PT2310127T - Dispositivo de extração de arn bacteriano - Google Patents

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Description

como as torres de refrigeração, porque uma baixa concentração representa sérios riscos para a saúde e grandes volumes de água devem ser concentrados em volumes de amostra menores, a fim de se realizar o teste analítico desejado e obter resultados precisos e reprodutíveis. É feita referência ao documento US 2004/0076980 Al, o qual ensina um método para separar o ADN extracromossomático do ARN incluindo células lisadas que compreendem o ADN extracromossomático, para formar um lisado e um lisado circulante.
RESUMO DA INVENÇÃO
Num aspeto, a presente invenção disponibiliza um instrumento como definido na reivindicação 1.
Como aqui utilizado, o termo "espécies alvo" pode compreender organismos microbiológicos tais como material celular e vírus. O material celular pode, por exemplo, ser escolhido a partir de bactérias, algas, fungos, procariotas, etc. Como é conhecido, nos organismos celulares, o material alvo, ácidos nucleicos, tais como o ADN ou o ARN, está localizado dentro da célula. Num vírus, o material alvo ácido nucleico está localizado dentro de um revestimento proteico. "Lise" é então uma rotura do revestimento da célula ou da proteína para libertar o ácido nucleico do alvo.
Outro exemplo de incorporação diz respeito a um método para recolher um material alvo desejado de uma amostra líquida, como definido na reivindicação 8. A invenção será descrita em mais detalhe conjuntamente com o desenho em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO A Figura 1 é uma vista em corte esquemática de um instrumento de acordo com a invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Voltando à Figura 1, é mostrado um dispositivo descartável 2 utilizado para capturar espécies alvo tais como as bactérias e subsequentemente lisar as bactérias para remover o ARN. 0 dispositivo compreende uma conduta de fluxo principal 4. A conduta de fluxo principal inclui uma entrada a montante 12 e termina numa saída a jusante 14. Um segmento descontínuo 6 é disponibilizado na conduta de fluxo principal, tendo este segmento descontínuo um encaixe a montante 8 e um encaixe a jusante 10, adequado para aí receber de forma confortável o cartucho do filtro 16. Os encaixes podem ser qualquer um ou mais do que um dos tipos convencionais, tais como roscados, de esfera, Y-T, espiga de mangueira e outros conetores à prova de fluído. O cartucho do filtro acomoda aí um meio filtrante 18. Como mostrado, o cartucho compreende uma carcaça 20 composta preferencialmente por um plástico rígido e tendo um encaixe de entrada 22 e um encaixe de saída 24. Os encaixes 22 e 24 são adequados para receber de forma confortável no encaixe a montante 8 e no encaixe a jusante 10 a conduta de fluxo principal. Em alguns casos, pode ser desejável disponibilizar um cartucho moldado ou inserido em que o filtro é moldado ou inserido no alojamento. É providenciada uma conduta de recirculação 30 preferencialmente de borracha ou de outro material flexível semelhante. Preferencialmente, a conduta é penetrável por uma agulha hipodérmica ou algo semelhante. A conduta de recirculação 30 comunica de forma vedada com a conduta de fluxo principal 4 na porta da conduta a montante 32 e na porta da conduta a jusante 34. Uma área de recolha ou reservatório 36 são disponibilizados na conduta de recirculação e adaptados para penetração por uma seringa hipodérmica, de forma a que o material possa ser extraído da conduta de recirculação a partir daí. Uma bomba 40 pode ser disponibilizada na conduta de recirculação e é preferencialmente uma bomba do tipo peristáltico bidirecional. Diversos tipos de bombas podem ser mencionados como exemplos. Uma bomba do contacto indireto é desejável uma vez que a tubagem de recirculação pode ser dispensada após utilização.
Como mostrado, pode ser disponibilizada uma válvula de retenção 70 na porção a montante da conduta de recirculação. É também disponibilizada uma válvula de retenção 50 na entrada da conduta de fluxo principal e uma outra válvula de retenção 60 é disponibilizada na saída da conduta 4 na posição fechada por ação da mola 62. A válvula 50 pode ser disponibilizada com uma mola para prevenir o refluxo no caso do ciclo de recirculação expandir devido a alguma pressão desenvolvida para vencer a ação da mola na válvula de retenção 60. A posição da conduta 14 da saída podia ser diferente da mostrada no desenho para assegurar que uma porção de filtrado, antes de lisar, é recolhida no reservatório para disponibilizar meios para serem bombeados. Desta forma um agente de lise concentrado podia ser adicionado ao reservatório para injeção no sistema. 0 meio filtrante 18 é provido de tamanhos de poro escolhidos de modo a que, a espécie alvo desejada que contém o material alvo desejado, seja aí capturada como concentrado. No entanto, depois das espécies alvo serem lisadas ou rompidas, o material alvo, tal como ARN libertado das células ou de um revestimento proteico passa através da membrana como filtrado. O meio filtrante 18 pode ser qualquer um de uma variedade de membranas filtrantes, desenhadas para reterem as espécies alvo biológicas desejadas. Exemplos não limitativos do material da membrana compreendem o nylon, o aço inoxidável, os éteres de celulose, e os ésteres, o PTFE, a fibra de vidro, o polipropileno, o cloreto de vinilo, o copolímero acrílico hidrófilo, a sulfona de poliéter, e o policarbonato, etc. Os tamanhos de poro destes filtros podem ser da ordem de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 5,0 ym. Uma membrana especialmente preferencial para utilização na recolha de células de
Legionella pneumophila é uma membrana de fibra de vidro disponível da Millipore, a qual tem um tamanho de poro de aproximadamente 2,7 ym.
Deve ser referido que numa outra incorporação exemplificativa do método, pode ser disponibilizada uma etapa de pré-filtragem em que, antes da entrada no dispositivo 2, a amostra de fluído pode ser passada através de um ou mais pré-filtros para remover componentes inorgânicos e biológicos de grandes dimensões, enquanto passam as espécies alvo como filtrado. Estas membranas podem, por exemplo, ser compostas do mesmo tipo de materiais acima determinados para utilização como meio filtrante 18, mas os tamanhos de poro devem ser maiores, na ordem de aproximadamente 1 a 100 ym, preferencialmente de aproximadamente 1 a 50 ym. Um par de filtros tandem com um tamanho de poro do filtro a montante de aproximadamente 20 ym e um tamanho de poro do filtro a jusante de aproximadamente 11 ym pode ser mencionado a título exemplificativo.
Em operação, aproximadamente 500 ml de fluído de amostra contendo espécies alvo que, por sua vez, encapsulam o material alvo, entra através do tubo de entrada e é passado através da cápsula do filtro. Um vácuo ou algo semelhante pode ser utilizado para ajudar a puxar o líquido através do filtro, aplicando o vácuo na porta de saída. Numa incorporação exemplificativa, o meio filtrante está dimensionado para reter células da bactéria da Legionella, permitindo contudo a passagem de ARN lisado através do mesmo.
Depois de a amostra ser passada através do dispositivo, é aplicado um agente de lise ao sistema e através da conduta de recirculação 30, propulsionado pela ação impulsionadora da bomba 40. O agente de lise pode ser admitido através da entrada 12 da conduta ou pode simplesmente ser injetado na conduta de recirculação 30 através de uma seringa ou algo semelhante. A bomba pode funcionar nos dois sentidos ou pode ser utilizada em combinação com uma válvula de retenção adicional para evitar que a amostra inicial se desvie do dispositivo de filtragem. Depois de um período de tempo, o tampão de lise ou a solução de lise proveniente da conduta da recirculação, rompe o material das espécies alvo capturadas no meio filtrante e o ARN da célula lisada pode então ser removido do dispositivo, quer utilizando uma seringa para puxar o líquido diretamente da conduta de recirculação, como por exemplo na área de recolha 36, ou, o líquido pode ser extraído do tubo de saída. 0 ARN pode então ser analisado por qualquer uma das várias técnicas convencionais de análise. 0 agente de lise pode ser aplicado de diversas maneiras. 0 agente de lise pode ser introduzido através de 12, ser injetado no reservatório 36, ou ser introduzido através de uma porta adicional acrescentada ao ciclo. Se são aplicados grandes volumes de agente de lise, a válvula de retenção 60 pode abrir resultando na perda de material alvo, a menos que o ciclo de recirculação seja evacuado primeiro através dos meios de vácuo como estabelecido acima. A válvula de retenção na entrada impede que o líquido escorra para fora da entrada durante a etapa do ciclo de recirculação, e uma válvula de retenção de ação por mola na saída permite que a saída vede, a menos que seja aplicada uma pressão ligeira para puxar o fluído.
Poderá ser também desejável uma mola de alívio na válvula de retenção 50. A bomba 4 0 é operada de forma a que a pressão gerada desse modo seja tal que não ultrapasse a válvula de retenção por mola de saída.
Relativamente ao agente de lise que é empregado, qualquer um que tenha o efeito de romper a membrana da célula ou o revestimento proteico do vírus pode ser utilizado. Os detergentes são um exemplo não limitativo de químicos que são geralmente utilizados para interromper uma membrana dupla de lípidos para liberar conteúdos da célula e para lisar a proteína da membrana, e exemplos não limitativos de químicos de lise são o sulfato de lítio e dodedilo, o CHAPS, o Tween-20E, ο NP40, o CTAB, o PVPP, os detergentes da série Triton X, o colato de sódio, e o deoxicolato de sódio, o cloreto de guanidínio, ou cáustico. Os agentes caotrópicos como os sais de guanidínio podem também atuar como agentes de lise neste sistema. A eficiência de lise e agentes de lise alternativos é dependente dos tipos de célula e das aplicações específicas, mas todos os materiais testados mostram lise adequado dentro dos requisitos de tempo para este método de teste. As enzimas tais como lisozimas, mutanolisinas, lambiase, lisostafinas, liticase, protease K, endolisinas e acromopeptidases podem ser incluídas como reagentes de lise ou aditivos para melhorar a lise. Os solventes orgânicos, tais como o DMSO e o DMF podem também ser incluídos como reagentes de lise ou aditivos para melhorar a lise. Uma variedade de fornecedores de biociência oferece uma vasta coleção de tampões de lise, adequados para aplicação na lise da célula. Quaisquer métodos físicos tais como agitar, aquecer, cortar e homogeneizar, etc., podem ser adicionados ao processo para aumentar a eficiência da lise. Atualmente, uma solução de lise que compreende uma concentração diluída de sulfato de lítio e laurilo, nonilfenol (40 moles etoxilação) e DMSO, pode ser mencionada como uma solução de lise exemplificativa que é recirculada através do dispositivo.
Como acima referido, noutras incorporações diferentes, a conduta de saída pode ser posicionada para permitir que o ar escape do reservatório e reter uma porção do filtrado fluido antes da aplicação do agente de lise. Por exemplo, a conduta de saída podia ser posicionada a jusante do filtro ao longo do lado direito do instrumento, conforme mostrado no desenho, comunicando com a conduta 4 e prolongando-se a partir dai angularmente para cima. Adicionalmente, podia ser provida uma válvula separada em comunicação com a conduta de fluxo de fluido, conduta de agente de lise ou reservatório para providenciar a extração do material alvo desejado.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 20040076980 Al [0003]
REIVINDICAÇÕES 1. Instrumento para recolha de um material alvo de uma amostra líquida que compreende espécies alvo, que é um organismo celular e que contém o material alvo referido, compreendendo o instrumento referido (a) uma conduta de fluxo de fluído (4) que tem uma entrada a montante (12) e uma saída a jusante (14); (b) um meio filtrante (18) entre a referida entrada de fluxo de fluído (12) e a saída a jusante mencionada (14); tendo o meio filtrante referido (18) um tamanho de poro adequado para aí reter as espécies alvo e para passar, como filtrado, o lisado que contém o material alvo referido; (c) uma conduta de agente de lise adequada para entregar agente de lise ao meio filtrante referido (18) para lisar a espécie alvo referida, libertando dessa forma o material alvo indicado, em que a referida conduta do agente de lise compreende uma conduta da recirculação (30) que tem uma primeira porta (32) que comunica com a conduta de fluxo de fluído mencionada (4) a montante do meio filtrante indicado (18) e de uma segunda porta (34) que comunica com a referida conduta de fluxo de fluído (4) a jusante do meio filtrante indicado (18), caracterizado por ser providenciada uma área de recolha ou um reservatório (36) na conduta de recirculação (30) e ser adequado para a penetração por uma seringa hipodérmica de forma a que o material possa ser extraído da conduta de recirculação (30). 2. Instrumento de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda uma bomba (40) conectada operacionalmente à referida conduta de recirculação do agente de lise, para bombear o agente de lise referido para o meio filtrante indicado (18) e recircular o agente de

Claims (14)

  1. lise referido através do instrumento referido.
  2. 3. Instrumento de acordo com a reivindicação 1, em que a referida conduta de fluxo de fluido (4) compreende um segmento descontinuo (6) com um encaixe a montante (8) e um encaixe a jusante (10), compreendendo o instrumento referido um alojamento que contém o meio filtrante referido (18) e definindo um cartucho com um encaixe de entrada e um encaixe de saida, respetivamente com receção hermética do fluido no referido encaixe a montante (8) e no referido encaixe a jusante (10) do segmento descontinuo indicado.
  3. 4. Instrumento de acordo com a reivindicação 1, em que a referida conduta de recirculação do agente de lise compreende uma área de recolha alargada (36).
  4. 5. Instrumento de acordo com a reivindicação 2, em que a bomba mencionada (40) compreende uma bomba bidirecional.
  5. 6. Instrumento de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de filtragem referido (18) compreende poros que têm tamanhos que variam de aproximadamente 10 nm a 5,0 ym.
  6. 7. Instrumento de acordo com a reivindicação 6, em que o meio filtrante referido (18) é um filtro de fibra de vidro.
  7. 8. Um método para recolha de um material alvo de uma amostra liquida, que pode compreender espécies alvo, que é um organismo celular e que contém o material alvo, incluindo o referido método (a) passar a referida amostra liquida através de uma membrana de filtragem que tem um tamanho de poro adequado para ai reter as espécies alvo referidas e para passar, como filtrado, o lisado que contém o material alvo referido; (b) disponibilizar uma conduta de agente de lise em comunicação com a membrana de filtragem referida; (c) fazer fluir um agente de lise através da conduta de agente de lise indicada, para contactar e lisar as espécies alvo referidas; através do que estas espécies alvo libertam o material alvo referido; e (d) recolher o material alvo referido, em que o agente de lise referido é bombeado para o elemento de filtro através de uma linha de fluxo de recirculação, compreendendo este método a recirculação do agente de lise referido através da membrana de filtragem indicada, em que uma área de recolha ou um reservatório são disponibilizados na linha de fluxo de recirculação, e em que o material alvo referido é recolhido por extração, através da penetração da área de recolha referida ou do reservatório por uma agulha hipodérmica.
  8. 9. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que a membrana de filtragem mencionada tem um tamanho de poro de aproximadamente 10 nm a 5 ym e as referidas espécies alvo compreendem Legionella pneumophila.
  9. 10. Um método de acordo com a reivindicação 9, em que a membrana de filtragem mencionada é uma membrana de filtragem em fibra de vidro.
  10. 11. Um método de acordo com a reivindicação 9, em que o material alvo referido é ARN ou ADN.
  11. 12. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que o organismo celular referido é escolhido de bactérias, algas, fungos e procariotas.
  12. 13. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que o material alvo referido compreende material intracelular.
  13. 14. Um método de acordo com a reivindicação 13, em que o material alvo referido compreende um ácido nucleico.
  14. 15. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que a espécie alvo referida é matéria virai e em que o material alvo referido está envolvido num revestimento proteico, sendo o material alvo referido um ácido nucleico.
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