PT2575467T

PT2575467T - Compostos macrocíclicos úteis como inibidores de histona desacetilases

Info

Publication number: PT2575467T
Application number: PT117874628T
Authority: PT
Inventors: Liu Xuedong; j phillips Andrew; Ungermannova Dana; G Nasveschuk Christopher; Zhang Gan
Original assignee: Univ Colorado Regents
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2016-10-14
Also published as: US20130203681A1; CN102946732B; AU2011258110B2; AU2011258110A1; BR112012030193A2; HK1181613A1; BR112012030193B1; RU2012157293A; US20150010541A1; KR20130123301A; CA2800958C; US9422340B2; US8754050B2; KR102028850B1; LT2575467T; HUE030812T2; JP2013528182A; EP2575467A1; ES2594500T3; DK2575467T3

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSTOS MACROCÍCLICOS ÚTEIS COMO INIBIDORES DE HISTONA DESACETILASES"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A divulgação presente diz respeito geralmente a uma série de novos compostos macrociclicos depsipeptidicos, possuindo propriedades de inibição da histona desacetilase (HDAC). Em especial, a divulgação presente descreve compostos que são adequados para utilização para reter de modo selectivo o crescimento celular, induzindo a diferenciação terminal e/ou iniciando a apoptose de células neoplásicas inibindo desse modo a sua proliferação. A divulgação descreve métodos de preparação destes novos compostos macrociclicos, composições e métodos de tratamento que compreendem a inibição selectiva de isoformas de HDAC, resultando em terapias especificas para o cancro. Os compostos da invenção podem igualmente ser úteis no tratamento de doenças accionadas por desregulação de HDAC, tais como doenças inflamatórias, doenças auto-imunes, doenças alérgicas e várias doenças do sistema nervoso central.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 Largazol, um depsipéptido ciclico isolado originalmente a partir de uma cianobactéria marinha, Symploca sp., tem demonstrado ser um agente anti-tumoral (Taori et al. 2008). O Largazol visa especificamente as histona desacetilases cuja disfunção está muitas vezes associada a uma variedade de tumores humanos. O Largazol tem demonstrado: (i) exibir valores de GI50 em nM em relação a uma variedade de linhas celulares (por exemplo, células de carcinoma mamário MDA-MB-231, GI50 = 7,7 nM; células de osteossarcoma fibroblásticas U20S, GIso= 55 nm; células do cólon HT29, GIso= 12 nM; células de neuroblastoma IMR-32 (Taori et al. 2008), GIso= 16 nM) (Taori et al. 2008), (ii) apresentar actividade diferencial para células transformadas e não transformadas (Nasveschuk et al. 2008; Taori et al. 2008;. Ungermannova 2010) e (iii) é estruturalmente mais simples e possivelmente mais fácil de obter sinteticamente que outros depsipéptidos.

Embora, a molécula de largazol seja um comprovado agente anti-tumoral, existe sempre uma necessidade de análogos estruturais melhorados que conduzam a propriedades de inibição de HDAC, toxicidade e perfis fisico-quimicos melhorados, resultando em terapias melhoradas de cancro. Há vários anos que é do conhecimento geral que DMSO e butirato, dois conhecidos inibidores relativamente inespecificos da HDAC, podem induzir determinadas células de leucemia a diferenciarem-se e suprimir o crescimento neoplásico (Sato et al. 1971; Leder et al. 1975).

Em anos recentes, as HDACs e as histonas acetilases (HATs) tornaram-se amplamente reconhecidas como intervenientes chave na regulação da transcrição (Minucci e Pelicci 2006). A acetilação das lisinas na histona H3 e caudas das histonas H4 está fortemente correlacionada com estados de cromatina que estão prontos para a transcrição, ou que fazem parte de regiões genómicas activamente transcritas (Allfrey et al. 1964). A acetilação de histonas também tem sido correlacionada com outras funções celulares importantes incluindo a montagem da cromatina, reparação e recombinação do ADN.

Existem 18 enzimas HDAC no genoma humano que podem ser classificadas em quatro classes (Lane e Chabner 2009) . As classes I, II e IV, contêm todas um átomo de zinco (Zn2+) no seu local activo (Tabela 1 adaptada a partir de (Lane e Chabner 2009)).

Devido ao seu importante papel na regulação da transcrição e perturbações da sua regulação em células tumorais, foi postulado que a inibição de HDAC pode ser uma forma eficaz para a terapêutica do cancro. Consequentemente, verificou-se um desenvolvimento substancial de inibidores de enzimas HDAC (HDACi) como potenciais fármacos anticancerigenos (Marks). A relevância clinica desta atenção em relação a HDACi está garantida e foi recentemente sublinhada pela introdução de vorinostat (ZolinzaMR, Merck, também amplamente conhecido como SAHA = ácido hidroxâmico suberoilanilida) para o tratamento do linfoma cutâneo de células T, no final de 2006 e, mais recentemente, Romidepsina (FK228) (Marks). A actividade catalítica das HDAC contém caracte-rísticas de ambas as enzimas protease e metaloprotease de serina. Com base nas estruturas cristalinas de HDAC8 e de uma proteína bacteriana tipo histona desacetilase (HDLP) , foi proposto o mecanismo para a reacção de desacetilação (Finnin et al. 1999; Somoza et al. 2004; Vannini et al., 2004). Existe uma bolsa estreita e profunda tipo tubo, que se expande na parte inferior e numa cavidade interna que delimita a bolsa (Figura 1.1). O interior do tubo é composto por resíduos hidrófobos e aromáticos. O ião zinco está situado na parte inferior da bolsa e Zn2+ e His 142, actuando como uma base geral, activam a molécula de água para o ataque nucleofílico no grupo carbonilo do substrato. Isto resultaria num carbono tetraédrico que é estabilizado pela formação de uma ligação de hidrogénio com Tyr 306 e um ácido geral His 143 que protona o grupo lisina lábil, obtendo-se os produtos acetato e lisina. Tanto His 142 como His 143 cabem no sistema carga-retransmissão Asp 166-His 131, que está proposto como modulando a basicidade dos resíduos His (Figura 1.4) (Finnin et al., 1999). O modo de acção da maioria dos inibidores de HDAC é o de imitar as interacções do substrato com a desacetilase, evitando assim a entrada do resíduo de lisina acetilada localizado na cauda da proteína histona. Todos os inibidores da histona-desacetilase de moléculas pequenas partilham três elementos estruturais que contribuem para a inibição de HDAC: (1) um dominio de reconhecimento de superfície, que está ancorado na borda da bolsa tipo tubo da HDAC, (2) um sitio de ligação de zinco, (3) uma região ligante que liga o dominio de reconhecimento de superfície com o sítio de ligação de zinco (Finnin et al., 1999). A Figura 1.5 (forma adaptada (Newkirk et al. 2009)) mostra um modelo geral de farmacóforo de vários inibidores de HDAC conhecidos.

Ainda que a SAHA exerça a sua actividade anti-cancerígena, pelo menos em parte por modulação de HDAC de uma forma directa por coordenação do ião Zn2+ no sítio activo da enzima pelo ácido hidroxâmico terminal, apresenta fraca selectividade de entre as 3 classes de HDAC em parte devido à simplicidade da sua estrutura (Minucci e Pelicci 2006; Lane e Chabner 2009). Tem sido geralmente aceite que as HDACs de Classe I são mais relevantes para a terapia do cancro e que a baixa selectividade dos inibidores de HDAC é responsável pela toxicidade crónica (Minucci e Pelicci 2006; Lane e Chabner 2009). A procura de inibidores de HDAC de Classe I mais específicos levou à descoberta de uma série de produtos depsipéptidos naturais incluindo FR901375 (Koho 1991), FK228 (Ueda et al. 1994a), espirucostatina A (Masuoka et al., 2001), e o muito recentemente isolado largazol (Taori et al., 2008) (Figura 2). Estes produtos naturais conhecidos como depsipéptidos partilham uma característica comum, todos eles contendo uma cadeia lateral ácido (3 S,4E)-3-hidroxi-7-mercapto-4-heptenóico (Newkirk et ai. 2009). Um sulfidrilo livre (tiol) necessita de ser exposto nesta classe de compostos para desencadear a actividade inibidora de HDAC uma que o tiol se coordena com o ião positivo Zn2+ do local activo para impedir a catálise. A fracção ligante Zn2+ do largazol é inactiva a menos que o tioéster seja removido por hidrólise. Foi demonstrado que largazol-tiol é a espécie activa que inibe de forma potente as HDAC (Bowers et ai. 2008; Ying et ai. 2008b.). Em conformidade o largazol é muito provavelmente um pró-fármaco que fica activado por esterases/lipases após absorção em células ou conjugado com uma proteína veí-culo/transportadora e reduzido a tiol intracelularmente. Verificaram-se desenvolvimentos significativos na concepção de pró-fármacos para melhorar as propriedades físico-químicas e farmacocinéticas de compostos líder biologicamente potentes (Rautio et al. 2008). No entanto, estas estratégias não foram aplicadas de modo sistemático aa largazol.

SUMÁRIO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

Esta invenção diz respeito ao domínio da terapia do cancro. Em particular, a invenção presente descreve novos compostos macrocíclicos e composições farmacêuticas que os compreendem. Além disso, a invenção descreve um novo processo para preparar e utilizar estes compostos. Estes compostos macrocíclicos são inibidores de HDAC e são úteis como agentes anti-proliferação para a terapia do cancro. Os métodos aqui descritos identificaram compostos que possuem selectividade em se direcionarem para as HDAC na terapia anti-cancro. Estes compostos direccionam-se para as HDAC cuja disfunção está muitas vezes associada a uma variedade de tumores humanos (Marks e Breslow 2007) .

Num aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (I)

Ϊ em que "A" seja arilo ou heteroarilo, opcionalmente substituído com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; Z sej a - (CH2) nSRi2;

Ri e R2 sejam independentemente H, halo, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10,

ou Ri e R2 em conjunto, ou um de entre Ri, R2 com Rg, formem um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10 e heterocicloalquilo C3-C10 se encontram opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2PARA20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; R3 e R4 sejam, independentemente, H, halo, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou R3 e R4 em conjunto, ou um de entre R3, R4 com Rio formem um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10 e heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, NCOR20R22, “CONr2oR22, _S(O)mR20; R5 e R6 sejam, independentemente, H, halo, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou R5 e R.6 em conjunto, ou um de entre R5, R6 com Rn, formem um cicloalquilo C3-C10 , heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; R7 e Re sejam, independentemente, H, halo, alquilo C1-C10 , cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou R7 e R8 formem em conjunto um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3- Cio, heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20/ -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; R9 seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou em conjunto com um de Ri, R2 forme um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;

Rio seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou em conjunto com um de R3, R4 forme um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;

Rn seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10/ ou em conjunto com um de Rs, R6 forme um cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-C8, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, hete-rocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo Ci-Ce, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-C8, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; R12 seja independentemente H, alquilo C1-C10, -COR20, -CONR20R22, -OR20, -COOR20, -COCR20R22NR20R22, -SR20, -P(0) (OR24) 2; R20 e R22 sejam independentemente H, C1-C10 alquilo, C3-Ciocicloalquilo, C3-C10 heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo; R24 seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, Na, K ou Ca; n = 1-6; m = 1 ou 2; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Num outro aspecto, a invenção presente propor ciona compostos com a Fórmula (II)

I em que L e Q sejam independentemente, S, 0, N ou CR26 R26 seja independentemente H, halo, alquilo Ci-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo e heteroarilo se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -C00H, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR26R22, -CONR20R22;

Ri, R2, R3, R4, R5, Rô, R7, R8, R9, Rio, R11 θ Z são tal como descritos anteriormente; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (III)

m: em que G, Q e Y sejam, independentemente, S, 0, N ou CR26; R26 seja independentemente H, halo, alquilo Ci-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo e heteroarilo se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -C00H, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22;

Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rio, R11 e Z sejam tal como descritos anteriormente; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos de fórmula (IV)

IV ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (V)

V ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico .

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (VI)

VI ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (VII)

VI: ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (VIII)

vil

ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (IX)

IX ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona compostos com a Fórmula (X)

X

em que A, Ri, R2, R3, R4, Rs, R6, R7, Rs, R9, Rio,

Rn e n sejam tal como descritos anteriormente; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona composições farmacêuticas dos compostos ou sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico de um ou mais compostos descritos neste documento, com um suporte aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em ainda outro aspecto, a invenção presente proporciona métodos de tratamento de doenças mediadas por enzimas HDAC, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade da mesma de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos descritos neste documento. Outros métodos envolvem co-terapias, por administração de um ou mais compostos da invenção presente com outros agentes anti-cancerigenos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra um papel potencial de HAT e HDAC na regulação transcricional. A) modificação da histona por HAT e HDAC. B) a regulação da expressão de genes muda no complexo com co-activador ou com co-repressor. Figura e descrição adaptadas de (Kim et al., 2003). A Figura 2 apresenta várias formas de realização de complexos HDLP-TSA. A) Representação espacial da TSA na bolsa do sitio activo. 0 grupo ácido hidroxâmico, a maior parte da cadeia alifática e parte do grupo dimetilaminofenil de TSA estão ocultados (60% da área de superfície da TSA). B) Representação esquemática das interações HDLP-TSA. Ambos os painéis e descrição parcial foram adaptados de (Finnin et al., 1999). A Figura 3 apresenta um mecanismo de acção proposto das HDAC dependentes de zinco. A Figura 4 ilustra uma forma de realização de um farmacóforo HDACi. Região de cobertura na parte superior; ligante na parte inferior com a fracção ligante de zinco. Figura e descrição adaptados de (Newkirk et al. 2009). A Figura 5. Produtos depsipéptido naturais inibidores de HDAC. É apresentado o domínio chave contendo tiol. A Figura 6 ilustra uma activação possível de largazol e FK228 para levar a cabo a inibição de HDAC. O largazol é um pró-fármaco que após a hidrólise é convertido no correspondente tiol, o qual desactiva a HDAC retirando o zinco por quelação do sítio activo da enzima. De um modo similar, a redução da ligação dissulfureto em FK228 liberta tiol que inibe de forma potente as HDAC. A Figura 7 proporciona as estruturas de largazol, e vários análogos estruturais de largazol. 0 Exemplo 1 é igualmente indicado como CGN 552. A Figura 8 apresenta exemplos de dados mostrando que o largazol, os seus análogos seleccionados e SAHA promovem a hiperacetilação H3 na linha celular de cancro HCT 116. a) Largazol (L) e SAHA inibem a desacetilação H3 de um modo dependente do tempo. As células HCT116 foram tratadas com largazol 10 nM ou SAHA 200 nM nas alturas indicadas no painel. Os extractos celulares foram separados através de electroforese SDS-PAGE e as bandas resultantes foram detectados utilizando anticorpos anti-acetil-H3. As células tratadas com DMSO servem como controlo negativo, enquanto que a expressão de GAPDH foi usada para mostrar a carga igual, b) as células HCT116 respondem a largazol, a seus análogos selectivos e a SAHA de uma forma dependente da dose. As células foram tratadas com o composto indicado, durante 8 horas com concentrações que variam de 1 μΜ a 100 nM e imunotransferidas com anticorpo anti-acetilhistona H3. CGN-722, CGN-552 e CGN-596 são inibidores da desacetilase ligeiramente mais potentes do que o largazol (L) e SAHA. A conversão de tioéster em cetona, (CGN-363), torna o composto inactivo no que diz respeito à inibição de HDAC. A Figura 9 apresenta dados de microarranjos de ADN que mostram que SAHA, Largazol e seu análogo seleccionado exemplo 1 causam mudanças distintas nos perfis de expressão genética na linha celular de cancro HCT 116. a) agrupamento hierárquico e cartas térmicas das mudanças nos perfis de expressão genética nas células HCT116 com o tratamento indicado. b) Diagramas de Venn mostrando conjuntos únicos e partilhados de genes cujos niveis de expressão se alteraram mais do que 2 vezes após exposição ao tratamento indicado às 6 horas e 24 horas. A Tabela 1 apresenta a classificação de isoformas de HDAC. A Classe I consiste em HDAC 1, 2, 3 e 8. A Classe II consiste em HDAC 4, 5, 6, 7, 9, 10. A Tabela 2 apresenta exemplos de dados que mostram um efeito do largazol, análogos de largazol juntamente com exemplos de compostos da invenção presente, na inibição do crescimento de células cancerosas. A análise comparativa do efeito citotóxico de largazol em linhas celulares de cancro humano HCT-116, SW480 e MDA-MB231. Foram usados HME como controlo. Foram colocadas em placas 8000 células em placas de 96 poços em que as linhas 1 e 10 foram tratadas com DMSO, linha 2 não continha células para estabelecer os niveis de base, as linhas 3-9 continham concentrações decrescentes de composto. As células foram incubadas com largazol durante 48 horas, seguindo-se uma coloração com corante de violeta de cristal. A absorvância a 588 nm foi medida utilizando um leitor de placas Tecan Sail re II. Os ensaios foram realizados em réplicas de seis, e as curvas de concentração-resposta foram geradas por análise de regressão não linear de mínimos quadráticos dos dados utilizando GraphPad Prism (San Diego, CA) . A inibição de crescimento (GI50) para cada composto foi definida como a concentração de fármaco que conduz a uma redução de 50% na A588 em comparação com os controlos. A Tabela 3 apresenta um sumário do número de genes cujos níveis de expressão se alteraram para duas vezes mediante o tratamento com produtos químicos indicados, em comparação com DMSO. Foram gerados ficheiros com os valores de expressão para cada amostra usando o algoritmo Robust Multichip Average (RMA). A expressão diferencial foi determinada utilizando o pacote de programas R limma para gerar modelos lineares e estatística Bayesianos empíricos. Os genes foram considerados diferencialmente expressos, quando o valor de P, ajustado para múltiplos testes utilizando o método de Benjamini e Hochberg, foi ã5% e o log da alteração para duas vezes foi ãl ou ^-1.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

DEFINIÇÕES O termo "substituto para" tal como utilizado neste documento, refere-se à alteração da administração de um primeiro composto ou fármaco a um sujeito por um segundo composto ou fármaco ao sujeito. Por exemplo, um extracto de Kratom pode ser substituido por um composto adicional, de tal modo que será administrado ao sujeito o extracto de Kratom em lugar do composto aditivo. 0 termo "em risco de" tal como utilizado neste documento, refere-se a um estado clinico ou a um conjunto de estados clinicos apresentados por um doente, os quais podem predispor o doente para uma determinada doença ou patologia. Por exemplo, estas condições podem resultar de influências que incluem, mas não se encontram limitadas a, influências comportamentais, emocionais, quimicas, bioquímicas ou ambientais. 0 termo "quantidade eficaz" tal como utilizado neste documento, refere-se a uma determinada quantidade de uma composição farmacêutica compreendendo um agente terapêutico que atinge um resultado clinicamente benéfico (ou seja, por exemplo, uma redução dos sintomas). A toxicidade e eficácia terapêutica de tais composições pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). O rácio da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o indice terapêutico, e pode ser expresso como a relação de LD50/ ED50. São preferidos os compostos que apresentam indices terapêuticos amplos. Os dados obtidos a partir daqueles ensaios de culturas de células e estudos animais adicionais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para utilização humana. A dosagem de tais compostos situa-se preferencialmente dentro de uma gama de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem utilizada, da sensibilidade do doente, e da via de administração. 0 termo "sintoma", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer evidência subjectiva ou objectiva de doença ou perturbação fisica observada pelo doente. Por exemplo, a evidência subjectiva é normalmente baseada em auto-relato do doente e pode incluir, mas não estando limitada a dor, dor de cabeça, distúrbios visuais, náuseas e/ou vómitos. Em alternativa, a evidência objectiva é geralmente um resultado de teste médico, incluindo, mas não se limitando a, temperatura corporal, hemograma completo, painéis lipidicos, painéis da tiróide, pressão arterial, frequência cardiaca, electrocardiograma, exames de imagem de tecidos corporais e outros resultados de testes médicos. 0 termo "doença", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer deterioração do estado normal do animal vivo ou de uma das suas partes que interrompe ou modifica o desempenho das funções vitais. Manifestando-se normalmente por sinais e sintomas distintivos, geralmente é uma resposta a: i) factores ambientais (como a desnutrição, riscos industriais ou clima); ii) agentes infecciosos específicos (tal como vermes, bactérias ou vírus); iii) defeitos inerentes do organismo (tal como anomalias genéticas); e/ou iv) combinações destes factores.

Os termos "reduzir", "inibir", "atenuar", "suprimir", "diminuir", "evitar" e seus equivalentes gramaticais (incluindo "inferior", "inferior", etc.), quando em referência à expressão de qualquer sintoma num sujeito não tratado em relação a um sujeito tratado, significa que a quantidade e/ou magnitude dos sintomas no sujeito tratado é menor do que no sujeito não tratado em qualquer quantidade que seja reconhecida como clinicamente relevante por qualquer pessoal com formação médica. Numa forma de realização, a quantidade e/ou magnitude dos sintomas no sujeito tratado é pelo menos 10% inferior a, pelo menos 25% inferior a, pelo menos 50% inferior a, pelo menos 75% inferior a, e/ou pelo menos 90% inferior à quantidade e/ou magnitude dos sintomas no sujeito não tratado. O termo "composto inibidor", como utilizado neste documento, refere-se a qualquer composto capaz de interagir com (ou seja, por exemplo, fixação, ligação, etc.) um parceiro de ligação sob condições tais que o parceiro de ligação se torna insensível aos seus ligandos naturais. Compostos inibidores podem incluir, mas não se encontram limitados a pequenas moléculas orgânicas, anticorpos e proteínas/péptidos. 0 termo "ligado", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer interacção entre um meio (ou suporte) e um fármaco. A ligação pode ser reversível ou irreversível. Tais ligações incluem, mas não se encontram limitadas a ligação covalente, ligação iónica, forças ou fricção de Van der Waals, e outras similares. Um fármaco encontra-se ligado a um meio (ou suporte) se estiver impregnado, incorporado, revestido, em suspensão com, em solução com ou misturado com, etc. 0 termo "fármaco" ou "composto", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer substância farmacologicamente activa capaz de ser administrada que alcança um efeito pretendido. Os fármacos ou os compostos podem ser sintéticos ou de ocorrência natural, não- péptidos, proteínas ou péptidos, oligonucleótidos ou nucleótidos, polissacáridos ou açúcares. 0 termo "administrado" ou "administração", tal como utilizado neste documento, refere-se a um modo de proporcionar uma composição a um doente de tal forma que a composição possui o efeito pretendido sobre o doente. Um método exemplificativo de administração é através de um mecanismo directo, tais como, a administração em tecido local (ou seja, por exemplo, a colocação extravascular), ingestão oral, emplastro transdérmico, tópica, inalação, supositórios, etc. 0 termo "doente", tal como utilizado neste documento, é um ser humano ou animal e não necessita de ser hospitalizado. Por exemplo, doentes externos, pessoas em lares de idosos são "doentes". Um doente pode compreender qualquer idade de humano ou animal não humano e, por conseguinte, inclui tanto adultos como jovens (ou seja, crianças). Não se pretende que o termo "doente" seja conotado com uma necessidade de tratamento médico, portanto, um doente pode voluntária ou involuntariamente ser parte de experimentação quer clinica quer em apoio de estudos de ciência básica. 0 termo "sujeito" tal como utilizado neste documento refere-se a um vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um primata, ainda mais preferencialmente um ser humano. Os mamíferos incluem, sem limitação, seres humanos, primatas, animais selvagens, animais ferozes, animais de criação, animais de desporto e animais de estimação. 0 termo "afinidade", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer força de atracção entre substâncias ou partículas que faz com que entrem e permaneçam em combinação química. Por exemplo, um composto inibidor que possui uma elevada afinidade em relação a um receptor irá proporcionar uma maior eficácia na prevenção do receptor interagir com os seus ligandos naturais, que um inibidor com uma baixa afinidade. 0 termo "derivado de", tal como utilizado neste documento, refere-se à fonte de um composto ou sequência. Num aspecto, um composto ou uma sequência pode ser derivado de um organismo ou espécie em particular. Num outro aspecto, um composto ou uma sequência pode ser derivado a partir de um complexo ou sequência maiores. 0 termo "composto em teste", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer composto ou molécula considerado como candidato a composto inibidor. 0 termo "proteína", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer uma das numerosas substâncias extremamente complexas que ocorrem naturalmente (tal como uma enzima ou anticorpo), que consistem em resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas, contêm os elementos carbono, hidrogénio, azoto, oxigénio, normalmente enxofre. Em geral, uma proteína compreende aminoácidos com uma ordem de magnitude dentro das centenas. 0 termo "péptido", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer de várias amidas que são derivados de dois ou mais aminoácidos por combinação do grupo amino de um ácido com o grupo carboxilo do outro e são geralmente obtidos pela hidrólise parcial de proteínas. Em geral, um péptido compreende aminoácidos com uma ordem de magnitude das dezenas. 0 termo "aceitável do ponto de vista farmacêutico" ou "farmacologicamente aceitável", tal como utilizados neste documento, referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem reacções adversas, alérgicas, ou outras indesejáveis quando administradas a um animal ou a um ser humano. 0 termo "suporte aceitável do ponto de vista farmacêutico", tal como utilizado neste documento, inclui todos e quaisquer solventes, ou um meio de dispersão, incluindo, mas não estando limitado a água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol liquido, e similares) , suas misturas adequadas e óleos vegetais, revestimentos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, lipossomas, agentes de limpeza disponíveis comercialmente e similares. Podem também ser incorporados ingredientes bioactivos suplementares em tais suportes. 0 termo "purificado" ou "isolado", tal como utilizado neste documento, pode referir-se a uma composição de péptido que tenha sido submetida a tratamento (ou seja, por exemplo, fraccionamento) para remover vários outros componentes, e cuja composição retém de modo substancial a sua actividade biológica expressa. 0 termo "amostra", tal como utilizado neste documento é utilizado no seu sentido mais lato, e inclui amostras ambientais e biológicas. As amostras ambientais incluem o material do ambiente, tal como solo e água. As amostras biológicas podem ser de origem animal, incluindo, humanas, fluidas (por exemplo, sangue, plasma e soro), sólida (por exemplo, fezes), tecidos, alimentos liquidos (por exemplo, leite), e alimentos sólidos (por exemplo, legumes). Por exemplo, uma amostra pulmonar pode ser recolhida por lavagem broncoalveolar (BAL) e que compreende fluido e células derivadas de tecidos pulmonares. Uma amostra biológica pode compreender uma célula, extracto de tecido, fluido corporal, cromossomas ou elementos extracromossómicos isolados a partir de uma célula, DNA genómico (em solução ou ligado a um suporte sólido tal como para análise Southern blot), de ARN (em solução ou ligado a um suporte sólido tal como para análise de Northern blot), ADNc (em solução ou ligado a um suporte sólido) e similares. 0 termo "biologicamente activo" refere-se a qualquer molécula que possui funções estruturais, reguladoras ou bioquímicas. Por exemplo, a actividade biológica pode ser determinada, por exemplo, por restabelecimento do crescimento de tipo selvagem em células sem a actividade da proteína. As células sem actividade de proteína podem ser produzidas por vários métodos (ou seja, por exemplo, mutação pontual e mutação por mudança de estrutura). A complementação é conseguida por transfecção de células que carecem de actividade de proteína com um vector de expressão que expressa a proteína, um seu derivado, ou uma porção da mesma.

Os termos "marcador" ou "marcador detectável" são utilizado neste documentos, para referir qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquí-micos, bioquímicos, imunoquímicos, eléctricos, ópticos ou quimicos. Tais marcadores incluem biotina para coloração com conjugado de estreptavidina marcado, esferas magnéticas (por exemplo, Dynabeads®), corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceina, vermelho Texas, rodamina, proteína fluorescente verde e similares), marcadores radioactivos (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P) , enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e outros comummente utilizados num ELISA), e marcadores calorimé-tricos, tais como ouro coloidal ou vidro colorido ou grânulos de plástico (por exemplo, poliestireno, polipropi-leno, látex, etc.). As patentes que ensinam a utilização de tais marcadores incluem, mas não estão limitadas a, patentes U.S. Nos. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241. Os marcadores contemplados na invenção presente podem ser detectados por muitos métodos. Por exemplo, os marcadores radioactivos podem ser detectados utilizando contadores de cintilação ou película fotográfica, os marcadores fluorescentes podem ser detectados utilizando um fotodetector para detectar a luz emitida. Os marcadores enzimáticos são tipicamente detectados proporcionando um substracto à enzima e detectando, o produto de reacção produzido pela acção da enzima sobre o substrato, e os marcadores calorimétricos são detectados simplesmente visualizando o marcador colorido. 0 termo "conjugado", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer composto que tenha sido formado pela junção de duas ou mais fracções.

Uma "fracção" ou "grupo" é um qualquer tipo de arranjo molecular designado por fórmula, nome quimico, ou estrutura. Dentro do contexto de certas formas de realização, diz-se que um conjugado compreende uma ou mais fracções ou grupos químicos. Isto significa que a fórmula da fracção se encontra substituída em algum lugar de modo a esteja unida e seja uma parte do arranjo molecular do conjugado. Apesar das fracções poderem ser diretamente ligadas de forma covalente, não se pretende que a união de duas ou mais fracções deva ser directamente uma com a outra. Um grupo ligante, grupo de ligação cruzada, ou grupo de união refere-se a qualquer arranjo molecular que vai ligar as fracções através de ligações covalentes, tais como, mas não estando limitadas a um ou mais grupo (s) amida, podem juntar as fracções. Adicionalmente, embora o conjugado possa não estar substituído, o conjugado pode ter uma variedade de substituintes adicionais ligados aos grupos ligantes e/ou ligados às fracções.

Um "polímero" ou "grupo polímero" significa uma espécie ou grupo químico formado por fracções repetidamente ligadas. Dentro de determinadas formas de realização, é preferido que o número de fracções repetidas seja três ou mais, ou superior a 10. As fracções ligadas podem ser idênticas em estrutura ou podem ter uma variação de estrutura da fracção. Um "polímero monomérico" ou "homopolímero" é um polímero que contém a mesma subunidade assimétrica repetida. Um "copolímero" é um polímero que é derivado de dois ou mais tipos de espécies monoméricas, isto é, dois ou mais sub-unidades químicas assimétricas diferentes. "Copolímeros de bloco" são polímeros compostos por duas ou mais espécies de subunidades de polímero ligadas por ligações covalentes. 0 termo "substituído", tal como utilizado neste documento, significa que pelo menos um átomo de hidrogénio de um arranjo molecular é substituído por um substituinte. No caso de um substituinte oxo ("= 0"), são substituídos dois átomos de hidrogénio. Quando substituído, um ou mais dos grupos abaixo são "substituintes". Os substituintes incluem, mas não se encontram limitados a, halogéneo, hidroxilo, oxo, ciano, nitro, amino, alquilamino, dialquil-amino, alquilo, alcoxilo, alquiltio, haloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo e heterocicloalquilo, bem como, -NRaRb,-NRaC(=0)Rb, -NRa-C(=0)NRaNRb, -NRaC(=0)ORb, -NRaS02Rb, -C(=0)Ra, -C(=0)0Ra, -C (=0)NRaRb, -0C(=0)NRaRb, -OR, -SR, -SORo, -S(=0)aR, -0S(=0)2Ra e -S(=0)0Ra. Além disso, os substituintes supra podem ainda estar substituídos com um ou mais dos substituintes supra, de modo que o substituinte compreende alquilo substituído, arilo substituído, arilalquilo substituído, heterociclo substituído ou heterocicloalquilo substituído. Ra e Rb, neste contexto, podem ser iguais ou diferentes e, de modo independente, hidrogénio, alquilo, haloalquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, hetero-ciclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído. 0 termo "não substituído", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer composto que não contenha substituintes adicionais ligados ao composto. Um composto não substituído refere-se à composição química do composto, sem substituintes adicionais, por exemplo, o composto não contém grupo(s) protector(es). Por exemplo, a prolina não substituída é um aminoácido prolina, apesar do grupo amino de prolina poder ser considerado como di-substituído com grupos alquilo. 0 termo "alquilo", tal como utilizado neste documento, significa qualquer hidrocarboneto alifático de cadeia linear ou ramificada, cíclico ou não cíclico, insaturado ou saturado contendo de 1 a 10 átomos de carbono saturada, enquanto que o termo "alquilo inferior" tem o mesmo significado que alquilo mas contém de 1 a 6 átomos de carbono. O termo "alquilo superior" tem o mesmo significado que alquilo mas contém de 2 a 10 átomos de carbono. Alquilos saturados de cadeia linear representativos incluem, mas não se encontram limitados a metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo e similares; enquanto que alquilos ramificados saturados incluem, mas não se encontram limitados a isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo e similares. Os alquilos cíclicos podem ser obtidos por junção de dois grupos alquilo ligados ao mesmo átomo ou juntando-se dois grupos alquilo cada um ligado a átomos adjacentes. Alquilos cíclicos saturados representativos incluem, mas não se encontram limitados a ciclopropilo ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo e similares; enquanto que alquilos cíclicos insaturados incluem, mas não se encontram limitados a ciclopentenilo e ciclo-hexenilo e similares. Alquilos cíclicos são também aqui referidos como "homociclos" ou "anéis homocíclicos". Alquilos insaturados contêm pelo menos uma ligação dupla ou tripla entre átomos de carbono adjacentes (referidos como "alcenilo" ou "alcinilo", respectivamente). Alcenilos de cadeia linear ou ramificada representativos incluem, mas não se encontram limitados a etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo e similares; enquanto que alcinilos de cadeia linear e ramificada representativos incluem, mas não se encontram limitados a acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2- butinilo, 1- pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinilo e similares. 0 termo "arilo", tal como utilizado neste documento, significa qualquer fracção carbocíclico aromático, tal como, mas não limitada a fenilo ou naftilo. 0 termo "arilalquilo" ou "aralquilo", tal como utilizado neste documento, significa qualquer grupo alquilo que tem pelo menos um átomo de hidrogénio alquílico substituído com uma fracção arilo, tal como benzilo, mas não limitado a, - (CH2) 2fenilo, - (CH2) 3fenilo, -CH(fenilo)2 e similares. 0 termo "halogéneo", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer fracção flúor, cloro, bromo ou iodo. 0 termo "haloalquilo", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer grupo alquilo possuindo pelo menos um átomo de hidrogénio substituído por halogéneo, tal como trifluorometilo e similares. 0 termo "heteroarilo", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer anel heterociclo aromático de 5 a 10 membros e possuindo pelo menos um heteroátomo seleccionado a partir de azoto, oxigénio e enxofre, e contendo pelo menos um átomo de carbono, incluindo, mas estando limitado a ambos os sistemas anelres monocíclicos e bicíclicos. Heteroarilos representativos incluem, mas não se encontram limitados a furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo, indolilo, iso-indolilo, aza-indolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, iso-oxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, cino-linilo, ftalazinilo ou quinazolinilo. 0 termo "heteroarilalquilo", tal como utilizado neste documento, significa qualquer grupo alquilo que tem pelo menos um átomo de hidrogénio alquilico substituído por uma fracção heteroarilo, tal como -CH-piridinilo, -CH2-pirimidinilo e similares. 0 termo "heterociclo" ou "anel heterociclico", tal como utilizado neste documento, significa qualquer anel heterociclico monociclico de 4 a 7 membros, ou biciclico de 7 a 10 membros, que pode ser saturado, insaturado, ou aromático, e que contém entre 1 a 4 heteroátomos seleccionados independentemente a partir de azoto, oxigénio e enxofre, e em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de azoto pode ser opcionalmente quaternizado, incluindo anéis biciclicos nos quais qualquer um dos heterociclos acima referidos são fundidos com um anel de benzeno . O heterociclo pode estar ligado através de qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Os heterociclos podem incluir os heteroarilos exemplificados por aqueles definidos anteriormente. Assim, para além dos heteroarilos acima mencionados, os heterociclos podem igualmente incluir, mas não se encontram limitados a morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetra-hidrofuranilo, tetra-hidropiranilo, tetra-hidropiridinilo, tetra-hidro-pirimidinilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra-hidrotiopiranilo, tetra-hidropirimidinilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra-hidrotiopiranilo e similares. 0 termo "heterocicloalquilo", tal como utilizado neste documento, significa qualquer grupo alquilo que tem pelo menos um átomo de hidrogénio alquílico substituido por um heterociclo, tal como -Cfb-morfolinilo e similares. 0 termo "homociclo" ou "cicloalquilo", tal como utilizado neste documento, significa qualquer anel carbociclico saturado ou insaturado (mas não aromático) contendo de 3-7 átomos de carbono, tais como, mas não estando limitado a ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclo-hexano, ciclo-heptano, ciclo-hexeno e similares. 0 termo "alquilamino", tal como utilizado neste documento, significa pelo menos um grupo alquilo ligado através de uma ponte de azoto (ou seja, -N-(alquilo)N, tal como uma dialquilamina)) incluindo, mas não estando limitado a metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino e similares.

Os termos "alquiloxilo" ou "alcoxilo", tal como utilizado neste documento, significam qualquer fracção alquilo ligada através de uma ponte de oxigénio (ou seja, -O-alquilo) tal como, mas não estando limitado a metoxilo, etoxilo e similares. 0 termo "alquiltio", tal como utilizado neste documento, significa qualquer fracção alquilo ligada através de uma ponte de enxofre (ou seja, alquil-S-), tal como, mas não estando limitado a metiltio, etiltio e similares. 0 termo "alcenilo" significa uma cadeia hidrocarboneto, não ramificada ou ramificada tendo uma ou mais ligações duplas na mesma. A ligação dupla de um grupo alcenilo pode ser não conjugada ou conjugada a outro grupo insaturado. Grupos alcenilo adequados incluem, mas não se encontram limitados a vinilo, alilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, butadienilo, pentadienilo, hexadienilo, 2-etilhexenilo, 2-propil-2-butenilo, 4-(2-metil-3-buteno)-pentenilo. Um grupo alcenilo pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. 0 termo "alcinilo" significa cadeia hidrocarboneto, não ramificada ou ramificada tendo uma ou mais ligações triplas na mesma. A ligação tripla de um grupo alcinilo pode ser não conjugada ou conjugada a outro grupo insaturado. Grupos alcinilo adequados incluem, mas não estão limitados a etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, metilpropinilo, 4-metil-l-butinilo, 4-propil-2-pentinil-, e 4-butil-2-hexinilo. Um grupo alcinilo pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. 0 termo "sais", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer sal que complexa com compostos identificados aqui contidos. Exemplos de tais sais incluem, mas não se encontram limitados a, sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similares), e sais formados com ácidos orgânicos tais como, mas não estando limitados a, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido fumárico, ácido maleíco, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftaleno sulfónico, ácido naftaleno dissulfónico e ácido poligalacturónico. Os compostos salinos podem também ser administrados sob a forma de sais quaternários aceitáveis do ponto de vista farmacêutico conhecidos pelo perito na técnica, que especificamente incluem os sais de amónio quaternário da fórmula -NR,R',R"+ Z-, em que R, R', R" é independentemente hidrogénio, alquilo, ou benzilo, e Z é um contra-ião, incluindo, mas não estando limitado a, cloreto, brometo, iodeto, alcóxido, toluenossulfonato, metilsulfonato, sulfonato, fosfato,ou carboxilato (tal como benzoato, succinato, acetato , glicolato, maleato, malato, fumarato, citrato, tartarato, ascorbato, cinamoato, mandeloato, e difenilacetato). Os compostos salinos podem também ser administrados sob a forma de sais catiónicos de piridina aceitáveis do ponto de vista farmacêutico tendo uma fórmula parcial substituída ou não substituída: em que Z é um contra-ião, incluindo, mas não estando limitado a, cloreto, brometo, iodeto, alcóxido, toluenossulfonato, metilsulfonato, sulfonato, fosfato ou carboxilato (tal como benzoato, succinato, acetato, glicolato, maleato, malato, fumarato, citrato, tartarato, ascorbato, cinamoato, mandeloato e difenilacetato).

Tal como utilizado neste documento, o termo "pró-fármaco" refere-se a um derivado de um composto que pode hidrolisar, oxidar, ou de outro modo reagir sob condições biológicas (in vitro ou in vivo) para proporcionar um composto da invenção. Os pró-fármacos só podem tornar-se activos após alguma reacção sob condições biológicas, mas podem possuir actividade nas suas formas não reagidas. Exemplos de pró-fármacos aqui contemplados incluem, sem limitação, análogos ou derivados de compostos da invenção, e/ou os seus sais, quando for possivel a formação do sal, mas, em particular, derivados de fracção tiol que se liga a zinco. Exemplos de fracções de pró-fármacos incluem fracções éster alquilico inferior substituídos ou não substituídos, ramificados ou não ramificados, (por exemplo, ésteres de ácido propiónico), ésteres de alcenilo inferior, ésteres di-alquil inferior-amino-alquílicos inferiores (por exemplo, éster dimetilaminoetílico) , ésteres acilamino de alquilo inferior (por exemplo, acetiloximetil éster), ésteres aciloxi de alquilo inferior (por exemplo, pivaloiloxi-metil éster), ésteres de arilo (éster fenílico), ésteres de aril-alquilo inferior (por exemplo, éster benzílico), ésteres de heteroarilo (éster nicotinato) , ésteres de aril e aril-alquilo inferior substituídos (por exemplo, com substituintes metilo, halo ou metoxido) , amidas, amidas de alquilo inferior, amidas de di-alquilo inferior, hidroxi amidas. Ésteres de aminoácidos naturais ou seus enantiómeros, ésteres dipeptídicos, ésteres de fosfato, ésteres de metoxifosfato, dissulfuretos e dímeros de dissulfureto. Os pró-fármacos e as suas utilizações são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Berge et ai., 1977). Os pró-fármacos podem geralmente ser preparados utilizando métodos bem conhecidos, tais como os descritos em Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (Manfred E. Wolff editor, 1995), e (Rautio, 2008).

Tal como utilizado neste documento, "grupos reactivos" refere-se a nucleófilos, electrófilos, ou grupos radicalmente activos, isto é, grupos que reagem na presença de radicais. Um nucleófilo é uma fracção que forma uma ligação quimica com o seu parceiro de reacção (o electrófilo), doando ambos os electrões da ligação. Os electrófilos aceitam esses electrões. Os nucleófilos podem participar em substituição nucleofilica, em que um nucleófilo é atraído por uma carga positiva total ou parcial num elemento e desloca o grupo a qual se encontra ligado. Alternativamente os nucleófilos podem participar em substituição do grupo carbonilo. Os ácidos carboxílicos são muitas vezes tornados por electrófílicos criando ésteres succinílicos e fazendo reagir estes ésteres com aminoalquilos para formar amidas. Outros grupos nucleófilos comuns são tioalquilos, hidroxialquilos, aminas primárias e secundárias, e nucleófilos de carbono, tais como enóis e complexos alquil metálicos. Outros métodos preferidos para a ligação de proteínas, oligossacáridos e células utilizando grupos reactivos são divulgados em (Lemieux e Bertozzi 1998), aqui incorporado como referência. Em ainda um outro método preferido, são proporcionados grupos reactivos para a ligação de Staudinger, ou seja, "click chemistry" com uma fracção compreendendo azida e grupos reactivos alcinilo para formar triazóis. Podem igualmente ser utilizadas adições de Michael de um enolato de um nucleófilo de carbono com um carbonilo electrofilico, ou formação de base de Schiff de uma amina primária ou secundária nucleofilica com um aldeído ou cetona. Outros métodos de bioconjugação são proporcionados em (Hang e Bertozzi 2001) e (Kiick et al., 2002). O termo "biocompatível", tal como utilizado neste documento, refere-se a qualquer material que não produza uma resposta prejudicial substancial no hospedeiro. Existe sempre a preocupação, quando um objecto estranho é introduzido num corpo vivo, que o objecto possa induzir uma reacção imunitária, tal como uma resposta inflamatória que terá efeitos negativos sobre o hospedeiro. No contexto desta invenção, a biocompatibilidade é avaliada de acordo com a aplicação para a qual foi concebida: por exemplo; uma ligadura é considerada como biocompatível com a pele, enquanto que um dispositivo médico implantado é considerado como biocompatível com os tecidos internos do corpo. Preferencialmente, os materiais biocompatíveis incluem, mas não se encontram limitados a materiais biodegradáveis e bioestáveis. Uma resposta prejudicial substancial não ocorreu se um implante que compreende o material está em estreita associação com o seu local do implante no animal hospedeiro e a resposta melhor do que uma resposta do tecido reconhecida e estabelecida como adequada a partir de materiais proporcionados num ASTM. Subcomité ASTM F04.16 sobre Métodos de Ensaio de Biocompatibilidade, desenvolveu padrões de biocompatibilidade de materiais médicos e cirúrgicos e dispositivos. Por exemplo, materiais que sejam para ser usados em contacto com a corrente sanguínea devem ser constituídos por materiais que cumpram as normas de hemocompatibilidade. Um desses testes é para os danos aos glóbulos vermelhos, o que pode resultar em hemólise, ou seja, a ruptura das células, conforme descrito em F 756 Prática para a Avaliação das Propriedades Hemolíticas dos Materiais.

Tal como utilizado neste documento, uma "substância bioactiva" refere-se a qualquer uma de uma variedade de fracções químicas e que se liga com uma biomolécula, tal como, mas não estando limitado a, péptidos, proteínas, enzimas, receptores, substratos, lípidos, anticorpos, antigénios e ácidos nucleicos. Em determinadas formas de realização preferidas, a substância bioactiva é uma biomolécula, mas não se pretende que a substância bioactiva seja limitada a biomoléculas. Em outras formas de realização preferidas, as substâncias bioactivas proporcionam interacções hidrófobas, hidrófilas ou electrostáticas, tais como os ácidos policarboxilicos que são aniónicos ao pH fisiológico. Em outra forma de realização preferida, os factores de crescimento alcalinos (com ponto isoeléctrico superior a 7) são retidos através de interacções electrostáticas favoráveis pelos policarboxilatos, e subsequentemente libertados de uma forma controlada e sustentada. "Cancro" é um termo usado para doenças nas quais as células anormais se dividem sem controlo e são capazes de invadir outros tecidos. Existem mais de 100 tipos diferentes de cancro. A maioria dos cancros são nomeados em relação ao órgão ou tipo de célula em que se iniciam-por exemplo, o cancro que se inicia no cólon é denominado de cancro de cólon; cancro que se inicia nas células basais da pele é denominado como carcinoma das células basais. As categorias principais de cancro incluem carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas e mielomas e cancros do sistema nervoso central. Alguns tipos de cancro comuns incluem, mas não se encontram limitados a cancro da bexiga, cancro da mama, cancro do cólon e rectal, cancro do endométrio, cancro do rim (células renais), leucemia, cancro do pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, cancro pancreático, cancro da próstata, o cancro de pele (não- melanoma) e cancro da tiróide. Numa forma de realização, os cancros aqui contemplados para tratamento incluem cancros do cólon e da mama.

Os termos "compreende", "compreendendo", destinam-se a ter o significado amplo e podem significar "inclui", "incluindo" e similares.

FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Em Janeiro de 2008 ou nessa altura, o largazol foi isolado a partir de uma cianobactéria do género Symploca, e designado pela sua localização em Key Largo (Luesch et al., University of Florida). 0 composto demonstra actividade antiproliferativa na linha celular epitelial mamaria transformada MDA-MB23 com uma IGso de 7,7 nM (Taori et al. 2008). Além disso, o largazol direcciona-se preferencialmente às células cancerosas relativamente às células normais, o que faz com que esta substância marinha seja um importante alvo sintético, bem como um agente quimioterapêutico do cancro potencialmente valioso (Taori et al., 2008). A primeira síntese reportada de largazol foi completada por Luesch e colaboradores (Ying et al. 2008b), seguido pelo grupo de Phillips (Nasveschuk et al. 2008), grupo de Cramer (Seiser et al. 2008), grupo de Williams (Bowers et al. 2008), e grupo de Ghosh (Ghosh e Kulkarni 2008) . Tem sido sugerido que a base molecular para a sua actividade anti-canceríngena é a inobição das Histona desacetilases (HDAC) (Ying et al. 2008b).

Os inibidores de HDAC foram sugeridos como sendo uma nova classe de agentes potentes anti-canceríngenos para o tratamento de mailignidades sólidas e hematológicas. Os actuais inibidores de HDAC, tais como butirato de sódio, Tricostatina A (TSA), suberoilanilida de ácido hidroxâmico (SAHA), FK228 e outros, podem exibir o seu efeito anti-tumoral através da regulação de genes e seus produtos proteicos que são necessários para a paragem do ciclo celular, reparação de danos no ADN, eliminação de radicais livres e apoptose (Marks 2010) . Por exemplo, SAHA foi aprovado para o tratamento de linfoma de célula T cutâneo avançado (Marks 2007). Vários outros inibidores de HDAC encontram-se actualmente em ensaios clínicos para o tratamento do cancro (Marks 2010). A estrutura do largazol compreende um macrociclo de 16 membros contendo uma 4-metiltiazolina fundida com um anel de tiazol e uma cadeia lateral de tioéster octanóico, uma unidade raramente encontrada em produtos naturais (Taori et al. 2008; Newkirk et al, 2009). Postulou-se que é a parte macrocíclica do composto que interage com a superfície da proteína HDAC, enquanto que a cadeia lateral seria inserida no sítio activo da HDAC e quelando-o, resultasse na cessação da desacetilação do substrato (Newkirk et al. 2009). (Figura 4).

Para melhor definir o farmacóforo de largazol, é lógico que, após a sua entrada no citoplasma da célula, a fracção tioéster seja rapidamente hidrolisada para produzir o grupo tiol livre, o qual pode interagir com o ião de zinco na parte inferior da bolsa de HDAC e inibir potentemente a actividade enzimática. (Figura 6).

Para validar que o tiol de largazol é a espécie reactiva, vários grupos sintetizaram um derivado de tiol e avaliaram a potência bioquímica na inibição do crescimento de células tumorais e em ensaios de inibição de HDAC celulares ou in vitro. Estes resultados indicam que o análogo de tiol possui inibição de HDAC similar utilizando extractos celulares tratados com o composto (Bowers et al. 2008; Ying et al, 2008a; Ying et al. 2008b.). Em ensaios in vivo, nos quais as células são tratadas com largazol ou tiol de largazol, a molécula original possui maior potência em relação à inibição de HDAC (IC50 51 nM vs. 209 nM para o metabolito tiol) (Ying et al. 2008a).

Em relação à actividade antiproliferativa, foram apresentados conjuntos de dados contraditórios por dois grupos: Ying et al. mostram que o largazol e o análogo tiol apresentam actividade anti-crescimento similar em células HCT116 com valores de IG50 de 44 e 38 nM, respectivamente (Ying et al. 2008b). O grupo de William utilizou uma série de linhas celulares de melanoma para demonstrar que o largazol possui uma consistente potência superior (IC50 45-315 nM) quando comparado com o seu metabolito tiol (IC50 380-2600 nM) . Eles atribuíram a diferença na citotoxicidade à superior permeabilidade do largazol tioéster (Bowers et al., 2008). Para medir a actividade da desacetilase in vitro, foram incubadas proteínas de comprimento completo de HDAC purificadas de classe I e de classe II, com substrato de fluoróforos e largazol ou tiol largazol. Os resultados não mostram apenas que o próprio largazol é um inibidor HDAC muito mais fraco quando comparado com a versão reduzida, mas também indicam uma preferência acentuada do largazol pelas HDACs 1, 2 e 3 em relação a HDAC6 (Bowers et al. 2008). Para ter em conta a ausência de diferença em ensaios de base celular, é possível que o tioéster seja clivado nas condições experimentais.

Além disso, uma vez que os hidroxilos não formam quelatos com o zinco, uma substituição de-SH com -OH impediu o efeito tóxico, bem como actividade inibidora no ensaio de HDAC (Bowers et al., 2008); (Yinq et al. 2008a)). Tomados em conjunto, o tiol é indispensável para ambas as actividades; portanto, pode-se, pois, especular que a inibição de HDAC promove o seu efeito antitumoral. Do ponto de vista da biossintese, a natureza produziu o largazol como um pró-fármaco, em lugar de uma espécie reactiva direccionada para aumento da sua estabilidade e para protecção em relação a oxidação indesejada (Ying et al. 2008b). Curiosamente, um mecanismo análogo de protecção-e-libertação foi observado numa substância natural, FK228 (Shigematsu et al., 1994), (Ueda et al, 1994a; Ueda et al, 1994b). Este composto ciclico distintivo contém uma ligação dissulfureto, a qual após hidrólise por glutationa reductase a butenil tiol estende-se para o residuo de zinco para terminar a actividade de HDAC. (Figura 6; e (Furumai et al. 2002).).

Foram preparados uma série de análogos para testar o comprimento óptimo da cadeia lateral octanoilo, uma vez que é o ligante que é inserido dentro da bolsa de HDAC para quelar o zinco, o que resulta em atenuação da actividade biológica de HDAC. Crê-se que o largazol bem como o FK228 incorporam um ligante de quatro átomos entre o macrociclo e o grupo de ligação ao zinco. Um macrociclo no qual esteja ausente toda a cadeia octanoilo não pode inibir a HDAC nem possui qualquer actividade tóxica nas células, o que autentica ainda mais a importância do grupo tiol no papel do largazol como inibidor de HDAC. Nem o encurtamento nem o alongamento da cadeia alifática é uma modificação estrutural vantajosa tal como medido por ensaios de HDAC in vivo e in vitro, bem como através de ensaio de viabilidade celular em relação à linha celular de cancro do cólon HCT116. (Tabela 2). Estes resultados sugerem que o comprimento natural da cauda de largazol é óptima (Ying et al, 2008a;. Ying et ai, 2008b; Newkirk et ai, 2009). Além disso, foram investigadas e relatadas por Leusch e associados duas mudanças na região da cobertura: a substituição de valina por alanina e um epímero de largazol (17R) (Ying et al. 2008a.). O composto de Vai-, Ala mostrou uma redução para metade em todas as actividades inibidoras quando comparado com o largazol, indicando que o resíduo valina pode ser facilmente permutado. Um análogo epímero teve um comportamento fraco como inibidor de HDAC, aludindo à importância da configuração S na posição C 17 (Ying et al. 2008a). Recentemente, mais estudos da relação estrutura actividade do largazol foram realizadas por Zeng et al. (Zeng et al. 2010), nos quais se substituiu a valina por leucina e fenilalanina e observaram que a atividade inibitória em relação a várias linhas celulares de cancro foi ligeiramente diminuída (por exemplo, o GIso para Largazol foi de 80 nM enquanto que foram medidos 560 nM e 2 60 nM por uma Leu 1 e Phe 1, respectivamente, em células HCT 116) . Curiosamente, quando a valina foi trocada por tirosina, o que resultou na redução da potência em relação a células cancerosas, aumentou muito o GI50 em relação a células normais, melhorando excessivamente a janela terapêutica (HCT-116: GIso 0,39 μΜ; A549: GIso 1,46 μΜ) para as linhas de células normais (HEK293: GIso 100 μΜ; HLF: GIso 100 μΜ, ao passo que o GIso do largazol em HEK293 é de 1,36 μΜ e 0,98 μΜ em células HLF). Por isso, foi sugerido que a colocação de Tyr no largazol pode forçar o composto a optar pelas HDACs em cancro em lugar das células normais (Zeng et al.2010).

Consequentemente, os inibidores de HDAC macro-cíclicos tais como o largazol apresentam potencial como ferramenta para estudar a biologia das HDACs e, ao mesmo tempo, devido às preferências do largazol no sentido de destruir células cancerosas vs. células normais, encerra uma enorme promessa como terapêutica do cancro (ou seja, dispõe uma ampla janela terapêutica). A atratividade do largazol reside igualmente no facto de que é altamente seletivo em relação às desacetilases de classe I, uma caracteristica raramente encontrada em inibidores de HDAC.

Numa forma de realização, a invenção presente contempla um método para melhorar as relações estrutura-actividade de análogos de largazol através da criação de análogos de largazol e avaliando os seus efeitos anti-proliferativos em linhas celulares de cancro do cólon e da mama.

Numa forma de realização, a invenção presente proporciona métodos para rastreio de compostos da invenção presente para determinar o seu efeito na inibição do crescimento de células cancerosas.

Numa outra forma de realização, a invenção presente proporciona métodos para aumentar a potência e selectividade do largazol através da criação de uma estrutura de macrociclo com 16 membros.

Em ainda outra forma de realização, a invenção presente proporciona novos análogos de largazol por ruptura do anel da 4-metiltiazolina o que resulta na melhoria da especificidade dos efeitos anti-tumorais, por exemplo, é constatado um efeito anti-tumoral in vivo dos novos análogos com uma eficácia comparável em relação ao compostos em que o anel de 4-metiltiazolina esteja intacto, mas o número de genes impactados pelonovo análogo é apenas 1/3 do que foi alterado pelo tratamento com largazol às 24 h. Esta observação sugere que os novos análogos são distintos dos largazol e provavelmente apresentam menos efeitos secundários.

Em ainda outra forma de realização, a valina da molécula de largazol foi substituída no macrociclo por um aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste em glicina, alanina, leucina e isoleucina.

Em ainda outra forma de realização, uma substituição de valina com glicina melhorou a eficácia do composto derivado em 3 vezes.

Em ainda outra forma de realização da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica, compreendendo, além de um ou mais compostos aqui descritos, pelo menos um suporte aceitável do ponto de vista farmacêutico. A composição pode tomar qualquer forma adequada para a via de administração pretendida. Quando a composição é para ser administrada por via oral, pode ser utilizada qualquer forma de dosagem oralmente administrável adequada, incluindo, sem limitação, comprimidos, cápsulas (cheias com sólido ou liquido), pós, grânulos, xaropes e outros líquidos, elixires, inalantes, trociscos, pastilhas e soluções. As composições injectáveis ou infusões i.v. são também proporcionadas na forma de soluções, suspensões e emulsões.

Em ainda outra forma de realização, uma composição farmacêutica de acordo com a invenção presente pode conter um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, para aumentar a eficácia ou diminuir os efeitos secundários. Em algumas formas de realização, por conseguinte, uma composição farmacêutica contém adicionalmente um ou mais agentes terapêuticos adicionais, seleccionados a partir de ingredientes activos úteis para tratar ou inibir doença mediada directa ou indirectamente por HDAC. Exemplos de tais ingredientes activos são, sem limitação, agentes para tratar ou inibir o cancro, doença de Huntington, fibrose cística, fibrose hepática, fibrose renal, fibrose pulmonar, fibrose de pele, artrite reumatóide, diabetes ou insuficiência cardíaca.

Em ainda outra forma de realização, um agente terapêutico adicional a ser incluído é um agente anti- cancerígeno. Exemplos de agente anti-cancerígeno incluem, mas não se encontram limitados a, agentes alquilantes, tais como ciclofosfamida, dacarbazina e cisplatina; anti-metabolitos tais como metotrexato, mercaptopurina, tio-guanina, fluoro-uracilo e citarabina; alcaloides de plantas tais como vinblastina e paclitaxel; antibióticos antitumorais tais como a doxorrubicina, bleomicina e mitomicina; hormonas/anti-hormonas, tais como como pre-dnisona, tamoxifeno e flutamida; outros tipos de agentes anti-cancerígenos, tais como asparaginase, rituximab, trastuzumab, imatinib, ácido retinóico e derivados, facto-res estimulantes de colónias, amifostina, camptotecina, topotecano, análogos de talidomida tal como lenalidomida, inibidores de CDK, inibidores do proteassoma, tal como Velcade e outros inibidores de HDAC.

Em ainda outra forma de realização, a invenção presente proporciona um método de inibição ou tratamento de doenças resultantes da proliferação e/ou diferenciação anormal de células num sujeito com necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos de acordo com a invenção presente. Numa forma de realização, o método de inibição ou tratamento da doença compreende a administração a um sujeito com necessidade do mesmo, de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um ou mais compostos da invenção e um suporte aceitável do ponto de vista farmacêutico. A composição a ser administrada pode ainda conter um agente terapêutico tal como um agente anti-cancerígeno.

COMPOSTOS DA INVENÇÃO

Os compostos da invenção são definidos neste documento pelas suas estruturas quimicas e/ou nomes químicos. Os compostos da invenção são qeralmente designados de acordo com o sistema de nomenclatura da IUPAC ou CAS. Podem ser utilizadas abreviaturas que são bem conhecidas de um perito vulgar na técnica. Quando um composto é referido tanto por uma estrutura química como pelo nome químico, e a estrutura química e o nome químico conflituam, a estrutura química é determinante da identidade do composto.

Os compostos com a Fórmula I da invenção presente são sintetizados de acordo com o esquema genérico, Esquema I:

ESQUEMA I

Os intermediários ácido Arilo ou Heteroarilo com a Fórmula geral 1 e intermediários amina com a Fórmula geral 2 podem ser sintetizados através de métodos bem conhecidos disponíveis na técnica ou estarem comercialmente disponíveis (Sigma-Aldrich; Advanced Chem Tech; Synthatech). 0 acoplamento de ácidos com a Fórmula 1 e aminas com a Fórmula 2 proporcionada amidas com a Fórmula 3, por métodos de acoplamento conhecidos, utilizando reagentes adequados, tais como EDCI (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida) ou HATU (hexafluorofos-fato de 2-(7-aza-lH-benzotriazole-l-il)-1,1,3,3-tetrame-tilurónio). A hidrólise dos ésteres com a Fórmula 3 proporciona os ácidos com a Fórmula 4, os quais por sua vez podem ser acoplados com aminas com a Fórmula 5 para se obter os compostos com a Fórmula 6. Exemplos de agentes de acoplamento são EDCI (l-metil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida) ou HATU (hexafluorofosfato de 2-(7-aza-lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio) . A hidrólise e a remoção do grupo protector de amina dos compostos com a Fórmula 6, seguido de macrociclização proporciona as macrolactamas com a Fórmula geral 7. A macrociclização pode ser conseguida fazendo reagir os aminoácidos desprotegidos dos compostos com a Fórmula 6 com di-isopropiletilamina, HATU (hexafluorofosfato de 2-(7-aza-lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio) num solvente tal como tetra-hidrofurano. A reacção metátese cruzada dos compostos com a Fórmula 7 convertem-nos em compostos com a Fórmula I da invenção presente.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são unicamente proporcionados para fins ilustrativos

Exemplo 1 oOctanotioato de S-(E)-4-((7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia- 3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3-enilo.

Passo 1: Preparação de 2-(2-((terc-butoxicarbo-nilamino)metil)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpropanoato de metilo: Num balão de fundo redondo com 50 mL de cloreto de metileno adicionou-se ácido 2-((terc-butoxicarbonilami-no) metil)tiazol-4-carboxilico (2,0 g, 7,74 mmole) e sal hidrocloreto de 2-amino-2-metilpropanoato de metilo (1,25 g, 8,13 mmole). À mistura, foi posteriormente adicionada trietilamina (5,4 mL, 38,7 mmole), seguido de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (2,97 g, 15,5 mmole) e hidroxibenzotriazol (2,09 g, 15,5 mmole). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi posteriormente diluida com cloreto de metileno. A mistura foi, em seguida, lavada com água e a fase aquosa foi extraida com cloreto de metileno. A fase orgânica combinada foi então seca em Na2SC>4 e filtrou-se. O

filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna de silica gel eluindo com 1:1 de EtOAc/hexano para proporcionar o produto pretendido (2,40 g, 87% de rendimento).

Passo 2: Preparação de ácido 2-(2-((terc-buto-xicarbonilamino)metil)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpropa-nóico: 2-(2-((terc-butoxicarbonilamino)metil)tiazol-4-car- boxamido)-2-metilpropanoato de metilo (2,4 g, 6,7 mmole) foi dissolvido em 10 mL de metanol e 3 mL de água. Foi posteriormente adicionada à mistura hidróxido de litio mono-hidratado (0,56 g, 13,4 mmole). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente até que a TLC indicou o consumo completo do material de partida. À mistura, foram adicionados água e EtOAc, e a fase aquosa foi acidificada com HC1 2N até cerca de pH 7. As fases foram separadas e a fase aquosa foi extraida com EtOAc. A fase orgânica combinada foi seca em Na2S04 e concentrou-se para proporcionar o produto pretendido sob a forma de sólido branco (2,3 g, rendimento quantitativo).

Passo 3: Preparação de (3S)—3—{[(2S)—2 — (2—{ [2 — ({[(terc-butoxi)carbonil]amino}metil)-l,3-tiazol-4-il]for-mamido}-2-metilpropanamido)-3metilbutanoil]oxi}pent-4-eno-ato de terc-butilo: a uma solução de ácido 2-(2-((terc-butoxicarbonilamino)metil)tiazol-4-carboxamido)-2-metilpro-panóico (1,26 g, 3,67 mmole) em 10 ml de dimetilformamida foi adicionado HBTU (O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametil-urónio-hexafluoro-fosfato) (1,67 g, 4,40 mmole) e di- isopropiletilamina (2,0 mL, 11,0 mmole). A mistura reac- cional resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Foi adicionado (S)-3-((S)-2-amino-3-metilbutanoiloxi)pent-4-enoato de terc-butilo (1,0 g, 3,67 mmole), e a mistura resultante foi agitada durante a noite. Foram adicionados água e EtOAc e as fases foram separadas. A fase aquosa foi extraida com EtOAc, a fase orgânica combinada foi seca em Na2S04 e concentrou-se. Puruficou-se por cromatografia em coluna, eluido com 1:1 de Hex/EtOAc para se obter o produto pretendido (2,1 g, 96% de rendimento).

Passo 4: Preparação de (7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-10-vinil-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo-[13.2.1]octadeca-1(17), 15(18)-dieno-2,5,8,12-tetra-ona:

Uma solução de (7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-10-vinil-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17), 15(18)-dieno-2,5,8,12-tetra-ona (200 mg, 0,33 mmole) em 10 ml de cloreto de metileno foi arrefecida a 0°C. À mistura, foram adicionados 10 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi agitada a 0°C durante 1,5 horas. A mistura foi concentrada e submetida a destilação azeotrópica três vezes com tolueno e uma vez com tetra-hidrofurano para proporcionar a amina-ácido. Num segundo balão de fundo redondo foi colocado HATU (381 mg, 1,0 mmole) e N,N-di-isopropiletilamina (0,51 ml, 2,85 mmole) em 70 mL de tetra-hidrofurano. A mistura foi arrefecida a 0°C. A solução anterior de amina-ácido em bruto em 14 mL de tetra- hidrofurano foi posteriormente adicionada durante 8 horas através de uma seringa de carga. A mistura reaccional foi posteriormente agitada durante a noite numa sala fria a 4°C. Aqueceu-se posteriormente até à temperatura ambiente e agitou-se durante 2 horas. A reacção foi em seguida cessada com água. As fases foram separadas e a fase aquosa foi extraida com EtOAc. A camada orgânica combinada foi seca em Na2SC>4 e concentrou-se. A mistura foi purificada por cromatografia em silica gel, eluindo com EtOAc para se obter o produto pretendido. Foi novamente purificado por cromatografia de fase reversa, eluindo com 0-100% de água/CH3CN para se obter o produto pretendido (45 mg, 32% de rendimento).

Passo 5: Preparação de (7 S,10S)-10-((E)-4-bro-mobut-l-enil)-7-isopropil-4,4-dimetil-9-oxa-16-tia-3, 6, 13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dieno-2,5,8,12-tetra-ona: A uma mistura de (7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-10-vinil-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabici-clo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dieno-2,5,8,12-tetra-ona (20 mg, 0,047 mmole) em 2 mL de 1,2-dicloroetano adicionou-se 4-bromo-l-buteno (25,6 mg, 0,19 mmole) e catalisador Zhan-1 (3,2 mg, 0,0047mmole). A mistura foi brevemente desgaseifiçada e, em seguida, aquecida num tubo selado a 85°C durante a noite. O produto em bruto foi concentrado e passado através de uma camada de silica gel para se obter uma mistura do produto pretendido e material de partida recuperado (proporção 2: 1). Foi novamente purificado por cromatografia de fase reversa, elundo com 0-80% de água/CH3CN para se obter o produto pretendido (8 mg, 32% de rendimento).

Passo 6: Preparação de S- (E)-4-((7S,10S)-7- isopropil-4,4-dimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia- 3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)— dien-10-il)but-3-enil octanotioato: A uma mistura de (7 S,10S)-10-((E)-4-bromobut-l-enil)-7-isopropil-4,4-dime-til-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1 (17) , 15 (18) -dieno-2, 5, 8, 12-tetra-ona (15 mg, 0,028 mmole) em 1 mL de acetona à temperatura ambiente adicionou-se K2CO3 (16 mg, 0,12 mmole) e ácido S-octanotióico (14 mg, 0,085 mmole). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante quatro horas. 0 solvente foi evaporado. A mistura em bruto foi passada através de uma camada de silica gel. Foi novamente purificada por cromatografia de fase reversa, eluindo com 0-90% de água/CH3CN para se obter o produto pretendido (4 mg, 23% de rendimento) . RMN de 1H (300 MHz, CDCI3) δ: 8,02 (s, 1H) , 7,62 (s, 1H) , 6,47 (d, J = 10,85Hz, 1H) , 6,33 (dd, J = 8, 65, 4,50 Hz, 1H) , 5,83 ~ 5,67 (m, 2H) , 5, 64-5,56 (m, 1H) , 5,18 (dd, J = 17,31, 8,22 Hz, 1H) , 4,64 (dd, J = 9, 87, 3, 97 Hz, 1H) , 4,37 (dd, J = 17,21, 4,01 Hz, 1H), 2,87 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2.81-2.61 (m, 2H) , 2,51 (t, J = 7,5 Hz, 2H) , 2,30 (m, 3H) , 1,90 (s, 3H) , 1,59 (m, 2H) , 1,57 (s, 3H) , 1,27 (m, 8H) , 0,88 (m, 5 H) , 0,69 (d, J = 6.82Hz, 3H)

Via alternativa para a preparação de octanotioato de S- (E)-4- ( (7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-2,5, 8, 12-te- tra-oxo-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]-octadeca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3-enilo: A uma mistura de (7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-10-vinil-9-oxa-16-tia- 3.6.13.18- tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dieno-2,5,8,12-tetra-ona (32,5 mg, 0,077 mmole, preparada a partir do passo 4) e octanotioato de S-but-3-enilo (33 mg, 0,15 mmole) em 1 mL de dicloroetano adicionou-se catalisador de Grela (5 mg, 0,077 mmole). A mistura foi purgada com árgon durante alguns minutos e aquecida a 85°C durante duas horas. Foram adicionados octanotioato (16,5 mg, 0,077 mmole) e catalisador Grela (5 mg, 0,077 mmole) adicionais. Agitou-se durante mais duas horas. O solvente foi evaporado e a mistura foi purificada por cromatografia em silica gel para se obter o produto pretendido (21,3 mg, 46%). MS (ESI) [M + Na+]+ = 631,3

Exemplo 2: etanotioato de S-(E)-4-((7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia- 3.6.13.18- tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3-enilo.

A uma mistura de (7 S,10S)-10-((E)-4-bromobut-l-enil)-7-isopropil-4,4-dimetil-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dieno-2,5,8,12-

tetra-ona (20 mg, 0,038 mmole) (preparado como no passo 5 do Exemplo 1) em 0,5 mL acetona à temperatura ambiente, adicionou-se K2CO3 (100,5 mg, 0,08 mmole) e ácido tioacético (6 mg, 0,08 mmole). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. O solvente foi evaporado. A mistura em bruto foi purificadA por cromatografia em silica gel, eluiu-se com EtOAc, posteriormente com 10% de MeOH em EtOAc, para se obter o produto pretendido (19 mg, 96% de rendimento). MS (ESI) [M + Na+]+ = 547,2

Exemplo 3: octanotioato de S-(E)-4-((7S,10S)-7-isopropil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azaspiro[biciclo[13.2.1]octadeca [1(17),15(18)]dieno-4,1'-ciclopropano]-10-il)but-3-enilo.

Este composto foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 1 usando materiais de partida apropriados. MS (ESI) [M + Na+]+ = 629,2

Exemplo 4: octanotioato de S-(E)-4-((7S,10S)-4,4,7-trimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9,16-dioxa-3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3-enilo.

Este composto foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 1 usando materiais de partida apropriados. MS (ESI) [M + Na+]+ = 587,3

Exemplo 5: (7S,10S)-4,4-dimetil-10-[(1E)-4-(octa-noilsulfanil)but-l-en-l-il]-7-(propan-2-il)-9-oxa-3,6,13, 19-tetra-azabiciclo[13.3.1]nonadeca-1(18),15(19),16-trieno-2,5,8,12-tetra-ona.

Este composto foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 1 usando materiais de partida apropriados. MS (ESI) [M + Na+]+ = 625,3

Exemplo 6: Dimero (7S,10S)-7-isopropil-10-((E)-4-(((E)-4-((7R,10R)-7-isopropil-4,4-dimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octa-deca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3-enil)disulfanil) but-1-enil)-4,4-dimetil-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo [13 . 2 . 1] octadeca-1 (17),15(18)-dieno-2,5,8,12-tetra-ona.

A uma solução de octanotioato de S- (E)-4-( (7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia-3,6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(11), 15 (18)-dien-10-il)but-3-enilo (10 mg, 0,016 mmole) em 2 mL de CH3CN foi adicionado NH3 aquoso (28,9%, 0,2 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h. Em seguida foram adicionados 0,2 mL adicionais de amoníaco aquoso e a mistura reaccional foi agitada durante um dia. Foram adicionados 0,2 mL de amoníaco aquoso e a mistura resultante foi agitada durante a noite. Foram adicionados outros 0,1 mL de NH3 aquoso e agitou-se durante 6 horas. Concentrou-se e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel, eluindo com EtOAc/MeOH (10/1). As fracções que continham o produto pretendido foram combinadas. Foi novamente purificado por cromatografia de fase reversa, eluição de gradiente com 0~80% de CH3CN/água para se obter o produto pretendido (6,5 mg, 82%). MS (ESI) [M + Na+]+ = 985,3

Seguem-se alguns exemplos não limitativos de compostos com a Fórmula 1 do Esquema I:

Seguem-se alguns exemplos não limitativos de compostos com a Fórmula 2 do Esquema I:

Exemplo 7: CULTURA DE CÉLULAS

As linhas celulares SW480, HCT116 e MDA-MB231 foram adquiridas de American Tissue Culture Collection. As células SW480 e MDA-MB231 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de vitelo a 37°C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2. A linha celular HCT116 foi cultivada em meio de McCoy 5a [ATCC; Cat. No.30-2007] com 1,5 mM de L-glutamina e soro fetal de bovino a 10% [ATCC; Cat. No. 30-2020]. As células HME (Clonetics, San Diego, CA; dador 4144) foram cultivadas em meio e suplementos recomendados por Clonetics isento de soro (52 μρ/ητϋ de extracto de pituitária bovina, 0,5 μρ/ιηΐ, de hidrocortisona, 0,01 μρ/πΛ de factor de crescimento epidérmico, 5 μρ/πϋΐ de insulina, 50 μg/mL de gentamicina e 50 μg/mL de anfotericina-B).

Exemplo 8: ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR 8.000 células de diferentes tipos de cancro foram colocadas em micro-placas de 96 poços de fundo plano. (Poços de controlo de nível de base, não contendo células, mas que contêm o mesmo volume de meio, foram incluídos em cada placa de ensaio). 24 horas após a cultura, foi adicionado novo meio. Para avaliar a citotoxicidade in vitro, cada composto foi dissolvido em DMSO e preparado imediatamente antes dos ensaios e foi diluído em meio completo antes da adição à culturas de células. Os compostos teste foram então adicionados ao meio de cultura nas concentrações decrescentes designadas (600 nM a 10 nM). A viabilidade celular foi determinada 48 horas mais tarde usando corante de violeta de cristal (Sigma-Aldrich), o qual foi solubilizado em etanol, e a absorvância foi medida a 588 nm utilizando um leitor de placas Tecan Sail re II. Os ensaios foram realizados em réplicas de seis, e as curvas de concentração-resposta foram gerados por análise de regressão não linear de minimos quadráticos dos dados utilizando GraphPad Prism (San Diego, CA) . A inibição do crescimento (GIso) para cada composto foi definida como a concentração de fármaco que conduz a uma redução de 50% em A588 quando comparada com os controlos.

Exemplo 9: TRANSFERÊNCIA WESTERN

Para a análise por Transferência Western, foram preparados extractos de proteinas totais através da lise de células em tampão de lise (50 mM de Tris-Cl [pH 8,0], 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo) . Foram separadas 50 μρ de proteinas solúveis totais por SDS-PAGE. As proteinas foram transferidas para membrana de nitrocelulose e a membrana foi bloqueada durante 1 hora com leite magro a 4%, seguido de incubação durante a noite a 4°C com anticorpos primários contra a histona H3 acetilada (1:1000, Upstate, #06-599), (Ezrin 1:10000, Sigma, E-8897), gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1:20000, Santa Cruz, SC-47724), histona H3 (H3; 1:1000, Santa Cruz, sc-8654). As membranas foram posteriormente incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase durante uma hora à temperatura ambiente. A detecção foi realizada usando Super Signal WestDura. A expressão de Ezrin e GAPDH foi usada como controlo de carga.

Exemplo 10: ENSAIOS PARA DETERMINAÇÃO DO EFEITO DO LARGAZOL E SEUS ANÁLOGOS NO CRESCIMENTO DE CÉLULAS CANCEROSAS

Colocaram-se 8.000 células de diferentes tipos de cancro ou células não transformadas em micro-placas de 96 poços de fundo plano. (Poços de controlo de nível de base, não contendo células, mas que contêm o mesmo volume de meio foram incluídos em cada placa de ensaio) . 24 horas após a cultura, foi adicionado novo meio. Para avaliar a citotoxicidade in vitro, cada composto foi dissolvido em DMSO e preparado imediatamente antes dos ensaios e foi diluído em meio completo antes da adição à cultura de células. Os compostos teste foram então adicionados ao meio de cultura nas concentrações decrescentes designadas (600 nM a 10 nM). A viabilidade celular foi determinada 48 horas mais tarde usando corante de violeta de cristal (Sigma-Aldrich) , o qual foi solubilizado em etanol, e a absorvância foi medida a 588 nm utilizando um leitor de placas Tecan Safire II. Os ensaios foram realizadas em réplicas de seis, e as curvas de concentração-resposta foram geradas por análise de regressão não linear dos mínimos quadráticos dos dados utilizando GraphPad Prism (San Diego, CA). A inibição do crescimento (GI50) para cada composto foi definida como a concentração do fármaco que conduz a uma redução de 50% em A588 quando comparada com os controlos.

Exemplo 11: ESTUDOS DE MICROARRANJOS DE ADN PARA DETERMINAR O EFEITO DE SAHA, LARGAZOL E SEUS ANÁLOGOS NOS PERFIS DE EXPRESSÃO GENÉTICA DE CÉLULAS CANCEROSAS. Células HCT-116 foram cultivadas em triplicado com uma confluência de aproximadamente 60%. Após oito horas, as células foram tratadas com o DMSO veiculo de controlo (0,01%), SAHA (200 μΜ), Largazol (20 nM) ou Exemplo 1 (20 nM). As células foram incubadas durante 6 ou 24 horas, seguindo-se uma lavagem com solução salina tamponada com fosfato. 0 ARN total foi extraido usando um kit de extracção de ARN RNeasy Mini (QIAGEN Inc., Valencia, CA) imediatamente após a lavagem. A concentração total de ARN foi determinada usando um espectrómetro Lambda 800 UV/VIS (PerkinElmer, Waltham, MA) e processou-se para marcar a hibridação, lavagem e rastreio em University of Colorado-Denver Health Sciences Center. Foram usados três arranjos GeneChip® Human Gene ST 1.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA) para cada um dos pontos temporais, tipos de células e tratamentos para um total de 24 arranjos. Foram gerados ficheiros de valores de expressão para cada amostra usando o algoritmo Robust Multichip Average (RMA). A expressão diferencial foi determinada utilizando o pacote de programas R limma para gerar modelos lineares e estatística Bayesiana empírica. Os genes foram considerados diferencialmente expressos, se o valor de P, ajustado para múltiplos testes utilizando o método de Benjamini e Hochberg, foi ^5% e o log da alteração para duas vezes foi <1 ou ^-1. Foi usado o programa GeneSpring GX (Agilent, Santa Clara, CA) para agrupamento hierárquico e gerar cartas térmicas.

REFERÊNCIAS

Allfrey, V.G., Faulkner, R., e Mirsky, A.E. 1964. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of RNA Synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51: 786-794.

Berge, S.M., Bighley, L.D., e Monkhouse, D.C. 1977. Pharmaceutical salts. Journal of pharmaceutical sciences 66(1): 1-19.

Bowers, A., West, N., Taunton, J., Schreiber, S.L., Bradner, J.E., e Williams, R.M. 2008. Total synthesis and biological mode of action of largazole: a potent class I histone deacetylase inhibitor. J. Am. Chem.

Soc. 130(33): 11219-11222.

Finnin, M.S., Donigian, J.R., Cohen, A., Richon, V.M., Rifkind, R.A., Marks, P.A., Breslow, R., e Pavletich, N.P. 1999. Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors. Nature 401 (6749) : 188-193.

Furumai, R., Matsuyama, A., Kobashi, N., Lee, K.-H., Nishiyama, M., Nakajima, H., Tanaka, A., Komatsu, Y., Nishino, N., Yoshida, M., e Horinouchi, S. 2002. FK228 (depsipeptide) as a natural prodrug that inhibits class I histone deacetylases. Cancer Res. 62(17): 4916-4921. Ghosh, A.K. e Kulkarni, S. 2008. Enantioselective total synthesis of (+)-largazole, a potent inhibitor of histone deacetylase. Org. Lett. 10(17): 3907-3909.

Hang, H.C. e Bertozzi, C.R. 2001. Chemoselective approaches to glycoprotein assembly. Accounts of chemical research 34(9): 727-736.

Kiick, K.L., Saxon, E., Tirrell, D.A., e Bertozzi, C.R. 2002. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(1): 19-24.

Kim, D.H., Kim, M., e Kwon, H.J. 2003. Histone deacetylase in carcinogenesis and its inhibitors as anti-cancer agents. J. Biochem. Mol. Biol. 36(1): 110-119.

Koho, K.T. 1991. Em (ed. F.P.C. Ltd).

Lane, A.A. e Chabner, B.A. 2009. Histone deacetylase inhibitors in cancer therapy. J. Clin. Oncol. 27(32): 5459-5468.

Leder, A., Orkin, S., e Leder, P. 1975. Differentiation of erythroleukemic cells in the presence of inhibitors of DNA synthesis. Science 190(4217): 893-894.

Lemieux, G.A. e Bertozzi, C.R. 1998. Chemoselective ligation reactions with proteins, oligosaccharides and cells. Trends in biotechnology 16(12): 506-513.

Marks, P.A. 2010. The clinical development of histone deacetylase inhibitors as targeted anticancer drugs. Expert Opin. Investig. Drugs 19(9): 1049-1066.

Marks, P.A. e Breslow, R. 2007. Dimethyl sulfoxide to vorinostat: development of this histone deacetylase inhibitor as an anticancer drug. Nat. Biotechnol. 25 (1) : 84-90.

Masuoka, Y., Shin-Ya, K., Furihata, K., Nagai, K., Suzuki, K., Hayakawa, Y., and Seto, H. 2001. Phoenistatin, a new gene expression-enhancing substance produced by Acremonium fusigerum. J. Antibiot. (Tokyo) 54 (2) : 187-190.

Minucci, S. e Pelicci, P.G. 2006. Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic (and more) treatments for cancer. Nat. Rev. Cancer 6(1): 38-51. Nasveschuk, C.G., Ungermannova, D., Liu, X., e Phillips, A.J. 2008. A concise total synthesis of largazole, solution structure, and some preliminary structure activity relationships. Org. Lett. 10(16): 3595-3598.

Newkirk, T.L., Bowers, A.A., e Williams, R.M. 2009. Discovery, biological activity, synthesis and potential therapeutic utility of naturally occurring histone deacetylase inhibitors. Nat. Prod. Rep. 26(10): 1293-1320 .

Rautio, J., Kumpulainen, H., Heimbach, T., Oliyai, R., Oh, D., Jarvinen, T., e Savolainen, J. 2008. Prodrugs: design and clinical applications. Nat. Rev. Drug. Discov. 7(3): 255-270.

Sato, T., Friend, C., e De Harven, E. 1971. Ultrastructural changes in Friend erythroleukemia cells treated with dimethyl sulfoxide. Cancer Res. 31(10): 1402-1417.

Seiser, T., Kamena, F., e Cramer, N. 2008. Synthesis and biological activity of largazole and derivatives. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47(34): 6483-6485. Shigematsu, N., Ueda, H., Takase, S., Tanaka, H., Yamamoto, K., e Tada, T. 1994. FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum No. 968. II. Structure determination. J. Antibiot. (Tokyo) 47(3): 311-314. Somoza, J.R., Skene, R.J., Katz, B.A., Mol, C., Ho, J.D., Jennings, A.J., Luong, C., Arvai, A., Buggy, J.J., Chi, E., Tang, J., Sang, B.-C., Verner, E., Wynands, R., Leahy, E.M., Dougan, D.R., Snell, G., Navre, M., Knuth, M.W., Swanson, R.V., McRee, D.E., e Tari, L.W. 2004. Structural snapshots of human HDAC8 provide insights into the class I histone deacetylases. Structure 12(7): 1325-1334.

Taori, K., Paul, V.J., and Luesch, H. 2008. Structure and activity of largazole, a potent antiproliferative agent from the Floridian marine cyanobacterium Symploca sp. J. Am. Chem. Soc. 130(6): 1806-1807.

Ueda, H., Manda, T., Matsumoto, S., Mukumoto, S., Nishigaki, F., Kawamura, L, e Shimomura, K. 1994a. FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum No. 968. III. Antitumor activities on experimental tumors in mice. J. Antibiot. (Tokyo) 47(3): 315-323.

Ueda, H., Nakajima, H., Hori, Y., Goto, T., and Okuhara, M. 1994b. Action of FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum no. 968, on Ha-ras transformed NIH3T3 cells. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 58(9): 1579-1583.

Ungermannova, D. 2010. P27 as a Molecular Target for Cancer Therapeutics: Discovering Small Molecule Inhibitors of P27 Proteolysis and Structure-Activity Relationship and Mechanistic Studies of Largazole, A Potent Inhibitor of Histone Deacetylase. Ph.D. thesis. University of Colorado-Boulder, Boulder, CO, EUA Vannini, A., Volpari, C., Filocamo, G., Casavola, E.C., Brunetti, M., Renzoni, D., Chakravarty, P., Paolini, C., De Francesco, R., Gallinari, P., SteinkAkhler, C., e Di Marco, S. 2004. Crystal structure of a eukaryotic zinc-dependent histone deacetylase, human HDAC8, complexed with a hydroxamic acid inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(42): 15064-15069.

Manfred E. Wolff 1995. Burger's medicinal chemistry and drug discovery. 5th Edition. Volume 1: Principles and Practice. Manfred E. Wolff (ed.), Wiley-Interscience, Nova Iorque. 172-178, 931-932.

Ying, Y., Liu, Y., Byeon, S.R., Kim, H., Luesch, H., e Hong, J. 2008a. Synthesis and activity of largazole analogues with linker and macrocycle modification. Org. Lett. 10 (18) : 4021-4024.

Ying, Y., Taori, K., Kim, H., Hong, J., e Luesch, H. 2008b. Total synthesis and molecular target of largazole, a histone deacetylase inhibitor. J. Am. Chem. Soc. 130(26): 8455-8459.

Zeng, X., Yin, B., Hu, Z., Liao, C., Liu, J., Li, S., Li, Z., Nicklaus, M.C., Zhou, G., e Jiang, S. Total synthesis and biological evaluation of largazole and derivatives with promising selectivity for cancers cells. Org. Lett. 12(6): 1368-1371.

Tabela 1

Tabela 2. Inibição de Crescimento Celular GIso em Nm

Tabela 3 Resumo do Número de Genes Cujos Níveis de Expressão se Alteraram Para o Dobro Após Tratamento com os Produtos Químicos Indicados em Comparação com o DMSO de Controlo N° de Genes _Alteração para o dobro_

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto com a Fórmula (I)

I em que A seja arilo ou heteroarilo, opcionalmente substituído com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; Z seja — (CH2) nSRi2; Ri e R2 sejam independentemente H, halo, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou Ri e R2 em conjunto, ou um de entre Ri, R2 com Rg, formem um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que alquilo Ci-

Cio, cicloalquilo C3-C10 e heterocicloalquilo C3-C10 se encontram opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2PARA20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22 ; r3 e R4 sejam, independentemente, H, halo, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou R3 e R4 em conjunto, ou um de entre R3, R4 com Rio formem um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10 e heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, NCOR20R22, -CONR20R22, - S (O) mR2o; R5 e R6 sejam, independentemente, H, halo, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou R5 e R6 em conjunto, ou um de entre Rs, R6 com Rn, formem um cicloalquilo C3-C10 , heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10/ arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, —NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; R7 e Rs sejam, independentemente, H, halo, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou R7 e Rs formem em conjunto um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3- Cio, heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; Rg seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou em conjunto com um de Ri, R2 forme um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, hete-rocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10/ arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; Rio seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou em conjunto com um de R3, R4 forme um cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-Cio se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; Rn seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, ou em conjunto com um de R5, R6 forme um cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-Cs, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10 se encontrem opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo Ci-Cs, cicloalquilo C3-C8, heterocicloalquilo C3-C8, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, OR20, -NR20R22, -NCOR20R22, -CONR20R22; R12 seja independentemente H, alquilo C1-C10, -COR20, -CONR20R22, -OR20, -COOR20, -COCR20R22NR20R22, -SR20, -P(0) (OR24) 2; R20 e R22 sejam independentemente H, C1-C10 alquilo, C3-Ciocicloalquilo, C3-C10 heterocicloalquilo, arilo ou heteroarilo; R24 seja independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, Na, K ou Ca; n = 1-6; m = 1 ou 2; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que A seja um anel heteroarilo com 5 membros possuindo pelo menos um átomo de azoto.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que A seja um anel heteroarilo com 6 membros possuindo pelo menos um átomo de azoto.
4. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, representado pela Fórmula (II)

II em que R1-R12, R20, R22, R24, Z, m e n sejam tal como definidos na reivindicação 1; L e Q sejam independentemente S, 0, N ou CR26; e R26 seja independentemente H, halo, alquilo Ci-C10, cicloalquilo C3- Cio, heterocicloalquilo C3-C10, arilo ou heteroarilo, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3_ Cio , heterocicloalquilo C3-C10, arilo e heteroarilo estejam opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10 , cicloalquilo C3-C10 , heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -C00H, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCO- R20R22 e -CONR20R22; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4, em que A seja um oxazol ou tiazol.
6. Composto de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4 ou 5, em que Ri e R.2 sejam independentemente H, alquilo Ci-Cio, cicloalquilo C3-C10, ou Ri e R2 em conjunto formem cicloalquilo C3-C10; R3 e R4 sejam independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, ou R3 e R4 em conjunto formem cicloalquilo C3-C10; R5 e R6 sejam independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, ou Rs e R6 em conjunto formem cicloalquilo C3-C10; R7 e Rs sejam independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, ou Rs e R6 em conjunto formem cicloalquilo C3-C10; R9, Rio e Rn sejam independentemente H ou Ci-C10 alkyl; e R12 seja -COR20, em que R20 seja independentemente H ou alquilo C1-C10.
7. Composto de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4 a 6, seleccionado a partir de: octanotioato de S-(E)-4-((7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia-3, 6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3-enilo; etanotioato de S- (E)-4-((7S,10S)-7-isopropil-4,4-dimetil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia-3, 6,13,18-tetra-azabiciclo[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3- enilo; octanotioato de S-(E)-4-((7S,10S)-7-isopropil-2,5,8,12-tetra-oxo-9-oxa-16-tia-3,6,13, 18-tetra-azaspiro[biciclo[13.2.1]octadeca[1(17),15(18)]diene-4,1'-ciclopropano]-10-il)but-3-enilo; e octanotioato de S-(E)-4-((7S,10S)-4,4,7-trimetil-2,5, 8, 12-tetra-oxo-9,16-dioxa-3,6,13,18-tetraazabiciclo-[13.2.1]octadeca-1(17),15(18)-dien-10-il)but-3-enilo; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
8. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 3, representado pela Fórmula (III)

Ill em que R1-R12, R20, R22, R24, Z, m e n sejam tal como definidos na reivindicação 1; L, Q e Y sejam independentemente N ou CR26; e R26 seja independentemente H, halo, alquilo Ci-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo ou heteroarilo, em que o alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo e heteroarilo estejam opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados a partir de alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C3-C10, arilo, heteroarilo, halo, hidroxilo, -CN, -COOH, -CF3, -OCH2F, -OR20, -NR20R22, -NCOR20R22 θ -CONR20R22; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
9. Composto da reivindicação 8, em que

Ri e R2 sejam independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, ou Ri e R2 em conjunto formem um cicloalquilo C3-C10; R3 e R4 sejam independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, ou R3 e R4 em conjunto formem um cicloalquilo C3-C10; R5 e R6 sejam independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, ou R5 e R6 em conjunto formem um cicloalquilo C3-C10; R7 e R8 sejam independentemente H, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C10, ou R7 e Rs em conjunto formem um cicloalquilo C3-C10; R9, Rio e Rn sejam independentemente H ou alquilo C1-C10; e R12 seja -COR20, em que R20 seja independentemente H ou alquilo C1-C10.
10. Composto de qualquer uma das reivindicações 1, 3, 8 ou 9, o qual seja (7S,10S)-4,4-dimetil-10-[(1E)-4-(octanoilsulfanil)but-l-en-l-il]-7-(propan-2-il)-9-oxa- 3,6,13,19-tetra-azabiciclo[13.3.1]nonadeca-1(18) , 15(19) , 16 — trieno-2,5,8,12-tetra-ona; ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
11. Composto com a Fórmula (IV):

IV ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
12. Composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda um ou mais agentes anti-cancerigenos.
14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para uso no tratamento de uma doença mediada por uma enzima HDAC.
15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para uso como medicamento.