PT2328417E - Compostos, composições e métodos para o tratamento de doenças causadas por -amiloide e sinucleinopatias - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSTOS, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS CAUSADAS POR β-AMILOIDE E SINUCLEINOPATIAS"

ÁREA TÉCNICA

Esta invenção refere-se a 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil) -1,2,4-triazol e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, composições farmacêuticas contendo 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol e o composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol para o tratamento de doença causada por amiloide Αβ, tal como observado na doença de Alzheimer, e sinucleinopatias, tal como observado na doença de Parkinson, e a utilização deste composto na preparação de medicamentos para esse tratamento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença de Alzheimer é caracterizada pela acumulação de um péptido formado por 39-43 aminoácidos denominado proteína β-amiloide ou Αβ, numa forma fibrilar, que existe como agregados nas placas extracelulares de amiloide e como amiloide dentro das paredes dos vasos sanguíneos cerebrais. Acredita-se que a deposição de agregado fibrilar Αβ na doença de Alzheimer seja prejudicial para o doente e, eventualmente, conduz à toxicidade e morte celular neuronal, marcas características da doença de Alzheimer. Cada vez mais evidências implicam o amiloide e, mais especificamente, a formação, deposição, acumulação e/ou persistência de agregados de Αβ, como um importante fator causador da patogénese da doença de Alzheimer. Além disso, para além da doença de Alzheimer, inúmeras outras 2 doenças causadas por amiloides envolvem a formação, deposição, acumulação e persistência de agregados de Αβ, incluindo a síndrome de Down, transtornos que envolvem a angiopatia congofílica, tais como, mas não limitados à hemorragia cerebral hereditária do tipo Dutch e a angiopatia cerebral causada por β-amiloide. A doença de Parkinson é um outro distúrbio humano caracterizado pela formação, deposição, acumulação, agregação e/ou persistência de depósitos de proteínas fibrilares anormais que demonstram muitas das características da amiloide. Acredita-se que na doença de Parkinson, uma acumulação de corpos de Lewy citoplasmáticos constituídos por agregados de filamentos de α-sinucleína seja importante na patogénese e como alvos terapêuticos. Novos agentes ou compostos capazes de inibir a formação, deposição, acumulação e/ou a persistência de α-sinucleína, ou romper as fibrilas ou agregados preformados de α-sinucleína (ou partes dos mesmos) são considerados como potenciais agentes terapêuticos para o tratamento da doença de Parkinson e sinucleinopatias afins. Um fragmento de 35 aminoácidos de α-sinucleína tem a capacidade de formar fibrilas ou agregados do tipo amiloide seja in vitro ou como observado nos cérebros de doentes com doença de Parkinson. 0 fragmento de a-sinucleína é um alvo terapêutico relativamente importante uma vez que se acredita que esta parte da a-sinucleína seja crucial para a formação de corpos de Lewy, como observado em todos os doentes com doença de Parkinson, sinucleinopatias e distúrbios relacionados. Além disso, a proteína α-sinucleína que forma fibrilas ou agregados, e é positiva para o ensaio de vermelho do Congo e Tioflavina S (manchas específicas usadas para detetar agregados de 3 fibrilas de amiloides), é encontrada como parte dos corpos de Lewy nos cérebros de doentes com a doença de Parkinson, doença dos corpos de Lewy (Lewy em Handbuch der Neurologie, M. Lewandowski, ed., Springer, Berlim pp. 920-933, 1912; Pollanen et al. , J. Neuropath. Exp. Neurol. 52: 183-191, 1993; Spillantini et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 95: 6469-6473, 1998; Arai et al., Neurosci. Lett. 259: 83-86, 1999), atrofia de múltiplos sistemas (Wakabayashi et al., Acta Neuropath 96:. 445-452, 1998), demência com corpos de Lewy, e a variante com corpo de Lewy da doença de Alzheimer. Na doença de Parkinson, os agregados desenvolvem-se nos cérebros de doentes com esta doença que são positivos para o ensaio de vermelho do Congo e Tioflavina S, e que contêm a estrutura secundária predominante de folha beta pregueada. O documento WO 2010/000372 divulga os compostos de fórmula (E) >E1

(E) e a sua utilização no tratamento e prevenção de uma doença limitada à agregação de proteína e/ou uma doença neurodegenerativa. O documento WO 2009/111611 divulga os compostos de fórmula

4 e sua utilização no tratamento de doença por causada pelo polipéptido das ilhotas (IAPP), tal como observado em diabetes do tipo 2. 3,5-bis(3,4-di-utilização no amiloide e Alzheimer e a 0 documento WO 03/101927 divulga hidroxifenil)-l-metil-2-pirazolina e sua tratamento de doenças causadas por sinucleinopatias tais como a doença de doença de Parkinson. O documento W02004/033432 divulga compostos de fórmula (I) OR5

(D e sua utilização como preventivo ou remédio para micose, em particular micoses profundas causadas por fungos profundos tais como candida e aspergillus e micose superficial causada por fungos tais como trichophyton. A amiloide como um alvo terapêutico para a doença de

Alzheimer também impõe um pesado fardo económico à sociedade. Um estudo recente estimou que o custo de cuidar de um doente com doença de Alzheimer com deficiências cognitivas graves em casa ou num lar de idosos, é mais do que 47 mil dólares por ano (A Guíde to Understanding

Alzheimer's Desease and Related Disorders) . Para uma doença que pode se estender de 2 a 20 anos, o custo total da doença de Alzheimer para as famílias e para a sociedade é impressionante. O custo económico anual da doença de

Alzheimer nos Estados Unidos em termos de despesas de saúde e salários perdidos tanto dos doentes como seus 5 cuidadores é estimado em 80 a 100 mil milhões de dólares (2003 Progress Report on Alzheimer's Disease) . 0 cloridrato de tacrina ("Cognex"), o primeiro fármaco aprovado pela FDA para a doença de Alzheimer, é um inibidor da acetilcolinesterase (Cutler e Sramek, N. Engl. J. Med. 328: 808 810, 1993). No entanto, este fármaco tem demonstrado êxito limitado na produção de melhoria cognitiva em doentes com a doença de Alzheimer e inicialmente tinha efeitos secundários relevantes, tais como a toxicidade do fígado. O segundo fármaco aprovado pela FDA, donepezil ("Aricept"), que também é um inibidor da acetilcolinesterase, é mais eficaz do que a tacrina, demonstrando ligeira melhoria cognitiva em doentes com doença de Alzheimer (Barner e Gray, Ann. Pharmacotherapy 32: 70-77, 1998; Rogers e Friedhoff, Eur. Neuropsych. 8:67-75, 1998), mas não se acredita que seja a cura. Assim sendo, é evidente que existe uma necessidade para tratamentos mais eficazes para doentes com doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer é caracterizada pela deposição e acumulação de um péptido formado por 39-43 aminoácidos denominado proteína beta-amiloide, Αβ ou β/Α4 (Glenner e Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120: 885-890, 1984;

Master et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 82: 4245-4249, 1985; Husby et al., Buli. WHO 71: 105-108, 1993). A Αβ é derivada por clivagem com protease de proteínas precursoras maiores denominados proteínas precursoras de β-amiloide (APPs) das quais há diversas variantes de splicing alternativo. As formas mais abundantes de APPs incluem proteínas que consistem em 695, 751 e 770 aminoácidos (Tanzi et al., Nature 31:528-530, 1988). 6 0 péptido Αβ pequeno é um componente principal que forma os depósitos de amiloide de "placas" nos cérebros de doentes com a doença de Alzheimer. Além disso, a doença de Alzheimer é caracterizada pela presença de inúmeros "emaranhados" neurofibrilares, que consistem em filamentos helicoidais emparelhados que se acumulam de forma anormal no citoplasma neuronal (Grundke-Iqbal et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 83: 4913-4917, 1986; Kosik et al. , Proc.

Natl. Acad. Sei. EUA 83:4044-4048, 1986; Lee et al.,

Science 251:675-678, 1991). A principal caracteristica patológica da doença de Alzheimer é, portanto, a presença de "placas" e "emaranhados", com β-amiloides sendo depositadas no núcleo central das placas. O outro tipo principal de lesão encontrado no cérebro com a doença de Alzheimer é a acumulação de β-amiloides nas paredes dos vasos sanguíneos, tanto no parênquima cerebral como nas paredes dos vasos das meninges que estão fora do cérebro. Os depósitos de β-amiloides localizados nas paredes dos vasos sanguíneos são referidos como cerebrovascular ou angiopatia congofílica (Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45: 79-90, 1986; Pardridge et al., J. Neurochem. 49: 1394-1401, 1987) .

Durante muitos anos tem havido um debate científico em curso sobre a importância da "β-amiloide" na doença de Alzheimer, e se as "placas" e "emaranhados" característicos desta doença eram uma causa ou apenas uma consequência da doença. Nos últimos anos, os estudos agora indicam que a β-amiloide é, de facto, um fator causal da doença de Alzheimer, e não deve ser considerada apenas como um espectador inocente. Foi demonstrado que a proteína Αβ de Alzheimer em cultura de células provoca a 7 degeneração das células nervosas em curtos períodos de tempo (Pike et al. Br. Res. 563: 311-314, 1991; J.

Neurochem. 64: 253-265, 1995). Os estudos sugerem que é a estrutura fibrilar (que consiste numa estrutura secundária predominante de folha β pregueada) que é responsável pelos efeitos neurotóxicos. Constatou-se também que a Αβ é neurotóxica em culturas de cortes do hipocampo (Harrigan et al. , Neurobiol. Aging 16: 779-789, 1995) e induz a morte das células nervosas em murganhos transgénicos (Games et al., Nature, 373:523-527, 1995; Hsiao et al.,

Science 274:99-102, 1996). A injeção de Αβ de Alzheimer em cérebro de murganho, também provoca declínio da memória e disfunção neuronal (Flood et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88: 3363-3366, 1991; Br. Res. 663: 271-276, 1994).

Provavelmente, a evidência mais convincente de que a Αβ está diretamente envolvida na patogénese da doença de Alzheimer vem de estudos genéticos. Foi descoberto que a produção de Αβ pode resultar de mutações na codificação do gene, seu precursor, a proteína precursora de β-amiloide (Van Broeckhoven et al. Science 248:1120-1122, 1990;

Murrell et al. , Science 254:97-99, 1991; Haass et al. ,

Nature. Med. 1:1291-1296, 1995). A identificação de mutações no gene da proteína precursora beta-amiloide que causam o início precoce da doença de Alzheimer familiar é o argumento mais forte de que a amiloide é fundamental para o processo patogénico subjacente a esta doença. Foram descobertas quatro mutações causadoras de doenças relatadas que demonstram a importância da Αβ na causa da doença de Alzheimer familiar (revistos em Hardy, Nature Genet. 1:233-234, 1992). Todos estes estudos sugerem que proporcionar um medicamento para reduzir, eliminar ou prevenir a formação, deposição, acumulação e/ou a persistência de fibrilas Αβ nos cérebros de doentes humanos servirá como uma terapêutica eficaz.

Doença de Parkinson e Sinucleinopatias A doença de Parkinson é um distúrbio neurodegenerativo que é caracterizado patologicamente pela presença de corpos de Lewy intracitoplasmáticos (Lewy em Handbuch der Neurologie, M. Lewandowski, ed., Springer, Berlim, págs. 920-933, 1912; Pollanen et ai., J. Neuropath. Exp. Neurol. 52:183-191, 1993), os principais componentes dos quais são filamentos que consistem em α-sinucleina (Spillantini et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 95:6469-6473, 1998; Arai et al., Neurosci. Lett. 259: 83-86, 1999), uma proteína de 140 aminoácidos (Ueda et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:11282-11286, 1993). Foram descritas duas mutações dominantes na α-sinucleína que causam o início precoce da doença de Parkinson familiar sugerindo que os corpos de

Lewy contribuem de forma mecânica para a degeneração de neurónios na doença de Parkinson e distúrbios afins (Polymeropoulos et al. Science 276:2045-2047, 1997; Kruger et al., Nature Genet. 18:106-108, 1998). Recentemente, estudos in vitro demonstraram que a a-sinucleína recombinante pode realmente formar fibrilas ou agregados do tipo corpos de Lewy (Conway et al., Nature Med. 4:1318-1320, 1998; Hashimoto et al., Brain Res. 799:301-306, 1998; Nahri et al. , J. Biol. Chem. 274:9843-9846, 1999).

Mais importante ainda, ambas as mutações de a-sinucleína ligadas à doença de Parkinson aceleram este processo de agregação, o que demonstra que tais estudos in vitro podem ter relevância para a patogénese da doença de Parkinson. A agregação de alfa-sinucleína e a formação de fibrilas preenchem os critérios de um processo de polimerização 9 dependente de nucleação (Wood et al. , J. Biol. Chem. 274:19509-19512, 1999). A este respeito, a formação ou agregação de fibrilas de α-sinucleína assemelha-se às das fibrilas de proteina β-amiloide (Αβ) de Alzheimer. A proteína alfa-sinucleína recombinante, e o componente não Αβ (conhecido como NAC) , que é um fragmento de péptido de 35 aminoácidos de α-sinucleína, ambos têm a capacidade de formar fibrilhas quando incubados a 37 °C, e são positivos com manchas amiloide, tais como o vermelho do Congo (demonstrando uma birrefringência vermelho/verde, quando vistos sob luz polarizada) e Tioflavina S (demonstrando fluorescência positiva) (Hashimoto et ai., Brain Res. 799: 301-306, 1998; Ueda et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90: 11282-11286, 1993).

As sinucleínas são uma família de proteínas neuronais, pré-sinápticas, pequenas, compostas de α-, β-, e γ-sinucleínas, das quais apenas os agregados de a-sinucleína foram associados com várias doenças neurológicas (Ian et al., Clinicai Neurose. Res. 1:445-455, 2001; Trojanowski e Lee, Neurotoxicology 23:457-460, 2002). O papel das sinucleínas (e, em particular, a alfa-sinucleína) na etiologia de diversas doenças neurodegenerativas, foi desenvolvido a partir de várias observações. Patologicamente, a sinucleína foi identificada como um componente principal dos corpos de Lewy, as inclusões características da doença de Parkinson, e um seu fragmento foi isolado de placas de amiloides de uma doença neurológica diferente, a doença de Alzheimer. Bioquimicamente, a α-sinucleína recombinante demonstrou que forma fibrilas ou agregados que recapitulam as características ultra-estruturais da alfa-sinucleína isolada de doentes com demência com corpos de Lewy, doença 10 de Parkinson e atrofia de múltiplos sistemas. Além disso, a identificação de mutações no gene da sinucleina, ainda que em casos raros da doença familiar de Parkinson, demonstraram uma relação inequívoca entre a patologia da sinucleina e as doenças neurodegenerativas. O envolvimento comum da α-sinucleína num espectro de doenças tais como a doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas e a variante com corpo de Lewy da doença de Alzheimer levou à classificação destas doenças no âmbito do termo genérico de "sinucleinopatias".

As fibrilas ou agregados de a-sinucleína da doença de Parkinson e as fibrilas de Αβ da doença de Alzheimer, ambas consistem predominantemente numa estrutura de folha β pregueada. Verificou-se que os compostos que inibem a formação de fibrilas de Αβ da doença de Alzheimer, também demonstraram ser eficazes na inibição da formação de fibrilas ou agregação de α-sinucleína, como ilustrado nos Exemplos da presente invenção. Estes compostos, portanto, também serviriam como agentes terapêuticos para a doença de Parkinson e outras sinucleinopatias, para além de ter eficácia como terapêutica para a doença de Alzheimer. A doença de Parkinson e a doença de Alzheimer são caracterizadas pela acumulação inadequada de agregados insolúveis compreendidos principalmente por proteínas mal dobradas que são enriquecidas na estrutura secundária de folha β pregueada (revisto em Cohen et al. Nature 426:905-909, 2003; Chiti et al.. Annu. Rev. Biochem., 75:333-366, 2006) . Na doença de Parkinson, a α-sinucleína é o constituinte mais importante destes agregados, como parte de corpos de Lewy, e mutações em α-sinucleína que aumentam a sua propensão para o mal dobramento e agregação são 11 observadas na doença de Parkinson familiar (Polymeropoulos et ai., Science 276:1197-1199, 1997; Papadimitriou et ai., Neurology 52:651-654, 1999). A disfunção mitocondrial, especificamente em decorrência da deficiência no complexo I da cadeia de transporte de eletrões, também é uma caracteristica comum da doença de Parkinson (Schapira et al., J. Neurochem, 54:823-827, 1990; revisada em Greenamyre et al. , IUBMB Life,· 52:135-141, 2001). A evidência direta das deficiências mitocondriais na etiologia da doença de Parkinson primeiro veio a partir da observação de que ο MPP+ (l-metil-4-fenil-2,3-di-hidropiridínio), o metabolito ativo da toxina N-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP) do parkinsonismo inibe o complexo I (Nicklas et ai., Life Sei., 36:2503-2508, 1985). Subsequentemente, a rotenona, outro inibidor do complexo I, demonstrou ser um modelo melhorado para a agregação de α-sinucleina porque reproduz os agregados citoplasmáticos da α-sinucleína acima mencionados, além das mudanças comportamentais e perda de neurónios dopaminérgicos vistos no modelo MPTP. A toxicidade da rotenona deste tipo é vista em vários sistemas de modelo, incluindo ratos (Betarbet et al. Nat. Neurosci., 3:1301-1306, 2000; Panov et ai., J. Biol. Chem., 280:2026-42035, 2005), cortes de cérebro de ratos (Sherer et ai., J. Neurosci., 23:10756-10764, 2003; Testa et ai., Mol. Brain Res., 134:109-118, 2005), C. elegans (Ved et ai., J. Biol. Chem., 280:42655-42668, 2005) e células em cultura (Sherer et ai., J. Neurosci., 22:7.006-7.015, 2002) e demonstrou ser uma consequência do dano oxidativo aumentado resultante da inibição do complexo I. 12

Para entender melhor a relação do dano oxidativo à patogénese da α-sinucleina mutante, foi estabelecida uma linha celular de neuroblastoma (usando células BE-M17) na técnica que sobre-expressa a α-sinucleína A53T. Nestas células, a α-sinucleina A53T agrega em resposta a uma variedade de agentes de indução de stress oxidativo e potência a disfunção mitocondrial e morte celular (Ostrerova-Golts et al., J. Neurosci., 20:6048-6054, 2000) . Estas células são susceptíveis ao tratamento com rotenona como indutor de stress oxidativo e, desse modo, são particularmente úteis para os agentes de teste que possam inibir a agregação/fibrilogénese de α-sinucleina. São desesperadamente procuradas a descoberta e a identificação de novos compostos ou agentes como terapêuticos potenciais para deter a formação, a deposição, a acumulação e/ou a persistência de amiloide que ocorre na doença de Alzheimer e doença de Parkinson.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a 3,5-bis(3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. São aqui divulgados compostos que podem ser úteis no tratamento de doenças causadas por β-amiloide e sinucleinopatias.

Os compostos são: compostos de fórmula:

em que: 13

Ri e R2, e R3 e R4 são, grupos hidroxilo independentemente posicionados numa das posições selecionadas do grupo que consiste em 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 3,5; 3,6; 4,5; 4, 6 e 5,6, e R é selecionado de uma sulfonamida, heteroarilo, tricicloalquilo e -C(0)NR', em que R' é selecionado de H ou CH3 ou seus ésteres ou sais farmaceuticamente aceitáveis. São também fornecidos quaisquer derivados farmaceuticamente aceitáveis, incluindo sais, ésteres, éteres ou ésteres de enol, acetais, cetais, orto-ésteres, hemiacetais, hemicetais, solvatos, hidratos ou pro-fármacos de 3,5-bis(3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem, mas não estão limitados a, sais de aminas, tais como, mas não limitados a N,N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaina, colina, amoníaco, dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, etilenodiamina, N-metilglucamina, procaína, N-benzilfenetilamina, l-para-clorobenzil-2-pirrolidin-1'-ilmetilbenzimidazol, dietilamina e outras alquilaminas, piperazina, tris (hidroximetil)aminometano, sais de metais alcalinos, tais como, mas não limitados a lítio, potássio e sódio, sais de metais alcalinoterrosos, tais como, mas não limitados a bário, cálcio e magnésio, sais de metais de transição, tais como, mas não limitados a zinco e outros sais de metais, tais como, mas não limitados a hidrogenofosfato de sódio e fosfato dissódico, e também incluindo, mas não limitado a, sais de ácidos minerais, tais como, mas não limitado a cloridratos e sulfatos, sais de ácidos orgânicos, tais como, mas não limitado a acetatos, lactatos, malatos, tartaratos, citratos, ascorbatos, succinatos, butiratos, valeratos e fumaratos. 14

As formulações farmacêuticas para administração por uma via apropriada e meios que contêm concentrações eficazes de 3,5-bis (3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol ou derivados farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais, ésteres, éteres ou ésteres de enol, acetais, cetais, orto-ésteres, hemiacetais, hemicetais, solvatos hidratos ou pró-fármacos de 3,5-bis(3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol que fornecem quantidades eficazes para o tratamento de doenças s, são também fornecidos.

As formulações são composições adequadas para administração por qualquer via desejada e incluem soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, comprimidos dispersáveis, pílulas, cápsulas, pós, pós secos para inalação, formulações de libertação prolongada, aerossóis para administração nasal e respiratória, pensos para administração transdérmica e qualquer outra via adequada. As composições devem ser adequadas para administração oral, administração parentérica por injeção, incluindo por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa como uma solução ou emulsão injetável aquosa ou oleosa, administração transdérmica e outras vias selecionadas. A utilização de 3,5-bis(3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol e suas composições para romper, desagregar e causar a remoção, redução ou eliminação das fibrilas ou agregados de β-amiloide ou α-sinucleína é proporcionada, desse modo, fornecendo novos tratamentos para doenças causadas por β-amiloide e sinucleinopatias. A invenção refere-se a 3,5-bis (3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol para uso no tratamento, prevenção ou 15 atenuação de um ou mais sintomas de doenças causadas por amiloides ou amiloidoses, incluindo, mas não limitadas a doenças associadas com a formação, deposição, acumulação ou persistência de fibrilas de β-amiloides.

As doenças causadas por amiloides, incluem, mas não estão limitadas à doença de Alzheimer, sindrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose do tipo Dutch, e angiopatia cerebral causada por β-amiloide. A presente invenção também se refere a 3,5-bis(3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol para uso no tratamento, prevenção e atenuação de um ou mais sintomas de doenças causadas por sinucleina ou sinucleinopatias. Numa forma de realização, o 3,5-bis(3,4-di-hidroxi-fenil)-1,2,4-triazol inibe ou impede o crescimento de fibrilas de a-sinucleína, e/ou provoca a desmontagem, rompimento, e/ou desagregação de agregados preformados de α-sinucleína e depósitos de proteína associados com a α-sinucleína. As doenças causadas por sinucleina incluem, mas não estão limitadas à doença de Parkinson, doença de Parkinson familiar, doenças dos corpos de Lewy, a variante com corpo de Lewy da doença de Alzheimer, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, e o complexo de Parkinsonismo/demência de Guam.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura IA mostra vários espectros de dicroísmo circular, que ilustram que as fibrilas de Αβ da doença de Alzheimer são rompidas pelos compostos testados a 1:1 peso/peso. A Figura 1B mostra graficamente a % de inibição. 16 A Figura 2 mostra os espectros de dicroísmo circular comparativos que ilustram que a α-sinucleína forma estrutura rica em folha β após 4 dias de agitação a 37 °C. A Figura 3 mostra vários espectros de dicroísmo circular que ilustram que os compostos testados inibem a agregação α-sinucleína numa proporção de 1:1 peso/peso. A Figura 3B mostra graficamente a % de inibição. A Figura 4 mostra vários espectros de dicroísmo circular que ilustram que os compostos inibem a agregação de a-sinucleína numa proporção de 1:0,1 p/p· A Figura 4B mostra graficamente a % de inibição. A Figura 5 resume graficamente os resultados medidos por Tio T, dos compostos testados para inibir a formação ou agregação de fibrilas de Αβ. A Figura 6 resume graficamente os resultados medidos por Vermelho do Congo, dos compostos testados para inibir a formação ou agregação de fibrilas de Αβ. A Figura 7 resume graficamente os resultados medidos por Tio T, dos compostos testados para inibir a formação ou agregação de fibrilas de α-sinucleína. A Figura 8 resume graficamente os resultados medidos por Vermelho do Congo, dos compostos testados para inibir a formação ou agregação de fibrilas de α-sinucleína.

As Figuras 9 A-D são exemplos de microfotografias fluorescentes que demonstram os efeitos da rotenona no número de agregados positivos para Tioflavina S. A Figura 17 9Α é o veículo sozinho, a Figura 9B é 1 μΜ de rotenona, a Figura 9C é 5 μΜ a baixa ampliação, e a Figura 9D é 5 μιη em alta ampliação. A Figura 9E resume a análise quantitativa da Tioflavina S em resposta ao tratamento com rotenona.

As Figuras 10 A-C são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram uma redução dos agregados positivos para tioflavina S (fluorescência verde), após aplicação de um composto de controlo positivo. A Figura 10 A é não tratada, a Figura 10 B mostra a 500 ng/mL do composto de controlo positivo e a Figura 10 C mostra 1 pg/mL de composto de controlo positivo. A Figura 10D resume a análise quantitativa da redução na agregação dependente da dose.

As Figuras 11 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram os efeitos do composto 1 na presença de agregados induzidos por rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células de uma forma dependente da dose. A Figura 11 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 11 B-D, respectivamente, mostram 500 ng/mL, 1 pg/mL e 2 pg/mL do composto 1. A Figura 11 D resume a análise quantitativa dos efeitos do composto 1.

As Figuras 12 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 2 reduz fortemente a presença de agregados induzidos por rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células. A Figura 12 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 12 B-D, respectivamente, mostram a 500 ng/mL, 1 pg/mL e 2 pg/mL do composto 2. A Figura 12E resume a análise quantitativa dos efeitos anti-agregação do composto 2. 18

As Figuras 13 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 3 reduz a presença de agregados induzidos por rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células de uma forma dependente da dose. A Figura 13 A é não tratada (apenas rotenona) , e as Figuras 13 B-D, respectivamente, mostram a 500 ng/mL, 1 pg/mL e 2 pg/mL do composto 3. A Figura 13 E resume a análise quantitativa dos efeitos anti-agregação do composto 3.

As Figuras 14 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 4 reduz minimamente a presença de agregados induzidos por rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células de uma forma dependente da dose. A Figura 14 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 14 B-D, respectivamente, mostram 500 ng/mL, 1 pg/mL e 2 pg/mL do composto 4. Figura 14 E resume a análise quantitativa dos efeitos do composto 4.

As Figuras 15 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 5 reduz moderadamente a presença de agregados induzidos por rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células de uma forma dependente da dose. A Figura 15 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 15 B-D, respectivamente, mostram 500 ng/mL, 1 pg/mL e 2 pg/mL do composto 5. A Figura 15 E resume a análise quantitativa dos efeitos anti-agregação do composto 5.

As Figuras 16 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 6 afecta minimamente a presença de agregados induzidos por rotenona 19 positivos para tioflavina S (verde) em células de uma forma dependente da dose. A Figura 16 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 16 B-D, respectivamente,

mostram a 500 ng/mL, 1 yg/mL e 2 yg/mL do composto 6. A

Figura 16 E resume a análise quantitativa dos efeitos do composto 6.

As Figuras 17 C-A são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 7 reduz moderadamente a presença de agregados induzidos por

rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células de modo dependente da dose. A Figura 17 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 17 B-C mostram, respectivamente, 500 ng/mL, e 2 yg/mL do composto 7. A

Figura 17 D resume a análise quantitativa dos efeitos anti-agregação do composto 7.

As Figuras 18 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 8 reduz moderadamente a presença de agregados induzida por rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células de uma forma dependente da dose. A Figura 18 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 18 B-D, respectivamente,

mostram 500 ng/mL, 1 yg/mL e 2 yg/mL do composto 8. A

Figura 18 E resume a análise quantitativa dos efeitos anti-agregação do composto 8.

As Figuras 19 A-D são exemplos de fotomicrografias fluorescentes que demonstram que o composto 9 reduz a presença de agregados induzidos por rotenona positivos para tioflavina S (verde) em células de uma forma dependente da dose. A Figura 19 A é não tratada (apenas rotenona), e as Figuras 19 B-D, respectivamente, mostram 20 500 ng/mL, 1 yg/mL e 2 yg/mL do composto 9. A Figura 19 E resume a análise quantitativa dos efeitos anti-agregação de composto 9, em que *p<0,05 em relação a apenas 1 yM de rotenona. A Figura 20 é um gráfico que mostra a redução de 35-45% na viabilidade das células após 2 dias de tratamento com rotenona medida pelo ensaio de Citotoxicidade XTT. A Figura 21 é um gráfico que mostra a capacidade do composto de controlo positivo para inibir a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de Citotoxicidade XTT . A Figura 22 A é um gráfico que mostra que o composto 1 não é tóxico até 10 yg/mL. A Figura 22 B é um gráfico que mostra a capacidade de um composto para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de Citotoxicidade XTT. A Figura 23 A é um gráfico que mostra que o composto 2 não é tóxico até 25 yg/mL. A Figura 23 B é um gráfico que mostra a capacidade do composto 2 para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de Citotoxicidade XTT. A Figura 24 A é um gráfico que mostra que o composto 3 não é tóxico até 50 yg/mL. A Figura 24 B é um gráfico que mostra a capacidade do composto 3 para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de Citotoxicidade XTT. 21 A Figura 25 A é um gráfico que mostra que o composto 4 não é tóxico até 25 pg/mL. A Figura 25 B é um gráfico que mostra a capacidade do composto 4 para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de Citotoxicidade XTT. A Figura 26 A é um gráfico que mostra que o composto 5 não é tóxico até 25 pg/mL. A Figura 26 B é um gráfico que mostra a incapacidade do composto 5 para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de

Citotoxicidade XTT. A Figura 27 A é um gráfico que mostra que o composto 6 não é tóxico até 50 pg/mL. A Figura 27 B é um gráfico que mostra a capacidade do composto 6 para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de

Citotoxicidade XTT. A Figura 28 A é um gráfico que mostra que o composto 7 não é tóxico até 50 pg/mL. A Figura 28 B é um gráfico que mostra a capacidade do composto 7 para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de

Citotoxicidade XTT. A Figura 29 A é um gráfico que mostra que o composto 8 não é tóxico até 25 pg/mL. A Figura 29 B é um gráfico que mostra a capacidade do composto 8 para proteger contra a toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de

Citotoxicidade XTT. A Figura 30 A é um gráfico que mostra que o composto 9 não é tóxico até 25 pg/mL. A Figura 30 B é um gráfico que mostra a incapacidade do composto 9 para proteger contra a 22 toxicidade induzida por rotenona medida pelo ensaio de Citotoxicidade XTT. A Figura 31 é um gráfico que mostra tempos de travessia da trave e os efeitos do tratamento com o composto. 0 tratamento com os compostos 2 e 7 melhoram o desempenho motor no teste de travessia da trave. Após três meses de tratamento, o composto 2 melhora o desempenho motor (medido por uma redução no tempo de travessia) no teste de travessia da trave de forma significativa (p<0,05) em 49%, em relação aos murganhos tratados com o veiculo com a mesma idade. Aos seis meses de tratamento, o composto 7 melhora o desempenho motor no teste de travessia da trave de forma significativa (p<0,05) em 35%, em relação aos murganhos tratados com o veiculo com a mesma idade. Além disso, o composto 7 mostra uma tendência geral para melhorar o desempenho motor em 39% aos três meses de tratamento, em relação aos murganhos tratados com o veículo com a mesma idade. A Figura 32 é um gráfico que mostra os tempos de giro no teste de poste e os efeitos do tratamento com o composto. 0 tratamento com o composto 7 melhora o desempenho motor no teste de poste. Aos 3 meses de tratamento, o composto 7 tende a melhorar o desempenho motor (medido por uma redução no tempo de giro) no teste de poste e aos 6 meses de tratamento, o composto 7 melhora, de forma significativa (p<0,01) o desempenho em 41%, em relação ao desempenho antes do tratamento. Depois de 6 meses de tratamento com o composto 7, o desempenho é similar aos murganhos não transgénicos de 16 meses de idade. Os murganhos tratados com o veículo tiveram um desempenho 23 similar a antes do tratamento e aos 3 e 6 meses de tratamento. A Figura 33 e um gráfico que mostra tempos de travessia da trave e os efeitos do composto 7. Às seis semanas de tratamento, o composto 7 melhora, de forma significativa, o desempenho motor no teste de travessia da trave (medido por uma redução de 3 6% de redução no tempo de travessia) , em relação ao murganho tratado com o veiculo com a mesma idade (**p<0,01). As barras representam a média + SEM, n=8 por grupo. A Figura 34 (Painéis A-F) são fotomicrografias que mostram que o tratamento com o composto 7 provoca uma redução de níveis de α-sinucleína em cérebro de murganho transgénico de 18 meses de idade evidenciado por imuno-histoquimica. Os murganhos tratados com o composto 7 (painéis C-D) exibem significativamente menos α-sinucleína humana intraneuronal no córtex frontal comparados com os murganhos tratados com o veiculo (painéis A-B) . Os cérebros de murganhos do tipo selvagem não transgénicos são desprovidos de manchas de α-sinucleína humana e são mostrados como controlo para a especificidade do anticorpo para a α-sinucleína humana derivada do transgene (E e F) . A análise e quantificação da imagem revela que o tratamento com o composto 7 provoca uma redução significativa de 81% de objetos positivos a α-sinucleína. Os dados são expressos como percentagens da área ocupada pelos objetos positivos. As barras representam a média + SEM, n-5 para os murganhos tratados com veículo, n=ll para os tratados com o composto 7, e n=4 para os não transgénicos (Não-Tg). ***p<0,001 em relação aos murganhos 24 tratados com o veículo por ANOVA de uma via e o ensaio de Turkey-Kramer post hoc. A Figura 35, painel A é uma fotografia de uma análise western blot que mostra os níveis de α-sinucleína na fração em partículas da parte anterior de cérebros de murganhos transgénicos que expressam α-sinucleína tratados durante 6 meses com o composto 7 ou controlo do veículo. 0 painel B mostra gráficos de barra que representam a média quantificada das intensidades de banda de duas análises western blot independentes que indicam uma significativa redução de 69% no geral e uma redução de 58% nas fêmeas nos níveis de monómero de α-sinucleína depois de tratamento com o composto 7. As intensidades de banda do monómero de α-sinucleína foram normalizadas contra as intensidades da banda 25 kDa (controlo de carga). *p<0,05, **p<0,01 em relação aos tratados com o veiculo. As barras representam a média + SEM. A Figura 36, painel A é uma fotografia de uma análise western blot que mostra os níveis de α-sinucleína na fração citosólica da parte anterior de cérebros de murganhos transgénicos que expressam α-sinucleína tratados durante 6 meses com o composto 7 ou controlo do veiculo. 0 painel B mostra gráficos de barra que representam as intensidades de banda quantificadas da análise western blot no painel A que indica um significativa redução de 73% no geral e uma redução de 48% nas fêmeas nos níveis de monómero de α-sinucleína depois de tratamento com o composto 7. As intensidades de banda do monómero de a-sinucleína foram normalizadas contra as intensidades da banda de β-actina (controlo de carga). *p<0,05 em relação 25 aos tratados com veículo. As barras representam a média + SEM. A Figura 37, painel A é uma fotografia de uma análise western blot que mostra os níveis de α-sinucleína na fração em partículas da parte superior de cérebros de murganhos transgénicos que expressam α-sinucleína de 4-5 meses de idade tratados durante 6 semanas com o composto 7 ou controlo do veículo. 0 painel B mostra um gráfico de barras que representa a média das intensidades de banda quantificadas de quatro análises western blot independentes que indicam que o tratamento com o composto 7 resulta numa significativa redução de 45% nos níveis de monómero de α-sinucleína em relação aos controlos tratados com veículo. As intensidades de banda do monómero de a-sinucleína foram normalizadas contra as intensidades da banda 25 kDa (controlo de carga) . *p<0,05, em relação aos tratados com o veículo. As barras representam a média + SEM. A Figura 38, painel A é uma fotografia de uma análise western blot que mostra os níveis de α-sinucleína na fração citosólica da parte anterior de cérebros de murganhos transgénicos que expressam α-sinucleína de 4-5 meses de idade, tratados durante 6 semanas com o composto 7 ou controlo do veículo. 0 painel B mostra um gráfico de barras que representa a média das intensidades de banda quantificadas de quatro análises western blot independentes que indicam que o tratamento com o composto 7 resulta numa significativa redução de 71% nos niveis de monómero de α-sinucleína em relação aos controlos tratados com veículo. As intensidades de banda do monómero de a-sinucleína foram normalizadas contra as intensidades da 26 banda de α-tubulina (controlo de carga). **p<0,01 em relação aos tratados com o veículo. As barras representam a média + SEM. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

Neste pedido, os seguintes termos terão os seguintes significados, sem levar em conta se os termos são usados de outra forma noutro lugar na literatura ou de outra forma na técnica conhecida.

Tal como aqui utilizado "doenças causadas por amiloide" ou "amiloidose" são doenças associadas com a formação, deposição, acumulação ou a persistência de fibrilas Αβ. Tais doenças incluem, mas não estão limitadas à doença de Alzheimer, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose do tipo Dutch, e angiopatia cerebral causada por β-amiloide.

Tal como aqui utilizado, "doenças causadas por sinucleína" ou "sinucleinopatias" são doenças associadas com a formação, deposição, acumulação ou a persistência de a-sinucleína. Tais doenças incluem, mas não estão limitadas à doença de Parkinson, doença de Parkinson familiar, doença de corpos de Lewy, a variante com corpo de Lewy da doença de Alzheimer, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, e o complexo parkinsonismo-demência de Guam. "Fibrilogénese" refere-se à formação, deposição, acumulação, agregação e/ou a persistência de fibrilas, 27 filamentos, inclusões, depósitos de β-amiloide, bem como fibrilas, filamentos, inclusões, depósitos, agregados ou similares de oí-sinucleina. "Inibição de fibrilogénese" refere-se à inibição da formação, deposição, acumulação, agregação e/ou a persistência de tais fibrilas de β-amiloides ou depósitos semelhantes a fibrilas de α-sinucleina. "Perturbação de fibrilas ou fibrilogénese" refere-se ao rompimento de β-amiloides ou α-sinucleína preformados, que geralmente existem numa estrutura secundária de folha β pregueada pré-dominante. Essas perturbações pelos compostos aqui proporcionados podem envolver a redução acentuada ou desmontagem de agregados de amiloide ou sinucleina como foi avaliado por vários métodos, tais como a fluorometria de Tioflavina T, ligação a vermelho do Congo, espectros de dicroismo circular, ensaios baseados em tioflavina S e em células, tais como ensaios de agregação de α-sinucleína e de citotoxicidade XTT e como demonstrado pelos Exemplos apresentados no presente pedido. "Neuroproteção" ou "neuroprotetor" refere-se à capacidade de um composto para proteger, reduzir, atenuar, melhorar e/ou reduzir os danos às células nervosas (neurodegeneração). "Mamífero" inclui tanto mamíferos humanos como mamíferos não humanos, tais como animais de companhia (cães, gatos e semelhantes), animais de laboratório (por exemplo, murganhos, ratos, porquinhos da índia, e semelhantes) e 28 animais de criação (gado, cavalos, ovelhas, cabras, porcos, e semelhantes) . "Excipiente farmaceuticamente aceitável" significa um excipiente que é convencionalmente útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geralmente seguro, não tóxico, e desejável, e inclui excipientes que são aceitáveis para utilização veterinária ou para utilização farmacêutica humana. Tais excipientes podem ser sólidos, líquidos, semissólidos ou, no caso de uma composição em aerossol, gasosos.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade que, quando administrada a um indivíduo ou animal para o tratamento de uma doença, é suficiente para afetar o grau desejado de tratamento, prevenção ou atenuação dos sintomas da doença. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "dose terapeuticamente eficaz" em certas formas de realização inibe, reduz, perturba, desmonta a formação, deposição, acumulação e/ou persistência de agregados de β-amiloide ou a-sinucleína, ou trata, impede, ou melhora um ou mais sintomas de uma doença causada por amiloide ou uma sinucleinopatia, numa quantidade mensurável numa forma de realização, em pelo menos 20%, noutra forma de realização, pelo menos 40%, noutra forma de realização em pelo menos, 60%, e ainda em outra forma de realização, pelo menos, 80%, relativamente a um indivíduo não tratado. As quantidades eficazes de 3,5-bis (3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol ou uma sua composição para tratamento de um indivíduo mamífero são de cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal do indivíduo/dia, tal como de cerca de 1 a cerca de 100 mg/kg/dia, em outra forma de realização, de cerca de 10 a 29 cerca de 500 mg/kg/dia. Acredita-se que um amplo intervalo de doses da composição divulgada sejam tanto seguras como eficazes. O termo "componente de libertação sustentada" é aqui definido como um composto ou compostos, que incluem, mas não se limitam a polímeros, matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, lipossomas, microesferas, ou outros semelhantes, ou uma combinação dos mesmos, que facilita a libertação sustentada do ingrediente ativo.

Se o complexo for solúvel em água, o mesmo pode ser formulado num tampão apropriado, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, ou outras soluções fisiologicamente compatíveis. Alternativamente, se o complexo resultante tiver fraca solubilidade em solventes aquosos, então o mesmo poderá ser formulado com um tensioativo não iónico, tal como Tween ou polietileno glicol. Desse forma, os compostos e os seus solventes fisiológicos podem ser formulados para administração por inalação ou insuflação (quer através da boca ou do nariz) ou administração oral, bucal, parentérica ou retal, como exemplos.

Tal como aqui utilizado, os derivados farmaceuticamente aceitáveis de um composto incluem sais, ésteres, éteres de enol, ésteres de enol, acetais, cetais, orto-ésteres, hemiacetais, hemicetais, solvatos, hidratos ou pró-fármacos destes. Tais derivados podem ser prontamente preparados pelos especialistas na técnica usando métodos conhecidos para tal derivação. Os compostos produzidos podem ser administrados a animais ou seres humanos sem efeitos tóxicos substanciais e ou são farmaceuticamente 30 ativos ou são pró-fármacos. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a sais de aminas, tais como, mas não limitados a N,N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, amoníaco, dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, etilenodiamina, N-metilglucamina, procaína, N-benzilfenetilamina, l-para-clorobenzil-2-pirrolidin-l'-ilmetil-benzimidazol, dietilamina e outras alquilaminas, piperazina e tris(hidroximetil)aminometano; sais de metais alcalinos, tais como, mas não limitados a lítio, potássio e sódio; sais de metais alcalino terrosos, tais como, mas não limitados a bário, cálcio e magnésio; sais de metais de transição, tais como, mas não limitados a zinco; e outros sais de metais, tais como, mas não limitados a hidrogenofosfato de sódio e fosfato dissódico; e também incluindo, mas não limitado a sais de ácidos minerais, tais como, mas não limitado a cloridratos e sulfatos; e sais de ácidos orgânicos, tais como, mas não limitado a acetatos, lactatos, malatos, tartaratos, citratos, ascorbatos, succinatos, butiratos, valeratos e fumaratos. Os ésteres farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, cicloalquilo e ésteres de heterociclilo de grupos ácidos, incluindo, mas não limitados a ácidos carboxílicos, ácidos fosfóricos, ácidos fosfínicos, ácidos sulfónicos, ácidos sulfínicos, e ácidos borónicos. Os éteres de enol farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a derivados de fórmula C=C(OR) em que R é hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, cicloalquilo ou heterociclilo. Os ésteres de enol farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a derivados de fórmula C=C(0C(0)R) em que R é 31 hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, cicloalquilo ou heterociclilo. Os solvatos e hidratos farmaceuticamente aceitáveis, são os complexos de um composto com uma ou mais moléculas de solvente ou de água, ou de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 10, ou um a cerca de 2, 3 ou 4, moléculas de solvente ou de água.

Tal como aqui utilizado, tratamento significa qualquer maneira na qual um ou mais dos sintomas de uma doença ou distúrbio são melhorados ou então são beneficamente alterados. O tratamento de uma doença também inclui a prevenção da ocorrência da doença num indivíduo que pode estar predisposto à doença mas que ainda não sente ou exibe os sintomas da doença (tratamento profilático), a inibição da doença (retardar ou deter o seu desenvolvimento), proporcionar atenuação dos sintomas ou os efeitos secundários da doença (incluindo tratamento paliativo), e o alívio da doença (causando a regressão da doença), tal como por ruptura dos agregados preformados de β-amiloide ou α-sinucleína. Tal como aqui utilizado, a atenuação dos sintomas de um distúrbio particular por administração de um composto particular ou da composição farmacêutica refere-se a qualquer redução, seja permanente ou temporária, duradoura ou transitória que possa ser atribuída ou associada à administração da composição.

Como aqui utilizado, acredita-se que a inibição da formação, deposição, acumulação, agregação e/ou da persistência de fibrilas de α-sinucleína seja um tratamento eficaz para um inúmeras doenças que envolvem a οί-sinucleína, tais como a doença de Parkinson, doença de corpos de Lewy e atrofia de múltiplos sistemas. 32

Tal como aqui utilizado, um pró-fármaco é um composto que, após administração in vivo, é metabolizado por uma ou mais etapas ou processos ou então é convertido na forma biológica, farmacêutica ou terapeuticamente ativa do composto. Para produzir um pró-fármaco, o composto farmaceuticamente ativo é modificado de tal modo que o composto ativo será regenerado por processos metabólicos. 0 pró-fármaco pode ser concebido para alterar a estabilidade metabólica ou as caracteristicas de transporte de um fármaco, para mascarar os efeitos secundários ou a toxicidade, para melhorar o sabor de um fármaco ou para alterar outras caracteristicas ou propriedades de um fármaco. Em virtude do conhecimento dos processos farmacodinâmicos e do metabolismo in vivo do fármaco, os especialistas na técnica, uma vez que um composto farmaceuticamente ativo seja conhecido, podem conceber pró-fármacos do composto (ver, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nova Iorque, páginas 388-392). São apresentadas as estruturas químicas de alguns dos compostos aqui divulgados. Os nomes dos compostos são vários nomes da IUPAC (nomes derivados de acordo com o sistema IUPAC aceite (União Internacional de Química Pura e Aplicada) estabelecido pela coligação da Comissão sobre Nomenclatura de Química Orgânica e da Comissão sobre Físico-Química Orgânica, como pode ser encontrado em http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac), nomes derivados de nomes IUPAC por adição ou substituição (por exemplo, pela utilização de "3,4-metilenodioxifenil" derivado de "fenilo", em vez de "benzo[1,3]dioxol-5-il") e nomes derivados dos nomes dos reagentes (por exemplo, pela 33 utilização de "ácido 3,4-di-hidroxianilida 3,4-di-hidroxibenzóico" em vez de "N-(3,4-di-hidroxifenil)-3,4-di-hidroxibenzamida"). No entanto, os nomes usados são explicitamente equiparados a estruturas químicas, e acredita-se que sejam facilmente entendidos por uma pessoa com conhecimentos correntes na técnica.

Um "agente farmacêutico" ou "agente farmacológico" ou "composição farmacêutica" refere-se a um composto ou combinação de compostos utilizados para o tratamento, de preferência numa forma pura ou quase pura. Na memória descritiva, os agentes farmacêuticos ou farmacológicos incluem o composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol. 0 composto são desejavelmente purificado a 80% de homogeneidade, e de preferência a 90% de homogeneidade. Acredita-se que os compostos e composições purificados a 99,9% de homogeneidade sejam vantajosos. Como teste ou confirmação, um composto homogéneo adequado em HPLC produziria, o que os peritos na arte identificariam como uma banda simples de pico pronunciado.

Deve ser entendido que os compostos aqui divulgados podem conter centros quirais. Tais centros quirais podem ser da configuração (R) ou (S) , ou podem ser uma mistura dos mesmos. Desse modo, os compostos aqui divulgados podem ser enantiomericamente puros, ou podem ser misturas estereoisoméricas ou diastereoméricas. No caso dos resíduos de aminoácidos, estes resíduos podem ser da forma L- ou D-. A configuração dos resíduos de aminoácidos de ocorrência natural é geralmente L. Quando não especificado, o resíduo é a forma L. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" refere-se a a-aminoácidos que são racémicos, ou da configuração D- ou L-. A 34 designação "d" precedendo uma designação de aminoácidos (por exemplo, dAla, dSer, dVal, etc.) refere-se ao D-isómero do aminoácido. A designação "dl" precedendo uma designação de aminoácidos (por exemplo, dlPip) refere-se a uma mistura dos isómeros L e D dos aminoácidos. Deve ser entendido que os centros quirais dos compostos aqui divulgados podem ser submetidos a epimerização ín vivo. Como tal, um especialista na técnica reconhecerá que a administração de um composto na sua forma (R) é equivalente, para os compostos que se submetem à epimerização in vivo, à administração do composto na sua forma (S).

Tal como aqui utilizado, substancialmente puros significa suficientemente homogéneo para parecer livre de impurezas facilmente detectáveis como determinado por métodos padrão de análise, como a cromatografia em camada fina (TLC), electroforese em gel, cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massa (MS) , utilizada pelos especialistas na técnico para avaliar essa pureza, ou suficientemente puro de tal modo que purificação adicional não alteraria de forma detetável as propriedades físicas e químicas, tais como as atividades enzimáticas e biológicas, da substância. Os métodos de purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente quimicamente puros são conhecidos dos especialistas na técnica. Um composto substancialmente quimicamente puro pode, porém, ser uma mistura de estereoisómeros. Nesses casos, a purificação adicional pode aumentar a atividade específica do composto.

Tal como aqui utilizado, as cadeias de carbono de alquilo, alcenilo e alcinilo, se não especificado, contêm 1 a 20 35 átomos de carbono, ou 1 ou 2 a 16 átomos de carbono, e são lineares ou ramificadas. As cadeias de carbono de alcenilo de 2 a 20 carbonos, em certas formas de realização, contêm 1 a 8 ligações duplas e as cadeias de carbono de alcenilo de 2 a 16 carbonos, em certas formas de realização, contêm 1 a 5 ligações duplas. As cadeias de carbono de alcinilo de 2 a 20 carbonos, em certas formas de realização, contêm 1 a 8 ligações triplas, e as cadeias de carbono de alcinilo de 2 a 16 carbonos, em certas formas de realização, contêm 1 a 5 ligações triplas. Grupos exemplificativos de alquilo, alcenilo e alcinilo da presente invenção incluem, mas não estão limitados a metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo, neopentilo, terc-pentilo, iso-hexilo, alilo (propenilo) e propargilo (propinilo). Tal como aqui utilizado, alquilo inferior, alcenilo inferior, e alcinilo inferior referem-se a cadeias de carbono que têm cerca de 1 ou cerca de 2 carbonos até cerca de 6 carbonos. Tal como aqui utilizado, "alc(en) (in)ilo" refere-se a um grupo alquilo que contém pelo menos uma ligação dupla e pelo menos uma ligação tripla.

Tal como aqui utilizado, "cicloalquilo" refere-se a um sistema de anel mono ou multiciclico saturado, em certas formas de realização da 3 a 10 átomos de carbono, em outras formas de realização da 3 a 6 átomos de carbono; cicloalcenilo e cicloalcinilo referem-se a sistemas de anel mono ou multiciclicos, que incluem, respectivamente, pelo menos, uma ligação dupla e pelo menos uma ligação tripla. Os grupos cicloalcenilo e cicloalcinilo podem, em certas formas de realização, conter 3 a 10 átomos de carbono, com os grupos cicloalcenilo, em outras formas de 36 realização, contendo 4 a 7 átomos de carbono e os grupos cicloalcinilo, em outras formas de realização, contendo 8 a 10 átomos de carbono. Os sistemas em anel dos grupos cicloalquilo, cicloalcenilo e cicloalcinilo podem ser compostos por um anel ou dois ou mais anéis, que podem ser unidos entre si numa forma fundida, em ponte, ligados de forma espiro. "Cicloalc(en)(in)ilo" refere-se a um grupo cicloalquilo que contém pelo menos uma ligação dupla e pelo menos uma ligação tripla.

Tal como aqui utilizado, "arilo" refere-se a grupos monociclicos ou multiciclicos aromáticos que contêm de 6 até 19 átomos de carbono. Os grupos arilo incluem, mas não estão limitados a grupos tais como fluorenilo substituído, fenilo substituído ou não substituído, não substituído ou substituído, e naftilo não substituído ou substituído.

Tal como aqui utilizado, "heteroarilo" refere-se a um sistema de anel aromático monocíclico ou multicíclico, em certas formas de realização, de cerca de 5 a cerca de 15 membros em que um ou mais, numa forma de realização de 1 a 3, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo, isto é, um elemento diferente de carbono, incluindo, mas não limitado a, azoto, oxigénio ou enxofre. O grupo heteroarilo pode ser opcionalmente fundido com um anel de benzeno. Os grupos heteroarilo incluem, mas não estão limitados a furilo, imidazolilo, pirimidinilo, tetrazolilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, quinolinilo e isoquinolinilo, imidazol, triazol e pirazol.

Tal como aqui utilizado, "heterociclilo" refere-se a um sistema de anel monocíclico ou multicíclico não aromático, 37 numa forma de realização de 3 a 10 membros, noutra forma de realização, de 4 a 7 membros, numa outra forma de realização de 5 a 6 membros, em que um ou mais, em certas formas de realização, de 1 a 3, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo, isto é, um elemento diferente de carbono, incluindo, mas não limitado a azoto, oxigénio ou enxofre. Nas formas de realização em que os heteroátomos são azoto, o azoto é opcionalmente substituído com alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, cicloalquilo, heterociclilo, cicloalquilalquilo, heterociclilalquilo, acilo, guanidino, ou o azoto pode ser quaternizado para formar um grupo amónio, onde os substituintes são selecionados como acima.

Tal como aqui utilizado, "aralquilo" refere-se a um grupo alquilo no qual um dos átomos de hidrogénio do alquilo é substituído por um grupo arilo.

Tal como aqui utilizado, "heteroaralquilo" refere-se a um grupo alquilo no qual um dos átomos de hidrogénio do grupo alquilo é substituído por um grupo heteroarilo.

Tal como aqui usado, "halo", "halogénio" ou "haleto" refere-se a F, Cl, Br ou I.

Tal como aqui utilizado, os grupos pseudo-haletos ou pseudo-halo são grupos que se comportam substancialmente semelhante a haletos. Tais compostos podem ser utilizados da mesma maneira e tratados da mesma maneira que os haletos. Os pseudo-haletos incluem, mas não estão limitadas a, cianeto, cianato, tiocianato, selenocianato, trifluorometoxi, e azida. 38

Tal como aqui utilizado, "haloalquilo" refere-se a um grupo alquilo no qual um ou mais dos átomos de hidrogénio são substituídos por halogéneo. Tais grupos incluem, mas não estão limitados a clorometilo, trifluorometilo e 1-cloro-2-fluoroetilo.

Tal como aqui utilizado, "haloalcoxi" refere-se a RO- em que R é um grupo haloalquilo.

Tal como aqui utilizado, "sulfinilo" ou "tionilo" refere- se a -S(0)-. Tal como aqui utilizado, "sulfonilo" ou "sulfurilo" refere-se a -S(0)2-· Tal como aqui utilizado, "sulfo" refere-se a -S(0)20.

Tal como aqui utilizado, "carboxi" refere-se a um radical divalente, -C(0)0-.

Tal como aqui utilizado, "aminocarbonilo" refere-se a -C(0)NH2.

Tal como aqui utilizado, "alquilaminocarbonilo" refere-se a -C(0)NHR no qual R é alquilo, incluindo alquilo inferior.

Tal como aqui utilizado, "dialquilaminocarbonilo" refere- se a -C(0)NR'R em que R' e R são cada um independentemente alquilo, incluindo alquilo inferior; "carboxamida" refere-se a grupos de fórmula -NR'C0R em que R' e R são cada um independentemente alquilo, incluindo alquilo inferior.

Tal como aqui utilizado, "arilalquilaminocarbonilo" refere-se a -C(0)NRR' em que um de R e R' representa um grupo arilo, incluindo arilo inferior, tal como fenilo, e 39 0 outro de R e R' representa um grupo alquilo, incluindo alquilo inferior.

Tal como aqui utilizado, "arilaminocarbonilo" refere-se a -C(0)NHR em que R é arilo, incluindo arilo inferior, tal como fenilo.

Tal como aqui utilizado, "hidroxicarbonilo" refere-se a -C00H.

Tal como aqui utilizado, "alcoxicarbonilo" refere-se a-C (0)0R em que R é alquilo, incluindo alquilo inferior.

Tal como aqui utilizado, "ariloxicarbonilo" refere-se a -C(0)0R em que R é arilo, incluindo arilo inferior, tal como fenilo.

Tal como aqui utilizado, "alcoxi" e "alquiltio" referem-se a RO- e RS-, em que R é um alquilo, incluindo alquilo inferior.

Tal como aqui utilizado, "ariloxi" e "ariltio" referem-se a RO- e RS-, em que R é arilo, incluindo arilo inferior, tal como fenilo.

Tal como aqui utilizado, "alcileno" refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático divalente, linear, ramificado ou cíclico, em certas formas de realização linear ou ramificado, numa forma de realização tendo de 1 a cerca de 20 átomos de carbono, noutra forma de realização tendo de 1 a 12 átomos de carbono. Numa outra forma de realização alcileno inclui alcileno inferior. Pode opcionalmente ser inserido ao longo do grupo alcileno um ou mais oxigénio, enxofre, incluindo S(=0) e S{=0)2, ou átomos de azoto substituídos ou não substituídos, incluindo os grupos -NR- 40 e -N+RR-, em que os substituintes de azoto são alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo ou COR', em que R' é alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, -OY ou -NYY, onde Y é hidrogénio, alquilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo ou heterociclilo. Os grupos alcileno incluem, mas não estão limitados a metileno (-CH2-) , etileno -(-CH2CH2-), propileno (-(CH2)3), metilenodioxi (-0-CH2-0) e etilenodioxi (-O-(CH2) 2_0) . O termo "alcileno inferior" refere-se a grupos alcileno com 1 a 6 átomos de carbono. Em certas formas de realização, os grupos alcileno são alcileno inferior, incluindo alcileno de 1 a 3 átomos de carbono.

Tal como aqui utilizado, "azaalcileno" refere-se a -(CRR)n_ NR- (CRR)m-, em que nem são, cada um, independentemente, um número inteiro de 0 a 4. Tal como aqui utilizado, "oxaalcileno" refere-se a - (CRR) n~0- (CRR) m, em que nem são, cada um, independentemente, um número inteiro de 0 a 4. Tal como aqui utilizado, "tiaalcileno" refere-se a -(CRR)n-S-(CRR) m-, - (CRR)n-S (=0) - (CRR)m e - (CRR) n-S (-0) 2 (CRR)m-, em que nem são, cada um, independentemente, um número inteiro de 0 a 4.

Tal como aqui utilizado, "alcenileno" refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático divalente, linear, ramificado ou cíclico, numa forma de realização linear ou ramificado, em certas formas de realização tendo de 2 a cerca de 20 átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla, em outras formas de realização de 1 a 12 átomos de carbono. Em outras formas de realização, os grupos alcenileno incluem alcenileno inferior. Pode opcionalmente ser inserido ao longo do grupo alcenileno um ou mais oxigénio, 41 enxofre ou azoto, substituído ou não, em que o substituinte de azoto é um grupo alquilo. Os grupos alcenileno incluem, mas não estão limitados a, 1 o II 0 1 o w II 0 1 CD 1 O II 0 κ 1 o to 0 termo " alcenileno inferior" refere- se a grupos alcenileno com 2 a 6 átomos de carbono. Em certas formas de realização, os grupos alcenileno são alcenileno inferior, incluindo alcenileno com 3 a 4 átomos de carbono.

Tal como aqui utilizado, "alcinileno" refere-se a um grupo hidrocarboneto divalente alifático linear, ramificado ou cíclico, em certas formas de realização linear ou ramificado, numa forma de realização tendo de 2 a cerca de 20 átomos de carbono e, pelo menos, uma ligação tripla, numa outra forma de realização de 1 a 12 átomos de carbono. Numa outra forma de realização, alcinileno inclui alquinileno inferior. Pode opcionalmente ser inserido ao longo do grupo alcinileno um ou mais oxigénio, enxofre ou átomos de azoto, substituído ou não substituído, em que o substituinte de azoto é um grupo alquilo. Os grupos alcinileno incluem, mas não estão limitados a, -C=-C-C=-C, -C=C- e -0=0-0¾. O termo "alcinileno inferior" refere-se a grupos alcinileno com 2 a 6 átomos de carbono. Em certas formas de realização, os grupos alcinileno são alcinileno inferior, incluindo alcinileno com 3 a 4 átomos de carbono.

Tal como aqui utilizado, "alc(en)(in)ileno" refere-se a um grupo hidrocarboneto divalente alifático, ramificado ou cíclico, em certas formas de realização linear, ou ramificado, numa forma de realização tendo de 2 a cerca de 20 átomos de carbono e pelo menos uma ligação tripla, e pelo menos uma ligação dupla; noutra forma de realização 42 de 1 a 12 átomos de carbono. Em outras formas de realização, alc(en) (in)ileno inclui alc(en) (in)ileno inferior. Pode opcionalmente ser inserido ao longo do grupo alcinileno um ou mais oxigénio, enxofre ou átomos de azoto não substituído ou substituído, em que o substituinte de azoto é um grupo alquilo. Os grupos ale(en)(in)ileno incluem, mas não estão limitados a -C=C-(CH2)nC=C-, onde n é 1 ou 2. 0 termo "alc (en) (in)ileno inferior" refere-se a grupos alc(en)(in)ileno que têm até 6 átomos de carbono. Em certas formas de realização, os grupos alc(en) (in)ileno têm cerca de 4 átomos de carbono.

Tal como aqui utilizado, "cicloalcileno" refere-se a um sistema de anel mono ou multicíclico divalente saturado, em certas formas de realização com 3 a 10 átomos de carbono, noutras formas de realização de 3 a 6 átomos de carbono; cicloalcenileno e cicloalcinileno referem-se a sistemas de anéis mono ou multicíclicos divalente que incluem, respectivamente, pelo menos, uma ligação dupla e pelo menos uma ligação tripla. Os grupos cicloalcenileno e cicloalcinileno podem, em certas formas de realização, conter de 3 a 10 átomos de carbono, com os grupos cicloalcenileno em certas formas de realização contendo de 4 a 7 átomos de carbono e os grupos cicloalcinileno em certas formas de realização, contendo de 8 a 10 átomos de carbono. Os sistemas em anel dos grupos cicloalquileno, cicloalcenileno e cicloalcinileno podem ser compostos por um anel ou dois ou mais anéis, que podem ser unidos entre si, numa forma fundida, em ponte ou ligados de forma espiro. "Cicloalc(en)(in)ileno" refere-se a um grupo cicloalquileno que contém pelo menos uma ligação dupla e pelo menos uma ligação tripla. 43

Tal como aqui utilizado, "arileno" refere-se a um grupo aromático divalente, monociclico ou policíclico, em certas formas de realização monociclico, numa forma de realização tendo de 5 a cerca de 20 átomos de carbono e pelo menos um anel aromático, noutra forma de realização de 5 a 12 átomos de carbono. Noutras formas de realização, arileno inclui arileno inferior. Os grupos arileno incluem, mas não estão limitados a 1,2-, 1,3- e 1,4-fenileno. O termo "arileno inferior" refere-se a grupos arileno com 6 átomos de carbono.

Tal como aqui utilizado, "heteroarileno" refere-se a um sistema de anel aromático monociclico ou multiciclico divalente, numa forma de realização de cerca de 5 a cerca de 15 átomos no anel ou anéis, em que um ou mais, em certas formas de realização 1 a 3, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo, isto é, um elemento diferente do carbono, incluindo, mas não limitado a azoto, oxigénio ou enxofre. O termo "heteroarileno inferior" refere-se a grupos heteroarileno com 5 ou 6 átomos no anel.

Tal como aqui utilizado, "heterociclileno" refere-se a um sistema de anel não aromático monociclico ou multiciclico divalente, em certas formas de realização de 3 a 10 membros, numa forma de realização de 4 a 7 membros, noutra forma de realização de 5 a 6 membros, em que um ou mais, incluindo 1 a 3, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo, isto é, um elemento diferente do carbono, incluindo, mas não limitado a azoto, oxigénio ou enxofre.

Tal como aqui utilizado, "alquilo substituído", "alcenilo substituo", "alcinilo substituído", "cicloalquilo substituído", "cicloalcenilo substituído", "cicloalcinilo 44 44 substituído", substituído", substituído", substituído", substituído", substituído", "arilo substituído", "heteroarilo "heterociclilo substituído", "alcileno "alcenileno substituído", "alcinileno 'cicloalcileno substituído", cicloalcenileno "cicloalcinileno substituído", "arileno "heteroarileno substituído", e "heterociclileno substituído" referem-se a grupos alquilo, alcenilo, alcinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, cicloalcinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, alcileno, alcenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalcenileno, cicloalcinileno, arileno, heteroarileno e heterociclileno, respectivamente, que estão substituídos com um ou mais substituintes, em certas formas de realização, um, dois, três ou quatro substituintes, em que os substituintes são como aqui definidos, numa forma de realização selecionados de Q1.

Tal como aqui utilizado, "alquilideno" refere-se a um grupo divalente, tal como -CR'R'', o qual está ligado a um átomo de um outro grupo, que forma uma ligação dupla. Os grupos alquilideno incluem, mas não estão limitados a metilideno (=0¾) e etilideno (=CHCH3) . Tal como aqui utilizado, "arilalquilideno" refere-se a um grupo alquilideno em que tanto R' como R' ' é um grupo arilo. Os grupos "cicloalquilideno" são aqueles em que R 'e R' ' estão ligados para formar um anel carbocíclico. Grupos "heterociclilideno" são aqueles em que pelo menos um de R 'e R' contêm um heteroátomo na cadeia, e R' e R' ' estão ligados para formar um anel heterocíclico.

Tal como aqui utilizado, "amido" refere-se ao grupo divalente -C(O)NH-. "Tioamido" refere-se ao grupo divalente -C(S)NH-. "Oxiamido" refere-se ao grupo 45 divalente -0C(0)NH-. "Tiaamido" refere-se ao grupo divalente -SC(0)NH-. "Ditiaamido" refere-se ao grupo divalente -SC(S)NH-. "Ureído" refere-se ao grupo divalente -HNC(0)NH-. "Tioureido" refere-se ao grupo divalente NC(S)NH-.

Tal como aqui utilizado, "semicarbazida" refere-se a NHC(0)NHNH-. "Carbazato" refere-se ao grupo divalente OC(0)NHNH-. "Isotiocarbazato" refere-se ao grupo divalente -SC(0)NHNH-. "Tiocarbazato" refere-se ao grupo divalente -0C(S)NHNH-. "Sulfonil-hidrazida" refere-se ao grupo divalente -SO2NHNH-. "Hidrazida" refere-se ao grupo divalente -C(0)NHNH-. "Azo" refere-se ao grupo divalente -Nn-. "Hidrazinilo" refere-se ao grupo divalente -NH-NH-.

Tal como aqui utilizado, "sulfonamida" refere-se a um grupo sulfona -RSO2NH2- ligado a um grupo amina.

Tal como aqui utilizado, "imidazol" refere-se a um composto orgânico aromático heterociclico tendo uma fórmula geral de C3H4N2.

Tal como aqui utilizado, "triazol" refere-se a um ou um par de compostos químicos isoméricos com a fórmula molecular de C2H3N3.

Tal como aqui utilizado, "pirazol" refere-se a um anel heterociclico de 5 membros formado por três átomos de carbono e dois átomos de azoto em posições adjacentes.

Tal como aqui utilizado, "adamantano" refere-se a um tricicloalquilo tendo uma fórmula geral de C10H16. 46

Sempre que não seja especificado o número de qualquer substituinte (por exemplo, haloalquilo), pode haver um ou mais substituintes presentes. Por exemplo, "haloalquilo" pode incluir um ou mais dos mesmos ou diferentes halogéneos. Como outro exemplo, "alcoxifenilo Ci_3" pode incluir um ou mais dos mesmos ou diferentes grupos alcoxi contendo um, dois ou três átomos de carbono.

Tal como aqui utilizado, as abreviaturas para quaisquer grupos protetores, aminoácidos e outros compostos, estão, a não ser que indicado de outra forma, de acordo com o seu uso comum, abreviaturas reconhecidas, ou a Comissão sobre Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (ver, (1972) Biochem. 11:942-944).

Compostos Vários compostos são aqui divulgados:

OH 3,4 di-hidroxianilida do ácido 2,3 di-hidroxibenzóico (Composto 1),

O

OH 2,3 di-hidroxianilida do (Composto 2), ácido 3,4 di-hidroxibenzóico 47

2,3 di-hidroxianilida do ácido 2,3 di-hidroxibenzóico (Composto 3),

3,4 di-hidroxifenilsulfonamida do ácido 3,4 di- hidroxibenzenossulfónico (Composto 5) ,

OH

2,4 bis (3,4 di-hidroxifenil) imidazol (Composto 6),

OH 3,5 bis (3,4 di-hidroxifenil) pirazol (Composto 8), 48

48 OH

HO 1,3 bis (3,4 di-hidroxifenil) adamantano (Composto 9). 0 composto da invenção é:

OH

3,5 bis (3,4 di-hidroxifenil) 1,2,4 triazol (Compound 7). Sintese dos Compostos

Os compostos desta invenção podem ser preparados por métodos geralmente conhecidos para a pessoa com conhecimentos correntes na técnica, tendo em conta o conhecimento e a divulgação do presente pedido, incluindo os Exemplos 1-5.

Os materiais de partida e os reagentes utilizados na preparação destes compostos ou estão disponíveis de fornecedores comerciais tais como a Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Bachem (Torrance, CA), Sigma (St. Louis, MO), ou Lancaster Synthesis Inc. (Windham, NH) , ou são preparados por métodos bem conhecidos para uma pessoa com conhecimentos correntes na técnica, seguindo os procedimentos descritos em referências tais como Fieser 49 and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols. 1-17, John Wiley and Sons, Nova Iorque, NY, 1991; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 e supps., Elsevier Science Publishers, 1989.; Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, Nova Iorque, NY, 1991; March J. : Advanced Organic Chemistry, 4a ed, John Wiley and Sons, Nova Iorque, NY.; e Larock: Comprehensive

Organic Transformations, VCH Publishers , Nova Iorque, 1989. Na maioria dos casos, os grupos protetores para os grupos hidroxi são introduzidos e finalmente removidos. Os grupos protetores adequados são descritos em Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, Segunda Edição, John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1991. Outros materiais de partida ou intermediários iniciais podem ser preparados por elaboração dos materiais listados acima, por exemplo, por meio de métodos bem conhecidos para uma pessoa com conhecimentos correntes na técnica.

Os materiais de partida, intermediários e compostos desta invenção podem ser isolados e purificados utilizando técnicas convencionais, incluindo precipitação, filtração, destilação, cristalização, cromatografia, e similares. Os compostos podem ser caracterizados utilizando métodos convencionais, incluindo constantes físicas e métodos espectroscópicos.

Farmacologia e Utilidade O composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol pode ser utilizado como tal, ser administrado na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis derivados de ácidos 50 inorgânicos ou orgânicos, ou utilizado em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A frase "sal farmaceuticamente aceitável" significa aqueles sais que são, dentro do âmbito do bom critério médico, adequados para utilização em contacto com os tecidos sem a indevida toxicidade, irritação, resposta alérgica, e afins, e são comensuráveis com uma proporção beneficio/risco razoável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento final e purificação de 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol ou separadamente por reação da substância ativa ácida ou básica com uma base ou ácido apropriado, respectivamente. Os sais típicos derivados de sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos incluem, mas não estão limitados a cloridrato, bromidrato, iodidrato, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bissulfato, gluconato, fumarato, hidroiodeto, lactato, maleato, oxalato, palmitoato, pectinato, succinato, tartarato, fosfato, glutamato, e bicarbonato. Os sais típicos derivados de bases orgânicas ou inorgânicas incluem, mas não estão limitados a lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio, monoalquilamónio tais como meglumina, dialquilamónio, trialquilamónio e tetralquilamónio.

Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos e o modo de administração das composições farmacêuticas aqui fornecidas podem ser variados a fim de alcançar a resposta terapêutica eficaz para um doente em particular. A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" do composto aqui proporcionado significa uma quantidade suficiente do composto para tratar distúrbios, com uma relação risco/benefício razoável aplicável a qualquer tratamento 51 médico. Será entendido, no entanto, que a utilização diária total do composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol e composições fornecidas será decidida pelo médico assistente dentro do âmbito do critério médico sólido. A dose diária total do composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol pode variar de cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg/kg/dia. Para fins de administração oral, as doses podem estar no intervalo de cerca de 1 a cerca de 500 mg/kg/dia. Se desejado, a dose diária eficaz pode ser dividida em doses múltiplas para fins de administração; consequentemente, as composições de dose única podem conter estas quantidades ou seus submúltiplos para perfazer a dose diária. O nivel de dose terapeuticamente eficaz específico para qualquer doente em particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; o histórico médico do doente, a atividade do composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol; a composição específica utilizada, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do doente, a hora da administração, a via de administração, a duração do tratamento, a taxa de excreção do composto 3,5-bis (3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol, os medicamentos utilizados em combinação ou coincidentes com o composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol; e semelhantes. 0 composto 3,5-bis (3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol pode ser formulado juntamente com um ou mais diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, transportadores, adjuvantes e agentes antibacterianos e antifúngicos tais como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e semelhantes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento tais como 52 lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pela utilização de tensioativos. Em alguns casos, a fim de prolongar o efeito do fármaco, é desejável diminuir a taxa de absorção do fármaco de injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser realizado por suspensão de substância ativa cristalina ou amorfa num veículo que tem uma fraca solubilidade em água, tal como óleos. A taxa de absorção do fármaco depende então da sua taxa de dissolução, a qual, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. A absorção prolongada de uma forma farmacêutica injetável pode ser conseguida pela utilização de agentes de retardamento da absorção, tais como monoestearato de alumínio ou gelatina. 0 composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol pode ser administrado por via entérica ou parentérica, em formas sólidas ou liquidas. As composições adequadas para injeção parentérica podem compreender soluções fisiologicamente aceitáveis, soluções, dispersões, suspensões ou emulsões isotónicas estéreis, aquosas ou não aquosas, e pós estéreis para reconstituição em soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Exemplos de veículos aquosos e não aquosos, diluentes, solventes ou veículos adequados incluem água, etanol, polióis (propileno glicol, polietileno glicol, glicerol, e similares), óleos vegetais (tais como azeite), ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo, e misturas adequadas dos mesmos. Estas composições também podem conter adjuvantes tais como agentes conservantes, molhantes, emulsionantes e dispersantes. As suspensões, para além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão tais como álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno 53 sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, ágar-ágar e tragacanto, ou misturas destas substâncias. 0 composto 3,5-bis(3,4-di-hidroxifenil)-1,2,4-triazol também pode ser administrado por injeção ou perfusão, por via subcutânea ou por via intravenosa, ou por via intramuscular, ou intraesternal, ou por via intranasal, ou por técnicas de perfusão, na forma de suspensão estéril injetável ou oleaginosa. 0 composto pode estar na forma de uma solução aquosa injetável estéril ou suspensões oleaginosas. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida utilizando os agentes de dispersão, de humidificação e agentes de suspensão que foram acima descritos. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão estéril injetável num diluente ou solvente parentericamente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados estão a água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente utilizados como um meio solvente ou de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixo brando pode ser convencionalmente utilizado, incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Além disso, ácidos gordos tais como ácido oleico encontram utilização na preparação de injetáveis. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica óptima. Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente ou a dosagem pode ser proporcionalmente reduzida como indicado pelas exigências da situação terapêutica. 54

As formas de depósito injetáveis são feitas pela formação de matrizes de microcápsulas do fármaco em polímeros biodegradáveis tais como poliláctido-poliglicólido. Dependendo da proporção de fármaco para polímero e da natureza do polímero particular utilizado, a taxa de libertação de fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). As formulações injetáveis de depósito são também preparadas por aprisionamento da droga em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos corporais. As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias ou por incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril, imediatamente antes da utilização.

As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativo pode ser misturado com pelo menos um excipiente ou veículo inerte, farmaceuticamente aceitável, tal como citrato de sódio ou fosfato dicálcico e/ou (a) enchimentos ou diluentes tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico; (B) aglutinantes, tais como carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e acácia; (c) humectantes tais como glicerol; (d) agentes de desintegração tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; (e) solução de agentes de retardamento, tais como parafina; (f) aceleradores de absorção tais como compostos de amónio 55 quaternário; (g) agentes molhantes tais como álcool cetilico e monoestearato de glicerol; (h) absorventes tais como caulino e argila de bentonite e (i) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio e misturas destes. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma farmacêutica pode também compreender agentes tamponantes. Composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser utilizadas como enchimentos em cápsulas de gelatina mole e dura, utilizando excipientes tais como lactose ou açúcar do leite, bem como polietileno glicóis de elevado peso molecular e semelhantes.

As formas farmacêuticas sólidas de comprimidos, drageias, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Estas podem conter opcionalmente agentes de opacidade e podem também ser de uma composição tal que liberte o ingrediente ativo apenas, ou de preferência, numa certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de uma forma retardada. Exemplos de composições incluídas que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Os comprimidos contêm o composto em mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos que são adequados para o fabrico de comprimidos. Estes excipientes podem ser por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e de desintegração, por exemplo, amido de milho ou ácido algínico; agentes de aglutinação, por exemplo, amido de milho, gelatina ou acácia, e agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de 56 magnésio ou ácido esteárico ou talo. Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e desse modo proporcionar uma ação sustentada durante um período mais prolongado. Por exemplo, pode ser utilizado um material de retardamento do tempo tal como monoestearato de glicerol ou diestearato de glicerol. As formulações para utilização oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura em que o composto é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino, ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite.

As formas farmacêuticas líquidas para administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Para além do composto ativo, as formas farmacêuticas líquidas podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsionantes tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetil formamida, óleos (em particular, óleo de semente de algodão, de amendoim, de milho, de gérmen, de oliva, de rícino e de sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácidos gordos de sorbitano e misturas destes. Para além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes molhantes, agentes emulsionantes e agentes de suspensão, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes. 57

As suspensões aquosas contêm o composto em mistura com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas. Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou molhantes podem ser fosfatidos que ocorrem naturalmente, por exemplo lecitina, ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos, por exemplo estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo heptadecaetilenoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos tais como hexitol, como monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo, monooleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo, p-hidroxibenzoato de etilo ou n-propilo, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes, ou um ou mais agentes edulcorantes, tais como sacarose ou sacarina. para

As suspensões oleosas podem ser formuladas por suspensão do composto num óleo vegetal, por exemplo óleo de amendoim, azeite, óleo de sésamo, ou óleo de coco, ou num óleo mineral tal como parafina liquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, por exemplo cera de abelha, parafina dura ou álcool cetilico. Os agentes edulcorantes, tais como os indicados abaixo, e os agentes aromatizantes podem ser adicionados 58 proporcionar uma preparação oral palatável. Estas composições podem ser conservadas pela adição de um antioxidante tal como ácido ascórbico. Os pós dispersáveis e grânulos adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água proporcionam o ingrediente ativo em mistura com um agente dispersante ou molhante, um agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou molhantes e agentes de suspensão adequados são exemplificados por aqueles já descritos acima. Excipientes adicionais, por exemplo agentes edulcorantes e aromatizantes, podem também estar presentes. 0 composto 3,5-bis (3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol também pode estar na forma de emulsões óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo azeite ou óleos de amendoim, ou um óleo mineral, por exemplo parafina liquida ou misturas destes. Os agentes emulsionantes adequados podem ser gomas de ocorrência natural, por exemplo goma arábica ou goma de tragacanto, fosfatideos que ocorrem naturalmente, por exemplo soja, lecitina, e fosfatidos que ocorrem, por exemplo soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo monooleato de sorbitano, e produtos de condensação dos referidos ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo monooleato de polioxietileno sorbitano. A emulsão também pode conter agentes edulcorantes e aromatizantes. Os xaropes e elixires podem ser formulados com agentes edulcorantes, por exemplo, glicerol, sorbitol ou sacarose. Tais formulações também podem conter um demulcente, um conservante e agentes aromatizantes e corantes. 59

Numa forma de realização, o composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol é formulado em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem, como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada uma contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto e pelo menos um excipiente farmacêutico. Um produto farmacêutico compreenderá uma forma de unidade de dosagem dentro de um recipiente que está rotulado ou acompanhado por uma etiqueta que indica o método de tratamento a que se destina, tal como o tratamento de uma doença causada por β-amiloide, por exemplo uma amiloidose, tal como a doença de Alzheimer, ou um doença associada com formação de fibrilas de α-sinucleína, tal como a doença de Parkinson. As composições para administração retal ou vaginal são de preferência supositórios que podem ser preparados por mistura dos compostos aqui proporcionados com, excipientes ou veículos não irritantes adequados tais como manteiga de cacau, polietileno glicol ou uma cera para supositório, que são sólidos à temperatura ambiente mas líquidos à temperatura do corpo e, por conseguinte, se fundem no reto ou na cavidade vaginal e libertam o composto ativo. 0 composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol também pode ser administrado na forma de lipossomas. Os métodos para formar lipossomas são conhecidos na técnica (Prescott, Ed., Methods in Cell Biology 1976, Volume XIV, Academic Press, Nova Iorque, NY) Como é conhecido na técnica, os lipossomas são geralmente derivados de fosfolípidos ou outras substâncias lipídicas. Os lipossomas são formados por cristais líquidos hidratados mono ou multilamelares que estão dispersos num meio 60 aquoso. Qualquer lípido não tóxico, fisiologicamente aceitável e metabolizável capaz de formar lipossomas pode ser utilizado.

As presentes composições na forma de lipossomas podem conter, para além do composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol, estabilizantes, conservantes, excipientes e semelhantes. Os lípidos preferidos são fosfolípidos naturais e sintéticos e fosfatidilcolinas (lecitinas). 0 composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol também pode ser adequado para administração na forma de um "pró-fármaco", em que os ingredientes ativos farmacêuticos, são libertados in vivo, mediante contacto com enzimas hidroliticas, tais como esterases e fosfatases no corpo. O termo "pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis", como aqui utilizado, representa aqueles pró-fármacos do composto, os quais são, dentro do âmbito do bom critério médico, adequados para utilização em contacto com os tecidos sem as indevidas toxicidade, irritação, resposta alérgica, e similares, comensurável com uma relação risco/beneficio razoável, e eficazes para a sua utilização pretendida. Uma discussão aprofundada é fornecida em T. Higuchi e V. Stella (Higuchi, T. e Stella, V. Pro-drugs cas Novel Delivery Systems, V. 14 do A.C.S. Symposium Series;. Edward B. Roche, Ed, Bioreversible Carriers in Drug Design 1987, American Pharmaceutical Association e Pergamon Press). O composto 3, 5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis, podem também ser formulados para ser direcionados para um tecido em particular, o receptor, ou outra área do corpo do 61 indivíduo a ser tratado. Muitos destes métodos de direcionamento são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Para exemplos não limitativos de métodos de direcionamento, ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6, 139, 865, 6, 048,736, 5,900,252, 6,253, 872, 6,060,082, 5,972,366, 6, 316, 652, 6, 274,552, 6,271,359, 6131570, 6,120,751, 6,071,495, 6, 039, 975, 6, 004,534, 5, 985,307, 5,840,674, 5,759,542 e 5,709,874.

Suspensões lipossomais, incluindo lipossomas dirigidos ao tecidos, tais como lipossomas dirigidas ao tumor, podem também ser adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, formulações de lipossomas podem ser preparadas como descrito na Patente U.S. N° 4,522,811. Resumidamente, lipossomas, tais como vesículas multilamelares (MLV) poderem ser formadas por secagem da fosfatidil colina do ovo e fosfatidil serina do cérebro (proporção molar 7:3) no interior de um frasco. Uma solução de um composto aqui proporcionado em solução salina tamponada com fosfato sem catiões divalentes (PBS) pode ser adicionada e o balão e agitado até que o filme de lípido seja disperso. As vesículas resultantes são lavadas para remover composto não encapsulado, peletizadas por centrifugação, e em seguida suspensas novamente em PBS.

Formulações de Liberação Sustentada É também divulgada a utilização de formulações de libertação sustentada para libertar os compostos aqui divulgados no alvo pretendido (isto é, o cérebro ou órgãos sistémicos) em altos níveis de circulação (entre 10“9 e 10“4 62 Μ). Para ο tratamento da doença de Alzheimer ou de Parkinson, os níveis circulantes dos compostos podem ser mantidos até IO”7 M. Os níveis podem circular no doente sistemicamente, ou presentes no tecido cerebral, e em certas circunstâncias, localizados nos depósitos de β-amiloides ou fibrilas de α-sinucleína no cérebro ou outros tecidos.

Entende-se que os níveis do composto são mantidos durante de um certo período de tempo, como é desejado e pode ser facilmente determinado por um especialista na técnica, utilizando esta divulgação e compostos aqui divulgados. É aqui divulgada uma característica única de administração que compreende uma formulação de libertação controlada de modo a que um nível constante de composto terapêutico possa ser mantido entre 10”8 e 10”6 M entre 48 a 96 horas nos soros.

Tais formulações de libertação sustentada e/ou temporizada podem ser realizadas por meios de libertação sustentada de dispositivos de libertação que são bem conhecidos dos especialistas na técnico, tais como os descritos nas Patentes U.S. Nos. 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 4,710,384; 5,674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5, 120, 548; 5, 073, 543; 5, 639, 476; 5, 354, 556 e 5,733,566.

Estas composições farmacêuticas podem ser utilizadas para proporcionar a libertação lenta ou sustentada de um ou mais dos compostos divulgados, utilizando, por exemplo, hidroxipropilmetil celulose, outras matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos multicamadas, micropartícuias, lipossomas, 63 microesferas, ou semelhantes. As formulações de libertação sustentada adequadas conhecidas dos especialistas na técnica, incluindo aquelas aqui descritas, poderão ser facilmente selecionadas para utilização com as composições farmacêuticas da invenção. Desse modo, as formas de dosagem unitárias individuais adequadas para administração oral, tais como, mas não limitados a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, comprimidos ovais, pós e outros semelhantes, que são adaptados para libertação sustentada são aqui divulgadas. A formulação de libertação sustentada pode conter o composto ativo, tal como, mas não limitados a celulose microcristalina, maltodextrina, etilcelulose, e estearato de magnésio. A formulação de libertação sustentada pode ser encapsulada por revestimento de partículas ou grânulos da composição farmacêutica aqui divulgada, com diferentes espessuras de polímeros lentamente solúveis em água ou por microencapsulação. A formulação de libertação sustentada pode ser encapsulada com um material de revestimento de espessura variável (por exemplo, de cerca de 1 micrómetro até 200 micrómetros), que permite a dissolução da composição farmacêutica cerca de 48 horas a cerca de 72 horas após a administração a um mamífero. 0 material de revestimento é um aditivo alimentar aprovado. A formulação de libertação sustentada pode ser um dispositivo de dissolução de matriz que é preparado por compressão do fármaco com um transportador de polímero lentamente solúvel num comprimido. As partículas revestidas têm uma dimensão compreendida entre cerca de 64 0,1 a cerca de 300 micrómetros, como divulgado nas patentes U.S. Nos. 4,710,384 e 5,354,556.

Cada uma das partículas tem a forma de uma micromatriz, com o ingrediente ativo uniformemente distribuído por todo o polímero. São divulgadas formulações de libertação sustentada tais como as descritas na Patente U.S. N° 4,710, 384, que têm uma percentagem relativamente elevada de agente plastificante no revestimento com a finalidade de permitir flexibilidade suficiente para impedir a ruptura substancial durante a compressão. A quantidade específica de agente plastificante varia dependendo da natureza do revestimento e o plastificante específico utilizado. A quantidade pode ser facilmente determinada empiricamente testando as características de libertação dos comprimidos formados. Se o medicamento for libertado demasiado rapidamente, então mais plastificante é utilizado. As características de libertação são também uma função da espessura do revestimento. Quando são utilizadas quantidades substanciais de plastificante, a capacidade de libertação sustentada do revestimento diminui. Desse modo, a espessura do revestimento pode ser aumentada ligeiramente para compensar o aumento da quantidade de plastificante. De uma maneira geral, o agente plastificante, em tal forma de realização estará presente numa quantidade de cerca de 15 a 30% do material de libertação sustentada no revestimento, de preferência de 20 a 25%, e a quantidade de revestimento será de 10 a 25% do peso do material ativo, de preferência 15 a 20%. Qualquer plastificante convencional farmaceuticamente aceitável pode ser incorporado no revestimento. 65 0 composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol pode ser formulado como uma formulação de libertação sustentada e/ou temporizada. Todos os produtos farmacêuticos de libertação sustentada têm um objetivo comum de melhorar a terapêutica medicamentosa em relação à obtida por seus equivalentes não sustentados. De forma ideal, a utilização de uma preparação de libertação sustentada concebida de forma óptima em tratamento médico é caracterizada por um mínimo de substância de fármaco sendo utilizada para curar ou controlar a doença. As vantagens das formulações de libertação sustentada podem incluir: 1) atividade prolongada da composição, 2) frequência de dosagem reduzida e 3) aumento da aceitação pelo doente. Além disso, as formulações de libertação controlada podem ser utilizadas para afetar o tempo de início da ação ou outras características, tais como os níveis sanguíneos da composição, e, desse modo, podem afetar a ocorrência de efeitos secundários.

As formulações de libertação sustentada divulgadas são concebidas para libertar inicialmente uma quantidade de composição terapêutica que prontamente produz o efeito terapêutico desejado, e gradual e continuamente libertar outras quantidades de composições para manter este nível de efeito terapêutico durante um período de tempo prolongado. De forma a manter este nível constante no corpo, a composição terapêutica deve ser libertada da forma de dosagem a uma taxa que vai substituir a composição a ser metabolizada e excretada do corpo. indutores, A libertação sustentada de um estimulada por vários ingrediente ativo pode ser por exemplo pH, 66 temperatura, enzimas, água, ou outras condições fisiológicas ou compostos. 0 termo "componente de libertação sustentada", no contexto da presente divulgação é aqui definido como um composto ou compostos, incluindo, mas não limitados a polímeros, matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, lipossomas, microesferas, ou outros semelhantes, ou uma combinação dos mesmos, que facilita a libertação sustentada do ingrediente ativo.

Se o complexo for solúvel em água, o mesmo pode ser formulado num tampão adequado, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, ou outras soluções fisiologicamente compatíveis. Alternativamente, se o complexo resultante tiver fraca solubilidade em solventes aquosos, então o mesmo poderá ser formulado com um tensioativo não iónico, tal como Tween ou polietileno glicol. Desse modo, os compostos e os seus solventes fisiologicamente compatíveis podem ser formulados para administração por inalação ou insuflação (quer através da boca ou do nariz) ou administração oral, bucal, parentérica ou retal, como exemplos.

As preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para dar uma libertação controlada do composto ativo. Os compostos aqui divulgados podem ser formulados como pós de libertação controlada de micropartículas discretas que podem ser prontamente formulados na forma líquida. 0 pó de libertação sustentada compreende partículas que contêm um ingrediente ativo e, opcionalmente, um excipiente, com pelo menos um polímero não tóxico. 67 0 pó pode ser disperso ou suspenso num veículo líquido e irá manter as suas características de libertação sustentada, durante um período de tempo útil. Estas dispersões ou suspensões tanto têm estabilidade química como estabilidade em termos de taxa de dissolução. 0 pó pode conter um excipiente que compreende um polímero, que pode ser solúvel, insolúvel, permeável, impermeável, ou biodegradável. Os polímeros podem ser polímeros ou copolímeros. 0 polímero pode ser um polímero natural ou sintético. Os polímeros naturais incluem polipéptidos (por exemplo, zeína), polissacáridos (por exemplo, celulose), e ácido algínico. Polímeros sintéticos representativos incluem aqueles descritos, mas não limitado àqueles descritos na coluna 3, linhas 33-45 da Patente U.S. N° 5,354,556.

Os polímeros particularmente adequados incluem os descritos, mas não se limitam aos descritos na coluna 3, linha 46 coluna 4, linha 8 da Patente U.S. N° 5,354,556.

Os compostos de libertação sustentada aqui divulgados podem ser formulados para administração parentérica, por exemplo, por injeções intramusculares ou implantes para os tecidos subcutâneos e várias cavidades do corpo e dispositivos transdérmicos. Numa forma de realização, as injeções intramusculares são formuladas como suspensões aquosas ou oleosas. Numa suspensão aquosa, o efeito de libertação prolongada, é devido, em parte, a uma redução na solubilidade do composto ativo por complexação ou uma diminuição na taxa de dissolução. Uma abordagem semelhante é feita com suspensões e soluções de óleo, em que a taxa de libertação de um composto ativo é determinada pela separação do composto ativo do óleo no meio aquoso 68 circundante. Apenas os compostos ativos que são solúveis em óleo e têm as caracteristicas desejadas de partição são adequados. Os óleos que podem ser utilizados para injeção intramuscular incluem, mas não estão limitados a óleo de sésamo, azeite, óleo de amendoim, de milho, de amêndoa, de soja, de semente de algodão e óleo de rícino.

Uma forma altamente desenvolvida de libertação de fármaco que confere libertação sustentada durante períodos de tempo que variam de dias a anos é a implantação subcutânea de um dispositivo polimérico portador do fármaco ou em várias cavidades do corpo. 0 material polimérico utilizado num implante, que tem de ser biocompatível e não tóxico incluem, mas não estão limitados a hidrogéis, silicones, polietilenos, copolímeros de etileno acetato de vinilo, ou polímeros biodegradáveis.

Avaliação da Atividade dos Compostos A atividade biológica dos compostos aqui divulgados como disruptores/inibidores das fibrilas da proteína β-amiloide (Αβ) da doença de Alzheimer e agregados de α-sinucleína da doença de Parkinson foi avaliada pela determinação da eficácia dos compostos para causar uma desmontagem/ruptura de fibrilas de amiloide preformadas da doença de Alzheimer (isto é, constituídas por fibrilas Αβ 1-42), e os agregados α-sinucleína da doença de Parkinson. Num estudo, a fluorimetria de tioflavina T foi utilizada para determinar os efeitos dos compostos, e de EDTA (como controlo negativo). Neste ensaio a tioflavina T liga-se especificamente a amiloides fibrilares, e esta ligação produz um aumento de fluorescência a 485 nm que é diretamente proporcional à quantidade de fibras presentes. 69

Quanto mais elevada for a fluorescência, maior será a quantidade de fibrilas presentes (Naki et al., Lab. Invest. 65:104-110, 1991; Levine III, Protein Sei. 2:404- 410, 19 93; Amiloide: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995).

No ensaio de ligação vermelho do Congo foi quantificada a capacidade de um determinado composto de teste para alterar a ligação de amiloides (fibrilas Αβ 1-42, ou agregados de α-sinucleina) ao vermelho do Congo. Neste ensaio, fibrilas Αβ 1-42, ou agregados de α-sinucleína e compostos de teste foram incubados durante 3 dias e em seguida filtrados sob vácuo através de um filtro de 0,2 ym. A quantidade de fibrilas Αβ 1-42, ou agregados de a-sinucleína retida no filtro foi então quantificada após coloração do filtro com vermelho do Congo. Após lavagem adequada do filtro, qualquer redução da cor vermelho do

Congo no filtro na presença do composto de teste (em comparação com a coloração com vermelho do Congo da proteína amiloide na ausência do composto de teste) foi indicativa da capacidade do composto de teste para diminuir/alterar a quantidade de fibrilas Αβ 1-42 agregadas e congofílicas, ou agregados de α-sinucleína.

Terapêutica Combinada O composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol pode ser administrado em combinação, ou sequencialmente com outro agente terapêutico. Estes outros agentes terapêuticos incluem os que são conhecidos para o tratamento, prevenção, ou atenuação de um ou mais sintomas de amiloidose e doenças causadas por sinucleína. Tais agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a 70 cloridrato de donepezilo (Aracept), tartatrato de rivastigmina (Exelon), cloridrato de tacrina (Cognex) e bromidrato de galantamina (Reminyl). Métodos de utilização dos compostos e composições 0 composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol é útil em métodos de tratamento, prevenção, ou atenuação de um ou mais sintomas de doenças ou distúrbios causados por β-amiloides, incluindo mas não se limitando a doenças associadas com a formação, deposição, acumulação ou a persistência de fibrilas de β-amiloides. Em certas formas de realização, o composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol é utilizado para o tratamento, prevenção, ou atenuação de um ou mais sintomas de doenças incluindo, mas não limitadas à doença de Alzheimer, Sindrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose do tipo Dutch, e angiopatia cerebral causada por β-amiloide. É também proporcionada a utilização do composto 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol para inibir ou prevenir o crescimento de fibriflas de α-sinucleina, e para causar a desmontagem, ruptura, e/ou a desagregação de agregados de α-sinucleína preformados e depósitos de proteína associados com a α-sinucleína.

Em certas formas de realização, as doenças causadas pela sinucleína ou sinucleinopatias tratadas, prevenidas ou cujos sintomas são melhorados pelo composto 3,5-bis (3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol não estão limitados a doenças associadas com a formação, deposição, acumulação ou persistência de agregados de sinucleína, incluindo fibrilas de α-sinucleína. Em certas formas de realização, 71 estas doenças incluem a doença de Parkinson, doença familiar de Parkinson, doença de corpos de Lewy, a variante com corpo de Lewy da doença de Alzheimer, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, e o complexo parkinsonismo-demência de Guam.

Numa forma de realização é proporcionado um composto que tem a fórmula

e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Numa outra forma de realização é proporcionada uma composição farmacêutica que compreende 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil ) -1 , 2 , 4-triazol e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Numa outra forma de realização é proporcionada a composição 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol para utilização na inibição da formação, deposição, acumulação ou persistência de agregados de amiloide Αβ ou a-sinucleína.

Numa outra forma de realização é proporcionada a composição 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol para utilização no tratamento de uma doença causada por β-amiloide ou uma sinucleinopatia num mamífero que sofre da mesma. 72

Numa outra forma de realização é proporcionada a composição 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol para utilização na melhoria do desempenho motor num mamífero que sofre de uma sinucleinopatia.

Numa outra forma de realização é proporcionada a composição 3,5-bis(3,4-di-hidrofenil)-1,2,4-triazol para utilização na interrupção do avanço de défices motores num mamífero que sofre de doença de Parkinson.

Os seguintes Exemplos não limitativos são apresentados a título de ilustração apenas e não são considerados uma limitação desta invenção.

EXEMPLOS

Procedimentos Experimentais Gerais

Todos os solventes foram destilados antes da sua utilização e foram removidos por evaporação rotativa a temperaturas até 35 °C. Gel de sílica Merck 60, malhas de 200-400, 40-63 ym, foram utilizados para a cromatografia flash em gel de sílica. A TLC foi realizada utilizando DC-plastikfolien Kieselgel 60 F254 da Merck, primeiro visualizada com uma lâmpada UV, e em seguida, por meio de imersão numa solução de vanilina (1% de vanilina, 1% de H2S04 em EtOH), e aquecimento. Os espectros de massa foram registados num instrumento Kratos MS-80. Os espectros de RMN, a 25 °C., foram registados a 500 ou 300 MHz para 1H e 125 ou 75 MHz para 13C nos espectrômetros Varian INOVA-500 ou VXR-300. Os desvios químicos são apresentados em ppm na escala δ com referência aos picos do solvente: CHCI3 a 7,25 73 e CDCI3 a 77,0 ppm ou (CH3)2CO a 2,15 e (CD3)2CO a 30,5 ppm ou CH3OD a 3,3 0 e CD3OD a 3 9,0 ppm.

Condições de HPLC

As amostras foram analisadas utilizando um instrumento Agilent HP1100, operado com software EzChrom Elite, e equipado com uma coluna C18 (Phenomenex Prodigy 5 pm 100 A, 250 x 4,6 mm) com uma coluna de guarda (Phenomenex ODS 4x3 mm, 5 pm) , mantida a 30 °C. Os picos foram detectados a 280 nm. A fase móvel foi acetonitrilo em água (com TFA a 0,1%) : t0=ll%, t20=ll%, t30=100%, t3i=ll%, t4o=H%. A taxa de fluxo foi de 1 mL/min e o volume de injeção de 5 pL.

Exemplo Comparativo 1: Síntese de Sulfonamida 2 Ácido 3,4 di-hidroxibenzenossulfónico 3,4 di-hidroxifenil sulfonamida (Composto 5)

A síntese da sulfonamida 2 foi reai-í ailzada por reação de cloreto de 3,4-metilenedioxibenzenossn 1 ^ i>UJ-íonilo (preparado a partir de 1,2-metilenodioxibenzeno nv ^lao, E.V.P.; Miller, W.D.

Patente U.S.

N

O

com 3,4- 74 metilenodioxianilina, para obter a sulfonamida 1 com um bom rendimento. A desproteção com tribrometo de boro, em condições padrão deu a sulfonamida fenólica livre com um rendimento razoável. A uma solução em agitação de cloreto de 1,3-benzodioxol-5-sulfonilo (Tao, E.V.P.; Miller, W.D. Patente U.S. N° 5,387,681, 1995) (1 g) em diclorometano (DCM) (10 mL) foi adicionada uma solução de 3,4-metilenodioxianilina (0,62 g) em diclorometano (10 mL) seguido de piridina (1 mL) . A mistura foi submetida a refluxo durante 2 horas, arrefecida, diluída com diclorometano (150 mL), lavada com HC1 aquoso (1 M, 2 x 100 mL) , seca, em seguida, evaporada em vácuo para dar o produto em bruto como uma goma castanha. A purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com 5-10% de acetato de etilo em diclorometano deu a sulfonamida pura na forma de uma goma castanho pálido (1,34 g, 92%). A cristalização a partir de etanol 95% deu o produto na forma de cristais castanhos claros. HPLC 29,6 minutos.

RMN de ΧΗ ((CD3)2CO) 8,75 (1H, s) , 7,39 (2H, dd, J 2, 9Hz) , 7,24 (1H, d, J 2Hz), 7,02 (1H, d, J 9Hz), 6,86 (1H, d, J 2Hz), 6,81 (1H, d, J 9Hz), 6,72 (2H, dd, J 2, 9Hz), 6,23 (2H, s) e 6,06 (2H, s) • HREIMS Encontrado, 344,0201; MNa+, Ci4HnNNa06S requer 344,0199. A uma solução da sulfonamida 1 (0,7 g) em DCM seco (50 mL) foi adicionado tribrometo de boro (0,5 mL) e a mistura foi deixada à temperatura ambiente durante 3 horas. Metanol (gota a gota depois 5 mL) foi adicionado cuidadosamente, em seguida, a reação foi deixada à temperatura ambiente 75 durante 24 horas. A mistura foi evaporada em vácuo a 1 mL, em seguida, mais metanol (20 mL) foi adicionado, o que foi repetido quatro vezes, em seguida, os solventes foram removidos por evaporação em vácuo. A purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com 0-20% de metanol em clorofórmio deu o produto na forma de uma goma castanho claro. Purificação adicional sobre sílica de fase reversa C-18, eluindo com 0-50% de acetonitrilo em água, seguida por liofilização, deu origem ao produto puro 2 como um pó castanho claro (295 mg, 45%). HPLC 12,9 minutos 95% RMN de XH (CD30D) 7,05 (1H, d, J 2Hz), 7,03 (2H, dd, J 2, 9Hz), 6,76 (1H, d, J 9Hz) , 6,57 (1H, d, J 2Hz) , 6,56 (1H, d, J = 9Hz) e 6,31 (2H, dd, J 2, 9Hz). HREIMS Encontrado, 296, 0241, M”, Ci2Hi0NO6S requer, 296,0234.

Exemplo Comparativo 2: Síntese de Imldazol 4 2,4-bis(3,4 di-hidroxifenil)imldazol (Composto 6)

HO' 4 76 0 anel de imidazol foi formado de acordo com o método descrito por Li et ai. (Li et ai., Organic Process Research and Development 2002, 6, 682-3) do amidinobenzeno, formado de piperonilonitrilo (Thurkauf et ai., J. Med. Chem. 1995, 38 (12), 2.251-2.255) e a bromocetona (Castedo et ai., Tetrahedron 1982, 38 (11), 1569-1570), formada de 3,4-metilenodioxiacetofenona de acordo com o método descrito por Lee et ai. (Korean Chem Soc. 2003, 24 (4), 407-408). A desproteção com tribrometo de boro, em condições padrão deu o imidazol fenólico livre com um bom rendimento.

De acordo com o processo descrito por Li, uma mistura de 3-amidinobenzeno (Thurkauf et ai., J. Med. Chem. 1995, 38 (12), 2251-2255) (0,5 g, 3 mmol) e bicarbonato de potássio (1,20 g, 12 mmol) em tetra-hidrofurano (THF) (16 mL) e água (4 mL) foi aquecida vigorosamente ao ser submetida a refluxo. Bromocetona (Castedo et ai., Tetrahedron 1982, 38 (11), 1569-1570, e Lee et al. , Korean Chem. Soc. 2003, 24 (4), 407-408) (0,729 g, 3 mmol) em THF (4 mL) foi adicionada ao longo de 30 minutos e o refluxo foi mantido durante mais 2 horas. O THF foi em seguida removido por evaporação sob vácuo e o resíduo foi extraído em acetato de etilo, seco e evaporado em vácuo para dar o produto em bruto na forma de um sólido castanho. A cristalização de etanol 95% deu o imidazol 3 puro na forma de um sólido cristalino amarelo pálido (0,54 g, 58%). HPLC 27,9 minutos. RMN ((CD3)2CO) 7,45-7,70 (5H, m) , 7,02 (1H, d, J 9Hz), 6,95 (1H, d, J 9Hz), 6,15 (2H, s) e 6,09 (2H, s) HREIMS Encontrado, 309,0875; MH+, C17H12N2O4 requer, 309, 0870 . 77 A uma solução do imidazol 3 (0,5 g) em DCM seco (50 mL) foi adicionado tribrometo de boro (1,0 mL) e a mistura foi deixada a temperatura ambiente durante 3 horas. Metanol (gota a gota, depois 5 mL) foi adicionado cuidadosamente, em seguida, a reação foi deixada à temperatura ambiente durante 24 horas. A mistura foi evaporada em vácuo a 1 mL, em seguida, mais metanol (30 mL) foi adicionado, o que foi repetido quatro vezes, em seguida, os solventes foram removidos por evaporação em vácuo. A purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com 0-20% de metanol em clorofórmio deu origem ao produto 4 na forma de um sólido castanho pálido (0,27 g, 58%) . HPLC 16,3 minutos 99% RMN de ΧΗ (CD3OD) 7,59 (1H, s) , 7,36 (1H, d, J 2Hz), 7,31 (2H, dd, J 2, 9Hz ), 7, 16 (1H, d, J 2Hz), 7,10 (2H, dd, J 2, 9Hz) , 6,98 (1H, d, J 9Hz) e 6,88 (1H, d, , J 9Hz). HREIMS Encontrado, 285, 0873; MH+, Ci5Hi3N204 requer 285, 0870.

Exemplo 3: Sintese de Trlazol 7 3,5-bis (3,4 di-hidroxifenil)1,2,4 triazol (Composto 7)

78 0 anel de 4-aminotriazolo foi formado por uma reação de dimerização de piperonilonitrilo de acordo com o método descrito por Bentiss (Bentiss et al. , J. Heterocyclic Chem., 1999, 36, 149-152) e, em seguida, a desaminação foi realizada de acordo com o método descrito por Bentiss (Bentiss et al., J. Heterocyclic Chem. 2002, 39, 93-96.) para dar o triazol 6 com bom rendimento. A desproteção com tribrometo de boro, em condições padrão deu o triazol fenólico livre 7, com bom rendimento.

De acordo com o processo descrito por Bentiss (Bentiss et al., J. Heterocyclic Chem., 1999, 36, 149-152) uma mistura de nitrilo aromático (1 g) , hidrato de hidrazina (1 g) e cloridrato de hidrazina (0,5 g) em solução em etileno

glicol (5 mL) foi aquecida a 130 °C durante 5 horas. A solução foi arrefecida, depois diluída com água (7 mL), o produto sólido foi filtrado, lavado com DCM depois seco para dar o produto em bruto. A recristalização a partir de metanol deu origem ao 4-aminotriazol 5 puro na forma de um sólido amarelo pálido (0,65 g, 66%). HPLC 27,0 minutos. RMN de XH ((CD3)2CO) 7,62 (2H, dd, J 2, 9Hz), 7,42 (2H, d, J 2Hz), 6,94 (2H, d, J 9Hz), 6,15 (2H, s) e 5,93 (4H, s) . H RE IMS Encontrado, 325, 0937; MH+, Ci6Hi3N404 requer 325,0931.

De acordo com o processo descrito por Bentiss (Bentiss et al., J. Heterocyclic Chem., 2002, 39, 93-96) a uma solução agitada de amino triazol 5 (0,5 g) numa solução aquosa de ácido hipofosforoso (50%, 5 mL) foi adicionada lentamente uma solução de nitrito de sódio (0,6 g) em água (1,5 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante mais uma hora, em seguida o precipitado cor de laranja pálido 79 foi recolhido, lavado com água e seco para dar o triazol 6 (0,38, 80%). HPLC 29,48 minutos. RMN de 1H ((CD3)2CO) 7,81 (2H, dd, J 2, 9Hz), 7,70 (2H, d, J 2Hz), 7,10 (2H, d, J 9Hz) e 6,20 (4H, s). H RE IMS Encontrado, 310,0818; C16H12N3O4 requer 310,0822. A uma solução do triazol 6 (0,5 g) em DCM seco (50 mL) foi adicionado tribrometo de boro (1,0 mL) e a mistura foi deixada à temperatura ambiente durante 3 horas. Metanol (gota a gota, depois 5 mL) foi adicionado cuidadosamente, depois a reação foi deixada à temperatura ambiente durante 24 horas. A mistura foi evaporada em vácuo a 1 mL, em seguida, mais metanol (30 mL) foi adicionado, o que foi repetido quatro vezes, depois os solventes foram removidos por evaporação em vácuo. A purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com 0-20% de metanol em clorofórmio deu o produto 7 na forma de um sólido castanho pálido (0,24 g, 52%) . HPLC 16,1 minutos 97% RMN de XH (CD3OD) 7,46 (2H, d, J 2Hz) , 7,41 (2H, dd, J 2, 9Hz), 7,15 (1H, s) e 6,96 (2H, d, J 9Hz) . HREIMS Encontrado, 286, 0815; MH+, Ci4Hi2N304 requer 286, 0822. 80

Exemplo Comparativo 4: Síntese de Pirazol 9 3,5-bis (3,4 di-hidroxifenil)pirazol (Composto 8)

o OH N NH

HC

N NH HO

9 A reação da 1,3-dicetona (Lopez et al., Planta Med. 1.998, 64 (1), 76-77) (preparado de acordo com o método descrito por Choshi et al. , (Chem. Pharm. Buli. 1992, 40 (4), 1047- 1049) com hidrato de hidrazina de acordo com o método descrito por Fink et al. , (Chemistry and Biology 1999, 6, 205-219), deu o pirazol 8 com bom rendimento. A desproteção com tribrometo de boro, em condições padrão deu o pirazol fenólico livre 9 com bom rendimento.

De acordo com o método descrito por Fink et al. , (Chemistry and Biology 1999, 6, 205-219), uma suspensão de dicetona (Choshi et al., Chem. Pharm. Buli. 1992, 40 (4), 1047-1049 e Lopez et al., Planta Med. 1998, 64 (1), 76-77) (1 g) e HC1 de hidrazina (1 g, 5 equiv) em DMF/THF (3:1, 12 mL) foi aquecida a refluxo durante 24 horas. Foi adicionada água e a mistura foi extraída com diclorometano, seca e evaporada em vácuo para dar o produto bruto 8 na forma de um sólido amarelo. A purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com 0-20% de acetato de etilo em 81 diclorometano deu o pirazol 8 na forma de um sólido amarelo pálido (0,49 g, 50%). HPLC 30,3 minutos RMN de ΧΗ ((CD3)2CO) 7,47 (2H, dd, J 2, 9Hz), 7,46 (2H, d, J 2Hz) , 7,04 (1H, s), 7,02 (2H, d, J 9Hz) e 6,14 (4H, s) . HREIMS Encontrado, 309, 0859; MH+, C17H13N2O4 requer 309,0870. A uma solução do pirazol 8 (0,46 g) em DCM seco (50 mL) foi adicionado tribrometo de boro (0,4 mL) e a mistura foi deixada à temperatura ambiente durante 3 horas. Metanol (gota a gota, depois 5 mL) foi adicionado cuidadosamente, em seguida, a reação foi deixada à temperatura ambiente durante 24 horas. A mistura foi evaporada em vácuo a 1 mL, em seguida, mais metanol (30 mL) foi adicionado, o que foi repetido quatro vezes, em seguida, os solventes foram removidos por evaporação em vácuo. A purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com 0-20% de metanol em clorofórmio deu o pirazol 9 na forma de um sólido amarelo pálido. (0,285 g, 67%) . HPLC 25,9 minutos 98% RMN de ΧΗ (CD3OD) 7,26 (2H, d, J 2Hz), 7,22 (2H, dd, J 2, 9Hz), 7,15 (1H, s) e 6,93 (2H, d, J 9Hz). HREIMS Encontrado, 285, 0879; C15H13N2O4 requer, 285, 0870. 82

Exemplo Comparativo 5: Síntese de Adamantano 10 1,3-bis (3,4 di-hidroxifenil)adamantano (Composto 9)

OH HO

+

OH HO

OH

HO 10 A reação de catecol com 1,3-adamantano-diol de acordo com o método descrito por Lu et al., (Lu et al. , J Med Chem 2005, 48 (14), 4576-4585) proporcionou o aducto 10 com um rendimento razoável.

De acordo com o método descrito por Lu, uma solução de catecol (1,0 g) e adamantano diol (0,5 g) em ácido metanossulfónico (2 mL) foi aquecida a 80 °C durante 3 horas, depois deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Foi adicionada água e a mistura foi extraída em 10% de metanol em clorofórmio, a qual foi seca e evaporada em vácuo para dar um sólido branco. A purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica eluindo com 0-20% de metanol em clorofórmio deu o produto na forma de um sólido branco. A cristalização a partir de éter dietílico/éter de petróleo a 40% então deu o produto puro 10 na forma de um sólido cristalino branco (210 mg, 20%) . HPLC 29,8 minutos 98%

RMN de 1E (CD3OD) 6,82 (2H, t, J 1,5Hz), 6,68 (4H, d, J 1,5Hz), 2,22 (2H, bs), 1,87 (8H, m) e 1,77 (2H, bs). 83 H RE IMS Encontrado, 387,1369; MCI , C22H24CIO4 requer, 387,1369.

Exemplo 6: Os compostos 1-9 são potentes disruptores de fibrilas ou agregados de Άβ 1-42 de Alzheimer

Constatou-se que os compostos preparados nos Exemplos precedentes são potentes inibidores/disruptores de fibrilas ou agregados (Αβ) da proteína β-amiloide da doença de Alzheimer. Numa série de estudos, foi analisada a eficácia dos compostos para provocar uma desmontagem/ruptura de fibrilas amiloides preformadas da doença de Alzheimer (isto é, que consistem em fibrilas Αβ 1-42) .

Parte A - Fluorometria de Tioflavina T

Num estudo, a fluorimetria de tioflavina T foi utilizada para determinar os efeitos dos compostos, e de EDTA (como controlo negativo). Neste ensaio a tioflavina T liga-se especificamente a amiloide fibrilar, e esta ligação produz um aumento de fluorescência a 485 nm que é diretamente proporcional à quantidade de fibrilas amiloides formadas. Quanto mais maior for a fluorescência, maior será a quantidade de fibrilas amiloides formadas (Naki et al., Lab. Invest. 65: 104-110, 1991; Levine III, Protein Sei. 2:404-410, 1993; Amiloide: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1- 6, 1995).

Neste estudo, 30 yL de uma solução de 1 mg/mL (em água destilada) de Αβ 1-42 pré-fibrilada (rPéptido) foi incubada a 37 °C durante 3 dias, isoladamente, ou na presença de um dos compostos ou EDTA (em proporções de 84 peso Αβ:composto de teste de: 1:1, 1:0,1, 1:0,01 ou 1:0,001). Depois de 3 dias de co-incubação, 50 yL de cada mistura de incubação foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 150 pL de água destilada e 50 pL de uma solução de tioflavina T (isto é, tioflavina T 500 mM num tampão fosfato 250 mM, pH 6,8) . A emissão de fluorescência foi lida a 485 nm (comprimento de onda de excitação de 444 nm) utilizando um fluorimetro de placa ELISA depois da subtração com o tampão sozinho ou composto sozinho, como branco.

Os resultados das incubações de 3 dias são ilustrados graficamente na Figura 5. Por exemplo, enquanto o EDTA ('+ C' na Figura 5) não causou inibição significativa das fibrilas Αβ 1-42 em todas as concentrações testadas, todos os compostos causaram uma perturbação/desmontagem dependente da dose de fibrilas Αβ 1-42 preformadas. Todos os compostos testados foram eficazes na perturbação de fibrilas Αβ 1-42 preformadas semelhantes aos resultados obtidos de um composto de controlo positivo ('+ C' na Figura 5). Por exemplo, todos os compostos provocaram pelo menos 96% de inibição quando utilizados numa proporção em peso de 1:1 de Αβ: composto de teste em comparação com 99% para o controlo. Numa proporção em peso de 1:0,1 de Αβ:composto de teste os níveis de inibição variaram entre 86 e 95% em comparação com 92% para o controlo. Este estudo indicou que os compostos testados são potentes disruptores/inibidores das fibrilas Αβ do tipo da doença de Alzheimer, e geralmente exercem os seus efeitos de uma maneira dependente da dose. 85

Parte B: Vermelho do Congo

No ensaio de ligação de vermelho do Congo é quantificada a capacidade de um composto de teste de alterar a ligação de β-amiloides com o vermelho do Congo. Neste ensaio, Αβ 1-42 (tal como preparado para o ensaio Tio T) e os compostos de teste foram incubados durante 3 dias e em seguida filtrados em vácuo através de um filtro de 0,2 ym. A quantidade de Αβ 1-42 retida no filtro foi então quantificada após coloração do filtro com vermelho do Congo. Após lavagem adequada do filtro, qualquer redução da cor vermelho do Congo no filtro, na presença do composto de teste (em comparação com a coloração com vermelho do Congo da proteína amiloide na ausência do composto de teste) foi indicativa da capacidade do composto de teste para diminuir/alterar a quantidade de Αβ agregada e congofílica.

Num estudo, foi determinada a capacidade de fibrilas Αβ para se ligarem ao vermelho do Congo na ausência ou na presença de quantidades crescentes dos compostos ou de EDTA (em proporções de peso de Αβ: composto de teste de 1:1, 1:0,1, 1 0,01 ou 1:0,001). Os resultados das incubações de 3 dias são ilustrados graficamente na Figura 6. Enquanto o EDTA ('-C' na Figura 6) não causou inibição significativa da ligação de fibrilas Αβ 1-42 ao vermelho do Congo em todas as concentrações testadas, os compostos provocaram uma inibição dependente da dose de ligação de Αβ ao vermelho do Congo, alguns excederam os efeitos do composto de controlo positivo ('+ C' na Figura 6). Por exemplo, o composto de controlo positivo causou uma redução significativa (p<0,01) de 73,5% de ligação para de vermelho do Congo com fibrilas Αβ 1-42 quando utilizado numa proporção em peso de 1:1 de Αβ: composto de teste, e 86 um aumento significativo (p<0,01) de 10,4% de inibição de ligação de Vermelho do Congo quando utilizado numa proporção em peso de 1:0,1 de Αβ:composto de teste. Os compostos 6, 8 e 9 excederam os resultados do composto de controlo positivo em ambas as proporções acima assinaladas. Similar aos resultados para o ensaio de Tio T, este estudo também indicou que os compostos testados são potentes inibidores da ligação de fibrilas Αβ com vermelho do Congo, e, geralmente, exercem os seus efeitos, de forma dependente da dose.

Parte D - Dados de Espectroscopia de Dicroísmo Circular A espectroscopia de dicroismo circular (CD) é um método que pode ser utilizado para determinar os efeitos dos compostos de teste sobre a perturbação da conformação estrutural secundária de fibrilas amiloides. Num estudo, como descrito neste exemplo, a espectroscopia de dicroismo circular foi utilizada para determinar os efeitos de diferentes compostos da invenção na conformação em folha β de fibrilas Αβι_42. Para este estudo, Αβι_42 (rPeptide Inc., Bogart, GA) foi primeiro liofilizado a partir de uma solução de NaOH 50 mM, sendo o pH mantido acima de 10 antes da congelação e liofilização. O peptideo foi então reconstituído em tampão de acetato 20 mM, pH 4,0, a uma concentração de 1 mg/mL. A diluição e a adição dos compostos de teste ou veiculo foi realizada de tal modo que a concentração final de péptido era de 0,5 mg/mL e as proporções p/p de Αβχ_42: compostos de teste eram de 1:1 e 1:0,1. Quando não foram adicionados compostos de teste, a quantidade de veiculo adicionado à mistura de reação foi igual à quantidade utilizada para libertar os compostos de teste. Após 5 dias de incubação a 37 °C na presença de 87 compostos ou veículo, os espectros de CD foram registados num espectropolarímetro Jasco 810 (Easton, MD) . Todos os espectros de CD foram coletados em células de quartzo de 0,05 ou 0,1 cm. Vestígios de comprimento de onda foram digitalizados de 190-270 nm em incrementos de 0,1 nm com uma largura de banda de 2 nm, a uma velocidade de varrimento de 50 nm por minuto, um tempo de resposta de 1 segundo, e um intervalo de dados de 0,1 nm. Todo o sistema foi equilibrado e continuamente purgado com azoto, a 10 L/min. Para o processamento de dados, 10 espectros replicados de Αβι_42 com veículo adicionado foram adquiridos antes da incubação, a média foi calculada e foi subtraído da média de 10 espectros de "Αβι_42 + composto de teste" ou veículo após o período de incubação. Os espectros médios foram convertidos de elipticidade em graus para especificar a elipticidade específica utilizando a fórmula [Ψ] = (Ψ°/φ x c onde Ψ° é a elipticidade em graus, d é o comprimento do percurso em mm, e c é a concentração em mg/mL. Desta maneira, pode-se avaliar a alteração na estrutura do péptido que ocorre entre a encontrada no tempo de dissolução inicial e a encontrada após incubação. A Figura IA mostra alguns dos espectros de CD gerados neste estudo. Αβι_42 sozinho (veículo na Figura IA) em tampão acetato 20 mM, após incubação geralmente demonstrou o espectro de CD típico de uma proteína amiloide com significativa estrutura em folha β, tal como demonstrado pelo mínimo observado a 218 nm. No entanto, na presença de alguns dos compostos, uma perturbação significativa da estrutura em folha β nas fibrilas Αβι_42 foi evidente (com um aumento significativo em espiral aleatória ou a-hélice) como mostrado pela redução da magnitude do mínimo observado a 218 nm (comparado com Αβι_42 sozinho) . 88 A Figura 1B mostra os efeitos dos compostos 1 e 2 sobre a inibição da estrutura em folha β da formação de fibrilas A β i-42, quando comparado com um composto de controlo positivo. Os estudos por meio de CD mostram que os compostos testados têm a capacidade de perturbar/desmontar a estrutura em folha β caracteristica das fibrilas Αβ de Alzheimer. Os resultados dos estudos confirmam também os exemplos anteriores utilizando fluorometria de Tioflavina T e ensaios de ligação do tipo vermelho do Congo.

Exemplo 7: Os compostos 1-9 são potentes disruptores das fibrilas ou agregados de α-sinucleina da doença de Parkinson

Constatou-se que os compostos testados são também potentes disruptores/inibidores das fibrilas ou agregados de a-sinucleína da doença de Parkinson. Foi demonstrado que a α-sinucleina forma fibrilas quando incubadas a 37 °C durante vários dias. Postula-se que a a-sinucleína desempenha um papel importante na patogénese da doença de Parkinson e outras sinucleinopatias. Neste conjunto de estudos, foi analisada a eficácia dos compostos para provocar uma desmontagem/perturbação das fibrilas ou agregados preformados de α-sinucleína da doença de Parkinson.

Parte A - Fluorometria de Tioflavina T

Num estudo, a fluorimetria de tioflavina T foi utilizada para determinar os efeitos dos compostos e de EDTA (como controlo negativo, (-C)) . Neste ensaio, a tioflavina T liga-se especificamente a fibrilas e aglomerados de a- 89 sinucleína, e esta ligação produz um aumento de fluorescência a 485 nm que é diretamente proporcional à quantidade de fibrilas ou agregados de a-sinucleína presentes. Quanto mais elevada for a fluorescência, maior será a quantidade de fibrilas ou agregados de a-sinucleína presentes (Naki et al.r Lab. Invest. 65:104-110, 1991; Levine III, Protein Sei. 2:404-410, 1993; Amiloide: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995).

Neste estudo, 30 pL de uma solução de 1 mg/mL de a-sinucleína (rPeptide) foi pré-fibrilada a 37 °C com agitação a 1400 rpm, durante 4 dias e em seguida incubada a 37 °C durante 3 dias, quer isoladamente ou na presença dos compostos ou de EDTA (a proporções em peso de a-sinucleína:composto de 1:1, 1:0,1, 1:0,01 ou 1: 0,001). Depois de 3 dias de co-incubação, 50 pL de cada mistura de incubação foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 150 pL de água destilada e 50 pL de uma solução de tioflavina T (isto é, de tioflavina T 500 mM em tampão fosfato 250 mM, pH 6,8) . A emissão de fluorescência foi lida a 485 nm (comprimento de onda de excitação de 444 nm) utilizando um fluorímetro de placa ELISA depois da subtração com tampão sozinho ou composto sozinho, como branco.

Os resultados das incubações de 3 dias são ilustrados graficamente na Figura 7. Por exemplo, enquanto o EDTA não causou inibição significativa de fibrilas ou agregados de α-sinucleína em todas as concentrações testadas, todos os compostos causaram uma perturbação/desmontagem dependente da dose de fibrilas ou agregados de a-sinucleína preformados em vários graus. Por exemplo, a uma proporção de α-sinucleína:composto de 1:0,01 o composto de controlo 90 positivo (+C na Figura 7) causou uma redução significativa (p<0,01) de 77,4% de inibição enquanto que os outros compostos testados apresentaram um intervalo de 45 a 83%. Os compostos 1, 4, 5 e 6 apresentaram resultados muito similares ao composto de controlo positivo. Este estudo indicou que os compostos testados são potentes disruptores/inibidores de fibrilas ou agregados de a-sinucleína da doença de Parkinson, e geralmente exercem os seus efeitos, de forma dependente da dose.

Parte B: Vermelho do Congo

No ensaio de ligação a vermelho do Congo, é quantificada a capacidade de um determinado composto de teste para alterar a ligação da α-sinucleína com o vermelho do Congo. Neste ensaio, α-sinucleína (pré-fibrilada como foi preparada no ensaio Tio T) e os compostos foram incubados durante 3 dias e em seguida filtrados em vácuo através de um filtro de 0,2 ym. A quantidade de α-sinucleína retida no filtro foi então quantificada após coloração do filtro com vermelho do Congo. Após lavagem adequada do filtro, qualquer redução da cor vermelho do Congo no filtro, na presença do composto (em comparação com a coloração com vermelho do Congo da proteína amiloide na ausência do composto) foi indicativa da capacidade do composto de teste para diminuir/alterar a quantidade de a-sinucleína agregada e congofílica.

Num estudo, foi determinada a capacidade das fibrilas e agregados de α-sinucleína para se ligarem ao vermelho do Congo na ausência ou na presença de quantidades crescentes de compostos ou de EDTA (em proporções em peso de a-sinucleína:composto de 1:1, 1:0,1, 1:0,01 ou 1:0,001). Os 91 resultados das incubações de 3 dias são ilustrados graficamente na Figura 8. Enquanto o EDTA (-C) não causou inibição significativa de ligação de fibrilas de a-sinucleína ao vermelho do Congo em todas as concentrações testadas, os compostos testados causaram uma inibição dependente da dose de ligação de α-sinucleína ao vermelho do Congo. Por exemplo, o composto de controlo positivo (+C) causou uma redução significativa (p<0,01) de 78,5% de inibição de ligação ao vermelho do Congo de fibrilas ou agregados de α-sinucleína a uma proporção peso/peso de 1:1. 0 intervalo de inibição na mesma proporção para a todos os compostos testados foi de 60 a 100%. Este estudo indicou que os compostos testados são também potentes inibidores das ligações das fibrilas de α-sinucleína do tipo da doença de Parkinson ao vermelho do Congo, e, geralmente, exercem os seus efeitos, de forma dependente da dose.

Parte C - Dicroísmo Circular A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) é um método que pode ser utilizado para determinar os efeitos dos compostos de teste sobre a conformação estrutural secundária de α-sinucleína. Uma vez que a automontagem de monómeros de α-sinucleína em agregados ou fibrilas não é possível sem a formação de estrutura secundária, ou seja a folha beta, a espectroscopia de CD pode ser utilizada para medir a capacidade dos compostos de teste para inibir o processo de fibrilação ou agregação.

Num estudo, como descrito neste exemplo, a espectroscopia de dicroísmo circular foi utilizada para determinar os efeitos de diferentes compostos da invenção sobre a 92 conformação de folha-β de α-sinucleína. Para este estudo, a α-sinucleína (rPeptide Inc., Bogart, GA) foi dissolvida em tampão fosfato 9,5 mM (PBS) a 1 mg/mL. 0 material resultante foi diluído no mesmo tampão e compostos de teste ou veículo foram adicionado de tal modo que a concentração final de péptido foi de 0,25 mg/mL e as proporções p/p de α-sinucleína:composto foram de 1:1 e 1:0,1. Um espectro de CD foi registado da amostra tratada com veículo antes da incubação de todas as amostras durante 4 dias, após o que foram adquiridos espectros de todas as reações α-sinucleína/composto ou veículo. Os espectros de CD foram registados num espectropolarímetro Jasco 810 (Easton, MD) . Todos os espectros de CD foram adquiridos utilizando células de quartzo de 0,10 cm. Vestígios de comprimento de onda foram digitalizados de 190-270 nm em incrementos de 0,1 nm com uma largura de banda de 2 nm, a uma velocidade de varrimento de 50 nm/minuto, um tempo de resposta de 32 segundos e um intervalo de dados de 0,5 nm. Todo o sistema foi equilibrado e continuamente purgado com azoto a 10 L/min. Para o processamento de dados, 10 espectros replicados de espectros do tampão com veículo adicionado foram adquiridos antes da incubação, a média foi calculada e foi subtraído da média de 10 espectros de "α-sinucleína + composto de teste" ou veículo após o período de incubação. Os espectros médios foram convertidos de elipticidade em graus para especificar a elipticidade específica utilizando a fórmula [Ψ] = (W°/d) x c onde Ψ° é a elipticidade em graus, d é o comprimento do percurso em mm, e c é a concentração em mg/mL. Desta maneira, pode-se avaliar a alteração na estrutura do péptido que ocorre entre a encontrada no tempo de dissolução inicial e a encontrada após incubação. 93 A Figura 2 mostra os espectros de CD gerados para uma a-sinucleína no tempo zero e depois de 4 dias de incubação a 37 °C . A α-sinucleína sozinha em tampão PBS tratado com veiculo demonstrou a assinatura espiral aleatória no tempo zero e depois 4 dias de incubação demonstrou o espectro de CD típico de uma proteína com significativa estrutura em folha β, tal como demonstrado pelo mínimo observado a 218 nm. No entanto, na presença de alguns dos compostos, uma acentuada inibição da formação da estrutura em folha β pela α-sinucleína foi evidente como mostrado pela redução na magnitude do mínimo observado a 218 nm (comparado com a α-sinucleína sozinha). A Figura 3A mostra alguns dos espectros de CD gerados neste estudo. A α-sinucleína no tempo zero produz o espectro indicativo de um péptido de espiral aleatória e também fornece 100% dos dados de controlo de inibição. Após a incubação, o espectro de α-sinucleína é o que seria esperado para uma estrutura em folha β, indicando que foram formados agregados de ordem superior e é utilizado para fornecer os dados de controlo de 0% de inibição. As amostras utilizadas para os controlos são veículo tratado para assegurar uma relação quantitativa entre estas amostras e as amostras tratadas dos compostos de teste. Estes dois espectros permite a quantificação precisa da percentagem de inibição da formação de fibrilas nas amostras tratadas de composto de teste devido ao seu estabelecimento de controlos positivos e negativos, que se assume como sendo 100% e 0% fibrilares, respectivamente. Apesar destas percentagens de controlo serem apenas estimativas, existe uma incerteza insuficiente para torná-las suspeitas, isto é, a extremidade inferior pode ser 0- 94 5% de inibição, enquanto a extremidade superior pode ser de 95-100% de inibição. Os controlos são geradas em cada ciclo do lote, utilizando a mesma solução mãe de a-sinucleína a qual é fraccionada em alíquotas de igual volume à qual se adiciona o composto de ensaio individual ou veiculo e correm em paralelo para assegurar a precisão da quantificação. Os espectros mostrados na Figura 3A foram adquiridos com uma proporção de a-sinucleína/composto de teste de 1:1 em peso/peso. Estes espectros de CD mostram que os compostos desta invenção têm a capacidade de inibir a formação de estrutura em folha β caracteristica de fibrilas ou agregados de a-sinucleína da doença de Parkinson. A Figura 3B mostra os efeitos dos compostos sobre a inibição da estrutura em folha β de α-sinucleína quando comparada com um composto de controlo positivo (+C) . O controlo positivo (+C1) é, como se disse, o espectro do veiculo tratado no tempo zero, enquanto o controlo negativo (-C) é o espectro do veiculo tratado durante 4 dias. A Figura 4A mostra alguns dos espectros de CD que foram obtidos neste estudo. Estes espectros foram adquiridos e processados da mesma maneira que os apresentados na Figura 3A. Estes espectros carecem da assinatura de folha β encontrada no espectro da amostra tratada com veículo. A Figura 4B mostra os efeitos dos compostos sobre a inibição da em folha β estrutura de α-sinucleína quando se compara com um composto de controlo positivo (+C). O controlo positivo (+C1) é, como se disse, o espectro do veículo tratado no tempo zero, enquanto o controlo 95 negativo (-C) é o espectro do veículo tratado durante 4 dias.

Os resultados dos estudos confirmam também os exemplos anteriores utilizando fluorometria de Tioflavina T e ensaios do tipo de ligação ao vermelho do Congo, que os compostos testados são potentes agentes anti-fibrilação de οί-sinucleína.

Exemplo 8: Os compostos 1-9 são potentes disruptores/inibidores de agregados de a-sinucleína associados com a doença de Parkinson A doença de Parkinson é caracterizada pela acumulação de agregados intraneuronais insolúveis chamados corpos de Lewy, um componente importante dos quais é a a-sinucleína (revisto em Dauer et al. , Neuron, 39:889-909, 2003). Uma vez que as mutações autossómicas dominantes em a-sinucleína causam um subconjunto de casos de doença de Parkinson familiar, e uma vez que estas mutações aumentam a probabilidade da α-sinucleína para agregar e formar corpos de Lewy, propõe-se que a α-sinucleína agregada esteja diretamente envolvida na etiologia e no avanço da doença (Polymeropoulos et al. , Science 276:1197-1199, 1997; Papadimitriou et al., Neurology 52:651-654, 1999).

Estudos estruturais revelaram que os corpos de Lewy intracelulares contêm uma grande proporção de proteínas mal dobradas com um elevado grau de estrutura secundária de folha β pregueada. Estes estudos foram conduzidos para determinar a eficácia dos compostos de teste na inibição/perturbação de agregados de a-sinucleína associados à doença de Parkinson. 96

Por conseguinte, para testar o potencial terapêutico dos compostos, foram utilizados dois ensaios baseados em células. Em ambos os ensaios, a rotenona é utilizada para induzir o stress oxidativo mitocondrial e agregação de a-sinucleína. 0 primeiro ensaio utiliza a ligação do corante fluorescente tioflavina S a estruturas com alto teor de folha β incluindo fibrilas e agregados de α-sinucleina. Desse modo, a avaliação quantitativa do grau de coloração positivo para tioflavina S de células fixas é utilizada para testar a capacidade dos compostos para diminuir a quantidade de agregados de α-sinucleína. No segundo ensaio, a viabilidade das células é avaliada utilizando o ensaio de citotoxicidade XTT, o qual é dependente de mitocôndrias funcionais, intactas em células vivas. Desse modo, o ensaio de citotoxicidade XTT é utilizado para testar a capacidade dos compostos para atenuar a toxicidade mitocondrial e resultante perda de viabilidade associada com a acumulação de agregados de α-sinucleína. Dito de outra forma, o ensaio de citotoxicidade XTT é utilizado para medir a eficácia neuroprotetora dos compostos. Estes estudos são apresentados nos exemplos seguintes.

Para realizar estes estudos, foi utilizado um modelo de cultura celular no qual a agregação de α-sinucleína humana é induzida experimentalmente. Foram obtidas células de neuroblastoma humano BE-M17 estavelmente transfectadas com α-sinucleína mutante humana A53T. Os reagentes de cultura de células foram obtidos da Gibco/Invitrogen, e as células foram cultivadas em OPTIMEM suplementado com FBS a 10%, Penicilina (100 unidades/mL) , Estreptomicina (100 yg/mL) e 500 yg/mL de G418, como previamente descrito (Ostrerova-Golts et al., J. Neurosci, 20:6048-6054, 2000). 97 A tioflavina S é vulgarmente utilizada para detectar estruturas contendo amiloides in situ, incluindo no tecido cerebral (Vallet et al., Acta Neuropathol 83:170-178, 1992), e células em cultura (Ostrerova-Golts et al., J. Neurosci, 20: 6048-6054, 2000), enquanto que a tioflavina T é frequentemente utilizada como um reagente in vitro para analisar a agregação de proteínas amiloides solúveis em fibrilas enriquecidas em estruturas em folha β pregueada (LeVine III, Prot. Sei, 2: 404-410, 1993).

Portanto, a histoquímica da tioflavina S foi utilizada em células cultivadas para detetar agregados que contêm um elevado grau de estruturas β pregueadas que foram formadas em resposta a agentes de indução de stress oxidativo (neste caso, a rotenona), como descrito anteriormente, com pequenas modificações (Ostrerova-Golts et al., J.

Neurosci, 20:6048-6054, 2000). Em resumo, para estes estudos, as células foram cultivadas em câmaras de lâminas de vidro revestidas com Poli-D-Lisina a aproximadamente 3 x 104 células/cm2. Depois de 24 horas, as células foram tratadas com rotenona 500 nM, 1 μΜ ou 5 μΜ (Sigma) ou veiculo (0,05% de DMSO) como indicado. Imediatamente após a adição de rotenona (ou veículo), os compostos foram adicionados na concentração indicada, ou foi adicionado apenas o meio de cultura de células (sem composto) , na presença de rotenona. Tratamentos idênticos foram repetidos ao fim de 48 horas. Após 48 horas adicionais, as células foram fixadas durante 25 minutos em paraf ormaldeído a 3%. Depois de uma lavagem com PBS, as células foram incubadas com tioflavina S a 0,015% em etanol a 50% durante 25 minutos, lavadas duas vezes durante quatro minutos em etanol a 50% e duas vezes durante cinco minutos em água desionizada e, em seguida, 98 montadas usando um composto de montagem de base aquosa concebido para proteger contra o fotobranqueamento. Os agregados que se ligam à tioflavina S foram detetados com um microscópio de fluorescência utilizando um conjunto de filtro High Q FITC (480-535 nm de largura de banda) e uma lente de objetiva 20 X, a menos que seja indicado de outra forma. Entre 8 e 16 imagens representativas por condição foram selecionadas, fotografadas e processadas por um experimentador que desconhecia as condições de tratamento. Para avaliar a quantidade de agregados positivos para a tioflavina S, foi determinada a área total por campo coberto pelas inclusões positivas para a tioflavina S. Para este efeito, a fluorescência de fundo que não conseguiu ultrapassar o tamanho pré-estabelecido ou os parâmetros de limite de intensidade de pixel foi eliminada utilizando o software Q-Capture. A fluorescência espúria, não associada a célula foi removida manualmente. A menos que seja indicado de outra maneira, os dados representam as médias de grupo ±SEM. As análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism (GraphPad Inc) . As diferenças entre as médias (duas amostras) foram avaliadas pelo teste t de Student. As diferenças entre as várias médias foram avaliadas por análise ANOVA de um fator, seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey.

Para validar a capacidade do ensaio para detectar quantitativamente os agregados que se ligam a tioflavina S, foi realizada a coloração de células BE-M17 que sobre-expressam a α-sinucleína A53T e os resultados revelaram um aumento dependente da dose de rotenona em agregados positivos para tioflavina S em relação às células de controlo tratadas com veículo (Figura 9A-D). A ampliação das imagens obtidas com uma objetiva 4 0 X indicou que os 99 agregados positivos para tioflavina S eram intracelulares e citoplasmáticos (Figura 9D) , analogamente à acumulação de corpos de Lewy intracitoplasmáticos que são caracteristicas patológicas associadas com a doença de Parkinson. A quantificação da área coberta por agregados positivos para tioflavina S estabeleceu que 5 μΜ de rotenona foi suficiente para induzir a agregação robusta (Figura 9E) e, desse modo, é uma dose eficaz para testar a capacidade dos compostos para atenuar a formação destes agregados.

Utilizando o protocolo descrito acima, vários compostos foram testados quanto à sua capacidade para reduzir, evitar ou eliminar os agregados positivos para tioflavina S em células BE-M17 tratadas com rotenona que sobre-expressam a α-sinucleína A53T. Exemplos de resultados obtidos a partir de experiências que utilizam estes compostos encontram-se descritos abaixo.

Em células tratadas com apenas 1 μΜ rotenona, houve uma forte presença de agregados positivos para tioflavina S (Figura 10A) . A adição de 500 ng/mL (Figura 10B) ou 1 pg/mL (Figura 10C) do composto de controlo positivo reduziu acentuadamente a abundância destes agregados induzidos por rotenona em 87% e 91% respectivamente (como mostrado na Figura 10D) em relação às células tratadas com apenas rotenona. Desse modo, o composto de controlo positivo é altamente eficaz na redução, prevenção e/ou eliminação de agregados positivos para tioflavina S em células que expressam α-sinucleína A53T humana. A adição de 500 ng/mL até 2 pg/mL (Figuras 11B-D) do composto 1, não reduziu a abundância de agregados 100 induzidos por rotenona relação às células tratadas com apenas rotenona (Figuras 11D e E) .

Como mostrado na Figura 12, em células tratadas com 1 μΜ rotenona a adição de 500 ng/mL e 2 yg/mL do composto 2 reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona em 39-44%, e em células tratadas com 5 μΜ de rotenona a adição de 1 yg/mL do composto 2 reduziu acentuadamente a abundância de agregados induzidos por rotenona em 67% (Figura 12E) .

As Figuras 13 A-E mostram os efeitos do composto 3. Em células tratadas com 1 μΜ de rotenona a adição de 500 ng/mL até 2 yg/mL do composto 3 reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona em 41 a 63% em relação às células tratadas com apenas rotenona. A adição de 500 ng/mL até 2 yg/mL do composto 4, não reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona relativos às células tratadas com apenas rotenona (Figuras 14A-E).

As Figuras 15 A-E mostram os efeitos do composto 5. Em células tratadas com 1 μΜ de rotenona a adição de 1-2 yg/mL do composto 3 reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona em 25 a 49% em relação às células tratadas com apenas rotenona. A adição do composto 6 não têm efeitos significativos sobre a abundância de agregados induzidos por rotenona em relação às células tratadas com apenas rotenona (Figura 16A-E). 101 A adição de 500 ng/mL e 2 yg/mL do composto 7 reduziu acentuadamente a abundância de agregados induzidos por rotenona em 60 e 74% (respectivamente) em relação às células tratadas só com rotenona em células tratadas com só 1 μΜ de rotenona. Em células tratadas com 5 μΜ de rotenona a adição de 500 ng/mL e 2 yg/mL do composto 7 reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona em 31 e 67% (respectivamente) (Figuras 17A-E).

As Figuras 18 A-E mostram os efeitos do composto 8. Em células tratadas com 1 μΜ de rotenona a adição de 1 yg/mL do composto 8 reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona em 56% em relação às células tratadas com apenas rotenona. Em células tratadas com 5 μΜ de rotenona a adição de 1 ou 2 yg/mL do composto 8 reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona em 48 e 38% (respectivamente). A adição de 500 ng/mL até 2 yg/mL do composto 9 reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona de 19 a 60% em relação às células tratadas só com rotenona em células tratadas com 1 yM rotenona (Figuras 19A-E) . A adição do composto 9, não reduziu a abundância de agregados induzidos por rotenona em células tratadas com 5 yM de rotenona embora coloração da linha de base fosse menor do que o esperado para esta dose de rotenona.

Em conclusão, muitos dos compostos testados, em especial os compostos 2, 3, 5, 7, 8 e 9, reduziram, evitaram, inibiram e/ou eliminaram eficaz e potencialmente a formação, deposição e/ou acumulação de agregados de a-sinucleína em células BE-M17 que expressam a a-sinucleína A53T. 102

Exemplo 9: Os compostos 1-9 protegem contra a citotoxicidade induzida por rotenona O Ensaio de citotoxicidade XTT (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) foi anteriormente utilizado para demonstrar que a α-sinucleina A53T potência a morte celular em células BE-M17 através de um mecanismo dependente de stress oxidativo (Ostrerova-Golts et al., J. Neurosci., 20:6048-6054, 2000). A pesquisa demonstrou que a acumulação de agregados de α-sinucleína nos corpos de

Lewy contribui mecanicamente para a degradação dos neurônios na doença de Parkinson e distúrbios relacionados (Polymeropoulos et al. , Science 276:2045-2047, 1997;

Kruger et al. , Nature Genet. 18 : 106-108, 1998). Neste documento, o ensaio de citotoxicidade de XTT (daqui em diante referido como o ensaio XTT) foi utilizado para medir a capacidade dos compostos de teste para proteger contra a citotoxicidade induzida por rotenona (capacidade neuroprotetora) . O ensaio é baseado no principio de que a conversão do sal de tetrazólio amarelo XTT para formar um corante de formazano de cor laranja (que absorve a luz em torno de 490 nm), ocorre apenas em células viáveis metabolicamente ativas. Desse modo, a absorvância de luz a 490 nm, é proporcional à viabilidade celular. Para este ensaio, as células foram plaqueadas em pratos de cultura de tecido de 96 poços a 104 células por poço. Após 24 horas, as células foram tratadas com 500 nM ou 2 μΜ de rotenona, ou veiculo (0,05% de DMSO), como indicado. Imediatamente após a adição de rotenona, os compostos foram adicionados na concentração indicada. Como um controlo, os compostos foram adicionados, sem rotenona (veiculo apenas, 0,05% de DMSO) e resultaram em nenhuma 103 toxicidade nas doses testadas. As células não tratadas receberam apenas meio de cultura celular (nenhum composto, com ou sem rotenona) . Após 40-44 horas de tratamento, o meio condicionado foi removido e substituído por 100 pL de meio fresco e 50 pL de mistura de reação de marcação XTT de acordo com as recomendações do fabricante. Cinco a seis horas mais tarde, a absorvância a 4 90 nm foi medida e corrigida para a absorvância no comprimento de onda de referência de 700 nm. O tratamento com 500 nM e 2 pM de rotenona geralmente reduzia a viabilidade em 35-45% em relação a células não tratadas sem rotenona (Figura 20). A percentagem de inibição de morte celular foi calculada como a diminuição da proporção da absorvância induzida por rotenona (viabilidade) que foi eliminada por tratamento com o composto de teste. O tratamento com o composto de controlo positivo em 10-25 pg/mL inibiu a perda induzida por rotenona de viabilidade em 25-33% em ambas as doses de rotenona (Figura 21). O ensaio foi realizado com cada composto e os resultados são mostrados nas Figuras 22-30. Figuras 22-30, o painel A ilustra graficamente a toxicidade do composto enquanto que as Figuras 22-30, o painel B mostra a inibição pelo composto da perda induzida por rotenona de viabilidade medida em ambas as doses de rotenona. O tratamento com 10 pg/mL do composto 1 indica que este composto não é tóxico, enquanto que as doses mais elevadas apresentaram alguma toxicidade (Figura 22A) . O tratamento com 10 pg/mL do composto 1 inibiram a perda induzida por 104 rotenona de viabilidade em aproximadamente 18 a 27% em ambas as doses de rotenona (Figura 22B). O tratamento com 10-25 yg/mL do composto 2 indica que este composto não é tóxico, enquanto que uma dose de 50 yg/mL apresentou alguma toxicidade (Figura 23A) . O tratamento com 25 yg/mL do composto 2 inibiu a perda induzida por rotenona de viabilidade em aproximadamente 20 a 28% em ambas as doses de rotenona (Figura 23B). O tratamento com 10 a 50 yg/mL do composto 3 indica que este composto é relativamente não tóxico em todas as doses testadas (Figura 24A) . O tratamento com 10 a 50 yg/mL de composto 3 inibiu a perda induzida por rotenona de viabilidade em aproximadamente 17 a 28% em ambas as doses de rotenona (Figura 24B). O tratamento com 10 e 25 yg/mL do composto 4 indica que o composto não é tóxico, enquanto que uma dose de 50 yg/mL exibiu toxicidade mínima (Figura 25A). O tratamento com 25 yg/mL do composto 4 foi particularmente eficaz e inibiu a perda induzida por rotenona da viabilidade em aproximadamente 50% na dose de 500 nM de rotenona, enquanto que a 2 yM a inibição observada foi de aproximadamente 26% (Figura 25B). O tratamento com 10 ou 25 yg/mL do composto 5 indica que esse composto não é tóxico, enquanto que uma dose de 50 yg/mL exibiu toxicidade mínima (Figura 26A) . O tratamento com o composto 5 não causou qualquer inibição da perda induzida por rotenona de viabilidade em qualquer uma das doses de rotenona (Figura 26B). 105 O tratamento com 10 a 50 yg/mL do composto 6 indica que esse composto não é tóxico em todas as doses testadas (Figura 27A) . O tratamento com 50 yg/mL do composto 6 na dose de rotenona de 500 nM inibiu a perda induzida por rotenona de viabilidade em aproximadamente 10%, enquanto que em 2 yM de rotenona, a inibição observada foi de aproximadamente 12-16% para todas as doses do composto testado (Figura 27B). 0 tratamento com 1 a 50 yg/mL do composto 7 indica que este composto não é tóxico, e mesmo doses mais elevadas (100-150 yg/mL) exibiram apenas toxicidade mínima (Figura 28A). O tratamento com 50 yg/mL do composto 7 apresentou a maior inibição da perda induzida por rotenona de viabilidade em aproximadamente 25% na dose de 500 nM de rotenona (Figura 28B). O tratamento com 10 a 25 yg/mL do composto 8 indica que este composto é relativamente não tóxico (Figura 29A).

Apesar de alguma toxicidade menor a 50 yg/mL, o composto, aparentemente, oferece alguma proteção contra a forte toxicidade da rotenona. Esta conclusão é confirmada por análise morfológica (não mostrada). 0 tratamento com 50 yg/mL do composto 1 a 2 yM de rotenona mostrou inibição da perda induzida por rotenona de viabilidade de aproximadamente 18% (Figura 29B). O tratamento com 10 a 25 yg/mL do composto 9 indica que este composto é relativamente não tóxico, enquanto que a dose mais elevada exibiu alguma toxicidade (Figura 30A) . O tratamento com o composto 9 não causou qualquer inibição apreciável da perda induzida por rotenona de viabilidade em qualquer uma das doses de rotenona (Figura 30B). 106

Em conclusão, muitos dos compostos testados eram eficazes na inibição da citotoxicidade induzida por rotenona demonstrando atividade neuroprotetora contra a toxicidade de α-sinucleina.

Exemplo 10: Desempenho motor melhorado de murganhos transgénicos que expressam α-sinucleína tratados com os compostos 2 e 7

Para avaliar a eficácia potencial de compostos num modelo de murganho relevante para a doença de Parkinson, foram utilizados murganhos transgénicos que sobre-expressam a a-sinucleína humana do tipo selvagem sob o controlo do promotor Thy-1 de murganho (Rockenstein E, et al., 2002. J Neurosci Res 68: 568-578). Os murganhos transgénicos a-sinucleína humana demonstraram serem úteis modelos para a doença de Parkinson, e, portanto, um sistema adequado para testar potenciais agentes terapêuticos, por inúmeras razões, incluindo as seguintes. (1) A presença de agregados de α-sinucleína que são detectáveis tanto por imuno-histoquímica (coloração) como métodos bioquímicos (Western blot) . Estes agregados são semelhantes aos corpos de Lewy (inclusões intracelulares compostas principalmente de α-sinucleína) que são a característica patológica da doença de Parkinson (Rockenstein E, et al., 2002. J. Neurosci. Res. 68:568-578 e Hashimoto, M. et al., 2003 Ann NY Acad Sei 991:171-188). (2) Os murganhos experimentam um défice dopaminérgico na via nigroestriatal, como indicado pela perda de projeções neuronais imunorreativas para a tirosina hidroxilase no corpo estriado (Hashimoto, M. et al., 2003 Ann NY Acad Sei 991:171-188). Esse défice também é visto em doentes humanos com doença de Parkinson. (3) Os 107 camundongos mostram défices, incluindo lentidão de movimentos, perda de equilíbrio e coordenação e fraqueza muscular num teste comportamental dependente da função motora, como o teste de travessia da trave (Fleming SM, et ai. 2004 J Neurosci 24:9434-9440 e Fleming SM, et ai. 2006 Neuroscience 142:1245-1253).

Disfunção motora semelhante é vista em doentes humanos com doença de Parkinson. Para avaliar a eficácia potencial de compostos que melhoram o desempenho motor ou minimizam os défices, foi realizado o teste de desafio de travessia da trave em murganhos tratos com o composto e tratados com o veículo avaliados antes do tratamento em 0 meses e novamente aos 3 e 6 meses de tratamento. Se os compostos foram eficazes, seria de esperar que os murganhos administrados com estes compostos teriam um melhor desempenho do que os murganhos tratados com o veículo com a mesma idade, e/ou que o tratamento com o composto de teste pudesse melhorar o declínio dependente da idade no desempenho dentro de um determinado grupo. Por exemplo, se os compostos de teste fossem eficazes, poder-se-ia esperar que os murganhos tratados com o composto atravessassem a trave mais rapidamente, em relação aos ratos tratados com veículo. Ou poder-se-ia esperar que as deficiências dependentes da idade dentro de um grupo fossem reduzidas (por exemplo, o desempenho após o tratamento com o composto poderia ser semelhante ao desempenho anterior ao tratamento, ou ainda melhor, ao passo que os murganhos tratados com o veículo desempenhariam progressivamente pior em relação ao mesmo período de tempo). 108

Teste de Travessia da Trave

No teste de travessia de trave, que é uma medida do desempenho motor, os murganhos são treinados durante dois dias, com cinco ensaios por dia, para atravessar uma trave que se estreita (separada em quatro segmentos) com rebordos de suporte fixados ao longo de cada lado, e que conduz à gaiola de habitação do animal. No terceiro dia, o teste é feito mais difícil, colocando uma grade de malha sobre a superfície da trave, deixando um pequeno espaço de cerca de 1 cm entre a grelha e a superfície da trave. Os animais são então filmados durante um período de cinco ensaios, e o tempo para atravessar, o número de passos dados e o número de deslizamentos são gravadas por um investigador cego ao tratamento medicamentoso (Fleming SM, et al., 2006. Neuroscience 142: 1245-1253).

Os murganhos transgênicos administrados com o composto 2 por três meses apresentaram uma melhora acentuada, significativa de 49% (tempo de atravessar a trave) em relação aos tratados com o veículo, com a mesma idade (15 meses de idade), os murganhos de controlo (Figura 31) . Após seis meses de tratamento, no entanto, o desempenho foi semelhante para os murganhos tratados com veículo com esta idade (Figura 31). Tomados em conjunto, estes dados mostram que o composto 2 atrasa o aparecimento de défices comportamentais no teste de travessia da trave.

Os murganhos transgênicos administrados com o composto 7 por seis meses apresentaram uma melhora acentuada, significativa de 35% (tempo de atravessar a trave) em relação aos tratados com o veículo, com a mesma idade (15 meses de idade), os murganhos de controlo (Figura 31). 109

Além disso, depois de apenas três meses de tratamento do composto 7, o desempenho foi melhorado em 39% em relação aos controlos tratados com o veiculo (Figura 31) . Tomados em conjunto, estes dados mostram que o tratamento com o composto 7 previne o avanço dependente da idade dos défices no teste de travessia da trave.

Exemplo 11: Desempenho motor melhorado de murganhos transgénlcos que expressam α-slnucleina tratados com o composto 7

Para avaliar a eficácia potencial do composto no teste do poste, os murganhos tratados com o composto testado e tratados com o veículo foram avaliados antes do tratamento (no mês 0) e de novo aos 3 e 6 meses de tratamento. Os murganhos transgénicos eram aqueles descritos no Exemplo 10 acima e receberam injeções i.p. diárias de 50 mg/kg/dia. Para avaliar a eficácia potencial no teste da trava, os murganhos tratados com o composto e tratados com o veiculo foram avaliados às 5-6 semanas de tratamento. Se os compostos fossem eficazes, seria de esperar que os murganhos administrados com o composto de teste teriam um melhor desempenho coque os murganhos tratados com o veículo com a mesma idade, e/ou que o tratamento com o composto de teste poderia atenuar os défices (melhora o desempenho) ao longo do tempo no determinado grupo. Por exemplo, se os compostos de teste fosse eficazes, seria de esperar que os murganhos tratados com o composto atravessariam a trave mais rapidamente, em relação aos murganhos tratados com o veículo. Seria de esperar uma melhora nas deficiências num grupo ao longo do tempo (por exemplo, desempenho depois de tratamento com o composto seria melhor do que antes do tratamento com o composto 110 enquanto que os murganhos tratados com o veículo teriam um desempenho similar, ou progressivamente piro, ao logo do mesmo período de tempo. A) Teste do Poste

No teste do poste, que é uma medida de desempenho motor, os murganhos são treinados no dia um (em dois ensaios) para descer um poste de madeira depois de teres sido colocados de cabeça para cima na parte superior do poste. No dia dois, os murganhos são testados em cinco ensaios e a latência de girar para baixo (tempo de giro), o tempo de descer (tempo de viagem) e o tempo total é registado por um investigador cego ao tratamento com o fármaco.

Os murganhos transgénicos administrados com o composto 7 durante 3 meses (n=ll) (15 meses de idade) apresentaram uma tendência no sentido de uma melhora no desempenho do teste do poste (diminuição do tempo de giro) em relação ao seu desempenho antes do tratamento. Depois de 6 meses de tratamento (n-11) com o composto 7, os murganhos (18 meses de idade) apresentaram uma melhora significativa de 41% no teste do poste em relação ao seu desempenho antes do tratamento e o seu desempenho foi similar ao de murganhos não transgénicos de 16 meses de idade (Figura 32) . Em contraste, o desempenho dos murganhos tratados com veículo aos 3 e 6 meses foi similar ao seu desempenho antes do tratamento. Estes resultados mostram que o composto 7 melhora o desempenho no teste do poste. 111 B) Teste De Travessia de Trava em Murganhos Transgénicos mais Jovens

Um teste de travessia de trava ligeiramente modificado (experiência de 2 dias em vez de 3 dias) foi utilizado para medir o desempenho motor em murganhos transgénicos mais jovens que expressam α-sinucleína (aos 3 meses de idade) tratados durante 6 semanas com o composto 7 (ou veiculo controlo) (n=8 por grupo). Os murganhos são treinados no dia um, em seis ensaios, para atravessar uma trave que se estreita (separada em quatro segmentos) com rebordos de suporte fixados ao longo de cada lado, e que conduz à gaiola de habitação do animal. No segundo dia, o teste é feito mais difícil, sendo colocada uma grade de malha sobre a superfície da trave, deixando um pequeno espaço de cerca de 1 cm entre a grelha e a superfície da trave. Os animais são então filmados durante um período de cinco ensaios, e o tempo para atravessar, o número de passos dados e o número de deslizamentos são gravadas por um investigador cego ao tratamento medicamentoso (Fleming SM, et al., 2006. Neuroscience 142: 1245-1253).

Os murganhos transgénicos administrados com o Composto 7 durante 6 semanas apresentaram uma significativa melhora de 36% (tempo para atravessar a trave) em relação aos murganhos de controlo tratados com veículo, da mesma idade (4-5 meses de idade) (Figura 33) . Não houve efeito significativo no número de passos dados, ou dos deslizamentos por passo (taxa de erro). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o Composto 7 melhora o desempenho no teste de travessia de trave. 112

Exemplo 12: Redução da imunocoloração intraneuronal positiva para α-slnuclelna em cérebros de murganhos transgénlcos A imunocoloração de α-sinucleína e análise de imagem foi realizada para determinar se o tratamento com o composto 7 reduz os níveis de α-sinucleína em murganhos transgénicos envelhecidos que expressam α-sinucleína (descrito acima). Depois de bloquear a ligação de anticorpo não específico, secções de cérebro de murganho foram incubadas de um dia para o outro a 4 °C com um anticorpo policlonal de coelho contra a α-sinucleína humana (Chemicon AB5038P; diluição de 1:500) . No dia 2, depois bem enxaguadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) as secções foram incubadas com um anticorpo secundário biotinilado (anti-coelho de cabra, VectorLabs) a uma diluição de 1:200 durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de bem enxaguadas em PBS as secções foram incubadas com o complexo avidina biotina da Vector Labs (ABC) durante 30 minutos à temperatura ambiente. As secções foram então enxaguadas em PBS três vezes e feiras reagir durante 4 minutos em Vector DAB (de acordo com as recomendações do fabricante). A reação DAB foi neutralizada por dois enxágues com tampão Tris. As secções foram montadas em lâminas carregadas e secas de um dia para o outro. As lâminas foram cobertas por vidro e fotografadas.

Para análise e quantificação da imagem, foram digitalizadas três imagens do córtex, anatomicamente equilibradas entre os murganhos (ampliação de 100 X) com uma câmara digital Q-Image e o software Q-Capture. Cada imagem foi processada utilizando o software Image-Pro. Um limite predeterminado para a segmentação de cor do pixel e 113 área mínima do objeto foi aplicado a cada imagem. Os artefatos formadores de imagem foram removidos e os dados foram exportados e processados para determinar a percentagem (%) da área ocupada por objetos imunomarcados positivos para a-sinucleína.

Os murganhos foram tratados durante 6 meses recebendo diariamente injeções i.p. de 50 mg/kg/dia desde os 12 meses de idade até os 18 meses de idade. A Figura 34 mostra que os murganhos tratados com o composto 7 (painéis C-D) exibem significativamente menos a-sinucleína intraneural humana no córtex frontal em comparação com os murganhos tratados com veículo (painéis A-B). Os cérebros de murganhos do tipo selvagem não transgénicos são desprovidos de coloração de α-sinucleína humana e são mostrados como controlo para a especificidade do anticorpo para a α-sinucleína humana derivada do transgene (E e F) . A análise e a quantificação da imagem revela que o tratamento com o composto 7 causa uma significativa redução de 81% dos objetos positivos para a a-sinucleína. O tratamento com o composto 7 durante 6 meses reduz de forma dramática os níveis de α-sinucleína no córtex frontal de murganhos transgénicos que expressam a-sinucleína humana, em relação aos controlos tratados com veículo. Estes dados correlacionam-se com os nossos dados que mostram um desempenho motor melhorado de murganhos transgénicos tratados durante 6 meses com o composto desta invenção. 114

Exemplo 13: Redução dos níveis de α-sinucleína em cérebro de murganho transgénico que expressa a-sinucleína

Dodecil sulfato de sódio - eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise Western blot foram utilizados para analisar a concentração de a-sinucleína nas frações em partículas (membrana) e citosólicas de regiões anteriores do cérebro de murganhos transgénicos (descrito acima) e não transgénicos, tanto de 18 meses de idade como de 4-5 meses de idade. Ambas as frações contêm grupos potencialmente patogénicos de agregados de a-sinucleína cuja maior parte é reduzida a monómeros nas condições redutoras de SDS-PAGE.

Depois de sacrificar os murganhos transgénicos que expressam α-sinucleína depois de 6 meses de tratamento com o composto (quando os animais tinham 18 meses de idade) ou 6 semanas de tratamento com o composto (quando os animais tinham 4-5 meses de idade), os cérebros foram removidos e bissetados ao longo da linha mediana (regime de tratamento conforme descrito acima). Os controlos tratados com veículo de ambas as idades foram processados de forma idêntica. A metade direita do cérebro foi bissetada coronalmente para dar uma parte anterior e uma parte posterior. As metades do cérebro bissetadas foram então congelados de foram instantânea num banho de gelo seco/etanol e armazenadas a -80 °C. Os cérebros foram submetidos ao fracionamento bioquímico para separar a fração citosólica solúvel da insolúvel, em partículas (membrana). Em resumo, os cérebros foram homogeneizados em 9 volumes de tampão HEPES (sem detergente), suplementados com inibidores de protease e fosfatase (Calbiochem). Uma homogeneização suave foi facilitada com um pilão de Teflon 115 num homogeneizador de vidro fritado (Kontes N° 19) para minimizar a perturbação das interações da a-sinucleína/membrana durante a lise. 0 lisado de células inteiras foi então centrifugado a baixa velocidade para granular as células e organelos não partidos (tais como núcleos). 0 sobrenadante (Sl) foi então centrifugado a 225.000 x g durante 1 hora a 4°C a fim de granular as membranas (P2) (esta fração pode incluir organelos tais mitocondrios). O sobrenadante (S2) era a "fração

citosólica". 0 granulado (P2) foi suspenso novamente por pipetagem em 2,5 volumes de solução tampão de homogeneização, sonicação em gelo por 5 x 1 segundos e referido como em "partículas " ou fração "membrana". A concentração total de proteína foi determinada pelo ensaio MicroBCA (Pierce). Quantidades iguais de proteína por pista (25 pg) foram corridas em SDS-PAGE (Bio-Rad Criterion 4-12% de géis Bis-Tris, 26 poços por gel), e transferidas para nitrocelulose. A eficácia consistente de transferência pela análise blot foi confirmada por coloração reversível com corante Ponceau S e formação de imagem num digitalizador de leito plano. Os blots descorados foram bloqueados e sondados com anticorpo policlonal de coelho purificado AB5038P (Chemicon) seguido por anticorpo secundário anti IgG/HRP de coelho (Abcam) em substrato SuperSignal West Pico Chemiluminescent (Pierce) para detectar a α-sinucleína. A especificidade do anticorpo AB5038P para a α-sinucleína nas análises western blot foi confirmada por pré-absorção do anticorpo com 50X o excesso molar de α-sinucleína humana purificada, que suprime todos os sinais exceto para uma banda que migra em 25 kDa (neste documento indicada a banda não específica 25 kDa) . 116

Os animais foram tratados com os compostos durante 6 meses com injeções i.p. diariamente a 50 mg/kg/dia desde 12 meses de idade até 18 meses de idade. O composto 7 reduziu de forma significativa os níveis de α-sinucleína em 69% na fração em partículas (Figura 35) e reduziu de forma significativa os níveis de α-sinucleína em 73% na fração citosólica (Figura 36) com relação aos murganhos tratados com o veículo. Uma vez que estes coortes são do género misto (em geral há dois machos por grupo) , e uma vez que algumas vezes vê-se variabilidade de níveis de a-sinucleína relacionados com o género, analisamos as fêmeas separadamente. Acima de tudo, o composto 7 reduziu, de forma significativa os níveis de α-sinucleína em 58% na fração em partículas (Figura 35) e em 48% na fração citosólica (Figura 36) quando apenas as fêmeas foram analisadas.

Para testar se os compostos resultariam numa redução similar de α-sinucleína em animais mais jovens, tratados por um tempo menor, os compostos (ou veículo) foram administrados durante 6 semanas em injeções i.p., diariamente, apenas nos murganhos fêmeas, em 50 mg/kg/dia de aproximadamente 3 meses de idade até aproximadamente 4-5 meses de idade. O tratamento com o composto 7 reduziu de forma significa os níveis de α-sinucleína em 45% na fração em partículas (Figura 37) e reduziu de forma significativa os níveis de α-sinucleína em 71% na fração citosólica (Figura 38) em relação aos murganhos tratados como veículo. Reduções similares nos níveis de α-sinucleína com o tratamento com o composto 7 (em relação aos controlos tratados com veículo) foram observadas quando a parte posterior do cérebro (menos o cerebelo) foi analisada (dados não apresentados). 117

Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que pela perturbação ou redução da agregação de α-sinucleína o tratamento pode resultar em formas mais solúveis de a-sinucleína (incluindo monómero) que são melhores substratos para depuração.

Exemplo 14: Composições dos compostos desta invenção

Os compostos desta invenção, como mencionado anteriormente, são administrados, de maneira desejável, na forma de composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas adequadas, e o método da sua preparação, são bem conhecidos das pessoas com conhecimentos normais da técnica e são descritas em tratados tais como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, ed, 20a edição, Lippincott., Williams & Wilkins, Filadélfia, PA.

As composições representativas são como se segue: 118

Formulação de Comprimidos Orais

Uma formulação de comprimido oral de um composto desta invenção é preparado como se segue: % p/p 10,0 0,5

86, 5

Composto desta invenção

Estearato de magnésio Amido

Hidroxipropilmetilcelulose

Celulose microcristalina

Os ingredientes são misturados até à homogeneidade, em seguida são granulados com a ajuda de água, e os granulados são secos. 0 granulado seco é, então, comprimido para formar comprimidos dimensionados para dar uma dose adequada do composto. 0 comprimido é opcionalmente revestido por aplicação de uma suspensão de um agente de formação de película (por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose) , pigmento (por exemplo, dióxido de titânio), e plastificante (por exemplo, ftalato de dietilo), e secagem da película por evaporação do solvente. 0 revestimento de película pode compreender, por exemplo, 2-6% do peso do comprimido.

Formulação de Cápsula Oral 0 granulado da secção anterior deste Exemplo é introduzido em cápsulas de gelatina dura de um tamanho adequado para a dose pretendida. A cápsula está unida por selagem, se desejado.

Formulação de Cápsulas de Gelatina Mole

Uma formulação de cápsula de gelatina mole é preparada como se segue: 119 Ο. ο ρ/ρ 20, 0 80, 0

Composto desta invenção Polietileno glicol 400 O composto é dissolvido ou disperso no polietileno glicol, e um agente espessante é adicionado, se for necessário. A quantidade de formulação suficiente para fornecer a dose desejada do composto é, em seguida, colocada em cápsulas de gelatina mole.

Formulação Parentérlca

Uma formulação parentérica é preparada da seguinte forma: | ! % p/p 1,0 99, 0

Composto desta invenção

Solução salina normal O composto é dissolvido na solução salina, e a solução resultante é esterilizada e introduzida em frascos, ampolas, e seringas pré-cheias, conforme apropriado.

Formulação oral de libertação controlada

Uma formulação de libertação sustentada pode ser preparada pelo método da Patente U.S. N° 4,710,384, como se segue:

Um kg de um composto desta invenção é revestido num revestidor de pó Uni-Glatt modificado com acetato de celulose Dow Tipo 10. A solução de pulverização é uma solução a 8% da etil celulose em 90% de acetona em 10% de etanol. Óleo de rícino é adicionado como plastificante numa quantidade igual a 20% da etil celulose presente. As 120 condições de pulverização são como se segue: 1) velocidade, 1 litro/hora; 2) flap, 10-15%; 3) temperatura de entrada, 50 °C, 4) temperatura de saida, 30 °C, 5) percentagem de revestimento, 17%. O composto revestido é peneirado em tamanhos de partículas entre 74 e 210 micrómetros. Presta-se atenção para garantir uma boa mistura de partículas de diferentes tamanhos dentro desse intervalo. Quatrocentos mg das partículas revestidas são misturados com 100 mg de amido e a mistura é comprimida numa prensa manual de 1,5 toneladas, para produzir um comprimido de 500 mg de libertação controlada.

Lisboa, 08 de Outubro de 2014

Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula

e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

2. Composição farmacêutica que compreende o composto de acordo com a reivindicação 1 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 para utilização na inibição da formação deposição, acumulação ou persistência de agregados de amiloide Αβ ou de α-sinucleina.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de doença causada por β-amiloide ou uma sinucleinopatia num mamífero que sofre da mesma.

5. Composto para utilização de acordo com a revindicação 4, em que a doença causada por β-amiloide é selecionada do grupo de doenças que consiste em doença de Alzheimer, sindrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose do tipo Dutch, e angiopatia cerebral causada por β-amiloide. 2

6. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a doença causada por β-amiloide é a doença de Alzheimer.

7. Composto para utilização de acordo com a revindicação 4, em que a sinucleinopatia é selecionada do grupo que consiste em doença de Parkinson, doença de Parkinson familiar, doenças dos corpos de Lewy, a variante com corpo de Lewy da doença de Alzheimer, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, e o complexo de Parkinsonismo/demência de Guam.

8. Composto para utilização de acordo com a revindicação 4, em que a sinucleinopatia é a doença de Parkinson.

9. Composto de acordo com a reivindicação 1, para utilização na melhora do desempenho motor num mamífero que sofre de uma sinucleinopatia.

10. Composto de acordo com a reivindicação 1, para utilização da interrupção do avanço de défices motores num mamífero que sofre de doença de Parkinson.

11. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença causada por β-amiloide ou uma sinucleinopatia num mamífero que sofre da mesma.

12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que a doença causada por β-amiloide é selecionada do grupo de doenças que consiste em doença de Alzheimer, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose 3 do tipo Dutch, e angiopatia cerebral causada por β- amiloides.

13. Utilização de acordo com a revindicação 11, em que a doença causada por β-amiloide é a doença de Alzheimer.

14. Utilização de acordo com a revindicação 11, em que a sinucleinopatia é selecionada do grupo de doenças que consiste em doença de Parkinson, doença de Parkinson familiar, doenças dos corpos de Lewy, a variante com corpo de Lewy da doença de Alzheimer, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, e o complexo de Parkinsonismo/demência de Guam.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que a sinucleinopatia é a doença de Alzheimer.

16. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 na preparação de um medicamento para utilização na melhora do desempenho motor num mamífero que sofre de uma sinucleinopatia.

17. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 na preparação de um medicamento para interrupção do avanço de défices motores num mamífero que sofre de doença de Parkinson. Lisboa, 08 de Outubro de 2014