PT608172E

PT608172E - Mutantes de phaffia rhodozyma processo de producao de beta-caroteno e utilizacao de biomassa rica em beta-caroteno

Info

Publication number: PT608172E
Application number: PT94400107T
Authority: PT
Inventors: Patrick Girard; Catherine Eliane Jeann Javelot; Barbu Dinu Vladimir Vladescu
Original assignee: Pernod Ricard
Priority date: 1993-01-19
Filing date: 1994-01-18
Publication date: 2001-08-30
Also published as: DE69426995T2; ATE200304T1; US5691190A; EP0608172B1; EP0608172A1; FR2700552B1; DE69426995D1; DK0608172T3; ES2155467T3; GR3036025T3; JPH06237759A; FR2700552A1

Description

DESCRIÇÃO

MUTANTES DE PHAFFIA RHODOZYMA, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BETA-CAROTENO E UTILIZAÇÃO DE BIOMASSA RICA EM BETA-CAROTENO A presente invenção refere-se a mutantes de Phaffia rhodozvma bloqueados na via da carotenogenese, a processos de obtenção de 3-caroteno, àutilização de biomassa destes mutantes e à utilização de β-caroteno.

Conhecido principalmente como a mais importante das provitaminas A (+ Le Merck Index, 11a edição, 1989, p. 282, ns de entrada 1860), o β-caroteno é actualmente objecto de estudos epidemiológicos e clínicos aprofundados que parecem atribuir-lhe papéis fisiológicos além dos ligados à vitamina A.

Com efeito, sendo a conversão do β-caroteno em vitamina A na parede intestinal regulada pela própria taxa de vitamina A no sangue, uma parte do β-caroteno alimentar permanece no estado de provitamina e exerce uma função anti-oxidante, provavelmente responsável pela protecção contra certas formas de cancro, arteriosclerose, artrite reumatóide, catarata senil, parkinsonismo. Uma dose diária de 5,2 a 6,0 mg de β-caroteno nos alimentos foi preconizada como factor importante de prevenção destas doenças.

Como o β-caroteno é igualmente um pigmento natural susceptível de substituir corantes de síntese e que goza de uma percepção muito favorável da parte dos consumidores, fazem-se esforços consideráveis actualmente sobre a elaboração de novos produtos alimentares contendo β-caroteno, produtos que fazem parte da categoria de alimentos de nova geração, ditos alimentos “funcionais”. Além disso, parecia que o β-caroteno era um agente de protecção solar muito eficaz, daí certas aplicações na indústria de produtos cosméticos.

Se bem que os carotenóides em geral e o β-caroteno em particular estejam largamente difundidos no mundo vivo. somente as plantas e certos microrganismos possuem os equipamentos enzimáticos necessários à sua bio-síntese a partir de acetil-CoA, via ácido mevalónico. 1

Entre os microrganismos, certos cogumelos e algas sintetizam carotenos (portanto ο β-caroteno), enquanto que as bactérias produzem essencialmente xantofilos. Os processos de produção de β-caroteno em fermentador propostos até à data utilizam a alga Dunaliella (Ben Amotz & Avron, 1980) e os ficomicetes Phicomyces blakesleeamus (Murillo-Araujo et ai, 82) e Blakeslea trispora (Ninet et Renaut, 1979).

Quanto às leveduras, com uma excepção, estes microrganismos não são objecto de processos industriais de produção de carotenóides. O toruleno, sintetizado por leveduras vermelhas pertencendo aos géneros Rhodotorula et Rhodosporídium (Oatabase WPI, Semana 8530, AN85-181407, apresenta apenas um interesse menor, enquanto que os outros carotenóides identificados nas leveduras (portanto o β-caroteno) estão presentes em tão fracas quantidades que uma exploração industrial parece pouco viável. O único exemplo de carotenóide produzido industrialmente por uso de leveduras é oferecido pela astaxantina, pigmento característico da levedura Phaffia rhodozvma. Após optimização da produção, a astaxantina ou a biomassa de levedura são utilizadas como suplementos na alimentação do salmão, da truta salmonada, dos crustáceos, das galinhas poedeiras, etc... (Patente WO 91/02060).

Os carotenóides, para além do β-caroteno, não apresentam nem o potencial vitamínico do β-caroteno nem o seu efeito protector anti-oxidante. No entanto, o rendimento importante do funcionamento da via de bio-síntese da astaxantina na Phaffia rhodozvma. bem como a capacidade de alimentação virtual desta espécie, sugere-nos aproveitar as propriedades desta levedura no processo de produção do β-caroteno.

Uma produção de β-caroteno por leveduras seria portanto interessante uma vez que estas são, por um lado, mais fáceis de cultivar em massa que outros microrganismos, tais como os cogumelos e as plantas, e, por outro lado, a biomassa de mutantes de leveduras produtores de β-caroteno poderia ser utilizada tal e qual nos produtos especialmente alimentares, dietéticos, cosméticos, parafarmacêutos ou farmacêuticos. O efeito da β-ionona na produção de β-caroteno por uma estirpe selvagem e uma estirpe mutada de Phaffia rhodozvma foi descrito em Lewis et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol 56, n9 9; Setembto de 1990, 2944-2945. Sabe-se além disso que a 2 decomposição térmica de β-caroteno dá lugar à formação de α e β-ionona (Chemical Abstract, Vol. 72, na 13, 30 de Março, n° 65371c, Laroe et al.). A presente invenção fornece mutantes de Phaffia rhodozvma bloqueados na via da carotenogenese e que acumulam β-caroteno. A via de bio-síntese da astaxantina na Phaffia rhodozvma foi em parte elucidada e está presente na Figura 1.

Os mutantes de acordo com a invenção são bloqueados provavelmente na etapa de conversão do β-caroteno em equinenona, especialmente por tratamento com UV. Estes mutantes são incapazes de produzir astaxantina. A presente invenção tem com efeito por objectivo um Processo de obtenção de mutantes de Phaffia rhodozvma produtor de β-caroteno de acordo com a invenção, caracterizado por: 1) se tratar uma estirpe selvagem de Phaffia rhodozvma em cultura por um agente mutagene físico ou químico, e 2) se seleccionar os clones de cor amarela obtidos após o tratamento da etapa 1).

Como se mencionou num modo de realização, na etapa 1), trata-se a estirpe selvagem de Phaffia rhodozvma com um agente mutagene consistindo em raios ultravioletas. A presente invenção tem também por objectivo um processo de produção de β-caroteno por fermentação de uma estirpe mutante de levedura de Phaffia rhodozvma de acordo com a invenção.

Obtém-se um aumento do rendimento de produção em β-caroteno quando o meio de cultura é enriquecido com ácido mevalónico (o ácido mevalónico (AMV) é com efeito um precursor do β-caroteno na via de bio-síntese da astaxantina). A presente invenção tem também por objectivo a utilização de biomassa, eventualmente desidratada, de um mutante de levedura Phaffia rhodozvma de acordo com a invenção, 3 como suplemento de β-caroteno na preparação de produtos alimentares ou dietéticos, cosméticos, parafarmacêuticos ou farmacêuticos. A presente invenção fornece um processo de produção de β-caroteno por aquecimento de células de um mutante de levedura Phaffia rhodozvma de acordo com a invenção. A presente invenção tem por fim por objectivo a utilização da biomassa de uma levedura Phaffia rhodozvma de acordo com a invenção como fonte de β-ionona, especialmente na preparação de produtos alimentares ou dietéticos, cosméticos, parafarmacêuticos ou farmacêuticos.

Outras características e vantagens da presente invenção surgirão à luz dos exemplos que se seguem. A Figura 1 representa a via de bio-síntese da astaxantina na Phaffia rhodozvma. A Figura 2 representa o espectro de absorção do extracto da estirpe PG 104 (A) e do produto de referência (β-caroteno puro, Sygma) (B). A Figura 3 representa a análise HPLC dos extractos da estirpe selvagem CBS 6938 de Phaffia rhodozvma (A), do mutante PG 104 (B) e dos produtos de referência alfa-caroteno, (Sygma) e β-caroteno. EXEMPLO 1

Obtenção dos mutantes

As células da estirpe selvagem CBS 6938 de Phaffia rhodozvma são cultivadas sobre um meio líquido (YPG) contendo 1% de extracto de levedura, 1% de bactopeptona e 2% de glucose, sob agitação (150 rpm) a 25SC. As culturas com idade de 72 horas são centrifugadas 5 min a 3000 g e as células são lavadas duas vezes com água destilada e tratadas com UV durante 50 s a 35 cm de uma lâmpada germicida, o que corresponde a uma dose de 1,789 J x s'1 x cm2. A taxa de sobrevivência é de cerca de 10%. As células tratadas são estendidas sobre caixas de YPG sólido e incubadas a 25SC durante 72 horas. Em 5 x 104 colónias examinadas, descobriram-se algumas colónias brancas bem 4 como duas colónias de cor amarela (PG 104 e PG 106) contrastando com a cor vermelha das colónias selvagens. O mutante PG 104 foi objecto de experimentações posteriores. EXEMPLO 2

Identificação dos carotenóides do mutante PG 104

Colocam-se 100 ml de meio SD (50,67% de bacto-yeast nitrogen base sem aminoácidos e 2% de glucose) em frascos Erlenmeyer de 1000 ml e inoculam-se com 106 células/ml da estirpe PG 104 retiradas de uma pré-cultura em YPG. Incubam-se as culturas a 25SC sob agitação (150 rpm) e, ao fim de 72 horas, recolhem-se as células por centrifugação e submetem-se a um tratamento lítico: a 200 ml de suspensão celular em tampão citrato-fosfato 0,1 M, pH 5,6, contendo 107 células/ml, adiciona-se 6 mg/ml de preparação enzimática (Novozym 234); após uma incubação de 60 min a 25SC sob agitação fraca, o exame microscópico mostra uma lise das paredes celulares de praticamente 100%. A preparação de protoblastos é então tratada com acetona e os carotenóides são extraídos com éter de petróleo. O espectro UV-VIS do extracto (Fig. 2) é idêntico ao do produto de referência (β-caroteno puro, Sygma). A análise por HPLC (Fig. 3) sobre coluna Microbondapak RP 18 (Waters), tendo como fase móvel metanol, mostra no caso do mutante PG 104 a presença de um único pico, correspondente ao do β-caroteno puro, contrariamente à estirpe selvagem que contém astaxantina como pico principal, mas também, em pequenas quantidades, outros intermediários prováveis da via dos carotenóides.

Uma comparação com as proporções relativas de diferentes carotenóides na estirpe selvagem (Tabela 1) mostra claramente que o mutante PG 104 produz praticamente em exclusividade β-caroteno. Ele corresponde provavelmente a um bloqueio mutacional ao nível da etapa de conversão do β-caroteno em equinenona. 5

Tabela 1 SELVAGEM * MUTANTE (P-104) Neurosporeno 0,01 0 Licopeno 0,01 ? γ-Caroteno 0,01 0 β-Caroteno 2-2,5 92 Equinenona 2-4 0 Hidroxi-equinenona 3-4 0 Foenicoxantina 5-7 0 Astaxantina 83-97 0 CAROTENÓIDES DE PHAFFIA RHODOZYMA (% DOS CAROTENÓIDES TOTAIS) * Segundo Andrewes et al. (1976) EXEMPLO 3

Produção de 6-caroteno com o mutante PG 104

Testaram-se diferentes meios e condições de cultura, bem como o efeito de certos suplementos sobre a bio-síntese de β-caroteno por PG 104, afim de estabelecer os parâmetros que permitem aumentar esta produção. Os resultados são apresentados na Tabela II.

No seguimento destes testes, escolheram-se os parâmetros de cultura seguintes para uma produção óptima de β-caroteno:

- Meio de cultura: SGIy-HC-AMC - Inóculo: 106cpm - Volume: 1/10 do volume do frasco

- Temperatura: 25SC - Agitação: 150 rpm 6

Nestas condições, obtém-se ao fim de 96 horas até 10 mg de β-caroteno por litro de cultura.

Tabela 2

Meio β-CAROTENO mg/ml mg/g peso seco YPG 0,37 0,07 YPGIy 2,35 0,32 SD 1,80 0,50 SGIy 0,05 0,12 PDB 2,30 0,29 VG 2,70 0,39 VGIy 0,46 0,31 SD-AMV 4,70 1,12 SGIy-HC 7,90 0,87 SGIy-AMV-HC 9,95 1,08

PRODUÇÃO DE β-CAROTENO EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA YPG = 1% de Extracto de levedura, 1% de Bactopeptona, 2% de Glucose YPGIy = 1 % de Extracto de levedura, 1 % de Bactopeptona, 3% v/v de Glicerol SD = 0,67% Bacto-yeast nitrogene base, 2% de Glucose SGIy = 0,67% Bacto-yeast nitrogene base, 3% v/v de Glicerol PDB = 2,4% de Dextrose de batata (Difco) VG = 2% de Extracto de carne, 2% de Glucose VGIy = 2% de Extracto de carne, 3% v/v de Glicerol SD-AMV = SD + 500 mg/l de ácido mevalónico SGIy-HC = SGIy + 5 g/l de hidrolisato de caseína SGIy-HC-AMV = SGIy + 5 g/l de hidrolisato de caseína + 500 mg/l de ácido mevalónico 7 EXEMPLO 4

Preparação bruta de β-caroteno a partir de células PG 104 de Phaffia rhodozvma

As células de PG 104 cultivadas nas condições padrão são recolhidas por centrifugação e lavadas uma vez com água destilada. A 1 g (peso húmido) de células, adiciona-se 100 ml de etanol absoluto e agita-se a suspensão 1 hora a 150 rpm. As células são recolhidas por centrifugação e o resíduo é repartido em camadas de 1-2 mm de espessura sobre caixas de Petri e seco 24 horas à temperatura ambiente. Obtém-se um pó que contém 2 mg de β-caroteno por grama. Alíquotas deste pó são espalhadas sobre caixas de YPG sólido e a ausência de crescimento ao fim de 2 semanas mostra que a preparação não contém nenhuma célula viva.

Esta preparação pode ser utilizada como suplemento de β-caroteno em sumos de fruta e qualquer outro produto alimentar, bem como em produtos cosméticos e na alimentação animal. EXEMPLO 5

Preparação rica em β-caroteno a partir de células de Phaffia rhodozvma PG 104

Tratam-se as células recolhidas em 100 ml de cultura com Novozym (como descrito no exemplo 2) e extraem-se 5 vezes com acetona. Reúnem-se os extractos e eliminam-se os resíduos celulares por centrifugação. Coloca-se o sobrenadante acetónico numa ampola de decantação; adicionam-se 10 ml de éter de petróleo e 1 ml de NaCI saturado. Recupera-se a fase superior (éter de petróleo) fortemente colorida; extrai-se a fase acetónica uma segunda vez com éter de petróleo e reúnem-se os extractos em éter, filtram-se, secam-se dobre Na2S04 anidro e retoma-se em 1 ml de éter de petróleo. Confirma-se a identidade do carotenóide extraído por espectrofotometria. O extracto final contém 1 g de β-caroteno por litro. 8 EXEMPLO 6

Produção de B-ionona no decurso da elaboração de bebidas destiladas A β-ionona é um aroma caro utilizado na indústria alimentar. Fermenta-se mosto de malte de destilaria (densidade inicial 1060) com uma camada de destilaria tradicional, até uma densidade de 997. Antes da destilação adiciona-se 1 g de células de Phaffia rhodozvma PG 104 tratadas previamente com Novozym. No low wine obtido após destilação, põe-se em evidência por GC-MS a presença de traços de β-ionona e ausentes no produtos testemunha.

Lisboa, '21 HAIO 2991

Por PERNOD-RICARD

Agente Oficiai da Propriedade industria, Arco da Conceição, 3,1!-1100 LISBOA θ

BIBLIOGRAFIA

Ben-Amotz A., Avron M. (1983) On factors which determine massive β-carotene accumulation in the halotolerant alga Dunaliella bardawil. Plant Physiol. 72: 593-597.

Murillo-Araujo F.J., Calderon I.L., Lopez-Diaz I., Cerda-Olmedo E. (1978) Carotene superproducing strains of Phycomyces. Appl. Environ. Microbiol. 3β: 639-642.

Ninet L., Renaut J. (1979) In “Microbial Technology”, H.J. Peppler & D. Perlman eds., 2nd Ed. Vol. 1 , pp. 529-544, Academic Press, New York.

Igene Biotechnology, Inc. (1989) Process for in vivo production of astaxanthin and Phaffia rhodozyma yeast of enhanced astaxanthin content. Patente WO 91/02060.

Andrewes A.G., Phaff H.J., Starr M.P. (1979) Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red-pigment fermenting yeast. Phvtochemistrv 15:1003-1007. 10

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Mutantes de Phaffia rhodozvma bloqueados na etapa de conversão do β-caroteno na via de bio-síntese da astaxantina.
2. Processo de obtenção de mutantes de Phaffia rhodozvma produtores de β-caroteno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: 1) se tratar uma estirpe selvagem de Phaffia rhodozvma em cultura por um agente mutagene físico ou químico, e 2) se seleccionar os clones de cor amarela obtidos após o tratamento da etapa D-
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por, na etapa 1), se tratar uma estirpe selvagem de Phaffia rhodozvma por um agente mutagene consistindo em ultravioletas.
4. Processo de produção de β-caroteno por fermentação de uma estirpe mutante de levedura de Phaffia rhodozvma de acordo com a reivindicação 1.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o meio de cultura ser enriquecido com ácido mevalónico.
6. Utilização de biomassa, eventualmente desidratada, de um mutante de levedura Phaffia rhodozvma de acordo com a reivindicação 1, como suplemento de β-caroteno na preparação de produtos alimentares ou dietéticos, cosméticos, parafarmacêuticos ou farmacêuticos.
7. Processo de produção de β-ionona por aquecimento de células de um mutante de levedura Phaffia rhodozvma de acordo com a reivindicação 1.
8. Utilização de biomassa de uma levedura Phaffia rhodozvma de acordo com a reivindicação 1, como fonte de β-ionona especialmente na preparação de produtos alimentares ou dietéticos, cosméticos, parafarmacêuticos ou farmacêuticos. 1 Lisboa, 2 1 ΜΑΙΟ 2001 Por PERNOD-RICARD

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