CN111269245B

CN111269245B - 一种环状氨基嘧啶衍生物及其抑制激酶的活性和用途

Info

Publication number: CN111269245B
Application number: CN201811474361.4A
Authority: CN
Inventors: 盛荣; 张冯敏; 罗瑾; 吴立军; 杨欢; 金泽武; 熊晓红; 钱扬
Original assignee: Hangzhou Hundred New Bio Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Hundred New Bio Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN111269245A

Abstract

一种环状氨基嘧啶衍生物及其抑制激酶的活性和用途本发明公开了一种环状氨基嘧啶衍生物，具有通式（Ⅰ）结构，其药学上可接受的盐、酯或溶剂化合物，所述衍生物能抑制激酶的活性，是多种激酶抑制剂，可更广泛地用于癌症的治疗，具有巨大的临床应用前景。

Description

一种环状氨基嘧啶衍生物及其抑制激酶的活性和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，一种环状氨基嘧啶衍生物及对激酶的抑制作用，还包括所述衍生物的制备方法及药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，为多种激酶抑制剂，具有治疗癌症的用途，应用前景巨大。

背景技术

癌症仍是人类健康的第一大杀手，据美国国立卫生院(NIH)统计，2012年，全球新发病例为1410万，癌症相关死亡人数为820万。2012年，57％的新增癌症病例发生在世界欠发达地区，包括中美洲和非洲及亚洲部分地区， 65％的癌症死亡也发生在这些地区。仅2018年，癌症新增病例就超过170万人次，到2030年，预计每年新发癌症病例数将增加到2360万。

我们已经知道，细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase，CDK)，属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族，是参与细胞周期调节的关键激酶。目前已报道有20个不同的CDK，它们都含有一段PSTAIRE的同源序列，并通过该序列与相应的调节亚基~细胞周期蛋白(cyclin)结合形成有活性的异源二聚体，参与转录、代谢、神经分化和发育等生理过程。

周期蛋白依赖性激酶CDK4/6是细胞周期的关键调节因子，通过与细胞周期蛋白D(cyclin D)形成复合物，可磷酸化视网膜母细胞瘤基因(Rb)继而释放转录因子E2F，促进细胞周期相关基因的转录，使细胞进入S期。

CDK4/6抑制剂有效地阻滞肿瘤细胞从G1期进展到S期。在雌激素受体阳性(ER＋)乳腺癌中，CDK4/6会过度表达，导致细胞增殖失控，演变成恶性肿瘤。CDK4/6和ER信号双重抑制具有协同作用，并能够抑制G1期ER+乳腺癌细胞的生长，恢复细胞周期控制，阻断肿瘤细胞增殖。

乳腺癌，因为高发病率和预后效果差，成为了女性第一杀手。2018年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据，此数据源于2017年全国肿瘤登记中心收集汇总的全国31省、市自治区肿瘤登记处2014年的恶性肿瘤登记资料。其中，乳腺癌目前已经成为了女性发病率最高的肿瘤。大约83%的乳腺癌患者呈现HR阳性，HR+/HER2-晚期乳腺癌是最常见的晚期乳腺癌之一，全球每年新确诊患者大约为 22 万例。

目前，FDA已经批准了三个CDK4/6抑制剂，用于激素受体阴性/人类表皮生长因子受体2阴性(HR-/HER2-)乳腺癌的治疗。还有很多新的CDK4/6抑制剂处于临床研究中。

Trk是一类神经生长因子激活的酪氨酸激酶家族，包括TrkA、TrkB和TrkC 3个个亚型，分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码。Trk激酶被磷酸化后，能够激活下游信号分子，从而起到调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等作用。NTRK基因可以与其它基因发生融合，导致Trk激酶的高表达或者Trk激酶活性持续升高，最终可能引起癌症的发生。2018年11月26日，美国食品和药物管理局（FDA）批准TRK抑制剂Vitrakvi ®（larotrectinib）上市，用于治疗成人和小儿具有神经营养受体酪氨酸激酶（治疗NTRK）基因融合的实体瘤治疗。Vitrakvi是FDA批准的第一个不区分肿瘤来源用于初始治疗的方法，对于年龄为4个月至76岁的患者，针对17种不同癌症治疗总体应答率为75％，这无疑是最振奋人心的好消息！说明新的化合物、新的研究成果永远值得期待。

化合物1 化合物2

文献WO2010075074A1、CN 105294683A公开了化合物1和化合物2的结构，一种CDK4、CDK6抑制剂。

2017年9月，美国FDA批准了礼来公司的Verzenio（Abemaciclib）上市，主要用于治疗接受内分泌疗法后疾病进展的激素受体（HR）阳性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）阴性的晚期或转移性乳腺癌成年患者。Abemaciclib的化合物专利为WO2010075074A1。

化合物3 化合物4

文献CN106687454A公开了化合物3和化合物4的结构，一种CDK4、CDK6抑制剂。

大环结构是一类具有激酶抑制生物活性的结构，其中在周期蛋白依赖性激酶中的活性也被广泛报道。

化合物5 化合物6

如文献W02004078682报道了一系列类似于化合物5结构的大环化合物，该类化合物具有良好的CDKs抑制活性，尤其是CDK2和CDK5活性。

文献W02018177889公开化合吴物6的结构，此类大环具有良好的选择性抑制CDK9活性。

虽然大环化合物在泛CDKs活性中报道较多，但选择性抑制CDK4/6活性的结构尚未报道，基于此，我们设计了一种新型的可以选择性抑制CDK4/6的大环结构。

值得关注的是本发明所述的环状氨基嘧啶衍生物，不仅显示出优良的抑制CDK4、CDK6活性，还具有抑制ALK、ROS1、TrkA、TrkB激酶活性作用，是多种激酶的抑制剂，作用广泛，因此具有巨大的临床应用价值。

发明内容

一种环状氨基嘧啶衍生物，或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化合物，具有通式（Ⅰ）的结构：

通式（I）

其中：

X选自-CH-、-NHCO-、-O-或-CO-；

W选自-CH₂-、-CH=CH-、-O-、-CHCH₃-、-CHOH-、-CO-、-NH-、-NHCO-

或-CONH-；

V选自-O-、-NHCO-或-NH-；

m1，m2分别独立选自0或1；

n1， n2 分别独立选自0、l 、2、3或4；

Y，Z选自N和CH；当Y是N时，Z是CH；当Y是CH时，Z是N或CH；

U选自N或CH；

R₁选自H、F、Cl、Br、CF₃，CHF_2，C₁-C₆烷基；当Z是N时，R₁是H、CF₃、CHF₂

或C₁-C₆烷基；

R₂，R₃，R₄取自H、F、Cl、Br、C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基、C₁-C₆烷氧基、CF₃

或CHF₂；

R₅取自氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₃-C₈环烷基、-NR₆R₇、

；

其中：

R₆,R₇分别独立选自C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基或C₁-C₆烷氧基；

R₈选自单键、C₁-C₃烷基或-CO-；

R₉选自H、-COCH₂CH₂OH、-NHCOCH₃、-CONHCH₃、 C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基或-NR₁₀R₁₁，其中R₁₀、R₁₁选自甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基；

或者，R₄和R₅与其直接相连的基团一起形成5-8元杂环基或5-10元杂芳基，

任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、羟基, C_l-C₈烷基, C₃-C₈环烷基, C_l-C₈烷氧基所取代；包括但不限于如下结构：

。

本发明所述的C₁-C₆烷基，其特征为含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2.2-二甲基丙基或正己基

所述C₃-C₈环烷基含有3-8个碳原子的单环或双环烷基，包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

所述的C₁-C₆烷氧基含有1-6个碳原子通过氧原子相连的直链或支链烷基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、2.2-二甲基丙氧基或正己氧基。

本发明所述的环状氨基嘧啶衍生物，其游离碱可与2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸和对甲苯磺酸中的一种成盐。

其中，当Y是N，Z是C时，本发明所述的环状氨基嘧啶衍生物为A1、B1结构通式中的一种，或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化合物。

式中V、W、X、U、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、m1、m2、n1、n2如前所述。

当Y是C，Z是N时，本发明所述的环状氨基嘧啶衍生物为A2、B2结构通式中的一种，或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化合物。

当Y，Z都是C时，本发明所述的环状氨基嘧啶衍生物为A3、B3结构通式中的一种，或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化合物。

环状氨基嘧啶衍生物是多种激酶抑制剂，对CDK4、CDK6、 ALK、ROS1、TrkA、TrkB激酶活性有很强的抑制作用，对癌细胞增殖有优秀的抑制作用，可用于治疗乳腺癌、肺癌、肠癌、小细胞肺癌、黑色素癌、胶质瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、急性髓性白血病和慢性髓性白血病。

本发明所述的环状氨基嘧啶衍生物是多种激酶抑制剂，具有巨大的临床应用价值，同时，所述的环状氨基嘧啶衍生物合成路线新颖，并且安全、环保，生产可行性好。

具体实施例

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但不是用其以任何方式来对本发明进行限制。

实施例1

化合物T-1的合成。

化合物T-1：(E)-4⁴-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-1⁴,2⁵-二氟-1²-甲基-1¹ H-5-氧杂-3-氮杂-1(6,1)-苯并[d]咪唑-2(4,2)-嘧啶-4(1,3)-苯并环十一烷-8-烯是按如下所示的一般操作合成的：

Scheme 1 T-1合成路线。

步骤1：4 -(1-(3-丁烯-1-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)-N-(3-(3-丁烯-1-氧基)- 4-( (4-乙基哌嗪-1-基)甲基)苯基)-5-氟嘧啶-2-胺 (1)的合成。

中间体Z-1 (0.27 g, 0.8 mmol)，W1-1 (0.29 g, 1.0 mmol), 碳酸铯（0.52 g,1.6 mmol）, 4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos, 0.093 g, 0.16 mmol)溶于10 mL 1,4-二氧六环中, 置换氮气三次，加入Pd₂(dba)₃, 升温至90℃反应3小时，将反应液倒入30 mL水中乙酸乙酯萃取（20 mL x 2），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱分离纯化（洗脱剂：二氯甲烷：甲醇=100:1-50:1），得到黄色油状物1（290 mg, 62%）。MS（m/ z）：588.0 [M+H ]⁺，¹H NMR(400MHz, CDCl₃): 8.35 (d, J=3.7Hz, 1H), 7.92-7.86 (m, 2H), 7.55 (d, J=1.7, Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.18 (s,1H), 7.01-6.99 (dd, J=2.0, 8.0 Hz, 1H), 5.98-5.73 (m, 2H), 5.18-5.04 (m, 4H),4,25 (t, J=7.1 Hz, 2H), 4.10 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.59 (s, 2H), 2.67-2.42(m,17H), 1.08 (t, J=7.1 Hz , 3H)。

步骤2: (E)-4⁴-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-1⁴,2⁵-二氟-1²-甲基-1¹ H-5-氧杂-3-氮杂-1(6,1)-苯并[d]咪唑-2(4,2)-嘧啶-4(1,3)-苯并环十一烷-8-烯 (T-1)的合成。

化合物1（59 mg, 0.1 mmol），三氟乙酸（TFA, 57 mg, 0.5 mmol）溶于10 mL DCM中，加入Grubbs 2^nd catalyst (8 mg, 0.1 mmol), 50℃反应过夜，将反应液旋干，制备硅胶板分离纯化，得到灰色固体T-1(20 mg, 36%)。MS（m/ z）：560.0 [M+H ]⁺，¹H NMR(400MHz, CDCl₃): 8.43 (s, 1H), 8.37 (d, J=2.6 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.50(d,J=11.8 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.46-6.44 (m, 1H), 5.20-5.12 (m,1H, J=12.4 Hz), 4.78-4.69 (m, 1H,J=12.4 Hz), 4,11 (t, J=5.6 Hz, 2H), 3.85 (t,J=5.3 Hz, 2H), 3.58 (s, 2H), 2.61-2.38(m, 17H), 1.05 (m, 3H)。

中间体Z-1：1-（3-丁烯-1-基）-2-甲基-4-氟-6-（2-氯-5-氟嘧啶-4-基）-1H-苯并[d]咪唑按如下所示的一般操作合成的：

。

步骤1：N' -（4-溴-2,6-二氟苯基）乙脒（4）的合成。

4-溴-2,6-二氟苯胺,（2, 10g, 48 mmol）乙酰胺（3, 14.2 g，240 mmol）、三氯氧磷（14.7 g, 96 mmol）溶于二氧六环（200 mL）中，常温搅拌0.5小时。滴加入三乙胺（4.9 g,48 mmol）的二氧六环溶液（20 mL），滴加完毕，移至油浴锅中，90℃加热，反应3小时。将反应液冷却至室温后，过滤，二氧六环洗涤滤饼，滤饼倒入200 mL水中，加乙酸乙酯，充分混合后分液，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（100 mL）洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到固体4（9.8 g, 82%）。MS（m/z）：248.9 [M+H]⁺。

步骤2：2-甲基-4-氟-6-溴-1H-苯并[d]咪唑（5）的合成。

N' -（4-溴-2,6-二氟苯基）乙脒（4，9.8 g，39.3 mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF, 150 mL）中，加入碳酸铯（64.0 g, 196.5 mmol），加热至150℃，反应过夜。将反应液冷却至室温后倒入200 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到化合物5（7.8g，92%）。MS（m/z）：228.9[M+H]⁺。

步骤3：1-（3-丁烯-1-基）-2-甲基-4-氟6-溴-1H-苯并[d]咪唑（7）的合成。

化合物5（7.8g,34.1 mmol）、4-溴-1-丁烯（6，5.5 g, 40.9 mmol）、碳酸钾（9.4 g,68.2 mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF, 80 mL），40℃加热搅拌，反应3 h，冷却。将反应液冷却至室温后倒入100 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到化合物7（7.2 g, 75%）。MS（m/z）：283.0[M+H]⁺。

步骤4：1-（3-丁烯-1-基）-2-甲基-4-氟-6-硼酸频哪醇酯-1H-苯并[d]咪唑（8）的合成。

化合物7（7.20 g, 25.4 mmol）、双联硼酸频那醇酯（B₂(pin)₂, 9.68 g, 38.1mmol）、三环己基膦（1.21 g, 4.3 mmol）、醋酸钾（7.48 g, 76.2 mmol）溶于1,4-二氧六环（60 mL）中，氮气保护下，加入醋酸钯（Pd(AcO)₂, 0.56 g, 2.5 mmol），升温至80℃反应2小时。将反应液冷却至室温后，倒入60 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（50 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇300:1-100:1），得到固体8 (3.3 g, 40%）。MS（m/z）：331.2 [M+H]⁺。

步骤5：1-（3-丁烯-1-基）-2-甲基-4-氟-6-（2-氯-5-氟嘧啶-4-基）-1H-苯并[d]咪唑（Z-1）的合成。

2,4-二氯-5-氟嘧啶（9，2.5 g, 15 mmol），碳酸钠（2.7 g, 25 mmol）溶于1,4-二氧六环/水（30 mL/6 mL）中，氮气保护下加入双三苯基膦二氯化钯（Pd(PPh₃)₂Cl₂, 0.21 g,0.3 mmol）, 升温至80℃，滴加8（3.3 g, 10.0 mmol）的1,4-二氧六环溶液（30 mL）。80℃反应4小时，将反应液冷却至室温后，倒入60 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（50 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇300:1-200:1），得到化合物Z-1（2.8 g, 84%）。MS（m/z）：335.1[M+H]⁺。

侧链W1-1:3-(3-丁烯-1-氧基) -4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-苯胺按如下所示的一般操作合成的：

。

步骤1: 2-(3-丁烯-1-氧基)-4-硝基苯甲酸-3-丁烯-1-酯（11）合成。

4-硝基水杨酸（10, 1.8 g, 10 mmol）, 碳酸钾(4.2 g, 30 mmo) 溶于20 mL DMF中，搅拌10 min, 缓慢加入4-溴丁烯（6, 3.4 g, 25 mmol），40℃反应8小时，停止反应，将反应液倒入50mL水中，乙酸乙酯萃取两次（20 mL x 2）,合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干得到黄色固体11 (2.6 g, 90%)。

步骤2：2-(3-丁烯-1-氧基)-4-硝基苯甲酸（12）的合成。

化合物11（2.6 g, 10 mmol）溶于40mL乙醇/水（1:1）溶液中，加入KOH (0.8 g, 15mmol),室温搅拌3小时。将反应液旋干，用20 mL水溶解，稀盐酸调节PH至3-4，过滤得到黄色固体12（2.0 g, 83%）。

步骤3：（2-(3-丁烯-1-氧基)-4-硝基苯基）-（4-乙基哌嗪-1-基）甲酮（14）的合成。

化合物12 (2.4 g, 10 mmol)，羰基二咪唑（CDI, 1.6 g, 1.01 mmol）溶于30 mLDMF中，70℃反应至原料反应完全，放置室温，加入5 mL乙基哌嗪（13, 1.3 g 1.1 mmol）DMF溶液, 室温反应3小时，将反应液倒入80 mL水中, EA萃取（20 mL x 2）干燥旋干，得到黄色油状物14（3.1 g，94%）。MS（m/ z）：334.2[M+H]⁺。

步骤4：2-(3-丁烯-1-氧基)-4-氨基苯基）-（4-乙基哌嗪-1-基）甲酮（15）的合成。

化合物14 (2.9 g, 8.7 mmol)溶于30mL乙醇/水（3:1）溶液中，加入Fe (3.4 g,60 mmol)和NH₄Cl (0.84 g, 16 mmol), 80℃反应2小时，将反应液过滤，乙醇洗涤滤渣，旋干溶剂，加30mL水溶解，碳酸钾调节PH至弱碱性，乙酸乙酯萃取（30mL x 3）,合并有机相，饱和食盐水洗涤，干燥旋干得到黄色油状物15 (1.9 g, 72%)。MS（m/ z）：304.2[M+H]⁺。

步骤4：3-(3-丁烯-1-氧基) -4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-苯胺（W1-1）的合成。

化合物15 (1.4 g, 4.5 mmol)溶于100mL无水THF中，-10℃环境中，缓慢加入LiAlH₄ (0.44 g, 11.3 mmol),加料完成后，升温至70℃回流5小时，将反应液置于冰浴中，缓慢加水（50 mL）淬灭,乙酸乙酯萃取（40 mL x 3），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后用硅胶柱分离纯化（洗脱剂:二氯甲烷:甲醇=100:1-10:1），得到黄色油状物W1-1（0.6 g，38%）。MS（m/ z）：290.2[M+H]⁺。

化合物T-2的合成。

化合物T-2：(E)-1⁴,2⁵-1²-甲基-1¹ H-5-氧杂-3-氮杂-1(6,1)-苯并[d]咪唑-2(4,2)-嘧啶-4(1,2)-苯并环十三碳烷-10-烯。

按如下所示路线合成：

。

参照实施例1合成方法，得到黄色固体T-2，MS（m/ z）：463.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz, CDCl₃): 8.59 (d, J=3.7 Hz, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.07 (d,J=4.8 Hz, 2H), 7.75 (d, J=11.6, Hz, 1H), 7.20 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.04-7.00(m, 1H), 5.84-5.77 (m, 1H，J=14.6 Hz), 5.60-5.53 (m, 1H, J=14.9 Hz), 4,25 (t,J=6.8 Hz, 2H), 4.15 (t, J=5.0 Hz, 2H), 2.69 (s, 3H), 2.59-2.54 (m, 2H), 2.28-2.23(m, 2H), 1.94-1.84 (m, 4H)。

侧链W2-1合成路线：

步骤1：3-（3-己烯-1-氧基）-2-硝基吡啶(19)的合成。

3-羟基-2-硝基吡啶（17, 2.0 g, 14.3 mmol）、6-溴-1-己烯（18, 2.8 g, 17.2mmol）、碳酸钾（3.9 g, 28.6 mmol）溶于20 mL DMF，40℃加热搅拌，反应4 h，将反应液冷却至室温后，倒入20 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（20 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到化合物19（2.6 g, 76%）。MS（m/z）：223.2[M+H]⁺。

步骤2：3-（5-己烯-1-氧基）-2-氨基吡啶(W2-1)的合成。

化合物19 (2.6 g, 10.8 mmol)溶于醋酸（6.4 g, 108 mmol），常温搅拌，缓慢加入锌粉（3.5 g, 54 mmol），反应0.5h，过滤，浓缩，加入碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（20 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到化合物W2-1（2.0 g, 90%）。MS（m/z）：193.1[M+H]⁺。

实施例3：

化合物T-3的合成。

化合物T-3：(E)-4⁵-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-1⁴,2⁵-二氟-1²-甲基-1¹ H-5-氧杂-3-氮杂-1 (6, 1)-苯并[d]咪唑-2 (4, 2)-嘧啶-4 (2, 4)-吡啶并环十一烷-8-烯是按如下所示的：

。

参照实施例1合成方法，得到黄色固体T-3，MS（m/ z）：561.3[M+H]⁺。

侧链W3-1合成路线：

步骤1：(4,6-二氯吡啶-3-基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮 (22)的合成。

4，6-二氯烟酸（21, 3.8 g, 20 mmol）溶于100 mL 甲苯中，加入3 mL二氯亚砜，100℃反应5小时，旋干溶剂，溶于DCM中，-10℃条件下滴加入乙基哌嗪 (13, 2.3 g, 20mmol), 三乙胺（2.0 g, 20 mmol）的DCM反应液中，反应1小时，旋干溶剂，50 mL EA溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干得到黄色固体22（5.1 g，89%）。MS（m/z）：288.1 [M+H]⁺。

步骤2：(4-(3-丁烯-1-氧基)-6-氯吡啶-3-基)（4-乙基哌嗪-1-基）甲酮24的合成。

化合物22（5.0 g, 17 mmol）,溶于100 mL 四氢呋喃中，室温缓慢加入NaH (2.0g, 8.5 mmol), 搅拌后加入3-丁烯-1-醇（23，1.8 g, 25.5 mmol）,室温反应5小时。缓慢加水淬灭，加乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，得到黄色油状物24(4.5 g, 82%)。MS（m/z）：324.1 [M+H]⁺。

步骤3：(6-氨基-4-(3-丁烯-1-氧基)吡啶-3-基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮26的合成。

化合物24（4.5 g, 14 mmol），二苯甲酮亚胺（25, 3.8 g, 21 mmol）,BINAP(1.7g, 2.8 mmol), 叔丁醇钾(2.4 g, 21 mmol)溶于100 mL甲苯中，氮气置换三次，加入醋酸钯(0.6 g, 2.8 mmol),氮气置换两次，110℃反应3小时，旋干溶剂。100 mL无水甲醇溶解，加入盐酸羟胺(2.0 g, 29.4 mmol), 醋酸钾(2.7 g, 28 mmol),室温搅拌过夜。次日旋干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶纯化，得到黄色油状物26（2.9 g, 68%）。MS（m/z）：305.2 [M+H]⁺。

步骤4：4(3-丁烯-1-氧基)- 5 –(4 -乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺(W3-1)的合成。

化合物26（1.5 g, 5 mmol）溶于50 mL无水四氢呋喃中，-10℃环境下，缓慢加入氢化铝锂(0.28 g 7.5 mmol)后，转至60℃反应2小时，将反应液置于-10摄氏度环境中，缓慢加入10%氢氧化钠水溶液淬灭，加水稀释过滤，旋干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶纯化，得到黄色油状物W3-1(1.2 g, 83%) 。MS（m/z）：291.2 [M+H]⁺。

按照实施例1-实施例3的合成方法还可以合成以下T-4到T-26的化合物：

T-25		MS (m/z) 613.3 [M+H]<sup>+</sup>
			T-26		MS (m/z) 520.2 [M+H]<sup>+</sup>

实施例4:

T-27的合成。

化合物T-27：(1³ Z,1⁴ E,10E)--1⁷,2⁵-二氟-1²-甲基-4⁴-((4-乙基哌嗪-1-基)-甲基-)-1² H-5-氧杂-3-氮杂-1(5,3)-吲唑-2(4,2)-嘧啶-4(1,3)-苯并环十二烷-10-烯是按如下所示的一般操作合成的：

Scheme 8 T-27的合成路线。

步骤1：(E)-N-(3-((6-溴-5-己烯-1-基)氧基) 4-( (4-乙基哌嗪-1-基)甲基)苯基)-5-氟-4-(7-氟-3-碘-2-甲基-2H-吲唑-5-基)嘧啶-2-胺 (27)的合成。

中间体Z-2 (0.32 g, 0.8 mmol)，W1-2 (0.4 g, 1.0 mmol), 碳酸铯 (0.52 g,1.6 mmol), Xantphos (0.093 g, 0.16 mmol)溶于10 mL 1,4-二氧六环中, 置换氮气三次，加入Pd₂(dba)₃, 升温至90℃反应3小时，将反应液倒入30 mL水中乙酸乙酯萃取（20 mLx 2），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱分离纯化（洗脱剂：二氯甲烷：甲醇=100:1-50:1），得到黄色油状物27（310 mg, 52%）。MS（m/ z）：766.1 [M+H ]⁺。

步骤2: (E)-5-氟-4-(7-氟-3-碘-2-甲基-2H-吲唑-5-基)-N-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-3-((6-硼酸频哪醇酯-5-己烯-1-基)氧基)苯基)嘧啶-2-胺(28)的合成。

化合物27 (300 mg, 0.4 mmol)，双联硼酸频那醇酯(B₂(pin)₂, 406 mg, 1.6mmol)、碳酸钠(63 mg, 0.6 mmol)溶于10 mL 1,4-二氧六环溶液中，氮气保护下，加入[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(Pd(dppf)Cl₂, 33 mg, 0.04 mmol), 升温至80℃反应5小时。将反应液冷却至室温后，倒入30 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（10 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化（洗脱剂：二氯甲烷/甲醇300:1-100:1），得到固体28 (240 mg, 74%）。MS（m/z）：814.3 [M+H]⁺。

步骤3：(1³ Z,1⁴ E,10E)- -1⁷,2⁵-二氟-1²-甲基-4⁴-((4-乙基哌嗪-1-基)-甲基-)-1² H-5-氧杂-3-氮杂-1(5,3)-吲唑-2(4,2)-嘧啶-4(1,3)-苯并环十二烷-10-烯（T-27）的合成。

化合物28（81 mg, 0.1 mmol），碳酸钠（27 mg, 0.25 mmol）溶于1,4-二氧六环/水（5mL/1 mL）中，氮气保护下加入Pd(PPh₃)₂Cl₂（2 mg, 0.003 mmol）, 升温至80℃反应5小时，将反应液冷却至室温后，倒入20 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（20 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化，得到化合物T-27（40mg, 71%）。MS（m/z）：560.2[M+H]⁺。

中间体Z-2：5 -(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-3-碘-2-甲基-2H-吲唑按如下所示的一般操作合成的：

。

步骤1：2,3-二氟-5-溴苯甲醛（30）的合成。

2,3-二氟-苯甲醛(29, 14.2 g, 100 mmol)溶于54 mL浓硫酸（18.4 mol/L, 1mol）中，分批加入N-溴代琥珀酰亚胺 (NBS, 21.3 g, 120 mmol), 室温反应过夜，将反应液倒入200 mL水中, 石油醚萃取三次（50 mL x 3）,合并有机相，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水各洗涤一次，干燥浓缩过柱，得到无色液体30（10.3 g, 47%）。MS（m/z）：221.0 [M+H]⁺。

步骤2：(反式)-5-溴-2,3-二氟苯甲醛-氧-甲基肟（31）的合成。

化合物30（7.2 g，32 mmol），氧甲基羟胺（3.2 g, 38 mmol），碳酸钾（5.3g, 38mmol）溶于150 mL THF中，40℃反应4小时。旋干溶剂，得到白色固体31（7.3 g，91%）。直接投下步反应。

步骤3：5-溴-7-氟-2H-吲唑（32）的合成。

化合物31（7.0 g, 28 mmol）、水合肼（10.1 g, 2 mol）溶于250 mL 二氧六环中，90℃反应过夜，旋干溶剂，得到白色固体，DCM洗涤，得到白色固体32（3.7 g, 62%）。MS（m/z）：215.0[M+H]⁺。

步骤4：2-甲基-5-溴-7-氟-2H-吲唑（33）的合成。

化合物32（3.2 g, 15 mmol）、碳酸钾(2.5 g, 18 mmol)溶于50 mL DMF中，搅拌下加入碘甲烷（2.5 g, 18 mmol），室温反应5小时。将反应液，倒入100 mL水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化得到黄色固体33(2.2 g, 65%）。MS（m/z）：229.2 [M+H]⁺。

步骤5：2-甲基-3-碘-5-溴-7-氟-2H-吲唑（34）的合成。

化合物33（2.0 g, 7 mmol），二(三氟乙酰氧基)碘代苯（PIFA, 3.6 g, 8.4mmol）,吡啶（0.8 g, 10.5 mmol）溶于50 mL DCM中，室温搅拌3小时，加入碘（1.1 g, 8.4mmol）,搅拌过夜，过滤，二氯甲烷洗涤滤渣，得到白色固体34（1.5 g, 60%）。MS（m/z）：355.0[M+H]⁺。

步骤6：2-甲基-3-碘-5-硼酸频哪醇酯-7-氟2H-吲唑（35）的合成。

化合物34（1.4 g, 4 mmol）、双联硼酸频那醇酯（B₂(pin)₂, 1.5 g, 6 mmol）、三环己基膦（0.21 g, 0.75 mmol）、醋酸钾（0.82 g, 6 mmol）溶于1,4-二氧六环（10 mL）中，氮气保护下，加入醋酸钯（Pd(AcO)₂, 90 mg, 0.4 mmol），升温至80℃反应2小时。将反应液冷却至室温后，倒入30 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（10 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化，得到固体35(1.5 g, 94%）。MS（m/z）：403.0 [M+H]⁺。

步骤7：2-甲基-3-碘-5-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-2H-吲唑（Z-2）的合成。

2,4-二氯-5-氟嘧啶（9，0.75 g, 4.5 mmol），碳酸钠（0.8 g, 7.5mmol）溶于1,4-二氧六环/水（10 mL/2 mL）中，氮气保护下加入双三苯基膦二氯化钯（Pd(PPh₃)₂Cl₂, 0.07g, 0.1 mmol）, 升温至80℃，滴加35（1.2 g, 3 mmol）的1,4-二氧六环溶液（5 mL）。80℃反应4小时，将反应液冷却至室温后，倒入30 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（10 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化，得到化合物Z-2（0.9 g, 74%）。MS（m/z）：407.2[M+H]⁺。

化合物W1-2合成参考W1-1的合成。MS（m/z）：396.0[M+H]⁺。

按照实施例4的合成方法还可以合成以下T-28到T-37的化合物：

实施例5

T-38 的合成。

化合物T-38： (E)-4⁴-((4-乙基哌嗪-1-基)-甲基-)-1⁷,2⁵-二氟-1²-甲基—1¹ H-5-氧杂-3-氮杂-1(5,3)-吲哚-2(4,2)-嘧啶-4(1,3)-苯并环十二烷-10-烯；

按如下所示合成：

。

参照实施例4的合成路线，可以得到化合物T-38 MS（m/z）：559.7[M+H]⁺。

中间体Z-3：2-甲基-3 -碘-5-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-1H-吲哚按如下所示的一般操作合成的：

。

步骤1：2-甲基-3-碘-5-硼酸频哪醇酯-7-氟-1H-吲哚（39）的合成。

2-甲基-3-碘-5-溴-7-氟-1H-吲哚（38, 3.5 g, 10 mmol）、双联硼酸频那醇酯（B₂(pin)₂, 3.8 g, 15 mmol）、三环己基膦（0.48 g, 1.7 mmol）、醋酸钾（2.1 g, 15 mmol）溶于1,4-二氧六环（50 mL）中，氮气保护下，加入醋酸钯（Pd(AcO)₂, 0.22 g, 1.0 mmol），升温至80℃反应2小时。将反应液冷却至室温后，倒入100 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（40 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化，得到固体39(3.2 g, 80%）。MS（m/z）：402.0 [M+H]⁺。

步骤2：2-甲基-3-碘-5-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-1H-吲哚（Z-3）的合成。

2,4-二氯-5-氟嘧啶（9, 1.25 g, 7.5 mmol），碳酸钠（1.73 g, 12.5 mmol）溶于1,4-二氧六环/水（30mL/6mL）中，氮气保护下加入双三苯基膦二氯化钯（Pd(PPh₃)₂Cl₂,0.11 g, 0.15 mmol）, 升温至80℃，滴加39（2.0 g, 5 mmol）的1,4-二氧六环溶液（10mL）。80℃反应4小时，将反应液冷却至室温后，倒入50 mL水中，乙酸乙酯萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水（30 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后用硅胶柱分离纯化，得到化合物Z-3（1.6 g, 79%）。MS（m/z）：405.6[M+H]⁺。

按照实施例5的合成方法还可以合成以下的化合物:T-39到T-44：

实施例6 化合物对CDK4、CDK6激酶的抑制作用。

将本发明所述化合物用DMSO溶解制成原溶液。取20μL原溶液用60μL DMSO的比例稀释10个浓度的化合物。将100μL DMSO加到两个空孔中，作为无化合物对照和无酶对照组。准备一张中间板，取10μL的不同浓度的样品溶液加入中间板中，用激酶缓冲液稀释至10倍，充分振荡混匀。取5μL中间板中的溶液加入384孔板中。

将适量的CDK4、CDK6激酶分别用缓冲液稀释成终浓度的2.5倍，将荧光标记肽和ATP用1×激酶缓冲液稀释成终浓度的2.5倍。

将稀释后的激酶10μL和不同的样品溶液5μL混合，室温孵育后。向反应体系中加入稀释后的10μL荧光标记肽和ATP，室温孵育30min。加入终止试验缓冲液25μL。利用酶标仪检测荧光强度（发射波长：445nm和520nm，激发波长：400nm）。计算公式：抑制率（%）=[（无化合物孔对照值-样本值）/（无化合物孔对照值-无酶对照值）]*100%，并用Graphpad PrismV5.0软件得到IC₅₀值。

本发明化合物对CDK4， CDK6激酶的抑制活性如下表所示：

本发明化合物对CDK4、CDK6活性的抑制率

说明：a表示抑制激酶的活性IC₅₀值小于50nM；

b表示抑制激酶K的活性IC₅₀值大于等于50nM，小于100nM；

c表示抑制激酶的活性IC₅₀值大于等于100nM，小于150nM。

本发明化合物对细胞周期蛋白激酶CDK4、CDK6具有很好的抑制作用，对CDK4的作用更强。

实施例7 化合物对ALK、ROS1、Trk激酶的抑制作用。

采用Cisbio Bioassays公司的HTRF试剂盒进行ALK、ROS1、Trk激酶活性生化分析。将待测化合物用DMSO溶解，并稀释成不同的浓度梯度。激酶混合物用激酶缓冲液进行稀释，并添加MgCl₂，DTT，和SEB。在384孔板中每孔加入5.0μL ALK（或ROS1, TrkA, TrkB）激酶，1.0μL不同浓度的待测化合物的溶液或空白激酶缓冲液，5.0μL TK Substrate-biotin/ATP的混合液。室温孵育30分钟。添加反应终止液，室温孵育60分钟。

在Tecan Spark酶标仪上读取信号（延迟时间100μs，采集时间300μs，330nm激发光，620nm和665nm发射光）。酶活力抑制率＝（酶对照组平均比值-加药组比值）/（酶对照组平均比值-空白对照组平均比值）×100%。使用GraphPad PRISM5计算IC₅₀值：

本发明化合物对ALK、 ROS1、 TrkA和 TrkB活性的抑制率

说明：a表示抑制的活性IC₅₀值小于10 nM；

b表示抑制的活性IC₅₀值大于等于10 nM，小于50nM；

c表示抑制的活性IC₅₀值大于等于50 nM，小于100nM；

d表示抑制的活性IC₅₀值大于等于100nM，小于250nM。

本发明化合物对ALK、ROS1、TrkA、TrkB激酶具有很好的抑制作用，并对TrkA、TrkB激酶的的抑制作用更强。

实施例8 化合物抑制肿瘤细胞增殖实验。

取对数生长期的细胞，常规消化后制成 2×10⁴/mL的细胞悬液，加入96孔板中，每孔100μL。培养12 h待细胞贴壁，加入不同浓度的待测化合物，化合物的浓度梯度为10000，1000，100，10，1，0.1nM。化合物与细胞共培养72h后，使用CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒（Promega）来评价细胞增值情况。每孔加入100μL CellTiter-Glo试剂，摇板10min，待细胞裂解后，用Tecan Spark型酶标仪检测萤光信号。细胞的抑制率（%）=（对照组-试验组OD值）/（对照组-空白组 OD值）×100 %。

IC₅₀值采用Graphpad Prism V5.0软件计算得出，结果见下表：

本发明化合物对不同癌细胞的抑制作用

说明：++++符号代表IC₅₀值小于50nM；

+++符号代表IC₅₀值大于等于50nM，小于等于100nM；

++符号代表IC₅₀值大于等于100nM，小于等于250nM；

+符号代表IC₅₀值大于等于250nM，小于等于500nM。

本发明化合物对MCF-7、NCI-H358、HCC78、KM-12和K299癌细胞增殖有很强的抑制作用。