KR100331176B1 - 재조합 단백질을 항원으로 이용한 소 바이러스성 설사증의진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 국내 소 사육농가에 호흡기질병 및 송아지 설사를 일으켜 심각한 피해를 주는 질병중의 하나인 소 바이러스성 설사증(BVD)에 대한 진단법에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 곤충세포에서 발현된 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질로 이루어진 재조합 단백질을 항원으로 이용하여, 간접결합효소면역 측정법으로 중화항체가를 검출하여 바이러스성 설사증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 진단방법은 수행시 특별한 시설 및 기술 없이도 신속하게 소 바이러스성 설사증 바이러스에 대한 항체를 검사할 수 있어 신속한 면역수준 검사에 의한 소 바이러스성 질병의 예방 및 방제대책 수립에 이용할 수 있고, 또한 백신접종 후 면역수준 또는 감염 실태 파악에 필요한 대량의 검사혈청을 단시간내에 처리할 수 있는 방법으로 소 바이러스성 설사증 바이러스에 의한 호흡기병 예방 및 근절에 크게 기여할 것이다.
Description
본 발명은 소 바이러스성 설사증 바이러스(Bovine viral diarrhea virus; 이하, BVDV라 함) gp53 재조합 단백질를 이용한 소 바이러스 설사증(Bovine viral diarrhea; 이하, BVD라 함)의 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 BVDV의 중화하는 항체를 유발하는 단백질로 알려져 있는 구조 단백질인 gp53을 유전자 재조합시켜 이를 항원으로 이용하여 간접결합효소면역 측정법 (Indirect sandwitch enzyme linked immunosorbent assay : IS-ELISA)으로 BVDV에 대한 중화항체가를 검출하여 소 바이러스 설사증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
소 바이러스성 설사증 바이러스는 전 세계적으로 산재된 소 바이러스성 설사병의 원인체로서, 설사에 의한 급성폐사 이외에도 임신우의 유산 또는 사산, 호흡 장애, 백혈병과 유사한 증상 등을 일으키고 있다. 또한, 국내 소 사육농가에 호흡기 질병 및 송아지 설사를 일으켜 심각한 피해를 주는 질병으로서 사육농가에 엄청난 경제적 피해를 끼치고 있다.
따라서, BVDV에 대한 예방 및 근절을 위하여 조직배양을 이용한 혈청중화시험법(Serum Neutralization test : SN)으로 BVDV에 대한 중화항체를 검사하고 있다. 그러나, SN법은 조직배양을 해야하는 번거로움과 검사기간이 3 내지 4일 정도 소요되는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 조직배양 기술없이 단시간내 수행가능하고 특이성 및 민감성이 높은 진단법으로 알려진 간접결합효소면역측정법으로 BVDV에 대한 항체가를 측정할 수 있는 지에 대하여 연구한 결과, BVDV의 구조 단백질인 gp53이 BVDV에 대하여 중화항체를 유발한다는 사실로부터, gp53 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 곤충세포에 이를 형질감염시켜 재조합 단백질을 얻은 다음 이 재조합 단백질을 항원으로 이용한다면, BVDV의 중화항체를 신속하게 검출할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 특별한 시설 및 기술없이 신속하게 소 바이러스성 설사증 바이러스에 대한 중화 항체를 검사하여, 소 바이러스성 설사증 바이러스에 대한 감염을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 소 설사증 바이러스 gp53 발현 벡터 제작 모식도이다.
도 2은 배큘로바이러스를 이용하여 발현한 재조합 gp53 단백질을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
레인 1 : 단백질 분자량 크기 마커(고)
레인 2 : BVDV gp53 배큘로바이러스 재조합
레인 3 : 야생형 배큘로바이러스(ACNPV)
레인 4 : BVDV 감염된 MDBK 세포
레인 5 : 단백질 분자량 크기 마커(저)
도 3는 도트 블로팅으로 재조합 gp53 단백질을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 중화항체가 측정방법과 종래기술에 따른 중화항체가 측정방법의 상관관계 비교도이다
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 진단방법은 곤충세포에서 발현된 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질로 이루어진 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 간접결합효소면역측정법으로 소 바이러스성 설사증 바이러스에 대한 중화항체를 측정함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
1. 소 바이러스성 설사증 바이러스 RNA 추출
소 바이러스성 설사증 바이러스 NADL주(ATCC VR-534)를 MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney; ATCC CCL22) 세포주에 접종한 후, 계대배양하였다. 세포배양액은 α-MEM(Minimal Essential Medium, GibcoBRL)을 사용하였다. 즉, BVDV NADL주 (ATCC VR-534)를 NDBK(ATCC CCL22) 세포주에 접종한 후, 세포병원성 효과 (cytopathic effect; CPE)가 80 내지 90% 관찰될 때 세포 및 상층액을 수확하고, 바이러스 감염세포와 상층액으로부터 UltraspecII RNA isolatio kit(Biotecx, USA)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 추출하였다.
2. 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질 유전자 cDNA 합성, 클로닝 및 염기서열분석
소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질 유전자의 cDNA의 합성은 상기 1에서 추출한 전체 RNA와 Collett et al(1988, Virology 165, 191-199)이 보고한 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 유전자의 염기서열을 참고하고, BamHI 사이트 및 전이정지코돈(stop codon)을 함유하는 프라이머 B55SECR(5'-CGGGATCC-TCACTCAGCGAAGTAATCCCGGTG-3') 및 역전사효소(reverse transcriptase; RTase : superscript GibcoBRL)를 사용하여 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 첫번째 가닥 cDNA를 BamHI 사이트를 포함하는 프라이머 B55SECF(5'-CGGGATCC-CACTTGGATTGCAAACCTGAATTC-3')과 B55SECR를 사용하여 95℃에서 3분간 열처리 한 후 94℃ 1분, 45℃ 2분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여 Thermocycler(pharmacia)에서 25사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA 합성을 실시하였다. 반응이 끝난 PCT 증폭산물을 pGEM-T(Promega) 플라스미드에 클로닝하여 'pBGP53'을 작성하고, 자동염기서열 분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 분석하였다(서열번호 1 참조)
3. 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 유전자 발현 벡터 작성
소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질 유전자 발현벡터인 pACGP53을 제작하는 방법은 도 1과 같다. 즉, 상기 2의 pBGP53 벡터를 BamHI로 처리하여 1029bp의 DNA 단편을 추출한다. 그 다음, 배큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter) 및 gp67 시그널 시퀀스를 가진 pACGP67B 벡터(Pharmingen, USA)를 BamHI으로 처리하고, 상기 DNA를 삽입하여 발현벡터 pACGP53을 작성하였다.
4. 공동형질감염(Cotransfection) 및 플라크 정제
재조합 배큘로바이러스 BacACGP53을 Pharmingen(USA)사의 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 작성하였다. 즉, 상기 3에서 작성한 pACGP53 벡터 5㎍과 배큘로바이러스 선형화 DNA 0.5㎍을 100㎕의 무혈청 Grace's 배지 및 100㎕의 리포펙틴 (0.1㎎/㎖, Gibco) 용액과 혼합하여 공동형질감염 혼합물(cotransfection mixture)를 제조하고 실온에서 20분간 방치하였다.
그 다음, 10% Fetal calf serum(FSC)과 Antibiotic-antimycotic(Gibo, 100×)이 첨가된 무혈청 Grace's 배지에서 28℃의 온도조건하에서 배양된 Sf9 세포(Invitrogen사; 3×106세포)를 60mm 페트리디쉬에 첨가한 후, 배지를 제거하고, 상기에서 제조한 공동형질감염 혼합물을 첨가하여 28℃에서 6 내지 12시간 동안 배양하였다. 공동형질감염 혼합물에 5% FCS를 함유하는 새 Grace's 배지를 2 내지 3㎖ 가하여 27℃에서 4 내지 6일간 배양하면서 세포병원성 작용(CPE) 출현 여부를 관찰하였다. 형질감염 배양상층액에서 재조합 바이러스를 분리하기 위하여 플라크 정제(plaque purification)를 다음과 같이 실시하였다.
2×106개의 Sf9 세포(Invitrogen 사)를 직경 60㎜ 조직배양 페트리디쉬에 단층으로 도포한 후, 형질감염 상층액 100㎕를 접종하였으며, 28℃에서 90분간 감작한 후, 1.5% 저융점 아가로스가 포함된 Grace's 배지를 그 위에 층을 이루도록 도포(overlayer)하여 3 내지 4일간 28℃에서 배양하여 나타난 단일 플라크를 취하였다. 선발된 바이러스는 연속 2 내지 3회 플라크 정제를 실시하여 유전자 재조합 배큘로바이러스 BacACGP53을 선발하였다.
5. 도트 블로팅 분석
재조합 바이러스를 확인하기 위하여 면역효소법을 이용하였다. 즉, 상기 4에서 선발된 재조합 배큘로바이러스 BacACGP53을 접종한 Sf9 세포(Invitrogen 사) 및 정상 Sf9 세포에 1% NP 40 용해 완충액(1% NP 40, 10mM Tris-Hcl pH 7.4, 150mM NaCl)를 4 부피 첨가하고, 얼음에서 30분동안 정치한 후 12,000×g으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 2 계단희석하여 나이트로셀룰로스 페이퍼(nitrocellulose paper)에 음압을 이용하여 도트-블로팅하였다. 이를 항-gp53 단클론성 항체 및 항-BVDV 다클론성 항체를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척한 후, 다시 항-쥐 IgG HRP(KPL) 및 항-소 IgG HRP(KPL)로 40분동안 반응시키고, 세척한 후 디아미노벤지딘(diaminobenzidin;DAB, Pierce)으로 발색하였다. 결과는 도 2와 같다.
6. 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석
6 웰 플레이트에 2x106cells/well이 되게 Sf9 세포를 배양하고, 재조합 및 야생형 배큘로바이러스(AcNPV, Pharmigen사)를 10 m.o.i(multiplicity of infection)되게 1시간 접종한 후 접종액을 제거하였다. 이어서 2㎖의 5% FCS함유 Grace's 배지를 첨가하고 28℃에서 72시간 배양한 후, Sf9 세포를 수확하고 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음 용해 완충액(0.5% TritonX-100, 150mM NaCl, 50mMTris-HCl, pH 7.5)을 200㎕ 첨가하고, 얼음에서 10분간 정치한 후, 12,000×g에서 5분간 원심분리한 상층액을 -20℃에 보관하면서 웨스턴 블로팅 시료로 공시하였다. 시료 완충액(10%-메르캅토에탄올, 10% SDS, 25% 글리세롤, 10mM Tris-Hcl pH 6.8)을 시료의 1/4 부피가 되게 첨가하고 5분 동안 끓인 다음, 12000×g에서 5분 동안 원심분리하고, Lammli 등의 방법으로 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전개한 후, 면역염색을 실시하였다. 면역염색은 먼저 gp53에 대한 단클론성 항체를 반응시키고 세척한 후, 항-쥐 HRP 콘쥬게이터를 반응시키고 세척한 다음 디아미노벤지딘(DAB, Pierce)으로 발색시켰다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3으로부터 재조합 배큘로바이러스는 분자량이 약 63kDa단백질임을 알 수 있다.
7. 재조합 gp53 단백질을 이용한 간접효소면역측정법(IS-ELISA)
재조합 배큘로바이러스 BacACGP53을 사용하여 간접결합효소면역 측정법으로 소 바이러스성 설사증 바이러스의 중화항체를 검출하는 방법은 다음과 같다.
(1)항 gp53 단클론항체(대한민국 국립수의과학 검역원 바이러스과) 복수액(ascite)를 흡착용 코팅 완충용액(증류수 200㎖에 Na2CO30.376g, NaHCO30.542g, NaCl 1.462g을 녹인 용액; pH 9.6; 2주간 냉장 보관하고, 2주 경과시 다시 만들어 사용한다)을 사용하여 최적농도인 500배로 희석하여 면역분석용 플레이트에 100㎕씩 분주한 후 4℃에서 밤새 보전하여 항체를 흡착하였다
(2) 흡착이 끝난 후, 항체를 플레이트에서 버린 후, ELISA 세척용액(100㎖ PBS에 Tween 20[BioRad] 100㎕를 녹인 용액 : PBS-T)으로 1회 세척한 후,스킴밀크(Difco) 3g을 PBST 100㎖에 용해시킨 차단완충용액(Blocking buffer solution)을 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 37℃에서 2시간 동안 차단하였다.
(3) 상기 4에서 정제한 재조합 배큘로바이러스 BacACGP53 단백질을 1.5% 차단완충용액(100㎖ PBS에 1.5g 스킴밀크를 녹인 용액)을 사용하여 최적 희석농도인 200배로 희석하여, 면역분석용 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 37℃에서 2시간 동안 흡착시켰다.
(4) 소 바이러스성 설사증 바이러스 중화항체 측정은 가검 동물에서 채취된 혈액에서 혈청을 분리한 다음, 이를 1.5% 차단완충용액을 사용하여 다른 희석용 플레이트에서 최적 혈청희석배수인 20배로 희석하였다.
(5)항원인 부착된 플레이트의 차단반응이 끝나면, 차단용액을 버리고, 상기한 농도로 희석된 가검 혈청을 100㎕씩 분주한다.
(6) 혈청이 분주된 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, ELISA 세척용액(PBS-T)으로 각각의 세척을 약 5분씩하여 3회 이상 실시한다.
(7) 세척된 플레이트에 항 소 콘쥬게이트인 항-소 IgG HRP(Jackson 사)를 1.5g 스킴 밀크를 PBS 100㎖에 용해시킨 1.5% 차단완충용액을 사용하여 최적의 희석농도인 500배로 희석한 후, 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
(8) 반응 후 플레이트를 ELISA 세척용액으로 3회 이상 세척한 후 발색제로 ABTS(Kp1사)를 첨가하여 발색시킨 후, 1% 소디움도데실설페이트(SDS : Sigma)을 첨가하여 정지시켰다.
(9) 발색이 정지된 플레이트내 반응을 ELISA reader를 이용하여 405nm에서흡광도를 측정하여 결과를 판정하였다.
결과를 판정하기 위하여, 표준 양성 및 음성 혈청 2개를 선정하여 대조군으로 가검혈청과 동일한 플레이트에서 IS-ELISA를 수행하고, 판독된 가검혈청의 흡광도를 공식(S/P ratio = [가검혈청흡광도-표준음성 흡광도]/[표준양성흡광도-표준음성 흡광도])에 대입하여 S/P ratio를 구하고, 구한 값이 0.14 이상이면 양성, 0.14미만이면 음성으로 판정한다. 가검혈청의 중화항체가의 산정은 가검혈청의 흡광도를 도 4에서 유추한 직선회귀공식 (Y=0.462+4.028 x X)의 X값에 대입하여 계산된 Y값을 2의 지수로하여 항체가(희석배수)를 결정한다.
8.검출 효율 비교
현재 소 바이러스성 설사증 중화항체검사에 사용되고 있는 혈청중화시험법(SN)과 본 발명에 따른 방법으로 소 바이러스성 설사증 바이러스의 항체가를 측정하고, 이들 사이의 상관관계를 도 4에 나타내었다
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 소 바이러스성 설사증 바이러스 중화항체를 검출하는 방법과 SN법이 0.80 정도의 상관성을 나타내므로, 본 발명에 따른 소 바이러스성 설사증 중화항체 검출법의 유효성을 확인할 수 있다.
이상의 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 유전자 재조합 방법으로 대량생산된 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질을 이용하여 간접결합 효소면역학적 측정법으로 소 바이러스성 설사증 바이러스에 대한 항체를 신속하고 정확하게 검출하므로써 소 바이러스성 설사증의 예방하고 조기에 근절시킬 수 있다.
Claims (3)
- 곤충세포에서 발현된 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질로 이루어진 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 간접결합효소면역 측정법으로 소 바이러스성 설사증 바이러스에 대한 중화항체를 검출하는 것을 특징으로 하는 소 바이러스 설사증의 진단방법.
- 제 1항에 있어서, 재조합 단백질은 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질을 발현하는 벡터를 가지고, 형질감염된 곤충세포로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 1의 소 바이러스성 설사증 바이러스 gp53 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터임을 특징으로 하는 방법.
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| KR960705944A (ko) * | 1993-11-05 | 1996-11-08 | 로렌스 티. 웰츠 | 소 바이러스성 설사 바이러스(bvdv) 항원을 갖는 바이러스 벡터(viral vector with bovine viral diarrhea virus(bvdv)antigens) |
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-
1999
- 1999-12-15 KR KR1019990057805A patent/KR100331176B1/ko active IP Right Grant
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