: D* = Sb/Sf em que:
Si, é a área relativa do pico a 470 nm (corrcopondcntc α daunorrubicina) que coincide com o tempo de retenção para o pico a 280 nm (correspondente a BSA); e
Sf é a área relativa do pico (ou picos) correspondentes a daunorrubicina que não coincide com o tempo de retenção do pico de BSA. 12
Os resultados são os seguintes:
Composição Dc Prep. A 0,01 Prep. B 0,39
Exemplo 12 A daunorrubicina micelar obtida como descrito no Exemplo 3 (Prep. A) e a daunorrubicina livre (Prep. B) são incubadas no escuro a 37°C e a citotoxicidade em relação a células CRL157 é então determinada do modo discutido na Parte B do Exemplo 1.
Os resultados são os seguintes: | tempo (horas) 2 4 12 24 48 96
IC50, pg/mL
Prep. A 9,1 10,0b 9,8 10, 4 10,7 11,3 Prep. B 400 475 1120 6300 10180 48900
Exemplo 13 A composição de daunorrubicina do Exemplo 3 (Prep. A) é avaliada contra cancro humano da mama sensível a daunorrubicina (MCF-7) e duas linhas celulares demonstrando resistência: resistente a daunorrubicina/verapamil (MCF-7AU) não expressando P-170 e resistente a daunorrubicina, sensível a verapamil (Dox-MCF-7), expressando P-170, em qualquer dos casos em comparação com daunorrubicina livre (Prep. B). Os resultados são os seguintes: 13
Iconc. (ng/mL) 50000 10000 2000 400 80 iU Célula % de inibição MCF-7 100 100 84 65 42 12 Prep. A MCF-7AU 100 100 100 96 69 39 Dox-MCF-7 100 100 100 89 73 45 MCF-7 100 100 91 69 43 15 Prep. B MCF-7AU 100 89 65 37 9 3 Dox-MCF-7 100 86 62 39 7 2 A daunorrubicina livre (Prep. R) exibe TC-so' s mais elevados (é menos tóxica) contra ambas as linhas resistentes. A daunorrubicina incorporada nos co-polimeros em bloco (Prep. A) exibiu IC50's mais baixos (é mais tóxica) contra ambas as linhas resistentes.
Exemplo 14
Grupos de murganhos fêmeas de C57B1/6 com 7 semanas de idade (6 animais/ponto de dose) são inoculados i.p. com daunorrubicina livre ou micelar (N = 1,3), obtida como descrito no Exemplo 3 (Prep. B e Prep. A, respectivamente) e são observados durante 14 dias. As concentrações de fármaco são ajustadas de modo a que o volume máximo de 0,5 mL seja injectado em cada murganho.
A MT D é definida como uma dose que não induz mortes por daunorrubicina (qualquer dose superior induz a morte relacionada com daunorrubicina em pelo menos 1 animal por grupo). A experiência é repetida duas vezes. Os resultados são reprodutíveis com uma variação' inferior a 10%. A MTD de daunorrubicina livre ou micelar (N - 1,3) é determinada como sendo 2,0 e 1,0 pg/kg de peso corporal, respectivamente. 14
Exemplo 15 A daunorrubicina possui uma elevada especificidade em relação à medula óssea, manifestando-se como leucopenia reversível, i.e., uma diminuição no número de WBS (contaqem de leucócitos) durante a administração do fármaco. A supressão de medula óssea assim como os efeitos anti-cancro da daunorrubicina, estão condicionados pela actividade de interligação de ADN, enquanto que o efeito colateral mais prejudicial de antraciclinas, cardiotoxicidade, resulta principalmente das interacções da membrana com metabolitos (que possuem baixa actividade anti-cancro e não produzem efeitos significativos na medula óssea). Assim, a contagem de leucócitos durante a administração in vivo de MTD de daunorrubicina permite a avaliação da razão entre actividade específica do fármaco (interligação de ADN) e toxicidade não especifica.
Grupos de murganhos fêmeas de C57B1/6 com 7 semanas de idade (6 animais/grupo) são inoculados i.p. com daunorrubicina livre ou micelar (N = 1,3), obtida como descrito no Exemplo 3 (Prep. B e Prep. A, respectivamente). As concentrações do fármaco (MTD) são ajustadas de modo a que o volume máximo de 0,5 mL seja injectado em cada murganho. São recolhidas amostras de sangue e contados os leucócitos viáveis como descrito em Michisch et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 547-551 (1991). O número de WBC após administração de 0,1 mL de PBS, 15-16 células mln/mL, é utilizado como controlo. A experiência é repetida duas vezes. Os resultados são reprodutíveis com uma variação inferior a 10%.
Os resultados obtidos são os seguintes: 15
Dias 0 3 7 10 14 WBS, % de controlo Prep. A 100 20 46, 6 86,6 100 Prep. B 100 40 60 93,8 100
Exemplo 16
Os efeitos da daunorrubicina livre ou micelar obtida oomo descrito no Exemplo 3 (Prep. B e Prep. A, respectivamente) na contagem de lecucócitos são determinados três dias após a administração tal como descrito no Exemplo 15.
Os resultados obtidos são os seguintes:
Dose de daunorrubicina 25 50 75 100 % de MTD WBS, % de controlo
Prep. A 85 73 45 21 1 Prep. B 78 61 36 39
Os resultados apresentados nos Exemplos 14 a 16 indicam que a solubilização de daunorrubicina nas micelas de co-polimero em bloco não afectam essencialmente a toxicidade qlobal do fármaco (MTD de 2 mg/kg e 1 mg/kg de fármaco livre e micelar, respectivamente), embora seja observado um aumento na supressão reversível da medula óssea que não influencia marcadamente a capacidade de sobrevivência do animal.
Exemplo 17 A actividade anti-neoplásica é determinada através da avaliação da actividade citotóxica do plasma de mamífero3 16 inoculados com a composição de teste (ver de Valeriola et al., Câncer Chemother. Pharmacol. 29, 133-140, 1991).
Grupos de murganhos fêmeas de C57B1/G com 7 semana3 de idade (6 animais/grupo) são inoculados i.v. (através da veia da cauda) com daunorruhicina livre ou micelar (N = 1,3), obtida como descrito no Exemplo 3 (Prep. B e Prep. A, respectivamente). As concentrações do fármaco (MTD) são ajustadas de modo a que o volume máximo de 0,1 mL seja injectado em cada murganho. A experiência é repetida duas vezes. Os resultados são reprodutíveis com uma variação inferior a 10%.
Para obter amostras de plasma, é recolhido sangue (10 μΐ) a partir da artéria da cauda uma hora após a administração do fármaco, diluído 1:10 com meio RPMI 1640 estéril e centrifugado a 400 g durante 15 minutos. Os sobrenadantes obtidos são diluídos com plasma, como apresentado na tabela, analogamente obtido a partir de murganhos não inoculados com o fármaco (o plaoraa dos murganhos não inoculados com o fármaco não produz nenhum efeito citotóxico significativo nas células H-69) e misturado com um volume igual de suspensão de células H-69 em meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitela fetal a 10%. As células são incubadas durante duas horas a 37°C e C02 a 5% e posteriormente lavadas três vezes com RPMI 1640. As células pré-tratadas são incubadas em RPMI 1640 suplementado com soro de vitela fetal a 10% a 37°C e C02 a 5% durante três dias, após os quais a citotoxicidade é determinada como descrito no Exemplo 1.
Os resultados são os seguintes: I Diluição de plasma 1:20 1:200 1:2000 1:20000 | % de inibição I Prep. A 100 08 8 Prep. B 42 5 0 0 1 17 f ......>
Assim os títulos de citoxicidade, a diluição na qual o plasma de murganhos inoculados com as preparações B ou A produziram 50% de inibição de crescimento de células H-69, de plasma de murganhos inoculadoe com ao prcparaçõco B o A em relação a células H-69 são determinadas como sendo 1:228 e 1:48, respectivamente.
Exemplo 18 0 procedimento do Exemplo 16 é repetido utilizando células SKVLB e SRVO3. Os resultados são os seguintes: a) guando é introduzida MTD de daunorrubicina ΕΞ
Diluição de plasma 1:20 1:200 1:2000 % de inibição
Prep. A SKVLB 82 61 18 Prep. B SKVLB 0 0 0 Prep. A SKVO3 11 0 0 Prep. B SRVO3 9 0 0 quando são introduzidos 10 mg/kg de daunorrubicina b)
Diluição de plasma 1:20 1:200 1:2000 Γη % de inibição
Prep. A SKVLB 100 94 69 Prep. B SKVLB 8 0 0 Prep. A SKVO3 62 31 0 Prep. B SRVO3 22 6 _ϋ_ 18
Exemplo 19
Uma composição adequada para administração parentérica é preparada dissolvendo 400 mg de Pluronic P-85 e 600 mg de
Pluronic L-64 em 50 mL de RPMI 1640 a 4°C. A mistura é incubada durante 30 minutos a 37°C e posteriormente esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. Isto é misturado com uma solução de 10 mg de daunorrubicina em pó liofilizada, dissolvida em 50 mL de RPMI e incubada durante 30 minutos a 37°C. A composição pode ser armazenada no escuro à temperatura ambiente durante 7 dias sem qualquer perda essencial de actividade ou pode ser liofilizada e armazenada durante pelo menos 1 ano no escuro à temperatura ambiente.
Exemplo 20
Outra composição adequada para administração parentérica é preparada dissolvendo 400 mg de Pluronic P-85 e 600 mg de Pluronic L-64 em 50 mL de PBS a 4°C. A mistura é incubada durante 30 minutos a 37°C e posteriormente esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. Isto é misturado com uma solução de 1 mg daunorrubicina em pó liofilizada e 5 mg de glucose dissolvida em 50 mL de PBS e a mistura é incubada durante 30 minutos a 37°C. A composição pode ser armazenada no escuro à temperatura ambiente durante 7 dias sem qualquer perda essencial de actividade ou pode ser liofilizada e armazenada durante pelo menos 1 ano no escuro à temperatura ambiente. 19
Exemplo 21
Outra composição adequada para administração parentérica é preparada dissolvendo 100 my de ascorbato de sódio numa solução aquosa de cloreto de sódio a 9%. A metade desta solução são adicionados a 4°C 400 mg de Pluronic P-8.5 e> 600 mg de Pluronic L-64. A mistura é incubada durante 30 minutos a 37°C e posf.eriormente esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μπι. Separadamente, 10 mg de daunorrubicina em pó liofilizada estéril e 50 mg de glucose são dissolvidos na restante solução de ascorbato de sódio-cloreto de sódio e as duas soluções são misturadas e incubadas durante 30 minutos a 37°C.
Esta composição pode ser armazenada durante 30 dias no escuro à temperatura ambiente sem qualquer perda essencial de actividade ou pode ser liofilizada e armazenada durante pelo menos 1 ano no escuro à temperatura ambiente.
Lisboa, 28 de Dezembro de 2000
20
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um agente anti-neoplásico para o tratamento de neoplasmas e pelo menos um co-polímero em blocos de poli (oxietileno)-poli(oxipropileno) no qual a razao de blocos de poli(oxietileno) para blocos de poli(oxipropileno) é dcodc ccrca de 0,25 até oerca de 1,5, em que o co-polimero está numa dispersão aquosa sob a forma de micelas, possuindo as micelas um diâmetro médio de cerca de 10 até cerca de 25 nm, e o agente anti-neoplásico é incorporado nas micelas do co-polimero.
- 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que cada co-polímero em blocos de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) é representado independentemente pela fórmula: HO- -ch2ch2o rCH3 I CHCH,Q- -ch2ch2o- -H na qual tanto x como z, independentemente um do outro, possui um valor de cerca de 5 até cerca de 100 e y possui um valor de cerca de 20 até cerca de 80.
- 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 em que as micelas são formadas a partir de uma pluralidade de co-polímeros em blocos de poli(oxietileno)-poli (oxipropileno), possuindo diferentes propriedades hidrofóbicas/hidrofilicas. 1 V Γ\
- 4. Composição de acordo com a reivindicação 3 em que o compósito dos co-polimeros em blocos satisfaz a equação: *i*a r2*b N = - + - * 1,32 (xi + Zi)*(a + b) . (x2 + Z2)*{a + b) em que: Ij e Y2 são o número de unidades de oxipropileno no primeiro e no segundo co-polímeros em blocos, respectivamente; xi e zi são o número de unidades de oxietileno no primeiro co-polímero em blocos; x2 e z2 são o número de unidades de oxietileno no segundo co-polímero em blocos; a é a proporção em peso no primeiro co-polímero em blocos; e b é a proporção em peso no segundo co-polímero em blocos d© tal modo que o valor de N seja de cerca de 0,25 a cerca de 1,5.
- 5. Composição de acordo com a reivindicação 1 em que o agente anti-neoplásico é um alcaloide, antibiótico ou anti-folato.
- 6. Composição de acordo com a reivindicação 5 em que o agente anti-neoplásico é seleccionado do grupo consistindo de vinblastina, colchicina, demecolina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, N-metilmiLomiciua C, bleomicina A2, metotrexato, aminopterina e ácido dide3azatctrahidrofólico.
- 7. Composição de acordo com a reivindicação 6 em que o agente anti-neoplásico é daunorrubicina. 2
- 8. Dispersão aquosa de uma quantidade de uma composição de acordo com a reivindicação 1 suficiente para, pelo menos, proporcionar uma dose eficaz do referido agente anti-neoplásico após administração parentérica.
- 9. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, ou uma dispersão de acordo com a reivindicação 8 para fabrico de um agente para combater neoplasmas. Lisboa, 28 de Dezembro de 20003
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