PT518756E - Processo de deteccao da infeccao pelo virus da diarreia bovina sequencia nucleotidica que codifica uma proteina induzida pela infeccao por este virus e proteinas e antigenios recombinantes afins - Google Patents

Description

-1 - 5\§^56 DESCRIÇÃO "PROCESSO DE DETECÇÃO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA DIARREIA BOVINA, SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA INDUZIDA PELA INFECÇÃO POR ESTE VÍRUS E PROTEÍNAS E ANTIGÉNIOS RECOMBINANTES AFINS"

Processo da detecção da infecção pelo vírus da diarreia bovina, sequência nucleotídica que codifica uma proteína induzida pela infecção por este vírus e proteínas e antigénios recombinantes afins. O presente invento refere-se a um processo de detecção da infecção pelo vírus da diarreia bovina, uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína associada à infecção por este vírus e proteínas e antigénios recombinantes afins. O vírus da diarreia bovina (BVD) é um vírus envolvido por ARN monocatenário infeccioso, que é aparentado com o vírus da peste porcina clássica e com o da doença de Border, formando os três vírus o género Pestivírus que pertence à família dos Togaviridae. O vírus BVD encontra-se espalhado universalmente nas populações bovinas e manifesta-se por um grande leque de sintomas clínicos associados a doenças congénitas, respiratórias ou entéricas (diarreia virai bovina, doença das mucosas).

Os isolados dos vírus BVD podem ser classificados em duas categorias ou biotipos distintos de acordo com os seus efeitos em cultura de células; citopatogénicos e não citopatogénicos. -2- A infecção aguda de animais seronegativos é ordinariamente benigna ou subclínica. Pelo contrário, uma infecção intra-uterina do feto, nos cerca de quatro primeiros meses após o início da gestação, para uma estirpe não citopatogénica, pode não somente provocar abortos, nados mortos ou o nascimento de vitelos fracos, mas também o nascimento de vitelos apresentando uma virémia persistente, ou seja excretando o vírus de um modo permanente. Esse período de quatro meses corresponde a uma ausência de imunidade no feto. Quando o sistema imunitário se toma competente, este reconhece o vírus como sendo seu e estabelece-se uma situação de imunotolerância (ausência de anticorpos). Esses animais não poderão sobreviver a uma infecção ulterior por uma estirpe citopatogénica de vírus BVD homólogo. A manutenção do vírus não citopatogénico no seio da população bovina é assegurada pela sua lenta disseminação a seguir à infecção aguda de animais seronegativos e, sobretudo, pela sua excreção contínua pelos animais que apresentem uma virémia persistente. (Ver J. Brownlie et al., Ann. Rech. Vét. (a987) 18: 157-166). A. Fenton et al. (Journal of Virological Methods, 27 (1990), 253-260) detectam os antigénios de Pestivírus no sangue de carneiros virémicos infectados de modo persistente pelo vírus da doença de Border, por um ensaio ELISA conduzido de modo a detectar um antigénio específico nos leucócitos desses animais. Esta técnica necessita previamente de uma purificação dos leucócitos que se revela de realização longa e complexa. O genoma da estirpe virai Osloss de biotipo citopatogénico foi clonado e inteiramente sequenciado por Renard et al. (pedido de patente EP-A-0.208.672 de 8 de Julho de 1985). O requerente verificou que a fase de leitura -3- aberta (ORF), da sequência genómica de BVD Osloss com o comprimento de 12.408 nucleótidos, tem uma capacidade para codificar 3.951 ácidos aminados (aas).

Num resumo distribuído no decurso do Simpósio sobre as infecções dos ruminantes pelos Pestivírus que teve lugar em Hanover nos dias 8 e 9 de Junho de 1990, C. Lecomte et al. indicam a identificação de um produto de tradução de ADNc do vírus BVD imunoprecipitado por anticorpos monoclonais reconhecendo a proteína não estrutural p80 de um certo número de estirpes de Pestivírus. O mesmo ADNc é expresso em E. coli e o antigénio produzido é utilizado em ELISA de competição para detectar anticorpos anti-BVD no soro bovino. A preparação e a caracterização de uma série de anticorpos monoclonais foram descritas por C. Lecomte et al. (Veterinary Microbiology, 23 (1990), 193-201), e do mesmo modo foi descrita a utilização de uma proteína de fusão produzida em E. coli, como antigénio recombinante permitindo a detecção de anticorpos séricos anti-BVD num ensaio ELISA de competição com os anticorpos monoclonais escolhidos.

Num resumo distribuído no Oitavo Congresso Internacional de virologia que teve lugar em Berlim de 26 a 31 de Agosto de 1990, C. Lecomte et al. fazem a proposta de recorrer a dois ensaios ELISA a fim de detectar por um lados os anticorpos anti-BVD e por outro lado os antigénios virais. Os anticorpos anti-BVD no soro seriam detectados por um ELISA de competição revelando um antigénio recombinante p80 de BVD Osloss produzido no E. coli e anticorpos monoclonais dirigidos especificamente contra a proteína p80 de um certo número de estirpes de Pestivírus. O segundo ELISA seria um ELISA de tipo "sandwich" utilizando dois anticorpos monoclonais e permitiria a detecção de antigénios nos animais com virémia persistente. O requerente verificou contudo que a proteína p80 produzida no E. coli não é reconhecida por todos os anticorpos monoclonais anti-p80 e nomeadamente por alguns de entre eles que apresentam uma poliespecificidade, ou seja que reagem em presença de várias ou de todas as estirpes de Pestivírus, o que compromete as hipóteses de poder detectar de uma só vez qualquer infecção por uma qualquer estirpe de BVD, tanto mais que o segundo ELISA, baseado na utilização de dois anticorpos monoclonais, poderia também não ser suficientemente poliespecífico.

Por outro lado, embora a totalidade do genoma da estirpe Osloss tenha sido sequenciada, não foi disponibilizada qualquer indicação sobre a sequência nucleotídica codificadora para o antigénio p80. O invento tem como objectivo fornecer um processo de detecção muito sensível permitindo um controlo completo e eficaz da eventual infecção de uma criação de gado por um vírus qualquer BVD, e incidindo concomitantemente sobre a detecção das virémias persistentes e sobre infecções agudas. O invento tem portanto como objectivo um processo de detecção da infecção a partir de uma colheita de sangue pelo vírus BVD, compreendendo um primeiro teste para a detecção dos anticorpos anti-BVD e um segundo teste para a detecção de partículas virais, caracterizado pelo facto de se detectarem os anticorpos anti-p80 com o auxilio de um antigénio recombinante compreendendo a proteína não estrutural p80 do vírus BVD, produzida em hospedeiro eucariota, e de preferência com o auxilio de um anticorpo competidor, e pelo facto de se detectar a presença de partículas virais com o auxilio de anticorpos, policlonais ou monoclonais, dirigidos contra a proteína p80 do vírus BVD, e de preferência de um soro dirigido contra o antigénio p80 recombinante produzido em hospedeiro eucariota ou procarionte, para a detecção das virémias persistentes e das infecções agudas seja qual for a estirpe de BVD. O invento tem igualmente como objectivo um processo de detecção dos anticorpos anti-BVD numa colheita de sangue, caracterizado pelo facto de se detectarem os anticorpos anti-p80 com o auxilio de um antigénio recombinante compreendendo a proteína p80 do vírus BVD produzida em hospedeiro eucariota. A proteína p80 provem, de preferência, de BVD Osloss e a sequência nucleotídica codificadora para essa proteína foi inteiramente sequnciada. A sequência é indicada na lista de sequências anexada, sob a referência SEQ ID NO:l. O requerente localizou assim, de um modo vantajoso, dois sítios potenciais de clivagem da p80 (KVR : Lisina - Valina - Arginina) correspondendo ao início e ao fim de p80. A proteína p80 é expressa em vectores virais ou eucariotas e nomeadamente no sistema Baculovírus, o qual é vantajosamente o baculovírus AcNPV (Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus). A sequência nucleotídica codificadora para p80 é introduzida num vector de expressão apropriado de acordo com as técnicas conhecidas de construção desses vectores, nomeadamente as descritas no pedido de patente EP-A-0.208.672.

Evidentemente, a sequência de nucleótidos anteriormente citada inclui todas as sequências equivalentes, ou seja que retomam as propriedades essenciais da sequência. A título de exemplo, tal seria o caso de uma sequencia que codificasse para uma· sequência idêntica de ácidos aminados, mas que -6- utilizasse outros codões específicos por degenerescência do código. Seria igualmente o caso para uma sequência que codificasse uma sequência de ácidos aminados também não idêntica mas semelhante, tomando em consideração as semelhanças entre ácidos aminados.

Considera-se também como sequência equivalente uma sequência, que codifique para p80, proveniente de uma outra estirpe de BVD e conservando o reconhecimento pelos anticorpos anti-p80. O antigénio recombinante provem ele próprio de culturas de células hospedeiras eucariotas que foram transfectadas pelo vector expressando p80, e é constituído de preferência por extractos dessas células. Os hospedeiros eucariotas podem ser culturas celulares animais ou leveduras, nomeadamente Saccharo-myces cerevisiae. Os vectores de transferência para as leveduras comportam vantajosamente marcadores permitindo a selecção dos recombinantes úteis, por exemplo por resistência aos antibióticos ou por outros meios de selecção conhecidos (Broach J. et al., Meth. Enz. (1983) 101 : 307). Para os promotores, ver igualmente Hess et al., J. Adv. Enz. Reg. (1968) 7 / 149, e Holland et al., Bio-chemistry (1968) 17 : 4900 ou Itzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255 : 2073.

As células animais são, de preferência, linhagens celulares de mamíferos conhecidas tais como HeLa, CHO, ou BHK, células de insectos, por exemplo Spodoptera frugiperda/depósito ATCC CRL 1711, Sf9) (nomeadamente para o sistema Baculovírus) e, de um modo geral, preferir-se-ão linhagens cuja utilização para a expressão de substancias a administrar ao animal tenha sido reconhecida pelas autoridades sanitárias. Utilizar-se-á como promotor, nessas construções celulares, promotores virais tais como os dos vírus SV40 (Fiers et al.,

Nature, (1978) 273 : 113) e do vírus CMV ou citomegalovírus humano (McGregor et Caskey, Nucleic Acids Res. 17 : 2365, 1989), ou ainda o do gene poli-hedrinaedrine do Baculovírus AcNPV ou Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus (Hooft van Iddekinge et al., 1983, Virology 131 : 561-565). O antigénio recombinante é de preferência imobilizado sobre um suporte sólido (placas de microtitulação por exemplo), nomeadamente por intermédio de um anticorpo monoclonal anti-p80 utilizado como captador. Diluições de soros bovinos são postas em contacto com o antigénio imobilizado ou não e os anticorpos anti-BVD são quer directamente revelados por um anti-soro anti-IgG bovinos acoplado por exemplo à peroxidase ou à biotina (ELISA indirecto), quer revelados por um ELISA de competição com um segundo anticorpo monoclonal anti-p80 acoplado por exemplo com a peroxidase ou com a biotina. Com efeito, esta detecção pode ser feita sobre qualquer ffacção de sangue bovino, nomeadamente soro e plasma.

De preferência, revelam-se as partículas virais no sangue completo, em bruto ou enriquecido com glóbulos brancos por meio de uma simples centrifugação, nomeadamente durante 30 minutos a 2.500 g.

Para assegurar uma detecção completa da presença de partículas virais de todos os tipos de BVD, utiliza-se, de preferência, como captador uma mistura de três anticorpos monoclonais específicos em relação a p80 em vez de um único anticorpo monoclonal.

Efectua-se de preferência um ensaio ELISA do tipo "sandwich" com, como captador, a mistura de três anticorpos monoclonais específicos da p80 virai e, como revelador, o soro dirigido contra a proteína p80 recombinante. O -8- soro provem nomeadamente da imunização de animais, nomeadamente de coelhos ou de cabras, por inoculações repetidas de p80 recombinante, a qual pode ser produzida tanto em células procariontes como em células eucariotas.

Pode-se também detectar como positivas amostras correspondendo a um título virai inferior por exemplo a 10 ufp/ml (ufp = unidades formadoras de placas). O invento permite com efeito detectar como positivas as amostras que, pelo método usual de imunofluorescência sobre células infectadas, podem necessitar de três passagens sucessivas do vírus e a escolha de hospedeiros adequados, o que obriga a propagar o vírus em vários tipos celulares. Não contendo a proteína p80 epítopos de neutralização, este processo irá permitir, de um modo vantajoso, fazer a distinção entre os animais infectados naturalmente e os animais vacinados por uma vacina recombinante tendo como base as proteínas estruturais do vírus. O invento tem também como objectivo a sequência de nucleótidos referenciada SEQ ID NO:l correspondendo à sequência de BVD Osloss que codifica a proteína não estrutural p80, ou uma sequência equivalente de acordo com a definição apresentada mais acima, assim como qualquer nova sequência nucleotídica que a contenha e que comporte meios que permitem a sua expressão ou que estejam associados a tais meios. O invento tem ainda como objectivo a proteína p80 recombinante correspondendo à tradução desta sequência, nomeadamente em hospedeiro eucariota, nos sistemas de expressão acima indicados, e a qualquer antigénio recombinante contendo essa sequência, nomeadamente constituída por extractos de células hospedeiras, em particular eucariotas, tal como foi aqui anteriormente exposto.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DO DESENHO A figura 1 mostra a posição dos clones de ADNc cobrindo o conjunto do genoma do vírus BVD (estirpe Osloss). A figura 2 mostra a análise in vitro da região do genoma de BVD Osloss correspondendo ao clone de ADNc 174. Os valores indicam ali o tamanho (pares de bases = pb) dos diferentes fragmentos obtidos por digestão da inserção 174 por cada um dos enzimas de restricção utilizados. A figura 3 mostra a localização, sobre o genoma de BVD Osloss, da região imunoreactiva de 80 ácidos aminados e dos limites da proteína p80. A figura 4 mostra a crivação de epítopos na região imunoreactiva, com um comprimento de 80 ácidos aminados, situada no seio da proteína p80. A figura 5 mostra o esquema do vector de transferência pAcYMl descrito por Matsuura et al. em J. Gen. Virol. (1987), 68 : 1233 a 1250. I - LOCALIZAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO DA SEQUÊNCIA QUE CODIFICA P80. 1. Fez-se a clonagem de ADNc (clone pCP174 da biblioteca de ADNc descrita no pedido de patente europeia EP-A-0.208.672) (figura 1) no plasmídeo pSP65, a jusante do promotor para a ARN polimerase do bacteriófago SP6, entre os sítios EcoRI e BamHI (vector descrito por Melton D.A. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12: 7035-7056). -10

2. Após digestão por diferentes enzimas de restricção cuja posição dos sítios sucessivos está indicada na figura 2, cada fragmento obtido foi transcrito in vitro, em seguida traduzido num sistema acelular (lisado de reticulocitos de coelho). Os produtos de tradução de peso molecular crescente foram imunoprecipitados por anticorpos monoclonais anti-p80; isto permitiu localizar uma região imunoreactiva longa de 80 ácidos aminados, localizada sobre a figura 3 e cuja sequência é dada na lista de sequências sob a referência SEQ ID NO:2. 3. A presença de epítopos reconhecidos nesta região de 80 ácidos aminados foi confirmada por rastreio de epítopos ("epitope scanning"), ou seja que 75 hexâmeros peptídicos recobrindo essa região foram sintetizados sobre suporte sólido e testados em ensaio ELISA em presença de anticorpos monoclonais anti-p80 e de soros bovinos positivos ou negativos em anticorpos. O resultado é ilustrado na figura 4. 4. A seguir à localização dos epítopos anti-p80, foi reconstituída a sequência codificadora da proteína p80 afim de se aproximar o mais possível da proteína natural. Por análise da sequência genómica do vírus BVD/Osloss e comparação com a dos Flaviviridae conhecidos, foi determinada a presença de dois sítios potenciais de clivagem (KVR : Lisina - Valina - Arginina) correspondendo ao início e ao fim da p80; o peso molecular teórico da proteína compreendida entre estes dois sítios é de 80.430 daltons. O primeiro dos dois triplets encontra-se exactamente no mesmo sítio que o genoma do vírus BVD/NADL, e o genoma inteiro de BVD/Osloss só contem 5 triplets KVR, todos eles situados na parte codificadora para as proteínas não estruturais do vírus (o genoma NADL contem sómente três deles). O fragmento p80 de 2.200 pb (pares de bases) correspondendo à - 11 - sequência que codifica p80 foi amplificado por PCR (Polymerase Chain Reaction) e clonado; a sua localização é ilustrada na figura 3 : a sua sequência nucleotidiva é referenciada comoSEQIDNO: 1. II.-EXPRESSÃO DO ANTIGÉNIO RECOMBINANTE. A integração do fragmento p80 no genoma do Baculovirus Autographa Califomica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) foi realizada por intermédio do vector de transferência pAcYMl descrito por Matsuura et al. (J. Gen. Virol. 68 : 1233-1250, 1987; mapa de restricção na figura 5), a jusante do promotor do gene da poli-hedrina de AcNPV. Este vector contem o sítio de poliadenilação do gene poli-hedrina assim como o gene de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmídeo pUC8 (J. Messing, 1983, Meth - Enzymol. 101:20).

Para este fim, o fragmento amplificado da sequência SEQ ID NO: 1 é dirigido pelos enzimas de restricção Ncol e BamHI, sendo em seguida tratado com ADN-polimerase (fragmento de Klenow), de modo a tomar livres as extremidades 5' e 3' do fragmento. Faz-se em seguida a clonagem no vector pAcYMl digerido por BamHI e tratado com ADN-polimerase (fragmento de Klenow) para tomar as extremidades livres. Obtem-se o plasmídeo recombinante pAcYMl-p80, sendo a p80 expressa sob a dependencia do promotor do gene da poli-hedrina. O plasmídeo obtido é utilizado para cotransfectar as células de insectos Sf9 ao mesmo tempo que o ADN purificado de AcNPV de tipo selvagem. Um víms recombinante AcNPV-p80 foi purificado espalhando o produto flutuante de cotransfecção e isolando as regiões virais por cobertura com agarose. - 12- III - ENSAIO ELISA DE DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-ρ80.

Princípio: O ensaio é baseado sobre a detecção dos anticorpos anti-p80, dito de outro modo dos anticorpos dirigidos contra uma proteína não estrutural de 80.000 daltons associada à infecção pelo vírus BVD.

Um antigénio recombinante compreendendo a proteína p80 proveniente do vírus Osloss é fixado sobre suporte sólido por intermédio de um anticorpo monoclonal utilizado como captador. A amostra de sangue ou de soro bovino é posta em contacto com o antigénio fixado e é em seguida quer directamente revelada por um antisoro anti-IgG bovinos acoplados, quer posta em competição com um segundo anticorpo monoclonal anti-p80 acoplado.

Material, reagentes e amostras: 1. Material e tampões: - placas para ELISA com 96 recipientes (NUNC - MAXISORP); - tampão carbonato pH 9,6 : Na2C03 15mM, NaHC03 35 mM, NaN3 3mM; - tampões de lavagem : (1) PBS, (2) PBS, Tween® 20 0,1%; - tampão de diluição : PBS, Tween® 20 0, 1%, soro de cavalo 10% (controlo isento de vírus BVD); - tampão de saturação : PBS, soro de cavalo 10% (controlo isento de vírus BVD). - cromogénio e tampão adequados. - 13- 2. Reagentes : - 1 anticorpo monoclonal anti-p80 utilizado como captador do antigénio p80 (líquido de ascite diluído); - antigénio p80 recombinante; - a) Competião ELISA : 1 anticorpo monoclonal anti-p80 diluído e acoplado à peroxidase ou à biotina; - b) ELISA indirecto : soro (coelho ou cabra)anti-igG bovinos acoplado à peroxidase ou à biotina). 3. Preparação das amostras: - amostras séricas : colheita do sangue em tubos sem anti-coagulante; coagulação mínima de 4 horas à temperatura ambiente; cetrifugação 2.500 g, 30 minutos; recolha do produto flutuante = soro. - o teste pode ser realizado em qualquer uma das fracções sanguíneas, nomeadamente o plasma ou mesmo o sangue completo colhido em tubos com anti-coagulante. Método: 1. Fixação do captador: O anticorpo monoclonal anti-p80 diluído é repartido à razão de 100 μΐ por cavidade: - contacto durante uma noite a 4o C; - 3 lavagens com o tampão (1). 2. Saturação (facultativa): 150 μΐ/cavidade de tampão de saturação: - 1 hora a 37° C. 3. Fixação do antigénio: antigénio p80 recombinante (100 μΐ/cavidade) - 14- - contacto durante uma noite a 4o C. 4. Contacto com as amostras: 100 μΐ/cavidade; soros diluídos lOx: - contacto durante 2 horas a 37° C. - 3 lavagens com o tampão (1). 5. Contacto com o anticorpo revelador: a) ELISA de competição: contacto com o anticorpo monoclonal diluído e acoplado: - Ih30 a 37° C; - 3 lavagens com o tampão (2); - 3 lavagens com água. b) ELISA indirecto: contacto com o soro anti-IgG bovinos diluído e acoplado: - Ih30 a 37° C; - 3 lavagens com o tampão (2); - 3 lavagens com água. 6. Revelação pelo cromogénio: O processo varia de acordo com o cromogénio e é detalhado pelo seu fornecedor.

IV - ENSAIO ELISA DE DETECÇÃO DE PARTÍCULAS VIRAIS.

Princípio: O ensaio é baseado sobre a detecção da proteína p80, proteína não estrutural do vírus BVD presente em grande quantidade no sangue dos animais infectados. Uma mistura de três anticorpos monoclonais específicos desta proteína é utilizada como captador e é fixada sobre suporte sólido (placas de microtitulação). O sangue completo ou a fracção de sangue enriquecido em glóbulos brancos ou "buffy coat" é feito contactar com a mistura captadora fixada. Um soro (coelho ou cabra) dirigido contra a proteína p80 recombinante é - 15 - utilizado como anticorpo revelador, quer directamente acoplado (à peroxidase ou à biotina), quer ele próprio revelado por um segundo anticorpo (anti-IgG de coelho ou de cabra) acoplado à peroxidase ou à biotina. A presença de antigénio virai nas amostras testadas traduz-se pela elevação da densidade óptica de base na presença de cromogénio.

Material, reagentes e amostras: 1. Material e tampões: - placas para ELISA com 96 recipientes: NUNC - MAXISORP. - tampão carbonato pH 9,6: Na2C03 15 mM, NaHC03 35 mM,

NaN3 3 mM. - tampão de lavagem: PBS, Tween® 20 0,1%. - tampão de saturação/diluição: PBS, Tween® 20 0,1%, soro de cavalo 10% (controlo isento de vírus BVD). - cromogénio e tampão adequados. 2. Reagentes: - mistura de 3 anticorpos monoclonais anti-p80, líquidos de ascite diluídos. - soro (coelho ou cabra) dirigido contra a proteína p80 recombinante, quer directamente acoplado (à peroxidase ou à biotina), quer ele próprio revelado por um segundo anticorpo (anti-IgG de coelho ou de cabra) acoplado à peroxidase ou à biotina. 3. Preparação das amostras:

Colheita do sangue em tubos com heparina; as amostras são - 16-

testadas quer tal e qual, quer após enriquecimento em glóbulos brancos seguindo o processo que se segue: centrifugação a 2.500 g; 30 minutos; após centrifugação, eliminação por pipetagem da camada superior constituída pelo plasma e retirada da "buffy coat", zona esbranquiçada situada entre o plasma e os glóbulos vermelhos. Método: 1. Fixação do captador:

Mistura de anticorpos monoclonais diluídos e repartidos à razão de 100 μΐ por cavidade. - Contacto durante uma noite a 4o C. - 3 lavagens em PBS/Tween®, 2. Saturação: 150 μΐ/cavidade de tampão de saturação contendo 10% de soro de cavalo. - 1 hora a 37° C. 3. Contacto com as amostras: 100 μΐ de sangue completo ou de "buffy coat" por cavidade.

- Contacto durante 2 horas a 37° C - 3 lavagens em PBS/Tween. 4. Contacto com o anticorpo revelador:

Soro anti-p80 diluído, acoplado ou não (peroxidase ou biotina): - contacto 1 h a 37° C (100 μΐ / cavidade); - 3 lavagens em PBS/Tween®; - 3 lavagens com água;

No caso de utilização de soro não acoplado, de novo contacto com antisoro acoplado (1 hora a 37° C). 5. Revelação pelo cromogénio: O processo varaia de acordo com o cromogénio escolhido e é detalhado pelo seu fornecedor. - 17- LISTA DAS SEQUÊNCIAS. SEQ ID NO. 1 TIPO DE SEQUÊNCIA : sequência nucleotídica COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 2.236 pares de bases NÚMERO DE BOCADINHOS : simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA : ADNc para ARN genómico ORIGEM : BYD Osloss REGIÃO TRADUZIDA : 40 - 2229 PROPRIEDADES : código para a proteína p80 TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CCÇ Met ATÇ Gly ÇGA Leu CTG 3 48 Trp Ala Tyr Thr His Gin Gly Gly Ile Afcol Ser Ser Vai Asp 19 IGG GCC TAC ACA CAC CAA GGC GGC ATA AGC TCA GTA GAC 96 Ala Gly Lys Asp Leu Leu Vai Cys Asp Ser Met Gly Arg 35 GCA GGC AAA GAC CTA CTG GTT TGT GAT AGT ATG GGT AGG 144 Vai Cys Gin Ser Asn Asn Lys Leu Thr Asp Glu Thr Glu 51 GTT TGC CAA AGT AAC AAC AAG TTA ACT GAT GAG ACA GAA 192 Lys Thr Asp Ser Gly Cys Pro Asp Gly Ala Arg Cys Tyr 67 AAG ACG GAC xcc GGA TGT CCA GAT GGT GCC AGG TGC TAC 240 Pro Glu Ala Vai Asn Ile Ser Gly Ser Lys Gly Ala Ala 83 CCA GAG GCA GTA AAT ATA TCA GGG ICC AAG GGA GCT GCT 288 Gin Lys Thr Gly Gly Glu Phe Thr Cys Vai Thr Ala Ser 99 CAA AAA ACA GGT GGG GAA TTC ACA TGT GTT ACT GCA TCG 336 Ala Phe Phe Asp Leu Lys Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly 115 GCC TTC TTT GAC CTG AAA AAT TTG AAG GGA TGG TCA GGT 384 Phe Glu Ala Ser Ser Gly Arg Vai Vai Gly Arg val Lys 131 TTT GAG GCT TCT AGT GGC AGG GTG GTC GGC AGA GTT AAA 432 Asn Glu Glu Ser Lys Pro Thr Lys Leu Met Ser Gly Ile 147 AAT GAG GAA ICC AAG CCC ACA AAA TTA ATG AGT GGT ATC 480 Lys Ser Thr Ala Asp Leu Thr GlU Met Vai Lys Lys 163 TCA AAA AGC ACA GCC GAT TTA ACA GAG ATG GTC AAG AAG 528 Met Asn Arg Gly Asp Phe Lys Gin Ile Thr Levl Ala Thr 179 ATG AAC AGG GGA GAC TTT AAG CAG ATA ACC CTT GCA ACA 576 Lys AAA Thr Thr Glu Leu- Pro Lys Ala Vai Ile Glu Glu Ile 195 ACT ACA GAA CTC CCA AAG GCA GTG ATA GAG GAG ATA 624

TCT AGA < < Xbe-I Glu Thr Gly GAA ACC GGA His Vai Thr CAT GTG ACC Thr Ar» Vai ACA AGA GTG Tyr Gly Vai XAT GGT GTC Vai Leu Asn GTA TTA AAT Vai His Leu GTA CAC CTC Gly Thr Pro GGA ACT CCA Leu Pro Ile CTA CCC ATA Vai Gly Lys GTA GGA AAG Gin Thr Vai CAA ACC GTC Ile Thr Sér ATA ACC AGC Gly Ala Gly GGG GCA GGA - 18- Gly Arg His Lys Arg Val Leu Val Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala Ala 211 GGA AGA CAC AAG CGG GTG CTA GTG CTT ATA CCA TTG AGA GCA GCA GCT 672 Glu Ser Vai Tyr Gin Tyr Met Arg Leu Lys His Pro Ser Ile Ser Phe 227 GAG TCA GTC TAT CAA TAC ATG AGA TTG AAA CAT CCC AGT ATC TCC TTC 720 Asn Leu Arg Ile Gly Asp Met Lys Glu Gly Asp Met Ala Thr Gly Ile 243 AAC TTA AGA ATA GGG GAC ATG AAA GAA GGG GAC ATG GCA ACT GGG ATC 768 Thr Tyr Ala Ser Tyr Gly Tyr Phe Cys Gin Met Pro Gin Pro Lys Leu 259 ACC TAC GCC TCA TAT GGA TAT TTT TGC CAA ATG CCG CAG CCG AAG CTC 816 Arg Ala Ala Met Val Glu Tyr Ser Tyr Ile Phe Leu Asp Glu Tyr His 275 AGG GCC GCA ATG GTA GAG TAT TCA TAC ATA TTT CTG GAT GAG TAT CAC 864 Cy s Ala Thr Pro Glu Gin Leu Ala Val Ile Gly Lys Ile His Arg Phe 291 TGT GCT ACT CCT GAG CAG TTG GCT GTC ATA GGA AAA ATT CAC AGA TTT 912 Ser Glu Ser Ile Arg Val Val Ala Met Thr Ala Thr Pro Ala Gly Ser 307 TCT GAA AGC ATA AGG GTG GTT GCT ATG ACC GCC ACC CCA GCA GGG TCA 960 Vai Thr Thr Thr Gly Gin Lys His Pro Ile Glu Glu Phe Ile Ala Pro 323 GTA ACT ACA ACA GGG CAA AAA CAC CCA ATA GAA GAA TTC ATA GCT CCT 1008 Glu Vai Met Lys Gly Glu Asp Leu Gly Ser Gin Phe Leu Asp Ile Ala 339 GAG GTG ATG AAA GGG GAA GAC CTT GGA AGC CAG TTC CTT GAC ΛΤΑ GCG 1056 Gly Leu Lys Ile Pro Val Glu Glu Met Lys Gly Asn Met Leu Val Phe 355 GGG CTA AAA ATC CCG GTT GAG GAG ATG AAG GGT AAC ATG CTG GTC TTC 1104 Vai Pro Thr Arg Asn Met Ala Val Asp Val Ala Lys Lys Leu Lys Ala 371 GTA CCC ACA AGA AAC ATG GCA GTT GAT GTA GCC AAG AAA CTA AAA GCC 1152 Lys Gly Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Glu Asp Pro Ala Asn 387 AAG GGC TAC AAC TCA GGG TAT TAC TAC AGT GGG GAA GAC CCG GCT AAC 1200 Leu Arg Val Val Thr Ser Gin Ser Pro Tyr Val Val val Ala Thr Asn 403 TTG AGG GTG GTA ACA TCA CAG TCC CCA TAC GTC GTA GTA GCC ACC ΛΑΤ 1248 Ala Ile Glu Ser Gly Val Thr Leu Pro Asp Leu Asp Thr Val Val Asp 419 GCC ATT GAG TCA GGG GTA ACG CTG CCA GAT TTA GAT ACA GTT GTT GAC 1296 Thr Gly Leu Lys Cys Glu Lys Arg Val Arg Val Ser Ser Lys Ile Pro 435 ACA GGT CTG AAG TGT GAA AAG AGG GTG AGG GTG TCA TCA AAA ATA CCT 1344 Phe Ile Val Thr Gly Leu Lys Arg Met Ala Val Thr Val Gly Glu Gin 451 TTC ATA GTA ACA GGC CIT AAA AGA ATG GCT GTC ACT GTG GGC GAA CAG 1392 Ala Gin Arg Arg Gly Arg Val Gly Arg Val Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr 467 GCT CAG CGA AGA GGC AGG GTA GGT AGA GTG AAG CCC GGT AGG TAC TAT 1440 Arg Ser Gin Glu Thr Ala Thr Gly Ser Lys Asp Tyr His Tyr Asp Leu 483 AGA AGC CAG GAA ACA GCG ACC GGG TCA AAG GAC TAC CAC TAT GAC CTG 1488 Leu Gin Ala His Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Gly Ile Asn Val Thr Lys 499 TTA CAG GCA CAC AGG TAT GGG ATA GAA GAT GGA ATC AAC GTG ACA AAG 1536

I

- 19-

Ser Phe Arg Glu Met Asn Tyr Asp Trp Ser Leu Tyr Glu Glu Asp Ser 515 TCC TTT AGG GAA ATG AAT TAC GAT TGG AGC CTG TAC GAG GAG GAC AGC 1584 Leu Leu Ile Thr Gin Leu Glu Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Ser Glu 531 TTG CTG ATA ACG CAG CTG GAG ATA CTG AAC AAT CTA CTC ATC TCT GAA 1632 Asp Leu Pro Ala Ala Vai Lys Asn Ile Met Ala Arg Thr Asp His Pro 547 GAC CTA CCA GCA GCA GTA AAA AAC ATC ATG GCA AGG ACT GAT CAC CCA 1600 Glu Pro Ile Gin Leu Ala Tyr Asn Ser Tyr Glu Vai Gin Vai Pro Vai 563 GAA CCA ATC CAG CTT GCA TAC AAC AGT TAT GAG GTC CAG GTC CCT GTA 1728 Leu Phe Pro Lys· • Ile Arg Asn Gly Glu Vai Thr Asp Thr Tyr Glu Asn 579 CTG TTT CCA AAA ATA AGG AAT GGG GAG GTT ACA GAT ACT TAC GAG AAC 1776 Tyr Ser Phe Leu Asn Ala Arg Lys Leu Gly Glu Asp Vai Pro Vai Tyr 595 TAC TCA TTC CTA AAT GCA AGA AAA CTA GGG GAA GAT GTA CCT GTG TAC 1824 Ile Tyr Ala Thr Glu Asp Glu Asp Leu Ala Vai Asp Leu Leu Gly Leu 611 ATT TAT GCC ACC GAA GAT GAA GAC CTG GCA GTA GAC CTT CTA GGC TTG 1872 Asp Trp Pro Asp Pro Gly Asn Gin Gin Vai Vai Glu Thr Gly Lys Ala 627 GAC TGG CCC GAC CCA GGG AAC CAG CAA GTA GTG GAG ACT GGG AAA GCA 1920 Leu Lys Gin Vai Vai Gly Leu Ser Ser Ala Glu Asn Ala Leu Leu Ile 643 CTG AAG CAA GTG GTA GGA CTG TCC TCT GCT GAG AAT GCC CTG CTC ATA 1968 Ala Leu Phe Gly Tyr Vai Gly Tyr Gin Ala Leu Ser Lys Arg His Vai 659 GCC CTG TTT GGG TAT GTA GGA TAT CAA GCT TTG TCA AAA AGA CAC GTC 2016 Pro Met Ile Thr Asp Ile Tyr Thr Ile Glu Asp Gin Arg Leu Glu Asp 675 CCA ATG ATC ACA GAC ATA TAC ACC ATA GAA GAT CAA AGA CTA GAG GAC 2064 Thr Thr His Leu Gin Tyr Ala Pro Asn Ala Ile Arg Thr Glu Gly Lys 691 ACA ACC CAC CTC CAA TAT GCA CCT AAT GCT ATA AGA ACT GAG GGG AAG 2112 Glu Thr Glu Leu Lys GlU Leu Ala Vai Gly Asp Met Asp Arg Ile Met 707 GAG ACT GAA CTA AAG GAA TTA GCA GTG GGT GAC ATG GAC AGA ATC ATG 2160 GlU Ser Ile Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Gly Leu Thr Phe Ile Arg Ser 723 GAA TCC ATC TCA GAT TAT GCA TCA GGA GGG TTG ACA TTC ATA AGA TCT 2208 STOP Gin Ala Glu Lys Vai Arg * * * 726 CAG GCA GAG AAA GTA CGC TAG C£2_ .aic 2236 θα,ηι Hl -20- SEQ ID NO. 2 TIPO DE SEQUÊNCIA : sequência nucleotídica COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 240 pares de bases NÚMERO DE BOCADINHOS : simples CONFIGURAÇÃO: linear TIPO DE MOLÉCULA : ADNc para ARN genómico ORIGEM : BVD Osloss REGIÃO TRADUZIDA : 1 - 240 PROPRIEDADES : código para uma região de 80 ácidos aminados da p80, compreendendo epítopos reconhecidos por anticorpos monoclonais anti-p80.

Gly Tyr Gin Ala Leu Ser Lys Arg His Vai Pro Met Ile Thr Asp Ile • 16 GGA TAT CAA GCT TTG TCA AAA,AGA CAC GTC CCA ATG ATC ACA GAC ATA 48' Tyr Thr Ile Glu Asp Gin Arg Leu Glu Asp Thr Thr Hls Leu Gin Tyr 32 TAC ACC ATA GAA GAT CAA AGA CTA GAG GAC ACA ACC CAC CTC CAA TAT 96. Ala Pro Asn Ala Ile Arg Thr Glu Gly Lys Glu Thr Glu Leu Lys Glu 48 GCA CCT AAT GCT ATA AGA ACT GAG GGG AAG GAG ACT GAA CTA AAG GAA 144. Leu Ala Vai Gly Asp Met Asp Arg Ile Met Glu Ser lie Ser Asp Tyr 64 TTA GCA GTG GGT GAC ATG GAC AGA ATC ATG GAA TCC ATC TCA GAT TAT 191 Ala Ser Gly Gly Leu Thr Phe Ile Arg Ser Gin Ala Glu Lys Vai Arg 80, GCA TCA GGA GGG TTG ACA TTC ATA AGA TCT CAG GCA GAG AAA GTA AGA Z4cf

Lisboa, 31 de Maio de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção da infecção de uma colheita de sangue por um vírus da diarreia bovina (BVD), compreendendo um primeiro teste para a detecção dos anticorpos anti-BVD e um segundo teste para a detecção das partículas virais, caracterizado pelo facto de se detectarem os anticorpos anti-p80 com o auxilio de um antigénio recombinante compreendendo a proteína p80 do vírus BVD produzida em hospedeiro eucariota e de se detectar a presença de partículas virais com o auxílio de anticorpos dirigidos contra a proteína p80 do vírus BVD, para a detecção das virémias persistentes e das infecções agudas por qualquer uma das estirpes de BVD.
2. 2. Processo de detecção dos anticorpos anti-BVD numa colheita de sangue, caracterizado pelo facto de se detectarem os anticorpos anti-p80 com o auxílio de um antigénio recombinante compreendendo a proteína p80 do vírus BVD produzida em hospedeiro eucariota.
3. 3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto da proteína p80 recombinante ser codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID N° 1 ou uma sequência equivalente.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto do antigénio p80 recombinante provir de culturas celulares animais transfectadas por um vector conveniente exprimindo a proteína p80.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto do antigénio p80 recombinante provir de culturas de células de insectos, tais como Spodoptera frugiperda.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto do antigénio p80 recombinante provir de culturas de células de mamíferos, tais como Hela, CHO ou BHK.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto do antigénio p80 recombinante provir de culturas de células de levedura, tais como Saccharomvces cerevisiae. transfectadas por um vector conveniente exprimindo a proteína p80.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto do antigénio p80 recombinante compreender extractos de células hospedeiras eucariotas transfectadas por um vector conveniente exprimindo a proteína p80.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto da proteína p80 ser obtida por expressão num vector virai ou eucariota.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto da proteína p80 ser expressa no sistema Baculovírus, tal como o baculovírus AcPNV.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de se detectarem os anticorpos anti-p80 em qualquer fracção de sangue, soro ou plasma.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto do antigénio p80 recombinante permitindo a detecção de anticorpos ser imobolizado sobre um suporte sólido.
13. 13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de se revelar a presença de anticorpos anti-p80 por um anti-soro anti-iGg bovinos acoplado a um revelador.
14. 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de se revelar a presença de anticorpos por um teste de competição, na presença de um anticorpo monoclonal anti-p80 acoplado a um revelador.
15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 14, caracterizado pelo facto de se detectar a presença de partículas virais no sangue completo, em bruto ou enriquecido em glóbulos brancos.
16. 16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 15, caracterizado pelo facto de se detectar a presença de partículas virais com o auxílio de um soro dirigido contra o antigénio p80 recombinante produzido em hospedeiro eucariota ou procarionte.
17. 17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 16, caracterizado pelo facto de, para a detecção das partículas virais, se utilizar uma mistura de três anticorpos monoclonais específicos da p80 virai
18. 18. Processo de acordo com o conjunto das reivindicações 16 e 17, caracterizado pelo facto de se efectuar um teste do tipo "sandwich" com a mistura de anticorpos monoclonais como captador e o soro como revelador.
19. 19. Polinucleótido da sequência referenciada SEQ ID N°: 1 e correspondendo à sequência de BVD Osloss que codifica a proteína não estrutural p80. -4-
20. 20. Proteína recombinante correspondendo à tradução da sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 19.
21. 21. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo facto de ser produzida em hospedeiro eucariota transfectado por um vector conveniente exprimindo a referida sequência nucleotídica.
22. 22. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo facto de ser produzida em células de insectos Sprodoptera frugiperda transfectadas por um vector Baculovírus, tal como o baculovírus AcNPV.
23. 23. Antigénio recombinante contendo a proteína recombinante de acordo com uma das reivindicações 20 a 22.
24. 24. Antigénio recombinante de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de compreender extractos de células hospedeiras transfectadas por um vector exprimindo a referida proteína recombinante. Lisboa, 31 de Maio de 2000

    JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA