PT2384339E - Tratamento de doenças autoimunes por modulação de anexina-1 (lipocortina 1) - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Tratamento de doenças autoimunes por modulação de Anexina-1 (Lipocortina 1)" 0 presente invento refere-se a métodos para tratamento de uma doença mediada por células T por modulação da actividade de Anexina-1.

As doenças autoimunes são patologias incapacitantes crónicas causadas por mau funcionamento do sistema imunitário. Na maioria dos casos são desencadeadas por uma resposta de células T descontrolada a autoantigénios apresentados no contexto de moléculas de MHC de células de apresentação de antigénio (APCs) . Têm sido descritos vários factores como estando envolvidos na patogénese de doenças autoimunes incluindo factores ambientais, genéticos e virais, com uma caracteristica primordial: a hiper-responsividade de células T.

Utilizam-se frequentemente glucocorticóides (GCs) para a terapia de uma variedade de doenças autoimunes crónicas por causa da sua capacidade para simultaneamente bloquear ambas as respostas imunitárias inatas e adaptivas. Estudos ao longo dos últimos 10 anos ou menos pelos presentes inventores e outros grupos de investigação têm mostrado que alguns dos efeitos inflamatórios de GCs sobre a resposta imunitária inata são mediados por uma proteina chamada Anexina-1 (Anx-Al). Foi provado que esta proteina exerce um controlo homeostático sobre um número de tipos de células incluindo neutrófilos, macrófagos e células endoteliais. No entanto, um aspecto que tem sido sempre negligenciado é o papel de Anx-Al na resposta imunitária adaptiva. Isto é surpreendente considerando que a Anx-Al tem sido proposta como um dos segundos mensageiros dos efeitos farmacológicos de GCs.

Os presentes inventores mostraram anteriormente que a Anx-Al desempenha um papel homeostático em células T por modulação da força de sinalização de receptores de células T (TCR) (D'Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007).

Para além disso, os inventores mostraram que níveis elevados de Anx-Al diminuem o limiar de activação de células T e favorecem a diferenciação em células Thl, enquanto ratinhos deficientes em Anx-Al exibem activação de células T comprometida e diferenciação em células Th2 aumentada (D'Acquisto et ai., Eur. J. Immunol. 37: 3131-3142, 2007). A WO 2005/027965 descreve a descoberta de um mecanismo pelo qual neutrófilos apoptóticos fornecem sinais anti-inflamatórios a células dendríticas e identifica um anticorpo que interfere com este processo. Em particular, a WO 2005/027965 descreve a identificação de Anx-1 como uma molécula de sinalização que se diz ser expressa por neutrófilos apoptóticos para inibir a activação e maturação de células dendríticas. A WO 2005/027965 propõe que um anticorpo denominado DAC5 (Detector of Apoptotic Cells Nor. 5) reconhece e bloqueia os efeitos anti-inflamatórios de Anx-1 apresentada sobre a superfície de neutrófilos apoptóticos após fagocitose por células dendríticas. A WO 2005/027965 refere-se assim à possibilidade de tratamento de várias doenças alvejando estas células apoptóticas e eliminando-as causando uma resposta inflamatória, mas não discute um papel de Anx-1 na activação de células T. A WO 2005/027965 reivindica que são expressas anexinas em células que estão a sofrer apoptose (ver por exemplo página 8, linhas 6-7 e 29-30) e que estas anexinas são apresentadas sobre a superfície destas células (ver por exemplo página 6, linhas 10-11 e página 8, linhas 16-17) . No entanto, dois estudos separados (Maderna et al., J. Immunol., 174: 3727-3733, 2005; Scannell et al., J. Immunol., 178: 4595-4605, 2007) mostraram que células apoptóticas, incluindo neutrófilos, libertam anexina-1, em vez de exprimirem a proteína e de a apresentarem sobre a superfície celular. Uma vez que a anexina-1 é libertada a partir da célula, não pode ser reivindicado que o DAC5 apenas identificaria células apoptóticas exprimindo a proteína sobre a superfície, dado que o anticorpo também identificaria anexina-1 libertada.

Além disso, WO 2005/027965 reivindica que a co-incubação de neutrófilos apoptóticos exprimindo anexina-1 sobre a sua membrana celular com células dendríticas activadas com LPS causa inibição da secreção de TNF- e regulação ascendente dos marcadores de activação CD83, CD86 e HLA-DR, e que a adição de DAC5 a esta cultura reverte os efeitos inibidores dos neutrófilos apoptóticos exprimindo anexina-1 (página 5, linha 31 à página 6, linha 8) . Dados dos presentes inventores (Huggins et al., FASEB J. 2008, no prelo) demonstram que as células dendríticas libertam Anx-1 após estimulação com LPS e assim o DAC5 descrito na WO 2005/027965 ligar-se-ia a Anx-1 externalizada sobre os neutrófilos bem como à anexina-1 libertada por células dendríticas. Adicionalmente, os presentes inventores constataram que a ausência de anexina-1 em células dendríticas causa uma expressão aumentada de marcadores de maturação/activação e produção de citoquinas inflamatórias tais como TNF- e IL-1 e IL-12. Deste modo, o anticorpo DAC5 descrito na WO 2005/027965 deveria afectar a maturação e activação de células dendríticas e assim a modulação subsequente da resposta imunitária.

Em apoio disto, os presentes inventores mostraram que a co-cultura de células dendríticas Anx-Al_/~ com células T naive numa reacção de linfócitos mistos (MLR) exibiu uma capacidade significativamente reduzida para induzir quer a proliferação de células T quer a produção de IL-2 e IFN- . Assim, agentes que bloqueiam a função de Anx-Al em células dendríticas deverão reduzir a sua capacidade para estimular uma resposta imunitária mediada por células T. Os anticorpos referidos na WO 2005/027965 não seriam por isso adequados para tratamento das doenças referidas nesse pedido de patente.

De acordo com um primeiro aspecto do invento é proporcionado um anticorpo anti-Anexina-1 (Anx-Al) ou um seu fragmento que se liga a Anx-Al para utilização no tratamento de uma doença autoimune.

Os presentes inventores mostraram anteriormente que a Anx-Al modula a força de sinalização dos receptores de células T (TCR) e que níveis elevados de Anx-Al diminuem o limiar de activação de células T e favorecem a diferenciação em células Thl. Os inventores identificaram agora o percurso de anexina, e o sinal subsequente, como um alvo para bloqueio de modo a tratar doenças mediadas por células T. Estas doenças incluem aquelas nas quais existe activação aberrante de células T, por exemplo muitas doenças autoimunes, e aquelas nas quais é desejável influenciar a diferenciação de células T a favor de células Thl em vez de Th2. 0 presente invento utiliza uma molécula de ligação especifica que se liga a Anexina-1 (Anx-Al).

As anexinas são um grupo de proteínas celulares de ligação a cálcio e fosfolípido e são também conhecidas como lipocortinas. A família da anexina tem 13 membros, incluindo Anexina Al, Anexina A2 e Anexina A5. A Anexina-Al é também conhecida como Anexina-1 e é aqui referida como "Anx-Al". A Anexina-1 (Anx-Al) é uma proteína de 37 kDa e foi originalmente descrita como um mediador das acções de glucocorticóides. Ao longo dos últimos anos a evidência tem mostrado que a Anx-Al desempenha um papel homeostático no sistema imunitário adaptivo, em particular células T, por modulação da força de sinalização de receptores de células T (TCR). A Anx-Al actua como um regulador descendente endógeno de inflamação em células do sistema imunitário inato in vivo. A Figura IA é um diagrama de fitas mostrando a estrutura tridimensional de Anx-Al.

Existem oito sequências de nucleótidos humanos que codificam Anx-Al. Destas, apenas quatro são traduzidas e assim existem quatro isoformas de Anx-Al, designadas ANXA1-002, ANXA1-003, ANXA1-004 e ANXA1-006. Estas sequências estão disponíveis no sítio web Ensembl (www.ensembl.org) e são designadas por OTTHUMT00000052664 (ANXA1-002), OTTHUMT00000052665 (ANXA1-003), OTTHUMT00000052666 (ANXA1- 004) e OTTHUMT00000052668 (ANXA1-006). As sequências de aminoácidos e de nucleótidos de uma isoforma de Anexina-1 humana (Anx-Al), ANXA1-003, são apresentadas na Figura 2a. As sequências de aminoácidos de isoformas ANXA1-002, ANXA1-004 e ANXA1-006 são apresentadas nas Figuras 2b, 2c e 2d respectivamente. Como se pode observar a partir da Figura 2, as isoformas ANXA1-002, ANXA1-004 e ANXA1-006 são quer variantes de montagem (splice) curtas de ANXA1-003 quer variantes de ANXA1-003 com um pequeno número de alterações de aminoácidos. Vários estudos mostraram que um péptido N-terminal de Anx-Al denominado Ac.2-26 actua como um substituto bioactivo da proteína inteira (ver e.g. Lim et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 14535-9, 1998). A Figura 1B é uma representação esquemática das repetições de anexina e da localização desta sequência bioactiva. 0 péptido Ac.2-26 é um péptido acetilado possuindo a sequência de resíduos de aminoácidos 2-26 da sequência de aminoácidos a todo o comprimento de Anx-Al apresentada na Figura 2. A sequência do péptido Ac.2-26 é apresentada na Figura 1C e é como se segue:

CH3CO-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK A Anx-Al e os seus péptidos bioactivos N-terminais derivados medeiam os seus efeitos biológicos através de membros da família do receptor de péptido de formilo (FPR, formyl peptide receptor). A Anx-Al exerce as suas acções contra-reguladoras sobre a extravasação de neutrófilos e imunidade inata por ligação directa e activação de um membro desta família, receptor de péptido de formilo de tipo 1 (FPRL-1, formyl peptide receptor like-1). Os presentes inventores constataram anteriormente que a estimulação de células T na presença de hrAnx-Al aumenta a activação de células T através da estimulação de FPRL-1 (D'Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007) . O presente invento utiliza uma molécula de ligação específica que se liga a Anexina-1 (Anx-Al). A Anx-Al à qual a molécula de ligação específica se liga é tipicamente Anx-Al humana possuindo a sequência de polipéptido que se mostra na Figura 2a, ou uma sua variante ou fragmento, tal como uma das isoformas de Anx-Al humana possuindo a sequência de polipéptido apresentada na Figura 2b, Figura 2c ou Figura 2d. O fragmento de Anx-Al humana ao qual a molécula de ligação específica se liga é tipicamente o polipéptido possuindo a sequência apresentada na Figura 1C. A Anx-Al à qual a molécula de ligação específica se liga é tipicamente codificada pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 2a.

Como aqui utilizado o termo "variante" refere-se a proteínas que têm uma sequência de aminoácidos similar e/ou que mantêm a mesma função. Por exemplo, o termo "variante" abrange proteínas ou polipéptidos que incluem uma ou mais adições, deleções, substituições de aminoácidos ou outras. As substituições de aminoácidos são tipicamente substituições conservativas, i.e. a substituição de um aminoácido por outro com propriedades em geral similares, tal que provavelmente o funcionamento global não é afectada seriamente.

Assim, os aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina podem muitas vezes ser substituídos uns pelos outros (aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas) . Destas substituições possíveis prefere-se que glicina e alanina sejam utilizadas para se substituírem uma pela outra (uma vez que têm cadeias laterais relativamente curtas) e que valina, leucina e isoleucina sejam utilizadas para se substituírem umas pelas outras (uma vez que possuem cadeias laterais alifáticas maiores que são hidrofóbicas). Outros aminoácidos que podem muitas vezes serem substituídos uns pelos outros incluem: fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos possuindo cadeias laterais ácidas); asparagina e glutamina (aminoácidos possuindo cadeias laterais de amida); e cisteína e metionina (aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre).

Utilizando os códigos de três letras e de uma letra os aminoácidos podem ser referidos como se segue: glicina (G ou Gly) , alanina (A ou Ala) , valina (V ou Vai) , leucina (L ou Leu), isoleucina (I ou lie), prolina (P ou Pro), fenilalanina (F ou Phe), tirosina (Y ou Tyr), triptofano (W ou Trp), lisina (K ou Lys), arginina (R ou Arg), histidina (H ou His), ácido aspártico (D ou Asp), ácido glutâmico (E ou Glu), asparagina (N ou Asn) , glutamina (Q ou Gin) , cisteína (C ou Cys) , metionina (M ou Met), serina (S ou Ser) e treonina (T ou Thr). Quando um resíduo pode ser ácido aspártico ou asparagina, podem-se utilizar os símbolos Asx ou B. Quando um resíduo pode ser ácido glutâmico ou glutamina, podem-se utilizar os símbolos Glx ou Z. Referências a ácido aspártico incluem aspartato, e referências a ácido glutâmico incluem glutamato, a não ser que o contexto especifique de outro modo.

Podem também ser efectuadas deleções ou inserções de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos da proteina referida acima. Assim, por exemplo, podem ser eliminados aminoácidos que não têm um efeito substancial sobre a actividade do polipéptido, ou pelo menos que não eliminam esta actividade. Estas deleções podem ser vantajosas uma vez que o comprimento global e o peso molecular de um polipéptido podem ser reduzidos mantendo ainda assim a actividade. Isto pode permitir reduzir a quantidade requerida de polipéptido para um propósito particular - por exemplo, os níveis de dosagem podem ser reduzidos.

Podem também ser efectuadas inserções de aminoácidos em relação à sequência da proteína de fusão acima. Isto pode ser efectuado para alterar as propriedades de uma substância (e.g. para auxiliar na identificação, purificação ou expressão).

Podem ser efectuadas alterações de aminoácido em relação à sequência apresentada acima utilizando qualquer técnica adequada e.g. utilizando mutagénese dirigida ou síntese de estado sólido.

Será de notar que podem ser efectuadas substituições ou inserções de aminoácidos utilizando aminoácidos de ocorrência natural e não de ocorrência natural. Utilizem-se ou não aminoácidos naturais ou sintéticos, prefere-se que estejam presentes apenas L-aminoácidos.

Pode-se utilizar um programa tal como o programa CLUSTAL para comparar sequências de aminoácidos. Este programa compara sequências de aminoácidos e encontra o alinhamento óptimo por inserção de espaços em qualquer das sequências como apropriado. É possível calcular a identidade ou similaridade de aminoácidos (identidade mais conservação do tipo de aminoácidos) para um alinhamento óptimo. Um programa tal como o BLASTx alinhará a extensão mais longa de sequências similares e atribuirá um valor ao ajuste. É assim possível obter uma comparação onde são encontradas várias regiões de similaridade, cada uma possuindo uma pontuação diferente. Na presente revelação são contemplados ambos os tipos de análise de identidade.

Variantes das proteínas e polipéptidos aqui descritos deverão manter a função da proteína ou polipéptido originais. Alternativamente ou adicionalmente à manutenção da função da proteína ou polipéptido originais, variantes das proteínas e polipéptidos aqui descritos possuem tipicamente pelo menos 60% de identidade (como descrito acima) com as proteínas e polipéptidos aqui descritos, em particular as sequências polipeptídicas apresentadas na Figura 1C ou na Figura 2. Tipicamente, as variantes possuem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade em relação às proteínas e polipéptidos aqui descritos, em particular as sequências polipeptídicas apresentadas na Figura 1C ou na Figura 2. A percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos é determinada por alinhamento das sequências para efeitos de comparação óptima (e.g., podem ser introduzidas lacunas na primeira sequência para melhor alinhamento com a sequência) e comparação de resíduos de aminoácido ou de nucleótidos nas posições correspondentes. O "melhor alinhamento" é um alinhamento de duas sequências que resulta na percentagem de identidade mais elevada. A percentagem de identidade é determinada pelo número de resíduos aminoácidos ou nucleótidos idênticos nas sequências que estão a ser comparadas (i.e., % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100). A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser efectuada utilizando um algoritmo matemático conhecido dos peritos na especialidade. Um exemplo de um algoritmo matemático para comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Os programas NBLAST e XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 têm incorporado um tal algoritmo. As pesquisas de nucleótido BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação (score) = 100, comprimento de palavra (wordlenght) = 12 para obter sequências de nucleótidos homólogas de moléculas de ácido nucleico. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas de moléculas de proteína. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, pode-se utilizar o Gapped BLAST como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, pode-se utilizar o PSI-Blast para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, podem-se utilizar os parâmetros por defeito dos programas respectivos (e.g., XBLAST e NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). 0 programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequências CGC tem incorporado um tal algoritmo. Outros algoritmos para análise de sequências conhecidos na especialidade incluem ADVANCE e ADAM como descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-8. No FASTA, ktup é uma opção de controlo que ajusta a sensibilidade e velocidade da pesquisa.

Numa abordagem alternativa, as variantes podem ser proteínas de fusão, incorporando porções que tornam a purificação mais fácil, por exemplo marcando eficazmente a proteína ou polipéptido desejados. Pode ser necessário remover o "marcador" ou pode dar-se o caso de a própria proteína de fusão manter funcionalidade suficiente para ser útil.

Uma "molécula de ligação específica que se liga a Anx-Al" como aqui utilizada é uma molécula que se liga com maior afinidade a Anx-Al do que a outras moléculas, i.e. que se liga especificamente a Anx-Al. Moléculas de ligação específicas que se ligam a Anx-Al incluem anticorpos anti-Anx-Al e aptâmeros. Os anticorpos anti-Anx-Al para utilização no presente invento funcionam por bloqueio da activação de células T e assim, quando administrados, podem ser utilizados no tratamento de doenças mediadas por células T, que são tipicamente causadas por activação aberrante de células T.

Anticorpos anti-Anx-Al podem ser criados, por exemplo, contra Anx-Al de humano possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2, tipicamente a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2a. Alternativamente, anticorpos anti-Anx-Al podem ser dirigidos a um epitopo particular ou epitopos de Anx-Al de humano possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2, tipicamente a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2a. Por exemplo, anticorpos anti-Anx-Al podem ser dirigidos contra um fragmento N-terminal de Anx-Al, por exemplo um fragmento N-terminal de pelo menos 188, 100, 50 ou 25 resíduos de aminoácido a partir da extremidade N da sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2a. Tipicamente, o anticorpo anti-Anx-Al para utilização no invento é um anticorpo contra o fragmento N-terminal de Anx-Al denominado Ac.2-26 e que tem a sequência que se mostra na Figura 1C, ou contra um seu fragmento de pelo menos 6 aminoácidos. Moléculas de ligação específicas que se ligam a Anx-Al incluem deste modo anticorpos anti-Anx-Al que são anticorpos contra o fragmento de Anx-Al Ac.2-26 possuindo a sequência que se mostra na Figura 1C ou um seu fragmento de pelo menos 6 aminoácidos. Nesta concretização, o anticorpo anti-Anx-Al é criado contra um fragmento da sequência que se mostra na Figura 1C que é antigénico e capaz de estimular a produção de anticorpos que, quando administrados, podem ser utilizados no tratamento de doenças mediadas por células T, que são tipicamente causadas por activação aberrante de células T.

Como afirmado acima, pode-se utilizar um subfragmento activo da sequência especificada conforme definido. Subfragmentos activos podem consistir de ou incluir um fragmento de pelo menos 6 resíduos de aminoácido contínuos (um hexapéptido) do fragmento N-terminal de Anx-Al denominado Ac.2-26 possuindo a sequência apresentada na Figura 1C, incluindo um ou mais de:

AMVSEF

MVSEFL

VSEFLK

SEFLKQ

EFLKQA

FLKQAW

LKQAWF

KQAWFI

QAWFIE

AWFIEN

WFIENE

FIENEE

IENEEQ

ENEEQE

NEEQEY

EEQEYV

EQEYVQ

QEYVQT

EYVQTV

YVQTVK

Subfragmentos activos podem consistir de ou incluir um fragmento de mais do que 6 resíduos de aminoácido contínuos do fragmento N-terminal de Anx-Al denominado Ac.2-26 possuindo a sequência apresentada na Figura 1C, por exemplo um fragmento de pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23 ou pelo menos 24 aminoácidos da sequência apresentada na Figura 1C.

Anticorpos anti-Anx-Al incluem anticorpos monoclonais e policlonais. Tipicamente, o anticorpo anti-Anx-Al é um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-Anx-Al pode ser um anticorpo disponível comercialmente, por exemplo um anticorpo policlonal de coelho ou um anticorpo monoclonal de ratinho. Tipicamente, o anticorpo anti-Anx-Al é humanizado, como descrito em detalhe abaixo.

Podem ser produzidos anticorpos monoclonais a partir de hibridomas. Estes são tipicamente formados por fusão de células de mieloma e de células de baço que produzem o anticorpo desejado de modo a formar uma linha de células imortal. Pode-se utilizar a técnica bem conhecida de Kohler & Milstein (Nature 256:495-497 (1975)) ou variações subsequentes desta técnica para produzir um anticorpo monoclonal para utilização de acordo com o invento.

Podem ser criados anticorpos policlonais por estimulação da sua produção num hospedeiro animal adequado (e.g. um ratinho, rato, porquinho-da-índia, coelho, ovelha, cabra ou macaco) por injecção de Anx-Al, ou de uma sua variante ou fragmento, no animal. Se desejado, pode-se administrar um adjuvante em conjunto com a proteína Anx-Al. Adjuvantes bem conhecidos incluem adjuvante de Freund (completo e incompleto) e hidróxido de alumínio. Os anticorpos podem depois ser purificados em virtude da sua ligação a Anx-Al. Técnicas para produzir anticorpos monoclonais e policlonais que se ligam a um polipéptido/proteína particular estão agora bem desenvolvidas na especialidade e estão descritas em livros de texto padrão de imunologia, por exemplo em Roitt et al.r Immunology, segunda edição (1989), Churchill Livingstone, London.

Para além de anticorpos inteiros, o presente invento inclui a utilização de derivados do mesmo que são capazes de se ligarem a Anx-Al como aqui descrito. Assim, o presente invento inclui a utilização de fragmentos de anticorpo e construções sintéticas. Exemplos de fragmentos de anticorpo e de construções sintéticas são fornecidos por Dougall et al. em Trends Biotechnol., 12: 372-379 (1994).

Fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, fragmentos Fab, F(ab')2 e Fv. Fragmentos Fab são descritos em Roitt et al [supra] . Fragmentos Fv podem ser modificados para produzir uma construção sintética conhecida como uma molécula Fv de cadeia simples (scFv). Isto inclui um ligador de péptido juntando de modo covalente regiões de cadeia pesada variável (VH) e de cadeia leve variável (Vl) , que contribui para a estabilidade da molécula. 0 ligador pode compreender de 1 a 20 aminoácidos, tais como por exemplo 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos, 5, 10 ou 15 aminoácidos, ou outros números intermédios no intervalo 1 a 20 conforme conveniente. O ligador de péptido pode ser formado a partir de quaisquer resíduos de aminoácido geralmente convenientes, tais como glicina e/ou serina. Um exemplo de um ligador adequado é Gly4Ser. Podem-se utilizar multímeros destes ligadores, tais como por exemplo um dímero, um trímero, um tetrâmero ou um pentâmero, e.g. (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)4 ou (Gly4Ser)s. Contudo, noutras concretizações não está presente qualquer ligador de péptido e o domínio VL está ligado ao domínio VH por uma ligação peptídica. A molécula de ligação específica pode ser um análogo de um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Por exemplo, o scFv pode ser ligado a outras moléculas de ligação específica (por exemplo outros scFv, fragmentos de anticorpo Fab e anticorpos de IgG quiméricos (e.g. com estruturas (frameworks) de humano) ) . 0 scFv pode ser ligado a outros scFv de modo a formar um multímero que é uma proteína de ligação multiespecífica, por exemplo um dímero, um trímero ou um tetrâmero. Os scFv biespecíficos são por vezes referidos por diacorpos, os triespecíficos como triacorpos e os tetraespecíficos como tetracorpos.

Um scFv pode ser preparado por qualquer técnica adequada utilizando tecnologia padrão química ou de biologia molecular. Numa concretização, os análogos de anticorpo monoclonal para utilização no invento podem ser preparados como scFv a partir de uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos naif (McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990); e como descrito na WO 92/01047) .

Outras construções sintéticas que podem ser utilizadas incluem péptidos de Região Determinante de Complementaridade (CDR). Estes são péptidos sintéticos compreendendo determinantes de ligação a antigénio. Podem-se também utilizar miméticos de péptido. Estas moléculas são usualmente anéis orgânicos restringidos em termos de conformação que mimetizam a estrutura de uma laçada de CDR e que incluem cadeias laterais interactivas com antigénio.

As construções sintéticas incluem moléculas quiméricas. Assim, anticorpos humanizados ou seus derivados estão dentro do âmbito dos anticorpos para utilização no presente invento. São bem conhecidos na especialidade métodos para humanização de anticorpos. O anticorpo pode ser humanizado modificando a sequência de aminoácidos do anticorpo. Um exemplo de um anticorpo humanizado é um anticorpo possuindo regiões de estrutura (framework) de humano, mas regiões hipervariáveis de roedor (por exemplo murinas). Modos de produção de anticorpos quiméricos são descritos por exemplo por Morrison et al. em PNAS, 81: 6851-6855 (1984) e por Takeda et al. em Nature, 314: 452-454 (1985). A humanização pode ser realizada, por exemplo, como descrito por Jones et al. em Nature, 321: 522-525 (1986); Verhoeyen et ai. em Science, 239: 1534-1536; Riechmann et ai. em Nature 332: 323-327, 1988. Métodos para reduzir a imunogenicidade das moléculas de ligação especifica para utilização no invento podem incluir enxerto de CDR sobre um andaime de estrutura de anticorpo adequado ou remodelação de resíduos de superfície variáveis, e.g. por mutagénese dirigida ou outras técnicas de biologia molecular vulgarmente conhecidas (Roguska et al. Protein Eng. 9 895-904 (1996)).

Outros métodos aplicáveis incluem a identificação de epítopos de célula T potenciais dentro da molécula, e a remoção subsequente destes e.g. por mutagénese dirigida (desimunização) . A humanização das regiões CDR da sequência de estrutura envolvente pode ser realizada como desejado.

As construções sintéticas incluem também moléculas compreendendo uma porção adicional que proporciona à molécula alguma propriedade desejável para além da ligação a antigénio. Por exemplo a porção pode ser um marcador (e.g. um marcador fluorescente ou radioactivo). Alternativamente, pode ser um agente farmaceuticamente activo. O presente invento refere-se a um anticorpo anti-Anexina-1 (Anx-Al) ou um seu fragmento que se liga a Anx-Al para utilização no tratamento de uma doença autoimune. A molécula de ligação específica que se liga a Anx-Al aqui descrita pode ser utilizada para tratar uma vasta gama de doenças que são mediadas por células T. No presente contexto, "doença mediada por células T" significa qualquer doença ou condição na qual as células T desempenham um papel na patogénese ou desenvolvimento da doença ou condição. Doenças mediadas por células T são tipicamente causadas por activação aberrante de células T. Por conseguinte, estas doenças podem ser tratadas por impedimento da activação de células T por bloqueio da actividade de Anx-Al. Tipicamente, as doenças mediadas por células T tratadas no presente invento são doenças nas quais as células Thl desempenham um papel.

Doenças mediadas por células T incluem mas não estão limitadas a doença de enxerto-versus-hospedeiro, rejeição de enxerto, aterosclerose, VIH e/ou SIDA, psoríase e algumas doenças autoimunes. 0 presente invento refere-se ao tratamento de doenças autoimunes. Doenças autoimunes que podem ser tratadas de acordo com o presente invento incluem artrite reumatóide (AR), esclerose múltipla (EM), lúpus eritematoso sistémico (LES), doença de Addison, doença de Graves, escleroderma, polimiosite, algumas formas de diabetes mellitus (por exemplo diabetes juvenil), uveo-retinite autoimune, colite ulcerosa, pênfigo vulgar, doença inflamatória do intestino, tiroidite autoimune e psoríase. A doença autoimune é tipicamente artrite reumatóide, esclerose múltipla ou lúpus eritematoso sistémico. A doença autoimune é tipicamente artrite reumatóide. Na artrite reumatóide (AR), pensa-se que as células T reconhecem e interagem com células de apresentação de antigénio no sinovium. Uma vez activadas, estas células produzem citoquinas e moléculas efectoras; esta produção expandida sequencial de citoquinas constitui a "cascata de citoquina" que resulta na activação de macrófagos e na indução do processo inflamatório, culminando na degradação e ressorção de cartilagem e osso. Ao longo do tempo, podem ocorrer a erosão óssea, a destruição de cartilagem e a perda completa de integridade da articulação. Eventualmente, podem ser afectados múltiplos sistemas de órgãos.

Noutra concretização, a doença autoimune é lúpus eritematoso sistémico (LES). Os inventores constataram agora que o ARNm e a proteína Anx-Al são expressos com níveis mais elevados em células T a partir de pacientes de LES do que em células T a partir de voluntários saudáveis.

Em relação à capacidade de Anx-Al para favorecer a diferenciação de células Thl, o presente invento pode também ser utilizado, por exemplo, para limitar respostas celulares protectoras descontroladas (Thl) contra patogénios intracelulares e para tratar a infecção extracelular (resposta de Th2) por supressão da diferenciação Thl e favorecimento da diferenciação Th2. A molécula de ligação específica que se liga a Anx-Al é tipicamente formulada para utilização com um transportador, excipiente, veículo, adjuvante e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. O presente invento abrange assim uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-Anexina-1 (Anx-Al) ou um seu fragmento para utilização no tratamento de uma doença autoimune. A composição farmacêutica compreende um anticorpo anti-Anexina-1 (Anx-Al) ou um seu fragmento e um transportador, excipiente, veículo, adjuvante e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na especialidade da farmácia, por exemplo por mistura do ingrediente activo com o transportador, excipiente, veículo, adjuvante e/ou diluente sob condições estéreis.

Transportadores, veículos, adjuvantes e/ou diluentes adequados são bem conhecidos na especialidade e incluem solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS) , carboximetilcelulose (CMC), metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), dextrose, lipossomas, poli (álcool vinílico), amido de grau farmacêutico, manitol, lactose, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glucose, sacarose (e outros açúcares), carbonato de magnésio, gelatina, óleo, álcool, detergentes, emulsionantes ou água (preferivelmente estéril). 0 anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento podem ser formulados como uma formulação líquida, que consistirá geralmente de uma suspensão ou solução do anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento num transportador ou transportadores líquidos, aquosos ou não aquosos, adequados, por exemplo água, etanol, glicerina, polietilenoglicol (PEG) ou um óleo.

Tipicamente, o anticorpo é PEGilado, i.e. ligado de modo covalente a um polietilenoglicol. Tipicamente, isto tem o efeito de reduzir a imunogenicidade e de aumentar a meia vida do referido anticorpo. 0 anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento podem ser administrados sozinhos ou em conjunto com outro agente. 0 anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento para utilização no presente invento é tipicamente administrado a um sujeito numa quantidade terapeuticamente eficaz. Uma tal quantidade é uma quantidade eficaz para atenuar, eliminar ou prevenir um ou mais sintomas de uma doença autoimune. Preferivelmente, o sujeito a ser tratado é um humano. No entanto, o presente invento é igualmente aplicável a medicina humana ou veterinária. Por exemplo, o presente invento pode encontrar utilização no tratamento de animais de companhia, tais como cães e gatos, ou animais de trabalho, tais como cavalos de corrida. 0 anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento pode ser administrado ao sujeito por quaisquer meios adequados. 0 anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento pode ser administrado sistemicamente, em particular intra-articularmente, intra-arterialmente, intraperitonealmente (i.p.), intravenosamente ou intramuscularmente. No entanto, o anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento podem também ser administrados por outras vias entéricas ou parentéricas tais como subcutânea, intradérmica, tópica (incluindo bucal, sublingual ou transdérmica), oral (incluindo bucal ou sublingual), nasal, vaginal, anal, pulmonar ou outras vias de administração apropriadas.

Composições adaptadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas ou comprimidos; como pós ou grânulos; como soluções, xaropes ou suspensões (em líquidos aquosos ou não aquoso; ou como espumas ou cremes comestíveis; ou como emulsões). Excipientes adequados para comprimidos ou cápsulas de gelatina dura incluem lactose, amido de milho ou seus derivados, ácido esteárico ou seus sais. Excipientes adequados para utilização em cápsulas de gelatina mole incluem por exemplo óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis semi-sólidos ou líquidos etc. Para a preparação de soluções e xaropes, excipientes que podem ser utilizados incluem por exemplo água, polióis e açúcares. Para a preparação de suspensões, podem-se utilizar óleos (e.g. óleos vegetais) para proporcionar suspensões de óleo-em-água ou água-em-óleo.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração transdérmica podem ser apresentadas como pensos discretos destinados a permanecer em contacto íntimo com a epiderme do recipiente durante um período de tempo prolongado. Por exemplo, o ingrediente activo pode ser entregue a partir do penso por iontoforese como geralmente descrito em Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986).

Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica podem ser formuladas como pomadas, cremes, suspensões, loções, pós, soluções, pastas, géis, pulverizações, aerossóis ou óleos. Para infecções do olho ou outros tecidos externos, por exemplo boca e pele, as composições são preferivelmente aplicadas como uma pomada tópica ou creme. Quando formulado numa pomada, o ingrediente activo pode ser utilizado com uma base de pomada guer parafínica quer miscível com água. Alternativamente, o ingrediente activo pode ser formulado num creme com uma base de creme de óleo-em-água ou uma base de creme de água-em-óleo. Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica ao olho incluem gotas oculares onde o ingrediente activo está dissolvido ou em suspensão num transportador adequado, especialmente um solvente aquoso. Composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica na boca incluem pastilhas, pastilhas moles e soluções para lavagem da boca.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração rectal podem ser apresentadas como supositórios ou enemas.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração nasal onde o transportador é um sólido incluem um pó grosseiro com um tamanho de partícula por exemplo na gama de 20 a 500 micron que é administrado por uma fungadela, i.e. por inalação rápida através da passagem nasal a partir de um recipiente do pó mantido próximo do nariz. Composições adequadas onde o transportador é um líquido, para administração como uma pulverização nasal ou como gotas nasais, incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente activo.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração por inalação incluem poeiras ou névoas de partículas finas que podem ser geradas por meio de vários tipos de aerossóis pressurizados, nebulizadores ou insufladores de dose calibrada.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverização.

Composições farmacêuticas adaptadas para administração parentérica incluem soluções estéreis para injecção, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação substancialmente isotónica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis, aquosas e não aquosas, que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Excipientes que podem ser utilizados para soluções injectáveis incluem água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. As composições podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de múltiplas doses, por exemplo ampolas fechadas e frascos para injectáveis, e podem ser armazenadas numa condição seca por congelação (liofilizada) requerendo apenas a adição do transportador liquido estéril, por exemplo águas para injecção, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões extemporâneas para injecção podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.

As composições farmacêuticas podem conter agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, edulcorantes, corantes, odorantes, sais, tampões, agentes de revestimento ou antioxidantes. Podem também conter agentes terapeuticamente activos para além do anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento. A dose do anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento a ser administrada pode ser determinada de acordo com vários parâmetros, especialmente de acordo com o anticorpo anti-Anx-Al ou seu fragmento que são utilizados; a idade, peso e condição do paciente a ser tratado; a via de administração; e o regime requerido. Um médico será capaz de determinar a via de administração e a dosagem requeridas para um paciente particular.

Esta dosagem pode ser repetida tão frequentemente quanto desejado. Se se desenvolvem efeitos secundários a quantidade e/ou frequência da dosagem podem ser reduzidas, de acordo com a prática clinica normal.

Para administração a mamíferos, e particularmente humanos, é de esperar que a dosagem diária do agente activo seja de 1 pg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, tipicamente à volta de 10 pg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Em qualquer caso, o médico determinará a dosagem real que será a mais adequada para um indivíduo que estará dependente de factores incluindo a idade, peso, sexo e resposta do indivíduo. As dosagens acima são exemplificativas de um caso médio. Obviamente que podem existir casos nos quais são necessárias dosagens mais elevadas ou mais baixas, e estas estão dentro do âmbito do invento.

Num segundo aspecto do invento, é proporcionada a utilização de um anticorpo anti-Anx-Al ou um seu fragmento que se liga a Anx-Al no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune.

Particularidades preferidas para o segundo e terceiro aspectos do invento são como para o primeiro aspecto mutatis mutandis. 0 invento será agora adicionalmente descrito por referência aos Exemplos e Figuras seguintes que são fornecidos para os propósitos apenas de ilustração e não devem ser entendidos como limitantes do invento. É feita referência a um número de Figuras, nas quais: A Figura IA é um diagrama de fita da estrutura de anexina- 1 mostrando as quatro repetições de anexina e o domínio N-terminal. A Figura 1B é uma representação esquemática das repetições de anexina e da localização da sequência bioactiva, péptido de Anexina-1 Ac.2-26. A Figura 1C mostra a sequência de aminoácidos do péptido Ac.2-26, que é um fragmento de péptido N-terminal de Anx-Al.

A Figura 2a mostra (i) a sequência de aminoácidos e (ii) a sequência de nucleótidos de Anexina-1 humana (Anx-Al), isoforma ANXA1-003. A Figura 2b mostra a sequência de aminoácidos de Anexina-1 de humano (Anx-Al), isoforma ANXA1-002. A Figura 2c mostra a sequência de aminoácidos de Anexina-1 de humano (Anx-Al), isoforma ANXA1-004. A

Figura 2d mostra a sequência de aminoácidos de Anexina-1 de humano (Anx-Al), isoforma ANXA1-006. A Figura 3 mostra o efeito de Anexina-1 recombinante de humano (hrAnx-Al) na activação de células T. 0 pré-tratamento de células primárias CD4+ naive murinas com hrAnx-Al seguido por activação com diferentes concentrações de anti-CD3/CD28 aumentou a proliferação celular (Figura 3A), a produção de IL-2 (Figura 3B) e a expressão na superfície celular de CD25 e CD69 (Figuras 3C e 3D) . A Figura 4 mostra que a Anx-Al endógena modula a proliferação de células T. A estimulação de células T Anx-Al+/+ ou Anx-Al_/~ com anti-CD3, anti-CD3/CD28 ou PMA/Ionomicina mostrou uma velocidade de diminuição de incorporação de 3H-timidina (Figuras 4A, 4B e 4C, respectivamente) e de produção de IL-2 (Figura 4D) nas células T deficientes em Anx-Al em comparação com células T não estimuladas de controlo. A Figura 5 mostra a activação de Proteína Activadora-1 (AP-1), Factor Nuclear- B (NF- B) e Factor Nuclear < Células T Activadas (NFAT) na presença ou na ausência de Anx-Al (Figura 5A), e uma comparação da activação de AP-1, NF- B e NFAT em células T Αηχ-Αΐ e Anx-Al_/_ (Figura 5B) . A Figura 6A mostra a análise FACS da expressão de FPRL-1 em células T estimuladas com antÍ-CD3/CD28 (5,0 pg/ml) para os tempos indicados. A Figura 6B mostra a localização celular de Anx-Al em células T antes (Controlo) ou após estimulação com anti-CD3/CD28 (5,0 pg/ml). A Figura 6C é uma representação esquemática do papel do sistema Anx-Al/FPRL-1 em células T. A Figura 7 mostra que a Anx-Al exógena e endógena modula a diferenciação Thl/Th2. A Figura 7A mostra os resultados quando células T de nódulo linfático naive foram diferenciadas in vitro em condições Thl (barras a preto) ou Th2 (barras a branco) na presença ou na ausência de hrAnx-Al e depois outra vez estimuladas com anti-CD3 ligado à placa para medir a produção de citoquina Thl ou Th2. A Figura 7B mostra os resultados quando células T de nódulo linfático naive a partir de ratinhos Anx-Al+/+ ou Anx-Al~/~ foram diferenciadas in vitro em condições Thl (primeiro e segundo gráficos de colunas a partir da esquerda) ou Th2 (terceiro e quarto gráficos de colunas a partir da esquerda) e depois outra vez estimuladas com anti-CD3 ligado à placa para medir a produção de citoquina Thl ou Th2. A Figura 8 mostra o volume da pata (Figura 8A) e a pontuação clínica (Figura 8B) de ratinhos DBA tratados com PBS ou hrAnx-Al durante 12 dias durante a fase de imunização do modelo de artrite induzida por colagénio (CIA) . A Figura 8C é uma análise da expressão de Anx-Al em células CD4+ de voluntários de controlo saudáveis (HC) ou de pacientes de artrite reumatóide (AR) . A Figura 8D mostra uma análise imuno-histoquímica da expressão de Anx-Al em tecido sinovial a partir de pacientes de AR. A Figura 9 mostra os efeitos de hrAnx-Al a todo o comprimento e do péptido N-terminal Ac.2-26 na activação de células T. A Figura 10 mostra a expressão de Anx-Al em placas ateroscleróticas de humano. Análise imuno-histoquímica da expressão de Anx-Al com anticorpo IB monoclonal de ratinho anti-Anx-Al humana (Figura 10A) ou com IgG não imune (Figura 10B) e placas ateroscleróticas de carótida removidas de pacientes durante cirurgia de endarterectomia carotídea. As fotografias são de um único paciente e representativas de seis pacientes diferentes com condições similares. A Figura 11 mostra a expressão de Anx-Al em placas ateroscleróticas de murino. A Figura 11 mostra a visualização por imunofluorescência de Anx-Al no seio aórtico de ratinhos ApoE-/~ (Figura 11A e Figura 11B) e na artéria braquiocefálica (Figura 11C) . As secções foram coradas com Dapi para localizar os núcleos. Os resultados ilustrados são de uma única experiência e são representativos de três experiências separadas. Ampliação original: x 200 (Figura 11A e Figura 11B), x 400 (Figura 11C) . A Figura 12 mostra a expressão de Anexina-1 em pacientes de Lúpus Eritematoso Sistémico (LES). Análise por RT-PCR (painel superior) e Western Blot (painel inferior) da expressão de Anx-Al em células T a partir de indivíduos saudáveis (Controlo) ou de pacientes de Lúpus Eritematoso Sistémico (LES). Os números na Figura indicam o volume (μΐ) de ADNc ou a quantidade (pg) de proteínas obtidas a partir do mesmo número (2 x 106) de células T colhidas a partir de indivíduos saudáveis (Controlo) ou de pacientes de Lúpus Eritematoso Sistémico (LES). A Figura 13 mostra a inibição de activação do receptor de células T (TCR), medida em termos de produção de interleucina-2 (IL-2), em células T periféricas de humano a partir de um dador, incubadas com um anticorpo monoclonal neutralizante criado contra anexina-1 recombinante de humano (mAblA anti-AnxAl). A Figura 14 mostra a inibição de activação do receptor de células T (TCR), medida em termos de produção de interleucina-2 (IL-2), em células T periféricas de humano a partir de um dador diferente, incubadas com um anticorpo monoclonal neutralizante criado contra anexina-1 recombinante de humano (mAblA anti-AnxAl). A Figura 15 mostra secções de medula espinal a partir de ratinhos C57BL/6 imunizados com MOG35-55 e CFA e dos quais se removeram as medulas espinais ao dia 12 (pontuação 0), dia 18 (pontuação 2) e dia 20 (pontuação 4). As secções foram coradas com hematoxilina e eosina (H&amp;E, Figura 15A) ou anti-AnxAl (Figura 15B) . Para cada coloração, os painéis à direita (20X) mostram uma maior ampliação de uma área dos painéis à esquerda (4X). Resultados representativos de 3 experiências. A Figura 16 mostra secções de medula espinal a partir de ratinhos C57BL/6 imunizados com MOG35-55 e CFA e dos quais se removeram as medulas espinais ao dia 20 (pontuação 4). As secções foram coradas com anti-AnxAl e anti-CD3 (A) ou anti-F4/80 (B). Os painéis à direita mostram uma sobreposição das duas colorações simples à direita. Resultados representativos de 3 experiências. A Figura 17 mostra os resultados de um estudo no qual ratinhos C57BL/6 foram imunizados com MOG35-55 e CFA e monitorizados diariamente quanto a sinais e sintomas de EAE (A) ou ganho/perda de peso (B) durante 23 dias. Os resultados são médias ± SEM (n = 10/grupo) . ** p<0,01, representativos de 3 experiências. A Figura 18 mostra a incorporação de 3H-timidina (A) e a produção de IL-2 (B) de células de nódulo linfático obtidas a partir de ratinhos AnxAl+/+ e AnxAl-/~ imunizados com MOG35-55 e CFA e sacrificados após 14 dias. As células foram estimuladas com MOG35-55 durante 48 horas e pulsadas com 1 μΟί de 3H-timidina durante 12 horas. Utilizaram-se os sobrenadantes celulares para medir a produção de IL-2. Os resultados são médias ± SEM (n = 4/grupo) . * p<0, 05, ** p<0,01, representativos de 3 experiências. A Figura 19 mostra o número total de células de baço (A) e de nódulo linfático (B) obtidas a partir de ratinhos AnxAl+/+ e AnxAl~/_ imunizados com MOG35-55 e CFA e sacrificados após 14 dias. C e D mostram a análise cito-fluorimétrica de células de nódulo linfático com anti-CD4 FITC e anti-CD8 PE. Os resultados são médias ± SEM (n = 10/grupo). ** p<0,01, representativos de 3 experiências. A Figura 20 mostra os níveis de (A) IFN- , (B) IL-2, (C) TNF- e (D) IL-17 nos sobrenadantes celulares de células de nódulo linfático obtidas a partir de ratinhos Anx-Al+/+ e Anx-Al_/_ imunizados com MOG35-55 e CFA e sacrificados após 14 dias. As células foram estimuladas com a concentração indicada de MOG35-55 durante 4 dias e os sobrenadantes foram utilizados para ELISA de citoquina.

Os resultados são médias ± SEM (n = 4/grupo). * p<0,05, ** p<0,01, representativos de 3 experiências.

A Figura 21 mostra a coloração com hematoxilina-eosina de secções de medula espinal obtidas a partir de ratinhos Anx-Al+/+ (A) e Anx-Al~/_ (B) imunizados com MOG35-55 e CFA e sacrificados após 22 dias. Para cada coloração, os painéis à direita (20X) mostram uma maior ampliação de uma área dos painéis à esquerda (4X) . Secções consecutivas foram coradas com anti-CD3 (C) ou anti-F4/80 (D) . As imagens são representativas de três experiências separadas com resultados similares. A Figura 22 mostra a análise FACS de células mononucleares positivas CD3 (A) e F4/80 (B) recuperadas por gradiente de Percoll de homogeneizados de medula espinal obtida a partir de ratinhos Anx-Al+/+ e Anx-Al_/_ imunizados com MOG35-55 e CFA e sacrificados após 14 dias. As representações de pontos e histogramas são de um único ratinho e representativas de 2 experiências com n = 4 ratinhos. Os números nos histogramas indicam a percentagem de células CD3+ e F4/80+.

Exemplos 1 a 10

Materiais e Métodos

Reagentes

Anti-CD3 de ratinho (clone 145-2C11), anti-CD28 de ratinho (clone 37.51), anti-CD3 de humano (clone OKT3), anti-CD28 de humano (clone CD28.2), anti-CD69 conjugado com PE (clone H1.2F3), anti-CD25 conjugado com FITC (clone PC61.5), IL-2 de murino, IL-4, IFN- , IL-12, anti-IL-4 (clone 11B11) e anti-IFN- (clone XMG1.2) foram comprados na eBioscience (Wembley, Reino Unido). Anx-Al recombinante de humano (hrAnx-Al) isenta de endotoxina foi preparada como descrito. Em algumas experiências, utilizámos hrAnx-Al desnaturada (inactivada por calor a 95°C durante 5 minutos) como controlo positivo. A não ser que especificado de outro modo, todos os outros reagentes foram da Sigma-Aldrich (St Louis, MO).

Ratinhos

Ratinhos macho BALB/C, C57/BL6 e DBA/1 foram obtidos nos Laboratórios Charles River (Wilmington, MA). Ratinhos BALB/C nulos em Anexina 1 foram gerados no nosso laboratório e criados em condições isentas de patogénios nas nossas instalações para animais. Todos os ratinhos utilizados nestes estudos tinham entre 6 e 8 semanas de idade. 0 trabalho com os animais foi realizado de acordo com a regulamentação do United Kingdom Home Office (Guidance on the Operation of Animals, Scientific Procedures Act 1986) e segundo as directivas da União Europeia.

Isolamento de células a partir de pacientes

Prepararam-se células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) a partir de sangue periférico utilizando centrifugação de densidade de Ficoll (Ficoll-Paque Plus; Amersham Biosciences, Freiburg, Alemanha). Seleccionaram-se células CD4+ a partir de sangue periférico utilizando selecção positiva. Resumidamente, sangue periférico foi submetido a centrifugação de densidade de Ficoll (Ficoll-Paque Plus; Amersham Biosciences). As células aderentes foram removidas das células mononucleares por aderência a plástico revestido com soro. Incubaram-se as células não aderentes com anticorpo de ratinho anti-CD4 humano (RFT4), lavaram-se em tampão (solução salina tamponada com fosfato [PBS], 0,5% de albumina de soro de bovino [BSA], EDTA 2 mM pH 7,2) e incubaram-se com anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado a pérolas magnéticas (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) . Fizeram-se passar as células através de uma coluna MACS (Miltenyi Biotec) e colheram-se as células CD4+. A pureza das células foi avaliada por citometria de fluxo. A percentagem mediana de células CD3+ CD4+ após as 10 depleções era 98% (amplitude, 97%-99,3%). Ressuspenderam-se as células restantes em tampão de lise (Ambion, Huntingdon, Reino Unido).

Cultura de células Células T murinas primárias foram preparadas a partir de nódulos linfáticos por selecção negativa. Resumidamente, nódulos linfáticos axilares, inguinais e mesentéricos foram despedaçados para produzir uma suspensão de células individuais, depois lavaram-se e depuseram-se sobre Ficoll. Lavou-se a buffy coat 2 vezes e depois incubou-se com a mistura de anticorpos e as pérolas magnéticas seguindo as instruções do fabricante (kit de isolamento negativo de células T de ratinho; Dynal, Bromborough, Reino Unido). Em algumas experiências, as células foram adicionalmente purificadas para obter células T CD62L+ CD4+ naive utilizando o kit de isolamento de células T CD62L+ CD4+ Miltenyi Biotec. As condições ThO foram criadas por células T durante 4 dias em placas de 6 poços pré-revestidas com anti-CD3 (5 pg/mL) e anti-CD28 (5 pg/mL) em meio RPMI completo (10% de soro fetal de vitelo [FCS] , L-glutamina 2 mM e 100 unidades de gentamicina mL_1) contendo IL-2 de murino (20 U/mL). As condições Thl foram criadas com IL-12 de murino (3,4 ng/mL; eBioscience), IL-2 (20 U/mL; eBioscience) e anti-IL4 (clone 11B11; 2 pg/mL). As condições Th2 foram criadas com IL-4 (3000 U/mL; Peprotech, Rocky Hill, NJ), IL-2 (20 U/mL) e anti-IFN- (clone XMG1.2; 2 pg/mL). As células Jurkat foram obtidas na ATCC (Manassas, VA) e foram cultivadas em meio RPMI completo.

Análise de citometria de fluxo Células T de nódulo linfático purificadas foram pré-tratadas com Anx-Al recombinante de humano durante 2 horas a 37 °C em tubos Eppendorf e depois estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 ligados à placa como indicado nas figuras. Após 16 horas, as células foram coradas com anti-CD69 (clone H1.2F3) conjugado com PE e anti-CD25 (clone PC61.5) conjugado com FITC diluídos em tampão FACS (PBS contendo 1% de FCS e 0,02% de NaN2) . As células intactas foram seleccionadas (gated) utilizando dispersão directa e lateral e foram analisadas com o programa CellQuest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) num citómetro de fluxo FACScan. Para analisar a expressão de FPRL-1, células T de sangue periférico de humano foram estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 ligados à placa para tempos diferentes e depois coradas com anticorpo de ratinho anti-FPRL-1 de humano (clone 6C7-3-A; 5 pg/mL), seguindo-se anticorpo conjugado com FITC.

Ensaio de proliferação celular Células T de nódulo linfático purificadas (105 células/mL) foram incubadas com meio sozinho ou com diferentes concentrações de hrAnx-Al durante 2 horas a 37°C em tubos Eppendorf. Depois, alíquotas de 200 pL de suspensão de células foram estimuladas por anti-CD3 e anti-CD28 ligados à placa durante 24 horas em placas de 96 poços. Após 18 horas, pulsaram-se as culturas durante 8 horas com 1 pCi (3,7 x 104

Bg) de [3H]-timidina (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) e mediu-se a radioactividade incorporada por um contador de cintilação automático (Packard Instruments, Pangboume, Reino Unido).

Ensaios de desvio de electromobilidade

Colheram-se extractos nucleares a partir de 3 x 106 a 5 x 106 células de acordo com protocolos anteriormente descritos. Incubaram-se os extractos nucleares (3 pg a 5 pg) com 1 pg (para NFAT) ou 2 pg (para NF- B e AP-1) de poly(dI:dC) em 20 pL de tampão de ligação com sondas de oligonucleótido de cadeia dupla marcadas na extremidade com 32P (5 x 105 cpm) e fraccionaram-se sobre um gel de poliacrilamida a 6% (razão de reticulação 29:1) em TBE a 0,5% durante 2,5 horas a 150 V. O tampão de ligação de NF- B e AP-1 (lOx) continha Tris-HCl 100 mM, (pH 7,5), NaCl 500 mM, EDTA 10 mM, 50% de glicerol, 10 mg/mL de albumina, GTP 30 mM, DTT 10 mM. O tampão de ligação de NFAT (lOx) continha Hepes 100 mM (pH 7,9), KC1 500 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 50% de glicerol, 5 mg/mL de albumina, 1% de Nonidet P-40, DTT 10 mM. As sondas de oligonucleótido de cadeia dupla de NF- B e AP-1 eram da Promega e a de NFAT era da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) .

Análise Western blotting Células T de nódulo linfático foram incubadas como indicado nas figuras. Após incubação a 37°C durante vários períodos de tempo, lisaram-se as células em tampão de lise arrefecido em gelo (1% de NP-40, Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 1 mM, PMSF 0,5 mM, aprotinina 1 pM, leupeptina 1 pM, pepstatina 1 pM, NaF 50 mM, Na4P2C>7 10 mM e NaVCP 1 mM, -glicerofosfato 1 mM) . Centrifugaram-se os lisados celulares a 13/226g (13 000) rpm durante 5 minutos a 4°C e colheram-se os sobrenadantes e submeteram-se a electroforese sobre um gel de SDS-poliacrilamida a 10%. Após transferência, incubaram-se as membranas de um dia para o outro com anticorpos diluídos em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20 (TTBS: NaCl 0,13 M; KC1 2,68 mM; Tris-HCl 0,019 M; 0,001% vol/vol DE Tween-20; pH 7,4) com 5% de leite em pó magro a 4°C. Para as experiências com anti-pERKl/2 e anti-Akt, o tampão TTBS foi suplementado com NaF 50 mM e utilizou-se albumina de soro de bovino (5%) em vez de leite. Para cada condição, utilizaram-se equivalentes de extracto obtidos a partir do mesmo número de células. A immunoblotting e a visualização de proteínas por quimiluminescência intensificada (ECL; Amersham Pharmacia Biotech) foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Para obter fracções citosólicas e de membrana, colheram-se primeiro as células e lavaram-se em PBS arrefecido em gelo e depois centrifugaram-se ligeiramente durante 2 minutos a 300g. Lisou-se o sedimento celular resultante em tampão de lise (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5; inibidores de protease conforme listados no tampão de lise) e fez-se passar através de uma agulha de calibre 25 pelo menos 5 vezes para assegurar lise suficiente. Depois centrifugou-se a suspensão durante 2 minutos a 300g, colheu-se o sobrenadante e centrifugou-se outra vez durante 45 minutos a 800g (4°C). Nesta etapa colheu-se o sobrenadante (fracção citosólica) e ressuspendeu-se o sedimento (fracção de membrana) em tampão de lise contendo 1% (vol/vol) de Triton X-100. Todas as fracções foram mantidas em gelo ao longo das experiências. ELISA de citoquinas

Para análise da produção de citoquina Thl/Th2, células Th0/Thl/Th2 (106/mL) obtidas após diferenciação de 4 dias em de distorção e 1 dia de repouso em meio RPMI completo, foram estimuladas com anti-CD3 ligado à placa (5 pg/mL) durante 8 h em placas de 24 poços. Colheram-se os sobrenadantes de cultura e analisaram-se quanto ao teor em IFN- , IL-2, IL-4 e IL-10 utilizando o kit ELISA de painel Thl/Th2 (eBioscience). O kit ELISA de IL-13 foi também comprado na eBioscience.

Exemplo 1 - Efeito de Anexina-1 recombinante de humano (hrAnx-Al) na activação de células T Células T de nódulos linfáticos naive murinas foram estimuladas com 5,0 ( ), 2,5 ( ) e 1,25 ( ) pg/ml de anti- CD3/CD28 na ausência ou na presença de diferentes concentrações de hrAnx-Al durante 24 h e foram depois pulsadas com 3H-timidina para medir a proliferação. Os resultados são apresentados na Figura 3A. A Figura 3B mostra a produção de IL-2 a partir de células T de nódulo linfático naive murinas primárias estimuladas com anti-CD3/CD28 (1,25 pg/ml) na ausência ou na presença de diferentes concentrações de hrAnx-Al durante 24 h. Células T de nódulo linfático naive murinas foram estimuladas com anti-CD3/CD28 numa concentração de 1,25 pg/ml (coluna da esquerda), 2,5 pg/ml (coluna do meio) e 5,0 pg/ml (coluna da direita), na ausência (painéis superiores) ou na presença (painéis inferiores) de hrAnx-Al (600 nM) durante 12 h e depois analisadas quanto à expressão de CD25 e CD69 por FACS. Os resultados são apresentados na Figura 3C.

Na Figura 3D, células T de nódulo linfático naive murinas foram estimuladas com a concentração indicada de anti-CD3/CD28 na presença de 150 (X) , 300 (iff) e 600 (O) nM de hrAnx-Al durante 12 horas e depois analisadas quanto à expressão de CD25 (gráfico à esquerda) e CD69 (gráfico à direita) por FACS.

Em todas as experiências os valores são médias ± S.E. de n = 3-4 ratinhos. *P<0,05; **P<0,01.

Os resultados mostram que o pré-tratamento de células primárias CD4+ naive murinas com hrAnx-Al seguido por activação com diferentes concentrações de anti-CD3/CD28 aumentou a proliferação celular (Figura 3A) , a produção de IL-2 (Figura 3B) e a expressão na superfície celular de CD25 e CD69 (Figuras 3C e D).

Exemplo 2 - A Anx-Al endógena modula a proliferação de células T A Figura 4 mostra que: (A) anti-CD3 (5,0 pg/ml) (B) anti-CD3/CD28 (5,0 pg/ml) ou (C) PMA (20 ng/ml) e Ionomicina (2 ng/ml) induziram a proliferação de células T do tipo selvagem e deficientes em Anx-Al, expressa como percentagem de incorporação de 3H-timidina em comparação com células T não estimuladas de controlo. Em algumas experiências, as células foram também activadas na presença de IL-2 recombinante de ratinho (20 ng/ml). Os valores são médias ± S.E. de n = 4-5 t t P<0,01 vs. células Anx-Al+/+ estimuladas com IL-2; **P<0.01 vs. células Anx-Al+/+ estimuladas com anti-CD3 ou anti-CD3/CD28 ou PMA/Ionomicina; §§P<0,01 vs. células Anx-Al_/“ estimuladas com anti-CD3 ou anti-CD3/CD28 ou PMA/Ionomicina A Figura 4D mostra a produção de IL-2 a partir de células T de nódulo linfático naive estimuladas com anti-CD3, anti-CD3/CD28 (5,0 pg/ml) ou PMA (20 pg/ml) e Ionomicina (2 ng/ml) durante 24 h. Os valores são médias ± S.E. de n = 4-5 ratinhos. **P<0,01.

Os resultados mostram que estimulação de células T Anx-Al+/+ ou Anx-Al_/_ com anti-CD3, anti-CD3/CD28 ou PMA/Ionomicina mostrou uma velocidade de diminuição da incorporação de 3H-timidina (Figuras 4A, 4B e 4C, respectivamente) e da produção de IL-2 (Figura 4D) nas células T deficientes em Anx-Al em comparação com células T não estimuladas de controlo.

Exemplo 3 - Activação de AP-1, NF- B e NFAT na presença ou na ausência de Anx-Al

Foram realizadas investigações sobre como Anx-Al exógena e endógena modula a activação de células T. Os três principais activadores de transcrição de células T, nomeadamente Proteína Activadora-1 (AP-1), Factor Nuclear- B (NF- B) e Factor Nuclear de Células T Activadas (NFAT) foram analisados em células estimuladas na presença de hrAnx-Al. A Figura 5A é um Ensaio de Desvio de Mobilidade Electroforética para activação de AP-1, NF- B e NFAT em células T estimuladas com anti-CD3/CD28 (1,25 pg/ml) na presença ou na ausência da concentração indicada de hrAnx-Al. A Figura 5B mostra uma comparação da activação de AP-1, NF- B e NFAT em células T Anx-Al+/+ e Anx-Al_/_ estimuladas com anti-CD3/CD28 (5,0 pg/ml).

Os resultados demonstraram activação aumentada de todos os três factores de transcrição (Figura 5A). Inversamente, as células T Anx-Al_/_ mostraram uma activação diminuída destes factores de transcrição em comparação com os seus correspondentes de controlo (Figura 5B).

Exemplo 4 - Externalização de FPRL-1 e Anx-Al em células T

Investigámos se as células T exprimem o receptor para Anx-Al, o receptor de péptido de formilo de tipo-1 (FPRL-1). A coloração FACS de células T de sangue periférico (PBT) humanas não estimuladas com anticorpo monoclonal especifico anti-FPRL-1 não demonstraram qualquer expressão de receptor. No entanto, a estimulação com anti-CD3/CD28 induziu a externalização de FPRL-1 em 1 hora seguida por uma expressão de estado estacionário estável sobre a superfície celular (Figura 6A). Interessantemente, foi observado um padrão similar para Anx-Al. Assim, a análise da distribuição de Anx-Al em PBT de humano demonstrou que a proteína está uniformemente distribuída entre o citosol e a membrana. No entanto, quando as células foram estimuladas com anti-CD3/CD28, observou-se acumulação de Anx-Al na membrana. A proteína é depois exportada para o lado exterior da membrana e libertada para o meio extracelular. Consistente com este modelo, quando precipitámos imunologicamente Anx-Al a partir do sobrenadante de cultura de PBT humanas estimuladas com antÍ-CD3/CD28, observámos uma libertação aumentada de Anx-Al em comparação com células não estimuladas de controlo (Figura 6B). Colectivamente, estas observações demonstram que a sinalização através do TCR aumenta a libertação de Anx-Al, concomitante com a regulação ascendente dos seus receptores.

Em condições fisiológicas, o Anx-Al/FPRL-1 integra-se com o TCR para modular a força de sinalização de TCR. No entanto, em condições patológicas, tais como em AR ou lúpus eritematoso sistémico (dados não publicados), onde a proteína é expressa com níveis mais elevados, isto poderia conduzir a activação de células T aumentada devido a um limiar mais baixo de sinalização de TCR (Figura 6C).

Exemplo 5 - A Anx-Al exógena e endógena modula a diferenciação Thl/Th2

Estudos recentes têm postulado que a força de sinalização de TCR influencia o comprometimento de linhagem de células T para células efectoras Thl ou Th2. Dada a sinalização de TCR aumentada ou diminuída em células T tratadas com hrAnx-Al (Figuras 3 e 5A) ou em células Anx-Al~/~ (Figuras 4 e 5B) , procurámos depois determinar se niveis diferentes de Anx-Al influenciariam a diferenciação de células T em células Thl ou Th2. Células T de nódulo linfático naive foram diferenciadas in vitro em condições Thl (barras a preto) ou Th2 (barras a branco) na presença ou na ausência de hrAnx-Al (600 nM) e depois outra vez estimuladas com anti-CD3 ligado à placa (5,0 pg/ml) durante 8 h para medir a produção de citoquina Thl ou Th2. Os resultados são apresentados na Figura 7A. Os valores são médias ± S.E. de n = 4-5 ratinhos. **P<0,01

Como se mostra na Figura 7A, a diferenciação de células T naive (CD441o, CD62Lhi) em condições Thl (antÍ-CD3/CD28, IL-2, IL-12 e anti-IL-4) ou Th2 (anti-CD3/CD28, IL-2, IL-4 e anti-IFN- ) na presença de hrAnx-Al aumentou a produção de IL-2 e IFN- com uma diminuição concomitante da libertação de IL-4 e IL-10 após reestimularão de anti-CD3. Células T de nódulo linfático naive a partir de ratinhos Anx-Al+/+ ou Anx-Al_/_ foram diferenciadas in vitro em condições Thl (primeiro e segundo gráficos a partir da esquerda) ou Th2 (terceiro e quarto gráficos a partir da esquerda) e depois outra vez estimuladas com anti-CD3 ligado à placa (5,0 pg/ml) durante 8 h para medir a produção de citoquina Thl ou Th2. Os resultados são apresentados na Figura 7B. Os valores são médias ± S.E. de n = 4-5 ratinhos. **P<0,01.

Como se mostra na Figura 7B, obtiveram-se também constatações similares em relação à proteína endógena; a análise da produção de citoquinas Thl/Th2 em células Thl/Th2 diferenciadas a partir de ratinhos Anx-Al+/+ ou Anx-Al-/~ produziu níveis mais elevados de IL-2 e IFN- em ratinhos do tipo selvagem em comparação com ratinhos knockout, com perfis opostos para a produção de IL-4 e IL-13.

Exemplo 6 - Anx-Al e artrite reumatóide

Para provar que hrAnx-Al aumentava a activação de células T in vivo, utilizámos um modelo de ratinho de doença autoimune crónica, o modelo de artrite induzida por colagénio (CIA) em ratinhos DBA. Os ratinhos foram injectados com hrAnx-Al diariamente durante 12 dias após imunização com colagénio (tempo durante o qual as células naive se diferenciam em células efectoras Th) e depois analisou-se a progressão da doença após desafio de antigénio. A Figura 8 mostra o volume da pata (Figura 8A) e a pontuação clinica (Figura 8B) dos ratinhos tratados com PBS (100 μΐ) ou hrAnx-Al (1 pg s.c. duas vezes ao dia). A sincronização do aparecimento da doença foi obtida por reforço com colagénio ao dia 21, e os sinais clínicos eram evidentes desde o dia 22 (dia 1 do aparecimento da doença). Os valores são médias ± S.E. de n = 6-8 ratinhos. Os grupos foram comparados utilizando o teste Mann-Whitney. *P<0,01

Como se pode observar a partir das Figuras 8A e 8B, o tratamento de ratinhos com hrAnx-Al exacerbou os sinais e sintomas de artrite em comparação com ratinhos tratados com veículo de PBS, confirmando que níveis elevados de Anx-Al influenciam a activação e a diferenciação de células T e que estes efeitos influenciam o desenvolvimento da doença num modelo de ratinho de AR.

Para investigar a relevância clínica destes estudos analisou-se expressão de Anx-Al em células T periféricas CD4+ e células CD3+ sinoviais a partir de pacientes de AR. A Figura 8C mostra os resultados. Os valores medianos estão indicados por linhas horizontais e mostram-se os valores de p do teste Mann-Whitney. *P<0,01. Como se mostra na Figura 8C, células CD4+ de AR exprimem níveis elevados de ARNm e proteína Anx-Al (dados não mostrados) em comparação com células a partir de voluntários de controlo saudáveis (HC).

Realizou-se também imuno-histoquímica de fluorescência utilizando anti-soro secundário marcado fluorescente verde e vermelho, como se mostra em cada painel na Figura 8D. Esta análise imuno-histoquímica de expressão de Anx-Al no tecido sinovial de pacientes de AR revelou um grau elevado de co-localização com células CDR3+. Por conseguinte, considerando que células CD4 a partir de pacientes de AR exprimem níveis mais elevados de Anx-Al, pode-se concluir que a expressão desregulada desta proteína pode contribuir para o desenvolvimento desta doença.

Exemplo 7 — Efeitos de hrAnx-Al a todo o comprimento e do péptido N-terminal Ac.2-26 na activação de células T.

Investigaram-se os efeitos de um péptido N-terminal de hrAnx-Al (péptido Ac.2-26) e de hrAnx-Al a todo o comprimento na activação de células T. A produção de IL-2 a partir de células T de nódulo linfático naive murinas foi estimulada com 0,6, 1,25 ou 2,5 pg/ml de anti-CD3/CD28 na presença ou na ausência de hrAnx-Al a todo o comprimento (300 nM) ou do péptido N-terminal derivado de Anx-Al Ac.2-26 (100 μΜ) durante 24 h.

Constatou-se que o péptido N-terminal Ac.2-26 mantém a maior parte da actividade biológica da proteína a todo o comprimento, i.e. produção de IL-2 (Figura 9) e proliferação de células T (dados não mostrados) aumentadas.

Exemplo de referência 8 - Anx-Al e aterosclerose

Para investigar se Anx-Al é expressa em placas ateroscleróticas de humano, secções de placas ateroscleróticas de carótida removidas de pacientes durante cirurgia de endarterectomia carotídea foram coradas com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-Anx-Al de humano (mAblB). A produção deste anticorpo é descrita em Pepinsky et ai. FEBS Letters 261: 247-252, 1990. Resumidamente, ratinhos BALB/c foram imunizados com uma injecção intraperitoneal de anexina-1 (referida como lipocortina-1 em Pepinsky et al) em adjuvante de Freund completo. Os animais foram reforçados aos dias 14 e 28 com anexina-1 em adjuvante de Freund incompleto. Após 6 semanas, colheram-se sangrias de teste e pesquisaram-se quanto a anticorpos que bloqueavam a actividade de anexina-1. Células de baço a partir de ratinhos cujos anti-soros exibiram actividade anti-anexina foram fundidas com células SP3 x Ag8 para produção de hibridoma. Ensaiaram-se os sobrenadantes de cultura de hibridoma em relação a anticorpos que podiam precipitar anexina-1 radiomarcada, e os hibridomas produzindo anticorpos que precipitavam mais de 50% das contagens de entrada foram subclonados por diluição limitante. As linhas mais promissoras foram cultivadas como ascites em ratinhos desafiados com pristano e os anticorpos monoclonais foram purificados por afinidade sobre proteína A-Sepharose, utilizando os sistemas de tampão de ligação e eluição Pierce.

Como se mostra na Figura 10, uma coloração compacta e clara para Anx-Al podia ser observada na placa confirmando que 0 infiltrado inflamatório nestes tecidos exprime níveis elevados de Anx-Al.

Foram também realizadas análises similares em ratinhos ApoE_/~. A localização de Anx-Al no seio aórtico e na artéria braquiocefálica (BCA) de ratinhos ApoE_/~ de 10 meses de idade foi realizada por microscopia confocal para determinar a expressão e a distribuição espacial de Anx-Al. Tecido arterial não aterosclerótico estava desprovido de Anx-Al imunorreactiva (dados não mostrados) . Em contraste, ambas as placas ateroscleróticas a partir de seio aórtico e de BCA estavam coradas para Anx-Al (Figura 11).

Foi detectada uma imunorreactividade clara para Anx-Al na proximidade da cápsula fibrosa tanto no seio aórtico (Figura 11A) como na BCA (Figura 11B) e na proximidade do núcleo necrótico da placa no seio aórtico (Figura 11B). Estes resultados demonstram que a Anx-Al é expressa em ambas as placas ateroscleróticas de humano e de murino e sugerem que a sua expressão poderia influenciar potencialmente a estabilidade da placa.

Exemplo 9 - Anx-Al e lúpus eritematoso sistémico (LES)

Estudos clínicos sobre as funções biológicas de Anexina- 1 têm associado a presença de autoanticorpos contra esta proteína com o desenvolvimento de doenças autoimunes incluindo lúpus eritematoso sistémico (LES), artrite reumatóide e doença inflamatória do intestino. À luz destas constatações colocámos a hipótese de a geração destes autoanticorpos pode ser devida a uma expressão descontrolada de Anexina-1 nestes pacientes. Para verificar esta hipótese, analisou-se o nível de expressão de Anexina-1 em células T colhidas a partir de voluntários saudáveis e de pacientes de LES. ARNm e proteína de Anexina-1 eram expressos num nível muito mais acentuado nas células T de LES (Figura 12). Assim, estes resultados suportam a hipótese de que a expressão aumentada de Anexina-1 em células T de LES, e por conseguinte em células T a partir de pacientes com outras patologias autoimunes, poderia ser responsável pelos níveis aumentados de citoquinas Thl descritos nestas patologias, representando assim um factor de risco para o desenvolvimento de doenças autoimunes.

Exemplo 10 - Inibição de activação de células T por anticorpos ant i-Anx-Al Células T de sangue periférico humano purificado foram incubadas com uma mistura de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (5 pg/ml) para activar o receptor de células T (TCR); isto ocorreu conforme demonstrado na Figura 13 pela produção notável de interleucina-2 (IL-2), uma citoquina central para a activação e diferenciação de células T.

Incubaram-se depois as células com diferentes concentrações (1,0, 0,1, 0,01 e 0,001 microgramas/ml) de um anticorpo monoclonal de ratinho neutralizante criado contra anexina 1 recombinante de humano (mAblA). A produção deste anticorpo é descrita em Pepinsky et al. FEBS Letters 261: 247-252, 1990 e no Exemplo 8. 0 tratamento com mAblA produziu uma inibição dependente da concentração da produção de IL-2 (Figura 13) e da proliferação celular (dados não mostrados). Utilizou-se IgG como controlo nas concentrações de 1,0, 0,1, 0,01 e 0,001 microgramas/ml e não foi eficaz para todas as concentrações. Os resultados mostraram que o bloqueio dos efeitos de anexina-1 pareceu ser mais eficaz para concentrações mais baixas do anticorpo monoclonal específico mAblA.

Em todos os casos, os dados são médias ± SE de medições em triplicado. *P<0,01. Células T de sangue periférico humano purificado a partir de um doador diferente foram depois incubadas com uma mistura de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 numa concentração diferente (1 pg/ml) para activar o receptor de células T (TCR). Outra vez, isto ocorreu como demonstrado na Figura 14 pela produção de interleucina-2 (IL-2), mas a um nível mais baixo devido à concentração mais baixa dos anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 utilizados.

Outra vez, as células foram então incubadas com diferentes concentrações (1,0, 0,1, 0,01 e 0,001 microgramas/ml) do anticorpo monoclonal de ratinho neutralizante criado contra anexina 1 recombinante de humano (mAblA). O tratamento com mAblA produziu uma inibição da produção de IL-2 dependente da concentração (Figura 14) . Utilizou-se IgG como um controlo numa concentração de 1,0 microgramas/ml e não foi eficaz. Outra vez, os resultados mostraram que o bloqueio dos efeitos de anexina-1 pareceu ser mais eficaz a concentrações mais baixas do anticorpo monoclonal específico mAblA, excepto com uma concentração de 1,0 microgramas/ml de mAblA.

Em todos os casos, os dados são médias ± SE de medições em triplicado, *P<0,01.

Estas experiências demonstram que a anexina 1 endógena promove a activação de células T na presença de um estímulo específico. Adicionalmente, o bloqueio do percurso de anexina 1 atenuou a activação de células T em até 50%. O facto de a inibição ter atingido um máximo à volta de 50% sugere que a imunidade "normal e de limpeza" não seria afectada pelo tratamento de doenças mediadas por células T utilizando uma molécula que se liga especificamente a Anx-Al como reivindicado.

Exemplo 11 - Anx-Al e esclerose múltipla (EM)

Materiais e Métodos Reagentes O péptido de glicoproteína de oligodendrócito de mielina (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) (MOG) 33-55 (MEVGWYRSPF SRVVHLYRNGK) foi sintetizado e purificado pela Cambridge Research Biochemicals (Billingham, Reino Unido). O adjuvante de Freund completo contendo Mycobacterium tuberculosis H37a foi comprado na Difco enquanto a toxina de Bordetella pertussis era da Sigma-Aldrich Co (Poole, Reino

Unido) . A não ser que especificado de outro modo, todos os outros reagentes foram da Sigma-Aldrich Co.

Ratinhos

Ratinhos machos nulos em Anx-Al foram como anteriormente descrito (Hannon et al., Faseb J, 17: 253-255, 2003; Roviezzo et al., J. Physiol Pharmacol 53: 541-553, 2002) (9-11 semanas de idade) e foram retrocruzados num fundo C57BL/6 durante > 10 gerações e criados nas instalações de cuidados animais da B&amp;K (Hull, UK) . Ratinhos C57BL/6 de controlo da mesma idade e género foram utilizados como controlo para todas as experiências. Os animais permaneceram sob condições padrão e foram mantidos num ciclo de 12h/12h de luz/escuridão a 22±1°C de acordo com a regulamentação do United Kingdom Home Office (Animal Act 1986) e segundo as directivas da União Europeia.

Indução de EAE

Os ratinhos foram imunizados subcutaneamente ao dia 0 com 300 μΐ de emulsão consistindo de 300 yg de MOG35-55 em PBS combinado com um volume igual de CFA contendo 30 0 yg de M. tuberculosis H37Ra mortos por calor. Injectou-se a emulsão em ambos os flancos e seguindo-se uma injecção intraperitoneal de toxina de B. pertussis (500 ng/100 yl) em 100 yl de solução salina aos dias 0 e 2. Os ratinhos foram observados diariamente quanto a sinais de EAE e perda de peso. A gravidade da doença foi pontuada numa escala de 6 pontos: 0 = ausência de doença; 1 = cauda parcialmente flácida; 2 = cauda completamente flácida; 3 = hipotonia do membro traseiro; 4 = paralisia parcial do membro traseiro; 5 = paralisia completa do membro traseiro; 6 = animal moribundo ou morto.

Ensaio de proliferação celular Células de nódulo linfático (105 células/200 yl) obtidas a partir de ratinhos imunizados com MOG33-55 durante 14 dias foram estimuladas com MOG33-55 (50-100 yg/200 yl) durante 48 h em placas de 96 poços. Durante as últimas 12 h, pulsaram-se as culturas com 1 yCi de [3H]-timidina (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido) e mediu-se a radioactividade incorporada por um contador de cintilação automático (Packard Instrument Company, Inc., Illinois, E.U.A.). ELISA de citoquinas Células de nódulo linfático (106 células/ml) obtidas a partir de ratinhos imunizados com MOG33-55 durante 14 dias foram estimuladas com MOG33-55 (100 pg/ml) durante 4 dias. Colheram-

se os sobrenadantes celulares e analisaram-se quanto ao teor em IFN- , IL-2, IL-17A e TNF- utilizan&amp;dts ELISA (eBioscience, Dorset, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante.

Isolamento de células inflamatórias a partir da medula espinal

Os ratinhos foram mortos utilizando CO2. As medulas espinais foram expelidas da coluna espinal com PBS por pressão hidrostática utilizando uma seringa ligada a uma agulha de calibre 21. Cortaram-se os tecidos em pequenos pedaços e fizeram-se passar através de um filtro de células (70 nm; BD Falcon) utilizando o êmbolo de uma seringa estéril de 1 ml. Centrifugou-se a suspensão de células individuais durante 10 min a 390xg, ressuspenderam-se em 20 ml de PBS contendo 30% de Percoll (Sigma) e sobrepôs-se sobre 10 ml de PBS contendo 70% de Percoll. Após centrifugação a 390xg durante 20 min, removeram-se as células mononucleares da fase intermédia, lavaram-se e ressuspenderam-se em tampão FACS (PBS contendo 1% de FCS e 0,02% de NaN2> para análise subsequente.

Citometria de fluxo

Amostras de células de tecidos de medula espinal purificadas em Percoll ou de nódulos linfáticos purificadas em Ficoll foram de novo colocadas em suspensão em tampão FACS contendo anticorpo de bloqueio de CD16/CD32 Fc HR (clone 93; eBioscience) durante 30 min a 4°C. Depois, marcaram-se as suspensões de células com anti-CD3 (1:100; clone 145 2C11) ou anti-F4/80 (1:100; clone BMT) conjugados com FITC enquanto as células de nódulo linfático foram coradas com antÍ-CD4-FITC (1:500; clone L3T4) e anti-CD8 (1:1000; clone Ly-2) durante 30 min a 4°C, antes da análise por FACScalibur utilizando software CellQuest (Becton Dickinson). Foram analisadas pelo menos 104 células por amostra, e a determinação das populações positivas e negativas foi realizada com base na coloração atingida com isótipos de IgG irrelevantes.

Histologia

Dissecaram-se os tecidos da medula espinal e fixaram-se em formalina tamponada neutra a 4% durante 48 h e depois incubaram-se em solução descalcificante contendo EDTA (0,1 mM em PBS) durante 14 dias antes do embebimento em parafina. A avaliação histológica foi realizada em secções embebidas em parafina com amostras colhidas a vários pontos temporais dependendo da gravidade da doença. Secções da medula espinal (5 pm) foram desparafinadas com xileno e coradas com hematoxilina e eosina (H&amp;E) para avaliar a inflamação. A coloração em relação a Anx-Al foi realizada sobre secções congeladas utilizando anticorpos anti-Anx-Al (diluição 1:500; Zymed, Invitrogen) e anti-Ig de coelho conjugados com peroxidase de rábano (HRP) (diluição 1:500; Dako). A dupla coloração em relação a Anx-Al e CD3 ou F4/80 foi realizada como anteriormente descrito utilizando anti-CD3 conjugado com FITC (1:100; clone 145 2C11) ou anti-F4/80 (1:100; clone BMT). As secções foram também contrastadas com hematoxilina. Em todos os casos, avaliaram-se um mínimo de >3 secções por animal. Foram captadas imagens digitais de contraste de fase utilizando o pacote de software de análise de imagem Image Pro.

Análise estatística

Utilizou-se software Prism (software GraphPad) para correr todos os testes. As avaliações estatísticas de freguência celular, proliferação e produção de citoquinas foram realizadas utilizando testes t de Student não emparelhados bilaterais. Aplicaram-se ANOVA para analisar a graduação clínica de EAE. Um valor de p de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Os dados são apresentados como médias ± S.E.M de n amostras por grupo.

Resultados A expressão de Anx-Al está correlacionada com a gravidade de encefalomielite autoimune experimental (EAE) A correlação entre os níveis de Anx-Al no conteúdo da medula espinal e a extensão de células mononucleares infiltrantes no SNC foram avaliados num modelo de ratinho de EM induzida por imunização com MOG35-55, EAE. A EAE induzida por MOG35-55 é um modelo para desmielinização autoimune do SNC e tem sido amplamente utilizada para investigar os mecanismos patogénicos responsáveis pelo desenvolvimento de EM. Para este propósito, colheram-se as medulas espinais e os cérebros de ratinhos do tipo selvagem imunizados com péptido MOG35-55 em diferentes etapas da doença i.e. ao dia 12 (pontuação 0), ao dia 18 (pontuação 2) e ao dia 20 (pontuação 4) e realizou-se a imuno-histoquímica para Anx-Al lado a lado com a coloração de hematoxilina e eosina.

Como se mostra na Figura 15, tecidos de medula espinal colhidos durante a fase de indução de ratinhos sem quaisquer sinais de doença mostraram uma coloração fraca em relação a Anx-Al (pontuação 0, Fig. 15A e B, respectivamente). Contudo, com o início dos sinais clínicos e o aparecimento de infiltrados inflamatórios no SNC, observaram-se manchas discretas de imunocoloração de Anx-Al a toda a volta das meninges (pontuação 2, Fig. 15A e B, respectivamente) . À medida que a doença progrediu, observou-se um aumento no número de manchas de infiltrado celular positivas em relação a Anx-Al (pontuação 4, Fig. 15A e B, respectivamente), sugerindo que a infiltração de células inflamatórias exprimindo níveis elevados de Anx-Al está correlacionada com a gravidade da doença.

Para identificar as fontes celulares de imunorreactividade Anx-Al na medula espinal, realizou-se a dupla coloração por imunofluorescência das secções com anti-Anx-Al e quer anti-CD3 (marcador para células T) ou anti-F4/80 (marcador para macrófagos). Detectou-se um grande número de células T e macrófagos infiltrados nas secções de medula espinal de ratinhos no pico de EAE (Fig. 16A e B, painéis do meio, respectivamente). No entanto, a coloração de Anx-Al nas mesmas secções mostrou uma co-localização parcial tanto com células T e como com macrófagos sem preferência particular por um ou por outro tipo de células (Fig. 16A e B, painéis à direita, respectivamente).

Ratinhos Anx-Al~f~ desenvolvem uma EAE comprometida

Uma vez que a expressão de Anx-Al estava regulada de modo ascendente no pico de EAE, investigou-se o papel desta proteína no desenvolvimento de EAE. Ratinhos Anx-Al+/+ e Anx-Al-/~ foram imunizados s.c. com péptido MOG35-55 em CFA ao dia 0, e depois injectados i.v. com toxina de B. pertussis tanto ao dia 0 como ao dia 2. Ambos os ratinhos Anx-Al+/+ e Anx-Al_/_ começaram a desenvolver EAE desde o dia 12 após imunização, atingindo o pico da doença à volta do dia 20. No entanto, os ratinhos Anx-Al~/~ tinham níveis reduzidos de doença em comparação com os ratinhos Anx-Al+/+ (Figura 17A) . Interessantemente, isto apenas foi evidente e significativo na fase mais tardia da doença i.e. do dia 18 ao dia 23 e por diante.

Estudos em modelos animais de EAE demonstraram que a fase aguda da doença coincide com a perda de peso, provavelmente devido a anorexia e incorporação deficiente de fluido. A medição de peso de ratinhos imunizados estava correlacionada com a gravidade da pontuação clínica e exibiu uma perda de peso reduzida - do dia 18 em diante - nos ratinhos Anx-Al_/_ em comparação com os controlos de Anx-Al+/+ (Figura 17B) . A comparação adicional do desenvolvimento de EAE em ratinhos Anx-Al+/+ e Anx-Al~/_ mostrou uma diminuição tanto na taxa de mortalidade como na pontuação máxima da doença, sem diferenças na taxa de incidência ou no aparecimento da doença (Tabela 1).

Tabela 1: Parâmetros clínicos de EAE induzida por MOG35-55 em ratinhos Anx-Al+/+ e Anx-Al_/_ (média ± SEM, n = 10/grupo)

Resposta de recordação in vitro a MOG35-55 em ratinhos Anx-Al-/~

As células T desempenham um papel chave no desenvolvimento de EAE e as células T Anx-Al-/- têm uma capacidade comprometida para responderem a estimulação de anti-CD3/CD28. À luz destas constatações, investigou-se se o desenvolvimento diminuído de EAE em ratinhos Anx-Al_/_ estava associado a uma resposta inferior à estimulação com antigénio. Células de nódulo linfático a partir de ratinhos Anx-Al+/+ e Anx-Al-/-, colhidas 14 dias após imunização, foram estimuladas in vitro com MOG35-55. As células de nódulo linfático Anx-Al-/- mostraram uma velocidade de proliferação e produziram níveis inferiores de IL-2 guando estimuladas com MOG35-55 em comparação com ratinhos do tipo selvagem (Figura 18A e B, respectivamente) . Obtiveram-se resultados similares com esplenócitos (dados não mostrados).

Estes resultados sobre a proliferação celular foram reflectidos no número de células recuperadas a partir do baço e de nódulos linfáticos drenantes dos ratinhos imunizados. A contagem de células totais de células de baço e de células mononucleares de nódulo linfático purificadas por Ficoll a partir dos mesmos animais, revelou uma diminuição significativa em ratinhos Anx-Al-/- em comparação com os controlos (Figura 19A e B, respectivamente), sem guaisquer alterações mensuráveis nas percentagens de células CD4 ou CD8 positivas (Figura 19C e D, respectivamente).

Respostas reduzidas de citoquina Thl e Thl7 especificas de MOG35-55 em ratinhos Anx-Al~f~

Estudos utilizando células de nódulo linfático drenantes a partir de ratinhos C57/BL6 imunizados com MOG35-55 mostraram alterações significativas na produção de citoquinas Thl e Thl7. A análise da produção de citoquinas a partir de células de nódulo linfático AnxAl-/- após repetição do desafio com MOG35-55 durante 96 h mostrou uma produção diminuída de citoquinas Thl IFN- , IL-2 e TNF- em comparação com as células do ti] selvagem (Figura 20A-C). Similarmente, a medição do produto de assinatura de Thl7 IL-17, revelou níveis diminuídos desta citoquina em Anx-Al-/- em comparação com o tipo selvagem (Figura 20D) .

Infiltração de células T no sistema nervoso de ratinhos Anx-Aldurante EAE

Os sinais reduzidos de EAE em ratinhos Anx-Al-/~ desde o dia 18 em diante, levou-nos a investigar se poderia existir uma correlação neuropatológica. As medulas espinais de ratinhos tratados Anx-Al+/+ e Anx-Al_/~, colhidas aos dias 18 ou 22, foram analisadas quanto a evidência histológica de inflamação. Constatou-se que existiam números reduzidos de infiltrados de células imunitárias detectados em ratinhos Anx-Al_/~ em comparação com animais Anx-Al+/+ (Figura 21A e B) .

Os sinais histológicos reduzidos de inflamação em ratinhos AnxAl_/~ estavam associados a um número reduzido de células CD3 e F4/80 positivas infiltrando o SNC (Figura 21C e D, respectivamente). Estas análises qualitativas foram confirmadas por FACS medindo as percentagens de leucócitos CD3 e F4/80 positivos isolados a partir de tecidos da medula espinal ao dia 18. Consistente com os resultados de imuno-histoquímica, os ratinhos AnxAl_/~ tinham cerca de 60 e 80% menos células T e macrófagos, respectivamente, em comparação com os ratinhos AnxAl+/+ (Figura 22A e B, respectivamente).

Os resultados mostram que existe uma acumulação notável de células exprimido Anexina-1 na medula espinal de ratinhos no pico da doença. Existe por conseguinte uma correlação entre a expressão de Anexina-1 e o desenvolvimento de EAE.

Adicionalmente, os resultados mostram que ratinhos deficientes em Anexina-1 desenvolvem EAE menos severa. Por conseguinte a ablação da expressão de Anexina-1 limita desenvolvimento de EAE, um modelo de ratinho para a EM.

Lisboa, 2015-04-27

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo anti-Anexina-1 (Anx-Al) ou um seu fragmento que se liga a Anx-Al para utilização no tratamento de uma doença autoimune.
2. 2. Anticorpo anti-Anx-Al ou um seu fragmento de acordo com a reivindicação 1, onde o referido anticorpo anti-Anx-Al é um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento.
3. 3. Anticorpo anti-Anx-Al ou um seu fragmento de acordo com a reivindicação 2, onde o anticorpo monoclonal é humanizado.
4. 4. Anticorpo anti-Anx-Al ou um seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde o fragmento é um fragmento Fab, F(ab')2 ou Fv ou uma molécula Fv de cadeia simples (scFv).
5. 5. Anticorpo anti-Anx-Al ou um seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde a doença autoimune é seleccionada entre o grupo consistindo de artrite reumatóide (AR), esclerose múltipla (EM), lúpus eritematoso sistémico (LES), doença de Addison, doença de Graves, escleroderma, polimiosite, diabetes mellitus, uveo-retinite autoimune, colite ulcerosa, pênfigo vulgar, doença inflamatória do intestino, tiroidite autoimune e psoríase.
6. 6. Anticorpo anti-Anx-Al ou um seu fragmento de acordo com a reivindicação 5, onde a referida doença autoimune é seleccionada entre o grupo consistindo de artrite reumatóide (AR) , esclerose múltipla (EM) e lúpus eritematoso sistémico (LES).
7. 7. Utilização de um anticorpo anti-Anx-Al ou um seu fragmento que se liga a Anx-Al no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, onde a referida doença autoimune é seleccionada entre o grupo consistindo de artrite reumatóide (AR), esclerose múltipla (EM) , lúpus eritematoso sistémico (LES), doença de Addison, doença de Graves, escleroderma, polimiosite, diabetes mellitus, uveo-retinite autoimune, colite ulcerosa, pênfigo vulgar, doença inflamatória do intestino, tiroidite autoimune e psoriase.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, onde a referida doença autoimune é seleccionada entre o grupo consistindo de artrite reumatóide (AR), esclerose múltipla (EM) e lúpus eritematoso sistémico (LES). Lisboa, 2015-04-27