PT2440241T

PT2440241T - Polipéptidos de hormona do crescimento e métodos de preparação e utilização dos mesmos

Info

Publication number: PT2440241T
Application number: PT107867251T
Authority: PT
Inventors: Schellenberger Volker; Silverman Joshua; Wang Chia-Wei; Spink Benjamin; Geething Nathan; P Stemmer Willem; L Cleland Jeffrey
Original assignee: Amunix Operating Inc
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2017-10-23
Also published as: AU2010258892A1; SG10201704777RA; IL216680A; MX2011013183A; EP2440241B1; WO2010144502A2; PL2440241T3; JP5805634B2; HK1250215A1; CN106916229A; EP2440241A1; JP2012529296A; CL2011003121A1; JP6543668B2; EP3278813A1; NO2440241T3; CA2764105A1; DK2440241T3; WO2010144502A9; HUE037249T2

Description

DESCRIÇÃO

POLIPÉPTIDOS DE HORMONA DO CRESCIMENTO E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO DOS MESMOS

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hormona do crescimento humano (hGH) é uma hormona que participa da regulação do crescimento e desenvolvimento humano. A hormona do crescimento (a seguir no presente documento "GH"), também conhecida como somatotropina, representa uma classe de hormonas proteináceas produzidas e secretados pelas células somatotrópicas da pituitária anterior. A secreção de GH é estimulada pela hormona de libertação da hormona do crescimento (GHRH) do hipotálamo e suprimida pela somatostatina. Esta. hormona, pituitária exibe uma série de efeitos biológicos incluindo a somatogénese, lactação, ativação de macrófagos, efeitos diabetogénicos e semelhante a insulina entre outros (Chawla, R, K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, C. K. et al. (1988)

Science 239, 769; Thorner, M. 0., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81, 745) . A hormona do crescimentG humano é um membro de uma família de hormonas homólogas que incluem lactógenos placentários, prolactinas e outras variantes de espécie e genética de GH. GH regula a secreção do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1, anteriormente conhecida como somatomedina C), entre outras hormonas peptídicas conhecidas coletivamente como somatomedinas, que representa a maior parte de sua atividade biológica.

Uma série de doenças e distúrbios estão associados à deficiência de GH. Uma deficiência pode ser congénita, adquiridas na infância ou na vida. adulta e pode ser parcial ou completa. Em alguns casos, a deficiência é transitória, mas, mais comumente, é permanente e pode ocorrer em associação com deficiências de outros hormonas pituitárias. A deficiência da hormona do crescimento em crianças leva. ao nanismo, falha no crescimento ou baixa estatura. A deficiência em adultos é rara, mas os sintomas podem incluir diminuição da. massa corporal e baixa densidade óssea, e uma série de sintomas psicológicos. Outros distúrbios hormonais ou glandulares frequentemente coincidem com a deficiência do hormona do crescimento.

Estimular o aumento da altura na infância ê o efeito mais conhecido de GH, e parece funcionar por pelo menos dois mecanismos: GH estimula diretamente a divisão e multiplicação de condrócitos de cartilagem e GH também estimula a produção de IGF-l. 0 IGF-1 tem efeitos estimulantes do crescimento numa ampla variedade de tecidos. IGF-1 adicional é gerado dentro dos tecidos alvo. Tornando aparentemente uma hormona endócrina e autôcrina/parãcrina. IGF-1 também tem efeitos estimuladores na atividade dos osteoblastos e dos condrócitos para promover o crescimento ósseo. A hormona do crescimento humano (hGH) desempenha um papel chave no crescimento somático através dos seus efeitos no metabolismo de proteínas, hidratos de carbono e lípidos. Além dos seus efeitos sobre o crescimento somático, HGH demonstrou estimular células sanguíneas in vitro (Derfalvi et al., 1998; Merchav et al; 1988), aumentar as contagens de eritrócítos e hemoglobina (Valerio et ai., 1997; Vihervuori et al. , 1996), aumentar tanto a proliferação quanto a produção de Ig nas linhas celulares plasmãticas (Kimata and Yoshida, 1994) e estimular as contagens de células CD8+ e, a um menor grau a contagens de células CD4+ (Ceffner, 1997) .

Formas injetáveis de GH têm sido comercializadas para deficiência de GH em crianças e adultos, síndrome de Turner, Síndrome de Prader-Willi e crianças pequenas para a idade gestacional. Além disso, tem visto uso na batalha contra o envelhecimento e para o controle de peso, Bem como a mobilização de células capazes de regenerar a hematopoiese no sangue períféricG. 0 peso molecular de 22 kDA da hGH está bem abaixo do valor limiar para a filtração renal de cerca de 70 k.Da (Caliceti (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:1261--1277), o que contribui para a semivida do soro de hGH nativa ser inferior a 20 minutos em humanos. Assim, As preparações comerciais de hGH devem ser doseadas diariamente para obter benefício clínico. Uma forma de libertação sustentada de CH, Nutropin Depot (Genentech and Alkermes) foi aprovada pela FDA em 1999, permitindo menos injeções (a cada 2 ou 4 semanas em vez de diariamente); contudo, o produto foi descontinuado em 2004.

As modificações químicas de uma proteína terapêutica podem modificar a sua taxa de depuração in vivo e a semivida sérica subsequente. Um exemplo de uma modificação comum é a adição de uma porção de polietilenoglicol (PEG) , Tipicamente acoplado à proteína através de um grupo aldeído ou N-hidroxissuccinimida (NUS) no PEG reagindo com um grupo amina (por exemplo, cadeia lateral de lisina ou terminal N). Contudo, a etapa de conjugação pode resultar na formação de misturas de produtos heterogéneos que precisam de ser separados, levando a uma perda significativa do produto e complexidade de fabrico e não resulta, num produto completamente quimicamente uniforme. Também, a função farmacológica da GH pode ser dificultada se as cadeias laterais de aminoãcidos na proximidade do seu local de ligação forem modificadas pelo processo de PEGilação. Outras abordagens incluem a fusão genética de um domínio Fc para a proteína GH terapêutica, A conjugação do domínio Fc aumenta o tamanho da proteína terapêutica, reduzindo assim a taxa de depuração através do rim. Adicionalmente, o domínio Fc confere a capacidade de se ligar e ser reciclado a partir de lisossomas por, o recetor FcRn, o que resulta em semivida farmacocinética aumentada. Infelizmente, o domínio Fc não se dobra eficazmente durante a expressão recombinante e tende a formar precipitados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão. Estes corpos de inclusão devem ser solubilizados e a proteína funcional deve ser renaturada a parir do agregado mal-dobrado, um prGcesso demorado, ineficaz e caro. Consequentemente, continua a existir uma necessidade de composições de hormona do crescimento que possam aumentar a semivida e podem ser administradas com menos frequência, mas são mais seguros e menos complicados e onerosos de produzir. 0 documento WO 2007/103515 fornece polímeros recombinant.es não estruturados (URPs) e proteínas contendo um ou mais URPs, bem como polipéptidos recombinantes incluindo vetores que codificam os entidades proteináceas de objeto e células hospedeiras compreendendo os vetores. 0 documento WO 2007/103515 descreve uma variedade de utilidades para as composições descritas, incluindo uma gstma de aplicações farmacêuticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente divulgação refere-se a composições e métodos que podem ser úteis para o tratamento de qualquer doença, distúrbio ou condição patológica que é aprimorada, melhorada ou inibida pela administração de hormona do crescimento. Em, particular, a presente invenção proporciona composições de proteínas de fusão compreendendo um ou mais polipéptidos recombinantes estendidos com uma sequência não repetitiva e/ou conformação não estruturada (XTEN) ligada à hormona do crescimento (GH), conforme definido na reivindicação 1. Em parte, a presente divulgação é dirigida a composições farmacêuticas que compreendem as proteínas de fusão e as utilizações das mesmas para o tratamento de doenças, distúrbios ou condições patológicas relacionadas com a hormona do crescimento.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, que compreende uma hormona do crescimento que é pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 95%, gu cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da hormona do crescimento humano conforme é mostrado no Quadro 1, em que a dita hormona do crescimento é ligada a um polipéptido recombinante estendido (XTEN) de pelo menos cerca de 200, ou pelo menos cerca de 400, ou pelo menos cerca de 800, ou pelo menos cerca de 900, ou pelo menos cerca de 1000 ou pelo menos cerca de 2000, até cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, em que ο XTEN ê caracterizado pelo fato de que (a) o XTEN compreende pelo menos cerca de 200 aminoácidos contíguos que exibe pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade com um comprimento comparável de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em AE912, AE288, AD576, AE576, AE624, AD836, AE 864, AF864, AG864, AM875, AM923 e AM1318 conforme é mostrado no Quadro 3,* (b) a sequências de XTEN não possui um epítopo de células T predito quando analisado pelo algoritmo TEPITOPE, em que a predição do algoritmo TEPITOPE para epítopos dentro da sequência XTEN é baseada numa pontuação de -6, ou -7, ou -8, ou -9 ou superior; (c) a XTEN tem uma pontuação de subsequência de menos de 10, ou menos de 9, ou menos de 8, ou menos de 7, ou menos de 6, ou menos de 5, ou ainda menos; e (d) a soma de resíduos de glicina (G) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) constitui mais de cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98% ou cerca de 99% dos resíduos de aminoácidos totais da XTEN, Numa forma de realização, a hormona do crescimento da proteína de fusão isolada é hormona do crescimento humano. Noutra forma de realização, a proteína de fusão isolada compreende pelo menos um segundo XTEN, em que a proteína de fusão adota uma configuração múltipla XTEN mostrada no Quadro 5, ou uma variante da mesma,

Noutra forma de realização, a sequência XTEN das proteínas de fusão GHXTEN é caracterizada por ter uma formação de espiral aleatória superior a 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de formação de espiral aleatória conforme determinado pelo algoritmo de GOR; e a sequência XTEN tem menos de 2% de hélices alfa e 2% de folhas beta conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona proteínas de fusão GHXTEN, em que o XTEN é caracterizado pelo facto de que a soma dos resíduos de asparagina e glutamina é inferior a 10% da sequência de aminoácidos total do XTSN, a soma dos resíduos de metionina e triptofano é inferior a 2% da sequência de aminoácidos total do XTEN, a sequência do XTEN tem menos de 5% de resíduos de aminoácidos com uma carga positiva, a sequência XTEN tem uma formação de espiral aleatória superior a 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de formação de espiral aleatória conforme determinado pelo algoritmo de GOR; e a sequência XTEN tem menos de 2% de hélices alfa e 2% de folhas beta conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman,

Noutra forma de realização, esta divulgação proporciona proteínas de fusão GHXTEN, em que o XTEN é caracterizado pelo fato de que peio menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da sequência de XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motivos de sequência tem de cerca de 9 a cerca de 14 resíduos de aminoácidos e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácidos contíguos não ocorre mais de duas vezes em cada um dos motivos de sequência, os motivos de sequência consistem em quatro a seis tipos de aminoácidos selecionados a partir de glicina (G) , alanina (A) , serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina. (P) .

Em algumas formas de realização, nenhum tipo de aminoácido constitui mais de 30% da sequência XTEN do GHXTEN. Noutras formas de realização, o XTEN tem uma sequência em que não são idênticos três aminoácidos contíguos a não ser que o aminoácido seja serina, em cujo caso não mais de três aminoácidos contíguos são resíduos de serina. Ainda noutras formas de realização, pelo menos cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% ou 100% da sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos, em que cada um dos motivos de sequência tem 12 Resíduos de aminoácidos. Numa forma de realização, a sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos, em que os motivos de sequência sâo de uma ou mais sequências do Quadro 2.

Nalgumas formas de realização, as proteínas de fusão GHXTEN exibem propriedades farmacocinéticas melhoradas em comparação com a GH não ligada ao XTEN, em que as propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitadas a, semivida terminal mais longa, maior área sob a curva, aumento do tempo em que a concentração no sangue permanece dentro da janela terapêutica, aumento do tempo entre doses consecutivas e diminuição da dose em moles ao longo do tempo. Nalgumas formas de realização, a semivida terminal da proteína de fusão GHXTEN administrada a um indivíduo é aumentada pelo menos cerca de duas vezes, ou pelo menos cerca de três vezes, ou pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos cerca de oito vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 60 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes ou ainda superior em comparação com GH não ligado a XTEN e administrado a um indivíduo num dose comparável. Noutras formas de realização, A propriedade farmacocinética reforçada é refletida pelo fato de que as concentrações sanguíneas que permanecem dentro da janela terapêutica para a proteína de fusão GHXTEN durante um determinado período são pelo menos cerca de duas vezes, ou pelo menos cerca de três vezes, ou pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos cerca de oito vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes mais longa, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 60 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes em comparação com GH não ligado a XTEN e administrado a um indivíduo num dose comparável. O aumento dei semivida e do tempo passado dentro da janela terapêutica permite uma dosagem menos frequente e quantidades diminuídas da proteína de fusão (em moles equivalentes) que são administradas a um indivíduo, em comparação com a GH correspondente nâo ligada a XTEN. Numa forma de realização, o regime de dose terapeuticamente eficaz resulta em um ganho no tempo de pelo menos duas vezes, ou pelo menos três vezes, ou pelo menos quatro vezes, ou pelo menos cinco vezes, ou pelo menos seis vezes, ou peio menos oito vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 60 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes entre pelo menos dois picos de CMax e/ou rebaixos de Cmin consecutivos para níveis sanguíneos da proteína de fusão em comparação com a correspondente GH não ligada à proteína de fusão e administrada utilizando um regime de dose comparável a um indivíduo.

Em algumas formas de realização, o XTEN aumenta a termoestabilidade de uma proteína biologicamente ativa quando ligado à proteína biologicamente ativa em que a termoestabilidade é determinada medindG a retenção da atividade biológica após exposição a uma temperatura de cerca de 3 7 °C durante pelo menos cerca, de 7 dias da proteína biologicamente ativa em comparação com o XTEN ligado à proteína biologicamente ativa. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, a retenção da atividade biológica é aumentada em pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 7 0%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100% ou cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300% ou cerca de 500% mais longa em comparação com a GH não ligada ao XTEN compreende do XTEN.

Em algumas fGrmas de realização, a proteína de fusão isolada com pelo menos um primeiro XTEN compreende uma GH em que a GH é hormona do crescimento humano. Em algumas formas de realização, a proteína de fusão isolada compreende, ainda, um segundo XTEN, que pode ser idêntico ou pode ser diferente do primeiro XTEN, e em que a proteína de fusão adota uma configuração múltipla XTEN mostrada no Quadro 5. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, o primeiro e o segundo XTEN podem ser uma sequência selecionada a partir do Quadro 3, ou podem exibir pelo menos cerca, de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%,, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do Quadro 3. Noutra forma de realização, a proteína de fusão isolada que compreende uma segunda sequência de XTEN adota, uma configuração de XTEN múltipla mostrada no Quadro 5.

Numa forma de realização, a proteína de fusão isolada é menos imunogénica em comparação com a GH não ligada ao XTEN, em que a imunogenicidade é determinada, por meio de, por exemplo, mediçâG da produção de anticorpos IgG que se ligam seletivamente à proteína biologicamente ativa após administração de doses comparáveis a um indivíduo.

Em algumas formas de realização, o péptido da hormona do crescimento e a XTEN da proteína de fusão é ligada via um espaçador, em que a sequência espaçadora compreende entre cerca de 1 a cerca de 50 resíduos de aminoãcidos que opcionalmente compreendem uma sequência de clivagem. Numa forma de realização, a sequência de clivagem é suscetível a clivagem por uma protease. Exemplos não limitantes de tais proteases incluem FXIa, FXIIa, calicreína, FVIIa, FIXa, FXa, trombina, elastase-2, granzíma B, MMP - 12, MMP--13, MMP-17 ou MMP-20, TEV, enteroquinase, rinovírus 3C protease e sortase A.

Em algumas formas de realização, a proteína de fusão isolada é configurada para ter afinidade de ligação reduzida para um recetor alvo da GH correspondente, em comparação com a GH correspondente não ligada à proteína de fusão. Numa forma de realização, a proteína de fusão GHXTEN exibe afinidade de ligação para um recetor alvo da GH no intervalo de cerca de 0,01 %- 30%, ou de cerca de 0,1% a cerca de 20%, ou de cerca de 1% a cerca de 15%, ou de cerca de 2% a cerca de 10% da afinidade de ligação do correspondente GH que não possui o XTEN. Noutra forma de realização, a proteína de fusão GHXTEN exibe afinidade de ligação para um recetor alvo da GH que é reduzido pelo menos cerca de 3 vezes, ou pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 6 vezes, ou pelo menos cerca de 7 vezes, ou pelG menos cerca de 8 vezes, ou pelo menos cerca de 9 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca, de 12 vezes, ou pelo menos cerca de 15 vezes, ou pelo menos cerca de 17 vezes, ou pelo menos cerca de 2 0 vezes, gu pelo menos cerca de 30 vezes, ou pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes menos afinidade de ligação em comparação com GH não ligada a XTEN. Numa forma de realização relacionada, uma prGteína de fusão com afinidade reduzida pode ter depuração mediada por recetor e urn correspondente aumento de semivida de pelo menos cerca de 3 vezes, ou pelo menos cerca de 5 vezes, ou pelo menos cerca de 6 vezes, ou pelo menos cerca de 7 vezes, ou pelo menos cerca de 8 vezes, ou pelo menos cerca de 9 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 12 vezes, ou pelo menos cerca de 15 vezes, ou pelo menos cerca de 17 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 30 vezes, ou pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes ma is longa, em comparação com GH não ligada a proteína de fusão.

Numa forma de realização, esta divulgação proporciona uma proteína de fusão isolada GHXTEN que compreende uma sequência de aminoãcidos que tem pelo menos cerca de 80%, ou pelo cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%,, ou pelo menos cerca de 9 8%, ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do Quadro 35 e Quadro 36.

Em algumas formas de realização, o GHXTEN exibe solubilidade aumentada de pelo menos cerca de três vezes, gu pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos cerca de sete vezes, ou pelo menos cerca de oito vezes, ou pelo menos cerca de nove vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes, ou pelG menos cerca de 15 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 60 vezes em condições fisiológicas em comparação com a GH não ligada à proteína de fusão.

Em algumas formas de realização, as proteínas de fusão GHXTEN exibem uma massa molecular aparente aumentada como determinado por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, em comparação com a massa molecular real, em que a massa molecular aparente ê pelo menos cerca de 100 kD, ou pelo menos cerca de 150 kD, ou pelo menos cerca de 200 kD, ou pelo menos cerca de 300 kD, ou pelo menos cerca de 400 kD, ou pelo menos cerca de 500 kD, ou pelo menos cerca de 600 kD, ou pelo menos cerca de 700 kD, enquanto que a massa molecular real de cada componente da GH da proteína de fusão é inferior a cerca de 25 kD. Consequentemente, a proteína de fusão GHXTEN pode ter uma Massa molecular aparente, que é cerca de 4 vezes superior, ou cerca de 5 vezes superior, ou cerca de 6 vezes superior, ou cerca de 7 vezes superior, ou cerca de 8 vezes superior que a massa molecular real da proteína de fusão. Em alguns casos, a proteína de fusão GHXTEN isolada das formas de realização anteriormente mencionadas exibe um fator de massa molecular aparente sob condições fisiológicas que é superior a cerca de 4, ou cerca de 5, ou cerca de 6, ou cerca de 7 ou cerca de 8. A invenção contempla composições de proteínas de fusão GHXTEN que compreendem, mas não limitados a GH selecionado a partir do Quadro 1 (ou fragmentos ou variantes de sequência das mesmas), XTEN selecionado a partir do Quadro 3 (ou variantes de sequência do mesmo) que estão numa configuração selecionada a partir do Quadro 5. No geral, o GHXTEN resultante reterá pelo menos uma porção da atividade biológica da correspondente GH não ligada ao XTEN. Em outros casos, o componente de GH torna···se biologicamente ativo ou tem um aumento de atividade após a sua libertação do XTEN por clivagem de uma sequência de clivagem opcional incorporada dentro de sequências espaçadoras no GHXTEN.

Numa forma de realização da composição de GHXTEN, a invenção proporciona uma proteína de fusão de fórmula I:

(XTEN) x - GH - (XTEN) v I em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona gg crescimento; xéOouleyéOoulem que x+y hl; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Em algumas formas de realização, o XTEN é fundido à hormona do crescimento numa terminação N ou C da hormona do crescimentG. Em algumas formas de realização, a proteína de fusão isolada compreende uma hormona do crescimento humano e um primeiro ou segundo XTEN selecionado a partir de AE912, AM923, ΆΕ144 e ΆΕ288.

Noutra forma de realização da composição de GHXTEN, a invenção proporciona uma proteína de fusão de fórmula II:

(XTEN)x-(GH)- (S)y-(XTEN)y II em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1 e y é 0 ou 1 em que x+y hl; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula III: (GH)-(S)x-(XTEN)- (S)y-GH)-(S)z-(XTEN)z III em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; z é 0 ou 1; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido,

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma prGteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula IV: (XTEN) K -(S)y-(GH)-(S)z-( XTEN) - (GH) IV em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; ζ é 0 ou 1; e XTEN é um pGlípéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma hormona do crescimento de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula V: (GH)x-(S)x-(GH)-(S)y-(XTEN) V em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoãcidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realizaçãG, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula VI: (XTEN)- (S)x-(GH)- (S)y-(GH) VI em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoãcidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; e XTEN é um pGlípéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula VII: (XTEN)-(S)x-(GH)-(S)y- (GH) -(XTEN) VII em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoãcidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula VIII:

((S)m-(GH)x-ÍS)n- (XTEN)y-(S)o) t VIII em que t é um número inteiro que é superior a 0 (1, 2, 3, etc.); independentemente de cada um de m, n, o, x e y ê um número inteiro (0, 1, 2, 3, etc.), GH é uma hormona do crescimento; S é um espaçador, opcionalmente compreende um local de clivagem; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido, com a condição de que: (1) x+y >1, (2) quando t = 1, x>Q e y>0, (3) quando existe mais de um GH, S ou XTEN, cada GH, XTEN ou S são iguais ou são independentemente diferentes; e (4) quando t > 1, cada m, n, o, x ou y dentro de cada subunidade são iguais ou são independentemente diferentes.

Em algumas formas de realização, a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de uma forma de realização das fórmulas I-VIII a um indivíduo que dela necessite pode resultar num ganho no tempo de pelo menos duas vezes, ou pelo menos três vezes, ou pelo menos quatro vezes, ou pelo menos cinco vezes ou mais gastos dentro de uma janela terapêutica para a proteína de fusão em comparação com a GH correspondente não ligada ao XTEN e administrada a uma dose comparável a um indivíduo. Em outros casos, a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de uma forma de realização das fórmulas I-VIII a um indivíduo que dela necessite pode resultar num ganho no tempo entre doses consecutivas necessárias para manter um regime de dose terapeuticamente eficaz de pelo menos 4 8 h, ou pelo menos 72 h, ou pelo menos cerca de 96 h, ou pelo menos cerca de 12 0 h, ou pelo menos cerca de 7 dias, ou pelG menos cerca de 14 dias, ou pelo menos cerca de 21 dias entre doses consecutivas em comparação com uma GH não ligada a XTEN e administrado a. uma dose comparável.

As proteínas de fusão podem ser concebidas para ter diferentes configurações, terminal N para C, de uma GH, XTEN e sequências espaçadoras opcionais, incluindo, mas não limitado a XTEN-GH, GH-XTEN, XTEN-S-GH, GH-S-XTEN, XTEN-GH-XTEM, GH-GH-XTEN, XTEN-GH-GH, GH-S-GH-XTEN, XTEN-GH-S-GH e muitímeros das mesmas. A escolha da configuração pode, conforme divulgado no presente documento, conferir propriedades farmacocinéticas, físico-químicas ou farmacológicas particulares.

Em algumas formas de realização, a proteína de fusão isolada é caracterizada pelo fato de que: (i) tem uma semivida mais longa em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN; (ii) quando uma quantidade molar menor da proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo sob um regime de dose de outra forma equivalente, a proteína de fusão atinge uma área sob a curva comparável (AUC) como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN; (iii) quando uma quantidade molar menor da proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo sob um regime de dose de outra forma equivalente, a proteína de fusão atinge um efeito terapêutico comparável como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN; (iv) quando a proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo utilizando um regime de dose de outra quantidade molar equivalente, a proteína de fusão atinge uma área sob a curva comparável (AUC) como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN; (v) quando a proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo utilizando um regime de dose de outra quantidade molar equivalente, a proteína de fusão atinge um efeito terapêutico comparável como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN; (vi) quando uma quantidade molar acumulativamente menor da proteína de fusão ê administrada a um indivíduo em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo sob um período de dose de outra forma equivalente, a proteína de fusão atinge uma área sob a curva comparável (AUC) como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN; ou (vii) quando uma quantidade molar acumulativamente menor da proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo sob um período de dose de outra forma equivalente, a proteína de fusão atinge um efeito terapêutico comparável como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN.

Numa forma de realização, as proteínas de fusão GHXTEN das formulas I-VIII descritas acima apresentam uma atividade biológica de pelo menos cerca de 0,1%, ou pelo menos cerca de 0,1%, ou pelo menos cerca de 1%, ou pelo menos cerca de 2%, ou pelo menos cerca de 3%, ou pelo menos cerca de 4%, ou pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 3 0%, ou pelo menos cerca de 4 0%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelG menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% da atividade biológica em comparação com GH não ligado à proteína de fusão. Noutra forma de realização, as proteínas de fusão GHXTEN das fórmulas I-VIII ligam-se aos mesmos recetores ou ligandos como a proteína biológica ativa parental correspondente que não está covalentemente ligada à proteína de fusão. A invenção proporciona um método de produção de uma proteína de fusão que compreende hormona do crescimento humano fundido com um ou mais polipéptidos recombinantes estendidos (XTEN), compreendendo: (a) proporcionar uma célula hospedeira que compreende uma molécula de polinucleôtido recombinante que codifica a proteína de fusão (b) a cultura da célula hospedeira em condições que permitam a expressão da proteína de fusão; e (c) recuperar a proteína de fusão. A hormona do crescimento da proteína de fusão tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o hormônio de crescimento humano ou uma sequência a partir do Quadro 1. 0 um ou mais XTEN da proteína de fusão expressa tem pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% a cerca de 100% de identidade de sequência com a sequência selecionada a partir do grupo que consiste em AE 912, AE288, AD576, ΑΞ576, AE624, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AM923 e AM1318 conforme é mostrado no Quadro 3. Noutra forma de realização do método, o polinucleôtido que codifica o XTEN é o codão otimizado para uma expressão melhorada da referida proteína de fusão na célula hospedeira. Noutra forma de realização do método, a célula hospedeira é uma célula prGcariótica. Noutra forma de realização do método, a célula hospedeira é E. coli. Noutra forma de realização do método, a proteína de fusão isolada é recuperada do citoplasma da célula hospedeira sob uma forma substancialmente SGlúvel. A divulgação proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de (a) um polinucleôtido que codifica a proteína de fusão de quaisquer das formas de realização anteriores ou (b) o complemento do polinucleôtido de (a) . Numa forma de realização, a divulgação proporciona um ácido nucleico isolado que compreende sequência polinucleotídica que tem pelo menos 80% de identidade de sequência, ou cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou de ca de 99% a 100% de identidade de sequência para (a) uma sequência polinucleotídica de um comprimento comparável selecionada a partir do Quadro 3 5 e Quadro 36,- ou (b) o complemento do polinucleõtido de (a). A divulgação proporciona vetores de expressão compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma. das formas de realização acima descritas neste parágrafo. Numa forma de realização, o vetor de expressão do anterior compreende ainda uma sequência reguladora recombinante operativamente ligada à sequência polinucleotídica. Noutra, forma de realização, a sequência polinucleotídica dos vetores de expressão dos anteriores é fundida numa estrutura a um polinucleõtido que codifica uma sequência de sinal de secreção, que pode ser uma sequência de sinal. procariótica.. Numa forma de realização, a sequência de sinal de secreção é selecionada a partir das sequências de sinal OmpA, DsbA e PhoA. A divulgação proporciona uma célula hospedeira, que pode compreender um vetor de expressão revelado no parágrafo anterior. Numa forma de realização, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Noutra forma de realização, a célula hospedeira é E. coli. Noutra forma de realização, a. célula hospedeira é uma. célula eucariõtica.

Numa forma de realização, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem a proteína de fusão de quaisquer das formas de realização anteriores e um veículo f armaceuticamente aceitável. Noutra. forma de realização, a divulgação proporciona kits, compreendendo material de embalagem e pelo menos um primeiro recipiente compreendendo a composição farmacêutica da forma de realização anterior e um rótulo que identifica a composição farmacêutica e condições de armazenamento e manuseamento, e um folheto de instruções para a reconstituição e/ou administração das composições farmacêuticas a um indivíduo. A invenção proporciona uma. proteína de fusão de acordo com o método de tratamento de uma condição patológica relacionada à hormona do crescimento num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de fusão de quaisquer das formas de realização anteriores. Numa fGrma de realização do método, a condição patológica relacionada à hormona do crescimento é selecionada. a partir de deficiência de hormona do crescimento, síndrome de Turner, síndrome de Prader-Willi, baixa estatura idiopática, definhamento por SIDA, esclerose múltipla, doença de Crohn, colite uleerativa e distrofia muscular.

Em algumas formas de realização, a composição pode ser administrada por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Numa forma de realização, a composição ê administrada numa quantidade terapeuticamente eficaz. Numa forma de realização, a quantidade terapeuticamente eficaz resulta num ganho no tempo gasto dentro de uma janela terapêutica para a proteína de fusão em comparação com a GH correspondente da proteína de fusão não ligada à proteína de fusão e administrada a uma dose comparável a um indivíduo. 0 ganho em tempo gasto dentro da janela terapêutica pode ser pelo menos três vezes mais longa do que a GH correspondente não ligada à proteína de fusão, ou alternativamente, pelo menos quatro vezes, ou cinco vezes, ou seis vezes, ou sete vezes, ou oito vezes, ou nove vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 mais longa que a correspondente GH não ligada à proteína de fusão. Sm algumas formas de realização do método de tratamento, (i) uma quantidade molar menor (por exemplo, de cerca de duas vezes menos, ou cerca de três vezes menos, ou cerca de quatro vezes menos, ou cerca de cinco vezes menos, ou cerca de seis vezes menos, ou cerca de oito vezes menos, ou cerca de 100 vezes menos ou maior) a proteína de fusão é administrada em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN sob uiti mesmo regime de dose e a proteína de fusão atinge uma área sob a curva comparável e./ou um efeito terapêutico comparável como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN; (ii) a proteína de fusão ê administrada menos frequentemente (por exemplo, a cada dois dias, cerca de a cada sete dias, cerca de a cada 14 dias, a cada 21 dias, ou aproximadamente, mensalmente) em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN sob uma mesma quantidade de dose, e a proteína de fusão atinge uma área sob a curva comparável e/ou um efeito terapêutico comparável como a hormona do crescimento correspondente que nãG possui o XTEN; ou (iii) uma quantidade molar cumulativa menor (por exemplo, cerca de 5%, ou cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 40%, ou cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 7 0%, ou cerca de 80% ou cerca de 90% menos) a proteína de fusão é administrada em comparação com a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN sob um mesmo regime de dose e a proteína de fusão atinge uma área sob a curva comparável e/ou um efeito terapêutico comparável como a hormona do crescimento correspondente que não possui o XTEN. A quantidade molar cumulativa menor é medida durante um período de pelo menos cerca de uma semana, ou cerca de 14 dias, ou cerca de 21 dias ou cerca de um mês. Em algumas formas de realização do método, o efeito terapêutico é um parâmetro de medida selecionado a partir de concentrações de IGF-1, concentração de IGFBP3, velocidade de altura, massa corporal magra, gordura corporal total, gordura do tronco, resposta ao desafio de insulina, taxa de divisão de condrócitos, números de condrócitos, densidade óssea, crescimento ósseo e aumento na largura da placa epifísea.

Noutra forma de realização, é divulgado um método de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição patológica, que compreende administrar a composição farmacêutica descrita acima a um indivíduo utilizando múltiplas doses consecutivas da composição farmacêutica administrada utilizando um regime de dose terapeuticamente eficaz. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, o regime de dGse terapeuticamente eficaz pode resultar num ganho no tempo de pelo menos três vezes, ou alternativamente, pelo menos quatro vezes, ou cinco vezes, ou seis vezes, ou sete vezes, ou oito vezes, ou nove vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 2 0 vezes, ou pelo menos cerca de 30 vezes, ou pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes tempo mais longo entre pelo menos dois picos de Críiax e/ou rebaixos de Cmin consecutivos para níveis sanguíneos da proteína de fusão em comparação com a correspondente GH da proteína de fusão não ligada à proteína de fusão e administrada utilizando um regime de dose comparável a um indivíduo. Noutra forma de realização do anteriormente mencionada, a administração da proteína de fusão resulta numa melhoria em pelo menos um parâmetro medido de uma. doença relacionada com a hormona do crescimento utilizando dosagem menos frequente ou uma dosagem total mais baixa em moles da proteína de fusão da composição farmacêutica em comparação com os componentes da proteína biologicamente ativa correspondente não ligados à proteína de fusão e administrados a um indivíduo d utilizando um regime terapeuticamente eficaz para um indivíduo. A divulgação proporciona ainda a utilização das composições que compreendem a proteína de fusão de quaisquer das formas de realização anteriores numa preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição patológica num indivíduo com necessidade da mesma. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, a doença, distúrbio ou condição patológica é selecionado a partir do grupo que consiste em síndrome de Turner, síndrome de Prader-Willi, baixa estatura idiopática, definhamento por SIDA, esclerose múltipla, doença de Crohn, colite ulcerativa e distrofia muscular. Qualquer uma das formas de realização descritas pode ser praticada sozinha ou em combinação, dependendo da aplicação interessada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As características e vantagens da. invenção podem ser adicionalmente explicadas com por referência à descrição detalhada que se segue e dos desenhos anexos que apresentam formas de realização ilustrativas. A FIG. 1 mostra, representações esquemáticas de proteínas de fusão GHXTEN exemplares (FIGS. 1A-H), tudo representado em uma orientação da terminação N para a C. A FIG. IA mostra duas configurações diferentes de proteínas de fusão GHXTEN (100) , cada. uma. compreendendo uma única hormona do crescimento (GH) e um XTEN, a primeira das quais tem uma molécula de XTEN (102) ligada à terminação C de uma GH (103) e a segunda das quais tem uma molécula de XTEN ligada à terminação N de uma GH (103). A FIG. 1B mostra duas configurações diferentes de proteínas de fusão GHXTEN (100), cada uma compreendendo uma única GH, uma sequência espaçadora e um XTEN, a primeira das quais tem uma. molécula de XTEN (102) ligada à terminação C de uma sequência espaçadora (104) e a sequência separadora ligada à terminação C de uma GH (103) e a segunda das quais tem uma molécula de XTEN ligada à terminação N de uma sequência, espaçadora (104) e a sequência espaçadora ligada à terminação N de uma GH (103) . A FIG, 1C mostra duas configurações diferentes de proteínas de fusão GHXTEN (101), cada uma compreendendo duas moléculas de uma única GH e uma molécula de um XTEN, a primeira das quais tem uma XTEN ligada à terminação C de uma primeira GH e essa GH está ligada à terminação C de uma segunda GH, e a segunda das quais está numa orientação oposta em que a XTEN está ligada à terminação N de uma primeira GH e essa GH está ligada à terminação N de uma segunda GH. A FIG. 1D mostra duas configurações diferentes de proteínas de fusão GHXTEN (101), cada uma compreendendo duas moléculas de uma única GH, uma sequência espaçadora e uma molécula de um XTSN, a primeira das quais tem uma XTEN ligada à terminação C de uma sequência, espaçadora e a sequência espaçadora ligada à terminação C de uma primeira GH que está ligada à terminação C de uma segunda GH, e a segunda das quais está numa orientação oposta em que a XTEN está ligada à terminação N de uma sequência espaçadora e a sequência espaçadora ligada à terminação N de uma primeira GH e essa GH está ligada à terminação N de uma segunda GH. A FIG. 1E mostra duas configurações diferentes de proteínas de fusão GHXTEN (101), cada uma compreendendo duas moléculas de urnsi única GH, uma sequência espeiçadora e uma molécula de um XTEN, a primeira das quais tem uma XTEN ligada à terminação C de uma primeira GH e a primeira GH ligada â terminação C de uma sequência espaçadora que está ligada à terminação C de uma segunda molécula de GH, e a segunda das quais está numa configuração de XTEN ligada à terminação N de uma primeira GI-I que está ligada à terminação N de uma sequência espaçadora que por sua vez está ligada â terminação N de uma segunda molécula de GH, A FIG. 1F mostra uma configuração de proteína de fusão GHXTEN (105), cada uma compreendendo uma molécula de GH e duas moléculas de um XTEN ligado ã terminação N e à terminação C do GH. A FIG. 1G mostra uma configuração (106) de uma única GH ligada a dois XTEN, com o segundo XTEN separado da GH por uma sequência espaçadora. A FIG. 1H é uma configuração (106) de duas GH ligadas a dois XTEN, com o segundo XTEN ligado à terminação C da primeira GH e à terminação da segunda GH, que está na terminação C do GHXTEN. A FIG. 2 é uma. ilustração esquemática de construções polinucleotídicas exemplificativas (Figuras 2Ά-Η) de genes GHXTEN que codificam os polipéptidos GHXTEN correspondentes da FIG, 1; tudo representado numa orientação de 5' para 3'. Nestes exemplos ilustrativos os genes codificam as proteínas de fusão GHXTEN com uma GH e XTEN (200) ; ou uma GH, uma sequência espaçadora e um XTEN (200); duas GH e um XTEN (201); ou duas GH, uma sequência espaçadora e um XTEN (201); uma GH e dois XTEN (205); ou duas GH e dois XTEN (206) . Nestas representações, os polinucleõtidos codificam os seguintes componentes: XTEN (202), GH (203) os aminoãcidos espaçadores que podem incluir uma sequência de clivagem (204), com todas as sequências ligadas em grelha, A FIG. 3 é uma ilustração esquemática de dois GHXTEN monoméricos exemplificativos e a capacidade das proteínas de fusão monoméricas para se ligar a um recetor alvo numa superfície celular, com a sinalização celular subsequente. A FIG. 3A mostra uma proteína de fusão GHXTEN (100) que consiste num GH (103) e um XTEN (102) e uma segunda proteína de fusão GHXTEN (105) que consiste numa GH ligada a dois XTEN (105) . A FIG. 3B mostra a interação do GHXTEN com a GH na terminação C (100) e o GHXTEN com um XTEN na terminação C (105) com recetores alvo (108) para GH numa superfície celular (107) . Neste caso, a ligação ao recetor com alta afinidade é exibida quando GH tem uma terminação C livre, enquanto o GHXTEN com um XTEN C-terminal não se liga firmemente ao recetor e se desassocia, conforme visto na FIG. 3C. A FIG. 3D mostra que o GHXTEN (100) ligado com alta afinidade de ligação permanece ligado ao recetor (106) e foi internalizado num endossoma (110) dentro da célula, ilustrando a depuração mediada pelo recetor da GH ligada e provocando a sinalização celular (109), retratado como citoplasma pontilhado. A FIG. 4 é um fluxograma esquemático de etapas representativas na montagem, produção e avaliação de um XTEN. A FIG. 5 ê um fluxograma esquemático etapas representativas na montagem de uma construção polinucleotídica de GHXTEN que codifica uma proteína de fusão. Os oligonucleotides individuais 501 são anelados em motivos de sequência 502, tais como um motivo de 12 aminoãcidos ("12-mero"), que é subsequentemente ligado com um oligo contendo Bbsl e os locais de restrição Kpnl 503. Motivos de sequências adicionais a partir de uma biblioteca são anelados para o 12-mero até que o comprimento desejado do gene XTEN 504 seja alcançado. O gene XTEN é clonado num vetor stuffer. O vetor codifica uma sequência Flag 506 seguido por uma sequência de paragem que está flanqueada pelos locais BSAI, Bbsl e Kpnl 507 e um gene de exendina-4 508, o que resulta no gene 500 que codifica uma fusão XTEN-GH. A FIG. 6 é um fluxograma esquemático de etapas representativas da montagem de um gene que codifica a proteína de fusão compreendendo uma hormona do crescimento (GH) e XTEN, a sua expressão e recuperação como uma proteína de fusão e sua avaliação como um produto GHXTEN candidato. A FIG. 7 é uma representação esquemática da conceção de vetores de expressão de GHXTEN com diferentes estratégias de processamento. A FIG 7A mostra um vetor de expressão exemplificativo codificando XTEN fundido com a extremidade 3' da sequência que codifica a GH. Note-se que nenhuma sequência de líder adicional é necessária neste vetor. A FIG. 7B representa um vetor de expressão codificando XTEN fundida com a extremidade 5' da sequência que codifica a GH com uma sequência líder de CBD e um local de protease de TSV. A FIG. 7C representa um vetor de expressão como na FIG. 7B onde o local de processamento CBD e TEV foram substituídos com uma sequência líder N-terminal otimizada (NTS). A FIG 7D representa um vetor de expressão que codifica uma sequência NTS, um XTEN, uma sequência que codifica GH e de uma segunda sequência que codifica uma XTEN. A FIG. 8 é uma representação esquemática da construção passo a passo de genes GHXTEN que contêm sequências de codificação de XTEN N-terminais ligadas a hGH e a subsequente ligação de sequências que codificam quer a 144 ou 288 XTEN ligadas ao terminal C de XTEN, como descrito no Exemplo 22. A FIG. 9 mostra os resultados de ensaios de expressão para as construções indicadas compreendendo sequências GFP e XTen. As culturas de expressão foram ensaiadas utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação 3 95 nm, emissão 510 nrn) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os resultados, representados graficamente como gráficos de bigode, embora os níveis de expressão medianos foram aproximadamente metade dos níveis de expressão em comparação com o domínio de terminal N auxiliar "de referência" CBD, os melhores clones a partir de bibliotecas estavam muito mais perto dos valores de referência, indicando que uma maior otimização em torno dessas sequências se justificava. Os resultados também mostram que as bibliotecas começando com aminoãcidos MA tinham melhores níveis de expressão do que aquelas que se iniciam com ME (veja-se Exemplo 14).

A FIG. 10 mostra três bibliotecas aleatórias utilizadas para os terceiro e quarto codões nas sequências N terminais de clones de LCW546, LCW547 e LCW552. As bibliotecas foram desenhadas com o terceiro e quarto resíduos modificados de modo que todas cis combinações de codões de XTEN permissíveis estavam presentes nestas posições, conforme mostrado. De modo a incluir todos os codões de XTEN permissíveis para cada biblioteca, nove pares de oligonucleotidos codificando 12 aminoãcidos com diversidades de codões do terceiro e quatro resíduos foram desenhados, anelados e ligados no vetor stuffer pCW0551 digerido com as enzimas de restrição Ndel/Bsal (Stuffer - XTEN__AM8 7 5 - GFP) e transformados em células competentes de E. coli BL21 Gold(DE3) para obter colónias das três bibliotecas LCW0569, LCW0570 e LCW0571. A FIG. 11 mostra um histograma de um reteste dos 75 melhores clones após a etapa de otimização, conforme descrito no Exemplo 15, para o sinal de fluorescência da GFP, em relação à construção CBD__AM875 de referência. Os resultados indicaram que vários clones foram agora superiores aos dos clones de referência. A FIG. 12 é uma vista esquemática de uma abordagem combinatória realizado para a união de preferências de otimização de codões para as duas regiões dos 48 aminoãcidos N-terminais. A abordagem criou 48 meros novos na terminação N da proteína XTEN para avaliação da otimização da expressão que resultou nas sequências líder que pode ser uma solução para a expressão de proteínas XTEN em que a XTE é N terminal para a GH, A FIG. 13 mostra um gel de SDS-PAGE confirmando a expressão de clones preferidos obtidos a. partir das experiências de otimização de codões N terminais de XTEN, em comparação com os clones XTEN de referência que compreendem a sequências líder CBD na terminação N das sequências de construção, como descrito no Exemplo 17. A FIG. 14 mostra um gel de SDS-PAGE de amostras a partir de um estudo de estabilidade da proteína de fusão de XTEN_AE864 fundida com a terminação N de GFP (veja-se o Exemplo 39). A GFP-ΧΤΕΝ foi incubada em plasma de cinomoigo e lisado de rim de rato durante um máximo de 7 dias a 37 °C. Além disso, a GFP-ΧΤΕΝ administrada a

macacos cinomoigo foi também avaliada. As amostras foram retiradas a 0, 1 e 7 dias e analisadas por SDS-PAGE seguido por deteção utilizando análise de Western e deteção com anticorpos contra GFP. A FIG. 15 mostra os resultados de um ensaio de ligação ao recetor de hGH em que a atividade de ligação de hGH fundida com o polipéptido K288 é comparada com hGH livre, como descrito no Exemplo 25. A FIG. 16 mostra, os resultados de ensaio de afinidade de ligação in vitro de hGH-AM864 (círculos) e AM864-hGH (triângulos invertidos) para hGHR-Fc, como descrito no Exemplo 25. HGH recombinante não modificada (quadrados) é mostrada para comparação. A FIG. 17 mostra os efeitos do tratamento térmico sobre a estabilidade de hGH e AM864-hGH, como descrito no Exemplo 26. A FIG. 17A é um gel de SDS-PAGE das duas preparações tratadas a 25 °C e 80 °C durante 15 minutos, enquanto que a FIG. 17B mostra a percentagem correspondente de atividade de ligação ao recetor da amostra a 80 °C em relação ao tratamento a 2 5 °C, indicando que o XTEN conferiu estabilidade ao calor e retenção de atividade à hGH e à proteína de fusão GHXTEN. A FIG, 18 mostra os resultados de um ensaio baseado em ELISA para determinar a capacidade de adição de um XTEN C-terminal para reduzir a afinidade de ligação de GHXTEN para se ligar ao recetor de GH, como descrito no Exemplo 25 . A FIG. 19 mostra a análise SDS-PAGE de hGH fundida com K288, com amostras de todo o processo de purificação, como descrito no Exemplo 19. A FIG. 2 0 mostra a análise SDS-PAGE de 5 pg de proteína purificada final de hGH fundida com Y576 nas configurações de hGH-Y576 e Y576-hGH submetidas a SDS-PAGE não redutora e redutora, conforme descrito no Exemplo 24, utilizando NuPAGE 4-12% de gel Bis-Tris de Invitrogen de acordo com as especificações do fabricante. A FIG. 21 mostra os perfis de cromatografia de exclusão de tamanho de duas construções GHXTEN Y576-GH e hGH-Y576 (terminal N a C) , mostrado como uma sobreposição, como descrito no Exemplo 24. A FIG. 22 mostra o perfil farmacocinético de duas construções de GHXTEN Y576-GH e hCH-Y576 (terminal N a C) apõs administração intravenosa a macacos cinomolgos, como descrito no Exemplo 30. Os resultados mostram que a orientação (N- versus C-terminal) de hGH em relação ao XTEN não afetou a depuração das proteínas de fusão. A FIG. 23 mostra o perfil farmacocinético após uma dose única de 5 mg/kg de AM864-hGH administrada subcutaneamente a macacos cinomolgos, com a concentração de hGH equivalente derivada mostrada (linha tracejada), como descrito no Exemplo 30. A semivida do terminal foi calculada como 33 horas por WinNonLin utilizando um ajuste de compartimento único. A FIG. 24 mostra os resultados da secreção de IGF-1 em macacos cinomolgos em resposta à administração de hGH ou GHXTEN AM864-hGH nas doses indicadas, como descrito no Exemplo 27. A FIG. 25 mostra os efeitos da administração de hGH ou AM864-hGH nas doses indicadas no peso corporal num modelo de rato hipox, como descrito no Exemplo 28. Os resultados mostram a retenção da atividade biológica pelas construções GHXTEN que é equivalente em potência à hGH, ainda com uma dosagem menos frequente. A FIG. 26 mostra os efeitos comparativos da administração de placebo, hGH e AM864-hGH no crescimento da cartilagem na placa de epifiseal tibial em ratos hipox, mostrado em secções transversais histológicas da tíbia após 9 dias de tratamento, como descrito no Exemplo 29. A FIG. 27 mostra os resultados farmacocinéticos de quatro proteínas de fusão hGH GHTXEN administradas a ratos por via subcutânea, em comparação com a hGH não modificada recomfoinante, como descrito no Exemplo 31. A FIG. 28 mostra os perfis de concentração de três construções de hGH XTEN após administração subcutânea a macacos cinomolgos, como descrito no Exemplo 32. A FIG. 29 mostra os resultados de um estudo farmacocinético de três níveis de doses do GHXTEN AE912-hGH-AE144 administrado a cynos SC masculino e feminino a 0,3 (círculos abertos), 1,5 (quadrados) e 7,5 mg/kg (triângulos), como descrito no Exemplo 33. A FIG. 30, mostra os resultados dos níveis de IGF-1 em cynos em resposta à administração de AE 912 -hGH-AE144, conforme descrito no Exemplo 33 (mesmos grupos que para a FIG. 29). A FIG. 31 mostra os resultados de uma experiência para comparar a biodisponibilidade do GHXTEN AE912-hGH-AE144 administrado por três rotas diferentes, como descrito no Exemplo 34. AE912-hGH-AE144 foi administrado a cynos SC masculino e feminino a 1,5 mg/kg por vias intravenosa (triângulo), subcutânea (círculos abertos) e intramuscular (quadrados) , com concentrações plasmãticas do GHXTEN mostradas na figura. A FIG. 32 mostra os efeitos da administração de veículo (círculos abertos), hGH recombinante dosificado a 5 nmol/kg/dia (círculos fechados), o GHXTEN AE912-hGK-AE144 em doses variáveis e frequência de dose (triângulos fechados = 0,5 nmol/kg/dia; triângulos abertos = 1,5 nmol/dia; quadrados = 3 nmol/kg/Q2D) de peso corporal em ratos hipox, como descrito no Exemplo 35. A FIG. 33 mostra os resultados de uma projeção modelada da habilidade da hGH ou do GHXTEN para manter os níveis sanguíneos dentro de uma janela terapêutica no modelo de rato hipox, com base nos resultados derivados dos dados retratados na FIG. 32, utilizando os mesmos grupos de dosagem. A FIG. 34 mostra os resultados de uma análise de uma cromatografia de exclusão de tamanho de amostras de construção de glucagão-XTen medidas contra padrões de proteína de massa molecular conhecida, com resultado do gráfico de absorvância em relação ao volume de retenção, como descrito no Exemplo 37. As construções de glucagão-XTEN são 1) glucagão -Y288; 2) glucagão Y-144; 3) glucagão-Y72; e 4) glucagão-Y36. Os resultados indicam um aumento na massa molecular aparente com o aumento do comprimento da porção XTEN. A FIG. 35 mostra o perfil farmacocinético (concentrações plasmáticas) em macacos cinomolgos após doses únicas de diferentes composições de GFP ligadas a polipéptidos não estruturados de comprimento variável, administrada subcutaneamente ou intravenosamente, conforme descrito no Exemplo 38. As composições foram GFP-L288, GFP-L576, GFP-XTEN_AF576, GFP-Y576 e XTEN_AD836-GFP. Amostras de sangue foram analisadas em vários momentos após a injeção e a concentração de GFP no plasma foi medida por meio de ELISA utilizando um anticorpo policlonal contra GFP para a captura e uma preparação biotinilada do mesmo anticorpo policlonal para deteção. Os resultados são apresentados como a concentração plasmáticas em função do tempo (h) após a dosagem e mostram, em particular, um aumento considerável da semivida para o XTEN_AD836-GFP, a composição com o maior comprimento da sequência de XTEN. A construção com o comprimento da sequência mais curto, a GFP-L288 teve a semivida mais curta. A FIG. 36 ilustra os resultados da escala alométrica para resposta humana prevista para Ex4-XTEN AE864 baseado em resultados medidos em quatro espécies animais; isto é, ratinhos, ratos, macacos cinomolgos e cães. A FIG. 36A mostra a semivida terminal medida em função da massa corporal, com um TI/2 predito em seres humanos de 139 h. A FIG. 36B mostra a depuração do fãrmaco medida em função da massa corporal, com um valor de taxa de depuração predito de 30 ml/h em seres humanos. A FIG 36C mostra o volume de distribuição medido em função da massa corporal, com um valor predito de 5970 ml em seres humanos. A FIG. 37 mostra o espectro de UV próximo de dicroísmo circular de Ex4-XTEN_AES64, realizado conforme descrito no Exemplo 42.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes das formas de realização da invenção serem descritas, é para ser entendido que tais formas de realização são fornecidas por meio de exemplo apenas, e que várias alternativas para as formas de realização da invenção descritas no presente documento podem ser empregues na prática da invenção, dentro da definição da invenção nas reivindicações. Numerosas variações, mudanças e substituições irão agora ocorrer para os peritos na especialidade sem nos afastarmos do âmbito da invenção, conforme definido nas reivindicações. A menos que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento possuem o mesmo significado como habitualmente entendido por um perito na especialidade ao qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalente aos descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. No caso de conflito, a memória descritiva da patente, incluindo as definições, controlarão. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são somente ilustrativos e não pretendem ser limitantes. Numerosas variações, mudanças e substituições irão agora ocorrer para os peritos na especialidade sem nos afastarmos do âmbito da invenção, conforme definido nas reivindicações.

DEFINIÇÕES

Como utilizado no presente documento, os seguintes termos têm o significados atribuídos a eles a menos que seja especificadG de outro mGdo.

Conforme utilizado na memória descritiva e nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem as respetivas referências plurais a não ser que o contexto claramente dite o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo misturas das mesmas.

Os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína” são utilizados indistintamente no presente documento para referir-se a polímeros de aminoãcidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoãcidos modificados e pode ser interrompido por nâo aminoãcidos. Os termos incluem também um polímero de aminoácido que foi modificado, por exemplo, por formação de ligações dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilaçâo ou qualquer outra manipulação, tal como por conjugação com una componente marcador.

Conforme é utilizado no presente documento, o termo "aminoácido" refere-se a aminoãcidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo mas não limitados a glicína e os isómeros óticos D ou L e análogos de aminoãcidos e peptidomiméticos. Os códigos simples ou de três letras são utilizados para designar os aminoãcidos. 0 termo "L-aminoácido natural" significa as formas L de isómeros óticos de glicina (C) , prolina (P) , alanina (A) , valina (V) , leucina (L) , isoleucina (I) , metionina (M) , cisterna (C) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptofano (W) , histidina (K) , lisina (K) , arginina (R) , glutamina (Q) , asparagina (N) , ácido glutâmico (E) , ácido aspárticc· (D) , serina (S) e treonina (T) . 0 termo "de ocorrência não natural", conforme é aplicado às seqtaências e conforme é utilizado no presente documentG, significa sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas que não têm uma contrapartida, não são complementares ou não têm um grau elevado de homologia com uma sequência de tipo selvagem u ocorrência natural encontrada num mamífero. Por exemplo, um polipéptido que não ocorre naturalmente ou fragmento pode compartilhar não mais do que 99%, 98%, 95%, 90%, 80 %, 70%, 60%, 50% ou mesmo menos identidade de sequência de aminoácidos em comparação com uma sequência natural quando devidamente alinhados.

Os termos "hidrofílico" e "hidrofóbico" referem-se ao grau de afinidade que uma substância tem com a água. Uma substância hidrofílica tem uma forte afinidade para a água, tendendo a dissolver-se, misturar-se com, humeceder-se com água, enquanto uma substância hidrofóbica não possui substancialmente de afinidade para a água, tendendo a repelir e não absorver água e tendendo a não se dissolver ou misturar com ou ser molhado por água. Os aminoácidos podem ser caracterizados com base na sua hidrofobicidade. Várias escalas foram desenvolvidas. Um exemplo é uma escala desenvolvida por Levitt, M, et ai., J Mol Biol (1976) 104:59, que está listada em Hopp, TP, et al. , Proc Nat.1 Acad Sei USA (1981) 78:3824. Exemplos de "aminoácidos hidrofílícos" são arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina e glutamina. De particular interesse são os aminoácidos hidrofílicos aspartato, glutamato e serina e glicina. Exemplos de "aminoácidos hidrofóbicos" são triptofano, tirosina, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina e valina.

Um "fragmento" é uma forma truncada de uma. proteína biologicamente ativa nativa que retém pelo menos uma porção da atividade terapêutica e/ou biológica. Uma "variante" é uma proteína com homologia de sequência com a proteína biologicamente ativa nativa que retém pelo menos uma porção da atividade terapêutica e/ou biológica da proteína biologicamente ativa. Por exemplo, uma proteína variante pode compartilhar pelo menos 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoãcidos com a proteína biologicamente ativa de referência. Conforme é utilizado no presente documento, o termo "fração de proteína biologicamente ativa" inclui proteínas modificadas deliberadamente, como por exemplo, por mutagénese dirigida ao local, inserções ou acidentalmente através de mutações.

Uma "célula hospedeira," inclui uma célula individual ou cultura de células que pode ser ou tem sido um recetor para os vetores objetos. As células hospedeiras incluem progénie de uma única célula hospedeira. A progénie pode não ser necessariamente completamente idêntica (na morfologia ou na genõmica do complemento de ADN total) à célula parental original devido a mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfetadas in vivo com um vetor desta descrição. "Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipéptidos divulgados no presente documento, significa um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente poderiam interferir com utilizações diagnosticas ou terapêuticas para o polipéptido, e pode incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteinãceos ou não proteinãceos. Tal como é aparente para um perito na especialidade, um polinucleõtido de ocorrência não natural, péptido, polipéptido, proteína, anticorpo ou fragmentos dos mesmos, não requer "isolamento" para o distinguir da sua contraparte que ocorre naturalmente. Além disso, um "concentrado", "separado"" ou "diluído" polinucleõtido, péptido, polipéptido, proteína, anticorpo ou fragmentos dos mesmos, é distinguível da sua, contraparte de ocorrência natural pelo facto de a concentração ou o número de moléculas por volume ser geralmente maior do que a de sua contrapartida natural. Mo geral, um polipéptido produzido por meios recombinantes e expresso numa célula hospedeira é considerado como "isolado".

Um polinucleótido ou um ácido nucleico que codifica um polipéptido "isolado" ou outro ácido nucleico que codifica um polipéptido é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico que codifica o polipéptido. Uma molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido isolada é outra que não na forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico que codificam o polipéptido isoladas distinguem-se portanto da molécula de ácido nucleico que codifica o polipétido específico tal como existe em células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipéptido isolada inclui moléculas de ácido nucleico que codificam o polipéptido contida em células que vulgarmente expressam o polipéptido onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica ou extra-cromossómica diferente daquela de células naturais.

Uma proteína "quimérica" contém pelo menos um polipéptido de fusão compreendendo regiões numa posição diferente na sequência do que a que ocorre na natureza. As regiões podem normalmente existir em proteínas separadas e são reunidas no polipéptido de fusão; ou podem existir normalmente na mesma proteína mas são colocados num novo arranjo no polipéptido de fusão. Pode criar-se uma proteína quimérica, por exemplo, por meio de síntese química ou criando e traduzindo um polinucleótido no qual as regiões peptídicas são codificadas na relação desejada. "Conjugado", "ligado", "fundido", e "fusão" são utilizados indistintamente no presente documento. Estes termos referem-se à união de dois ou mais elementos ou componentes químicos, por quaisquer meios incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Por exemplo, um promotor ou potenciador está operativamente ligado a uma sequência codificadora se afeta a transcrição da sequência. Em geral, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a serem ligadas sâo contíguas e na fase de leitura ou em grelha. Uma "fusão em grelha" refere-se à união de duas ou mais grelhas de leitura abertas (ORFs -open reading frames) para formar uma ORF contínua mais longo, de uma forma que mantém a grelha de leitura correta das ORFs originais. Consequentemente, a proteína de fusão recombinante resultante é uma única proteína contendo dois ou mais segmentos que correspondem a polipéptidos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos nâo são normalmente tão ligados na natureza).

No contexto de polipéptidos, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos num polipéptido numa direção da terminação amino para carboxilo na qual os resíduos que são vizinhos entre si na sequência são contíguos na estrutura primária do polipéptido. Uma "sequência parcial" é uma sequência linear de parte de um polipéptido que é conhecido pGr compreender resíduos adicionais numa ou em ambas as direções. "Heterólogo" significa derivados de uma entidade genotípica distinta do resto da entidade para a qual está a ser comparada. PGr exemplo, uma sequência rica em glicina removida da sua sequência de codificação nativa e operativamente ligada a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é uma sequência heteróloga rica em glicina. 0 termo "heterólogo", tal como aplicado a um polinucleótido, um polipéptido, significa que o polinucleótido ou polipéptido é derivado de uma entidade genotípica distinta da do resto da entidade à qual está a ser comparada.

Os termos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos", "nucleótidos" e "oligonucleotides" são utilizados indistintamente. Referem-se a uma forma polimêrica de nucleótidos de qualquer comprimento, desoxirribonucleótidos ou ribonucleotides ou análogos dos mesmos. Os polinucleótidos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleótidos: regiões codifica.nt.es ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definidos a partir da análise de ligação, exões, intrões, ARN mensageiro (ARNm), ARN de transferência, ARN ribossõmico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plasmídeos, vetores, ADN ísoladG de qualquer sequência, ARN ísGladG de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos de nucleótidos. Se estiver presente, podem ser feitas modificações da estrutura do nucleôtido antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleótidos pode estar interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleótido pode ser modificado além disso depois da polimerização, tal como por conjugação com um componente marcador. 0 termo "complemento de um polinucleótido'' denota uma molécula polinucleotídica tendo uma sequência de bases complementar e orientação inversa em comparação com uma sequência de referência, de modo a poder hibridar com uma sequência de referência com fidelidade completa. "Recombinante", tal como aplicado a um polinucleótido que significa que o polinucleótido é o produto de combinações de várias etapas de clonagem in vitro, de restrição e/ou ligação e outros procedimentos que resultam numa construção que podem potencialmente ser expressa numa célula hospedeira.

Os termos "gene" ou "fragmento de gene" são utilizados indistintamente no presente documento. Referem-se a um polinucleótido contendo pelo menos uma grelha de leitura aberta que é capaz de codificar uma proteína particular depois de ser transcrita e traduzida. Um gene ou fragmento de gene pode ser genómico ou ADNc, desde que o polinucleótido contenha pelo menos uma grelha de leitura aberta, a qual pode cobrir toda a região de codifieação ou um segmento da mesma. Um "gene de fusão" é um gene composto de peio menos dois polinucleótidos heterólogos que estão ligados entre si. "Homologia" ou "homólogo" refere-se à similaridade de sequência ou permutabilidade entre duas ou mais sequências polinucleotídicas ou duas ou mais sequências polipeptídicas. Quando se utiliza um programa tal como BestF.it para determinar a identidade de sequência, similaridade ou homologia entre duas sequências de aminoãcidos diferentes, os ajustes pré-definidos podem ser utilizados ou uma matriz de pontuação adequada, tais como blosum45 ou blosumSO, pode ser selecionada para otimizar as pontuações de identidade, similaridade ou homologia. Preferentemente, os polinucleótidos que sâo homólogos são aqueles que hibridam sob condições restringentes tal como definidas no presente documento e têm pelo menos 70%, preferentemente pelo menos 80%, mais preferentemente pelo menos 90%, mais preferentemente 95%, mais preferentemente 97%, mais preferentemente 98% e ainda mais preferentemente 99% de identidade de sequência para essas sequências. "Ligação" refere-se ao processo de formar ligações fosfodiêster entre dois fragmentos de ácidos nucleicos ou genes, ligando-os juntamente. Para ligar os fragmentos de ADN ou genes juntamente, as extremidades do ADN têm que ser compatíveis entre si. Em alguns casos, sis extremidades serão díretamente compatíveis após digestão com endonuclease. Contudo, pode ser necessário primeiro converter as extremidades escalonadas comumente produzidas após a digestão com endonuclease em extremidades rombas para torná-las compatíveis para a ligação.

Os termos "condições restringentes" ou "condições de hibridação restringentes" incluem referência a condições sob as quais um polinucleótido vai hibridar com a sua sequência alvo, a um grau detetavelmente maior do que outras sequências (por exemplo, pelo menos duas vezes sobre o fundo). Em geral, a restringência da hibridação é expressa, em parte, com referência à temperatura e à concentração de sal sob a qual a etapa de lavagem ê levada a cabo. Tipicamente, as condições restringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de ião Na, tipicamente de cerca de 0,01 a 1.0 M de concentração de ião Na (ou outros sais) num pH de

7.0 a 3,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para polinucleótidos curtos (por exemplo, de 10 a 50 nucleôtidos) e pelo menos cerca de 60 °C para polinucleótidos longos (por exemplo, superiores a 50 nucleôtidos) , por exemplo, "condições restringentes" podem incluir hibridação em formamida a 50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e três lavagens durante 15 min cada um em 0,1 xSSC/SDS a 1% a 60°C a 65°C. Alternativamente, temperaturas de cerca de 65 °C, 60°C, 55°C ou 42 °C podem ser utilizadas. A concentração de SSC pode variar de cercst de 0,1 a 2xSSC, estando a SDS presente a cerca de 0,1%. Tais temperaturas de lavagem são tipicamente selecionadas para serem cerca de 5 °C a 20 CC inferiores ao ponto de fusão térmica para a sequência específica com uma força iónica e um pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iónica e pH definidos) a qual 50% da sequência alvo hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Uma equação para calcular Tm e condições para hibridação de ácido nucieico são bem conhecidas e podem ser encontradas em Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainviev; N.Y.; veja-se especif icamente o volume 2 e o capítulo 9. Tipicamente, os reagentes de bloqueio são utilizados para bloquear a hibridação não específica. Tais reagentes de bloqueio incluem, por exemplo, ADN de esperma de salmão cortado e desnaturado a cerca de 100-200 pg/ml. 0 solvente orgânico, tal como a fcrmamida a uma concentração de cerca de 35-50% v/v, pode também ser utilizado em circunstâncias particulares, tal como para hibridações de ARN: ADN. Variações úteis nestas condições de lavagem serão prontamente aparentes para aqueles peritos comuns na especialidade.

Os termos "percentagem de identidade" e "% de identidade", conforme aplicado às sequências de polinucleótidos, referem-se à percentagem de correspondências de resíduos entre pelo menos duas sequências polinucleotídicas alinhadas utilizando um algoritmo padronizado. Tal algoritmo pode inserir, de uma forma padronizada e reprodutível, lacunas nas sequências que estão a ser comparadas de modo a otimizar o alinhamento entre duas sequências e consequentemente alcançar uma comparação mais significativa das duas sequências. A percentagem de identidade pode ser medida ao longo do comprimento de uma sequência de polinucleótido definido inteiro ou pode ser medido ao longo de um comprimento mais curto, por exemplo, ao longo do comprimento de um fragmento tomado a partir de uma maior, e definida sequência polinucleotídica, por exemplo, um fragmento de pelo menos 45, pelo menos 60, pelo menos 90, pelo menos 120, pelo menos 150, pelo menos 210 ou pelo menos 450 resíduos contíguos. Esses comprimentos são apenas exemplificativos e entende-se que qualquer comprimento de fragmento suportado pelas sequências mostradas no presente documento, nos quadros, figuras ou Listagem de Sequências, pode ser utilizado para descrever um comprimento sobre o qual a percentagem de identidade pode ser medida. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos", no que diz respeito às sequências de polipéptido identificadas no presente documento, é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência de consulta que sâo idênticos aos resíduos de aminoácido de uma segunda sequência polipeptídica de referência ou uma porção da mesma, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a máxima percentagem de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. 0 alinhamento para propósitos de determinação da percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias formas que estão dentro da experiência da técnica, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente, como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo sob o comprimento total das sequências a serem comparadas. A percentagem de identidade pode ser medida ao longo do comprimento de uma sequência de polipéptido definido inteiro ou pode ser medida ao longo de um comprimento mais curto, por exemplo, ao longo do comprimento de um fragmento tomado a partir de uma maior, e definida sequência polipeptídica, por exemplo, um fragmento de pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 70 ou pelo menos 150 resíduos contíguos. Esses comprimentos são apenas exempiificativos e entende-se que qualquer comprimento de fragmento suportado pelas sequências mostradas no presente documento, nos quadros, figuras ou Listagem de Sequências, pode ser utilizado para descrever um comprimentG sobre o qual a percentagem de identidade pode ser medida. 0 termo "não repetitividade" tal como utilizado no presente documento no contexto de um polipéptido refere-se a uma falta ou grau limitado de homologia interna numa sequência de péptido ou polipéptido. 0 termo "substancialmente não repetitivo" pode significar, por exemplo, que existem poucos ou nenhuns casos de quatro aminoácidos contíguos na sequência que são tipos de aminoácidos idênticos ou que o polipéptido tem uma pontuação subsequência (definida infra) de 10 ou menos ou que não existe um padrão na ordem, da terminação N para C, dos motivos de sequência que constituem a sequência polipeptídica. 0 termo "repetitividade" ta.1 como utilizado no presente documento no contexto de um polipéptido refere-se aG grau limitado de homologia interna numa sequência de péptido ou polipéptido. Ac· contrário, uma sequência "repetitiva" pode conter várias cópias idênticas de sequências curtas de aminoácidos. Por exemplo, uma sequência polipeptídica de interesse pode ser dividida em sequências de η-mero e o número de sequências idênticas pode ser contado. As sequências altamente repetitivas contêm uma grande fração de sequências idênticas enquanto as sequências não repetitivas contêm pGucas sequências idênticas. No contexto de um polipéptido, uma sequência pode conter múltiplas cópias de sequências mais curtas de comprimento definido ou variável ou motivos, em que os próprios motivos têm sequências não repetitivas, tornando o polipéptido de comprimento completo substancialmente não repetitivo. 0 comprimento do polipéptido dentro do qual a não repetitividade é medida pode variar desde 3 aminoácidos até cerca de 200 aminoácidos, desde cerca de 6 até cerca de 50 aminoácidos ou desde cerca de 9 até cerca de 14 aminoácidos. A "repetitividade" utilizada, no contexto das sequências polinucleotídicas refere-se ao grau de homologia interna na sequência tal como, por exemplo, a frequência de sequências de nucleõtidos idênticas de um dado comprimento. A repetitividade pode, por exemplo, ser medida por análise da frequência de sequências idênticas.

Um "vetor" é uma molécula de ácido nucleico, preferentemente auto-replicante num hospedeiro apropriado, que transfere uma molécula de ácido imcleico inserida para dentro e/ou entre células hospedeiras. 0 termo inclui vetores que funcionam principalmente por inserção de ADN ou de ARN numa célula, a replicação de vetores que funcionam principalmente para a replicação de ADN ou ARN e vetores de expressão que funcionam para transcrição e/ou tradução do ADN ou ARN. Também estão incluídos vetores que proporcionam mais de uma das funções acima. Um "vetor de expressão" é um polinucleótido que, quando introduzido numa célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido num polipéptido. Um "sistema de expressão" normalmente conota uma célula hospedeira adequada compreendida por um vetor de expressão que pode funcionar para produzir um produto de expressão desejado. "Resistência à degradação do soro", conforme aplicado a um polipéptido, refere-se à capacidade dos polipéptidos de suportarem a degradação no sangue ou nos seus componentes, o que tipicamente envolve proteases no soro ou plasma. A resistência à degradação do soro pode ser medida combinando a proteína com soro ou plasma humano (ou de ratinho, rato, macaco, conforme apropriado), tipicamente durante um intervalo de dias (por exemplo, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 dias) tipicamente a cerca de 37 °C. As amostras para estes pontos de tempo podem ser executadas num ensaio Western blot e a proteína é detetada com um anticorpo. 0 anticorpo pode ser um marcadGr na proteína. Se a proteína mostrar uma única banda no Western, onde o tamanho da proteína é idêntico ao da proteína injetada, então não ocorreu nenhuma degradação. Neste método exemplificative, o ponto de tempo em que 50% da proteína é degradada, tal como avaliado por transferências de Western ou técnicas equivalentes, é a semivida de degradação do soro ou "semivida no soro" da prGteina. 0 termo "ti/2" conforme é utilizado no presente documento significa a. semivida, terminal como ln(2)/Kel. Kei é a taxa de eliminação terminal constante calculada por regressão linear da porção linear terminal de concentração de log vs curva de tempo. Semivida tipicamente refere-se ao tempo necessário para metade da quantidade de uma substância administrada depositada num organismo vivo a ser metabolizada ou eliminada por processos biológicos normais. Os termos "ti/2"/ "semivida terminal", "semivida de eliminação" e "semivida de circulação" são utilizados indistintamente no presente documento. "Fator de massa molecular aparente" ou "massa molecular" são termos relacionados referindo-se a uma medida do aumento ou diminuição relativa da massa molecular aparente exibido por uma sequência de aminoãcidos particular. A massa molecular aparente é determinada utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SSC) e métodos semelhantes comparados com os padrões de proteínas globulares e é medido em unidades de "kD aparente". 0 fator massa molecular aparente é a razão entre a massa molecular aparente e a massa molecular real; o ultimo predito pela adição, com base na composição de aminoãcidos, da massa molecular calculada de cadet tipo de aminoácido na composição. 0 "raio hidrodinâmico" ou "raio de Stokes" é o raio efetivo (Rh em nm) de uma molécula numa solução medido por assumir que é um corpo que se move através da solução e resistido pela viscosidade da solução. Na formas de realização da invenção, as medições do raio hidrodinâmico das proteínas de fusão XTEN correlacionam-se com o "Fator de Massa Molecular Aparente", que é uma medida mais intuitiva. 0 "raio hidrodinâmico" de uma proteína afeta a sua taxa de difusão em solução aquosa, bem como a sua capacidade para migrar em géis de macromoléculas. 0 raio hidrodinâmico de uma proteína é determinado pela sua massa molecular, bem como pela sua estrutura, incluindo forma e compacidade. Métodos para a determinação do raio hidrodinâmico são bem conhecidos na técnica, tal como pela utilização de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), conforme descrito nos documentos de Patente U.S. N°s 6.406.632 e 7,294,513, A maioria das proteínas tem estrutura globular, que é a estrutura tridimensional mais compacta que uma proteína pode ter com o menor raio hidrodinâmico. Algumas proteínas adotam uma conformação aleatória e aberta, não estruturado ou "linear" e como resultado têm um raio hidrodinâmico muito maior em comparação com proteínas globulares típicas de massa molecular semelhante, "Condições fisiológicas" refere-se a um conjunto de condições num hospedeiro vivo, bem como as condições in vitro, incluindo temperatura, concentração de sal, pH, que imitam as condições de um indivíduo vivo. Uma série de condições fisiologicamente relevantes para a utilização em ensaios in vitro foram estabelecidas. Em geral, um tampão fisiológico contém uma concentração fisiológica de sal e é ajustado para um pH neutro variando desde cerca de 6,5 até cerca de 7,3 e preferentemente desde cerca de 7,0 até cerca de 7,5. Uma variedade de tampões fisiológicos está listada em Sambrook et al. (1989) . A temperatura fisiologicamente relevante varia desde cerca de 25 °C até cerca de 38 °C, e preferentemente desde cerca de 35°C e cerca de 37°C.

Um "grupo reativo" é uma estrutura química que pode ser acoplada a um segundo grupo reativo. Exemplos de grupos reativos são grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo, grupos hidroxilo, grupos aldeído, grupos azida. Alguns grupos reativos podem ser ativados para facilitar o acoplamento com um segundo grupo reativo. Exemplos não limitantes para ativação são a reação de um grupo carboxilo com carbodiimida, a conversão de um grupo carboxilo num éster ativado ou a conversão de um grupo carboxilo numa função azida. "Agente de libertação controlada", "agente de libertação lenta", "formulação de depósito" ou "agente de libertação sustentada" são utilizados indistintamente para se referir a um agente capaz de prolongar a duração da libertação de um polipéptido da invenção em, relação à duração da libertação quando o polipéptido é administrado na ausência de agente. Forma de realização diferentes da presente invenção podem ter taxas de libertação diferentes, resultando em quantidades terapêuticas diferentes.

Os termos "antigénio", "antigénio alvo" ou "imunogéniG" são utilizados indistintamente no presente documento para se referir à estrutura ou determinante de ligação que um fragmento de anticorpo ou um agente terapêutico baseado em fragmentos de anticorpo se liga ou tem especificidade contra. 0 termo "carga útil" conforme é utilizado no presente documento refere-se a uma proteína ou sequência peptídica que tem atividade biológica ou terapêutica; a contrapartida ao farmacõforo de pequenas moléculas. Exemplos de cargas úteis incluem, mas não estão limitados a, citocinas, enzimas, hormonas e sangue e fatores de crescimento. Cargas úteis podem ainda compreender frações geneticamente fundidas ou conjugadas quimicamente, tais como agentes quimioterapêuticos, compostos antivirals, toxinas ou agentes de contraste. Estas frações conjugadas podem ser unidas ao resto do polipéptido através de um ligante que pode ser clivável ou não clivãvel. 0 termo "antagonista", conforme utilizado no presente documento, inclui qualquer molécula que bloqueia parcial ou completamente, inibe ou neutraliza uma atividade biológica ou um polipéptido nativo divulgado no presente documento. Os métodos para identificar antagonistas de um polipéptido podem compreender o contacto de um polipéptido nativo com uma molécula antagonista candidata e a medição de uma alteração detetável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipéptido nativo. No contexto da presente invenção, antagonistas podem incluir proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, anticorpos ou quaisquer outras moléculas que diminuem o efeito de uma proteína biologicamente ativa. 0 termo "agonista" é utilizado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que imita uma atividade biológica de um polipéptido nativo divulgado no presente documento. As moléculas agonistas adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequências de aminoácidos de polipéptidos nativos, péptidos, moléculas orgânicas pequenas, etc. Os métodos para identificar agonistas de um polipéptido podem compreender o contacto de um polipéptido nativo com uma molécula agonista candidata e a medição de uma alteração detetável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipéptido nativo. "Atividade" para os fins do presente documento refere-se uma ação ou efeito de um componente de uma proteína de fusão consistente com a da proteína biologicamente ativa nativa correspondente, em que "atividade biológica" refere-se a uma função ou efeito biológico in vitro ou in vivo, incluindo mas não limitados a ligação a recetor, atividade antagonista, atividade agonista ou uma resposta celular ou fisiológica..

Conforme é utilizado no presente documento, "tratamento" ou "tratar", ou "paliar" ou "melhorar" é utilizado indistintamente no presente documento. Estes termos referem-se a uma abordagem para a obtenção de resultados benéficos ou desejados incluindo, mas não limitados a, um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico se entende a erradicação ou melhora do distúrbio subjacente a ser tratado. Também, um benefício terapêutico é alcançado com a erradicação ou melhora de um ou mais dos sintomas fisiológicos associados ao distúrbio subjacente, de modo que uma melhora é observada no indivíduo, não obstante que o indivíduo ainda possa estar afligido com o distúrbio subjacente. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença específica, ou a um indivíduo que relate um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, mesmo que o diagnóstico desta doença não tenha sido feito.

Um "efeito terapêutico", conforme utilizado no presente documento, refere-se a um efeito fisiológico, incluindo, mas não limitado a, cura, mitigação, melhoria ou prevenção de doenças em seres humanos ou outros animais, ou para melhorar o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais, causada por um polipéptido de fusão da invenção diferente da capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigénico possuído pela proteína biologicamente ativa. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz encontra-se dentro da capacidade dos peritos na especialidade, especialmente à luz da divulgação detalhada proporcionada no presente documento.

Os termos "quantidade terapeuticamente eficaz" e "dose terapeuticamente eficaz", conforme utilizado no presente documento, refere-se a uma quantidade de uma proteína biologicamente ativa, sozinho ou como parte de uma composição de proteína de fusão, que é capaz de ter qualquer efeito detetável e benéfico sobre qualquer sintoma, aspeto, parâmetro ou características medidos de um estado ou condição de doença quando administrado em uma ou doses repetidas para um indivíduo. Este efeito não precisa ser absoluto para ser benéfico. 0 termo "regime de dose terapeuticamente eficaz", conforme utilizado no presente documento, refere-se a uma programação para doses administradas consecutivamente de uma proteína biologicamente ativa, sozinho ou como parte de urna composição de proteína de fusão, em que as doses são administradas em quantidades terapeuticamente eficazes para resultar em efeito benéfico sustentado em qualquer sintoma, aspeto, Parâmetro medido ou características de um estado ou condição de doença.

I) . TÉCNICAS GERAIS A prática do presente invento utiliza, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de irnunologia, bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genómíca e ADN recombinante, que estão dentro da habilitação comum na especialidade. Veja-se Sambrook et al. , J. et al. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edição, Cold. Spring Harbor Laboratory Press, 2001; "Current protocols in molecular biology", F. M. Ausubel, et al. eds.,1987; a série "Methods in Enzymology," Academic Press, San Diego, CA. ; "PCR 2-. a practical approach", M. J. MacPherson, B.D.

Hames and G.R. Taylor eds., Oxford University Press, 1995; "Antibodies, a laboratory manual" HarlGw, E. and Lane, D. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; "Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," IIa Edição, McGraw-Hill, 2005; e Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," 4a edição, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000.

II) . HORMONA DO CRESCIMENTO A presente invenção refere-se, em parte, a composições de proteínas de fusão de hormona do crescimentG (GH) , incluindo hormona do crescimento humana (hGH), conforme definido nas reivindicações. (A) Proteínas de hormona do crescimento "Hormona do Crescimento" ou "GH" significa uma proteína da hormona do crescimento e espécies e variantes de sequências da mesma, e inclui, mas não está limitada a, a sequência de 191 aminoãcidos de cadeia única de GH humana. 0 GH pode ser a proteína nativa, de comprimento total ou pode ser um fragmento truncado ou uma variante de sequência que retém pelo menos uma porção da atividade biológica da proteína nativa. Existem dois tipos conhecidos de GH humana (a seguir "hGH") derivada da glândula pituitária: um corn um peso molecular de cerca, de 22.000 daltons (hGH de 22 kD) e o outro tendo um peso molecular de cerca de 20,000 daltons (hGH de 20 kD). 0 HGH de 20 kD tem uma sequência de aminoãcidos que corresponde à da HGH de 22 kD que consiste em 191 aminoãcidos, exceto que estão faltando resíduos de 15 aminoãcidos da 32a a 46a da hGH de 22 kD. Alguns relatórios mostraram que o hGH de 20 kD mostrou apresentar riscos mais baixos e maior atividade do que a hGH de 22 k.D. A invenção contempla a utilização da 22 kD, A hGH de 2 0 kD, bem como espécies e variantes de sequência e fragmentos truncados da mesma como sendo apropriados para utilização como um parceiro de fusão com XTEN divulgado no presente documento para composições de GHXTEN. 0 gene clonado para hGH foi expresso numa forma segregada em Eschericha coli (Patente dos Estados Unidos N ° 4.898.830; Chang, C. N., et al, , Gene 55:189 [1987]) e sua sequência de aminoãcidos e ADN foi relatado (Goeddel, et al. Nature,281:544 [1979); Gray, et al., Gene 39: 247[1985}]. A invenção contempla a inclusão nas sequências de composições de GHXTEN com hornologia às sequências de GH, fragmentos de sequência que são naturais, Tais como de seres humanos, primatas não humanos, mamíferos (incluindo animais domésticos) e variantes de sequência nãc· naturais que retêm pelo menos uma porção da atividade biológica ou função biológica da GH e/ou que são úteis para prevenir, tratamento, mediar ou melhorar uma doença relacionada com GH, deficiência, distúrbio ou condição patológica. As sequências de GH de não mamífero estão bem descritas na literatura. Por exemplo, um alinhamento de sequência de GHs de peixe pode ser encontrada em Genetics and Molecular Biology 2003 26 p.295-300. Uma análise da evolução de sequências de GH aviária é apresentada em Journal of Evolutionary Biology 2006 19 p.844-854. Além disso, as sequências nativas homólogas à GH humana podem ser encontradas por técnicas de busca de homologia padrão, tal como NCBI BLAST.

Os efeitos da GH nos tecidos do corpo geralmente podem ser descritos como anabolizantes. Como a maioria das hormonas de outras proteínas, GH nativo age por interação com um recetor de membrana plasmãtica específico, referido como recetor de hormona do crescimento. GH atua no fígado e outros tecidos para estimular a produção de IGF-1, que é responsável pelos efeitos de GH que promovem o crescimento e também reflete a quantidade produzida. IGF--1, por sua vez, tem efeitos estimuladores na atividade dos osteoblastos e dos condrócitos para promover o crescimento ósseo. Numa forma de realização, a invenção proporciona um GHXTEN que exibe pelo menos uma das propriedades de GH nativo descrita anteriormente no presente documentG.

Numa forma de realização, a GH incorporada nas composições em questão é um polipéptido recombinante com uma sequência correspondente a uma proteína encontrada na natureza. Noutra forma de realização, a GH é uma variante de sequência, fragmento, homólogo ou um mimético de uma sequência natural que retém pelo menos uma porção da atividade biológica da GH nativa correspondente. G Quadro 1 fornece uma lista não limitativa de sequências de GHs de uma grande variedade de espécies de mamíferos que são abrangidas pelas proteínas de fusão GHXTEN desta divulgação. Qualquer uma destas sequências de GH ou derivados homólogos construídos por mistura de mutações individuais entre espécies ou famílias que retém pelo menos uma. porção da atividade biológica da GH nativa pode ser útil para as proteínas de fusâG desta descrição. GH que pode ser incorporado numa proteína de fusão GHXTEN pode incluir uma proteína que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do Quadro 1.

Quadro 1: Sequências de aminoácidos da hormona do crescimento de espécies de animais

Ill) . COMPOSIÇÕES DE PROTEÍNA DE FUSÃO DE HORMONA DO CRESCIMENTO A presente invenção refere-se, em parte, a composições de proteínas de fusão de hormona do crescimento (GH) definidas nas reivindicações. Num aspeto, a invenção proporciona proteínas de fusão monoméricas isoladas de GH compreendendo a sequência de comprimento total ou variantes de sequência de GH humana ligadas covalentemente a polipéptidos recombinantes estendidos ("XTEN" ou "XTENs"). Conforme descrito mais completamente abaixo, as proteínas de fusão incluem opcionalmente sequências espaçadoras que compreendem ainda sequências de clivagem para libertar a GH da proteína de fusão quando é realizada por uma protease, libertando GH da(s) sequência(s) de XTEN.

Num aspeto, a divulgação proporciona uma proteína de fusão isolada compreendendo pelo menos uma primeira proteína de hormona do crescimento biologicamente ativa ligada covalentemente a um ou mais polipéptidos recombinantes estendidos ("XTEN"), resultando em uma composição de proteína de fusão de hormona do crescimento-XTEN (a seguir no presente documento "GHXTEN") . Numa forma de realização, a hormona do crescimento e hormona do crescimento humanos ou uma variante de sequência de hGH. Conforme descrito mais completamente abaixo, as proteínas de fusão incluem opcionalmente sequências espaçadoras que compreendem ainda sequências de clivagem para libertar a GH da proteína, de fusão quando é realizada, por uma protease. 0 termo "GHXTEN", conforme utilizado no presente documento, pretende englobar polipéptidos de fusão que compreendem uma ou mais regiões de carga útil cada uma compreendendo uma GH biologicamente ativa que medeia uma ou mais atividades biológicas ou terapêuticas associadas à hormona do crescimento e pelo menos uma outra região compreendendo pelo menos um primeiro polipéptido XTEN que serve como um transportador. A GH das composições de objeto, particularmente aquelas divulgadas no Quadro 1, juntamente com suas correspondentes sequências de aminoácidos correspondentes e ácidos nucleicos, são bem conhecidos na arte e descrições e sequências estão disponíveis em bancos de dados públicas, como as bases de dados do Chemical Abstracts Services (por exemplo, o Registo CAS), GenBank, The Universal Protein Resource (UniProt) e bases de dados por assinatura tais como GenSeq (e.g., Derwent). As sequências polinucleotídicas podem ser uma sequência polinucleotídica de tipo selvagem que codifica uma GH dada (por exemplo, quer em comprimento completo ou maduro), ou em alguns casos a sequência pode ser uma variante da sequência polinucleotídica do tipo selvagem (por exemplo, um polinucleótido que codifica a proteína biologicamente ativa do tipo selvagem, em que a sequência de ADN do polinucleótido foi otimizada, por exemplo, para expressão em espécies particulares; ou um polinucleótido que codifica uma variante da proteína, de tipo selvagem, tal como um mutante dirigida ao local ou uma variante alélica. Está bem dentro da capacidade do perito na especialidade utilizar uma sequência de ADNc de tipo selvagem ou de consenso ou uma variante otimizada para codões de uma GH para criar construções de GHXTSN contempladas no presente documento utilizando métodos conhecidos na técnica e/ou em conjunto com a orientação e métodos proporcionados no presente documento e descritos mais completamente nos Exemplos. 0 GH para inclusão no GHXTEN inclui qualquer hormona do crescimento ou variante de sequência de interesse ou função biológica, terapêutica, profilática ou de diagnóstico, ou que seja útil para mediar ou prevenir ou melhorar uma doença, distúrbio ou condição patológica associado a crescimento, deficiência de hormona do crescimento ou defeito quando administrado a um indivíduo. De particular interesse são as composições de proteínas de fusão GHXTEN para as quais um aumento num parâmetro farmacocinético, solubilidade aumentada, estabilidade aumentada ou alguma outra propriedade farmacêutica melhorada em comparação com a GH nativa, ou para o qual o aumento da semivida terminal melhoraria a eficácia, segurança, ou resultar em reduzir a frequência de dosagem e/ou melhorar a conformidade do paciente. Assim, as composições da proteína de fusão GHXTEN são preparadas com vários objetivos em mente, incluindo a melhoria da eficácia terapêutica da GH bioativa, por exemplo, aumentando a exposição in vivo ou o comprimento que o GHXTEN permanece dentro da janela terapêutica quando administrado a um indivíduo, em comparação com uma GH não ligada a XTEN.

Numa forma de realização, a GH incorporada nas composições em questão pode ser um polipéptido recombinante com uma sequência correspondente a uma proteína encontrada na natureza. Noutra forma de realização, a GH é uma variante de sequência, fragmento, homologo ou um mimético de uma sequência natural que retêm pelo menos uma porção da atividade biológica da GH nativa. Em exemplos não limitativos, uma GH é uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de proteína selecionada a partir do Quadro 1. Numa forma de realização, uma proteína de fusão GHXTEN compreende uma única molécula de GH ligada a um XTEN (como descrito ma is completamente abaixo) . Noutra forma de realização, o GHXTEN compreende uma primeira GH e uma segunda molécula da mesma GH, resultando em uma proteína de fusão compreendendo as duas GH ligadas a um ou mais XTEN (por exemplo, ou duas moléculas de hGH) . Nalguns casos das formas de realização anteriores, os componentes GH e XTEN são de uma. configuração de terminal N para C selecionada a partir do Quadro 5, Noutra forma de realização, a proteína de fusão GHXTSN compreende uma única molécula de GH ligada a um primeiro e um segundo XTEN, com uma configuração N- a C-terminal de XTEN-GH-XTEN, em que a GH é uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de proteína selecionada a partir do Quadro 1, e o primeiro e/ou o segundo XTEN são sequências que exibem, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência, selecionada a partir do Quadro 3 .

No geral, o componente parceiro de fusão GH do GHXTEN exibe uma especificidade de ligação a um dado alvo ou a outra característica biológica desejada quando utilizado in vivo ou quando utilizado num ensaio in vitro. Por exemplo, o GHXTEN é um agonista, tendo a capacidade de se ligar a um recetor transmembranar para hormona do crescimento. Numa forma de realização, a ligação de GHXTEN ao recetor de crescimento conduz à dimerização do recetor e leva a pelo menos uma pGrçâo da ativação da via de transduçâo do sinal intercelular em comparação com a hormona do crescimento nativa. Numa forma de realização, o GHXTEN ligado a um recetor transmembrana para o hormônio do crescimento exibiria pelo menos cerca de 1%, ou cerca de 5%, ou cerca de 10%, ou cerca de 15%, ou cerca de 20%, ou cerca de 25%, ou cerca de 3 0%, ou cerca, de 4 0%, ou cerca de 50%, ou cerca de 6 0%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% da ativação da via de transduçâo do sinal intercelular em comparação com hormona do crescimento nativa não vinculada ao XTEN. 0 GHXTEN objeto da presente invenção exibe um aprimoramento de um ou mais parâmetros farmacocinéticos, que opcionalmente é aumentado pela libertação de GH da proteína de fusão por clivagem de uma sequência espaçadora. 0 GHXTEN com parâmetros farmacocinéticos melhorados permite uma dosagem menos frequente ou um efeito farmacológico reforçado, tais como, mas não limitado a, manter o GHXTEN biologicamente ativo na janela terapêutica entre a dose efetiva mínima ou a concentração sanguínea e a dose máxima tolerada ou a concentração sanguínea (Cmax. Em tais casos, a ligação da GH a uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de XTEN seletiva pode resultar em uma melhoria nessas propriedades, tornando-os mais úteis como agentes terapêuticos ou preventivos em comparação com a. GH não ligada ao XTEN.

IV). POLIPÊPTIDOS REC0MBINANT1S XTENDED

Num aspeto, a divulgação proporciona composições de polipéptido XTEN que são úteis como um parceiro de proteína de fusão ao qual GH está ligada, resultando em uma proteína de fusão GHXTEN. XTEN são geralmente polipéptidos de comprimento estendido com ocorrência nãG natural, sequências substancialmente não repetitivas que são constituídas principalmente por pequenos aminoácidos hidrofílicos, com a sequência tendo um grau baixo ou nenhuma estrutura secundária ou terciária em condições fisiológicas.

Os XTENs têm utilidade como parceiro de parceiros de proteína de fusão na medida em que eles servem como "transportador", conferindo certas propriedades farmacocinéticas, físico-químicas e farmacêuticas desejáveis quando ligadas a uma proteína de GH para criar uma proteína de fusão. Tais propriedades desejáveis incluem, mas não estão limitadas a parâmetros farmacocinéticos melhorados e características de solubilidade das composições, entre outras propriedades descritas no presente documento. Tais composições de proteínas de fusão têm utilidade para tratar certas doenças relacionadas com a hormona do crescimento, distúrbios ou condições patológicas, conforme descrito no presente documento. Conforme é utilizado no presente documento, "XTEN" exclui especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpos tais como anticorpos de cadeia, simples ou fragmentos de Fc de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada.

Em algumas formas de realização, XTEN sâo polipéptidos longos possuindo mais do que cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoâcidos, de preferência maior que 400 a cerca de 3000 resíduos quando utilizado como transportador ou cumulativamente quando mais de uma unidade XTEN é utilizada numa única proteína de fusão. Noutras formas de realização, quando usado como um ligante entre os componentes da proteína de fusão ou em que não é necessário um aumento na semi vida da proteína de fusão, mas onde é desejado um aumento na solubilidade ou outra propriedade físico-química para o componente do parceiro de fusão de GH, uma sequência XTEN inferior a 100 resíduos de aminoâcidos, tais como cerca de 96, ou cerca de 84, ou cerca de 72, ou cerca de 60, ou cerca de 48, ou cerca de 36 resíduos de aminoâcidos são incorporados numa composição de proteína de fusão com o GH para efetuar a propriedade.

Os critérios de seleção para o XTEN a serem ligados às proteínas biologicamente ativas utilizadas para criar as composições das proteínas de fusão da invenção geralmente se relacionam com atributos de propriedades físico-químicas e estrutura conformacional do XTEN que é, por sua vez, usado para conferir propriedades farmacêuticas e farmacocinéticas aprimoradas às propriedades de composições de proteínas de fusão. 0 XTEN da presente invenção apresenta uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, solubilidade aquosa melhorada, alto grau de resistência à protease, imunogenicidade baixa, baixa ligação aos recetores de mamíferos e raios hidrodinâmicos (ou Stokes) aumentados; propriedades que os tornam particularmente úteis como parceiros de proteína de fusão. Exemplos não limitativos das propriedades das proteínas de fusão que compreendem GH que é reforçada por XTEN incluem aumentos 11a solubilidade geral e/ou na estabilidade metabólica, suscetibilidade reduzida a proteólise, imunogenicidade reduzida, taxa reduzida de absorção quando administrada por via subcutânea ou intramuscular e propriedades farmacocinéticas melhoradas, tais como semivida terminal mais longa e área aumentada sob a curva (AUC) , absorção mais lenta após injeção subcutânea ou intramuscular (em comparação com a GH não ligada ao XTEN e administrada por uma via similar), de modo que a Cmax é menor, que, por sua vez, resulta em redxações nos efeitos adversos da GH que, coletivamente, resulta num período de tempo aumentado que uma proteína de fusão de uma composição de GHXTEN administrada a um indivíduo retém a atividade terapêutica.

Uma variedade de métodos e ensaios são conhecidos na técnica para a determinação das propriedades físicas/químicas das proteínas tais como as composições que compreendem o XTEN inventivo; propriedades tais como estrutura secundária ou terciária, solubilidade, agregação de proteínas, propriedades de fusão, contaminação e teor de água. Tais métodos incluem centrifugação analítica, EPR, HPLC-permuta iónica, HPLC-exclusão de tamanho, HPLC-fase reversa, dispersão de luz, eletroforese capilar, dicroismo circular, calorimetria de varrimento diferencial, fluorescência, HPLC-permuta iónica, HPLC-exclusão de tamanho, IR, R.MN, espectroscopia de Raman, refratometria e espectroscopía de UV,/visível. Métodos adicionais são divulgados em Arnau et al, Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13. A aplicação destes métodos à invenção seria ao alcance de um perito na especialidade.

Tipicamente, XTEN são concebidos para comportar-se como sequências peptídicas desnaturadas em condições fisiológicas, apesar do comprimento estendido do polímero. Desnaturado descreve o estado de um péptido em solução que é caracterizado por uma grande liberdade conformacional da estrutura principal do péptido. A maioria dos péptidos e proteínas adotam uma conformação desnaturada na presença de altas concentrações de desnaturantes ou a temperaturas elevadas. Os péptidos em conformação desnaturada têm, por exemplo, espectros de dicroísmo circular característico (CD) e são caracterizados pela falta de interações de longo alcance determinadas por RMN. "Conformação desnaturada" e "Conformação não estruturada" são usados de forma sinónima no presente documento. Em algumas formas de realização, a invenção proporciona sequências de XTEN que, sob condições fisiológicas, se assemelham a sequências desnaturadas em grande parte desprovidas de estrutura secundária. Em outros casos, as sequências XTEN são substancialmente desprovidas de estrutura secundária sob condições fisiológicas. "Em grande parte desprovidas", conforme utilizado neste contexto, significa que menos de 50% dos resíduos de aminoácidos de XTEN da sequência de XTEN contribuem para a estrutura, secundária medida ou determinada pelos meios descritos no presente documento. "Substancialmente desprovidas", conforme utilizado neste contexto, significa que pelo menos cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% dos resíduos de aminoácidos de XTEN da sequência de XTEN não contribuem para a estrutura secundária, como medido ou determinado pelos métodos descritos no presente documento.

Uma variedade de métodos foram estabelecidos na técnica para discernir a presença ou ausência de estruturas secundárias e terciárias em um determinado polipéptido. Em particular, estrutura secundária pode ser medida por espectrofotometria, por exemplo, por espectroscopia de dicroísmo circular na região espectral "UV distante" (190-250 nm) . Elementos de estrutura secundária., tal como alfa hélice e folha beta, cada um dã origem a uma forma característica e magnitude dos espectros de CD. A estrutura secundária também pode ser prevista para uma sequência de polipéptido através de certos programas ou algoritmos de computador, tal como o bem conhecido algoritmo de Chou-Fasman (Chou, P. Y., et al. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) e o algoritmo de Garnier-Osguthorpe-Robson ("GOR") (Gamier J, Gibrat JF, Robson B. (1996), GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol 266:540-553), conforme descrito na Publicação de pedido de patente US 20030228309A1. Para uma dada sequência, os algoritmos podem prever se existe alguma ou nenhuma estrutura secundária, expresso como o total e/ou a percentagem de resíduos da sequência que se forma, por exemplo, alfa-hélices ou folhas beta ou a percentagem de resíduos da sequência prevista para resultar em formação de espirais aleatórias (que não possui estrutura secundária).

Em algumas formas de realização, as sequências XTEN utilizadas nas composições da proteína, de fusão inventivas podem ter uma percentagem de alfa-hélice variando desde 0% até menos de cerca de 5% conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em outros casos, as sequências XTEN das composições de proteína de fusão têm uma percentagem de folha beta variando desde 0% até menos de cerca de 5% conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em algumas formas de realização, as sequências XTEN das composições de proteína de fusão têm uma percentagem, de alfa-hélice variando desde 0% até menos de cerca de 5% e uma percentagem de folha beta variando desde 0% até menos de cerca de 5% conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em algumas formas de realização, as sequências XTEN das composições de proteína de fusão têm uma percentagem de alfa-hélice de menos de cerca de 2% e uma percentagem de folha beta de menos de cerca de 2%. Hm outros casos, as sequências XTEN das composições da proteína de fusão possuem um alto percentual de espirais aleatórios, conforme determinado pelo algoritmo de GOR. Em algumas formas de realização, uma sequência de XTEN tem pelo menos cerca de 80%, mais preferentemente pelo menos cerca de 90%, mais preferentemente pelo menos cerca de 91%, mais preferentemente pelo menos cerca de 92%, mais preferentemente pelo menos cerca de 93%, mais preferentemente pelo menos cerca de 94%, mais preferentemente pelo menos cerca de 95%, mais preferentemente pelo menos cerca de 96%, mais preferentemente pelo menos cerca de 97%, mais preferentemente pelo menos cerca de 98% e o mais preferentemente peio menos cerca de 99% de espiral aleatória, conforme determinado pelo algoritmo de GOR. 1. Sequências não repetitivas

Em algumas formas de realização, As sequências XTEN das composições são substancialmente não repetitivas. No geral, as sequências de aminoãcidos repetitivas tendem a se agrupar ou formar estruturas de ordem superior, como exemplificado por sequências repetitivas naturais, como colagéniGS e zíperes de leucina, ou fGrma contatos resultando em estruturas cristalinas ou pseudocristalinas. Ao contrário, a baixa tendência de sequências não repetitivas para agregar permite o projeto de XTENs de longa sequência com uma frequência relativamente baixa de aminoãcidos carregados que provavelmente seria agregado se as sequências fossem repetitivas de outra forma. Tipicamente, as proteínas de fusão GHXTEN compreendem sequências de XTEN superiores a cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoãcidos, preferentemente superior a cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos cumulativos, em que as sequências são substancialmente não repetitivas. Numa forma de realização, as sequências de XTEN têm mais do que cerca de 100 a cerca, de 3000 resíduos de aminoãcidos, preferentemente mais do que 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoãcidos, em que não são idênticos três aminoãcidos contíguos a não ser que o aminoãcido seja serina, em cujo caso não mais de três aminoãcidos contíguos são resíduos de serina. Net forma de realização anterior, a sequência de XTEN seria substancialmente não repetitiva. O grau de repetitividade de um polipéptido ou um gene é medido por programas ou algoritmos de computador ou por outros meios conhecidos na técnica. A repetitividade numa sequência de polipéptidos pode, por exemplo, ser avaliado determinando o número de vezes que as sequências mais curtas de um determinado comprimento ocorrem dentro do polipéptido. Por exemplo, um polipéptido de 200 resíduos de aminoãcidos tem 192 sequências de 9 aminoãcidos sobrepostas (ou "quadros" de 9 meros) e 198 quadros de 3 meros, mas o número de sequências exclusivas de 9 meros ou 3 meros dependerá da quantidade de repetição dentro da sequência. É gerado um resultado (doravante denominado "escore de subsequência") que reflete o grau de repetitividade das subsequências na sequência de polipéptido geral. Mo contexto da presente invenção, "índice de subsequência" significa a soma das ocorrências de cada quadro único de 3 meros em uma sequência de 200 aminoãcidos consecutivos do polipéptido dividido pelo numero absoluto de subsequências únicas de 3 meros dentro da sequência de 200 aminoãcidos. Exemplos de tais pontuações de subsequência derivadas dos primeiros 200 aminoãcidos de polipéptidos repetitivos e não repetitivos são apresentados no Exemplo 44. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona GHXTEN cada um compreendendo um ou mais XTEN em que ο XTEN tem uma pontuação de subsequência inferior a 10, mais preferentemente inferior a 9, mais preferentemente inferior a 8, mais preferentemente inferior a 7, mais preferentemente inferior a 6 e o mais preferentemente inferior a 5. Nas formas de realização anteriores no presente documento descritas neste parágrafo, um XTEN com uma pontuação de pontuação de subsequência inferior a cerca de 10 (isto é, 9, 8, 7, etc.) é "substancialmente não repetitiva". A característica não-repetitiva do XTEN transmite às proteínas de fusão com GH um maior grau de solubilidade e menor tendência de agregação em comparação com polipéptidos com sequências repetitivas. Estas propriedades facilitam a formulação de preparações farmacêuticas contendo XTEN contendo concentrações de fármaco extremamente elevadas, em alguns casos excedendo 100 mg/ml.

Adicionalmente, as sequências do polipéptido XTEN das formas de realização são concebidas para ter um baixo grau de repetitividade interna para reduzir ou eliminar substancialmente a imunogenicidade quando administrada a um mamífero. Sequências de polipéptidos compostos por motivos curtos e repetidos, amplamente limitados a três aminoãcidos, tais como glicina, serina e glutamato, pode resultar em títulos de anticorpos relativamente elevados quando administrados a um mamífero apesar da ausência de epítopos das células T preditos nestas sequências. Isso pode ser causado peia natureza repetitiva dos polipéptidos, como foi demonstrado que os imunogénios com epítopos repetidos, incluindo agregados de proteínas, imunogénios reticulados e hidratos de carbono repetitivos são altamente imunogénicos e podem, por exemplo, resultam na reticuiação dos recetores das células B causando a ativação das células B. (Johansson, J,, et ai. (2007) Vaccine, 25:1676-82; Yankai, Z., et al. (2006) Biocnem Biophys Res Commun, 345:1365-71; Hsu, C. T., et al. (2000) Cancer Res, 60:3701-5); Bachmann MF, et al. Eur J Immunol. (1995) 25(12):3445-3451). 2. Motivos de sequências exemplares A presente invenção abrange XTEN que compreende unidades múltiplas de sequências mais curtas ou motivos, em que as sequências de aminoácidos dos motivos não são repetitivas. Ao desenhar sequências de XTEN, descobriu-se que o critério não repetitivo pode ser cumprido apesar da utilização de uma abordagem de "bloco de construção" utilizando uma biblioteca de motivos de sequência que são multimerizados para criar as sequências XTEN. Assim, embora uma sequência de XTEN possa consistir em múltiplas unidades de tão pouco quanto quatro tipos de motivos de sequência diferentes, dado que os próprios motivos geralmente consistem em sequências de aminoácídGS não repetitivas, a sequência global de XTEN é tornada substancialmente não repetitiva.

Numa forma de realização, XTEN tem uma sequência não repetitiva mais do que cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, preferentemente mais do que 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou cerca de 100% da sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos, em que cada um dos motivos tem de cerca de 9 a 36 resíduos de aminoácidos. Noutras formas de realização, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou cerca de 100% da sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motives tem de 9 a 14 resíduos de aminoácidos. Ainda noutras formas de realização, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou cerca de 100% do componentes de sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoácidos. Nestas formas de realização, é preferido que os motivos da sequência sejam compostos principalmente de pequenos aminoácidos hidrofílicos, tal como a sequência global tem uma característica náo estruturada, flexível. Exemplos de aminoácidos incluídos no XTEN, são, por exemplo, arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, serina e glicina. Como resultado das variáveis de teste, como otimização de codões, polinucleótidos de montagem que codificam motivos de sequência, expressão de proteína, distribuição de carga e solubilidade da proteína expressa, e estrutura secundária e terciária, descobriu·· se que as composições XTEN com características melhoradas incluem principalmente resíduos de glicina (G), alanina (A), serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) em que as sequências são concebidas para serem substancialmente não repetitivas. Numa forma de realização, as sequências XTEN têm predominantemente quatro a seis tipos de aminoácidos selecionados a partir de glicina (G) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) ou prolina (P) que estão dispostos numa sequência substancialmente não repetitiva que é superior a cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, preferentemente mais do que 400 a cerca de 3000 resíduos de comprimento. Em algumas formas de realização, XTEN têm sequências de mais do que cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, preferentemente mais do que 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cerca de 80% da sequência consiste em motivos de sequência que não se sobrepõem, em que cada um dos motivos tem de 9 a 36 resíduos de aminoácidos em que cada um dos motivos consiste em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados a partir de glicina (G) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) , e em que o teor de qualquer tipo de aminoácido no XTEN de comprimento total não exceda 30%. Noutras formas de realização, pelo menos cerca de 90% da sequência de ΧΊΈΝ consiste em motivos de sequência que não se sobrepõem, em que cada um dos motivos tem de 9 a 3 6 resíduos de aminoáeidos em que os motivos consistem em 4 a 6 tipos de aminoáeidos selecionados a partir de glicina (G) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) , e em que o teor de qualquer tipo de aminoãcido no XTEN de comprimento total não exceda 30%. Noutras formas de realização, pelo menos cerca de 90% da sequência de XTEN consiste em motivos de sequência que não se sobrepõem, em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoáeidos que consistem em 4 a 6 tipos de aminoáeidos selecionados a partir de glicina (G), alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamatG (S) e prolina (P), e em que o teor de qualquer tipo de aminoácido no XTEN de comprimento total não exceda 30%. Ainda noutras formas de realização, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99%, a cerca de 100% da sequência de XTEN consiste em motivos de sequência que não se sobrepõem, em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoáeidos que consistem em glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) , e em que o teor de qualquer tipo de aminoãcido no XTEN de comprimento total não exceda 30%.

Ainda noutras formas de realização, XTENs compreendem sequências não repetitivas de mais do que cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoáeidos, preferentemente mais do que 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoáeidos em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 9 0%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou. cerca de 93%, ou. cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% da sequência consiste em motivos de sequência que não se sobrepõem de 9 a 14 resíduos de aminoáeidos em que os motivos consistem em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina. (P) , e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácidos contíguos em qualquer um motivo nâo é repetida ma is de duas vezes no motivo da sequência. Noutras formas de realização, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de uma sequência de XTEN consiste em motivos de sequência que nãc· se sobrepõem de 12 resíduos de aminoácidos em que os motivos consistem em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácidos contíguos em qualquer um motivo de sequência não é repetida mais de duas vezes no motivo da sequência. Noutras formas de realização, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de uma sequência de XTEN consiste em motivos de sequência que não se sobrepõem de 12 resíduos de aminoácidos em que os motivos consistem em glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) , e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácidos contíguos em qualquer um motivo de sequência não é repetida mais de duas vezes no motivo da sequência. Ainda noutras formas de realização, os XTENs consistem em 12 motivos de sequência de aminoácidos em que os aminoácidos sâo selecionados a partir de glicina (G) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) , e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácidos contíguos em qualquer um motivo de sequência não é repetida mais de duas vezes no motivo da sequência, e em que o teor de qualquer um tipo de aminoácido no XTEN de comprimento completo não excede 30%· Nas formas de realização anteriores acima no presente documento descritas neste parágrafo, as sequências de XTEN seriam substancialmente não repetitivas.

Em algumas formas de realização, as composições compreendem sequências de XTEN não repetitivas de mais do que cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, de cumulativamente mais do que 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cercai de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência consiste em múltiplas unidades de dois ou mais motivos de sequência que não se sobrepõem selecionados a partir das sequências de aminoácidos do Quadro 2. Em algumas formas de realização, o XTEN compreende motivos de sequência que não se sobrepõem em que cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência consiste em duas ou mais sequências que não se sobrepõem selecionadas a partir uma única família de motivos do Quadro 2, resultando em uma sequência, "familiar" na qual a sequência geral permanece substancialmente não repetitiva. Consequentemente, nestas formas de realização, uma sequência XTEN compreende múltiplas unidades de motivos de sequência que não se sobrepõem da família de motivos AD, ou. da família de motivos AE, ou da família de motivos AF, ou da família de motivos AG, ou da família de motivos AM, ou da família de motivos AQ, ou a família de motivos BC, ou a família de motivos BD das sequências do Quadro 2. Noutras formas de realização, 0 XTEN compreende sequências de motivos de duas ou mais das famílias motivo do QuadrG 2.

Quadro 2; Motivos da sequência de XTBB3 de 12 aminoácidos e famílias de motivos

Noutras formas de realização, a composição de GHXTEN compreende uma sequência de XTEN não repetitiva de mais do que cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, preferentemente mais do que 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência consiste em motivos de sequência de 36 aminoácidos que nâo se sobrepõem selecionados a partir de uma ou mais sequências de polipéptidos dos Quadros 8-11.

Nessas formas de realização em que o componente XTEN da proteína de fusão GHXTEN tem menos de 100% de seus aminoácidos consistindo em quatro a seis aminoácidos selecionados a partir de glicina (G) , alanina (A) , serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), ou menos do que 100% da sequência consistindo nos motivos de sequência do Quadro 2, ou menos do que 100% da identidade de sequência com um XTEN do Quadro 3, os outros resíduos de aminoácidos são selecionados de qualquer outro dos 14 L~ aminoácidos naturais, mas sâo preferentemente selecionados a partir de aminoácidos hidrofílicos de tal modo que a sequência XTEN contenha pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de aminoácidos hidrofílicos. Qs aminoácidos XTEN que nâo são glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) são intercaladas ao longo da sequência XTEN, estão localizados dentro ou entre os motivos da sequência ou estão concentrados em um ou mais trechos curtos da sequência XTEN. Em tais casos em que o componente XTEN do GHXTEN compreende aminoãcidos diferentes da glicina (G) , aianina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamate· (E) e prolina (P) , é preferido que os aminoãcidos não sejam resíduos hidrofóbicos e não devem conferir substancialmente a estrutura secundária do componente XTEN. Os resíduos hidrofóbicos que são menos favorecidos na construção do XTEN incluem triptofano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, vali na. e metionina. Adicionalmente, pode-se projetar as sequências XTEN para conter poucos (por exemplo, menos de 5%) ou nenhum dos seguintes aminoãcidos: cisteína (para evitar a formação de dissulfureto e oxidação), metionina (para evitar oxidação), asparagina e glutamina (para evitar desamidação). Assim, em algumas formas de realização, o componente XTEN da proteína de fusão GHXTEN compreendendo outros aminoãcidos, para além da glicina (G) , aianina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) teriam uma sequência com menos de 5% dos resíduos que contribuem para alfa hélices e folhas beta, conforme medido pelo algoritmo de Chou-Fasman e com pelo menos 90%, ou pelo menos cerca de 95 % ou mais formação de espirais aleatórias medida pelo algoritmo de GOR. 3. Comprimento de Sequência

Noutro aspeto da presente invenção, a invenção abrange composições de GHXTEN compreendendo transportadores de polipéptídGS de XTEN com sequências de comprimento prolongado. A presente invenção utiliza a descoberta de que o aumento do comprimento de polipéptidos não-repetitivos e não estruturados aumenta a natureza não estruturada dos XTENs e aumenta de forma correspondente as propriedades biológicas e farmacocinéticas das proteínas de fusão compreendendo o transportador de XTEN. Conforme descrito maís completamente nos Exemplos, aumentos proporcionais no comprimento do XTEN, mesmo se criado por uma ordem de repetição fixa de motivos de sequência de família única (por exemplo, os quatro motivos AS do Quadro 2) , resultam em uma sequência com maiGr percentagem de formação de espirais aleatórias, conforme determinado pelo algoritmo de GOR, em comparação com os comprimentos de XTEN mais curtos. No geral, aumentando o comprimento do parceiro de fusão de polipéptido não estruturado, conforme descrito nos Exemplos, resulta em uma proteína de fusão com um aumento desproporcional na semivida terminal em comparação com proteínas de fusão com parceiros de polipéptidos não estruturados cgití comprimentos de sequência mais curtos.

Exemplos não limitativos de XTEN contemplados para inclusão no GHXTEN da invenção são apresentados no Quadro 3. Numa forma de realização, a divulgação proporciona composições de GHXTEN em que o comprimento da sequência de XTEN da(s) proteína(s) de fusão é superior a cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoãcidos e, em alguns casos, é superior a 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, em que o XTEN confere propriedades farmacocinéticas melhoradas no GHXTEN em comparação com a GH não ligada ao XTEN. Em algumas formas de realização, As sequências XTEN das composições GHXTEN podem ter cerca de 100, ou cerca de 144, ou cerca de 288, ou cerca de 401, ou cerca de 500, ou cerca de 600, ou cerca de 700, ou cerca de 800, ou cerca de 900, ou cerca de 1000, ou cerca de 1500, ou cerca de 2 0 00, ou cerca de 2500, ou até cerca de 3000 resíduos de aminoãcidos de comprimento. Em outros casos, as sequências de XTEN podem ter de 100 a 150, de cerca de 150 a 250, de cerca de 250 a. 400, de 401 a cerca de 500, de cerca de 500 a 900, de cerca de 900 a 1500, de cerca de 1500 a 2 000, ou de cerca de 2000 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos de comprimento. Numa forma de realização, o GHXTEN pode compreender uma sequência XTEN em que a sequência exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um XTEN selecionado a partir do Quadro 3. Em algumas formas de realização, a sequência XTEN foi concebida para expressão otimizada como o componente N-terminal do GHXTEN pela inclusão de nucleó tidos cie codificação para uma sequência líder N-terminal otimizada (NTS) na porção XTEN do gene que codifica a proteína de fusão. Numa forma de realização, a sequência XTEN N-terminal do GHXTEN expresso tem pelo menos 90% de identidade de sequência para a sequência de ΆΕ48 ou ΆΜ48, AE624 ou ΆΕ912 ou AM923. Noutra forma de realização, 0 XTEN tem os resíduos N-terminais descritos nos Exemplos 14-17.

Noutras formas de realização, a proteína de fusão GHXTEN compreende uma primeira e uma segunda sequência XTEN, em que o total cumulativo dos resíduos nas sequências XTEN é superior a cerca de 400 a. cerca de 3000 resíduos de aminoácidos. Nas formas de realização do anterior, a prGteína de fusão GHXTEN compreende uma primeira e uma segunda sequência XTEN em que as sequências exibem cada uma pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou, em alternativa, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com pelo menos um ou adicionalmente um segundo XTEN selecionado a partir do Quadro 3. Exemplos em que mais de um XTEN é utilizado numa composição GHXTEN incluem, mas não se limitam a construções com um XTEN ligado a ambos os terminais N e C de pelo menos um GH.

Conforme descrito mais completamente abaixo, a invenção fornece métodos em que o GHXTEN é concebido selecionando o comprimento do XTEN para conferir uma semivida alvo sobre uma proteína de fusão administrada a um indivíduo. No geral, 0 comprimento de XTEN é mais longo do que gs 400 resíduos cumulativos incorporados nas composições de GHXTEN resultam em semivida mais longa em comparação com comprimentos cumulativos mais curtos; por exemplo, mais curtos que cerca de 280 resíduos. Contudo, noutra fGrma de realização, As proteínas de fusão GHXTEN são concebidas para compreender XTEN com um comprimento de sequência, mais longo que é selecionado para conferir adicionalmente taxas mais lentas de absorção sistémica após administração subcutânea ou intramuscular a um indivíduo. Em tais formas de realização, o Cmax é reduzido em comparação com uma dose comparável de uma GH não ligada, a XTEN, contribuindo assim para a capacidade de manter o GHXTEN dentro da janela terapêutica para a composição. Assim, 0 XTEN confere a propriedade de um depósito ao GHXTEN administrado, além das outras propriedades físicas/químicas descritas no presente documento. _Quadro 3: Polipéptidos de XTEN_

4. Segmentos de XTEN

Numa forma de realização, a divulgação proporciona uma proteína de fusão GHXTEN isolada, em que o comprimento cumulativo do componente XTEN é superior a cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminGâcidos contendo pelo menos um segmento de sequência de polipéptido selecionado a partir dos Quadros 3, 8, 9, 10, 11 e 12 e em que pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98% ou mais do resto da sequência XTEN contém, em geral, aminoãcidos hidrofílícos e menos de cerca de 2% do restante do XTEN consiste em aminoãcidos hidrofóbicos ou aromáticos, ou cisteína. Em algumas formas de realização, o XTEN contém múltiplos segmentos em que os segmentos são idênticos ou diferentes. Noutra forma de realização, a divulgação proporciona uma proteína de fusão GHXTEN isolada em que o comprimento cumulativo do componente XTEN é superior a cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoãcidos e compreende pelo menos um segmento de sequência de pelo menos cerca de 100 a cerca de 923, ou de pelo menos cerca de 100 a cerca de 875, ou de pelo menos cerca de 100 a cerca de 576, ou de pelo menos cerca de 100 a cerca de 288 ou de pelo menos cerca de 100 a cerca de 144 resíduos de aminoãcidos, em que o(s) segmento (s) de sequência consiste(m) em pelo menos três tipos diferentes de aminoãcidos e a soma de resíduos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) no(s) segmento(s) de sequência constituem pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94 %, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da sequência de aminoãcidos total do segmento de sequência e pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97 %, ou pelo menos cerca de 98% do restante da(s) sequência(s) de XTEN consistem em aminoãcidos hidrof ílicos e menos do que cerca de 2% do restante da (s) sequência(s) de XTEN de consiste em aminoãcidos hidrofóbicos ou aromáticos ou cisteína. Noutra forma de realização, a divulgação proporciona uma proteína de fusão GHX.TEN isolada em que o comprimento cumulativo do componente XTEN é superior a cerca de 100 a cerca de 3 000 resíduos de aminoãcidos e compreende pelo menos um segmento de sequência de pelo menos cerca de 200 a cerca de 923, ou de pelo menos cerca de 200 a cerca de 875, ou de pelo menos cerca de 200 a cerca de 576, ou de pelo menos cerca de 200 a cerca de 288 resíduos de aminoãcidos, em que o(s) segmento(s) de sequência consiste(m) na soma de resíduos de glicina (G) , alanina (A) , serina (5) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) no(s) segmento(s) de sequência constituem pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da sequência de aminoãcidos total do segmento de sequência e em que a pontuação de subsequência, do segmento é inferior a 12, mais preferentemente inferior a 10, mais preferentemente inferior a 9, mais preferentemente inferior a 8, mais preferentemente inferior a 7, mais preferentemente inferior a 6 e o mais preferentemente inferior a 5 e pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98% ou mais do resto da sequência XTEN consiste em aminoácidos hidrofílicos e menos de cerca de 2% do restante da sequência de XTEN consiste em aminoácidos hidrofõbicos ou aromáticos ou cisteína. 5- Sequências que melhoram a expressão de XTEN N-terminal

Em algumas formas de realização, a divulgação fornece uma sequência XTEN de comprimento curto incorporada como a porção N-terminal da proteína de fusão GHXTEN. A expressão da proteína de fusão é aumentada numa célula hospedeira transformada com um vetor de expressão adequado compreendendo uma sequência polinucleotídica líder N-terminal otimizada (que codifica o XTEN N--terminal) incorporada no polinucleótido que codifica a proteína de fusão de ligação. Foi descoberto, conforme descrito nos Exemplos 14-17, que uma célula hospedeira transformada com um tal vetor de expressão compreendendo uma sequência líder N-terminal otimizada (NTS) no gene da proteína de fusão de ligação resulta em uma expressão muito aumentada da proteína de fusão em comparação com, a expressão de uma proteína de fusão correspondente a partir de um polinucleótido não compreendendo o NTS, e evita a necessidade de incorporação de uma sequência líder não XTEN utilizada, para aumentar a expressão. Numa forma de realização, a divulgação proporciona proteínas de fusão GHXTEN compreendendo um NTS em que a expressão da proteína de fusão de ligação do gene codificador numa célula hospedeira é aumentada cerca de 50%, ou cerca de 75%, ou cerca de 100%, ou cerca de 150% ou cerca de 2 00% ou cerca de 400% em comparação com a expressão de uma proteína de fusão GHXTEN que não compreende a sequência XTEN N-terminal (onde o gene codificador não possui NTS).

Numa forma de realização, o polipéptido XTEN N-terminal do GHXTEN compreende uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80%, mais preferentemente pelo menos cerca de 90%, mais preferentemente pelo menos cerca de 91%, mais preferentemente pelo menos cerca de 92%, mais preferentemente pelo menos cerca de 93%, mais preferentemente pelo menos cerca de 94%, mais preferentemente pelo menos cerca de 95%, mais preferentemente pelo menos cerca de 96%, mais preferentemente pelo menos cerca de 97%, mais preferentemente pelo menos cerca de 98%, mais preferentemente pelo menos 99%, ou exibe 100% de identidade de sequência para a sequência de aminoãcidos de AE48 ou AM48, as respetivas sequências de aminoãcidos são as seguintes:

AE48: MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS

AM48: MAEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS

Noutra forma de realização, o XTEM N-terminal de comprimento curto está ligado a um XTEN de comprimento mais longo para formar a região N-terminal da proteína de fusão C-HXTEN, em que a sequência polinucleotídica que codifica o XTEM N-terminal de comprimento curto confere a propriedade de expressão aumentada na célula hospedeira, e em que o comprimento longo do XTEN expresso contribui para as propriedades melhoradas do veículo XTEN na proteína de fusão, conforme descrito acima. No que precede, o XTEN de comprimento curto está ligado a qualquer um dos XTEN divulgados no presente documento (por exemplo, um XTEN do Quadro 3) e o XTEN resultante, por sua vez, está ligado ao N-terminal de qualquer um dos GH divulgados no presente documento (por exemplo, um GH do Quadro 1) como um componente da proteína de fusão. Alternativamente, os polinucleótidos que codificam o XTEN de comprimento curto (ou o seu complemento) estão ligados a polinucleótidos que codificam qualquer um dos XTEN (ou o seu complemento) divulgados no presente documento e o gene resultante que codifica o XTEN N-terminal, por sua vez, está ligado â extremidade 5 ’dos polinucleótidos que codificam qualquer uma das GH (ou à extremidade 3' do seu complemento) divulgadas no presente documento. Em algumas formas de realização, o polipéptido XTEN N-terminal com comprimento longo exibe pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos 99% ou exibe 100% de identidade de sequência para uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências AE624, AE912 e AM923.

Em qualquer das formas de realização de XTEN N~ terminais descritas acima, o XTEN N-terminal pode ter de cerca de um a cerca de seis resíduos de aminoãcidos adicionais, preferentemente selecionados a partir de GESTPA, para acomodar os locais de restrição de endonuclease de restrição que seriam empregues para unir os nucleótidos que codificam o XTEN N-terminal ao gene que codifica a fração alvo da proteína de fusão. Os métodos para a geração das sequências N-terminais e a incorporação nas proteínas de fusão da invenção são descritos mais completamente nos Exemplos. 6. Carga líquida

Noutras formas de realização, os polipéptidos XTEN têm uma característica não estruturada conferida pela incorporação de resíduos de aminoãcidos com uma carga líquida e/ou reduzindo a proporção de aminoãcidos hidrofobicos na sequência XTEN. A carga líquida global e a densidade de carga líquida são controladas modificando o teor de aminoãcidos carregados nas sequências XTEN. Em algumas formas de realização, a densidade de carga líquida do XTEN das composições pode estar acima de +0,1 ou abaixo de -0,1 cargas/resíduo. Noutras formas de realização, a carga líquida de um XTEN pode ser de cerca de 0%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10% cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19% ou cerca de 20% ou mais.

Uma vez que a maioria dos tecidos e superfícies em um ser humano ou animal tem uma carga negativa líquida, nalgumas formas de realização, as sequências XTEN são concebidas para ter uma carga negativa líquida para minimizar as interações não específicas entre as composições contendo XTEN e várias superfícies tais como vasos sanguíneos, tecidos saudáveis ou. vários recetores. Sem estar ligado por uma teoria particular, o XTEN pode adotar conformações abertas devido à repulsão eletrostática entre aminoãcidos individuais do polipéptido XTEN que carregam individualmente uma carga negativa, líquida, e que estão distribuídos através da sequência do polipéptido XTEN. Essa distribuição de carga negativa líquida nos comprimentos de sequência estendida de XTEN pode levar a uma conformação não estruturada que, por sua vez, pode resultar em um aumento efetivo do raio hidrodinâmico. Em formas de realização preferidas, a carga negativa é conferida pela incorporação de resíduos de ácido glutâmico. Consequentemente, numa forma de realização a invenção proporciona XTEN em que as sequências XTEN contêm cerca de 8, 10, 15, 20, 25 ou mesmo cerca de 30% de ácido glutâmico. No geral, os resíduos glutâmicos seriam espaçados uniformemente através da sequência XTEN. Em alguns casos, o XTEN pode conter cerca de 10-80 ou cerca de 15-60 ou cerca de 20-50 resíduos de resíduos glutâmicos por 20 kD de XTEN que podem resultar em um XTEN com resíduos carregados que teriam pKa muito similar, o que pode aumentar a homogeneidade da carga do produto e afiar seu ponto isoelétrico, aumentando as propriedades físico-químicas da proteína de fusão GHXTEN resultante por exemplo, simplificando procedimentos de purificação. Ο XTEN das composições da presente invenção geralmente não possui ou tem um baixo teor de aminoácidos carregados positivamente. Em, algumas formas de realização, o XTEN pode ter menos de cerca de 10% de resíduos de aminoácidos com uma carga positiva, ou menos de cerca de 7%, ou menos de cerca de 5%, ou menos de cerca de 2%, ou menos de cerca de 1% de resíduos de aminoácidos com uma carga positiva. Contudo, a invenção contempla construções onde um número limitado de aminoácidos com uma carga positiva, tal como lisina, são incorporados no XTEN para permitir a conjugação entre a épsilon amina da lisina e um grupo reativo em um péptido, uma ponte de ligação ou um grupo reativo em uma droga ou molécula pequena para ser conjugado com a estrutura principal de XTEN. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, o XTEN tem entre cerca de l e cerca de 100 resíduos de lisina, ou de cerca de 1 a cerca de 70 resíduos de lisina, ou de cerca de 1 a cerca de 50 resíduos de lisina, ou de cerca de 1 a cerca de 30 resíduos de lisina, ou de cerca de 1 a cerca de 20 resíduos de lisina, ou de cerca de 1 a cerca de 10 resíduos de lisina, ou de cerca de 1 a cerca de 5 resíduos de lisina, ou alternativamente apenas um único resíduo de lisina. Utilizando o XTEN contendo lisina anterior, são construídas proteínas de fusão que compreendem XTEN, uma hormona do crescimento, mais uma agente quimioterapêutico útil no tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com o crescimento, em que o número máximo de moléculas do agente incorporado no componente XTEN é determinado pelos números de lisinas ou outros aminoâcidGS com cadeias laterais reativas (por exemplo, cisteína) incorporadas no XTEN.

Em algumas formas de realização, a sequência de XTEN compreende resíduos carregados separados por outros resíduos tais como serina ou glicina, o que leva a uma melhor expressão ou comportamento de purificação. Com base na carga líquida, alguns XTEN têm um ponto isoelétrico (pi) de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 ou mesmo 6,5. Sm formas de realização preferidas, o XTEN terá um ponto isoelétrieo entre 1,5 e 4,5. Nestas formas de realização, o XTEN incorporado nas composições de proteína de fusão GHXTEN da presente invenção carrega uma carga negativa líquida sob condições fisiológicas que contribuem para a conformação não estruturada e redução da ligação do componente XTEN a proteínas e tecidos de mamíferos. Ã medida que os aminoácidos hidrofóbicos conferem estrutura a um polipéptido, a invenção proporciona que o teor de aminoácidos hidrofóbicos no XTEN seja tipicamente inferior a 5%, ou inferior a 2% ou a inferior a 1% de teor de aminoácidos hidrofóbicos. Numa forma de realização, o teor de aminoácidos de metionina e triptofano no componente XTEN de uma proteína de fusão GHXTEN é tipicamente inferior a 5%, ou inferior a 2%, e mais preferentemente inferior a 1%. Noutra forma de realização, o XTEN terá uma sequência que tem menos de 10% de resíduos de aminoácidos com uma carga positiva, ou menos de cerca de 7%, ou menos de cerca de 5%, ou menos de cerca de 2% de resíduos de aminoácidos com uma carga positiva, a soma dos resíduos de metionina e triptofano será inferior a 2% e a soma dos resíduos de asparagina e glutarnina será inferior a 10% da sequência XTEN total. 7 . Baixa imunoçfenicidade

Noutro aspeto, a invenção proporciona composições em que as sequências XTEN têm um baixo grau de imunogenicidade ou são substancialmente não imunogénicas. Vários fatores podem contribuir para a baixa imunogenicidade do XTEN, por exemplo, a sequência não repetitiva, a conformação não estruturada, o alto grau de solubilidade, o baixo grau ou ausência de auto-agregação, o baixo grau ou falta de sítios proteolíticos dentro da sequência e o baixo grau ou falta de epítopos na sequência XTEN.

Os epítopos conformacionais são formados por regiões da superfície da proteína que sâo compostas por múltiplas sequências de aminoãcidos descontínuas do antigénio protéico. 0 dobradura precisa da proteína traz essas sequências para uma configuração espacial bem definida e estável, ou epítopos, que pode ser reconhecido como "estrangeiro" pelo sistema imunológico humoral do hospedeiro, resultando na produção de anticorpos para a proteína ou a ativação de uma resposta imune mediada por células. No último caso, a resposta imune a uma proteína em um indivíduo é fortemente influenciada pelo reconhecimento do epítopo de células T que é uma função da especificidade de ligação do péptido do alotipo HLA-DR desse indivíduo. 0 engajamentG de um complexo peptídico MIHC de classe II por um recetor de células T cognato na superfície da célula T, juntamente com a ligação cruzada de certos outros co-recetores, como a molécula CD4, pode induzir um estado ativado dentro da célula T. A ativação leva à libertação de citoquinas, além de ativar outros linfócitos tais como células B para. produzir anticorpos ou ativar células T killer como resposta imune celular completa. A capacidade de um péptido para ligar uma determinada molécula de Classe II de MHC para apresentação na superfície de uma APC (célula apresentadoras de antigénio) depende de uma série de fatores; de forma mais notável da sua sequência primária. Numa forma de realização, um menor grau de imunogenicidade é conseguido através do desenho de sequências de XTEN que resistem ao processamento de antigénio em células apresentadoras de antigénio, e/ou escolhendo sequências que não se ligam bem aos recetores de MHC. A invenção proporciona proteínas de fusão GHXTEN com polipéptidos XTEN substancialmente não repetitivos concebidos para reduzir a ligação com recetores MHC II, bem como evitando a formação de epítopos para o recetor de células T ou a ligação de anticorpos, resultou num baixo grau de imunogenicidade. Evitar a imunogenicidade é, em parte, um resultado direto da flexibilidade conformedional das sequências XTEN; isto é, a ausência de estrutura secundária devido à seleção e ordem de resíduos de aminoácidos. Por exemplo, de interesse particular são as sequências com baixa tendência para adaptar conformações dobradas de forma compacta em solução aquosa ou em condições fisiológicas que podem resultar em epítopos conformacionais. A administração de proteínas de fusão compreendendo XTEN, utilizando práticas terapêuticas convencionais e dosagem, geralmente não resulta na formação de anticorpos neutralizantes para a sequência XTEN e também reduz a imunogenicidade do parceiro de fusão GH nas composições GHXTEN.

Numa forma de realização, as sequências XTEN utilizadas nas proteínas de fusão de objeto podem estar substancialmente isentas de epítopos reconhecidos por células T humanas. A eliminação de tais epítopos com a finalidade de gerar menos proteínas imunogênicas foi divulgada anteriormente; veja-se, por exemplo, o documento WO 98/52976, WO 02/079232 e WO 00/3317. Ensaios para epítopGS de células T humanas foram descritos (Stickler, M. , et al. (2003) J Immunol Methods, 281: 95-108). De particular interesse são as sequências de péptidos que podem ser oligomerizadas sem gerar epítopos de células T ou sequências não humanas. Isto é conseguido testando as repetições diretas dessas sequências para a presença de epítopos de células T e para a ocorrência de 6 a 15-meros e, em particular, Sequências de 9-mer que não são humanas, e depois alteram o design da sequência XTEN para eliminar ou interromper a sequência do epítopo. Em algumas formas de realização, as sequências XTEN são substancialmente não imunogênicas pela restrição do número de epítopos do XTEN predito para se ligar aos recetores MEC. Com uma redução no número de epítopos capazes de se ligar aos receptores de MHC, há uma redução concomitante no potencial de ativação de células T, bem como na função auxiliar de células T, redução da ativação das células B ou regulação positiva e redução da produção de anticorpos, 0 baixo grau de epítopos de células T preditos pode ser determinado por algoritmos de predição de epítopos, tais como, por exemplo, TEPITOPE (Sturniolo, T., et al. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555-61),

conforme mostrado no Exemplo 45. A pontuação TEPITOPE de uma determinada estrutura peptídica dentro de uma proteína é o logaritmo do Kd (constante de dissociação, afinidade, off-rate) da ligação dessa moldura peptídica a múltiplos dos alelos MEC humanos mais comuns, conforme divulgado em Sturniolo, T. et al. (1999) Nature Biotechnology 17:555). A pontuação varia ao longo de pelo menos 20 logs, desde cerca de 10 até cerca de -10 (correspondendo a restrições de ligação de 10e!0 Kd a 10e10 Kd) e pode ser reduzido evitando os aminoãcidos hidrofóbicos que servem como resíduos de âncora durante a exibição do péptido no MHC, tais como Μ, I, L, V, F. Nalgumas formas de realização, um componente XTEN incorporado num GHXTEN não possui um epítopo de células T previsto com uma pontuação de TEPITOPE de cerca de -5 ou superior, ou -6 ou superior ou -7 ou superior ou -8 ou superior, ou com uma pontuação de TEPITOPE de -9 ou superior. Conforme é utilizado no presente documento, uma pontuação de "-9 ou superior" abrangeria pontuações TEPITOPE de 10 a -9, inclusive, mas não abrangeria uma pontuação de -10, jã que -10 é menor que -9 .

Noutra forma de realização, as sequências de XTEN inventivas, incluindo aquelas incorporadas nas proteínas de fusão GHXTEN de objeto, são tornadas substancialmente não imunogénicas pela restrição de locais proteolíticos conhecidos a partir da sequência do XTEN, reduzindo o processamentG de XTEN em pequenos péptidos que podem se ligar aos receptores MHC II. Noutra forma de realização, a sequência XTEN é tornada substancialmente não imunogénica pela utilização de uma sequência que é substancialmente desprovida de estrutura secundária, conferindo resistência a muitas proteases devido à alta entropia da estrutura. Consequentemente, a pontuação TEPITOPE reduzida e a eliminação de sítios proteolíticos conhecidos do XTEN tornam as composições XTEN, incluindo o XTEN das composições da. proteína de fusão GHXTEN, substancialmente incapaz de ser ligado por recetores de mamíferos, incluindo aqueles do sistema imune. Numa forma de realização, um XTEN de uma proteína de fusão GHXTEN pode ter >100 nM de Kd de ligação a um recetor de mamífero, ou. superior a 500 nM de Kd ou superior a 1 μΜ de Kd para uma superfície de célula de mamífero ou recetor de polipéptido circulante.

Adicionalmente, a sequência não repetitiva e a correspondente ausência de epítopos de XTEN limitam a capacidade das células B para se ligar ou ser ci.tivci.das pela XTEN. Uma sequência repetitiva é reconhecida e pode formar contatos multivalentes com até algumas células B e, como consequência da reticulação de múltiplos recetores independentes de células T, pode estimular a proliferação de células B e a produção de anticorpos. Ag contrário, enquanto um XTEN pode fazer contatos com muitas células B diferentes em sua sequência estendida, cada célula B individual sõ pode fazer um ou um pequeno número de contatos com um XTEN individual devídG à falta de repetição da sequência. Sem estar ligado por nenhuma teoria, Os XTEN tipicamente têm uma tendência muito menor para estimular a proliferação de células B e, portanto, uma resposta imune. Numa forma de realizaçãG, o GHXTEN reduziu a imunogenicidade em comparação com a GH correspondente que não está fundida. Numa forma de realização, a administração de até três doses parentéricas de um GHXTEN a um mamífero resulta em IgC anti-GHXTEN detetável numa diluição no soro de 1:100, mas não a uma diluição de 1:1000. Noutra forma de realização, a. administração de até três doses parentéricas de um GHXTEN a um mamífero resulta em IgG anti-GH detetável numa diluição no soro de 1:100, mas não a uma diluição de 1:1000. Noutra forma de realização, a administração de até três doses parentéricas de um GHXTEN a um mamífero resulta em IgG anti-XTEN detetável numa diluição no soro de 1:100, mas não a uma diluição de 1:1000. Nas formas de realização anteriores, o mamífero pode ser um ratinho, um rato, um coelho ou um macaco cinomolgo.

Uma característica adicional de XTENs com sequências não repetitivas em relação a sequências com alto grau de repetição é XTEN não repetitivo formando contatos mais fracos com anticorpos. Os anticorpos são moléculas multívalentes. Por exemplo, As IgGs têm dois locais de ligação idênticos e as IgM contêm 10 locais de ligação idênticos. Assim, anticorpos contra, sequências repetitivas podem formar contatos multívalentes com tais sequências repetitivas com alta avidez, o que pode afetar a potência e/ou a eliminação de tais sequências repetitivas. Ao contrário, os anticorpos contra XTENs não repetitivos podem produzir interações monovalentes, esuitando em menor prGbabilidade de remoção imune, de mGdo que as composições GHXTEN possam permanecer em circulação por um período de tempo aumentado. 8. Raio hidrodinâmico aumentado

Noutro aspeto, a presente invenção proporciona XTEN em que os polipêptidos XTEN têm um raio hidrodinâmico elevado, o que confere uma correspondente massa molecular aparente correspondente â proteína de fusão GHXTEN que incorpora o XTEN. Conforme detalhado no Exemplo 37, a ligação das sequências XTEN às GH resulta em composições GHXTEN que podem ter raios hidrodinâmicos aumentados, massa molecular aparente aumentada e fator de massa molecular aparente aumentadG em comparação com uma GH não ligada a um XTEN, Por exemplo, em aplicações terapêuticas em que é desejada semivida prolongada, as composições nas quais um XTEN com um raio hidrodinâmico elevado é incorporado numa proteína de fusão que compreende uma ou mais GH podem aumentar eficazmente o raio hidrodinâmico da composição para além do tamanho de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (correspondente a uma massa molecular aparente de cerca de 70 kDA) (Caliceti. 2003. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277), resultando em redução da depuração renal das proteínas circulantes. 0 raio hidrodinâmico de uma proteína é determinado pela sua massa molecular, bem como pela sua estrutura, incluindo forma ou compacidade. Sem estar ligado por uma teoria particular, 0 XTEN pode adotar conformações abertas devido a repulsão eletrostática entre cargas individuais do péptido ou a flexibilidade inerente conferida pelos aminoácidos particulares na sequência que não tem potencial para conferir estrutura secundária. A conformação aberta, estendida e não estruturada do polipéptido XTEN pode ter um raio hidrodinâmico proporcional maior em comparação com polipéptidos de um comprimento de sequêncict e/ou massa molecular comparáveis que possuem estrutura secundária e/ u terciária, tal como proteínas globlares típicas. Métodos para a determinação do raio hidrodinâmico são bem conhecidos na técnica, tal como pela utilização de cromatografia de exclusão de tamanhG (SEC), conforme descrito nos documentos de Patente U.S. N°s 6.406.632 e 7.294.513. Conforme os resultados do Exemplo 37 demonstram, a adição de comprimentos crescentes de XTEN resulta em aumentos proporcionais nos parâmetros de raio hidrodinâmico, massa molecular aparente e fator de massa molecular aparente, permitindo a adaptação de GHXTEN ao corte característico desejado, massas moleculares aparentes gu raios hidrodinâmicos. Consequentemente, em determinadas formas de realização, a proteína de fusão GHXTEN pode ser configurada, com um XTEN de tal modo que a proteína de fusão pode ter um raio hidrodinâmico de pelo menos cerca de 5 nm, ou pelo menos cerca de 8 nm, ou pelo menos cerca de 10 nm, ou 12 nm, ou pelo menos cerca de 15 nm. Nas formas de realização anteriores, o grande raio hidrodinâmico conferido pelo XTEN em uma proteína de fusão GHXTEN pode levar à redução da depuração renal da proteína de fusão resultante, levando a um aumento correspondente na semivida terminal, um aumento do tempo médio de residência e/ou diminuição da taxa de depuração renal.

Noutra forma de realização, um XTEN de um comprimento e uma sequência escolhidos pode ser incorporado seletivamente num GHXTEN para criar uma proteína de fusão que tenha, sob condições fisiológicas, uma massa molecular aparente de pelo menos cerca de 150 kDa, ou pelo menos cerca de 3 00 kDa, ou pelo menos cerca de 4 00 kDa, ou pelo menos cerca de 500 kDa, ou pelo menos cerca de 600 kDa, ou pelo menos cerca de 700 kDa, ou pelo menos cerca de 800 kDa, ou pelo menos cerca de 900 kDa, ou pelo menos cerca de 1000 kDa, ou pelo menos cerca de 1200 kDa, ou pelo menos cerca de 1500 kDa, ou pelo menos cerca de 1800 kDa, ou pelo menos cerca de 2000 kDa ou pelo menos cerca de 2300 ou mais. Noutra forma de realização, um XTEN de um comprimento e uma sequência escolhidos pode ser ligado seletivamente numa GH para resultar uma proteína de fusão GHXTEN que tenha, sob condições fisiológicas, um fator de massa molecular aparente de pelo menos três, alternativamente de pelo menos quatro, alternativamente de pelo menos cinco, alternativamente de pelo menos seis, alternativamente de pelo menos oito, alternativamente de peio menos 10, alternativamente de pelo menos 15 ou um fator de massa molecular aparente de pelo menos 20 ou superior. Noutra forma de realização, a proteína de fusão GHXTEN tem, sob condições fisiológicas, um fator de massa molecular aparente que é de cerca de 4 a cerca de 20, ou é de cerca de 6 a cerca de 15, ou é de cerca de 8 a cerca de 12, ou é de cerca de 9 a cerca de 10 com relação à massa molecular real da proteína de fusão.

V). PROPRIEDADES E CONFIGURAÇÕES ESTRITURAIS DE GHXTEN A GH das composições de objeto não são limitadas a polipéptidos nativGS de comprimento completo, mas também incluem versões recombinantes, bem como variantes ou fragmentos biologicamente e/ou farmacologicamente ativos. Por exemplo, será apreciado que várias deleções de aminoãcidos, inserções e substituições podem ser feitas na GH para criar variantes sem se afastar do espírito da divulgação em relação à atividade biológica ou propriedades farmacológicas da GH. Exemplos de substituições conservativas para aminoãcidos em sequências polipeptídicas são mostrados no Quadro 4. Contudo, em formas de realização do GHXTEN em que a identidade de sequência da GH é inferior a 100% em comparação com uma sequência específica divulgada no presente documento, a invenção contempla a substituição de qualquer um dos outros 19 L-aminoãcidos naturais por um dado resíduo de aminoãcido da GH dada, que pode estar em qualquer posição dentro da sequência do GH, incluindo resíduos de aminoãcidos adjacentes. Se qualquer uma substituição resultar em uma mudança indesejável na atividade biológica, então pode ser utilizado um dos aminoãcidos alternativos e a construção avaliada pelos métodos descritos no presente documento, ou utilizando qualquer das técnicas e diretrizes para mutações conservadoras e não conservativas estabelecidas, por exemplo, no documento de patente U.S. N.° 5.364.934 ou utilizando métodos geralmente conhecidos na técnica. Além disso, as variantes podem incluir, por exemplo, polipéptidos em que um ou mais resíduos de aminoãcidos são adicionados ou eliminados no terminal N ou C da sequência de aminoãcidos nativa de comprimento total de uma GH que retém uma parte, ou não, da atividade biológica do péptido nativo.

Quadro 4; Substituições de axainoãcido conservafcivas

(a) Configurações de proteína de fusão GHXTEN A invenção proporciona composições de proteína de fusão GHXTEN com os componentes GH e XTEN ligados em configurações específicas de N-C-terminais. Em algumas formas de realização, uma ou mais GH são ligadas a um ou ma is XTENs, na terminação N ou na terminação C, com ou. sem espaçador, para formar um copolímero em bloco, e a disposição sequencial das GHs e dos XTEN na proteína de fusão GHXTEN são as mesmas que a configuração conhecida na química do copolímero em bloco. Quando existe mais de uma GH, XTEN ou espaçador, cada um da GH, o XTEN ou o espaçador têm sequências iguais ou diferentes e os GHs e/ou XTENs estão ligados de forma contínua ou alternada (regular ou irregular), Assim, em todas as fórmulas proporcionadas no presente documento, quando existe mais de uma GH, XTEN ou espaçador, cada um da GH, o XTEN ou o espaçador são iguais ou diferentes. Em algumas formas de realização, o GHXTEN é uma proteína de fusão monomérica com uma GH ligada a um polipéptido de XTEN. Noutras formas de realização, o GHXTEN é uma proteína de fusão monomérica com uma GH ligada a dois ou mais polipéptidos de XTEN. Ainda noutras formas de realização, o GHXTEN é uma proteína de fusão monomérica com duas ou mais GH ligadas a um polipéptido de XTEN. Ainda noutras formas de realização, o GHXTEN é uma proteína de fusão monomérica com duas ou mais GH ligadas a dois ou mais polipéptidos de XTEN. 0 Quadro 5 proporciona exemplos não limitativos de configurações que são abrangidas pelas prGteínas de fusão GHXTEN da invenção; numerosas outras variações serão aparentes para o perito na especialidade, incluindo a incorporação das sequências de espaçador e clivagem divulgadas no presente documento ou conhecidas na técnica. _Quadro 5; Configurações de GHXTEN_

A invenção contempla composições de proteínas de fusão GHXTEN que compreendem, mas não limitados a GH única ou múltipla selecionada, a partir do Quadro 1 (ou fragmentos ou variantes de sequência das mesmas), XTEN único ou múltiplo selecionado a partir do Quadro 3 (ou variantes de sequência do mesmo) que estão numa configuração selecionada a partir do Quadro 5. No geral, o GHXTEN resultante retêm pelo menos uma porção da atividade biológica da correspondente GH não ligada ao XTEN. Noutras formas de realização, o componente de GH torna-se biologicamente ativo ou tem um aumento de atividade após a sua libertação do XTEN por clivagem de uma sequência de clivagem opcional incorporada dentro de sequências espaçadoras no GHXTEN, descrito mais completamente abaixo.

(XTEN)X-GH-(XTEN)y I em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormGna do crescimento; x é 0 ou 1 e y é 0 ou 1 em que x+y >1; e XTEN é um polipéptidc· recombinante estendido.

(XTEN)x~(GH)-(S)y-(XTEN)y II em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento a; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1 e y é 0 ou 1 em que x+yái; e XTEN ê um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma prGteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula (GH)-(S)x-(XTEN)- (S)y-(GH)- (S)z-(XTEN)z III em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; z é 0 ou 1; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula IV: (XTEN) x- (S) y- (GH) - (S) z- (XTEN) - (GH) IV em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; z ê 0 ou 1; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma hormona do crescimento de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula V:

(GH) x-(S)x-(GH)- (S)y-(XTEN) V em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1? y é 0 ou 1; e ΧΊΈΝ é um pGlípéptido recombinant e estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula VI: (XTEN)- (S)x-(GH)- (S)y-(GH) VI em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoãcídGS que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula VII: (XTEN) (S) x - (GH) (S) y - (GH) - (XTEN) VII em que independentemente para cada ocorrência, GH é uma hormona do crescimento; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 e cerca de 50 resíduos de aminoácidos que podem opcionalmente incluir uma sequência de clivagem; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido.

Noutra forma de realização, a invenqão proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é de fórmula VIII: ( (S)m- (GH) x- (S) n- (XTEN) y- (S)0)t VIII em que t é um número inteiro que é superior a 0 (1, 2, 3, etc.); independentemente de cada um de m, n, o, x e y é um número inteiro (0, 1, 2, 3, etc.), GH é uma hormona do crescimento,· S é um espaçador, opcionalmente compreendendo um local de clivagem; e XTEN é um polipéptido recombinante estendido, coin a condição de que: (1) x+y >1, (2) quando t = 1, x>0 e y>0, (3) quando existe mais de um GH, S ou XTEN, cada GH, XTEN ou S são iguais ou são independentemente diferentes; e (4) quando t > 1, cada m, n, o, x ou y dentro de cada subunidade são iguais ou são independentemente diferentes.

Em algumas formas de realização, a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de uma forma de realização das fórmulas I-VIII a um indivíduo que dela necessite resulta num ganho no tempo de pelo menos duas vezes, ou pelo menos três vezes, ou pelo menos quatro vezes, ou pelo menos cinco vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 100 vezes ou mais gastos dentro de uma janela terapêutica para a proteína de fusão em comparação com a GH correspondente não ligada ao XTEN e administrada a uma quantidade comparável administrada a um indivíduo. Noutras formas de realização, a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de uma forma de realização das fórmulas I-VIII a um indivíduo que dela necessite pode resultar num ganho no tempo entre doses consecutivas necessárias para manter um regime de dose terapeuticamente eficaz de pelo menos 48 h, ou pelo menos 72 h, ou pelo menos cerca de 96 h, ou pelo menos cerca de 120 h, ou pelo menos cerca de 7 dias, ou pelo menGS cerca de 14 dias, ou pelo menos cerca de 21 dias entre doses consecutivas em comparação com uma GH não ligada a XTEN e administrado a uma dose comparável.

Qualquer grupo de sequência espaçadora é opcional nas proteínas de fusão abrangidas pela invenção. 0 espaçador é proporcionado para aumentar a expressão da proteína de fusão a partir de uma célula hospedeira ou para diminuir o obstáculo estérico, de tal modo que o componente de GH pode assumir a sua estrutura terciária desejada e/ou interagir adequadamente com o seu recetor alvo. Para espaçadores e métodos de identificação de espaçadores desejáveis, veja-se, por exemplo, George, et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879. Numa forma de realização, o espaçador compreende uma ou mais sequências peptídicas que estão entre 1-50 resíduos de aminoãcidos em comprimento, ou cerca de 1-25 resíduos, ou cerca de 1-10 resíduos de comprimento. Sequências espaçadoras, exclusivas de locais de clivagem, podem compreender qualquer um dos 20 aminoãcidos L naturais, e de preferência compreenderão aminoãcidos hidrofílicos que estão sem impedimentos estéricos que podem incluir, mas não se limitam a, glicina (G) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) . Em alguns casos, o espaçador pode ser poliglicinas ou polialaninas, ou é predominantemente uma mistura de combinações de resíduos de glicina e alanina. 0 polipéptido espaçador exclusivo de uma sequência de clivagem é em grande parte substancialmente desprovido de estrutura secundária; por exemplo, menos de cerca de 10%, ou menos de cerca de 5%, conforme determinado pelos algoritmos Chou-Fasman e/ou de GOR. Numa forma de realização, uma ou ambas as sequências espaçadoras numa composição de proteína de fusão GHXTEN contém, cada uma, uma sequência de clivagem, que são igua.is ou diferentes, em que a sequência de clivagem pode ser realizada por uma protease para libertar a GH da proteína de fusão.

Numa forma de realização, um GH incorporado numa proteína de fusão GHXTEN tem uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência para uma sequência do Quadro 1, alternativamente pelG menos cerca de 81%, ou cerca de 82%, ou cerca de 83%, ou cerca de 84%, ou cerca de 85%, ou cerca de 86%, ou cerca de 87%, ou. cerca de 88%, ou cerca de 8 9%, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência em comparação com uma sequência do Quadro 1. 0 GH da forma de realização anterior pode ser avaliado para atividade utilizando ensaios ou parâmetros medidos ou determinados como descrito no presente documento, e essas sequências que retém pelo menos cerca de 40%, ou cerca de 50%, ou cerca de 55% ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca, de 90%, ou cerca de 95% ou ma is de atividade em comparação com a sequência de GH nativa correspondente, seriam considerados adequados para inclusão no sujeito GHXTEN. 0 GH encontrado para reter um nível adequado de atividade pode ser ligado a um ou mais polipéptidos XTEN descritos acima. Numa forma de realização, um GH encontrado para reter um nível adequado de atividade pode ser ligado a um ou mais polipéptidos XTEN com pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência a uma sequência do Quadro 3, alternativamente pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 9 9% ou 100% de identidade de sequência em comparação com uma sequência do Quadro 3, resultando em uma proteína de fusão quimé rica.

Exemplos não limitativos de sequências de proteínas de fusão contendo uma única GH ligada a um único XTEN são apresentados no Quadro 35. Numa forma de realização, uma composição de GHXTEN compreenderia uma proteína de fusão tendG peio menos cerca de 80% de identidade de sequência para um GHXTEN do Quadro 35, alternativamente pelo menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência em comparação com um GHXTEN do Quadro 35. Exemplos não limitativos de sequências de proteínas de fusão contendo duas moléculas de XTEN ligadas a uma ou. mais GH são apresentados no Quadro 36, mas a invenção também contempla a substituição de outra GH por sequências apresentando pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência de hGH selecionada a partir do Quadro 1 ligada a um ou dois XTEN, que podem ser iguais ou diferentes, exibindo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência selecionada, partir do Quadro 3.

(b) Propriedades farmacocinéticas de GHXTEN A invenção proporciona proteínas de fusão GHXTEN com farmacocinética melhorada em comparação com a GH não ligada a XTEN que, quando utilizado na dose determinada para a composição pelos métodos descritos no presente documento, pode atingir uma concentração circulante resultando em um efeito farmacológico, ainda permaneça dentro do intervalo de segurança para o componente biologicamente ativo da composição por um longo período de tempo em comparação com uma dose comparável da GH não ligada ao XTEN, Em tais casos, o GHXTEN permanece dentro da janela terapêutica para a composição da proteína de fusão durante um longo período de tempo. Conforme é utilizado no presente documento, uma "dose comparável" significa uma dose com um moles/kg equivalentes para o farmacóforo GH ativo que é administrado a um indivíduo de forma comparável. Será entendido na técnica que uma "dosagem comparável" da proteína de fusão GHXTEN representaria um peso maior de agente, mas teria essencialmente os mesmos equivalentes de moles GH na dose da proteína, de fusão e/ou teria a mesma concentração molar aproximada em relação à GH,

As propriedades farmacocinéticas de uma GH que podem ser melhoradas através da ligação de um determinado XTEN ao GH incluem a semivida terminal, área sob a curva (AUC), volume de distribuição Crnax e biodisponibil idade proporcionando maior utilidade no tratamento de doenças, condições patológicas e distúrbios relacionados à hormona do crescimento. A GH das composições GHXTEN pode ser uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de proteína selecionada a partir do Quadro 1, ligado a um ou mais XTEN que exibem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de proteína selecionada a partir do Quadro 3.

Conforme descrito mais completamente nos Exemplos relativos às características farmacocinéticas das proteínas de fusão compreendendo XTEN, descobriu-se surpreendentemente que aumentar o comprimento da sequência XTEN confere um aumento desproporcionado na semivida terminal de uma proteína de fusão que compreende o XTEN. Consequentemente, a invenção proporciona proteínas de fusão GHXTEN compreendendo XTEN em que o XTEN é selecionado para proporcionar uma semivida direcionada para a composição GHXTEN administrada a um indivíduo. Em algumas formas de realização, a invenção proporciona proteínas de fusão monoméricas compreendendo XTEN em que o XTEN é selecionado para conferir um aumento na semivida terminal para a GHXTEN administrada a um indivíduo, em comparação com a GH correspondente não ligada à proteína de fusão e administrado numa. dose comparável, pelo menos cerca de duas vezes mais longa, ou pelo menos cerca de três vezes, ou pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos cerca de sete vezes, ou. pelo menos cerca de oito vezes, ou pelo menos cerca de nove vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes, ou pelG menos cerca de 15 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 80 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes ou superior m aumento na semivida terminal em comparação com a GH não ligada à proteína de fusão. A hormona do crescimento humano administrada de forma exógena foi relatada como tendo uma semivida terminal em seres humanos de menos de 15 minutos (Hindmarch, P.C., et al., Clinical Endocrinology (2008) 30(4); 443-450), enquanto várias composições de GHXTEN divulgadas no presente documento que foram administradas experimentalmente a várias espécies de animais, conforme descrito nos Exemplos, resultaram em valores de semivida terminal de várias horas. De forma semelhante, as proteínas de fusão de GHXTEN podem ter um aumento de AUC de pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 150%, ou pelo menos cerca de 200%, ou pelo menos cerca de 300%, ou pelo menos cerca de 500%, ou pelo menos cerca de 1000%, ou pelo menos cerca de 2000% de aumento de AUC em comparação com a GH correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada a um indivíduo a uma dose comparável. Os parâmetros farmacocinéticos de um GHXTEN podem ser determinados por métodos padrão que envolvem a dosagem, a recolha, de amostras de sangue em intervalos de tempo e o ensaio da proteína utilizando ELISA, HPLC, radioensaios ou outros métodos conhecidos na técnica ou CGnforme descrito no presente, seguido de cálculos padrão dos dados para derivar a semivida e outros parâmetros PK. A invenção proporciona ainda GHXTEN compreendendo uma primeira e uma segunda molécula de GH, opcionalmente separados por uma sequência espaçadora que pode ainda compreender uma sequência de clivagem, ou separada por uma segunda sequência XTEN. Numa forma de realização, a GH tem menos atividade quando ligada à proteína de fusão em comparação com uma GH correspondente não ligada à proteína de fusão. Em tal caso, conforme é ilustrado na FIG. 38, 0 GHXTEN é concebido de tal forma que, após a administração a um indivíduo, o componente GH é gradualmente libertado por clivagem dais) sequência(s) de clivagem, depois disso, recupera a atividade ou a capacidade de se ligar ao seu recetor ou ligando alvo. Consequentemente, 0 GHXTEN do que precede serve como um profãrmaco ou um depósito circulante, resultando em uma semivida terminal mais longa comparada à GH não ligada à proteína de fusão.

(c) Farmacologia e propriedades farmacêuticas de GHXTEN A presente invenção proporciona composições de GHXTEN compreendendo GH ligada covalentemente a XTEN que pode ter propriedades melhoradas em comparação com GH não ligada a XTEN, bem como métodos para melhorar a atividade terapêutica e/ou biológica ou o efeito dos respetivos dois componentes GH das composições. Além disso, a invenção proporciona composições de GHXTEN com propriedades melhoradas em comparação com as proteínas de fusão conhecidas na técnica que contêm parceiros de polipéptidos de imunoglobulina, polipéptidos de pares de comprimento e/ou polipéptido de comprimento mais curto com sequências repetitivas. Além disso, as proteínas de fusão GHXTEN proporcionam vantagens significativas em relação aos conjugados químicos, tais como construções peguiladas, nomeadamente o fato de que as proteínas de fusão GHXTEN recombinantes podem ser feitas em sistemas de expressão de células bacterianas, o que pode reduzir o tempo e o custo nas fases de pesquisa e desenvolvimento e fabrico de um produto, bem como resultar em um produto mais homogéneo e definido com menos toxicidade tanto para o produto quanto para os metabolites do GHXTEN em comparação com conjugados peguilados.

Como agentes terapêuticos, o GHXTEN possui uma série de vantagens em relação à terapêutica que não compreende XTEN, incluindo uma ou mais das seguintes propriedades de reforço exemplificativas não limitativas; solubilidade aumentada, estabilidade térmica aumentada, imunogenicidade reduzida, massa molecular aparente aumentada, depuração renal reduzida, proteõlise reduzida, metabolismo reduzido, eficiência terapêutica melhorada, uma dose terapêutica eficaz mais baixa, biodisponibilidade aumentada, aumento do tempo entre dosagens capazes de manter os níveis sanguíneos dentro da janela terapêutica para a GH, uma taxa de absorção "adaptada", estabilidade de liofilização melhorada, estabilidade de soro/plasma melhorada, semivida terminal aumentada, solubilidade na corrente sanguínea aumentada, ligação diminuída pela neutralização de anticorpos, depuração mediada por recetor diminuída, efeitos secundários reduzidos, retenção de afinidade de ligação do recetor/ligando ou ativação do receptor/ligando, estabilidade à degradação, estabilidade ao congelamento-descongelamento, estabilidade às proteases, estabilidade à ubiquitinação, facilidade de administração, compatibilidade com outros excipientes ou veículos farmacêuticos, persistência no indivíduo, maior estabilidade no armazenamento (por exemplo, semivida aumentada), toxicidade reduzida num organismo ou meio ambiente e semelhantes. 0 efeito líquido das propriedades melhoradas é que o GHXTEN resulta, em efeito terapêutico e/ou biológico melhorado ou melhora a conformidade do paciente quando administrado a um indivíduo com uma doença ou distúrbio relacionado com a hormona do crescimento.

Ensaios e métodos específicos para. medir as propriedades físicas e estruturais das proteínas expressas são conhecidos na técnica, incluindo métodos para determinar propriedades como agregação de proteínas, solubilidade, estrutura secundária, e terciária, propriedades de fusão, contaminação e teor de água, etc. Tais métodos incluem centrifugação analítica, EPR, HPLC-permuta iõnica, HPLC-exclusão de tamanho, HPLC-fase reversa, dispersão de luz, eletroforese capilar, dicroismo circular, calorimetria de varrimento diferencial, fluorescência, HPLC-permuta iónica, HPLC-exclusão de tamanho, IR, RMN, espectroscopia de Raman, refratometria e espectroscopia de UV/visível. Métodos adicionais são divulgados em Arnau et al, Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13. A aplicação destes métodos à invenção seria ao alcance de um perito na especialidade.

Numa característica particular da invenção, O XTEN como parceiro de fusão aumenta a solubilidade da carga útil da GH, particularmente na expressão de GH, que é tipicamente expresso como corpos de inclusão insolúveis em células hospedeiras transformadas, such as E. coli (veja-se, por exemplo, Singh, S. M., et al. (2005) J Biosci Bioeng, 99: 303; Patra, A. K., et al. (2000) Protein Expr Purif, 18: 182). Consequentemente, onde o melhoramento das propriedades farmacêuticas ou físico-químicas da GH é desejável, tais como o grau de solubilidade ou estabilidade aquosa, o comprimento e/ou a composição familiar do motivo das primeiras e segundas sequências de XTEN da primeira e dei segunda proteína de fusão podem, cada uma, ser selecionadas para conferir um grau diferente de solubilidade e/ou estabilidade nas respetivas proteínas de fusão de modo que as propriedades de produto farmacêutico global da composição de GHXTEN são aprimoradas. As proteínas de fusão GHXTEN podem ser construídas e ensaiadas, utilizando métodos descritos no presente documento, para confirmar as propriedades físico-químicas e o XTEN ajustado, conforme for necessário, para resultar nas propriedades desejadas. Numa forma de realização, a sequência de XTEN do GHXTEN é selecionado de tal modo que a proteína de fusão possui uma solubilidade aquosa que está em pelo menos cerca de 25% maior em comparação com uma GH não ligada à proteína de fusão, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 200%, ou pelo menos cerca de 300%, ou pelo menos cerca de 400%, ou pelo menos cerca de 500%, ou pelo menos cerca de 1000% maior que a GH correspondente não ligada à proteína de fusão. A invenção proporciona métodos para produzir e recuperar o GHXTEN expresso de uma célula hospedeira com maior solubilidade e facilidade de recuperação em comparação com a GH não ligada ao XTEN. Em algumas formas de realização, o método inclui as etapas de transformar uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, E. coli) com um polinucleótido que codifica um GHXTEN com um ou mais componentes XTEN do comprimento da sequência cumulativa superior a cerca de 800, ou superior a cerca de 900 ou superior a cerca de 1000 ou superior a cerca de 1100 resíduos de aminoãcidos, expressando a proteína de fusão GHXTEN na célula hospedeira, lise a célula hospedeira ptira recuperar conteúdos citoplasmáticos e acidificando os conteúdos citoplasmáticos da célula hospedeira em que a GH pode permanecer em forma solúvel enquanto a maioria das proteínas das células hospedeiras são precipitadas em forma insolúvel. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, os lisados de células hospedeiras em bruto pós-expressão podem ser acidificados até um pH inferior a cerca de 5,0 ou a um pH inferior a cerca de 4,7 ou a um pH inferior a cerca de 4,5 ou a um pH inferior a cerca de 4,2 e superior a cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou. cerca de 80% ou mais do GH expresso pode ser recuperado sob uma forma solúvel. Numa característica da forma de realização anterior, o GHXTEN enriquecido pode ser separado dos contaminantes da proteína das células hospedeiras precipitadas por centrifugação do lisado acidificado, um reflexo da solubilidade aumentada conferida ao GH por fusão ao transportador XTEN. Nas formas de realização anteriores no presente documento descritas neste parágrafo, 0 XTEN das proteínas de fusão GHXTEN pode ter pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96 %, ou cerca de 97%, ou cerca de 98% ou cerca de 9 9%, a cerca de 100% de identidade de sequência para um ou maís ΧΊΈΝ selecionados a partir do Quadro 3 e a GH pode ter pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98%, ou cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência para uma GH selecionada a partir do Quadro 1 e os componentes de GHXTEN podem estar numa configuração N a C-terminal selecionada a partir do Quadro 5.

Numa forma de realização, a invenção proporciona composições e métodos de GHXTEN para produzir as composições que podem manter o componente de GH dentro de uma janela terapêutica por um período de tempo maior em comparação com dosagens comparáveis da GH correspondente não ligada ao XTEN. Será entendido na técnica que uma "dosagem comparável" da proteína de fusão GHXTEN representaria una peso maior de agente, mas teria os mesmos equivalentes de moles GH aproximados na dose da proteína de fusão e/ou teria a mesma concentração molar aproximada em relação à GH. O método para produzir as composições que podem manter o componente de GH dentro de uma janela terapêutica inclui as etapas de selecionar o XTEN apropriado para a conjugação de um GH para proporcionar as propriedades farmacocinéticas desejadas em vista de uma dada dose e regimento de dose, seguido de ensaios para verificar as propriedades farmacocinéticas, a atividade da proteína de fusão GHXTEN e o segurança da composição administrada. Pelos métodos, GHXTEN pode ser produzido que permite uma eficácia aumentada da composição administrada mantendo as concentrações circulantes da GH dentro da janela terapêutica durante um período de tempo aumentado. Conforme é utilizado no presente documento, "janela terapêutica" significa que a quantidade de fármaco ou biologia como faixa de concentração de sangue ou plasma, que proporciona eficácia, ou um efeito farmacológico desejado ao lGngo do tempo para a doença ou condição sem toxicidade inaceitável, isto é, o intervalo das concentrações sanguíneas circulantes entre a quantidade mínima para atingir qualquer efeito terapêutico positivo e a quantidade máxima que resulta em uma resposta que é a resposta imediatamente antes da toxicidade para o sujeito (numa dose ou concentração mais alta). Adicionalmente, a janela terapêutica abrange geralmente um aspecto do tempo; a concentração máxima e mínima que resulta num efeito farmacológico desejado ao longo do tempo que não resulta em toxicidade inaceitável ou eventos adversos. Uma composição doseada que permanece dentro da janela terapêutica para o indivíduo também pode ser dito estar dentro da "faixa de segurança".

As características das composições de GHXTEN da invenção, incluindo características funcionais ou atividade biológica e farmacológica e parâmetros que resultam, são determinados por qualquer ensaio de rastreio adequado conhecido na técnica para medir a característica desejada. Isto proporciona métodos para ensaiar as proteínas de fusão GHXTEN de diferentes composições ou configurações de modo a proporcionar GHXTEN com o grau desejado de atividade biológica e/ou terapêutica., bem como perfil de segurança. Os ensaios biológicos específicos in vivo e ex vivo são utilizados para avaliar a atividade de cada componente GHXTEN e/ou GH configurado a ser incorporado no GHXTEN, incluindo, mas não se limitando aos ensaios dos Exemplos, esses ensaios do Quadro 34, bem como os seguintes ensaios ou outros ensaios semelhantes conhecidos na técnica para ensaiar as propriedades e os efeitos de GH. Podem ser realizados ensaios que permitem a determinação das características de ligação do GHXTEN para recetores de GH ou um ligando, incluindo constante de ligação (Kd), valores de EC50, bem como a sua semivida de dissociação do complexo ligando-recetor (Ti/2) . A afinidade de ligação pode ser medidas, por exemplo, por um ensaio de ligação do tipo competição que deteta alterações na capacidade de se ligar especificamente a um recetor ou ligando (veja-se, por exemplo, os Exemplos). Adicionalmente, técnicas como citometría de fluxo ou ressonância de plasmão de superfície podem ser utilizadas para detetar eventos de ligação. Os ensaios podem compreender moléculas recetoras solúveis ou podem determinar a ligação a recetores expressos em células. Tais ensaios podem incluir ensaios baseados em células, incluindo ensaios para proliferação, morte celular, apoptose e migração celular. Outros possíveis ensaios podem determinar a ligação do recetor de polipéptidos expressos, em que os ensaios podem compreender moléculas recetoras solúveis ou podem determinar a ligação a. recetores expressos em células. A afinidade de ligação de um GHXTEN para os recetores ou ligandos alvo da GH correspondente pode ser ensaiada utilizando ensaios de ligação ou de ligação competitiva, tais como ensaios Biaçore com recetores ligados a chips ou proteínas de ligação ou ensaios ELISA, conforme descrito na Patente US N° 5.534.617, ensaios descritos nos Exemplos no presente documento, ensaios de recetor de rádio ou outros ensaios conhecidos na técnica. Além disso, As variantes de sequência de GH (ensaiadas como componentes únicos ou como proteínas de fusão de GHXTEN) podem ser comparadas com a GH nativa utilizando um ensaio de ligação ELISA competitivo para determinar se eles têm a mesma especificidade e afinidade de ligação que a GH nativa, ou alguma fração da mesma, de tal modo que eles são adequados para inclusão no GHXTEN. Os ensaios funcionais podem incluir o aumento da secreção e/ou geração de IGF-1 nas células alvo como resultado da exposição ao GHXTEN e/ou os efeitos estimulantes resultantes do IGF- 1 na atividade dos osteoblastos e dos condrócitos para promover o crescimento ósseo; todos são parâmetros adequados para avaliar a atividade de GH para inclusão na proteína de fusão GHXTEN ou o GHXTEN resultante. Além disso, A hormona do crescimento humano (hGH) é conhecida por desempenhar um papel no crescimento somático através dos seus efeitos sobre o metabolismo das proteínas, hidratos de carbono e lípidos, bem como a estimulação da produção de células sanguíneas in vitro (Derfalvi et ai., 1998; Merchav et al; 1988), aumentar o número de eritrócitos e o teor de hemoglobina no sangue (Valerio et al., 1997; Vihervuori et al., 1996), bem como o aumento da proliferação e produção de Ig nas linhas celulares plasmãticas (Kimata and Yoshida, 1994), a estimulação das contagens de células CD8+ e, a um menor grau a contagens de células CD4+ (Geffner, 1997) . Parâmetros que podem ser medidos cronicamente incluem velocidade de crescimento, maturação física e taxa de crescimento comparativo do osso. Tudo o que precede pode ser utilizado para avaliar a atividade de componentes de GH a serem incorporados no GHXTEN e o GHXTEN resultante. A otimização de dose é importante para todos os fármacos, especialmente para aqueles com uma estreita janela terapêutica. Por exemplo, uma dose única padronizada de GH para todos os pacientes que apresentam sintomas diversos ou parâmetros clínicos anormais pode nem sempre ser efetiva. Uma consideração destes fatores está bem dentro da competência do clínico normalmente qualificado com o propósito de determinar a quantidade terapêutica ou farmacologicamente eficaz do GHXTEN, versus essa quantidade que resultaria em toxicidade inaceitável e colocá-lo fora da faixa de segurança, ou pGtência insuficiente, de modo que a melhora clínica nãc· seja alcançada.

Em muitos casos, a janela terapêutica para GH em indivíduos de diferentes idades ou grau de doença foi estabelecida e está disponível na literatura publicada ou são indicadas no rótulo do medicamento para produtos aprovados que contêm o GH. Em outros casos, A janela terapêutica pode ser estabelecida para novas composições, incluindo aqueles GHXTEN da divulgação. Os métodos para estabelecer a janela terapêutica para uma determinada composição são conhecidos dos peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11a Edição, McGraw-Hill (2005)) . Por exemplo, utilizando estudos de escalonamento de dose em indivíduos com a doença ou distúrbio alvo para determinar a eficácia ou um efeito farmacológico desejável, o surgimento de eventos adversos e determinação dos níveis sanguíneos circulantes, A janela terapêutica para um determinado indivíduo ou população de indivíduos pode ser determinada para um dadG medicamento ou biológico, ou combinações de biologias ou fármacos. Os estudos de escalonamento de dose podem avaliar a atividade de um GHXTEN através de estudos metabólicos num indivíduo ou grupo de indivíduos que monitoriza parâmetros fisiológicos ou bioquímicos, como é conhecido na técnica ou conforme descrito no presente para. um ou mais parâmetros associados à doença ou distúrbio metabólico ou parâmetros clínicGS associados a um resultado benéfico para a indicação particular, juntamente com observações e/ou parâmetros medidos para determinar a dose sem efeito, eventos adversos, dose máxima tolerada e semelhantes, juntamente com a medida dos parâmetros farmacocinéticos que estabelecem os níveis sanguíneos circulantes determinados ou derivados. Os resultados podem então ser correlacionados com a dose administrada e as concentrações sanguíneas do terapêutícG que coincidem com os parâmetros ou níveis de efeito acima mencionados. Por estes métodos, uma gama de doses e concentrações sanguíneas podem ser correlacionadas com a dose efetiva mínima, bem como a dose máxima e a concentração sanguínea a que ocorre o efeito desejado e acima do qual ocorre a toxicidade, estabelecendo assim a janela terapêutica para a terapêutica doseada. As concentrações sanguíneas da proteína de fusão (ou medida pelo componente de GH) acima do máximo seriam consideradas fora da janela terapêutica ou intervalo de segurança. Consequentemente, pelos métodos anteriores, um nível sanguíneo Cmin seria estabelecido, abaixo do qual a proteína de fusão GHXTEN não teria o efeito farmacológico desejado e um nível de Cmax sanguíneo seria estabelecido que representaria a maior concentração circulante antes de atingir uma concentração que provocaria efeitos colaterais inaceitáveis, toxicidade ou eventos adversos, colocando-o fora do alcance de segurança para o GHXTEN. Com tais concentrações estabelecidas, a frequência de dosagem e a dosagem podem ser melhoradas adicionalmente através da medição da Cmax e Cmir; para proporcionar a dose e a frequência de dose apropriadas para manter a(s) proteína(s) de fusão dentro da janela terapêutica. Um perito na especialidade pode, pelos meios divulgados no presente documento ou por outros métodos conhecidos na técnica, confirmar que o GHXTEN administrado permanece na janela terapêutica para o intervalo desejado ou requer ajuste na dose ou comprimento ou sequência de XTEN. Adicionalmente, a determinação da dose adequada e da frequência de dose para manter o GHXTEN dentro da. janela terapêutica estabelece o regime de dose terapeuticamente eficaz; a programação para a administração de múltiplas doses consecutivas utilizando uma dose terapeuticamente eficaz da proteína de fusão para um indivíduo que dela necessite, resultando em picos de Cmax consecutivos e/ou rebaixos de Cmin que permanecem dentro da janela terapêutica e resultam em uma melhoria em pelo menos um parâmetro medido relevante para a doença alvo, distúrbio ou condição patológica. Em alguns casos, o GHXTEN administrado a uma dose apropriada para um indivíduo resulta em concentrações sanguíneas da prGteína de fusão GHXTEN que permanece dentro da janela terapêutica durante um período pelo menos duas vezes mais longo em comparação com o GH correspondente não ligado ao XTEN e administrado a uma dose comparável; alternativamente pelo menos cerca de três vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de quatro vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de cinco vezes mais longo; alternativamente peio menos cerca de seis vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca, de sete vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de oito vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de nove vezes mais longo ou pelo menos cerca de dez vezes mais longo ou maior em comparação com o GH correspondente não ligado a XTEN e administrado a uma dose comparável. Conforme é utilizado no presente documento, uma "dose apropriada" significa uma dose de um medicamento ou biológico que, quando administrado a um indivíduo, resultaria em um efeito terapêutico ou farmacológico desejável e uma concentração sanguínea dentro da janela terapêutica.

Numa forma de realização, o GHXTEN administrado a um regime de dose terapeuticamente eficaz resulta num ganho no tempo de pelo menos cerca de três vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de quatro vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de cinco vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de seis vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de sete vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de oito vezes mais longo; alternativamente pelo menos cerca de nove vezes mais ou. pelo menos cerca de dez vezes mais tempo entre pelo menos dois picos de Gnsx consecutivos e/ou rebaixos de Cmin para níveis de sangue da proteína de fusão em comparação com a proteína biologicamente ativa correspondente da proteína de fusão não ligada à proteína de fusão e administrada em regime de dose comparável a um indivíduo. Noutra forma de realização, o GHXTEN administrado num regime de dose terapeuticamente eficaz resulta numa melhoria comparável em um, ou dois ou três ou mais parâmetros medidos utilizando dose menos frequente ou uma dosagem total mais baixa em moles da proteína de fusão da composição farmacêutica em comparação com o(s) correspondente(s) componente(s) proteico(s) biologicamente ativo(s) não ligado(s) à proteína de fusão e administrado(s) a um indivíduo utilizando um regime de dose terapeuticamente eficaz para a GH. Os parâmetros medidos incluem qualquer um dos aspectos clínicos, parâmetros bioquímicos ou fisiológicos aqui descritos, ou outros conhecidos na técnica para avaliar indivíduos com distúrbios relacionados com a hormona do crescimento, A invenção proporciona GHXTEN isolado em que a afinidade de ligação para recetores ou ligandos alvo de GH pelo GHXTEN pode ser pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 4 0%, ou a pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou peio menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 9 9%, ou pelo menos

Cerca de 100% ou mais da afinidade de uma GH nativa não ligada a XTEN para o recetor alvo ou ligandG. Em alguns casos, a afinidade de ligação Kd entre o sujeito GHXTEN e um recepor ou ligando nativo do GHXTEN é pelo menos cerca de 10“4 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"b M, alternativamente pelo menos cerca de IQ”6 M, ou pelo menos cerca de 1G”7 M, ou pelo menos cerca de 10"8 M, ou pelo menos cerca, de 10‘9 M da afinidade entre o GHXTEN e um recetor ou ligando nativo.

Noutras formas de realização, a invenção fornece proteínas de fusão GHXTEN isoladas especificamente concebidas para ter uma afinidade de ligação reduzida para o recetor GH. Numas formas de realização, tais como proteínas de fusão compreendendo um XTEN fundido com a terminação C da GH 1 cerca de 97% de identidade de sequência ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com proteínas de fusão de GH selecionadas a partir de AE912 -hGí-I-ΆΕ144, AE912-hGH-AF144 , AE912 -hGI-I-AE288, AM923-hGH-AE144 , AM923-hGH-AF144 , ΆΜ923-hGH-AE288 e as sequênc ias dos Quadros 36- 3 7 .

Em algumas formas de realização, as proteínas de fusão GHXTEN da invenção retêm pelo menos cerca de 0,05%, ou cerca de 0,1%, ou. cerca de 1%, ou cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 30%, ou cerca de 40%, ou cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 98% ou cerca de 99% por cento da atividade biológica da GH correspondente não ligada â proteína de fusão em relação a uma atividade biológica in vitro ou efeito farmacológico conhecido ou associado à utilização da GH nativa no tratamento e prevenção de doenças, distúrbios ou condições patológicas relacionadas à hormona do crescimento. Exemplos não limitativos de atividades ou efeitos farmacológicos que podem ser testados para avaliar a atividade retida das proteínas de fusão GHXTEN incluem marcadores de transdução de sinal em células com recetores de GH, concentrações de IGF -1 provocadas, concentrações de ICFBP3 provocadas, mudanças em velocidade de altura, massa corporal magra, gordura corporal total, gordura do tronco, parâmetros associados a síndrome de resistência à insulina, medição de divisão e taxas de multiplicação de condrócitos, mudanças na densidade óssea e crescimento ósseo (por exemplo, aumento da largura da placa, epifisária) . Em algumas formas de realização, a atividade do componente de GH é manifestada pela proteína de fusão GHXTEN intacta, enquanto que, em outros casos, a atividade do componente GH seria manifestada principalmente após a clivagem e a libertação da GH da proteína de fusão por ação de uma protease que atua sobre uma sequência de clivagem incorporada na proteína de fusão GHXTEN. No que precede, o GHXTEN foi concebido para reduzir a afinidade de ligação do componente de GH para o recetor ou ligando guando ligadG ao XTEN, mas tem uma afinidade restaurada ou aumentada quando libertada do XTEN através da clivagem da(s) sequência(s) de clivagem incorporada(s) na sequência GHXTEN, conforme é descrito mais completamente acima.

Em outros casos, o GHXTEN pode ser concebido para reduzir a afinidade de ligação do componente GH ao recetor GH para aumentar a semivida terminal do GHXTEN administrado a um indivíduo através da redução da depuração mediada pelo recetor; por exemplo, ao adicionar um XTEN ao terminal C do componente GH da. proteína de fusão. Em outros casos, o GHXTEN é concebidos ara reduzir a afinidade de ligação do componente de GH ao recetor de GH para reduzir a toxicidade ou efeitos colaterais devido à composição administrada.

Consequentemente, a invenção proporciona um método para aumentar a semivida terminal de um GHXTEN produzindo uma construção de proteína de fusão de cadeia única com uma configuração de N-a-C-terminal específica dos componentes compreendendo pelo menos um primeiro GH e um primeiro e um segundo XTEN, em que a proteína de fusão numa primeira configuração do terminal N- para C dos componentes GH e XTEN reduziu a depuração mediada pelo recetor (RMC) e um aumento correspondente na semivida terminal em comparação com um GHXTEN numa segunda configuração N-a-C-terminal. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, o GHXTEN é configurado, N- a C-terminal como XTEN-GH-XTEN, que reduziu a ligação do recetor em comparação com um GHXTEN configura, N- a C-terminal como XTEN-GH. Noutra forma de realização do anteriormente mencionada, o GHXTEN é configurado GH- XTEN. Nas formas de realização anteriores, as duas moléculas .XTEN podem ser idênticas ou podem ser de uma composição ou comprimento de sequência diferente. Exemplos não limitativos da forma de realização anterior com dois XTEN ligados a uma única GH incluem as construções AE912 -hGH-AE14 4, AE912 -hGH-AE288, AE864-ÚGH-AE144, AM923- hGH-AE144 e AM923~hGH~AE288, Sâo contempladas outras construções tais nas quais um GH do Quadro 1 e ΧΤΞΝ do Quadro 3 são substituídos pelos respetivos componentes dos exemplos anteriores e são produzidos, por exemplo, numa configuração do Quadro 5 de tal modo que a construção reduziu a depuração mediada pelo recetor em comparação com uma configuração alternativa dos respetivos componentes. Em algumas formas de realização, o método anterior para aumentar a semivida terminal proporciona GHXTEN configurado que pode resultar em um aumento da semivida terminal de pelo menos cerca de 30%, ou cerca de 50%, ou cerca de 75%, ou cerca de 100%, ou cerca de 150 % ou cerca de 200%, ou cerca de 300%, ou cerca de 400% ou mais em comparação com a semivida de um GHXTEN em uma segunda configuração onde a ligação ao recetor não é reduzida. A invenção aproveita o facto de certos ligandos em que a afinidade de ligação reduzida a um recetor, quer como resultado de uma diminuição da taxa ou de uma taxa de deslocamento aumentada, pode ser efetuada pela obstrução do terminal N-ou C (como mostrado na figura 3) e utilizando esse terminal como a ligação a outro polipéptido da composição, se uma outra molécula de um GH, um XTEN ou uma sequência espaçadora resulta na afinidade de ligação reduzida. A escolha da configuração particular da proteína de fusão GHXTEN reduz o grau de afinidade de ligação ao recetor de tal modo que é conseguida uma taxa reduzida de depuração mediada pelo recetor. Mo geral, a ativação do recetor ê acoplada a RMC de tal modo que a ligação de um polipéptido ao seu recetor sem ativação não conduz à RMC, enquanto a ativação do receptor leva ao RMC. Contudo, em alguns casos, particularmente onde o ligando tem uma taxa de redução aumentada, o ligando pode, no entanto, ser capaz de se ligar suficientemente para iniciar a sinalização celular sem desencadear a depuração mediada pelo recetor, Com o resultado líquido de que o GHXTEN permanece biodisponível.

Em tais casos, 0 GHXTEN configurado tem uma vida útil aumentada em comparação com as configurações que levam a um maior grau de RMC.

Nos casos em que é desejada uma redução na afinidade de ligaçãG ao recetor da hormona do crescimento de modo a reduzir a depuração mediada pelo recetor, mas também é desejada a retenção de pelo menos uma porção da atividade biológica, uma afinidade de ligação suficiente para obter a ativação desejada do recetor deve, no entanto, ser mantida, por exemplo, por iniciação da transdução de sinal. Assim, numa forma de realização, a. invenção proporciona um GHXTEN configurado de tal forma que a afinidade de ligação do GHXTEN para um recetor alvo está no intervalo de cerca de 0,01%-40%, ou de cerca de 0,01%-30%, ou de cerca de 0,01%-20% da afinidade de ligação em comparação para um GHXTEN correspondente numa configuração em que a afinidade de ligação não é reduzida. A afinidade de ligação do BXTEN configurado é de preferência reduzida em pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,99% em comparação com a afinidade de ligação de um GHXTEN correspondente numa configuração em que a afinidade de ligação do componente GH ao recetor alvo não é reduzida ou comparada com a GH não ligada à prGteína de fusão, determinado em condições comparáveis. Expresso de forma diferente, o componente GH do GHXTEN configurado tem uma afinidade de ligação que é tão pequena quanto cerca de 0,01%, ou pelo menos cerca de 0,1%, ou pelG menos cerca de 1%, ou pelo menos cerca de 2%, ou pelo menos cerca de 3%, ou a pelo menos cerca de 4%, ou pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 2 0%, ou pelo menos cerca de 3 0%, ou pelo menos 4 0% do componente correspondente de GH de um GHXTEN num configuração em que a afinidade de ligação do componente GH não é reduzida. Nas formas de realização anteriores, a afinidade de ligação do GHXTEN configurado para o recetor alvo é "substancialmente reduzida" em comparação com urn GH nativo correspondente ou um GHXTEN com uma configuração na qual a afinidade de ligação do componente GH correspondente não é reduzida. Consequentemente, a presente invenção proporciona composições e métodos para produzir composições com, RMC reduzido configurando o GHXTEN, exemplos do quais são proporcionados acima, de modo a poder ligar-se e ativar um número suficiente de recetores para obter uma resposta biológica desejada in vivo, mas evitar a ativação de mais recetores do que é necessário para obter essa resposta. A semivida aumentada permite doses mais elevadas e redução da frequência de dosagem em comparação com a GH não ligada ao XTEN ou comparada às configurações GHXTEN, em que o componente GH mantém uma atividade biológica ou farmacológica suficiente para resultar em uma composição com eficácia clínica mantida apesar da frequência de dosagem redu z i da.

VI). UTILIZAÇÃO DAS COMPOSIÇÕES DA PRESENTE INVENÇÃO

Noutro aspeto, a invenção proporciona um método para alcançar um efeito benéfico em uma doença, distúrbio ou condição mediada por GH. A presente invenção aborda desvantagens e/ou limitações da GH que têm uma semivida terminal relativamente curta e/ou uma janela terapêutica estreita. A maioria dos processos envolvidos no crescimento do corpo são regulados por múltiplos péptidos e hormonas e tais péptidos e hormona, bem como análogos dos mesmos, encontraram utilidade no tratamento de doenças distúrbios e condições patológicas relacionadas à hormona do crescimento. Contudo, a utilização de hormonas do crescimento comercialmente disponíveis, encontrou-se com sucesso inferior ao ideal na gestão de indivíduos afetados por tais doenças, distúrbios e condições patológicas. Em particular, a otimização da dose e a frequência de dosagem sãc· importantes para as biologias de péptidos e hormonas utilizadas no tratamento de doenças e distúrbios relacionados à hormona do crescimento. 0 facto de que a hormona do crescimento tem uma semivida curta, precisa uma dosagem frequente com a finalidade de conseguir benefício clínico, o que resulta em dificuldades na gestão de tais pacientes.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um método para alcançar um efeito benéfico em um indivíduo com uma doença, distúrbio ou condição patológica relacionada à hormona do crescimento compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de forma terapêutica ou profilática de um GHXTEN em que a referida administração resulta na melhoria de um ou mais parâmetros bioquímicos ou fisiológicos ou parâmetros clínicos associados a uma doença relacionada com a doença, distúrbio ou condição patológica relacionada à hormona do crescimento. A quantidade efetiva produz um efeito benéfico para ajudar a tratar (por exemplo, cura ou reduzir a gravidade) ou prevenir (por exemplo, reduzir a probabilidade de início ou gravidade) uma doença, distúrbio ou condição patológica relacionada à hormona do crescimento. Em alguns casos, o método para alcançar um efeito benéfico inclui administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de proteína de fusão GHXTEN para tratar um indi\fíduo com uma doença, distúrbio ou condição patológica relacionada à hormona do crescimento, incluindo, mas não limitados a, deficiência de GH congénita ou adquirida em adultos e crianças, síndrome de Turner, síndrome de Prader-Willi, insuficiência renal crónica, retardo do crescimento intrauterine, baixa estatura ídiopãtica, definhamento por SIDA, obesidade, esclerose múltipla, envelhecimento, fibromialgia, doença de Crohn, colite ulcerativa, distrofia muscular, baixa massa muscular (por exemplo, musculação), baixa densidade óssea ou qualquer outra indicação para a qual GH pode ser utilizada (mas para os quais os niveis endógenos de hormona do crescimento num indivíduo não são necessariamente deficientes).

Noutra forma de realização, a invenção fornece um método para estimular a produção de IGF-1 em indivíduos com deficiência de GH. 0 método compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de GHXTEN a um indivíduo que resulta em níveis aumentados de sangue e/ou duração em níveis aumentados de IGF-1 em sangue em comparação com um indivíduo que recebe uma GH não ligado a um XTEN e administrado a uma dose comparável. Sm alguns casos, o aumento em IGF-1 é de pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca, de 50%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 200% ou pelo menos cerca de 300%. Noutra forma de realização, a invenção fornece um método para estimular a divisão e o número de condrócitos. 0 método compreende a etapa da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de GHXTEN que resulta na produção aumentada de condrócitos em pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou a pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 200% ou pelo menos cerca de 300% em comparação com um indivíduo que recebe uma GH não ligada a um XTEN e administrada a uma dose comparável. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método que compreende a etapa da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de GHXTEN que resulta no crescimento ósseo aumentado conforme medido na placa epifisária em pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou a peio menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 200% ou pelo menos cerca de 300% em comparação com um indivíduo que recebe uma GH não ligada a um XTEN e administrada a uma dose comparável.

Como resultado dos parâmetros PK melhorados do GHXTEN, conforme descrito no presente documento, a GH é administrada utilizando intervalos mais longos entre as doses em comparação com a GH correspondente não ligada ao XTEN para prevenir, tratar, mitigar, reverter ou melhorar sintomas ou anormalidades clínicas da doença, distúrbio ou condição patológica relacionada à hormona do crescimento ou prolongar a sobrevivência do indivíduo a ser tratado.

Os métodos da invenção incluem a. administração de doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz do GHXTEN durante um período de tempo suficiente para alcançar e/ou manter o parâmetro desejado ou efeito clínico, e tais doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz estabelecem a eficácia terapêutica regime de dose para o GHXTEN; isto é, o agendamento para doses administradas consecutivamente da composição da proteína de fusão, em, que as doses são administradas em quantidades terapeuticamente eficazes para resultar em efeito benéfico sustentado em qualquer sinal ou sintoma, aspeto, parâmetro medido ou característica de um estado ou condição de doença metabólica, incluindo, mas não limitados a, àqueles descritos no presente documento. Numa forma de realização, o método compreende a administração de uma-quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma composição de proteína de fusão GHXTEN compreendendo uma GH ligada a uma(s) sequência (s) de XTEN e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável a um indivíduo que dela necessite, o que resulta numa maior melhoria em pelo menos um parâmetro, condição fisiológica ou resultado clínico mediado pelos componentes de GH) (exemplos não limitativos descritos acima) em comparação com o efeito mediado pela administração de uma composição farmacêutica, compreendendo uma GH não ligada a XTEN e administrado a uma dose comparável. Numa forma de realização, a composição farmacêutica é administrada numa dose terapeuticamente eficaz. Noutra forma de realização, a composição farmacêutica é administrada utilizando múltiplas doses consecutivas utilizando um regime de dose terapeuticamente eficaz (conforme definido no presente documento) para a duração do período de dosagem.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do GHXTEN varia de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou da porção de anticorpo para desencadear uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do GHXTEN são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz refere-se a uma quantidade de GHXTEN necessária durante o período de tempo necessário para alcançar o resultado profilático desejado.

Para os métodos inventivos, As composições GHXTEN de ação prolongada são preferidas, de modo a melhorar a conveniência do paciente, para aumentar o intervalo entre doses e para reduzir a. quantidade de medicamento necessário para alcançar um efeito sustentado. Numa forma de realização, um método de tratamento compreende a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de um GHXTEN a um indivíduo que dele necessite, o que resulta num ganho no tempo gasto dentro de uma janela terapêutica estabelecida para a proteína de fusão da composição em comparação com o(s) componente(s) GH correspondente não ligado à proteína de fusão e administrado a uma dose comparável a um indivíduo. Em alguns casos, o ganho no tempo gasto dentro da janela terapêutica é de peio menos cerca de três vezes, ou peio menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos aproximadamente cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos aprGximadamente oito vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 80 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes mais longo, em comparação com o correspondente GH correspondente não ligada à proteína de fusão e administrado numa dose comparável a um indivíduo. Os métodos ainda proporcionam que a administração de múltiplas doses consecutivas de um CHXTEN administrado utilizando um regime de dose terapeuticamente eficaz para um indivíduo com necessidade do mesmo resulta em um ganho no tempo entre os picos de Críiax consecutivos e/ ou os rebaixos de Cmin para os níveis sanguíneos da proteína de fusão em comparação com a GH correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada usando um regime de dose estabelecido para essa GH. Na forma de realização anterior, o ganho no tempo gasto entre Crr,ax consecutivos e/ou os rebaixos de Cmin é de pelo menos cerca de três vezes, ou pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos aproximadamente cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos aproximadamente oito vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 80 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes mais longo, em comparação com o correspondente GH correspondente não ligada à proteína de fusão e administrado utilizando um regime de dose estabelecido para essa GH. Nas formas de realização anteriores no presente documento descritas neste parágrafo a administração da proteína de fusão resulta numa melhoria em pelo menos um dos parâmetros (divulgados no presente documento como sendo úteis para avaliar as doenças, condições patológicas e distúrbios em questão) utilizando uma dose unitária mais baixa em moles de proteína de fusão em comparação com o componente de GH correspondente não ligado à proteína de fusão e administrado a uma dose unitária ou regime de dose comparável a um indivíduo. 0 método de tratamento compreende a administração de urn GHXTEN utilizando um regime de dose terapeuticarnente eficaz para efetuar melhorias em um ou mais parâmetros associados a doenças, distúrbios ou condições patológicas da hormona do crescimento. Em algumas formas de realização, A administração do GHXTEN a um indivíduo resulta numa melhoria em um ou msiis dos parâmetros bioquímicos, fisiológicos ou clínicos de maior magnitude do que o componente correspondente da GH não ligado ao XTEN, determinado utilizando o mesmo ensaio ou com base em um parâmetro clínico medido. Noutras formas de realização, A administração do GHXTEN a um indivíduo utilizando um regime de dose terapeuticarnente eficaz resulta em atividade em um ou mais dos parâmetros bioquímicos, fisiológicos ou clínicos que é de maior duração do que a atividade de um dos componentes de GH únicos não ligados a XTEN, determinado utilizando esse mesmo ensaio ou com base em um parâmetro clínico medido. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, a administração do GHXTEN a um indivíduo utilizando um regime terapêutico eficaz de dose resulta em uma melhoria nas concentrações máximas e 11a área sob a curva de níveis de IGF-1 no sangue de pelo menos cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 30%, ou cerca de 40%, ou cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 100% ou mais no indivíduo em comparação com uma dose comparável de GH não ligada ao XTEN administrado para um indivíduo. Noutra forma de realização do anteriormente mencionada, a administração do GHXTEN a um indivíduo usando um regime de dose eficaz em termos de terapêutica, resulta em aumento do aumento de peso no indivíduo de pelo menos cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 30% ou cerca de 40% ou cerca de 50% ou mais em comparação com um regime de dose comparável de GH não ligado ao XTEN administrado a um indivíduo. 0 GHXTEN utilizado de acordo com os métodos proporcionados no presente documento é administrado em conjunto com outros métodos de tratamento e composições farmacêuticas úteis para o tratamento de doenças, distúrbios e condições patológicas relacionadas com a hormona do crescimento, ou condições para as quais hormona do crescimento é a terapêutica adjuvante,* por exemplo, resistência à insulina e mal controlo glicêmico. Tais composições, incluem por exemplo, inibidores de DPP-IV, insulina, análogos de insulina, agonistas de PPAR gama, agonistas de PPAR de dupla ação, agonistas ou análogos de GLP-1, inibidores de PTP1B, inibidores de SGLT, secretagogos de insulina, agonistas de RXR, inibidores da glicogénio sintase quinase-3, sensibilizantes de insulina, moduladores imunes, agonistas de recetor beta-3 adrenérgico, agonistas de Pan-PPAR, inibidores de llbeta-HSD1, biguanidas, inibidores de alfa-glucosidase, meglitinidas, tiazolidinadionas, sulfonilureias e outros medicamentos para. diabetes conhecidos na técnica, ou fãrmacos anti-hipertensivos, bloqueadores dos canais de cálcio e outros produtos relacionados. Em algumas formas de realização, a administração de um GHXTEN permite a utilização de doses mais baixas da composição farmacêutica co·-administrada para atingir um efeito clínico comparável ou parâmetro medido para a doença, distúrbio ou condição patológica no indivíduo.

Noutro aspeto, a invenção proporciona um método de conceção das composições de GHXTEN com propriedades farmacológicas ou farmacêuticas desejadas. As prGteínas de fusão GHXTEN são projetadas e preparadas com vários objetivos em mente (em comparação com os componentes de GH não ligados à proteína de fusão), ncluindo a melhoria da eficácia terapêutica para o tratamentG de doenças distúrbios e condições patológicas relacionadas à hormona do crescimento, melhorando as características farmacocinéticas das proteínas de fusão em comparação com a GH, diminuindo a dose ou a frequência de dosagem necessária para atingir um efeito farmacológico, melhorando as propriedades farmacêuticas e melhorando a capacidade dos componentes de GH para permanecer dentro da janela terapêutica por um longo período de tempo.

No geral, as etapas no desenho e produção das proteínas de fusão e as composições inventivas, conforme é ilustrado nas FIGS. 4-6, incluem: (1) a seleção de GHs (por exemplo, proteínas nativas, análogos ou derivados com atividade) para tratar a. doença, distúrbio ou condição patológica particular; (2) selecionar o XTEN que conferirá a PK desejada e as características físico-químicas no GHXTEN resultante (por exemplo, a administração da composição a um indivíduo faz com que a. proteína de fusão seja mantida dentro da janela terapêutica durante um período maior em comparação com GH não ligada a XTEN); (3) estabelecer uma configuração desejada de N-para-C-terminal do GHXTEN para atingir a. eficácia desejada ou parâmetros de PK; (4) estabelecer o desenho do vetor de expressão que codifica o GHXTEN configurado; (5) transformar um hospedeiro adequado com o vetor de expressão; e (6) expressão e recuperação da proteína de fusão resultante. Para aqueles GHXTEN para os quais é desejado um ciumento na semivida (maior que 24 h) ou um período aumentado do tempo gasto dentro de uma janela terapêutica, o XTEN escolhido para incorporação geralmente tem pelo menos cerca de 500, ou cerca de 576, ou cerca de 864, ou cerca de 875, ou cerca de 912, ou cerca de 923 resíduos de aminoácidos onde um único XTEN deve ser incorporado no GHXTEN. Noutra forma de realização, o GHXTEN compreende um primeiro XTEN dos comprimentos anteriores, e um segundo XTEN de cerca de 144, gu cerca de 288, ou cerca de 576, ou cerca de 864, ou cerca de 875 ou cerca de 912 ou cerca de 923 resíduos de aminoácidos.

Noutras formas de realização, onde não é necessário um aumento da semivida, mas é desejado um aumento na propriedade farmacêutica (por exemplo, solubilidade), um GHXTEN foi concebido para incluir XTEN de comprimentos mais curtos. Em algumas formas de realização do anteriormente mencionado, o GHXTEN compreende um GH ligado a um XTEN tendo de pelo menos cerca de 24, ou cerca de 36, ou cerca de 48, ou cerca de 60, ou cerca de 72 ou cerca de 84 ou cerca de 96 resíduos de aminoãcidos, em que a solubilidade da proteína de fusão sob condições fisiológicas é pelo menos três vezes superior à GH correspondente não ligada ao XTEN ou, alternativamente, pelo menos quatro vezes, ou cinco vezes, ou seis vezes, ou sete vezes, ou oito vezes, ou nove vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 ou superior que a Gh não ligada ao XTEN. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, a GH é hormona do crescimento humano.

Noutro aspeto, a invenção fornece métodos de fazer composições GHXTEN para melhorar a facilidade de fabrico, resultar em estabilidade aumentada, solubilidade em água aumentada e/ou facilidade de formulação, em comparação com a. GH nativa. Numa forma de realização, a divulgação inclui um método para aumentar a solubilidade em água de uma GH compreendendo a etapa de ligar a GH a um ou mais XTEN de tal modo que seja conseguida uma concentração mais elevada na forma solúvel do GHXTEN resultante, sob condições fisiológicas, em comparação com a GH num estado náo fundido. Os fatores que contribuem para a propriedade de XTEN para conferir maior solubilidade em água de GHs quando incorporadas em uma proteína de fusão incluem a alta solubilidade do parceiro de fusão XTEN e o baixo grau de auto-agregação entre moléculas de XTEN em solução. Em algumas formas de realização, o método resulta numa proteína de fusão GHXTEN em que a solubilidade em água é pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30% maior, ou pelo menos cerca de 50% maior ou pelo menos cerca de 75% maior ou pelo menos cerca de 90% maior, ou pelo menos cerca de 100% maior, ou pelo menos cerca de 150% maior, ou pelo menos cerca de 2 00% maior, ou pelo menos cerca de 4 00% maior, ou pelo menos cerca de 600% maior, ou pelo menos cerca de 800% maior, ou pelo menos cerca de 1000% maior, ou pelo menos cerca de 2000% maior, ou pelo menos cerca de 4000% maior ou pelo menos cerca de 6000% maior em condições fisiológicas, em comparação com a GH não fundida.

Noutra forma de realização, a invenção inclui um método para aumentar a vida útil de uma GH compreendendo a etapa de ligar a GH com um ou mais XTEN selecionados de tal modo que a vida útil do GHXTEN resultante é prolongada em comparação com a GH num estado não fundido. Conforme é utilizado no presente documento, vida útil refere-se ao período de tempo em que a atividade funcional de um GH ou GHXTEN que está em solução ou em alguma outra formulação de armazenamento permanece estável sem perda de atividade indevida. Conforme é utilizado no presente documento, "atividade funcional" refere-se a um efeito farmacológico ou atividade biológica, tal como a capacidade de ligar um recetor ou ligando, ou uma atividade enzimática, ou para exibir uma ou mais atividades funcionais conhecidas associadas a uma GH, tal como conhecido na técnica. Uma GH que degrada ou agrega geralmente tem atividade funcional reduzida ou biodisponibi 1 idade reduzida, em comparação com uma que permanece em solução. Fatores que contribuem para a capacidade do método para prolongar a vida útil de GHs quando incorporadas em uma proteína de fusão incluem aumento da solubilidade em água, redução da auto-agregação em solução e aumento da estabilidade ao calor do parceiro de fusão XTEN. Em particular, a baixa tendência de XTEN agregar facilita os métodos de formulação de preparações farmacêuticas que contenham maiores concentrações de GHs e a estabilidade ao calor do XTEN contribui para a propriedade das proteínas de fusão GHXTEN para permanecer solúvel e funcionalmente ativas durante longos períodos. Numa forma de realização, o método resulta em proteínas de fusão GHXTEN com vida de armazenamento "prolongada" ou "estendida" que exibem maior atividade em relação a um padrão que foi submetido às mesmas condições de armazenamento e manuseio. 0 padrão pode ser a GH de comprimento total não fundida. Numa forma de realização, o método inclui a etapa de formular o GHXTEN isolado com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis que aumentam a capacidade do XTEN de reter sua conformação não estruturada e para que g GHXTEN permaneça solúvel na formulação durante um tempo que seja maior do que a correspondente GH não fundida. Numa forma de realização, o método compreende ligar uma GH a um ou mais XTEN para criar uma proteína de fusão GHXTEN, resultando numa solução que retém mais do que cerca de 100% da atividade funcional ou mais do que a cerca de 105%, 110%, 120%, 130%, 150% ou 200% da atividade funcional de um padrão quando comparados em um determinado pontG de tempo e quando submetidos âs mesmas condições de armazenamento e manuseio que o padrão, aumentando deste modo sua vida útil. A vida útil também pode ser avaliada em termos de atividade funcional restante após o armazenamento, normalizado a atividade funcional quando o armazenamento começou. As proteínas de fusão GHXTEN da invenção com vida útil prolongada ou prolongada, tal como exibida por atividade funcional prolongada ou prolongada, mantêm cerca de 50% mais de atividade funcional, ou cerca de 60%, 70%, 80% ou 90% mais da atividade funcional da GH equivalente não ligada ao XTEN quando submetida nas mesmas condições durante o mesmo período de tempo. Por exemplo, uma proteína de fusão GHXTEN da invenção que compreende hormona do crescimento humano fundida com urna ou mais sequências de XTEN mantém cerca de 80% ou mais da sua atividade original em solução durante períodos de até 2 semanas ou 4 semanas ou 6 semanas ou mais a várias condições de temperatura.. Em algumas formas de realização, o GHXTEN retém pelo menos cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, e mais preferentemente pelo menos cerca de 90% ou mais da sua atividade original em solução quando aquecida a 80 °C durante 10 min. Em outras formas de realização, o GHXTEN retém pelo menos cerca de 50%, preferentemente pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou, alternativamente, pelo menos cerca de 90% ou mais da sua atividade original em solução quando aquecida ou mantida a 37 °C durante cerca de 7 dias. Noutra forma de realização, A proteína de fusão GHXTEN retém pelo menos cerca de 80% ou mais da sua atividade funcional após exposição a uma temperatura de cerca de 30 °C a cerca de 70 °C durante um período de tempo de cerca de uma hora a cerca de 18 horas. Nas formas de realização anteriores acima no presente documento descritas neste parágrafo, a atividade retida do GHXTEN é pelo menos cerca de duas vezes, ou pelo menos cerca de três vezes, ou pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes maior num determinado ponto de tempo do que a GH correspondente não ligada à proteína de fusãG.

VII). AS SEQUÊNCIAS DE ÂCIDDOS NUCLEICOS DA DIVULGAÇÃO A presente invenção proporciona ácidos po.linucle.icos isolados que codificam proteínas de fusão quiméricas GHXTEN e sequências complementares a moléculas de ácido polinucleico codificando polipéptidos GHXTEN quiméricos, incluindo variantes homologas do mesmo. Noutro aspeto, A presente invenção proporciona ácidos polinucleicos isolados que codificam proteínas de fusão quiméricas GHXTEN e sequências complementares a moléculas de ácido polinucleico codificando proteínas de fusão quiméricas GHXTEN, incluindo variantes homólogas do mesmo. Em geral, e conforme é ilustrado nas FIGS. 4-6, os métodos de produção de uma sequência de polinucleótidos codificando para uma. proteína de fusão GHXTEN e expressando o produto génico resultante incluem montar nucleótidos codificando GH e XTEN, ligação dos componentes em grelha, incorporando o gene de codificação num vetor de expressão apropriado para uma célula hospedeira, transformar a célula hospedeira adequada com o vetor de expressão e cultivar a célula hospedeira sob condições para fazer com que a proteína de fusão seja expressa na célula hospedeira transformada, deste modo produzindo o polipéptido GHXTEN biologicamente ativo, que é recuperado como uma prGteína de fusão isolada por métodos padrão de purificação de proteínas conhecidos na técnica. Técnicas recornbinantes padrão na biologia molecular são utilizadas para fabricar os polinucleótidos e vetores de expressão da presente divulgação.

De acordo com a invenção, sequências de ácido nucleico que codificam GHXTEN (ou seu complemento) são utilizadas para gerar moléculas de ADN recombinante que dirigem a expressão de proteínas de fusão GHXTEN em células hospedeiras adequadas. Várias estratégias de clonagem são adequadas para a realização deste método, muitos dos quais são usados para gerar uma construção que compreende um gene que codifica uma proteína de fusão da composição GHXTEN da presente invenção ou o seu complemento. Em algumas formas de realização, a estratégia de clonagem é utilizada para criar um geme que codifica uma GHXTEN monomérica que compreende pelG menos um primeiro GH e pelo menos um primeiro polipéptido XTEN ou seu complemento. Numa forma de realização do anteriormente mencionado, o gene compreende uma sequência que codifica uma hGH ou variante de sequência. Noutras formas de realização, a estratégia de clonagem é utilizada para criar um gene que codifica um GHXTEN monomérico que compreende nucleótidos que codificam pelo menos uma primeira molécula de GH ou o seu complemento e um primeiro e pelo menos um segundo XTEN ou o seu complemento que é utilizado para transformar uma célula hospedeira para expressão da proteína de fusão da composição de GHXTEN. Nas formas de realizaçâG anteriores acima no presente documento descritas neste parágrafo, o genes podem adicionalmente compreender nucleótidos codificando sequências espaçadoras que também codificam sequência(s) de clivagem.

Ao desenhar uma sequência de XTEN desejável, foi descoberto que a natureza não repetitiva do XTEN das composições inventivas é alcançada apesar da utilização de uma abordagem molecular de "blocos de construção" na criação das sequências codificadoras de XTEN. Isto foi conseguido pela. utilização de uma biblioteca de polínucleótídos que codificam motivos de sequência peptídica, descritas acima, que são então ligados e/ou multimerizados para criar os genes que codificam as sequências XTEN (veja-se as Figuras 4 e 5 e Exemplos). Assim, embora os XTEN(s) da proteína de fusão expressa possa consistir em múltiplas unidades de tão pouco quanto quatro motivos de sequência diferentes, dado que os próprios motivos consistem em sequências de aminoãcidos não repetitivas, a sequência global de XTEN é tornada não repetitiva. Consequentemente, numa forma de realização, os polinucleótidos codificadores de XTEN compreendem múltiplos polinucleôtidos que codificam sequências não repetitivas, ou motivos, ligados operativamente na estrutura e nos quais as sequências de aminoãcidos de XTEN expressas resultantes são não repetitivas.

Numa abordagem, ê primeiro preparada uma construção contendo a sequência de ADN correspondente à proteína de fusão GHXTEN. 0 ADN que codifica a GH das composições pode ser obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada utilizando métodos padrão a partir de tecido ou células isoladas que acredita-se que possui ARNm de GH e expressando-o a um nível detetável. As bibliotecas são rastreadas com sondas contendo, por exemplo, cerca de 20 a 100 bases concebidas para identificar o gene de GH de interesse por hibridação utilizando técnicas convencionais de biologia molecular, os melhores candidatos para sondas são aqueles que representam sequências que são altamente homólogas psira a hormona do crescimento humano e devem ser de comprimento suficiente e suficientemente inequívocos para que os falsos positivos sejam minimizados, mas podem ser degenerados em uma ou mais posições. Se necessário, a sequência codificante pode ser obtida utilizando procedimentos de extensão de iniciadores padrão conforme descrito em Sambrook, et al, , supra, para detetar precursores e intermediários de processamento de ARNm que podem não ter sido submetidos a transcrição reversa em ADNc. Pode-se então utilizar a metodologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar a sequência codificante de ADN ou ARN alvo para obter material suficiente para a preparação das construções GHXTEN contendo o(s) gene(s) de GH. Os ensaios podem então ser conduzidos para confirmar que a hibridação de genes de comprimento total são o(s) gene(s) de GH desejado(s). Por estes métodos convencionais, pode ser obtido ADN convenientemente a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tais fontes. 0(s) gene(s) codificando GH são também ser obtidos a partir de uma biblioteca genómica ou criados através de procedimentos sintéticos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, síntese automatizada de ácido nucleico utilizando, por exemplo, um dos métodos descritos em Engels et al. {Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 1989)), utilizando sequências de ADN Gbtidas a partir de bases de dados publicamente disponíveis, patentes ou referências bibliográficas. Tais procedimentos são bem, conhecidos na técnica e bem descritos na literatura científica e de patentes. Por exemplo, podem ser obtidas sequências a partir de Números de Registo de Chemical Abstracts Services (CAS) {publicados pela American Chemical Society) e/ou Números de Acesso GenBank (por exemplo, identificadores, Locus ID, NF_XXXXX e XP_XXXXX)) Model Protein disponíveis através da página v/eb do National Center for Biotechnology Information (NCBI), disponível na world wide web em nc--bi.nlm.nih.gov que correspondem a entradas na base de dados do CAS Registry ou GenBank que contêm uma sequência de aminoácidos da proteína de interesse ou um fragmento ou variante da proteína. Para tais identificadores de sequência proporcionados no presente documento, são listadas as páginas de resumo associadas com cada um destes Números de Acesso CAS Registry e GenBank e GenSeq bem como as publicações literárias citadas (por exemplo, número de ID de PubMed (PMID)) são cada um incorporados por referência na sua totalidade, particularmente com respeito às sequências de aminoácidos descritas aí. Numa forma de realização, o gene que codifica GH codifica uma proteína a partir de qualquer um do Quadros 1, ou fragmento gu variante do mesmo.

Um gene ou polinucleõtido que codifica a porção GH da proteína GHXTEN em questão, no caso de uma proteína de fusão expressa que compreende uma única GH pode então ser clonada numa construção, que é um plasmídeo ou outro vetor sob o controlo de sequências de transcrição e tradução adequadas para expressão proteica de alto nível num sistema biológico. Numa etapa posterior, um segundo gene ou polinucleótido que codifica o XTEN é geneticamente fundido aos nucleótidos que codificam o terminal N ou C do gene GH através de clonagem do mesmo na construção adjacente e na estrutura com o(s) gene(s) que codificam a GH. Esta segunda etapa ocorre através de uma etapa de ligação ou multimerização. Nas formas de realização anteriores acima no presente documento descritas neste parágrafo, deve ser entendidG que todas as construções gênicas que sâo criadas podem alternativamente ser o complemento dos respetivos genes que codificam as respetivas proteínas de fusão, 0 gene que codifica o XTEN pode ser preparado numa ou em mais etapas, ou totalmente sinteticamente ou através de síntese combinada com processos enzimáticos, tais como clonagem mediada por enzimas de restrição, PCR e extensão por superposição, incluindo métodos descritos mais completamente nos Exemplos. Os métodos divulgadas no presente documento podem ser utilizados, por exemplo, para ligar sequências curtas de polinucleótidos que codificam XTEN em genes XTEN mais longos de um comprimento e sequência desejados. Numa forma de realização, o método liga dois ou mais oligonucleótidos otimizados por codões que codificam motivos de XTEN ou de segmento de cerca de 9 a 14 aminoãcidos, ou de cerca de 12 a 20 aminoãcidos, ou de cerca de 18 a 36 aminoãcidos, ou de cerca de 48 a cerca de 144 aminoãcidos, ou de cerca de 144 a cerca de 288 ou mais, ou qualquer combinação dos intervalos anteriores de motivos ou comprimentos de segmento.

Alternativamente, o método descrito é utilizado para multimerizar sequências de codificação XTEN em sequências mais longas de um comprimento desejado; por exemplo, um gene que codifica 3 6 aminoãcidos de XTEN pode ser dimerizado num gene que codifica 72 aminoãcidos, depois 144, depois 288, etc. Mesmo com multimerização, Os polipéptidos XTEN podem ser construídos de tal forma, que o gene que codifica XTEN tem baixa ou praticamente nenhuma repetitividade através da conceção dos codões selecionados para os motivos da unidade mais curta usada, o que pode reduzir a recombinação e aumentar a estabilidade do gene codificador no hospedeiro transformado. Genes que codificam XTEN com sequências não repetitivas são montados a partir de oligonucleótidos utilizando técnicas padrão de síntese génica. 0 desenho do gene pode ser realizado utilizando algoritmos que otimizam a utilização de codões e a composição dos aminoácidos. Num método, uma biblioteca de construções de polinucleótidos que codificam XTEN relativamente curta é criada e posteriormente montada, conforme é ilustrado nas FIG. 4 e 5. Esta pode ser uma biblioteca de codões pura de tal modo que cada membro da biblioteca tenha a mesma sequência de aminoácidos mas sejam possíveis muitas sequências de codificação. Tais bibliotecas podem ser montadas a partir de oligonucleótidos parcialmente aleatorizados e utilizados para gerar grandes bibliotecas de segmentos de XTEN compreendendo os motivos da sequência. 0 esquema de aleatorízação pode ser otimizado para controlar eleições de aminoácidos para cada posição bem como utilização de codões. Métodos de exemplo para conseguir o anterior são divulgados nos Exemplos. Bibliotecas de polinucleótidos

Noutro aspeto, a divulgação proporciona bibliotecas de polinucleótidos que codificam sequências de XTEN que são utilizadas para montar genes que codificam XTEN de um comprimento e sequência desejados.

Em determinadas formas de realização, as construções da biblioteca de codificação de XTEN compreendem polinucleótidos que codificam segmentos de polipéptidos de um comprimento fixo. Como uma etapa inicial, pode ser montada uma biblioteca de oligonucleótidos que codificam motivos de 9-14 resíduos de aminoácidos. Numa forma de realização preferida, são montadas bibliotecas de oligonucleótidos que codificam motivos de 12 aminoácidos.

Os segmentos da sequência codificadora de XTEN podem ser dimerizados ou multimerizados em sequências codificadoras tnais longas. Pode ser realizada dimerização ou multimerizaçãa através de ligação, extensão por superposição, montagem por FCR ou técnicas de clonagem semelhantes conhecidas na técnica. Este processo pode ser repetido várias vezes até as sequências codificantes de XTEN resultantes terem alcançado a organização de sequência e comprimento desejado, proporcionando os genes codificadores de XTEN. Conforme será apreciado, uma biblioteca de polinucleótidos que codifica, por exemplo, 12 motivos de amínoãcidos podem ser dimerizados e/ou ligados numa biblioteca de polinucleótidos que codificam 36 aminoãcidos. Bibliotecas que codificam motivos de diferentes comprimentos; por exemplo, 9-14 motivos de aminoãcidos que conduzem a bibliotecas que codificam 27 a 42 aminoãcidos são contempladas. Por sua vez, a biblioteca de polinucleótidos que codificam 27 a 42 aminoãcidos e, de preferência, 36 aminoãcidos (conforme descrito nos Exemplos) pode ser dimerizada em série numa biblioteca contendo sucessivamente longos comprimentos de polinucleótidos que codificam sequências XTEN de um comprimento desejado para incorporação no gene codificando a proteína de fusão GHXTEN, conforme divulgado no presente documento. Em algumas formas de realização, são montadas bibliotecas de polinucleótidos que codificam aminoãcidos que são limitados a famílias de XTEN de sequência específica; por exemplo, sequências AD, ΑΞ, AF, AG, AM ou AQ do Quadro 2. Noutras formas de realização, as bibliotecas compreendem sequências que codificam duas ou mais das sequências da família de motivos do Quadro 2. Os nomes e sequências de sequências de polinucleótidos representativas não limitant.es de bibliotecas que codificam 36 meros são apresentados nos Quadros 8-11 e os métodos utilizados para criã-las são descritos mais detalhadamente nos Exemplos. Noutras formas de realização, as bibliotecas que codificam XTEN são construídas a partir de segmentos de codões polinucleotídicos ligados em uma sequência aleatória que codificam aminoãcidos em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou a pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% dos codões são selecionados a partir do grupo que consiste ern codões para os aminoãcidos glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (Ξ) e prolina (P) . A.s bibliotecas podem ser utilizadas, por sua vez, para dimerização em série ou ligaçãi para alcançar bibliotecas de sequências de polinucleõtidos que codificam sequências de XTEN, por exemplo, de 48, 72, 144, 288, 576, 864, 875, 912, 923, 1318 aminoãcidos, ou até um comprimento total de cerca de 3000 aminoãcidos, bem como comprimentos intermediários, em que o XTEN codificado pode ter uma ou mais das propriedades divulgadas no presente documento, quando expresso como um componente de uma proteína de fusão GHXTEN. Em alguns casos, as sequências da biblioteca, de polinucleótidos podem também incluir bases adicionais utilizadas como "ilhas de sequenciamento", descritas mais detalhadamente abaixo.

A FIG. 5 é um diagrama de fluxo esquemático de etapas não limitantes representativas na montagem de uma construção de polinucleótidos de XTEN e uma construção de polinucleótido de BPXTKN nas formas de realização da divulgação. Os oligonucleotides individuais 501 são anelados em motivos de sequência 502, tais como um motivo de 12 aminoãcidos ("12•mero") , que é subsequentemente ligado com um oligo contendo Bbsl e os locais de restrição Kpnl 503. Motivos de sequências adicionais a partir de uma biblioteca são anelados para o 12-mero até que o comprimento desejado do gene XTEN 504 seja alcançado. 0 gene XTEN é clonado num vetor stuffer. 0 vetor opcionalmente codifica uma sequência Flag 506 seguida por uma sequência stuffer que está flanqueada pelos sítios Bsal, Bbsl e Kpnl 507 e, neste caso, um único gene de GH (codificando hGH neste exemplo) 508, resultando no gene codificando um GHXTEN compreendendo uma única GH 500. É proporcionada uma lista não exaustiva dos nomes de XTEN para polinucleótidos que codificara XTEN e sequências precursoras no Quadro 7„

Quadro 7; Sequências de ADN de XTEN e sequências precursoras_

A biblioteca de genes codificadores de XTEN pode ser clonada num ou mais vetores de expressão conhecidos na técnica. Para facilitar a identificação de membros da biblioteca com boa expressão, a biblioteca pode ser construída como fusão a uma proteína repórter. Exemplos não limitantes de genes repórter adequados são proteína verde fluorescente, luciferase, fosfatase alcalina e beta-galactosidase. Através de rastreio, podem ser identificadas sequências curtas de XTEN que podem ser expressas em concentração elevada no organismo hospedeiro de eleição. Subsequentemente, pode ser gerada uma bibliGteca de dímeros de XTEN aleatórios e o rastreio repetido para nível elevado de expressão. Subsequentemente, as construções resultantes podem ser rastreadas para uma série de propriedades tais como nível de expressão, estabilidade a protease e ligação a anti-sorc·.

Um aspeto é proporcionar sequências polinucleotídicas que codificam os componentes da proteína de fusão em que a criação da sequência foi submetida à otimização de codões. E de particular interesse a otimização de codões com o objetivo de melhorar a expressão das composições de polipéptido e de melhorar a estabilidade genética do gene codificante nos hospedeiros de produção. Por exemplo, a otimização de codões é de particular importância para as sequências de XTEN que são ricas em glicina ou que têm sequências de aminoácidos muito repetitivas. A otimização de codões é realizada utilizando programas de computador (Gustafsson, C., et al. (2004) Trends Biotechnol, 22: 346-53) , alguns dos quais minimizam a pausa rihossõmica (Coda Genomics Inc.). Numa forma de realização, pode ser realizada otimização de codões construindG bibliotecas de codões onde todos os membros da biblioteca codificam a mesma sequência de aminoácidos mas onde a utilização dos codões é variada. Tais bibliotecas podem ser rastreadas para membros com expressão elevada e geneticamente estáveis que são particularmente adequados para a produção a grande escala de produtos contendo XTEN. Ao desenhar sequências de XTEN podem ser consideradas uma série de propriedades. Pode ser minimizada a repetitividade nas sequências codificadoras de ADN. Além disso, pode ser evitada ou minimizada a utilização de codões que são raramente utilizadGS pelo hospedeiro de produção (por exemplo, os codões de arginina AGG e AGA e um codão de leucina em E. coli) . No caso de E. coli, dois codões de glicina, GGA e GGG, são raramente utilizados em proteínas com expressão elevada. Consequentemente a otimização de CGdões do gene que codifica sequências de XTEN pode ser muito desejável. As sequências de ADN que têm um nível elevado de glicina tendem a ter um teor de GC elevado que pode levar a instabilidade ou níveis baixos de expressão. Consequentemente, quando possível, é preferível escolher codões de tal modo que o teor de GC da sequência codificadora de XTEN seja adequado para o organismo de produção que será utilizado para fabricar o XTEN.

Opcionalmente, 0 gene que codifica XTEN de comprimento completo compreende uma. ou. mais ilhas de sequenciação. Neste contexto, as ilhas de sequenciação são sequências de estiramento curto que são distintas das sequências de construção da biblioteca XTEN e que incluem um local de restrição não presente ou esperado estar presente no gene que codifica XTEN de comprimento completo. Numa forma de realização, uma ilha de sequenciamento é a sequência 5'-AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGT-3'. Noutra forma de realização, uma ilha de sequenciamento é a sequência 5' - AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGT-- 3 ' .

Como alternativa, pode-se construir bibliotecas de codões onde todos os membros da biblioteca codificam a mesma sequência de aminoácidos, mas onde a utilização de codões para os respetivos aminoácidos na sequência é variado. Tais bibliotecas podem ser rastreadas para membros com expressão elevada e geneticamente estáveis que são particularmente adequados para a produção a grande escala de produtos contendo XTEN.

Opcionalmente, pode-se sequenciar clones na biblioteca para eliminar isolados que contenham sequências

indesejáveis. A biblioteca inicial de sequências XTEN curtas permite algumas variações na sequência de aminoãcidos. Por exemplo, pode-se aleatorizar alguns codões, de modo que uma série de aminoãcidos hidrofílicos possam ocorrer em uma posição particular. Durante o processo de multimerização iterativa, pGde-se visualizar os membros da biblioteca resultantes para outras características, como solubilidade ou resistência à protease, além de uma tela para expressão de alto nível.

Uma vez que o gene que codifica o XTEN do comprimento e propriedades desejados é selecionado, é geneticamente fundido aos nucleótidos que codificam o terminal N e/ou C do(s) gene(s) de GH através de clonagem do mesmo na construção adjacente e na estrutura com o gene que codificam a GH ou, opcionalmente, adjacente à sequência espaçadora. A divulgação fornece várias permutações do exposto, dependendo do GHXTEN a ser codificado. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína de fusão GHXTEN compreendendo um GH e dois XTEN, tal como concretizado pela fórmula VI, conforme representando acima, o gene teria polinucleôtidos que codificavam GH, codificando dois XTEN, que podem ser idênticos ou diferentes na composição e comprimento da seqúência. Numa forma de realização não limitativa do que precede, os polinucleôtidos de GH codificariam a hormona do crescimento humano e os polinucleôtidos que codificam o NTEN-XTEN codificariam AE912 e os polinucleôtidos que codificam o terminal C XTEN codificariam ΆΕ144. A etapa de clonagem dos genes GH na construção XTEN pode ocorrer através de uma etapa de ligação ou multimerização. Conforme mostrado na Fig. 2, as construções que codificam proteínas de fusão GHXTEN podem ser concebidas em diferentes configurações dos componentes XTEN 202, GH 203, e sequências espaçadoras 204. Numa forma de realização, conforme ilustrado na FIG. 2A, a construção compreende sequências poiinucleotídicas complementares ou as que codificam um polipéptido monomérico de componentes

na ordem seguinte (5' a 3') GH 203 e XTEN 202, ou a ordem inversa. Noutra forma de realização, conforme ilustrado na FIG. 2B, a construção compreende sequências polinucleotídicas complementares ou aquelas que codificam um polipéptido monomérico de componentes na Grdem seguinte (5' a 3') GH 203, sequência espaçadora 204, e XTEN 202, ou a ordem inversa.. Noutra forma de realização, conforme ilustrado na FIG. 2C, a construção 201 codifica um GHXTEN monomérico compreendendo sequências polinucleotídicas complementares ou aquelas que codificam componentes na ordem seguinte (5' a 3!): duas moléculas de GH 203 e XTEN

202, ou a ordem inversa. Noutra forma de realizaçâG, conforme ilustradG na FIG. 2D, a construção compreende sequências polinucleotídicas complementares ou aquelas que codificam um polipéptido monomérico de componentes na ordem seguinte (5' a 3’): duas moléculas de GH 203, sequência espaçadora 204, e XTEN 2 02, ou a ordem inversa. Noutra forma de realização, conforme ilustrado na FIG. 2E, a construção compreende sequências polinucleotídicas complementares ou aquelas que codificam um polipéptido monomérico de componentes na ordem seguinte (5' a 3'}: GH 203, sequência espaçadora 204, uma segunda molécula de GH 203, e XTEN 202, ou a ordem inversa. Noutra forma de realização, conforme ilustrado na FIG. 2F, a construção compreende sequências polinucleotídicas complementares ou aquelas que codificam um polipéptido monomérico de componentes na ordem seguinte (5' a 3'): GH 203, XTEN 202, GH 203, e uma segunda XTEN 202, ou a sequência inversa. Os polinucleótidos espaçadores podem opcionalmente compreender sequências que codificam sequências de clivagem. Como será aparente para aqueles peritos na. especialidade, outras permutações do exposto são possíveis. A divulgação abrange também pGlinucleótidos compreendendo variantes de polinucleótidos que codificam XTEN que têm uma elevada percentagem de identidade de sequência para (a) uma sequência polinucleotídica do Quadro 7, ou (b) sequências que são complementares aos polinucleótidos de (a) . Um, polinucleótido com uma elevada percentagem de identidade de sequência é aquele que possuí pelo menos cerca de uma identidade de sequência de ácido nucleico a 80%, alternativamente pelo menos 81%, alternativamente pelo menos 82%, alternativamente pelo menos 83%, alternativamente pelo menos 84%, alternativamente pelo menos 85%, alternativamente pelo menos 86%, alternativamente pelo menos 87%, alternativamente pelo menos 88%, alternativamente pelo menos 89%, alternativamente pelo menos 90%, alternativamente pelo menos 91%, alternativamente pelo menos 92%, alternativamente pelo menos 93%, alternativamente pelo menos 94%, alternativamente pelo menos 95%, alternativamente pelo menos 96%, alternativamente pelo menos 97%, alternativamente pelo menos cerca de 98% e, alternativamente, pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de ácido nucleico para (a) ou (b) do anterior, ou que pode hibridar com o polinucleótido alvo ou o seu complement© em condições rigorosas.

Homologia, a semelhança de sequência ou a identidade de sequência de sequências de nucleótidos ou de aminoãcidos também podem ser determinadas convencionalmente utilizando software ou programas de computador conhecidos, como os programas de comparação em pares BestF.it ou Gap (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). 0 BestFit usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Advances in Applied Mathematics. 1981. 2: 482-489}, para encontrar o melhor segmento de identidade ou similaridade entre duas sequências. GAP realiza alinhamentos globais: Toda uma sequência com toda a outra sequência semelhante usando o método de Needleman e Wunsch, (Journal of Molecular

Biology. 1970. 48:443-453). Ao usar um programa de alinhamento de sequência, como o BestFit, para determinar o grau de homologia, similaridade ou identidade de sequência, o ajuste pré--de£inido pode ser utilizado ou uma matriz de pontuação adequada pode ser selecionada para otimizar as pontuações de identidade, similaridade ou homologia.

As sequências de ácido nucleico que são "complementares" são aquelas que são capazes de emparelnamento de base de acordo com as regras padrão de complementaridade Watson-Crick. Conforme é utilizado no presente documento, o termo "sequências complementares" significa sequências de ácido nucleico que são substancialmente complementares, como pode ser avaliado pela mesma comparação de nucleõtidos apresentada acima, ou como definido como capaz de se hibridar com os polínucleótídos que codificam as sequências de GHXTEN em condições restringentes, como aquelas descritas no presente documento.

Os polinucleõtidos resultantes que codificam as proteínas de fusão quiméricas GHXTEN podem então ser individualmente clonados num vetor de expressão. A sequência de ácido nucleico é inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. No geral, 0 ADN é inserido num local(is) de endonuclease de restrição apropriado utilizando técnicas conhecidas na técnica. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um prGmotGr e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vetores adequados contendo um ou mais desses componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas pelos especialistas. Tais técnicas são bem conhecidas na técnica e bem descrítGS na literatura científica e de patentes. Vários vetores estão publicarnente disponíveis. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A descrição proporciona a utilização de vetores de plasmídeo contendo sequências de replicação e controle que são compatíveis e reconhecidos pela célula hospedeira e estão operativamente ligados ao gene GHXTEN para a expressão controlada das proteínas de fusão GHXTEN. 0 vetor transporta normalmente um sítio de replicação, bem como sequências que codificam proteínas que são capazes de proporcionar a seleção fenotípica nas células transformadas. Tais sequências de vetor são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, levedura e vírus. Gs vetores de expressão úteis que podem ser utilizados incluem, por exemplo, segmentos de sequências de ADN cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas. "Vetor de expressão" refere-se a uma construção de ADN contendo uma sequência de ADN que está operacionalmente ligada a uma sequência de controlo adequada capaz de efetuar a expressão do ADN que codifica a proteína de fusão num hospedeiro adequado. Tais sequências de controlo incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar tal transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação ribossomal de ARNm e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução. Outros vetores adequados incluem, rnsis não estão limitados a, derivados de SV40 e pcDNA e plasmídeos bacteríanos conhecidos tais como col EI, pCRl, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX conforme descrito por Smith, et al. , Gene 57:31-40 (1988), pMB9 e derivados dos mesmos, plasmídeos tais como RP4, ADNs de fago tais como os numerosos derivados do fago I tal como NM98 9, em como outros ADN de fago tal como M13 e ADN de fago de cadeia simples filamentoso; plasmídeos de levedura tais como o plasmídeo de 2 micra ou derivados do plasmídeo 2m, bem como vetores transportadores de levedura centoméricos e integrativos; vetores úteis em células eucarióticas tais como 'vetores úteis em células de insetos ou mamíferos? vetores derivados de combinações de plasmídeos e ADN de fago, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar ADN de fago ou. as sequências de controlo de expressão? e semelhantes. Os requisitos são que os vetores sâo replicáveis e viáveis na célula hospedeira de escolha. Podem ser utilizados vetores de número de cópias baixas ou altas como desejado.

Os promotores adequados para utilização em vetores de expressão com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas de promotor de β-lactamase e lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al. , Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema de promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)? Documento ΞΡ 36.776] e promotores híbridos, como o promotor tac [deBoer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)], todos estarão operativamente ligados ao ADN que codifica os polipéptidos GHXTEN. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também podem conter uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.), operativamente ligados ao ADN que codifica os polipéptidos GHXTEN. A invenção ontempla a utilização de outros sistemas de expressão incluindo, por exemplo, um sistema de expressão de baculovírus com ambos os 'vetores de transferência de não fusão, como, mas não limitado a pVL941 Summers, et al., Virology 84:390-402 (1978)), pVL1393 (Invitrogen), pVL1392 (Summers, et al., Virology 84:390- 402 (1978) e Invitrogen) e pBlueBacIII (Invitrogen) , e vetores de transferência, de fusão tais como, mas não limitado a, pAc7 00 (Summers, et al. , Virology 84:390-402 (1978)), pAc701 e pAc70-2 (o m esmo que pAc700, com diferenciar grelhas de leitura), pAc 3 6 0 Invitrogen) e pBlueBacHisA, B, C (,· Invitrogen) podem ser utilizados.

Os vetores de expressão de mamíferos podem compreender uma origem de replicação, um promotor e potenciador adequado e também quaisquer locais de ligação de ribossoma necessários, sítio de poliadenilaçâo, sítios de acetor e dador de união, sequências de terminação da transcrição e sequências não transcritas de £lanqueamento de 5'. As sequências de ADN derivadas da união de SV40 e os sítios de poliadenilaçâo podem ser usadaspara fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos. Os vetores de expressão de mamíferos contemplados para utilização na invenção incluem vetores com promotores indutíveis, tais como os promotores de di-hidrofolato redutase, qualquer vector de expressão com uma cassete de expressão DHFR ou um vetor de co-amplificação DHFR/metotrexato tal como pED (Randal J. Kaufman, 1991, Randal J. Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16,12 (1991)). Alternativamente, um vetor de co-amplificação de glutamina sintetase/metionina suit'oximina, tal coma pEE14 (Celltech) . Um vetor que direciona expressão episomal sob o controlo do vírus Epstein Barr (EBV) ou antígeno nuclear (ΞΒΝΑ) pode ser usado como pREP4 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMEP4 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen) e pEBVHis (Invitrogen).

Os vetores de expressão de mamíferos selecionáveis para utilização na invenção incluem, mas não estão limitados a, pRc/CMV (Invitrogen), pRc/RSV (Invitrogen) e semelhantes. Vetores de expressão de mamíferos do vírus Vaccinia (veja-se, por exemplo, Randall J. Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology 16.12 (Frederick M. Ausubel, et al., eds. Wiley 1991) que podem ser utilizados na presente invenção incluem, , mas não estão limitados a, pSCIl, pMJ601 pTKgptFIS e semelhantes.

Sistemas de expressão de levedura que também podem ser utilizados na presente invenção incluem,, mas não estão limitados a, o vetor de não fusão pYES2 (Invitrogen), a fusão pYESHisA, B, C (Invitrogen), vetores pRS e semelhantes.

Além disso, o vetor de expressão que contém a molécula de polinucleótido que codifica a proteína de fusão quimérica GHXTEN pode incluir marcadores de selecção de fármacos. Tais marcadores ajudam na clonagem e na seleção ou identificação de vetores contendo moléculas de DNA quiméricas· Por exemplo, genes que conferem resistência à neomicina, puromicina, higromicina, inibidor de dihidrofolato redutase (DHFR), guanina fosforibosil transferase (GPT), zeocina e histidinol são marcadores úteis selecionáveis. Alternativamente, podem ser utilizadas enzimas tais como a timidina quinase do vírus do herpes simples (tk) ou a cloranfenicol de acetiltransferase (CAT). Os marcadores imunológicos também podem ser empregues. Qualquer marcador selecionável conhecido pode ser utilizado desde que seja capaz de ser expresso simultaneamente com o ácido nucleico que codifica um produto de gene. Exemplos adicionais de marcadores selecionáveis são bem conhecidos para um perito na especialidade e incluem repórteres como proteína fluorescente verde potenciada (EGFP), beta-ga.lactosida.se (β-gal) ou cloranfenicol acetiltransf erase (CAT).

Numa forma de realização, o polinucleótido que codifica uma composição de proteína de fusão GHXTEN é fundido C-terminal a uma sequência de sinal N-terminal apropriada para o sistema hospedeiro de expressão. As sequências de sinal são tipicamente removidas proteoliticamente da proteína durante o processo de translocação e secreção, gerando um N-terminal definido. Uma ampla variedade de sequências de sinais foram descritas para a maioria dos sistemas de expressão, incluindo sistemas de bactérias, leveduras, insetos e mamíferos. Uma lista, não limitativa de exemplos preferidos para cada sistema de expressão segue no presente documento. Sequências de sinal preferidas são OmpA, PhoA e DsbA para expressão em E. coli. Os péptidos de sinal preferidos para expressão de levedura são ppL-alfa, DEX4, péptido sinal de invertase, péptido de sinal de fosfatase ácida, CPY ou INU1. Para a expressão de células de insetos, as sequências de sinal preferidas são precursor de hormona adipocinética sexta, CPI, CP2, CP3, CP4, TPA, PAP ou gp67. Para expressão em mamífero as sequências de sinal preferidas são IL2L, SV40, IgG kappa e IgG lambda.

Noutra forma de realização, uma sequência líder, potencialmente compreendendo um domínio de proteína independente bem expresso, pGde ser fundido com o N-terminal da sequência GHXTEN, separado por um sítio de clivagem de protease. Embora qualquer sequência peptídica líder que não iniba a clivagem no local proteolítico concebido possa ser utilizada, as sequências em formas de realização preferidas compreenderão sequências estáveis bem expressas de tal modo que a expressão e a dobragem da composição global não são significativamente prejudicadas e, de preferência, a expressão, solubilidade e/ou eficiência de dobragem são significativamente melhoradas. Uma ampla variedade de sequências líderes adequadas foram descritas na literatura. Uma lista não limitativa de sequências adequadas inclui proteína de ligação a maltose, domínio de ligação a celulose, glutationa S-transferase, etiqueta 6xHis, etiqueta FLAG, etiqueta de hemaglutinina e proteína fluorescente verde. A sequência líder também pode ser melhorada pela otimização de codões, especialmente na segunda posição do codão seguindo o codão de início ATG, por métodos bem descritos na literatura e acima descritos. Vários métodos enzimáticos in vitro para clivagem de proteínas em locais específicos são conhecidos. Tais métodos incluem o uso de enterocinase (DDDK), Fator Xa (IDGR), trombina (LVPRGS), PreScission™ (LEVLFQGP), TSV protease (EQLYFQG), 3C protease (ETLFQGP), Sortase A (LPETG) , Cranzima B (D/X, N/X, M/N ou ,3/X) , ínteínas, SUMO, DAPase (TAGZyme™), aminopeptidase de Aeromonas, Aminopeptidase M e carboxipeptidases A e B. São descritos métodos adicionais em Arnau, et al., Protein Expression and Purification 48: 1-13 (2006).

Em outros casos, construções e métodos para produzir construções compreendendo uma sequência polinucleotídica otimizada para expressão que cGdifica pelo menos cerca de 20 a cerca de 60 aminoãcidos com características XTEN que podem ser incluídas no N-terminal de uma sequência codificadora de portador XTEN (por outras palavras, os polinucleótidos que codificam os aminoãcidos otimizados codificados 20-60 estão ligados em quadro para polinucleótidos que codificam um componente XTEN que é N-terminal para GH) são divulgados, para promover a iniciação da tradução para permitir a expressão de fusões de XTEN no terminal N de proteínas sem a presença de um domínio auxiliar. Numa vantagem do que precede, a sequência não requer clivagem subsequente, reduzindo assim o número de etapas para preparar composições contendo XTEN. Conforme descrito em mais detalhe nos Exemplos, a sequência N-terminal otimizada possui atributos de uma proteína, não estruturada, mas podem incluir bases nucleotídicas que codificam aminoãcidos selecionados por sua capacidade de promover a iniciação da tradução e expressão reforçada. Numa forma, de realização do anteriormente mencionado, o polínucleótido otimizado codifica uma sequência XTEN com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com AE912. Noutra forma de realização do anteriormente mencionada, o polínucleótido otimizado codifica uma sequência XTEN com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com AM923. Noutra forma de realização do anteriormente mencionada, o polínucleótido otimizado codifica uma sequência XTEN com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com AE48. Noutra forma de realização do anteriormente mencionada, o polínucleótido otimizado codifica uma sequência XTEN com pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com AM48. Numa forma de realização, o polinucleótido NTS otimizado compreende uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%, de identidade de sequência com uma sequência ou se complemento selecionado a partir de AE 48: 5'- ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCÀACCTCCACTGAGGAAGGTACCCCGGGTAGCGGTACTGCTT CTTCCTCTCCAGGTÀGCTCTACCCCTrCTGGTGCAACCGGCTCTCCAGGTGCrrCTCCGGGCACC AGCTCTACCGGTTCTCCA-3 ’ e AM 48: 5!- ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTGCATCCCCGGGCACCÁGCTCTA CCGGTTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCTGGTGCTACCGGCTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCT GGTGCTACTG GCTCTCC A-3 ’

Noutra forma de realização, o local de protease da construção da sequência líder é escolhido de modo que é reconhecido por uma protease in vivo. Nesta forma de realização, a proteína é purificada do sistema de expressão enquanto mantém o líder, evitando o contato com uma protease apropriada. A construção de comprimento total é então injetada num paciente. Após a injeção, a construção entra em contato com a protease específica para o local de clivagem e é cortada peia protease. No caso em que a proteína não clivada é substancialmente menos ativa do que a forma clivada, este método tem o efeito benéfico de permitir doses iniciais mais elevadas, evitando a toxicidade, como a forma ativa é gerada lentamente in vivo. Alguns exemplos não limitativos de proteases in vivo que são úteis para esta aplicação incluem calicreína de tecido, calicreína plasmãtica, tripsina, pepsina, quimiotripsina, trombina e metaloproteinases de matriz.

Desta forma, uma molécula de ADN quimérica que codifica para uma proteína de fusão monomérica GHXTEN é gerada dentro da construção. Opcionalmente, esta molécula de ADN quimérico pode ser transferida ou clonada noutra construção que é um vetor de expressão mais apropriado. Neste ponto, uma célula hospedeira capaz de expressar a molécula de ADN quimérico pode ser transformada com a molécula de ADN quimérico. Os vetores contendo os segmentos de ADN de interesse podem ser transferidos para a célula hospedeira através de métodos bem conhecidos, dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, A transfeçao de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio, lipofecção ou eletroporação podem ser usadospara outros hospedeiros celulares. Outros métodos utilizados para transformar células de mamíferos incluem a utilização de polibreno, fusão de protoplast©, lipossomas, eletroporação e microinjeção. Veja-se, geralmente, Sambrook, et al., supra. A transformação pode ocorrer com ou sem a utilização de um veículo, tal como um vetor de expressão. Posteriormente, a célula hospedeira transformada é cultivada SGb condições adequadas para a expressão da molécula de ADN quimérico que codifica GHXTEN. A presente invenção também proporciona uma célula hospedeira para expressar as composições de proteína de fusão monomérica das reivindicações. ExemplGS de células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem, mas não estão limitados a células de mamíferos, tais como células VERO, células BELA tais como ATCC No. CCL2, linhas celulares CHO, células COS, células WI38, células BHK, células HepG2, células 3T3, células A549, células PC12, células K562, células 293, células Sf9 e células Cvl. Exemplos de células eucarióticas não mamíferas adequadas incluem micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores de codificação. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 2 90: 140 [1981],· EP 139,383 publicado em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (U.S. Pat. No. N.° 4.943.529; Fleer et al. , Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tais como, por exemplo, K. lactis (MW98-SC, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K, waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van Den Berg et al. ,

Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (dGcumento EP 183,070; Sreekrishna et ai., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:5259-5263 [1979]);

Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occídentalís (documento EP 394.538 publicado em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205- 221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). As leveduras metilotrõpicas são adequadas no presente documento e incluem, mas não estão limitados a, levedura capaz de crescer em metanol selecionado a partir dos gêneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplares desta classe de leveduras pode ser encontrada em C, Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Outras células adequadas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, estirpes de células hospedeiras procarióticas, tais como Escherichia coli, (por exemplo, estirpe DH5-g) , Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou estirpes do gênero de Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, Exemplos não limitativos de procariotas adequados incluem os gêneros: Actinoplanes; Archaeoglobus; Bdellovibrio; Borrei ia; Chloroflexus; Enterococcus; Escherichia; Lactobacillus; Listeria; Oceanobacillus; Paracoccus; Pseudomonas; Staphylococcus; Streptococcus; Streptomyces; Thermoplasma; e Vibrio. Exemplos não limitativos de estirpes específicas incluem: Archaeoglobus fulgidus; Bdellovibrio bacteriovorus; Borrelía burgdorferi; Chloroflexus aurantiacus; Enterococcus faecalis; Enterococcus faecium; Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus plantarum; Lactococcus lactis; Listeria innocua; Listeria monocytogenes; Oceanobacillus iheyensis; Paracoccus zeaxanthinifaciens; Pseudomonas mevalonii; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus haemolyticus; Streptococcus agalactiae; Streptomyces griseolosporeus; Streptococcus mutans; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Thermoplasma acidophilum; Thermoplasma volcanium; Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; e Vibrio vulnificus.

As células hospedeiras contendo os polinucleótidos de interesse podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais (por exemplo, mistura de nutrientes de Ham) modificada, conforme apropriado, para ativar promotores, selecionar transformantes ou amplificando genes. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são aqueles anteriormente utilizados com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para o perito na especialidade. As células são tipicamente recolhidas por centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos e o extrato bruto resultante retido para posterior purificação· Para composições secretadas pelas células hospedeiras, o sobrenadante da centrifugação é separado e retido para purificação adicional. As células microbianas empregues na expressão de prGteínas podem ser interrompidas através de qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelamento e descongelamento, sonicação, rutura mecânica ou utilização de agentes de lise celular, todos os quais são bem conhecidos dos peritos na especialidade. Formas de realização que envolvem lise celular podem implicar a utilização de um tampão que contém inibidores de protease que limitam a degradação após a expressão da molécula de DNA quimérico. Inibidores de protease adequados incluem, mas não estão limitados a leupeptinas, pepstatina ou aprotinina, 0 sobrenadante então pode ser precipitado em concentrações sucessivamente crescentes de sulfato de amónio saturado. A expressão génica pode ser medida numa amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting, Northern blotting convencionais para quantificar a transcrição de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980) ] , dot blotting (análise de ADN) ou hibridação in situ, utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências proporcionadas no presente documento. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos que podem reconhecer dúplex específicos, incluindo dúplex de ADN, dúplex de ARN e dúplex híbridos de ADN-ARN ou dúplex de ADN-proteína. Os anticorpos, por sua vez, podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado onde o dúplex é ligado a uma superfície, de modo que, após a formação do dúplex na superfície, a presença de anticorpo ligado ao dúplex pode ser detetada. A expressão génica, alternativamente, pode ser medida por métodos imunolõgicos e de fluorescência, tais como a coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecidos e ensaio de cultura celular ou fluidos corporais ou a deteção de marcadores selecionáveis, para quantificar diretamente a expressão do produto gênico. Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser mGnoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido de GH de sequência nativa ou contra um péptido sintético com base nas sequências de ADN proporcionadas no presente documento ou contra a sequência exógena, fundida com GH e codificando um epítopo de anticorpo específico. Exemplos de marcadores selecionáveis são bem conhecidos para um perito na especialidade e incluem repórteres como proteína fluorescente verde potenciada (EGFP), beta-galactosidase (β-gal) ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT). 0(s) produto(s) de polipéptido(s) de CHXTEN expresso pode(m) ser purificado(m) através de métodos conhecidos na técnica, ou por métodos aqui descritos. Procedimentos tais como filtração em gel, purificação por afinidade, fracionamento com sal, cromatografia de permuta iõnica, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de adsorção com hidroxiapatite, A cromatografia de interação hidrofõbica e a eletroforese em gel podem ser utilizadas; cada um adaptado para recuperar e purificar a prGteína de fusão produzida pelas células hospedeiras respetivas. Alguns GHXTEN expressos podem exigir o redobramento durante o isolamento e a purificação. Métodos de purificação são descritos em Robert K. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Charles R. Castor (ed.), Springer-Verlag 1994, e Sambrook, et al., supra. Separações de purificação de múltiplas etapas são também descritas em Baron, et al., Crit. Rev. Biotechnol. 10:179-90 (1990) e Below, et al., J. Chromatogr. A. 679:67-83 (1994).

VIII). COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS A presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo GHXTEN de acordo com as reivindicações. Numa forma de realização, a composição farmacêutica CGinpreende a proteína de fusãG GHXTEN e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Os polipéptidos GHXTEN da presente invenção podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, pelo que o polipéptido é combinado em mistura com um veículo transportador farmaceuticamente aceitável, tais como soluções aquosas ou tampões, suspensões e emulsões farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de solventes não aquosos incluem propil etilenoglicol, polietilenoglicol e óleos vegetais. As formulações terapêuticas são preparadas para armazenamento através da mistura da ingrediente ativo tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais fisiologicamente aceitáveis, conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980), sob a forma de formulações liGfilizadas ou soluções aquosas.

As composições farmacêuticas podem ser administradas por via oral, intranasal, parentérica ou por meio de terapêutica de inalação e pode ter a forma de comprimidos, pastilhas para chupar, grânulos, cápsulas, pílulas, ampolas, supositórios e forma de aerossol. Também podem ter a forma de suspensões, soluções e emulsões do ingrediente ativo em diluentes aquosos ou não aquosos, xaropes, granulados ou põs. Além disso, as composições farmacêuticas também podem conter outros compostos farmaceuticamente ativos ou uma pluralidade de compostos da invenção.

Mais particularmente, as presentes composições farmacêuticas podem ser administradas para terapêutica por qualquer via adequada incluindo oral, retal, nasal, tópica (incluindo transdérmica, aerossol, bucal e sublingual), vaginal, parentérica (incluindo subcutânea, subcutânea por bomba de infusão, intramuscular, intravenosa e intradérmica), intravítrea e pulmonar. Também será apreciado que a via preferida variará com a condição e a idade do recetor e a doença a ser tratada.

Numa forma de realização, a composição farmacêutica é administrada por via subcutânea. Nesta, forma de realização, a composição pode ser fornecida como um pó liofilizado a reconstituir antes da administração. A composição também pode ser fornecida na forma líquida, que pode ser administrada diretamente a um paciente. Numa forma de realização, a composição é fornecida como um líquido numa seringa pré-cheia de modo que um paciente pode facilmente auto-administrar a composição.

As formulações de libertação prolongada úteis na presente invenção podem ser formulações orais compreendendo uma matriz e uma composição de revestimento. Materiais de matriz adequados podem incluir ceras (por exemplo, carnaúba, cera de abelhas, cera de parafina, ceresina, cera de goma-laca, ácidos gordos e álcoois gordos), óleos, óleos endurecidos ou gorduras (por exemplo, óleo de colza endurecido, óleo de rícino, sebo de carne bovina, óleo de palma. e óleo de soja.) e polímeros (por exemplo, hidroxipropí1celulose, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose e polietílenoglícol). Outros materiais de compressão de matriz adequados são celulose microcri stalina, celulose em pó, hidroxipropilce.lul.ose, etilcelulose, com outros veículos e cargas. Os comprimidos também podem conter granulados, pós revestidos e péletes. Os comprimidos também podem estar em múltiplas camadas. Os comprimidos de múltiplas camadas são especialmente preferidos quando os ingredientes ativos têm perfis farmacocinéticos marcadamente diferentes. Opcionalmente, o comprimido acabado pode ser revestido ou não revestido. A composição de revestimento pode compreender um polímero de matriz insolúvel e/ou um material solúvel em água. Materiais solúveis em água podem ser polímeros tais como polietilenoglicol, hidroxipropileelulose, hidroxipropil metil celulose, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico ou materiais monoméricos tais como açúcares (por exemplo, lactose, sacarose, frutose, manitol e semelhantes), sais (por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio e semelhantes) , ácidos orgânicos (por exemplo, ácido fumárico, ácido succínico, ácido láctico e ácido tartárico) e misturas dos mesmos. Opcionalmente, um polímero entérico pode ser incorporado na composição de revestimento. Os polímeros entéricos adequados incluem hidroxipropilmetílcelulose, acetato sucinato, hidroxipropil metil celulose, ftalato, acetato ftalato de polivinilo, acetato ftalato de celulose, Trimelitato acetato celulose, goma laca, zeína e polimetacrilatos contendo grupos carboxilo. A composição de revestimento pode ser plastificada pela adição de plastificantes adequados tais como, por exemplo, ftalato de trietilo, ésteres de citrato, polietilenoglicol, glicerol, glicéridos acetilados, ésteres de citrato acetilados, dibutilssebacato e óleo de rícinG. A composição de revestimento também pode incluir uma carga, que pode ser um material insolúvel como dióxido de silício, dióxido de titânio, talco, caulino, alumina, amido, celulose em pó, MCC e poliacrilina potássio. A composição de revestimento pode ser aplicada como uma solução ou látex em solventes orgânicos ou solventes aquosos ou suas misturas, solventes, tal como água, álcool de cadeia curta, hidrocarbonetos clorados de cadeia curta, cetonas e misturas dos mesmos podem ser utilizados.

As composições da invenção podem ser formuladas utilizando uma variedade de excipientes. Excipientes adequados incluem celulose microcristalina (por exemplo, Avicel PI-I1G2, Avicel PH101) , polimetacrilato, poli (acrilato de etilo, metacrilato de metilo, cloreto de metacrilato de trimetilamonometilo) (tal como Eudragit RS-30D) , hidroxipropilmetilcelulose (Methocel K100M, Premium CR Methocel K100M, Methocel E5, Opadry®), estearato de magnésio, talco, citrato de trietilo, dispersão aquosa de etilcelulose (Surelease®) e sulfato de protamina. 0 agente de libertação lenta também pode compreender um veículo, que pode compreender, por exemplo, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antifúngicos e antibacterianos, agentes de retardamento de absorção e isotónicos. Os sais farmaceuticamente aceitáveistambém podem ser utilizados nestes agentes de libertação lenta, por exemplo, sais minerais tais como cloridratos, bromídratos, fosfatos ou sulfatos, bem como os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos ou benzoatos. A composição também pode conter líquidos, tal como água, solução salina, glicerol e etanol, bem como substância tais como agentes humectantes, agentes emulsionantes e/ou agentes de tamponamento de pH. Lipossomas também podem ser utilizados como veículo.

Noutra forma de realização, as composições da presente invenção são encapsulados em lipossomas, que demonstraram utilidade na entrega de agentes ativos benéficos de forma controlada durante períodos prolongados de tempo. Os lipossomas são membranas bicamadas fechadas contendo um volume aquoso aprisionado. Os lipossomas tairbém podem ser vesículas unilamelares possuindo uma bicamada de membrana única ou vesículas multilamelares com bicamadas de membrana múltiplas, cada um separado do próximo por uma camada aquosa. A estrutura da bicamada de membrana resultante é tal que as caudas hidrofóbicas (não polares) do lípido estão orientadas em direção ao centro da bicamada enquanto as cabeças hidrofílicas (polares) se orientam para a fase aquosa. Numa forma de realização, o lipossoma pode ser revestido com um polímero solúvel em água flexível que evita a absorção pelos órgãos do sistema de fagócitos mononucleares, principalmente o fígadG e baço. Os polímeros hidrófilos adequados para rodear os lipossomas incluem, sem limitação, PEG, polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropiImetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmeta.cr.1 lato, pol ihidroxietilacri lato, hidroximetilcelulose, hidroxietilcelulose, polietilenoglicol, poliaspartamida e sequências de péptidos hidrofílicos conforme descrito nas Patentes U.S. n° 6.316.024; 6.126.966; 6.056.973; 6.043.094.

Os lipossomas podem ser compreendidos de qualquer combinação lipídica ou lípido conhecido na técnica. Por exemplo, os lípidos formadores de vesículas podem ser lipídios de ocorrência natural ou sintéticos, incluindo fosfolípidos, tais como fosfatidilcolina, fosfatídiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol e esfingomielina conforme divulgados nas Patentes U.S. n° 6.056.973 e 5.874.104. Os lipídios formadores de vesículas também podem ser glícolípidos, cerebrósidos e lípidos catiõnicos, tais como 1,2-dioleiloxi-3-{trimetilamino) propano (DOTAP); brometo N- [1- (2,3, -ditetradeciloxi)prop.il] -N,N- dimetil-N-hidroxietilamõnío (DMRIE)brometo N-[1[(2,3,-dioleiloxi)propil]-N,N- dimetil-N-hidroxietilamõnio (DMRIE); cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio ÍDOTMA); 3 [N-(Ν',Ν'-dimetilaminoetano) carbamoli] colesterol (DC-Chol); ou dimetildioctadecilamónio (DDAB) também divulgado na Patente U.S. n° 6.056.973. 0 colesterol também pode estar presente na gama apropriada para conferir estabilidade à vesícula como divulgado nas Patentes U.S. n° 5.916.588 e 5.874.104.

Tecnologias lipossómicas adicionais são descritas nas Patentes U.S. n° 6.759.057; 6.406.713; 6.352.716? 6.316.024; 6.294.191; 6.126.966; 6.056.973; 6.043.094; 5.965.156; 5.916.588? 5.874.104; 5.215.680; e 4.684.479. Estes descrevem lipossomas e microbolhas revestidas com lípidos e métodos para sua fabricação. Assim, um perito na especialidade, considerando tanto a divulgação desta invenção como as divulgações destas outras patentes podem produzir um lipossoma para a libertação prolongada dos polipéptidos da presente invenção.

Para formulações líquidas, uma propriedade desejada é que a formulação seja fornecida numa forma que possa passar através de uma agulha de calibre 25, 28, 30, 31, 32 para administração intravenosa., intramuscular, intra - articular ou subcutânea. A administração através de formulações transdérmicas pode ser realizada utilizando métodos também conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos geralmente em, por exemplo, Patente U.S. n.° 5.186.938 e 6.183.770, 4.861.800, 6.743.211, 6.945.952, 4.284.444 e documento WO 89/09051. Um penso transdérmico é uma forma de realização particularmente útil com polipéptidos com problemas de absorção. Os pensos podem ser feitos para controlar a libertação de ingredientes ativGS permeáveis à pele ao longo de um período de 12 horas, 24 horas, 3 dias e 7 dias. Num exemplo, um excesso diário de 2 v-ezes de um polipéptido da presente invenção é colocado num fluido não volátil. As composições da invenção são proporcionadas na forma de um líquido viscoso não volátil. A penetração através da pele de formulações específicas pode ser medida por métodos padrão na técnica (por exemplo, Franz et al., J. Invest. Derm. 64:194-195 (1975)). Exemplos de pensos adequados são pensos dérmicos de transferência passiva, pensos dérmicos iontoforéticos ou pensos com microagulhas como Nicoderm.

Noutras formas de realização, A composição pode ser entregue por via intranasal, bucal ou sublingual ao cérebro para permitir a transferência dos agentes ativos através das passagens olfativas para o SNC e reduzir a administração sistémica. Os dispositivos comummente utilizados para esta via de administração estão incluídos na Patente U.S. n° 6,715,485. As composições entregues através desta via podem permitir o aumento da dosagem do SNC ou redução da carga total do corpo, reduzindo os riscos de toxicidade sistémica associados a certos medicamentos. A preparação de uma composição farmacêutica para administração num dispositivo subdérmicamente implantãvel pode ser realizada utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em, por exemplo, Patentes U.S. n° 3.992.518; 5.660.848; e 5.756.115.

As bombas osmõticas podem ser utilizadas como agentes de libertação lenta sob a forma de comprimidos, pílulas, cápsulas ou dispositivos implantáveis. As bombas osmõticas são bem conhecidas na técnica e prontamente disponíveis para um especialista na técnica a partir de empresas experientes em fornecer bombas osmõticas para libertação de fármaco de libertação prolongada. Exemplos são ALZA's DUROS™; ALZA's OROS™; sistema Osmotica Pharmaceutical's Osmodex™; Shire Laboratories' EnSoTrol™ system; e Alzet™. Patentes que descrevem a tecnologia de bomba osmótica são Patentes U.S. n° 6.890.918; 6.838,093; 6.814.979; 6.713.086; 6.534.090; 6.514.532; 6.361.796; 6.352.721; 6.294.201; 6.284.276; 6.110.498; 5.573.776; 4.200.0984; e 4.088.864. Um perito na especialidade, Considerando tanto a divulgação desta invenção como as divulgações destas outras patentes poderiam produzir uma bomba osmótica para a libertação prolongada dos polipéptidos da presente invenção.

As bombas de seringa também podem ser usadas como agentes de liberação lenta. Tais dispositivos são descritos nas Patentes U.S. n° 4.976.6S6; 4.933.185; 5.017.378; 6.309.370; 6.254.573; 4.435.173; 4.398.908; 6.572.585; 5.298.022; 5.176.502; 5.492.534; 5.318.540; e 4.988.337. Um perito na especialidade, Considerando tanto a divulgação desta invenção como as divulgações destas outras patentes poderiam produzir uma bomba de seringa para a libertação prolongada das composições da presente invenção. A.

IX). KITS FARMACÊUTICOS

Noutro aspeto, esta divulgação fornece um kit para facilitar a utilização dos polipéptidos GHXTEN. 0 kit compreende a composição proporcionada na presente invenção, um rótulo que identifica a composição farmacêutica e uma instrução para armazenamento, econstituição e/ou administração das composições farmacêuticas a um indivíduo em alguma forma de realização, o kit compreende, preferentemente: (a) uma quantidade de uma composição de proteína de fusão GHXTEN suficiente para tratar uma doença, condição patológica ou distúrbio após a administração a um indivíduo que precisa da mesma; e (b) uma quantidade de um veículo farmaceuticamente aceitável; juntamente numa formulação pronta para injeção ou para reconstituição com água estéril, tampão ou dextrose; juntamente com um rótulo que identifica o medicamento GHXTEN e as condições de armazenamento e manuseio e uma folha das indicações aprovadas para o medicamento, instruções para a reconstituição e/ou administração do medicamento GHXTEN para o uso para prevenção e/ou tratamento de uma indicação aprovada, informações adequadas de dosagem e segurança e informações que identificam o lote e a expiração do medicamento. Noutra forma de realização do anteriormente mencionada, o kit pode compreender um segundo recipiente que pode transportar um diluente adequado para a composição GHXTEN, que proporcionará ao utilizador a concentração apropriada de GHXTEN para ser entregue ao sujeito.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção de segmentos de motivo XTEN AD36 0 seguinte exemplo descrevem a construção de uma coleção de genes otimizados por codões que codificam sequências de motivo de 36 aminoâcidos. Como uma primeira etapa, um vetor stuffer pCW0359 foi CGnstruído com base num vetor pST e que inclui um promotor T7. pCWQ359 codifica um domínio de ligação a celulose (CBD) e urn sítio de reconhecimento de protease TEV seguido por uma sequência stuffer que é flanqueada pelos sítios Bsal, Bbsl Kpnl. Os sítios Bsal e Bbsl foram inseridos de modo que gerassem salientes compatíveis depois da digestão. A sequência staffer é seguida por uma versão truncada do gene GFP e uma etiqueta His, A sequência stuffer contém codões de interrupção e, portanto, as células de E. coli que carregam o plasmídeo stuffer pCW0359 formam colónias não fluorescentes. 0 vetor stuffer pCW359 foi digerido com Bsal e Kpnl para remover o segmento stuffer e o fragmento do vetor resultante foi isolado por purificação em gel de agarose. As sequências foram designadas XTEN__AD36, refletindo a família AD de motivos. Os seus segmentos têm a sequência de aminoãcidos [X] 3 onde X é um péptido de 12 mero com as sequências: GESPGGSSGSES, GSEGSSGPGESS, GSSESGSSEGGP ou GSGGEPSESGSS. 0 inserto foi obtido por anelamento dos seguintes pares de pares de oligonucleótidos sintéticos fosforilados:

AD 1 for: AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC AD1rev: ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC AD2for: AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC AD2rev: ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT AD3for: AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC AD3 rev: ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA AD4for: AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC

Também se anelou o oligonucleótido fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e o oligonucleótido não fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleótidos anelados foram ligados, o que resultou numa mistura de produtos com comprimentos variáveis que representa o número variável de repetições de 12 mero ligadas a um segmento Bbsl/Kpnl. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor stuffer pCW0359 digerido com Bsal/Kpnl. A maior parte dos clones na biblioteca resultante designada LCW0401 mostraram fluorescência verde depois da indução, o que mostra que a. sequência de XTEN_AD3 6 tinha sido ligada em estrutura com o gene GFP e que a maioria das sequências de XTEN_AD36 tinham bons níveis de expressão.

Foram rastreados 96 isolados a partir da biblioteca LCW0401 quanto a fluorescência de nível elevado por estampagem numa placa de agar contendo IPTG. Os mesmos isGladGS fGram avaliadGS pGr PCR e foram identificados 48 isolados que continham segmentos com 36 aminoácidos bem como uma forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e foram identificados 39 clones que continham segmentos XTEN__AD36 corretos. Os nomes dos ficheiros das construções de nucleótidos e aminoácidos para estes segmentos estão listados no Quadro 8.

Quadro 6: Sequências de ADlsi e antineácidos para motivos de 36 mero

Exemplo 2% Construção de segmentos XTEN_AE36

Foi construída uma biblioteca de codões codificando sequências de XTEN de 36 aminoãcidos de comprimento. A sequência de XTEN foi designada XTEN_AE36. Os seus segmentos têm a sequência de aminoãcidos [X] 3 onde X é um péptido de 12 mero com a sequência: GSPAGSPTSTEE, GSEPATSGSE TP, GTSESA TPESGP ouGTSTSPSEGSAP. 0 inserto foi obtido por anelamento dos seguintes pares de pares de oligonucleotides sintéticos fosforilados:

ΑΞ1for: AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA AElrev: ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT ΑΞ2for: AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC AE 2 rev: ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT ΑΞ3 for: AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC AE 3 rev: ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT AE4for: AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC AE4rev: ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT

Também se anelou o oligonucleótido fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e o oligonucleótido nâo fosforilado pr_3Kpn!stopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleótidos anelados foram ligados, o que resultou numa mistura de produtos com comprimentos variáveis que representei o número variável de repetições de 12 mero ligadas a um segmento BbsI/Kpnl. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoãcidos foram isolados da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor stuffer pCW0359 digerido com Bsal/Kpnl. A maior parte dos clones na biblioteca resultante designada LCW0402 mostraram fluorescência verde depois da indução, o que mostra que a sequência de XTEN__AE36 tinha sido ligada em estrutura com o gene GFP e a maioria das sequências de XTEN_AE36 mostraram boa expressão.

Foram rastreados 96 isolados a partir da biblioteca LCW0402 quanto a fluorescência de nível elevado por estampagem numa placa de agar contendo IPTG, Os mesmos isolados foram avaliados por PCR e foram identificados 48 isolados que continham segmentos com 36 aminoãcidos bem como uma forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e foram identificados 37 clones que continham segmentos XTEN__AE36 corretos. Os nomes dos ficheiros das construções de nucleõtidos e aminoãcidos para estes segmentos estão listados no Quadro 9.

Quadro 9: Sequências de ADN e aminoácídos para motivos de 36 mero

Exemplo 3: Construção de segmentos XTEN_AF36

Foi construída uma biblioteca de codões codificando sequências de 36 aminoãcidos de comprimento. As sequências foram designadas XTEN_AF36. Os seus segmentos têm a sequência de aminoãcidos [X] 3 onde X é um péptido de 12 mero com a sequência: GSTSESPSGTAP, GTSTPESGSASP, GTSPSGESSTAP, or GSTSSTAESPGP. 0 inserto foi obtido por anelamento dos seguintes pares de pares de oligonucleótidos sintéticos fosforilados:

AFlfor: AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC AF1rev: ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA AF2for: AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC AF2rev: ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT AF3for: AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC AF3rev: ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT AF4for: AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC AF4 rev: ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA

Também se anelou o oligonucleótido fosforilado 3KpnlstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e o oligonucleótido não fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleótidos anelados foram ligados, que resultaram numa mistura de produtos com comprimentos variáveis que representa o número variável de repetições de 12 mero ligadas a um segmento BbsI/Kpnl. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoãcidos foram isolados a partir da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor pCWQ359 digerido com Bsal/Kpnl. A maior parte dos clones na biblioteca resultante designada LCW0403 mostraram fluorescência verde depois da indução, o que mostra que a sequência de XTEN_AF36 tinha sido ligada em estrutura com o gene GFP e a maioria das sequências de XTEN_AF36 mostraram boa expressãG.

Foram rastreados 96 isolados a partir da biblioteca LCWQ403 quanto a fluorescência de nível elevado por estampagem numa placa de agar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados por PCR e foram identificados 48 isolados que continham segmentos com 36 aminoâcidos bem como uma forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e foram identificados 44 clones que continham segmentos XTEN_AF36 corretos. Os nomes dos ficheiros das construções de nucleótidos e aminoâcidos para estes segmentos estão listados no Quadro 10.

Quadro 10: Sequências de ADN e aminoácidos para motivo

Exemplo 4; Construção de segmentos XTEN_AG36

Foi construída uma biblioteca de codões codificando sequências de 36 aminoãcidos de comprimento. As sequências foram designadas XTEN AG36. Os seus segmentos têm a sequência de aminoãcidos [X] 3 onde X é um péptido de 12 mero com a sequência: GTPGSGTASSSP, GSSTPSGATGSP, GSSPSASTGTGP, or GASPGTSSTGSP. 0 inserto foi obtido por anelamento dos seguintes pares de pares de oligonucleotides sintéticos fosforilados:

AGIfor: AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC AGlrev: ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT AG2for: AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC AG2rev: ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT AG3for: AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC AG3rev: ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA AG4for: AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC AG4rev: ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC

Também se anelou o oligonucleótido fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e o oligonucleótido não fosforilado pr 3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleótidos anelados foram ligados, o que resultou numa mistura de produtos com comprimentos variáveis que representa o número variável de repetições de 12 mero ligadas a um segmento BbsI/Kpnl. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoãcidos foram isolados da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor stuffer pCW0359 digerido com Bsal/Kpnl. A maior parte dos clones na biblioteca resultante designada LCW0404 mostraram fluorescência verde depois da indução, o que mostra que a sequência de XTEN__AG36 tinha sido ligada em estrutura com o gene GFP e a maioria das sequências de XTEN AG36 mostraram boa expressão.

Foram rastreados 96 isolados a partir da biblioteca LCW0404 quanto a fluorescência de nível elevado por estampagem numa placa de agar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados por PCR e foram identificados 48 isolados que continham segmentos com 36 aminoâcidos bem como uma forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e foram identificados 44 clones que continham segmentos XTEN_AG36 corretos. Os nomes dos ficheiros das construções de nucleótidos e aminoâcidos para estes segmentos estão listados no Quadro 11.

Quadro 11: Sequências de ADN e aminoácidos para motivos de 36 mero

Exemplo 5: Construção de XTEN_AE864 XTEN_AES64 foi construído a partir da dimerização em série de XTEN_AE36 para AE72, 144, 288, 576 e 864, Uma coleção de segmentos XTEN_AE72 foi construída a partir de 37 segmentos diferentes de XTEN__AE36. Culturas de E. coli albergando os 37 segmentos de 36 aminoácidos diferentes foram misturadas e o plasmídeo foi isolado. Este agrupamento de plasmídeo foi digerido com Bsal/Ncol para gerar o fragmento pequeno como o inserto. 0 mesmo agrupamento de plasmídeo foi digerido com BbsI/Ncol para gerar o fragmento pequeno como o vetor. 0 inserto e fragmentos de vector foram ligados resultando numa duplicação do comprimento e a mistura de ligaçâG foi transformada em células BL21 Gold(DE3) para obter colónias de XTEN_AE7 2.

Esta biblioteca de segmentos de XTEN___AE72 foi designada LCW0406. Todos os clones de LCW0406 foram combinados e dimerizados novamente utilizando o mesmo processo como descrito acima dando a biblioteca LCW0410 de XTEN_AE144. Todos os clones de LCW0410 foram combinados e dimerizados novamente utilizando o mesmo processo como descrito acima dando a biblioteca LCW0414 de XTEN_AE288. Dois isolados LCW0414.001 e LCW0414.002 foram aleatoriamente selecionados a partir' da biblioteca e sequenciados para verificar as identidades. TGdos os clones de LCW0414 foram combinados e dimerizados novamente utilizando o mesmo processo como descrito acima dando a biblioteca LCW0418 de XTEN_AE576. Foram rastreados 96 ísGladGS a partir da biblioteca LCW0418 quanto à fluorescência de GFP de nível elevado. 8 isolados com tamanhos corretos de insertos por PCR e forte fluorescência foram sequenciados e 2 isolados (LCW0418.018 e LCW0418.052) foram escolhidos para utilização futura com base nos dados de sequenciação e expressão. 0 clone específico pCW0432 de XTEN_AE864 foi construído por combinação LCW0418.018 de XTEN_AE576 e LCW0414.002 de XTEN_AE288 utilizando o mesmo processo de dimerização como descrito acima.

Exemplo 6: Construção de XTENAM144

Foi construída uma coleção de segmentos XTEN__AM144 a partir de 37 segmentos diferentes de XTEN_AE36, 44 segmentos de XTEN__AF36 e 44 segmentos de XTEN__AG36,

Culturas de E. coli albergando todos os 125 segmentos de 36 aminoãcidos diferentes foram misturadas e o plasmídeo foi isolado. Este agrupamento de plasmídeo foi digerido com Bsal/Ncol para gerar o fragmento pequeno como o inserto. 0 mesmo agrupamento de plasmídeo foi digerido com BbsI/Ncol para gerar o fragmento pequeno como o vetor. 0 inserto e fragmentos de vector foram ligados resultando numa duplicação do comprimento e a mistura de ligação foi transformada em células BL21 Gold(DE3) para obter colónias de XTEN_AM72.

Esta biblioteca de segmentos de XTEN_AM72 foi designada LCW0461. Todos os clones de LCW0461 foram combinados e dimerizados novamente utilizando o mesmo processo como descrito acima dando a biblioteca LCWQ462. 1512 isolados a partir da biblioteca LCWQ462 foram rastreados quanto à expressão proteica. Colónias individuais foram transferidas para placas de 96 poços e cultivadas durante a noite como culturas iniciais. Estas culturas iniciais foram diluídas em medio de autoindução novo e cultivadas durante 20-30h. A expressão foi medida utilizando um leitor de placas de fluorescência com excitação a 395 nm e emissão a 510 nm. 192 isolados mostraram uma expressão de nível elevado e foram enviados para sequenciação de ADN. A maioria dos clones na biblioteca LCW0462 mostraram uma boa expressão e propriedades físico-químicas semelhantes sugerindo que a maioria das combinações de segmentos de XTEN_AM3 6 dão sequências de XTEN úteis. 30 isolados a partir de LCW0462 foram escolhidos como uma coleção preferida de segmentos de XTEN_AM144 para a construção de proteínas multifuncionais que contêm múltiplos segmentos de XTEN. Os nomes dos ficheiros das construções de nucleótidos e aminoãcidos para estes segmentos estão listados no Quadro 12.

Quadro 12; Sequências de ADN e aminoacidos para segmentos de ΆΜ144

Exemplo 7: Construção de ΧΤΕΝ ΆΜ288

Toda a biblioteca LCW0462 foi dimerizada como descrito no Exemplo 6 resultando numa biblioteca de clones de XTEN__AM2 8 8 designada LCW0463. 1512 isolados a partir da biblioteca LCW0463 foram rastreados utilizando o protocolo descrito no Exemplo 6. 176 clones de elevada expressão foram sequenciados e 40 segmentos de XTEN_AM288 preferidos foram escolhidos para a construção de proteínas multifuncionais que contêm múltiplos segmentos de XTEN com 288 resíduos de aminoãcidos.

Exemplo 8: Construção de XTEN_AM432

Foi gerada uma biblioteca de segmentos de XTEN_AM432 por recombinação de segmentos a partir da biblioteca LCWQ462 de segmentos de XTEN__AM144 e segmentos a partir da biblioteca LCW04 63 de segmentos de XTEN__AM2 88, Esta nova biblioteca de segmentos de XTEN_AM432 foi designada LCW0464. 0 plasmídeo foi isolado a partir de culturas de E. coli que albergam LCW0462 e LCW0463, respetivamente. 1512 isGlados a partir da biblioteca LCW0464 foram rastreados utilizando o protocolo descrito no Exemplo 6. 176 clones de elevada expressão foram sequenciados e 39 segmentos de XTEN AM432 preferidos foram escolhidos para a construção de XTEN s mais longos e para a construção de proteínas multifuncionais que contêm múltiplos segmentos de XTEN com 432 resíduos de aminoãcidos.

Em paralelo, construiu--se uma biblioteca LMS0100 de segmentos de XTEN__AM432 utilizando segmentos de XTEN_AM144 e XTEN_AM288 preferidos. 0 rastreio desta biblioteca rendeu 4 isolados que foram selecionados para construção adicional.

Exemplo 9: Construção de XTEN__ÂM875 0 vetor stuffer pCW359 foi digerido com Bsal e Kpnl para remover o segmento stuffer e o fragmento do vetor resultante foi isolado por purificação em gel de agarose.

Anelou-se o oligonucleótido fosforilado Bsal-Ascl-KpnlforP: AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e o oligonucleótido não fosforilado Bsal-Ascl-Kpnlrev: CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCCGTGCTTGGCGCGCCGCTTGCGCTTGC para introduzir a ilha de sequenciação A (SI-A) que codifica os aminoãcidos GASASGAPSTG e tem a enzima de restrição Asei reconhecimento de sequência de nucleotídeo GGCGCGCC dentro. Os pares de oligonucleotides anelados foram ligados com o vector stuffer pCW0359 digerido com Bsal e KpnJ preparado acima para produzir pCW0466 contendo SI-A. Gerou-se então uma biblioteca de segmentos de XTEN_AM443 recGirtbinando 43 segmentos de XTEN_AM432 preferidos do Exemplo 8 e segmentos SI-A de pCW04 66 no terminal C utilizando o mesmo processo de dimerização descrito no Exemplo 5. Esta nova biblioteca de segmentos de XTE13__AM443 foi designada LCW0479,

Gerou-se uma biblioteca de segmentos de XTEN_AM875 recombinando segmentos da biblioteca LCW0479 de segmentos de XTEN_AM443 e 43 segmentos de XTEN_Aí4432 preferidos do ExemplG 8 usando o mesmo processo de dimerização descrito no Exemplo 5. Esta nova biblioteca de segmento de XTEN ΆΜ875 foi designada LCW0481.

Exemplo 10: Construção de XTENAM1318

Anelou-se o oligonucleótido fosforilado Bsal-Fsel-KpnlforP: AGGTCCAGAACCAACGGGGCGGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e o oligonucleótido não fosforilado Bsal-Fsel-Kpnlrev: CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTCTGG para introduzir a ilha de sequenciação B (SI-B) que codifica os aminoãcidos GPEPTGPAPSG e tem a enzima de restrição Fsel de reconhecimento de sequência de nucleotídeo GGCCGGCC dentro. Os pares de oligonucleótidos anelados foram ligados com o vetor stuffer pCW0359 digerido com Bsal e Kpnl como utilizado no Exemplo 9 para produzir pCWQ467 contendo SI-B. Gerou-se então uma biblioteca de segmentos de ΧΤΞΝ AM443 recombinando 43 segmentos de XTEN__AM432 preferidos do Exemplo 8 e segmentos SI-B de pCW0467 no terminal C utilizando o mesmo processo de dimerização descrito no Exemplo 5. Esta nova biblioteca de segmentos de ΧΤΕΝ AM443 foi designada LCW0480.

Gerou-se uma biblioteca de segmentos de XTEN_AM1318 recombinando segmentos da biblioteca LCW0480 de segmentos de XTEN_AM443 e segmentos da biblioteca LCW0481 de segmentos de XTEN_AM875 usando o mesmo processo de dimerização que no Exemplo 5. Esta nova biblioteca de segmentos de XTEN_AM1318 foi designada LCWQ487.

Exemplo 11: Construção de XTEN_AD864

Utilizando os vários ciclos consecutivos de dimerização, montou-se uma coleção de sequências de XTEN AD864 começando a partir dos segmentos de XTEN AD36 listados no Exemplo 1. Estas sequências foram montadas como descrito no Exemplo 5. Vários isolados de XTEN_AD864 foram avaliados e verificou-se que mostravam boa expressão e excelente solubilidade sob condições fisiológicas. Uma construção intermediária de XTEN__AD576 foi sequenciada. Este clone foi avaliado numa experiência de PK em macacos cinomolgos e foi medida uma semivida de cerca de 20 h. Exemplo 12: Construção de XTEN_AF864

Utilizando os vários ciclos consecutivos de dimerização, montou-se uma coleção de sequências de XTEN__AF864 começando a partir dos segmentos de XTEN_AF36 listados no Exemplo 3. Estas sequências foram montadas como descrito no Exemplo 5. Vários isolados de XTEN_AF864 foram avaliados e verificou-se que mostravam boa expressão e excelente solubilidade sob condições fisiológicas. Uma construção intermediária de XTEN_AF540 foi sequenciada. Este clone foi avaliado numa experiência de PK em macacos cinomolgos e foi medida uma semivida de cerca de 2 0 h. Um clone de comprimento completo de XTEN_AF864 teve uma solubilidade excelente e mostrou uma semivida que excedia 60 h em macacos cinomolgos. Um segundo conjunto de sequências de XTEN AF foi montado incluindo uma ilha de sequenciação como descrito no Exemplo 9.

Exemplo 13: Construção de XTEN_AG864

Utilizando os vários ciclos consecutivos de dimerização, montou-se uma coleção de sequências de XTEN_AG864 começando a partir dos segmentos de XTEN_AD36 listados no Exemplo 1. Estas sequências foram montadas como descrito no Exemplo 5. Vários isolados de XTEN_AG864 foram avaliados e verificou-se que mostravam boa expressão e excelente solubilidade sob condições fisiológicas. Um clone de comprimento completo de XTEN__AG864 teve uma solubilidade excelente e mostrou uma semivida que excedia 60 h em macacos cinomolgos.

Exemplo 14: Construção de extensões N-terminais de XTEN -Construção e rastreio de bibliotecas de adição de 12 mero

Este exemplo detalha uma etapa na otimização do terminal N da proteína XTEN para promover a. iniciação da tradução para permitir a expressão de fusões de XTEN no terminal N de proteínas de fusão sem a presença de um domínio auxiliar. Historicamente, a expressão de proteínas com XTEN no terminal N foi fraca., produzindo valores que seriam essencialmente indetetáveisno ensaio de fluorescência GFP (<25% da expressão com o domínio N-terminal CBD helper). Para criar diversidade ao nível dos codões, as sequências de aminoáeidos foram selecionadas e preparadas com uma diversidade de codões. Sete pares de oligonucleotides codificando 12 aminoáeidos com diversidades de codões foram desenhados, anelados e ligados no vetor stuffer pCW0551 digerido com as enzimas de restrição Ndel/Bsal (Stuffer-XTEN ΆΜ875-GFP) e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold (DE3) para obter colónias das sete bibliotecas. Os clones resultantes têm 12 mero de XTEN N-terminais fundidos em estrutura com XTEN_AM875-GFP para permitir a utilização de fluorescência de GFP para o rastreio da expressão. Colónias individuais a partir das sete bibliotecas criadas foram escolhidas e cresceram durante a noite até à saturação em 500 μΐ de meio super broth numa placa de 96 poços fundos. 0 número de colónias escolhidas variou desde aproximadamente metade até um terço da diversidade teórica da biblioteca (veja-se o Quadro 13).

Quadro 13; Diversidade teórica e números de amostragem para bibliotecas de adição de 12 mero. Os resíduos de axninoâcidos com codões randomizados estão sublinhados.

As culturas de durante a noite saturadas foram usadas para inocular culturas novas de 500 μΐ em meio de autoindução no qual cresceram durante a noite a 2 6 0 C.

Estas culturas de expressão foram então testadas usando um leitor de placas de fluorescência (excitação 395 nm, emissão 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente (veja-se a FIG. 9 para os resultados dos ensaios de expressão). Os resultados, representados graficamente como gráficos de bigode, embora os níveis de expressão medianos foram aproximadamente metade dos níveis de expressão em comparação com o domínio de terminal N auxiliar "de referência" CBD, os melhores clones a partir de bibliotecas estavam muito mais perto dos valores de referência, indicando que uma maior Gtimização em torno dessas sequências se justificava. Isso contrasta com as versões anteriores do XTEN que foram <25% dos níveis de expressão da referência CB--N-terminal. Os resultados também mostram que as bibliotecas começando cgiu aminoácidos MA tinham melhores níveis de expressão do que aquelas que se iniciam com ME. Isto foi mais aparente quando se observavam os melhores clones, que estavam mais próximos das referências jã que na sua maioria começavam com MA. Dos 176 clones dentro de 33 % da referência CBD-AM875, 87 % começam com MA, enquanto apenas 75 % das sequências nas bibliotecas começando com MA, uma clara sobre representação dos clones que começam com MA no nível de expressão mais elevado. 96 dos melhores clones foram sequenciados para confirmar a identidade e doze sequências (veja-se o Quadro 14) , 4 de LCW546, 4 de LCW547 e 4 de LCW552 foram selecionadas para otimização adicional.

Quadro 14; Sequência nucleotídica de ADN de 12 mero avançada

Exemplo 15: Construção de extensões N-terminais de XTEN ~ Construção e rastreio de bibliotecas otimizando os codõee 3 e 4

Este exemplo detalha uma etapa na otimização do terminal N da proteína XTEN para promover a iniciação da tradução para permitir a expressão de fusões de XTEN no terminal N de proteínas sem a presença de um domínio auxiliar. Com preferências pelos dois primeiros codões estabelecidos (veja-se o Exemplo acima), o terceiro e quatro codões foram random!zados para determinar as preferências. Três bibliotecas, baseadas nos melhores clones de LCW546, LCW547 e LCW552, foram desenhadas com o terceiro e quarto resíduos modificados de modo que todas as combinações de codões de XTEN permissíveis estavam presentes nestas posições (veja-se a FIG, 10) . De modo a incluir todos os codões de XTEN permissíveis para cada biblioteca, nove pares de oligonucleótidos codificando 12 aminoácidos com diversidades de codões do terceito e quatro resíduos foram desenhados, anelados e ligados no vetor stuffer pCWQ551 digerido com as enzimas de restrição Ndel/Bsal (Stuffer-XTEN_AM875-GFP) e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold (DE3) para obter colónias das três bibliotecas LCW0569-571. Com 24 codões de XTEN, a diversidade teórica de cada biblioteca é de 576 codões únicos. Um total de 504 colónias individuais a partir das três bibliotecas criadas foram escolhidas e cresceram durante a noite até à saturação em 500 μΐ de meio super broth numa placa de 96 poços fundos. Isto proporcionou uma cobertura suficiente para entender o desempenho relativo das bibliotecas e as preferências de sequências, As culturas de durante a noite saturadas foram usadas para inocular culturas novas de 500 μΐ em meio de autoindução no qual cresceram durante a noite a 26 0 C. Estas culturas de expressão foram então testadas usando um leitor de placas de fluorescência (excitação 395 nm, emissão 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os 75 melhores clones do rastreio foram sequenciados e testados novamente quanto à expressão de repórter GFP em comparação com as amostras de referência (veja-se a FIG. 11) . 52 clones produziram dados de sequenciação úteis e foram utilizados para análise subsequente. Os resultados foram discriminados por biblioteca e indicaram que LCW546 era a biblioteca superior. Os resultados são apresentados no Quadro 15, Surpreendentemente, descobriu-se que as leituras de fluorescência de base para os melhores clones foram -900 AU, enquanto que a referência N-terminal foi de apenas -600 AU. Isso indica que esta biblioteca instituiu uma melhoria de aproximadamente 33% em relação aos melhores clones da biblioteca anterior, que eram aproximadamente iguais em expressão à referência CB-N-terminal (Exemplo 14).

Quadro 15; Comparação de biblioteca de otimização de ____terceiro e quarto codões

Tendências adicionais foram observadas nos dados mostrando preferências por codões particulares na terceira e quarta posição. Dentro da biblioteca LCW569, o codão de glutamato GAA na terceira posição e o codão de treonina ACT foram associados com uma expressão mais elevada como mostrado no Quadro 16.

Quadro 16; Terceiro e quarto codões preferidos em LCW569

Adicionalmente, o reteste dos 75 melhores clones indicou que vários eram agora superiores aos clones de referência.

Exemplo 16: Construção de extensões N-terminais de XTEN -Construção e rastreio de bibliotecas de 12 mero e 36 mero combinatórias

Este exemplo detalha uma etapa na otimização do terminal N da proteína XTEN para promover a iniciação da tradução para permitir a expressão de fusões de XTEN no terminal N de proteínas sem a presença de um domínio auxiliar. Com preferências pelos dois primeiros codões estabelecidos (veja-se o Exemplo acima), o terminal N foi examinado num contexto mais amplo através de combinação das 12 sequências de 12 mero selecionadas (veja-se o Exemplo acima) no próprio terminal N seguidas por 125 segmentos de 36 mero previamente construídos (veja-se o exemplo acima) de uma forma combinatória. Isto criou novos 48 mero no terminal N da proteína XTEN e permitiu a avaliação do impacto de interações de maior alcance no terminal N sobre a expressão das sequências mais longas (FIG. 12). De forma semelhante aos procedimentos de dimerização utilizados para montar 36 mero (veja-se o Exemplo abaixo), os plasmídeos contendo os 125 segmentos de 36 mero selecionados foram digeridos com enzimas de restrição BbsI/Ncol e o fragmento apropriado foi purificado em gel. 0 plasmídeo a partir do clone AC94 (CBD-XTEN_AM875-GFP) foi também digerido com Bsal/Ncol e os fragmentGS apropriados foram purificados em gel. Estes fragmentos foram ligados em conjunto e transformados em células competentes de E. coli BL21 Gold(DE3) para obter colónias da biblioteca LCW0579, que também serviram como o vetor para clonagem adicional de 12 12 mero selecionados no próprio terminal N. Os plasmídeos de LCW0579 foram digeridos com Ndel/EcoRI/Bsal e os fragmentos apropriados foram purificados em gel, 12 pares de oligonucleõtidos codificando os 12 12 mero selecionados foram desenhados, anelados e ligados com o vetor LCW0579 digerido com Ndel/EcoRI/Bsal e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold (DE3) para obter colónias da biblioteca LCWQ580. Com uma diversidade teórica de 1500 clones únicos, um total de 1512 colónias individuais a partir da biblioteca criada foram escolhidas e cresceram durante a noite até à saturação em 500 μΐ de meio super broth numa placa de 96 poços fundos. Isto proporcionou uma cobertura suficiente para entender o desempenho relativo das bibliotecas e as preferências de sequências. As culturas de durante a noite saturadas foram usadas para inocular culturas novas de 500 μΐ em meio de autoindução que cresceram durante a noite a. 26 0 C. Estas culturas de expressão foram então testadas usando um leitor de placas de fluorescência (excitação 3 95 nm, emissão 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os 90 melhores clones foram sequenciados e testados novamente quanto à expressão de repórter GFP. 83 clones produziram dados de sequenciação úteis e foram utilizados para análise subsequente. Os dados de sequenciação foram utilizados para determinar os 12 mero principais que estavam presentes em cada clone e o impacto de cada 12 mero na expressão foi avaliada. Os clones LCW546_06 e LCW546_G9 ressaltaram como sendo o terminal N superior (veja-se o Quadro 17).

Quadro 17; Desempenho relativo dos clones começando com LCW546 06 e LCW459 09

A sequenciação e reteste também revelaram vários casos de replicações independentes da mesma sequência nos dados que produzem resultados semelhantes, aumentando assim a confiança no ensaio. Adicionalmente, 10 clones com 6 sequências únicas foram superiores ao clone de referência. São apresentados no Quadro 18. Notou-se que estes foram as únicas ocorrências destas sequências e que, em nenhum caso, uma destas sequências ocorreu e foi incapaz de bater o clone de referência. Estas seis sequências foram avançadas para otimização adicional.

Quadro 18: Clones de 12 mero e 36 mero combinatórios _superiores aos clones âe referência_

Exemplo 17: Construção de extensões N-terminais de XTEN -Construção e rastreio de bibliotecas de 12 mero e 36 mero combinatórias para XTEN-AM875 e XTEN-AE864

Este exemplo detalha uma etapa na otimização do terminal N da proteína XTEN para promover a iniciação da tradução para permitir a expressão de fusões de XTEN no terminal N de proteínas sem a presença de um domínio auxiliar. Com preferências para os primeiros quatro codões (veja-se Exemplos supra, e para o melhor emparelhamento de N--terminal 12 meros e 36 meros (veja-se o Exemplo supra) estabelecido, uma abordagem combinatória foi levada a cabo para examinar a união destas preferências. Isto criou 48 mero novos no terminal N da proteína XTEN e permitiram a testagem da confluência de conclusões prévias. Adicionalmente, a capacidade destas sequências líder para serem uma solução universal para todas as proteínas XTEN foi avaliada colocando os novos 4 8 mero à frente de ambos ΧΤΕΝ-ΆΕ864 e XTEN-AM875. Em vez de se utilizar todos os 125 clones do segmento de 36 mero, os piasmídeos a partir de 6 clones selecionados do segmento de 36 mero com a melhor expressão de GFP na biblioteca combinatória foram digeridos com Ndel/EcoRI/Bsal e os fragmentos apropriados foram purificados em gel. Os piasmídeos dos clones AC94 (CBD-XTEN_AM8 7 5 - GFP) e AC104 (CBD-XTEN_AE864-GFP) foram digeridos com Ndel/EcoRI/Bsal e os fragmetos apropriados foram purificados em gel. Estes fragmentos foram ligados em conjunto e transformados em células competentes de E, coli BL21 Gold(DE3) para obter colónias das bibliotecas LCW0585 ( -XTEN_AM87 5-GFP) e LCW0586 (-XTEN_AE864-GFP) , que também serviram como o vetor para clonagem adicional de 8 12 mero selecionados no próprio terminal N. Os piasmídeos de LCW0585 e LCW0586 foram digeridos com Ndel/EcoRI/Bsal e os fragmentos apropriados foram purificados em gel. 8 pares de oligonucleótidos codificando 8 sequências de 12 mero selecionadas com a melhor expressão de GFP no rastreio anterior (Geração 2) foram desenhados, anelados e ligados com os vetores LCW0585 e LCW0586 digeridos com Ndel/EcoRI/Bsal e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold (DE3) para obter colónias das bibliotecas finais LCW0587 (XTEN AM923-GFP) e LCW0588 (XTEN_AE912-GFP). Com uma diversidade teórica de 48 clones únicos, um total de 252 colónias individuais a partir das bibliotecas criadas foram escolhidas e cresceram durante a noite até à saturação em 500 μΐ de meio super broth numa placa de 96 poços fundos. Isto proporcionou uma cobertura suficiente para entender o desempenho relativo das bibliotecas e as preferências de sequências. As culturas de durante a noite saturadas foram usadas para inocular culturas novas de 500 μΐ em meio de autoindução no qual cresceram durante a noite a 26 0 C. Estas culturas de expressão foram então testadas usando um leitor de placas de fluorescência (excitação 395 nm, emissão 510 ntn) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os 36 melhores clones foram sequenciados e testados novamente quanto à expressão de repórter GFP. 36 clones produziram dados de sequenciação úteis e estes 36 foram utilizados para a análise subsequente. Os dados de sequenciação determinaram os 12 mero, o terceiro codão, o quatro codãc· e os 36 mero presentes no clone e revelaram que muitos dos clones eram replicações independentes da mesma sequência. Adicionalmente, os resultados do reteste para estes clones têm valores próximos, indicando que o processo de rastreio foi robusto. Foram observadas preferências por algumas combinações no terminal N e deram consistentemente valores de fluorescência aproximadamente 50% mais elevados do que os controlos de referência (vejam-se os Quadros 19 e 20) . Esta data apoia a conclusão de que a inclusão das sequências que codificam o XTEN N-terminal otimizado nos genes da proteína de fusão conferiu um aumento marcado na expressão das proteínas de fusão.

Quadro 19; Combinações N-terminais preferidas para XTEN- AM875

Quadro 20: Combinações N-terminais preferidas para XTEN- AE864

De forma notável, a combinação preferida do N-terminal para ο XTEN-AM875 e a combinação preferida para ο ΧΤΕΝ-ΆΕ864 não são as mesmas (Tabelas 19 e 20) , indicando interações mais complexas além de 150 bases a partir do nível de iniciação dos níveis de expressão do local. As sequências para as sequências de nucleótidos preferidas são listadas no Quadro 21 e os clones preferidos foram analisados por SDS-PAG para confirmar a expressão independentemente (veja···se a FIG. 13) . As sequências completas de XTEN__AM923 e XTEN__AE912 foram selecionadas para análise adicional.

Quadro 21; Sequências de nucleótidos de ADN preferidas para os primeiros 48 resíduos de aminoácidos da XTEN-AM875 e XTEN-AE864 M-terminal

Exemplo 18: Métodos para produzir e avaliar GHXTEN; XTKN-hGH como exemplo

Um esquema geral para produzir e avaliar composições de GHXTEN é apresentado na FIG. 6, e constitui a base para a descrição geral deste exemplo. Utilizando os métodos divulgados e aqueles conhecidos para um perito na especialidade, em conjunto com a orientação proporcionada nos exemplos ilustrativos, um perito na especialidade pode criar e avaliar uma gama de proteínas de fusão GHXTEN compreendendo, XTENs, GH e variantes de GH conhecidas na técnica. 0 Exemplo é, como tal, para ser interpretado como meramente ilustrativo e não limitativo dos métodos de qualquer forma em absoluto; numerosas variações serão aparentes para o perito na especialidade. Neste Exemplo, um GHXTEN de hormona do crescimento humano ligado a um XTEN da família de motivos ΆΕ será criado. 0 esquema geral para a produção de polinucleótidos que codificam XTEN é apresentado nas FIGS. 4 e 5. A FIG. 5 é um fluxograma esquemático de etapas representativas na montagem de uma construção de polinucleótido de XTEN numa das formas de realização da invenção. Os oligonucleôtidos individuais 501 são anelados em motivos de sequência 502, tais como um motivo de 12 aminoãcidos (”12-mero”) , que é subsequentemente ligado com um oligo contendo Bbsl e os locais de restrição Kpnl 503. As bibliiotecas de motivos podem ser limitadas a famílias de XTEN de sequência específica; por exemplo, sequências AD, AE, AF, AG, AM ou AQ do Quadro 1. Neste caso, os motivos da família AE seriam utilizados como a biblioteca de motivos, que são anelados ao 12 mero para criar um comprimento de "bloco de construção"; por exemplo, um segmento que codifica 36 aminoãcidos. O gene que codifica a sequência de XTEN pode ser montado por meio de ligação e mui timer ização dos "blocos de construção" até que o comprimento desejado do gene XTEN 504 seja alcançado. Conforme é ilustrado na FIG. 5, o comprimento de XTEN neste caso é de 48 resíduos de aminoãcidos, mas comprimentos mais longos podem ser alcançados através deste processo. Por exemplo, a multimerização pode ser realizada por ligação, extensão por superposição, montagem por PCR ou técnicas de clonagem semelhantes conhecidas na técnica. 0 gene XTEN pode ser clonado num vetor staffer. No exemplo ilustrado na FIG. 5, o vetor pode codificar uma sequência Flag 506 seguida por uma sequência staffer que está flanqueada pelos sítios

Bsal, Bbsl e Kpnl 507 e urn gene de GH (p. ex., hGI-I) 508, resultando no gene que codifica o GHXTEN 500, que, neste caso codifica a. proteína de fusão na. configuração, terminal N para C, XTEN-hGH.

As sequências de ADN que codificam GH podem ser convenientemente obtidas por procedimentos padrão conhecidos na técnica a partir de uma biblioteca de ADN preparada a partir de uma fonte celular apropriada, a partir de uma biblioteca genómica ou podem ser criados sinteticamente (por exemplo, síntese de ácidos nucleicos automatizada) utilizando sequências de ADN obtidas a partir de bases de dados publicamente disponíveis, patentes ou referências bibliográficas. Um gene ou polinucleótido que codifica a porção GH da proteína pode depois ser clonado numa construção, como aquelas descritas no presente documento, que pode ser um plasmídeo ou outro vetor sob o controlo de sequências de transcrição e tradução adequadas para expressão proteica de alto nível num sistema biológico. Um segundo gene ou polinucleótido que codifica a porção XTEN (no caso da figura 5 ilustrada como ΑΞ com 48 resíduos de aminoácidos) pode ser fundido geneticamente aos nucleôtidos que codificam o terminal N- do gene hGH, clonando-o na construção adjacente e em moldura com o gene que codifica a hGH, através de uma etapa de ligação ou multimerização. Desta forma, uma molécula de ADN quimérica que codifica (ou é complementar com) a proteínas de fusão XTEN-hGH GHXTEN poderia ser gerada dentro da construção. Opcionalmente, um gene que codifica um segundo XTEN pode ser inserido e ligado em grelha aos nucleôtidos que codificam o terminal C do gene XTEN-hGH, resultando numa construção que codifica uma proteína, de fusão XTEN-hGH-XTEN. A construção pode ser desenhada em configurações diferentes para codificar as várias permutações dos parceiros de fusão como um polipéptido monomérico. Por exemplo, o gene pode ser criado para. codificar a proteína de fusão na ordem (terminal N para C): hGH-XTEN; XTEN- hGH; hGH-XTEN- hGH; XTEN- hGH-ΧΤΕΝ; bem como multímeros das anteriores. Opcionalmente, esta molécula de ADN quimérico pode ser transferida ou clonada noutra construção que é um vetor de expressão mais apropriado. Neste ponto, uma célula hospedeira capaz de expressar a molécula de ADN quimérico poderia ser transformada com a molécula de ADN quimérico. Os vetores contendo os segmentos de ADN de interesse podem ser transferidos para uma célula hospedeira apropriada através de métodos bem conhecidos, dependendo do tipo de hospedeiro celular, conforme descrito acima.. Células hospedeiras contendo o vetor de expressão XTEN-GH poderiam ser cultivadas em meios nutritivos convencionais modificados como apropriado para ativar o promotor. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são aqueles anteriormente utilizados com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para o perito na especialidade. Depois da expressão da proteína de fusão, as células poderiam ser recolhidas por centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos e o extrato bruto resultante retido para purificação da proteína de fusão, conforme descrito abaixo. Para composições de GH.XTEN secretadas pelas células hospedeiras, o sobrenadante da centrifugação seria separado e retido para purificação adicional. A expressão génica seria medida numa amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting, Northern blotting convencionais para quantificar a transcrição de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de ADN) ou hibridação in situ, utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências proporcionadas no presente documento. Alternativamente, a expressão génica seria medida por métodos imunológicos e de fluorescência, como coloração imunohistoquímica de células para quantificar diretamente a expressão do produto génico. Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra, podem ser monoclonals ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra o polipéptido de sequência GH utilizando um pêptido sintético baseado nas sequências proporcionadas no presente documento ou contra uma sequência exógena fundida a hGH e que codifica um epítopo de anticorpo específico. Exemplos de marcadores selecionáveis são bem conhecidos para um perito na especialidade e incluem repórteres como proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) , beta-galactosidase (β-gal) ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT). 0 produto polipeptídico de ΧΤΕΝ-hGH seria purificado por métodos conhecidos na técnica. Procedimentos tais como filtração em gel, purificação por afinidade, fracionamento com sal, cromatografia de permuta iónica, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de adsorção com hidroxiapatite, cromatografia de interação hidrofóbica ou eletroforese em gel são todas técnicas que podem ser utilizadas na purificação. Métodos específicos de purificação são descritos em Robert K. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Charles R. Castor, ed., Springer-Verlag 1994, e Sambrook, et al., supra. Separações de purificação de múltiplas etapas são também descritas em Baron, et al., Crit. Rev. Biotechnol. 10:17 9-90 (1990) e Below, et al., J. Chromatogr. A. 679:67-83 (1994) .

Conforme é ilustrado na FIG. 6, as proteínas de fusão ΧΤΕΝ-hGH seriam depois caracterizadas quanto às suas propriedades químicas e de atividade. Uma proteína de fusão isolada seria caracterizada, por exemplo, quanto à sequência, pureza, massa molecular aparente, solubilidade e estabilidade utilizando métodos padrão conhecidos na técnica. A proteína de fusão que cumpre com os padrões esperados poderia então ser avaliada quanto à atividade, que pode ser medido in vitro ou in vivo medindo um dos parâmetros associados à hormona do crescimento descritos no presente documento, utilizando um ou mais ensaios divulgados no presente documento ou utilizando os ensaios dos Exemplos ou Quadro 34„

Além disso, a proteína de fusão XTEN-GH seria administrada a uma ou mais espécies animal para determinar os parâmetros farmacocinéticos padrão, conforme descrito nos Exemplos 30-32,

Através do processo interativo de produção, expressando e recuperando construções XTEN-hGH, seguido pela sua caracterização utilizando métodos divulgados no presente documento ou outros conhecidos na técnica, as composições de GHXTEN compreendendo hGH e um XTEN podem ser produzidas e avaliadas por um perito na especialidade para confirmar as propriedades esperadas como solubilidade potenciada, estabilidade potenciada, farmacocinética melhorada e imunogenicidade reduzida, conduzindo a uma atividade terapêutica global potenciada em comparação com a hGH não fundida correspondente. Para aquelas proteínas de fusão que não possuem as propriedades desejadas, uma sequência, diferente pode ser construída, expressa, isolada e avaliada através destes métodos, de modo a obter uma composição com tais propriedades.

Exemplo 19: Construção de genes e vetores de hGH ligados a

sequências K e Y XTEN

Construções de GHXTEN da série K

Um vetor da série pET foi construído com o promGtor T7, que expressa uma proteína contendo o domínio de ligação de celulose (CBD) no terminal N, seguido por um sítio de clivagem da protease do vírus Tomato Etch (TEV), seguido pela sequência de codificação de hGH e pela sequência de codificação K288: CBD-K288- hGH. A K288 tem a sequência repetitiva (GEG- GGEGGE)32. A sequência CBD utilizada é mostrada no arquivo Swissprot Q06851 e a purificação das proteínas de fusão CBD é descrita em Ofir, K. et al. (2005) Proteomics 5:1806. A sequência do local de clivagem TEV é ENLYFQ/X; G foi usado na posição X. Esta construção foi transformada em estirpe de E. coli BL21 (DE3)-star e crescida sob condições que promovem a expressão. As células foram coletadas e rompidas. 0 sobrenadante celular foi aplicado na resina de celulose com contas (Perloza 100) , lavado com tampão A (Tris a 25 tnM pH=8,0) e eluído da coluna com NaOH a 20 mM. 0 pH foi ajustado por titulação da amostra com tampão Tris a 1 M pH = 8,0. A pureza da proteína foi estimada acima de 90%. A proteína eluída foi digerida com protease de TEV purificada de um dia para o outro a 4 °C, e a amostra digerida foi aplicada a uma resina de celulose frisada (Perloza 100). 0 CBD foi mantido na coluna e o K288~hGH foi encontrado no fluxo da coluna. O fluxo combinado foi carregado na troca aniónica (Q-sepharose, Pharmacia), permuta com tampão A (Tris a 25 mM pH = 8,0) e eluído da coluna utilizando um gradiente linear raso do mesmo tampão com NaCl a 1 Μ. A proteína de fusão eluída foi reunida, dialisado contra tampão A, concentrado e purificado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) como a purificação final. A pureza da proteína foi estimada acima de 98%. A proteína final é K288-hGH. As análises de SDS PAGE das amostras ao longo do processo de purificação são mostradas na FIG. 20.

Construções de GHXTEN da série Y 0 gene que codifica hGH foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR), que introduziu os sítios de restrição Bbsl e HindIII que são compatíveis com os sítios Bbsl e HindIII que flanqueiam o stuffer no vetor de destino XTEN. 0 plasmídeo pCBD-XTEN é um derivado pET30 de Novagen no formato do domínio de ligação de celulose (CBD)-ΧΊΈΝ-Stuffer, onde Stuffer é proteína verde fluorescente (GFP) e XTEN pode ter qualquer comprimento de 36 a 576 ou superior.

As construções foram geradas substituindo uma sequência de stuffer em pCBD-XTEN pelo fragmento codificador de hGH (Fig, 7B). 0 pCBD- XTEN apresenta um promotor T7 a montante de CBD seguido por uma sequência XTEN fundida em estrutura a montante da sequência de stuffer. As sequências XTEN empregues pertencem à família XTEN_Y e codificam comprimentos que incluem 36, 72, 144, 288 e 576 aminoãcidos. 0 fragmento de stuffer foi removido por digestão por restrição utilizando as endonucleases Bbsl e HindIII. 0 fragmento de ADN de hGI-I digerido por restrição foi ligado no vetor pCBD-ΧΤΕΝ clivado utilizando T4 DMA ligase e eletroporado em BL21 (DE3) Gold (Stratagene) . Os transformantes foram rastreados pGr miniprep de ADN e a construção desejada foi confirmada por sequenciação de ADN. 0 vetor final produz o gene CBD__XTEN_hCH sob o controlo de um promotor T7. As sequências de DMA resultantes codificadas para GH ligadas a XTEN de comprimentos de 36, 72, 144 e 288 aminoãcidos, respetivamente.

Exemplo 20: Construção de genes e vetores de hGH-XTEN utilizando sequências AE e AM XTEN 0 gene que codifica hGH foi amplificado pela reaçâG em cadeia da polimerase (PCR), que introduziu os sítios de restrição Ndel e Bbsl que são compatíveis com os sítios Ndel e Bsal que flanqueiam o stuffer no vetor de destino XTEN. 0 plasmídeo pXTEN é um derivado pET30 de Novagen no formato de Stuffer-ΧΤΞΝ, onde Stuffer pode ser proteína verde fluorescente (GFP)ou CBD e XTEN pode ter qualquer comprimento de 36 a 1318 aminoãcidos ou superior (FIG. 7). As construções foram geradas substituindo uma sequência de stuffer em pXTEN pelo fragmento codificador de hGH. O pXTEN apresenta um promotor T7 a montante da sequência stuffer e uma sequência XTEN fundida em estrutura a jusante da sequência de stuffer. As sequências XTEN empregues pertencem à família AE ou AM de XTEN e codificam comprimentos que incluem 36, 72, 144, 288, 576, 864, 875 e 1318 aminoácidos. 0 fragmento de stuffer foi removido por digestão por restrição utilizando as endonucleases Ndel e Bsal, 0 fragmento de ADN de b.GH digerido por restrição foi ligado no vetor pXTSN clivado utilizando T4 DNA ligase e eletroporado em BL21 (DE3) Gold (Stratagene). Os transformantes foram rastreados por miniprep de ADN e as construções desejadas foram confirmadas por sequenciação de ADN. 0 vetor finai produz o gene de hGH-ΧΤΕΝ sob o controlo de um promotor T7 e seria utilizado para expressar uma proteína de fusão com hGI-I no terminal N.

Exemplo 21: Construção de XTEN-hGH e genes e vetores de XTEN-hGH utilizando sequências ΑΞ e AM XTEN 0 gene que codifica hGH foi amplificado pela reaçâG em cadeia da polimerase (PCR), que introduziu os sítios de restrição Bbsl e HindiII que são compatíveis com os sítios Bbsl e HindIII que flanqueiam o stuffer no vetor de destino XTEN. 0 plasmídeo pCBD-XTEN é um derivado pET30 de Novagen no formato do domínio de ligação de celulose (CBD)-XTEN-Stuffer, onde Stuffer é proteína verde fluorescente (GFP) e XTEN pode ter qualquer comprimento de 36 a 1318 ou superior (FIG. 7). As construções foram geradas substituindo uma sequência de stuffer em pCBD-XTEN pelo fragmento codificador de hGH. 0 pCBD- XTEN apresenta um promotor T7 a montante de CBD seguido por uma sequência XTEN fundida em estrutura a montante da sequência de stuffer. As sequências XTEN empregues pertencem à família XTEN_AE e XTEN_AM e codificam comprimentos que incluem 36, 72, 144, 288, 576, 864, 875 e 1318 aminoácidos. 0 fragmento de stuffer foi removido por digestão por restrição utilizando as endonucleases Bbsl e HindIII. 0 fragmento de ADN de hGH digerido por restrição foi ligado no vetor pCBD-XTEN clivado utilizando T4 DNA ligase e eletroporado em BL21 (DE3) Gold (Stratagene). Os transformantes foram rastreados por miniprep de ADN e a construção desejada foi confirmada por sequenciação de ADN. 0 vetor final produz o gene de CBD_XTEN_hGH sob o controlo de um promotor T7 e seria utilizado para expressar uma proteína de fusão com hGH no terminal N.

Exemplo 22: Construção de genes e vetores XTEN -AEhGHXTEN-AE 0 gene que codifica hGH foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR), que introduziu os sítios de restrição Bsal e HindiII que são compatíveis com os sítios Bbsl e HindlII que flanqueiam o stuffer no vetor de destino pNTS-XTEN. 0 plasmídeo pNTS-XTEN_AE é um derivado pET30 de Novagen no formato de sequência, de expressão XTEN de N-terminal de 48 aminoácidos-XTEN-Stuffer, onde Stuffer é proteína verde fluorescente (GFP) e XTEN pGde ter qualquer comprimento de 3 6 a 576 ou superior. As construções foram geradas substituindo uma sequência de stuffer em pNTS-XTEN pelo fragmento codificador de hGH. 0 pNTS-XTEN apresenta um promotor T7 a montante de NTS seguido por uma sequência XTEN fundida em estrutura a montante da sequência de stuffer. As sequências XTEN empregues pertencem à família XTEN AE e codificam comprimentos que incluem 36, 72, 144, 288, 576, 864 e 1296 aminoácidos. 0 fragmento de stuffer foi removido por digestão por restrição utilizando as endonucleases Bbsl e HindlII. 0 fragmento de ADN de hGH digerido por restrição foi ligstdo no vetor pNTS-XTEN clivado utilizando T4 DNA ligase e eletroporado em BL21 (DE3) Gold (Stratagene). Em alguns casos, uma segunda sequência XTEN_AE de 144 ou 288 aminoácidos foi ligada ao terminal C do gene codificador de hGH, cujas etapas estão ilustradas na FIG. 8. 0 gene que codifica hGH foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR), que introduziu os sítios de restrição Bsal e HindlII (com adicional Bbsl em frente de HindlII) que são compatíveis com os sítios Bbsl e HindlII que flanqueiam o stuffer no vetor de destino pNTS-XTEN. Após digestões com enzimas de restrição, ligação e transformação, o plasmídeo intermediário resultante tem o formato de pNTS-XTEN-hGH com os sítios de restrição BbsI/HindIII no terminal C de hGH. 0 plasmídeo intermediário foi ainda digerido com Bbsl e HindIII, ligado com a segunda sequência XTEN_AE de 144 ou 288 aminoácidos flanqueada por Bsal e HindIII, colocando o AE144 ou os sequências de codificação AE288 no terminal C do gene ΧΤΕΝ-hGH e transformados em ouro BL21 (DE3) . Os transformantes foram rastreados por miniprep de ADN e a construção desejada foi confirmada por sequenciação de ADN, Os vetores finais, descritas acima, rendem os genes nas configurações de NTS_XTEN_hGH ou NTS_XTEN__hGH_XTEN, sob o controlo de um promotor T7, conforme mostrado nas FIG. 7C e 7 D.

Exemplo 23: Purificação de construções GHXTENAE

Proteína de expressão

Os plasmídeos descritos acima foram transformados em estirpe BL21 (DE3) -Gold E. coli (Novagen) e plaqueados em uma placa LB-agar com os antibióticos apropriados e crescidos durante a noite a 37 °C. Uma única colónia foi. inoculada em 5 ml de meio TB125 e cresceu durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, o inoculo foi transformado em um vaso de 2 L com 500 ml de TB125 e cresceu até atingir uma OD = 0,6, seguido por crescimento contínuo a 26 °C durante 16 horas com IPTG 0,1 mM.

As células fGram recolhidas por centrifugação e o sedimento celular foi ressuspenso em 50 ml de tampão contendo Tris a 5 mM, pH 8,0, NaCl a 100 mM. As células foram rompidas usando um homogeneizador APV-2000. 0 pH do lisado foi então ajustado para pH 4,5 com ácido acético para precipitar proteínas de células hospedeiras contaminant.es e posteriormente foi clarificado por centrifugação. 0 lisado tratado com ácido clarificado foi entãG aplicado a uma coluna de cromatografia de permuta de aniões DE52 e eluído com NaCl. A fração eluída foi então acidificada até pH 4,2 e aplicada a uma coluna de cromatografia de troca de catiões MacroCAPSP. 0 produto foi eluído utilizando eluição sequencial com NaCl. Uma etapa de cromatografia adicional empregando Macroeap Q foi implementada para remover agregados relacionados ao produto e impurezas residuais da célula hospedeira (por exemplo, endotoxina, ADN, proteína de célula hospedeira). A pureza da proteína foi estimada acima de 98%. A quantidade de proteína de fusão eluída foi determinada por análise SDS-PAGE e por medição da concentração total de proteína. A elevada quantidade de proteína de fusão de GHXTEN eluída reflete o maior grau de solubilidade da proteína de fusão em relação à hGH não ligada ao XTSN (veja-se, por exemplo, Singh, S, M., et al. (2005) J Biosci

Bioeng, S9: 303; Patra, A. K. , et al. (2000) Protein Expr Purif, 18: 182), bem como a capacidade de permanecer solúvel em condições acidificadas que resultam na precipitação da proteína das células hospedeiras.

Formulação final e armazenamento

As proteínas permutadas com tampão foram então concentradas utilizando uma unidade de ultrafiltração centrífuga de 10K MWCQ Vivacell 100 a não menos de 15 mg/ml. 0 concentrado foi esterilizado por filtração usando um filtro de seringa de 0,22 um. A solução final foi dividida em alíquotas e armazenada a --80 °C.

Exemplo 24: Caracterização de construções de GHXTEN Análise de SDS-PAGE

5 ug de proteínas GHXTEN purificadas finais de GH ligadas a Y576 (qualquer terminal N ou C de Y576) foram submetidos a SDS-PAGE nãG redutor e reduzindo utilizando o NuPAGE 4-12% de gel Bis-Tris de Invitrogen de acordo com as especificações do fabricante. 0 gel resultante é mostrado na FIG. 20.

Cromatografia por exclusão de tamanho analítica A análise de cromatografia de exclusão de tamanho foi realizada utilizando uma coluna TSKGel-G4000 SWXL (7,8 mm x 30 cm), Foram separados 20 pg da proteína purificada a uma concentração de 1 mg/ml a um taxa de fluxo de 0,6 ml/min em fosfato a 20 mM pH 6,8, NaCl a. 114 mM. Os perfis de cromatograma foram monitorizados utilizando D0214 nm e DO280 nm. A ealibraçâo da coluna foi realizada utilizando um padrão de ealibraçâo por exclusão de tamanho de BioRad, os marcadores incluem tiroglobulina (670 kDa.) , globulina bovina (158 kDa), ovalbumina de frango (44 kDa) , mioglobuina equina (17 kDa) e vitamina B12 (1,35 kDa). Os perfis cromatogrãficos de Y576-GH foram gerados e demonstraram que a massa molecular aparente de cada construção é significativamente maior que o esperado para uma proteína globular, em comparação com as proteínas padrão executadas no mesmo ensaio (dados não apresentados). RP-HPLC analítica A análise de cromatografia de RP-HPLC analítica foi realizada utilizando uma coluna C4 (7,8 mm x 20 cm). A coluna foi equilibrada com 100% de AcetonNitrilo mais 0,1% de TFA na fase móvel a um fluxo de 1 ml/min. Vinte microgramas da proteína purificada, com e sem desnaturação, a uma concentração de 0,2 mg/ml foi injetada separadamente. A proteína foi separada e eluída por gradiente de revestimento dentro de 15 min desde 5% até 60% de tampão contendo H20 de grau HPLC mais TFA a 0,1%. Os perfis de cromatograma foram monitorizados utilizando D0214 nm e DO280 nm. Os perfis cromatogrãficos de Y576-GH nativos e desnaturados são mostrados como uma sobreposição na. FIG. 21.

Exemplo 25: Ensaios de ligação baseados em ELISA

As fusões XTEN para GH foram testadas em um ensaio padrão baseado em ELISA para avaliar sua capacidade de se ligar ao recetor de GH. Os ensaios foram realizados utilizando um formato ELISA em sanduíche no qual um recetor de hGH recombinante (hGHR-Fc) é revestido em poços de uma placa de ELISA. Os poços foram então bloqueados, lavados e as amostras de GHXTEN são então incubadas nos poços em diluições variáveis para permitir a captura do GHXTEN, Os poços foram lavados extensivamente e a proteína, ligada foi detetada usando uma preparação biotinilada de um anticorpo policlonal ou monoclonal anti-GH ou anti-XTEN e estreptavidina HRP. A fração de proteína ligada pode ser calculada comparando a resposta colorimétrica em cada diluição de soro com uma curva padrão de GH não modificada. Num primeiro ensaio comparando hGH ligado a K288 em comparação com hGH recombinante, os resultados, mostrados na FIG. 15, demonstram a capacidade de GHXTEN para se ligar ao recetor de hGH. Num segundo ensaio, duas configurações de GHXTEN; AM864~hGH e hGH-AM864; comparou com a hGH recombinante. Os resultados, mostrados na FIG. 16, indicam valores aparentes de CE50 para hGH nativa de 0,07 01 nM, AM864-hGH de 0,3905 e hGH-AM864 de 2,733. Num terceiro ensaio, HGH recombinante foi comparada com AE912-hGH-AE144 de modo a mostrar a capacidade de reduzir a afinidade de ligação pela adição de um XTEN C-terminal ao componente hGH de uma proteína de fusão GHXTEN e os resultados (Figura 18) demonstram uma diminuição em afinidade de ligação de aproximadamente 17 vezes em comparação com hGH.

Exemplo 26: Efeito do tratamento térmico sobre a estabilidade de hGH e GHXTEN A capacidade do XTEN de conferir estabilidade estrutural à molécula terapêutica anexada foi investigada. As amostras de hGH e AM864-h.GH foram incubadas a 25 °C e 80 °C e depois analisadas por meio de eletroforese em gel e coloração com Coomassie. A FIG. 17A é um gel de SDS-PAGE das duas preparações tratadas a 25 °C e 80 °C durante 15 minutos, enquanto que a FIG. 17B mostra a percentagem correspondente de atividade de ligação ao recetor da amostra a 80 °C em relação ao tratamento a 25 °C. Os resultados indicam que a hGH desnatura-se sob as condições de tratamento enquanto a construção GHXTEN permanece em grande parte estável nas condições experimentais, mantendo quase 80% de sua atividade de ligação ao receptor.

Conclusões: 0 componente XTEN da proteína de fusão GHXTEN confere propriedades de solubilidade e estabilidade reforçadas à proteína de fusão em comparação com a hGH não ligada ao XTEN.

Exemplo 27: Efeitos comparativos de hGH e AM864-hGH na secreção de IGF-1 A capacidade de um GHXTEN para reter a potência farmacológica foi avaliada utilizando o parâmetro medido de IGF-1 circulante em resposta ao composto administrado. A FIG. 24 mostra os efeitos da administração diária de hGH (0,071 mg/kg por dia) ou uma dose única de AM864-hGH (5 mg/kg; equivalente a 1,1 mg / kg) em níveis circulantes de IGF-1 em macacos cinotnolgos (n=4/grupo) , representado como variação percentual em relação à avaliação inicial. Os resultados mostram atividade aprimorada pela construção GHXTEN, apesar de ser administrado apenas uma vez no início a experi ênci a.

Exemplo 28: Efeitos comparativos de hGH e AM864~hGH no ganho de peso corporal A capacidade de um GHXTEN para reter a potência farmacológica foi avaliada, utilizando o parâmetro de ganho de peso corporal num rato hipox em resposta ao composto administrado. A FIG. 25 mostra os efeitos da administração de hGH ou AM864-hGH nas frequência de dose e doses indicadas no ganho de peso corporal num modelo de rato hipox. Os resultados mostram a retenção da atividade biológica pelas construções BPXTEN que é equivalente em potência a dosagem comparável à hGH, ainda com uma dosagem menos frequente. 0 aumento da dosagem de ΆΜ864-hGH levou a aumentos nos ganhos de peso corporal mostrando o aprimoramento das propriedades farmacodinãmicas do GHXTEN em comparação com a hGH nessas condições.

Exemplo 29: Efeitos comparativos de hGH e AM864-hGH na cartilagem óssea A capacidade de um GHXTEN para reter a potência farmacológica foi avaliada utilizando o parâmetro medido de aumento na largura da placa epifisária da tíbia em ratos hypox. A FIG. 26 mostra os efeitos comparativos da administração de placebo, hGH e AM864-hCH, mostrado em secções transversais histológicas da tíbia de ratos após 9 dias de tratamento, com as margens denotadas com linhas tracejadas. Os grupos são os mesmos que mostrados na Fig. 26, A FIG. 26A mostra que o grupo placebo tinha uma largura média de seção transversal de 344 ± 38,6 um da placa após 9 dias. A FIG. 26B mostra que g grupo hGH (lOpg diariamente) tinha uma largura média de seção transversal de 598 ± 8,5 pm após 9 dias. A FIG. 26C mostra que ο ΆΜ864-hGH (15 mg/kg q3d) tinha uma largura média de secção transversal de 944 ± 8,5 um após 9 dias. Os resultados mostram atividade aprimorada pela construção GHXTEN hGH em comparação com hGH, apesar de ser administrado em intervalos menos frequentes.

Exemplo 30: Análise de PK de fusões de proteína GHXTEN GH-Y576 e Y576h-GH (neste caso indicando a ordem N-C-terminal de GH e XTEN) foram injetados em macacos cinomolgos para determinar parâmetros farmacocinéticos in vivo. As composições foram proporcionadas num tampão aquoso e foram administradas por rotas intravenosas em animais separados a 0,15 mg/kg de dosagem. As amostras de soro foram recolhidas em vários pontos de tempo após a administração e analisaram as concentrações séricas das proteínas acessórias. A análise foi realizada utilizando um formato ELISA em sanduíche. Os anticorpos policlonais de coelho anti-XTEN (para XTEN de Y) foram revestidos em poços de uma placa de ELISA. As amostras de soro foram então incubadas nos poços em diluições variáveis para permitir a captura do composto pelos anticorpos revestidos. Os poços foram lavados extensivamente e a proteína ligada foi detetada utilizando uma preparação biotinilada de um anticorpo policlonal anti-XTEN e estreptavidina HRP. As concentrações de proteína sérica foram calculadas em cada ponto do tempo comparando a respGsta colorimétrica em cada diluição do soro com uma curva padrão. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados utilizando o pacote de software WinNonLin. A FIG. 22 mostra o perfil de concentração das duas construções de GH após administração intravenosa a macacos cinomolgos. Após a administração IV, a semivida foi. calculada para ser 7 horas para hGH-Y576 e 10,5 horas para Y576-hGH. Para referência, a semivida publicada de GH não modificada é bem descrita na literatura como 10-15 minutos em seres humanos adultos (veja-se, por exemplo, Hindmarch, P.C., et al. , Clinical Endocrinology (2008) 30(4): 443-450) . Os resultados mostram que a orientação (N- versus C-terminal) de hGH em relação ao XTEN não afetou a depuração das proteínas de fusão e que a adição do Y57 6 ampliou amplamente a semivida terminal da proteína de fusão.

Outro estudo farmacocinético em macacos cinomolgos foi realizado utilizando a construção AM864-hGH. A FIG. 23 mostra o perfil farmacocinético após uma dose única de 5 mg/kg de AM864-hGH administrada subcutaneamente a macacos cinomolgos, com a concentração de hGH equivalente derivada mostrada (linha tracejada).

Conclusões: O componente XTEN da proteína de fusão GHXTEN confere propriedades farmacocinéticas reforçadas à prGteína de fusão em comparação com a hGH não ligada ao XTEN, sob estas condições.

Exemplo 31: Análise de PK de polipéptidos de fusão de hGH XTEN em ratos

As proteínas de fusão GHXTEN ΆΕ 912 -hGH, AM864-hGH (sinónimoo de AM875-hGH para este e os seguintes Exemplos), AE912-hGH e AE912-hGH-AE288 foram avaliados em macacos cinomolgos com a finalidade determinar parâmetros farmacocinéticos in vivo dos polipéptidos hGHXTEN. Todas as composições foram proporcionadas num tampão aquoso e foram administradas por rota subcutânea (SC) em animais separados utilizando dGses únicas 1,5 mg/kg. As amostras de plasma foram recolhidas em vários pontos de tempo após a administração e analisaram as concentrações dos artigos de teste. A análise foi realizada utilizando um formato ELISA em sanduíche. 0 hCHR-Fc recombinante foi revestido em poços de uma placa de ELISA. Os poços foram bloqueados, lavados e amostras de plasma foram então incubadas nos poços em diluições variáveis para permitir a captura do composto pelos anticorpos revestidos. Os poçgs foram lavados extensivamente e a proteína ligada foi detetada utilizando uma preparação biotinilada de um anticorpo policlonal anti-hGH e estreptavidina HRP. As concentrações do artigo de teste foram calculadas em cada ponto do tempo comparando a resposta colorimétrica em cada diluição do soro com uma curva padrão. Os parâmetros £armacocinéticos foram calculados utilizando o pacote de software WinNonLin. A FIG. 27 mostra os perfis de concentração das quatro construções de XTEN após administração subcutânea. A semivida terminal calculada para AE912-hGH foi de 7,5 h, 6,8 h para AM864- hGH (sinónimo de AM875-hGH) , 12,4 h para AE912-hGH-AE144 e 13,1 h para AE912-hCH-AE288. Para comparação, A hGH não modificada foi executada em paralelo na mesma experiência e mostrou uma semivida plasmãtica dramaticamente mais curta.

Conclusões^ A incorporação de diferentes sequências XTEN em proteínas de fusão compreendendo hGH resulta em aumento significativo dos parâmetros farmacocinéticos para todas as quatro composições em comparação com hGH não modificada, conforme demonstrado no mGdelG de roedor nestas condições. A adição de uma segunda proteína XTEN ao termina.! C das construções AE-hGH resulta em um aumento adicional da semivida terminal em comparaçãG com as construções com um único XTEN; provavelmente devido à redução da depuração mediada pelo recetor.

Exemplo 32: Análise de PK de polipéptidos de fusão de hGH XTEN em macacos cinomolgos

Proteínas de fusão GHXTEN contendo uma ou duas moléculas XTEN (ΆΕ912-hC4H, AM864-ÚGH e AE 912 - hGH - AE14 4 ) foram avaliados em macacos cinomolgos para determinar o efeito da inclusão de um segundo XTEN nos parâmetros farmacocinéticos in vivo dos polipéptidos hGHXTEN. Todas as composições foram proporcionadas num tampão aquoso e foram administradas por rota subcutânea (SC) em animais separados utilizando dGses únicas 1,5 mg/kg. As amostras de plasma foram recolhidas em vários pontos de tempo após a administração e analisaram as concentrações dos artigos de teste. A análise foi realizada utilizando um formato ELISA em sanduíche. 0 hCHR-Fc recombinante foi revestido em poços de uma placa de ELISA. Os poços foram bloqueados, lavados e amostras de plasma, foram então incubadas nos poços em diluições variáveis para permitir a captura do composto pelos anticorpos revestidos. Os poços foram lavados extensivamente e a proteína ligada foi detetada utilizando uma preparação hiotinilada de um anticorpo policlonal anti-hGH e estreptavidina HRP. As concentrações do artigo de teste foram calculadas em cada ponto do tempo comparando a resposta colorimétrica em cada diluição do soro com uma curva padrão. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados utilizando o pacote de software WinNonLin e a FIG. 28 mostra os perfis de concentração das três construções de HGH XTEN após administração subcutânea ao longo do período de 336 b. A semivida terminal média para as proteínas de fusão foi de 33 h para AM864-hGH, 44 h para AE912-hGH e 110 h para ο AE912-hGH-AE144 (contendo dois XTEN ligados aos terminais N- e C da hGH).

Conclusões: A incorporação de diferentes sequências XTEN em proteínas de fusão compreendendo hGH resultou em aumento significativo dos parâmetros farmacocinéticos para todas as três composições, conforme demonstrado no modelo de cinomolgos nestas condições, com a construção contendo um segundo XTEN ligado ao terminal C da hGH mostrando um aumento maior do que cerca de duas vezes da semivida terminal em comparação com o GHXTEN com um único XTEN no terminal N.

Exemplo 33: Avaliação dos efeitos farmacodinâmicos de AE912-hGH-AE144 GHXTEN pela medição da resposta de IGF-1 em macacos cinomolgos AE912-hGH-AE144 foi administrado a cinomolgos SC masculino e feminino a 0,3, 1,5 e 7,5 mg/kg e volumes de dose variando desde 0,80 até 1,13 ml. Amostras de sangue (1,0 mL) foram recolhidas em tubos heparinizados pré-arrefecídos em predose, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216, 264, 336, 388, 432, 504 horas de pontos de tempo (16) e processadas no plasma. 0 PK foi medido por ensaio ELISA utilizando o anticorpo de captura anti-XTEN e o anticorpo de deteção anti-hGH biotinilado. As amostras de IGF-1 foram enviadas e analisadas pela Millipore. Os parâmetros PK foram calculados por análise utilizando o pacote de software WinNonLin e são mostrados no quadro abaixo. Os perfis de concentração plasmática das três doses de níveis de GHXTEN e IGF-1 são mostrados na FIG. 29 e a FIG. 30, respetivamente (círculos abertos= 0,3 mg./kg; quadrados == 1,5 mg/kg; triângulos = 7,5 mg/kg). Os resultados mostram que a administração de AE912-hGH-AE144 resulta em um aumento sustentado dos níveis de IGF-1, consistente com o modo de ação biológico da hormona do crescimento e a semivida plasmática longa de AE912-hGH-AE 144.

Quadro 22: Parâmetros de PK em macacos cinomolgos

Exemplo 34; Biodisponibilidade comparativa de AE912~hGH~ ΆΕ144 via administração subcutânea e intramuscular em macacos cinomolgos AE912-hGH-AE144 foi administrado a cynos SC masculino e feminino a 1,5 mg/kg por via intravenosa, subcutânea e intramuscular. Amostras de sangue (1,0 mL) foram recolhidas em tubos heparinizados pré-arrefecidos em predose, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216, 264, 336, 388, 432, 504 horas de pontos de tempo (16) e processadas no plasma. Os níveis plasmãticos em cada ponto de tempo foram medidos por ensaio ELISA utilizando o anticorpo de captura anti-XTEN e o anticorpo de deteção anti-hGH biotinilado. Os parâmetros de biodisponibilidade e PK foram calculados por análise utilizando o pacote de software WinNonLin e são mostrados no quadro abaixo. Os perfis de concentração de plasma são mostrados na FIG. 31 (círculos abertos = subcutâneo; triângulo = IV; quadrados = intramuscular). Para os cálculos de biodisponibilidade, a AUC para administração intravenosa foi definida como 100%. Os resultados mostram que AE912-hGH-AE144 mostra uma alta biodisponibilidade e distribui-se rapidamente do local da injeção para o compartimento sanguíneo após a injeção.

Quadro 23: Parâmetros de

PK em macacos cinomolgos

Exemplo 35: Determinação da janela terapêutica para ΑΞ912-hGH-AE144 A atividade específica do GHXTEN AE912-hGH-AE144 foi avaliada utilizando o parâmetro medido de ganho de peso corporal em um rato hipofisectomizadG (hipox) em resposta ao composto administrado. A FIG. 32 mostra os efeitos da administração de veículo (círculos abertos), hGH recombinante dosifiçado a 5 nmol/kg/dia (círculos fechados), o GHXTEN AE912-hGH-AE144 em doses variáveis e frequência de dose (triângulos fechados = 0,5 nmol/kg/dia; triângulos abertos = 1,5 nmol/dia; quadrados = 3 nmol/kg/Q2D) de peso corporal em ratos. Os resultados mostram que uma dose de GHXTEN AE912- hGH-AE144 tão baixa quanto 1,5 nmol/kg dia produz um crescimento comparável a hGH sozinho. Contudo, uma dose menor de 0,5 nmol/kg/dia não promove o crescimento nesses animais. Com base nos perfis farmacocinéticos determinados nos ratos, um modelo para níveis plasmáticos após a dosagem repetida foi construído como mostrado na FIG. 33 (mesmo grupos como na Figura 32). 0 modelo diferencia claramente as doses eficazes da dose menor nâo eficaz. Os resultados mostram que a concentração plasmática de AE912-hGH-AE144 geralmente deve permanecer acima de cerca de 1 nmol/L de concentração com a finalidade de manter um crescimento ótimo no modelo de rato hipofisomectomizado.

Exemplo 36s Desenhos de ensaios clínicos humanos para avaliação de GHXTEN

Os ensaios clínicos podem ser concebidos de tal forma que a eficácia e as vantagens das composições GHXTEN, em relação as hormonas biológicas correspondentes da hormona do crescimento, pode ser verificada em seres humanos. Por exemplo, as construções de fusão GHXTEN compreendendo crescimento, conforme descrito nos Exemplos acima, pode ser usado em ensaios clínicos para caracterizar a eficácia das composições. Os ensaios podem ser realizados em uma ou mais doenças, distúrbios ou condições patológicas relacionadas com a hormona do crescimento que são aprimoradas, melhorada ou inibida pela administração de hormona do crescimento. Tais estudos em pacientes adultos compreendem três fases. Em primeiro lugar, um estudo de Fase I de segurança e farmacocinética em pacientes adultos é conduzido para determinar a dose máxima tolerada e farmacocinética e farmacodinâmica em seres humanos (indivíduos normais ou pacientes com doença ou condição de crescimento), bem como para definir possíveis toxicidades e eventos adversos a serem rastreados em estudos futuros. 0 estudo é conduzido em que as únicas doses crescentes de composições de proteínas de fusão de GHXTEN são administradas e bioquímicas, PK e os parâmetros clínicos são medidos. Isso permite a. determinação da dose máxima tolerada e estabelece o limiar e concentrações máximas na dosagem e medicamento circulante que constituem a janela terapêutica para os respetivos componentes. Posteriormente, ensaios clínicos são realizados em pacientes com a doença, distúrbio ou condição patológica.

Ensaios clínicos de__fa.se II e III

Um estudo de dosagem de fase II é conduzido em pacientes onde a farmacodinâmica. da hormona do crescimento no sangue e outros parâmetros clínicos, fisiológicos, PK e segurança (como os listados abaixo) são apropriados para ensaios, como a reversão da baixa estatura devido à deficiência de GH em pacientes pediátricos, tratamento de síndrome de Turner, insuficiência renal crónica, síndrome de Prader-Willi, retardo do crescimento intra-uterino ou melhorias na composição da massa corporal (aumento da massa corporal magra, diminuição da massa gorda) em pacientes adultos (como pacientes com tumores hipofisãrios de HIV + ou adquiridos). Parâmetros e parâmetros clínicos são medidos como uma função da dosagem das composições das proteínas de fusão, produzindo informações de dose- intervalo em doses que seriam apropriadas para um posterior teste de Fase III, além de coletar dados de segurança relacionados a eventos adversos. Os parâmetros PK. estão correlacionados aos dados de parâmetros fisiológicos, clínicos e de segurança para estabelecer a janela terapêutica e o regime de dose terapêutica para a composição C4HXTEN, permitindo que o clínico estabeleça os intervalos de dose apropriados para uma composição de GHXTEN. Finalmente, um estudo de eficácia de fase III é conduzido em que os pacientes receberiam a composição de GHXTEN no regime de dose e um controle positivo (como uma hormona do crescimento aprovada comercialmente) ou um placebG é administrado diariamente ou usando outro cronograma de dosagem considerado apropriado Dadas as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da composição de controlo, com todos os agentes administrados por um período de tempo adequadamente prolongado para atingir os pontos finais do estudo. Os parâmetros que são monitorizados incluem GH, concentrações de IGF-1 e IGFBP3, mudanças em velocidade de altura, massa corporal magra, gordura corporal total, gordura do tronco, parâmetros associados a síndrome de resistência à insulina, medição de divisão e taxas de multiplicação de condrõcitos e/ou mudanças na densidade óssea e/ou crescimento ósseo; parâmetros que seriam rastreados em relação aos grupos de controlo de placebo ou positivo. Os resultados de eficácia seriam determinados utilizando métodos estatísticos padrão. A toxicidade e marcadores de eventos adversos também são seguidos neste estudo para verificar se o composto é seguro quando utilizado da maneira descrita.

Exemplo 37; Cromatografia por exclusão de tamanho de proteínas de fusão XTEN com diversas cargas úteis

As análises de cromatografia por exclusão de tamanho foram realizadas em proteínas de fusão contendo várias proteínas terapêuticas e proteínas recombinantes não estruturadas de comprimento crescente. Um ensaio exemplificative utilizou uma coluna TSKGel-G40Q0 SWXL (7,8 mm x 3 0 cm) na qua.l 4 0 μα de uma proteína de fusão de glucagon a uma concentração de 1 mg/ml foi separada a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min em fosfato a 20 mM, pH 6,8, NaCl a 114 mM. Os perfis de cromatograma foram monitorizados utilizando D0214 nm e DO280 nm. A calibração da coluna para todos os ensaios foi realizada utilizando um padrão de calibração por exclusão de tamanho de BioRad; os marcadores incluem tiroglobulina (670 kDa), globulina bovina (158 kDa), ovalbumina de frango (44 kDa), mioglobuina equina (17 kDa) e vitamina B 12 (1,35 kDa). Os perfis cromatográficos de Glucagon-Y288, Glucagon-Y144, Glucagon-Y72, Glucagon-Y36 são mostrados como uma sobreposição na FIG. 34. Os dados mostram que a massa molecular aparente de cada composto é proporcional ao comprimento da sequência de XTEN ligada. Contudo, os dados também mostram que a massa molecular aparente de cada construção é significativamente maior do que o esperado para uma proteína globular (como mostrado por comparação com as proteínas padrão testadas no mesmo ensaio). Com base nas análises de SEC para todas as construções avaliadas, incluindo composição de GHXTEN, as Massas Moleculares Aparentes, o Fator de Massa Molecular Aparente (expresso como a razão da Massa Molecular Aparente em relação à massa molecular calculada e o raio hidrodinâmico <rh em nM) são mostrados no Quadro 24. Qs resultados indicam que a incorporação de XTENs diferentes de 576 aminoãcidos ou maiores confere um peso molecular aparente para a proteína de fusão de aproximadamente 339 kDa a 760 e que XTEN de 864 aminoãcidos ou maior confere um peso molecular aparente maior que aproximadamente 800 kDA. Os resultados de aumentos proporcionais na massa molecular aparente para a massa molecular atual foram consistentes para as proteínas de fusão criadas com XTEN para várias famílias de motivos diferentes; isto ê, AD, AE, AF, AG e AM, com aumentos de pelo menos quatro vezes e razões tão altas como de cerca de 17 vezes. Adicionalmente, a incorporação de parceiros de fusão XTEN com 576 aminoãcidos ou ma is em proteínas de fusão com as várias cargas úteis (e 288 resíduos no caso de glucagon fundido em Y288) resultou com um raio hidrodinâmico de 7 nm ou superior; bastante além, do tamanho de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm.

Consequentemente, espera-se que as proteínas de fusão compreendendo crescimento e ΧΤΞΝ teriam uma eliminação renal reduzida, contribuindo para uma semivida terminal aumentada e melhorando o efeito terapêutico ou biológico em relação a uma proteína de carga útil biológica nãG fundida correspondente.

Quadro 24: Análise de SEC de vários polipéptidos

Exemplo 38: Farmacocinêtica da polipéptidos estendidos fundidos a GFP em macacos cinomolgos A farmacocinética de GFP-L288, GFP-L576, GFP- XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576 e XTEN_AD836- GFP foi testada em macacos cinomolgos para determinar o efeito da composição e comprimento dos polipéptidos não estruturados nos parâmetros de PK. Amostras de sangue foram analisadas em vários momentos após a injeção e a concentração de GFP no plasma foi medida por meio de ELISA utilizando um anticorpo policlonal contra GFP para a captura e uma preparação biotinilada do mesmo anticorpo policlonal para deteção. Os resultados são resumidos na FIG. 35. Mostram um aumento surpreendente da semivida com o aumento do comprimento da sequência de X.TEN. Por exemplo, uma semivida de 10 h foi determinada para GFP-ΧΤΕΝ L288 (com 288 resíduos de aminoãcidos no XTEN). Duplicando o comprimento do parceiro de fusão de polipéptido não estruturado para 576 aminoãcidos, aumentou a semivida para 20-22 h para construções de proteínas de fusão múltiplas; isto é, GFP-XTEN_L576, GFP- XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576. Um aumento adicional do comprimento do parceiro de fusão de polipéptido não estruturado para 836 resíduos resultou numa semivida de 72-75 h para XTEN_AD836-GFP. Consequentemente, aumentando o comprimento do polímero em 288 resíduos de 288 para 576 resíduos, aumentou a semivida in vivo cerca de 10 h. Contudo, o aumento do comprimento do polipéptido em 260 resíduos de 576 resíduos para 836 resíduos aumentou a semivida em mais de 50 h. Estes resultados mostram que existe um surpreendente limiar de comprimento de polipéptido não estruturado que resulta num ganho maior do que proporcionai na semivida in vivo. Consequentemente, espera-se que proteínas de fusão que compreendem polipéptidos não estruturados tenham a propriedade de farmacocinética melhorada em comparação com polipéptidos de comprimentos mais curtos.

Exemplo 39: Estabilidade de XTEN no soro

Uma proteína de fusão contendo XTEN ΆΕ864 fundida com o terminal N de GFP foi incubada em plasma de macaco e lisado de rim de rato durante até 7 dias a 37 °C. As amostras foram retiradas no tempo 0, Dia 1 e Dia. 7 e analisadas por SDS-PAGE seguido por deteção utilizando análise de Western e deteção com anticorpos contra GFP como mostrado na FIG. 14. A sequência de XTEN_AE864 mostrou sinais insignificantes de degradação durante 7 dias no plasma. Contudo, XTSN_AS864 foi rapidamente degradado no lisado de rim de rato ao longo de 3 dias. A estabilidade ín vivo da proteína de fusão foi testada em amostras de plasma em que GFP_AE864 foi imunoprecipitado e analisado por SDS PAGE como descrito acima. Amostras que foram retiradas até 7 dias depois da injeção mostraram muitos poucos sinais de degradação. Os resultados demonstraram a resistência de GHXTEN frente à degradação devido às proteases sérieas; um fator na potenciação das propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão de GHXTEN.

Exemplo 40: Análise PK da proteína de fusão Ex4-XTEN em múltiplas espécies a semivida humana prevista

Para determinar o perfil farmacocinético previsto em seres humanos de uma proteína terapêutica fundida em XTEN, os estudos foram realizados usando exendina-4 fundida com o AE864 XTEN como um único polipéptido de fusão. A construção Ex4-XTEN foi administrada a quatro espécies animais diferentes a 0,5-1,0 mg/kg, subcutaneamente e intravenosamente. As amostras de soro foram coletadas em intervalos após a administração, com concentrações sérieas determinadas usando métodos padrão. A semivida para cada espécie foi determinada e está tabulada no QuadrG 25. Os resultados foram utilizados para prever a semi-vida humana utilizando escalonamento alométrico da semivida terminal, volume de distribuição e taxas de depuração com base na massa corporal média. A FIG. 36A mostra um gráfico da semivida terminal medida em função da massa corporal nas espécies de animais, com um T1/2 predito num ser humano de 7 5 kg de 14 0 h, em comparação com a semivida relatada de exenatida de 2,4 h (Bond, A. Proc (Bayl Univ Med Cent) 19 (3): 281-284. (2006)). A FIG. 36B mostra a depuração do fãrmaco medida em função da massa corporal, com um valor de taxa de depuração predito de 30 ml/h num ser humano de 75 kg. A FIG 36C mostra o volume de distribuição medido em função da massa corporal, com um valor predito de 5970 ml num ser humano de 75 kg.

Conclusões: Pode-se concluir a partir dos resultados que a adição de um XTEN a um péptido regulador de glicose, tal como ex.end.ina-4, pode aumentar consideravelmente a semivida terminal em comparação com o péptido não ligado ao XTEN .

Quadro 25; Semivida de Ex4-XTEN

Exemplo 41: Aumento da solubilidade e estabilidade de uma carga útil de péptido ligando-sa a XTEN

Com a finalidade de avaliar a capacidade do XTEN para melhorar as propriedades físicas/químicas da solubilidade e estabilidade, as proteínas de fusão de glucagon mais XTEN de comprimento mais curto foram preparadas e avaliadas. Os artigos de teste foram preparados em solução salina tamponada com Tris a pH neutro e a caracterização da solução de Gcg-XTEN foi por HPLC de fase re\^ersa e cromatografia de exclusão de tamanho para afirmar que a proteína era homogénea e não agregada em solução. Os dados são apresentados no Quadro 26. Para fins comparativos, o limite de soliibilidade do glucagon não modificado no mesmo tampão foi medido a 6Q μΜ (0,2 mg/mL) e o resultado demonstra que, para todos os comprimentos de XTEN adicionados, foi conseguido um aumento substancial em solubilidade. De forma importante, na maioria dos casos, as proteínas de fusão de glucagon-XTEN foram preparadas para atingir as concentrações alvo e não foram avaliadas para determinar os limites máximos de solubilidade para a construção fornecida. Contudo, no caso do glucagon ligado ao AF-144 XTEN, o limite de solubilidade foi determinado, com o resultado de um aumento da solubilidade de 60 vezes, em comparação com um glucagon não ligado a XTEN. Além disso, o glucagon·· AF144 GHXTEN foi avaliado quanto à estabilidade, e foi encontrado estável em formulação líquida durante pelo menos 6 meses sob condições refrigeradas e por aproximadamente um mês a 37 °C (dados não mostrados).

Conclusões: Qs dados suportam a conclusão de que a ligação de polipéptidos XTEN de curto comprimento a uma proteína biologicamente ativa, como o glucagon, pode aumentar marcadamente as propriedades de solubilidade da proteína pela proteína de fusão resultante, bem como conferem estabilidade nas maiores concentrações de proteína.

Quadro 26; Solubilidade de construções de glucagon-XTEN

Exemplo 42: Caracterização da estrutura secundária da proteína de fusão XTEN A proteína de fusão Ex4-AE864 foi avaliada quanto ao grau de estrutura secundária por espectroscopia de dicroísmo circular. A espectroscopia de CD foi realizada num Jasco J-715 (Jasco Corporation, Tóquio, Japão) espetropolarímetro equipado com controlador de temperatura Jasco Peltier (TPC-348WI). A concentração de proteína foi ajustada para 0,2 mg/mL em fosfato de sódio a 20 mM pH 7,0, NaCl a 50 mM. As experiências foram realizadas utilizando células de quartzo HELLMA com um comprimento de caminho ótico de 0,1 cm. Os espectros CD foram adquiridos a 5 °, 25°, 45 0 e 65 °C e processados utilizando o J-7QQ versão 1.08.01 (Build 1) Jasco software para Windows. As amostras foram equilibradas a cada temperatura durante 5 min antes de realizar medições de CD. Todos os espectros foram registados em duplicado de 300 nm a 185 nm utilizando uma largura de banda de 1 nm e uma constante de tempo de 2 segundos, a uma velocidade de varrimento de 100 nm/rnin. 0 espetro de CD mostrado na FIG. 37 não mostra evidências de estrutura secundária estável e é consistente com um polipéptido não estruturado.

Exemplo 43; Análise de sequências para estrutura secundária por algoritmos de predição

As sequências de aminoãcidos pGderrt ser avaliadas para estrutura secundária através de determinados programas de computador ou algoritmos, tal como o bem conhecido algoritmo de Chou-Fasman (Chou, P. Y., et al. (1974)

Biochemistry, 13: 222-45) e o algoritmo de Garnier-

Osguthorpe-Robson ou método de "GQR") (Gamier J, Gibrat JF, Robson B. (1996). GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol 266:540-553). Para uma dada sequência, os algoritmos podem prever se existe alguma ou nenhuma estrutura secundária, expresso como o total e/ou a percentagem de resíduos da sequência que se forma, por exemplo, alfa-hélices ou folhas beta ou a percentagem de resíduos da sequência, prevista para resultar em formação de espirais aleatórias. Várias sequências representativas de XTEN "famílias" foram avaliadas utilizando duas ferramentas de algoritmo para os métodos Chou-Fasman e GOR para avaliar o grau de estrutura secundária nessas sequências. A ferramenta Chou-Fasman foi fornecida por William R. Pearson e pela Universidade da Virgínia, no sítio de Internet. "Biosupport", URL localizado na World Wide Web em .fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/fasta www.cgi?rm=miscl conforme existia em 19 de junho de 2009. A ferramenta GOR foi fornecida pela Pole Informatique Lyonnais no sítio da Internet Network Protein Sequence Analysis, URL localizado na World Wide Web at .npsa-pbil.ibcp.fr/cgi--bin/secpred_gor4.pi conforme existia em 19 de junho de 2008 .

Como uma primeira etapa nas análises, uma única sequência XTEN foi analisada pelos dois algoritmos. A composição AE864 é um XTEN com 864 resíduos de aminoácidos criados a partir de cópias múltiplas de quatro motivos de sequência de 12 aminoácidos que consistem nos aminoácidos G, S, T, S, P e A. Os motivos de sequência são caracterizados pelo fato de que há repetitividade limitada dentro dos motivos e dentro da sequência geral, na medida em que a. sequência de dois aminoácidos consecutivos não é repetida ma is de duas vezes em qualquer motivo de 12 aminoácidos e que não hã três aminoácidos contíguos de comprimento total, o XTEN são idênticos. As porções sucessivamente ma is .'Longas da sequência AF 864 do N- terminal foram analisadas pelos algoritmos Chou-Fastnan e GOR {o último requer um comprimento mínimo de 17 aminoãcidos), As sequências foram analisadas digitando as sequências do formato FASTA nas ferramentas de predição e executando a análise. Os resultados das análises são apresentados no Quadro 27.

Os resultados indicam que, pelos cálculos Chou-Fastnan, Os quatro motivos da família AS (Quadro 1) não possuem alfa-hélices ou folhas beta. Verificou-se que a sequência até 288 resíduos não possui hélices alfa ou folhas beta. A sequência de resíduo de 4.32 prevê ter uma pequena quantidade de estrutura secundária, com apenas 2 aminoãcidos contribuindo para uma alfa-hélice para uma percentagem global de 0,5%. 0 polipéptido AF864 de comprimento total tem, os mesmos dois aminoãcidos que contribuem para uma alfa-hélice, para uma percentagem global de 0,2%. Os cálculos para a formação aleatória da bobina revelaram que, com o aumento do comprimento, a percentagem de formação de espiral aleatória aumentou. Os primeiros 24 aminoãcidos da sequência apresentaram formação de espiral aleatória de 91%, o que aumentou com o aumento do comprimento até o valor de 99,77% para a sequência de comprimento total.

Numerosas sequências XTEN de 500 aminoãcidos ou mais das Gutras famílias motivo também foram analisadas e revelou que a maioria apresentava formação de bobina aleatória maior que 95%. As exceções eram aquelas sequências com um ou mais casos de três resíduos de serina contíguos, que resultou na formação prevista de folhas beta. Contudo, mesmo essas sequências ainda tinham aproximadamente 99% de formação de espiral, aleatória.

Ao contrário, uma sequência polipeptídica de 84 resíduos limitado a A, S e P aminoãcidos foi avaliado pelo algoritmo de Chou-Fasman, que previa um alto grau de hélices alfa previstas. A sequência, que teve várias sequências de repetição "AÃ" e "AAÃ", teve uma percentagem prevista global de estrutura de alfa-hélice de 69%. 0 algoritmo GOR previu a formação de espiral aleatória de 78,57%; muito menos do que qualquer sequência consistindo de 12 motivos de sequência de aminoãcidos constituídos pelos aminoãcidos G, S, T, E, P, analisados no presente Exemplo.

Conclusões: A análise suporta a conclusão de que: 1) 0 XTEN criado a partir de motivos de sequência múltipla de G, S, T, E, P e A, que têm uma repetitividade limitada quanto a aminoãcidos contíguos, preveem quantidades muito baixas de hélices alfa e folhas beta; 2) que aumentar o comprimento do XTEN não aumenta sensivelmente a probabilidade de formação de alfa-hélice ou folha beta; e 3) que aumentando progressivamente o comprimento da sequência XTEN por adição de 12-mers não repetitivos consistindo nos aminoãcidos G, S, T, E, p e A resultam em aumento da porcentagem de formação de espiral aleatória. Ao contrário, polipéptidos criados a partir de aminoãcidos limitados a A, S e P que têm um maior grau de repetitividade interna preveem ter uma percentagem elevada de hélices alfa, conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman, bem como a formação de espiral aleatória. Com base nas numerosas sequências avaliadas por esses métodos, conclui-se que XTEN criou a partir de motivos de sequência de G, S, T, E, P e A que têm uma repetição limitada (definida como não mais do que dois aminoácidos contíguos idênticos em qualquer motivo) superior a cerca de 400 resíduos de aminoãcidos de comprimentG, deverâG ter uma estrutura secundária muito limitada. Com a exceção de motivos contendo três serinas contíguas, acredita-se que qualquer ordem ou combinação de motivos de sequência do Quadro 1 pode ser utilizada para criar um polipéptido XTEN de um comprimento maior que cerca de 400 resíduos que resultará em uma sequência XTEN que é substancialmente desprovida de estrutura secundária. Espera-se que tais sequências tenham as características descritas nas formas de realização GHXTEN da invenção divulgadas no presente documento.

Quadro 27; Cálculos de previsão das sequências polipeptídicas de CHQU-FASMM? e GQR

Exemplo 44: Análise de sequências de polipéptidos para repetitividade

As sequências de aminoãcidos polipeptídicas podem ser avaliadas quanto à repetitividade quantificando o número de vezes que uma suhsequência mais curta aparece no polipêptido global. Por exemplo, um polipéptido de 200 residues de aminoãcidos tem 192 subsequências de 9 aminoãcidos sobrepostas (ou "quadros" de 9 meros), mas o número de subsequências exclusivas de 9 meros dependerá da quantidade de repetição dentro da sequência. Ma presente análise, diferentes sequências foram avaliadas para repetição, somando a ocorrência de todas as subsequências únicas de 3 meros para cada quadro de 3 aminoácidos nos 200 primeiros aminoácidos da porção de polímero dividida pelo número absolute de subsequências únicas de 3 meros dentro dos 200 aminoácidos sequência. 0 resultado da subsequência resultante é um reflexo do grau de repetição dentro do polipéptido.

Os resultados, mostrados no Quadro 28, indicam que os polipéptidos não estruturados que consistem em 2 ou 3 tipos de aminoácidos possuem altos índices de subsequência, enquanto que aqueles de constituídos por 12 aminoácidos motivos dos seis aminoácidos G, S, T, E, P e A com um baixo grau de repetitividade interna, tem subsequências de menos de 10, e em alguns casos, menos de 5. Por exemplo, a sequência L288 tem dois tipos de aminoácidos e tem sequências curtas e altamente repetitivas, resultando numa pontuação de subsequência de 50,0. 0 polipéptido J288 tem três tipos de aminoácidos, mas também tem sequências curtas repetitivas, resultando numa pontuação de subsequência de 33,3. Y576 também tem três tipos de aminoácidos, mas não é feito de repetições internas, refletido no resultado da subsequência de 15,7 nos primeiros 200 aminoácidos. W576 consiste em quatro tipos de aminoácidos, mas tem um maior grau de repetitividade interna, por exemplo, "GGSG”, resultando numa pontuação de subsequência de 23,4. O AD576 consiste em quatro tipos de 12 motivos de aminoácidos, cada um consistindo em quatro tipos de aminoácidos. Devido ao baixo grau de repetitividade interna dos motivos individuais, a pontuação geral da subsequência nos primeiros 200 aminoácidos é 13,6. Ao contrário, 0 XTEN composto por quatro motivos contém seis tipos de aminoácidos, cada um com um baixo grau de repetição interna tem pontuações de subsequência mais baixas; isto é, ΑΞ864 (6,1), AF864 (7,5) eAM875 (4,5).

Conclusões: Os resultados indicam que a combinação de 12 motivos de subsequência de aminoãcidos, cada um consistindo em quatro a seis tipos de aminoãcidos que são essencialmente náo repetitivos, em um polipéptido XTEN mais longo resulta em uma sequência geral que nâG é repetitiva. Isto apesar do fato de cada motivo subsequente ser usado várias vezes na. sequência. Ao contrário, os polímeros criados a partir de um menor número de tipos de aminoãcidos resultaram em maiores pontuações de subsequência, embora a sequência real po 3 í3 ci S er adaptada para reduzir o grau de repetição para resultar em menores resultados da subsequência.

Quadro 28; Cálculos de pontuação de subsequência de sequências de

po 1 ipêptidos

Exemplo 45: Cálculo de pontuações de TEPITOPE

As pontuações TEPITOPE da sequência peptídica S mero podem ser calculadas adicionando potenciais de bolso como descrito por Sturniolo [Sturniolo, T., et al. (1999) Nat

Biotechnol, 17: 555]. No presente Exemplo, As pontuações de Tepitope separadas foram calculadas para aleios HLA individuais. 0 Quadro 29 mostra como exemplo os potenciais de bolso para HLA*0101B, que ocorre em alta frequência na população caucasiana. Para calcular o escore TEPITOPE de um péptido com a sequência P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9, foram adicionados os potenciais de bolso individuais correspondentes no Quadro 29. 0 escore HLA*0101B de um péptido 9 mero com a sequência FDKLPRTSG seria a soma de 0, -1,3, Ο, 0,9, 0, -1,8, 0,09, 0, 0.

Para avaliar as pontuações de TEPITOPE para peptídeos longos, pode-se repetir o processo para todas as subsequências de 9 mero das sequências. Este processo pode ser repetido para as proteínas codificadas por outros alelos HLA. Os quadros 30-33 oferecem potenciais de bolso para os produtos proteicos de alelos HLA que ocorrem, com alta frequência na população caucasiana.

Os escores TEPITOPE calculados por este método variam de aproximadamente -10 a +10. Contudo, Os péptidos 9 mero que não possuem um aminoácido hidrofóbico (FKLMVWY ) na posição PI calcularam os escores TEPITOPE na faixa de -1009 a -989. Este valor é biologicamente sem sentido e reflete o fato de que um aminoácido hidrofóbico serve como um resíduo âncora para ligação HLA e os péptidos que não possuem um resíduo hidrofóbico em PI são considerados não aglutinantes para HLA. Como a maioria das sequências de XTEN carecem de resíduos hidrofóbicos, todas as combinações de subsequências de 9mer terão TEPlTOPEs no intervalo de -1009 a -989. Este método confirma que os polipéptidos XTEN podem ter poucos ou nenhum epítopo de células T previsto.

Quadro 29; Potencial de bolso para o alelo HLA*0101B.

Quadro 30; Potencial de bolso para o alelo HLA*Q3Q1B.

Quadro 31; Potencial de bolso para o alelo HLA*Q4Q1B,

Quadro 32; Potencial de bolso para o alelo HLA*Q701B„

Quadro 33: Potencial de bolso para o alelo HLA*1501B.

Quadro 34; Atividade biológica de exemplo, ensaios biológicos e indicações preferidas

Quadro 35; Exemplos de GHXTEN compreendendo hormonas do crescimento e XTEN único

Quadro 36; Exemplos de QHXTEN compreendendo hormonas do crescimento e duas

sequências de ΧΊΈΝ_

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição ® WO 2007103515 A [0007] ® US 6406632 B [0076] [0142] • US 7294513 B [0076] [0142] • US 4898830 A [0091] [0351] • US 20030228309 AI [0109] • WO 9852976 A [0138] • WO 02079232 A [0138] • WO 003317 A [0138] • US 5364934 A [0144] • US 5534617 A [0169] • EP 36776 A [0217] • EP 139383 A [0230] • US 4943529 A [0230] • EP 402226 A [0230] • EP 183070 A [0230] • EP 244234 A [0230] • EP 394538 A [0230] • WO 9100357 A [0230] • US 6316024 B [0243] [0245] • US 6126966 A [0243] [0245] • US 6056973 A [0243] [0244] [0245] • US 6043094 A [0243] [0245] • US 5874104 A [0244] [0245] • US 5916588 A [0244] [0245] • US 6759057 B [0245] • US 6406713 B [0245] * US 6352716 B [0245] ® US 6294191 B [0245] ® US 5965156 A [0245] ® US 52156S0 A [0245] ® US 4684479 A [0245] ® US 5186938 A [0247] ® US 6183770 B [0247] ® US 4861800 A [0247] ® US 6743211 B [0247] ® US 6945952 B [0247] ® US 4284444 A [0247] ® WO 8909051 A [0247] ® US 6715485 B [0248] ® US 3992518 A [0248] ® US 5660848 A [0248] ® US 5756115 A [0248] ® US 6890918 B [0249] ® US 6838093 B [0249] ® US 6814979 B [0249] ® US 6713086 B [0249] ® US 6534090 B [0249] ® US 6514532 B [0249] ® US 6361796 B [0249] ® US 6352721 B [0249] ® US 6294201 B [0249] ® US 6284276 B [0249] ® US 6110498 A [0249] ® US 5573776 A [0249] ® US 42000984 B [0249] ® US 4088864 A [0249] ® US 4976696 A [0250] ® US 4933185 A [0250] ® US 5017378 A [0250] ® US 6309370 B [0250] ® US 6254573 B [0250] ® US 4435173 A [0250] ® US 4398908 A [0250] ® US 6572585 B [0250] ® US 5298022 A [0250] ® US 5176502 A [0250] ® US 5492534 A [0250] ® US 5318540 A [0250] ® US 4988337 A [0250]

Documentos de não patente citados na descrição • CHAWLA, R, K. Ann. Rev. Med, 1983, vol. 34, 519 [0001] ® EDWARDS, C. K. et al. Science, 1988, vol. 239, 769 [0001] • THORNER, M. O. et al. J. Cl in. Invest., 1988, vol. 81, 745 [0001] • CALICETI. Adv Drug Deliv Rev, 2003, vol. 55, 1261-1277 [0006] • LEVITT, M et al. J Mol Bíol, 1976, vol. 104, 59 [0053] • HOPP, TP et al. Proc Natl Acad Sei USA, 1981, vol. 78, 3824 [0053] ® SAMBROOK, J. et al. Molecular Cloning: a Laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989, vol. 1-3 [0068] ® SAMBROOK, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0089] • Current protocols in molecular biology. 1987 [0089] ® Methods in Knzymology. Academic Press [00893 • PCR 2: a practical approach. Oxford University Press, 1995 [0089] ® Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0089] ® Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw-Hill, 2005 [0089] • FRESHNEY, R.I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. John Wiley & Sons, 2000 [0089] • CHANG, C. N. et al. Gene, 1987, vol. 55, 189 [0091] • GOEDDEL et al. Nature, 1919, vol. 281, 544 [0091] [0217] • GRAY et al. Gene, 1985, vol. 39, 247 [0091] • Genetics and Molecular Biology, 2003, vol. 26, 295-300 [0092] • Journal of Evolutionary Biology, 2006, vol. 19, 844-854 [0092] • ARNAU et al. Prot Expr and Purif, 2006, vol. 48, 1-13 [0107] [0165] • CHOU, P. y. et al. Biochemistry, 1974, vol. 13, 222-45 [0109] [0339] • GAMIER J; GIBRAT JF; ROBSON B. GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol, 1996, vol. 266, 540-553 [0109] • JOHANSSON, J. et al. Vaccine, 2007, vol. 25, 1676-82 [0114] • YANKAI, Z. et al. Biochem Biophys Res Commun, 2006, vol. 345, 1365-71 [0114] • HSU, C. T. et al. Cancer Res, 2000, vol. 60, 3701-5 [0114] • BACHMANN MF et al. Eur J Immunol., 19 95, vol. 25 (12), 3445-3451 [0114] • STICKLER, M. et al. J Immunol Methods, 2003, vol. 281, 95-108 [0138] • STURNIOLO, T. et al. Nat Biotechnol, 1999, vol. 17, 555- 61 [0138] • STURNIOLO, T. et al. Nature Biotechnology, 1999, vol. 17, 555 [0138] • CALICETI. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev, 2003, vol. 55, 1261-1277 [0142] • GEORGE et al. Protein Engineering, 2003, vol. 15, 871-879 [0156] • HINDMARCH, P.C. et al. Clinical Endocrinology, 2008, vol. 30 (4), 443-450 [0161] [0318] • SINGH, S. M. et al. J Biosci Bioeng, 2005, vol. 99, 303 [0166] [0306] ® PATRA, A, K, et al. Protein Expr Pur if , 2 000, vol. 18, 182 [0166] [0306] • GOODMAN; GILMAN'S. The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw-Hill, 2005 [0171] • ENGELS et al. Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 1989, vol. 28, 716-734 [0198] • GUSTAFSSON, C. et al. Trends Biotechnol, 2004, vol. 22, 346-53 [0207] • SMITH; WATERMAN. Advances in Applied Mathematics, 1981, vol. 2, 482-489 [0213] • NEEDLEMAN; WUNSCH, Journal of Molecular Biology, 1970, vol. 48, 443-453 [0213] • SMITH et al. Gene, 1988, vol. 57, 31-40 [0216] ® CHANG et al. Nature, 1978, vol. 275, 615 [0217] • GOEDDEL. Nucleic Acids Res., 1980, vol. 8, 4057 [0217] • DEBOER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 21-25 [0217] • SUMMERS et al. Virology, 1978, vol. 84, 390-402 [0218] • SUMMERS et al. Virology, 1978, vol. 84, 390-402 [0218] ® RANDAL J. KAUFMAN. Current Protocols in Molecular Biology, 1991, vol. 16, 12 [0219] • RANDALL J. KAUFMAN et al. Current Protocols in Molecular Biology 16.12. Wiley, 1991 [0220] • ARNAU et al. Protein Expression and Purification, 2006, vol. 48, 1-13 [0225] • BEACH; NURSE. Nature, 1981, vol. 290, 140 [0230] • FLEER et al. Bio/Technology, 1991, vol. S, 968-975 [0230] ® LOUVENCOURT et al. J. Bacteriol., 1983, vol. 737 [0230] • VAN DEN BERG et al. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 135 [0230] ® SREEKRISHNA et al. J. Basic Microbiol., 1988, vol. 28, 265-278 [0230] ® CASE et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, 5259-5263 [0230] • BALLANCE et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, vol. 112, 284-289 [0230] • TILBURN et al. Gene, 1983, vol. 26, 205-221 [0230] • YELTON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 1470-1474 [0230] ® KELLY; HYNES. EMBO J, 1985, vol. 4, 475-479 [0230] • C. ANTHONY. The Biochemistry of Methylotrophs, 1982, vol. 269 [0230] • THOMAS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 5201-5205 [0233] [0294] • ROBERT K. SCOPES. Protein Purification: Principles and

Practice. Springer-Verlag, 1994 [0235] [0295] • BARON et al. Grit. Rev. Biotechnol., 1990, vol. 10, 179- 90 [0235] [0295] ® BELOW et al. J. Chromatogr. A., 19 94, vol. 679, 67-83 [0235] [0295] ® Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0236] • FRANZ et al. J. Invest. Derm., 1975, vol. 64, 194-195 [0247] • OFIR, K. et al. Proteomics, 2005, vol. 5, 1806 [0299] • BOND, A. Proc (Bayl Univ Med Cent), 2006, vol. 19 (3)( 281-284 [0334] • GARNER J; GIBRAT JF; ROBSON B. GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid secruence. Methods Enzymol, 1996, vol. 266, 540-553 [0339] • STURNIOLG, T. et al. Nat Biotechnol, 1999, vol. 17, 555 [0349] ® J Endocrinol, Outubro de 2000, vol. 167 (1), 165-74 [0351] • KAREY. Cancer Res., 1988, vol. 48, 4083 [0351] • J Clin Endocrinol Me tab, novembro de 2000, vol. 85 (11), 4274-9 [0351] • Appl Physiol, 2000, vol. 89 (6), 2174-8 [0351] • Growth Horm IGF Res, Outubro de 2000, vol. 10 (5), 248-55 [0351] • norm Res, 1999, vol. 51 (1), 7-12 [0351]

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uma proteína de fusão, que compreende uma sequência de hormona do crescimento (GH) selecionada a partir de hormona do crescimento humano como mostrado no Quadro 1 e uma variante de sequência da mesma que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoãcidos da hormona do crescimento humano como mostrado no Quadro 1, em que a dita GH está ligado a um polipéptido recombinante estendido (XTEN) de pelo menos 200 resíduos de aminoácidos, em que ο XTEN ê caracterisado por: (a) a sequência XTEN compreender pelo menos 200 aminoãcidos contíguos que exibem pelo menos 90% de identidade de sequência a um comprimento comparável de uma sequência de ciminoãcidos selecionada do grupo que consiste em AE912, AE288, AD576, AE576, AE624, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AM923 e AM1318 conforme é mostrado no Quadro 3; (b) a sequências de XTEN não possuir um epítopo de células T preditG quando analisado pelo algoritmo TEPITOPE, em que a predição do algoritmo ΤΕΡΙΤ0ΡΞ para epítopos dentro da sequência XTEN é baseada numa pontuação de -6 ou superior; (c) ter uma pontuação subsequência inferior a 10; e (d) a soma de resíduos de glicina (G) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) e prolina (P) constituir mais de cerca de 90% dos resíduos de aminoácidos totais do XTEN.
2. A proteína, de fusão de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda uma segunda XTEN, em que o dito segundo XTEN compreende uma sequência de aminoãcidos que exibe pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (a) GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP; (b) GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP; (c) ΑΞ144 conforme é mostrado no Quadro 3; e (d) AE288 conforme é mostrado no Quadro 3, e em que a proteína de fusão adota uma configuração múltipla XTEN mostrada no Quadro 5,
3 . A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a proteína de fusão se liga ao(s) recetor(es) do hormona do crescimento com uma afinidade de ligação reduzida em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN, em que a afinidade de ligação é opcionalmente reduzida em pelo menos cerca de 10 vezes.
4. A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, que compreende uma sequência de aminoãcidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir do grupo que consiste em AE912--hGH, AE2 88-hCH , AD576-hGH, AE576 -hGH, AE624 -hGH, AD836-hGH , AE 8 6 4 -hGH, AF 8 6 4 -hGH, AG864- hGH, AM8 7 5 -hGH, AM923-hGH e AM1318 conforme é mostrado no Quadro 35, em que a proteína de fusão compreende opcionalmente: (i) uma sequência de aminoãcidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoãcidos selecionada, a partir de AE 912 - hGH - AE 14 4 e AE912 hGH AE288 como mostrado no Quadro 36; ou (ií) uma sequência de aminoãcidos selecionada a partir de AE912-hGH-AE144 e AE912-hGH-AE288 como mostrado no Quadro 3 6 ; OU. (i) uma sequência de aminoãcidos que tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoãcidos de AE912-hGH-AE144 como mostrado no Quadro 36.
5. A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 4, que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de ΆΕ912--hGH--AE144 ou AE912-hGH-AE288 como mostrado no Quadro 36.
6. A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 5, que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de AE912-hGH-AE144 ou AE912-hGH-AE288 como mostrado no Quadro 36.
7. Uma prGteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de hormona do crescimento humano como mostrado no Quadro 1 ligada a uma sequência de polipéptido recombinante prolongado (XTEN) com pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ΑΞ912 como mostrado no Quadro 3.
8. A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 7, que compreende ainda um segundo XTEN compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de: GT8ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPG.
9. A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, configurada de acordo com a fórmula I: (XTEN) x - GH - (XTEN) y (I) em que independentemente para cada ocorrência: (a} x é 0 ou 1; e (b) y é 0 ou 1, em que x+y>l.
10. A proteína de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada por ter uma semivida terminal mais longa quando administrada a um indivíduo em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN quando administrado a um indivíduo com uma dose molar comparável.
11, A proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizada por (i) quando uma quantidade molar menor da proteína de fusão do que a GH correspondente que não possui o XTEN é administrada a um indivíduo, a proteína de fusão atinge uma área sob a curva comparável (AUC) em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN; (ii) quando uma quantidade molar menor da proteína de fusão do que a GH correspondente que não possui o XTEN é administrada a um indivíduo, a proteína de fusão atinge um efeito terapêutico comparável com a GH correspondente que não possui o XTEN; (iii) quando a proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo utilizando um regime de dose de outra quantidade molar equivalente, a proteína de fusão atinge uma área sob a curvo, comparável (AUC) em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN; (iv) quando a proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo utilizando um regime de dose de outra quantidade molar equivalente, a proteína de fusão atinge um efeito terapêutico comparável com a GH correspondente que não possui o XTEN.
12. A proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda uma segunda XTEN, em que o dito segundo XTEN compreende uma. sequência de aminoãcidos que exibe pelo menos S0% de identidade de sequência com GTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE P S E G S A P G T S E SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEP S E G SAPGTSTEPSEGSAP GS P AG S P T S T EEGTSTEPSEGSAPG.
13. Uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 39% de identidade de sequência com a sequência de AE912-hGH-AE144 como mostrado no Quadro 3 6.
14. Uma composiçâG farmacêutica que compreende a proteína de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que a administração da referida composição a um indivíduo produz uma concentração aumentada de IGF--1 em comparação com a concentração de IGF--1 antes da dosagem.
16. Um método de produção de uma proteína de fusão que compreende hormona do crescimento humano (GH) fundida com um ou mais polipéptidos recombinantes estendidos (XTEN), compreendendo: (a) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de polinucleótido recombinante que codifica a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13; (b) cultívcir a célula hospedeira sob condições que permitem a expressão da proteína de fusão; e (c) recuperar a proteína de fusão.
17. G método de acordo com a reivindicação 16, em que: (i) a célula hospedeira é uma célula procariõtica; ou (ii) a proteína de fusão é recuperada do citoplasma da célula hospedeira sob uma forma substancialmente solúvel.
18. Uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 para utilização num método de tratamento de uma condição patológica relacionada à hormona do crescimento num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de fusão.
19. A proteína de fusão para utilização de acordo com a reivindicação 18, em que (a) a condição patológica relacionada à hormona do crescimento é selecionada a partir de deficiência de hormona do crescimento, síndrome de Turner, síndrome de Prader-Willi, insuficiência renal crónica, retardG do crescimento intrauterino, baixa estatura idiopãtica, definhamento por SIDA, obesidade, esclerose múltipla, f ibromialgia, doençat de Crohn, colite ulcerativa, distrofia muscular, baixa massa muscular, baixa densidade óssea; ou (ii) a administração de duas ou mais doses consecutivas da proteína de fusão administrada utilizando um regime de dose terapeuticamente eficaz para um indivíduo resulta num período prolongado entre picos de Cmax e/ou rebaixos Cmin consecutivos para níveis sanguíneos da proteína de fusão em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN e administrado utilizando um regime terapêutico eficaz de dose estabelecido para a GH; ou (iii) uma quantidade molar menor da proteína de fusão é administrada a um indivíduo em comparação com a GH correspondente que não possui o XTEN administrado a um indivíduo sob um regime de dose de outra forma equivalente e a proteína de fusão atinge um efeito terapêutico comparável como GH correspondente que não possui o XTEN; ou (iv) a proteína de fusão é administrada com menos frequência a um indivíduo em comparação com a GH correspondente que nâo possuí o XTEN administrado a um indivíduo usando uma dose molar equivalente de outra forma, e a proteína de fusão atinge um efeito terapêutico comparável como a GH correspondente que não possui XTEN; ou (v) o efeito terapêutico é um parâmetro de medida selecionado a partir de concentrações de IGF-1, concentração de IGFBP3, velocidade de altura, massa corporal magra, gordura corporal total, gordura do tronco, resposta ao desafio de insulina, taxa de divisão de condrócitos, números de condrõcitos, densidade óssea, crescimento ósseo e aumento na largura da placa epifísea.