PT2282727E

PT2282727E - Micelas polimerizadas

Info

Publication number: PT2282727E
Application number: PT09738359T
Authority: PT
Inventors: Francois Lefoulon; Julien Ogier; Eric Doris; Thomas Arnauld
Original assignee: Servier Lab; Commissariat Energie Atomique
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2012-02-01
Also published as: JP2011518868A; EP2282727A2; ATE534376T1; ES2378283T3; SI2282727T1; FR2930444B1; EA019804B1; ME01991B; EA201001692A1; WO2009133325A2; CA2722050A1; US20110105516A1; DK2282727T3; AU2009241887B2; US8663660B2; HRP20120150T1; EP2282727B1; RS52170B; PL2282727T3; WO2009133325A3

Description

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DESCRIÇÃO "MICELAS POLIMERIZADAS" A invenção tem como objecto micelas polimerizadas, os processos para a sua preparação e as suas aplicações.

Um grande número de moléculas com actividade terapêutica, e em especial as moléculas anti-cancerosas, apresentam uma pequena solubilidade em água, proveniente das propriedades hidrofóbicas intrínsecas da molécula. Com Efeito, estas moléculas têm que possuir um determinado grau de hidrofobicidade para poderem aceder à parte interna das células. A vectorização das moléculas terapêuticas tem como objectivo contornar os problemas associados em especial à sua solubilidade, à sua estabilidade, à sua farmacocinética, à sua biodistribuição e ao seu alvejamento específico.

Foram descritos na literatura diferentes modos de vectorização de compostos hidrofóbicos, alegadamente capazes de transportar quantidades suficientes de moléculas com actividade terapêutica através das diversas barreiras biológicas, para atingirem de um modo eficaz os seus locais de actuação. 2

Uma destas técnicas de vectorização consiste em encapsular um principio activo numa microesfera formada por uma matriz polimérica tal como em poli(alquilcianoacrilatos), em poli(anidridos), em ácido poliláctico. Estas microesferas têm dimensões de entre 20 pm e 100 μιη, que excluem a sua utilização por via endovenosa e permitem taxas de inclusão relativamente fracas de entre 0,2 % e 3,5 % de compostos hidrófobos.

As micelas de polímeros, outra técnica de vectorização, recorrem a dispersões coloidais compostas por polímeros anfifílicos contendo domínios hidrofóbicos e domínios hidrofílicos distintos. Estas micelas de polímeros são estruturas supramoleculares com região central e casca. As micelas de polímeros são compostos por poliéteres utilizados em combinação com poli(etilenoglicol) para formarem polímeros anfifílicos sob a forma de copolímeros em dois blocos (plurónicos: PPO-co-PEG) ou de copolímeros em três blocos (poloxâmeros: PEG-co-PPO-co-PEG). Estas micelas de polímeros têm dimensões compreendidas entre 50 nm e 100 nm. As taxas de inclusão de compostos nas micelas de polímeros são de entre 0,1 % e 40 % consoante o método utilizado: inclusão por evaporação, inclusão por diálise ou inclusão por nanoprecipitação. As micelas de polímeros são portanto vectores que permitem a incorporação de quantidades importantes de compostos hidrófobos mas necessitam de operações técnicas (síntese e inclusão) e industriais difíceis. 3

Os sistemas de vectorização por lipossomas e as vesículas de polímeros estão estudados de um modo intensivo e estão actualmente em fase clínica diversas formulações de medicamentos nestes sistemas, tendo já algumas delas sido aprovadas para uma utilização clínica. Os lipossomas e as vesículas de polímeros podem incluir princípios activos hidrófilos no interior aquoso da vesícula, ou moléculas hidrofóbicas na dupla camada de polímeros. Os lipossomas e as vesículas de polímeros têm estruturas (MLV vesículas muitilamelares, SUV vesículas unilamelares de pequenas dimensões, LUV vesículas unilamelares de grande dimensão, GUV vesículas gigantes) e dimensões muito diferentes compreendidas entre 100 nm e 1.000 nm. Os lipossomas e as vesículas de polímeros são veículos de princípios activos importantes na vectorização de moléculas hidrofílicas.

Em 2003, foi descrito um novo tipo de organização à superfície dos nanotubos de carbono: os nano anéis, isto é, uma estruturação de anfifílicos em toros todo ao longo dos nanotubos. Os nano anéis são anéis de tensioactivos polimerizados formados à superfície dos nanotubos que são em seguida separados do seu suporte em carbono para serem utilizados como agentes de dissolução de princípios activos hidrofóbicos (WO 2004/092231). Os nano anéis são no entanto nano vectores dificilmente industrializáveis.

Os vectores para transporte e libertação descritos acima resolvem mais ou menos bem o problema da vectorização que é o de transportar princípio activo 4 suficiente de um modo eficaz e pouco tóxico para tratar a patologia. Estes vectores resolvem o problema da solubilidade dos princípios activos hidrofóbicos sem no entanto resolver os problemas provenientes da dimensão do vector, do trabalho de transformação exigido ou da industrialização. A invenção presente tem portanto como objectivo propor uma nova estratégia para se obterem nano vectores com uma capacidade de inclusão de princípios activos hidrofóbicos superior à dos vectores clássicos da literatura, e possuindo uma formulação simples, facilitando a sua industrialização futura. A invenção presente diz respeito a micelas polimerizadas caracterizadas por incluírem moléculas anfifílicas polimerizadas obtidas a partir de moléculas anfifílicas comportando uma ou duas cadeias lipídicas contendo cada uma delas uma ou duas espécies polimerizáveis, dos tipos diacetilénico, vinílico, acrilato ou estireno, ligados a uma extremidade polar.

De acordo com a invenção presente, entende-se por «micelas» objectos esféricos auto-montados com uma superfície hidrófila e uma parte interior hidrofóbica, e cuja dimensão seja inferior a 100 nm.

Entende-se por «anfifílicas» ou «tensioactivas» moléculas orgânicas que tenham a particularidade de serem tanto hidrofílicas como hidrofóbicas. As espécies anfifílicas, caracterizadas pelas suas propriedades 5 antagonistas, têm propriedades especiais em solução e organizam-se espontaneamente nos meios aquosos assumindo diferentes microestruturas. A invenção diz respeito a micelas polimerizadas contendo moléculas anfifilicas polimerizadas obtidas a partir de moléculas anfifilicas com a fórmula geral A-X-B-L-Z em que A representa CH3—(CH2Jm , C=C-C=C- (CH2)“, ou CH2=CH- ou CH2=CH-C6H4-, nem, iguais ou diferentes, são inteiros de 1 a 16; em que X representa CO-NH ou NH-CO ou uma ligação, X é uma ligação quando B é uma ligação e L é uma ligação; em que B representa -(CH2^m , C=C—C=C— (CH2^~, ou -CH=CH-C6H4- ou uma ligação, nem, iguais ou diferentes, são inteiros 1 a 16; em que L representa -(CH2) r-CH[NH-CO-A']- ou uma ligação, r é um inteiro de 1 a 16 e A' representa A; em que Z representa —CONH-(CH2)—ÇH~N''CHz’Rz “ NHCO-(CH2)—ÇH~Nn I r R CH2-R2 *1 CH2'Rz ou 1 s é um inteiro de 1 a 16 quando R2 representar COOH ou SO3H ou OSO3H ou 0P03H2 ou 0P02H2 e R4 representa H ou um grupo COOH ou SO3H ou OSO3H ou OPO3H2 ou 0P02H2 ou um grupo -CO-NH-(CH2)t-CH3, t é um inteiro de 1 a 16, ou Z pode igualmente ser extremidades polares hidrofilicas neutras, de tipo açúcar ou polissacárido, bem como os seus sais de adição a um ácido ou a uma base aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Entre os ácidos aceitáveis do ponto de vista 6 farmacêutico, podem citar-se a titulo não limitativos os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, tartárico, maleico, cítrico, ascórbico, oxálico, metanossulfónico, benzenosulfónico, canfórico.

Entre as bases aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, podem citar-se a título não limitativo o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio, a trietilamina, a terc-butilamina.

De preferência, a invenção diz respeito a micelas polimerizadas que incluem moléculas anfifílicas polimerizadas obtidas a partir de moléculas anfifílicas com a fórmula geral A-X-B-LZ, em que A represente CH,-(CH,)—CSC-C=C—(CH2)— , n e m, iguais ou diferentes, são inteiros de 1 a 16; em que X representa CO-NH ou NH-CO ou uma ligação, X é uma ligação quando B é uma ligação e L é -~(CH2)-C=C-C=C-(CH2)r uma ligaçao; em que B representa ou uma ligação, nem, iguais ou diferentes, são inteiros de 1 a 16; em que L representa - (CH2) r-CH [NH-CO-A'] - ou uma ligação, r é um inteiro de 1 a 16 e A' representa A ou CH2=CH- ou CH2=CH-C6H4-; em que Z representa xch2-cooh _

—NHCO-ÍCH^CH-N^ K ch2-cooh -CONH-(CH2)r<pH-Nv R1

^CHj-COOH

CHz-COOH ou s é um inteiro de 1 a 16 em que Ri representa H ou um grupo COOH ou um grupo -CO-NH- (CH2) t-CH3, t é um inteiro de 1 a 7 16, ou Z pode igualmente ser extremidades polares hidrofilicas neutras, do tipo açúcar ou polissacárido, bem como os seus sais de adição a um ácido ou a uma base aceitável do ponto de vista farmacêutico. A invenção também diz respeito às micelas polimerizadas constituídas por moléculas anfifílicas cujas extremidades polares hidrofilicas neutras sejam do tipo de éteres coroa.

De forma vantajosa, a invenção diz respeito a micelas polimerizadas cuja extremidade polar Z é funcionalizada.

Por micelas polimerizadas «funcionalizadas», entendem-se micelas polimerizadas modificadas por ligandos de reconhecimento molecular, para as fazer evoluir em direcção a vectores inteligentes e selectivos destinados a indentificar de uma maneira específica antigénios ou receptores sobre-expressos à superfície de células alvo, tais como as células cancerosas ou infecciosas. Para este efeito, as micelas polimerizadas devem ser funcionalizadas por ligandos específicos cuja ligação à superfície do vector se faça por um acoplamento químico.

De forma vantajosa, os ligandos ligados à superfície das micelas polimerizadas são: fluoróforos ou agentes de imagiologia nuclear (99Tc, 11In, 125I, 18F, 64Cu) ou óptica (cianina, fluoresceína, luciferase, quantum dots) ou magnética (partículas de óxido de ferro), o ácido fólico, a manose, a galactose, anticorpos, ligandos de tipo RGD.

De uma maneira preferida, as micelas polimerizadas de acordo com a invenção são funcionalizadas ao nível da extremidade polar Z por um ácido fólico.

Num modo de concretização preferido, as micelas polimerizadas são funcionalizadas de acordo com um processo tal como se descreve no exemplo 5. A funcionalização da superfície das micelas polimerizadas torna portanto as referidas micelas polimerizadas furtivas e permite que elas alvejem células específicas. A invenção diz igualmente respeito a micelas polimerizadas que incluam ou diversos compostos hidrofóbicos no interior das moléculas anfifílicas polimerizadas de acordo com a invenção.

Entende-se por «compostos hidrofóbicos» os representados por moléculas com pequena dimensão que possuam uma fraca solubilidade em água, menor do que 1 g por litro, na totalidade ou em parte da zona de pH na qual as proteínas ou os ácidos nucleicos tenham problemas de solubilidade ou de estabilidade em meio aquoso. 9

De um modo preferido, as micelas polimerizadas de acordo com a invenção são constituídas por moléculas anfifílicas polimerizadas obtidas a partir da molécula anfifílica II-4 com a fórmula

De um modo igualmente preferido, as micelas polimerizadas são constituídas por moléculas anfifílicas polimerizadas obtidas a partir da molécula anfifílica 11-23 com a fórmula

De uma forma vantajosa, as micelas polimerizadas são constituídas por moléculas anfifílicas polimerizadas obtidas a partir da molécula anfifílica com a fórmula

10

As micelas polimerizadas são igualmente formadas a parir de moléculas anfifilicas polimerizadas com a fórmula 10

„COOH tiL .COQH r‘

De um modo preferido, as micelas polimerizadas de acordo com a invenção são constituídas por moléculas anfifilicas polimerizadas obtidas a partir da molécula anfifílica com a fórmula

As micelas polimerizadas são preferivelmente formadas a partir das moléculas anfifilicas polimerizadas obtidas a partir da molécula anfifílica com a fórmula

De uma forma vantajosa, as micelas polimerizadas são constituídas por moléculas anfifilicas polimerizadas obtidas a partir da molécula anfifílica com a fórmula 11

A invenção presente tem igualmente como objecto os processos de preparação dos compostos consoante a invenção, caracterizados por:

+ R”—NHj

Base

A-X-B-L-Z R· “ Cl, Br, OCOCHj,

0-N

O R= A-X-B-L com R" = extremidade polar ou R" = a-X-b-L com R = extremidade polar A invenção diz igualmente respeito às composições farmacêuticas que incluam micelas polimerizadas consoante a invenção. De forma vantajosa, estas composições farmacêuticas incluem um ou diversos excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, isto é, um ou diversos veículos excipientes inertes, não tóxicos e apropriados.

No que toca aos excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, podem citar-se a título não limitativo os aglomerantes, os diluentes, os desagregantes, os estabilizadores, os conservantes, os lubrificantes, os odores, os aromas ou os edulcorantes.

Entre as composições farmacêuticas consoante a invenção, mencionam-se em especial as que são adequadas para uma administração por via oral, parenteral e 12 nomeadamente endovenosa, percutânea ou transcutânea, nasal, rectal, perlingual, ocular, respiratória e mais especificamente os comprimidos, simples ou drageifiçados, os comprimidos sublinguais, as gélulas, as glossetes, as cápsulas, as tabletes, as preparações injectáveis, os aerossóis, as gotas oculares ou nasais, os supositórios, os cremes, as pomadas ou os geles dérmicos. A via de administração preferida é a via endovenosa e as composições farmacêuticas correspondentes podem destinar-se a uma libertação instantânea ou diferida dos princípios activos. A invenção presente diz igualmente respeito à utilização das micelas polimerizadas consoante a invenção a título de vectores de moléculas hidrofóbicas. A invenção diz igualmente respeito à utilização das micelas polimerizadas como vectores de princípios activos hidrofóbicos.

Por «vector», entende-se qualquer molécula ou montagem de moléculas que consiga transportar princípios activos, uma proteína ou um ácido nucleico, em direcção ao seu local de acção, através de um alvejamento de ligandos específicos ou de um modo passivo por dissolução ou por estabilização da espécie em questão.

Entende-se por «princípio activo» qualquer molécula, proteína ou ácido nucleico que possua um efeito 13 terapêutico .

Foram desenvolvidos diferentes métodos de inclusão de princípios activos para se optimizar a taxa de inclusão ou de incorporação nas micelas polimerizadas. Os métodos de inclusão consoante a invenção são: • o método «vórtex» que consiste na inclusão por agitação de uma solução aquosa de micelas polimerizadas e de princípio activo no estado de pó, com um vórtex, durante cerca de 30 minutos; • o método «vórtex/sonicação» que consiste na inclusão por agitação de uma solução aquosa de micelas polimerizadas e de princípio activo no estado de pó, com um vórtex, combinada com ciclos de sonicação, durante cerca de 2 horas; • o método «agitação a 20°C» que consiste na inclusão de uma solução aquosa de micelas polimerizadas e de princípio activo no estado de pó por agitação magnética à temperatura ambiente durante cerca de 12 horas; • o método «agitação a 50°C» que consiste na inclusão de uma solução aquosa de micelas polimerizadas e de princípio activo no estado 14 de pó por agitação magnética a cerca de 50°C durante cerca de 12 horas; • o método «evaporação de DCM» que consiste na inclusão por adição do principio activo dissolvido em diclorometano (DCM) a uma solução aquosa de micelas polimerizadas, aquecida a cerca de 50°C.

No final da sequência de inclusão, a solução é filtrada para se eliminar o excesso de principio activo não incluído. A invenção diz respeito, de um modo preferido, a um método de inclusão por agitação magnética de uma solução de micelas polimerizadas e de princípio activo durante 12 horas a 50°C. A inclusão de princípio activo nas micelas polimerizadas é controlada pela energia de agitação e pela temperatura. A taxa de incorporação pode ser melhorada por recorrendo a uma agitação mais enérgica, a um período de contacto mais longo, e a uma temperatura mais elevada.

De preferência, as soluções micelares obtidas no final do passo de inclusão são esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 pm atenta a utilização por injecção endovenosa, sem perda de concentração em princípio activo. 15 0 estudo sobre a inclusão que se levou a cabo sobre micelas permitiu mostrar o efeito da polimerização da micela sobre a capacidade de incorporação de principio activo. As micelas devem ser polimerizadas para que este nano vector tenha a capacidade de incluir uma quantidade importante de princípios activos. Para este transportador obtém-se uma taxa de incorporação de S39625 de 48 %, ou seja, 5 vezes mais ao obtido com a formulação em nano anéis. 0 estudo da inclusão levado a cabo sobre diversos princípios activos confirmou a aptidão deste nano vector para dissolver diferentes tipos de moléculas hidrofóbicas a fortes taxas de inclusão. Os trabalhos levados a cabo com uma molécula de referência, o paclitaxel, permitiram comparar os valores das taxas de incorporação com os dados da literatura. As micelas polimerizadas do anfifílico II-4 permitiram incluir o paclitaxel com uma taxa de incorporação de 33 %. Na literatura, taxas de inclusão do paclitaxel compreendidas entre 6,7 % e 14,3 % foram conseguidas com diversos tipos de vesículas, e conseguiram-se taxas de incorporação compreendidas entre 0,2 % e 27 % com nano partículas, e taxas de inclusão de entre 0,2 e 25 % com as micelas de polímeros. As micelas polimerizadas apresentam-se portanto como nano vectores com um poder de dissolução notável que permitiu dissolver princípios activos com estruturas e pesos moleculares diferentes. 16 A invenção presente diz respeito por último a um processo de obtenção das micelas polimerizadas consoante a invenção. Este processo de obtenção inclui os passos que se seguem: • os compostos lipidicos a polimerizar sofrem uma automontagem em micelas esféricas; • as micelas esféricas auto-montadas são polimerizadas.

Por «automontagem» de moléculas anfifilicas, entende-se a organização espontânea em micelas esféricas por parte das moléculas anfifilicas em meios aquosos nos quais elas estejam em concentrações superiores à concentração micelar critica, ou CMC. A concentração micelar critica da molécula anfifilica II-4 tal como descrita acima foi experimentalmente determinada como sendo 0,082 mg/mL. A invenção inclui igualmente o processo de obtenção de micelas polimerizadas no qual o passo de polimerização é do tipo de uma irradiação luminosa, ou fotopolimerização. A fotopolimerização é um método de polimerização especialmente bem adaptado à polimerização das espécies diacetilénicas. A fotopolimerização é um método «limpo» utilizando uma irradiação luminosa a 254 nm e nenhum agente químico externo. A fotopolimerização das espécies 17 diacetilénicas implica a formação de intermediários dirradicalares: o primeiro passo consiste em formar-se a espécie dirradicalar por uma excitação fotónica; o segundo passo é a reacção de propagação do radical a uma nova espécie polimerizável que se encontre na proximidade, aumentando-se deste modo a cadeia polimérica; o último passo é um passo de terminação por acoplamento de dois radicais. A invenção também diz respeito ao processo de obtenção de micelas polimerizadas no qual o passo de polimerização é do tipo polimerização radicalar. As espécies vinilicas e acrilatos são em geral polimerizadas por polimerização radicalar. Esta via de polimerização é conhecida e é correntemente utilizada. A iniciação da polimerização radicalar pode ser conseguida por intermédio de um iniciador radicalar gerado por dissociação térmica e homolitica, por reacção de oxi-redução ou por uma irradiação. E por último, a invenção diz igualmente respeito ao processo de obtenção de micelas polimerizadas no qual o passo de polimerização inclui diversos tipos de polimerização sucessivos, por exemplo uma fotopolimerização e em seguida uma polimerização através de um iniciador radicalar. 18 A invenção presente é ilustrada sem que deste modo seja limitada, pelas figuras e pelos exemplo que se seguem:

Figura 1: Estrutura química do S39625;

Figura 2: Método de inclusão do S39625 em micelas polimerizadas e não polimerizadas;

Figura 3: (1) cromatograma do S39625 em acetonitrilo, (2) cromatograma das micelas não polimerizadas/polimerizadas, (3) cromatograma do S39625 incluído nas micelas não polimerizadas, (4) cromatograma do S39625 incluído em micelas polimerizadas;

Figura 4: (1) cromatograma do S39625 dissolvido em acetonitrilo, (2) cromatograma do S39625 incluído em micelas polimerizadas;

Figura 5: Estruturas dos princípios activos hidrofóbicos (1) S44563, (2) 42909, (3) paclitaxel e (4) pireno;

Figura 6: Estrutura química do 4-amino-3-hidroxi-1-sulfonato-naftaleno;

Figura 7: Espectros de fluorescência do 4-amino-3-hidroxi-l-sulfonato-naftaleno, dos nano 19 anéis e das micelas polimerizadas funcionalizadas pelo fluoróforo e da amostra de controlo (excitação a 345 nm);

Figura 8: (A) espectros de absorvância da amina III-9, das micelas polimerizadas e das micelas polimerizadas funcionalizadas pela amina III-9 (B) espectros de fluorescência da amina III-9, das micelas polimerizadas funcionalizadas pela amina III-9 e da amostra de controlo (excitação a 280 nm). EXEMPLO 1: SÍNTESE DAS MOLÉCULAS ANFIFÍLICAS II-4 E 11-23 1.1 Síntese da molécula anfifílica 11-4 O primeiro passo desta síntese consoante o esquema 1 consiste em preparar a parte hidrofílica da molécula anfifílica (derivada do ácido nitrilotriacético) a partir da N-benziloxicarbonil-L-lisina (Z-L-lisina).

Esquema 1

IH B-2 O segundo passo da síntese de acordo com o esquema 2 consiste em acoplar a cabeça hidrofílica II-2 com o ácido 10,12-pentacosadi-inóico, previamente activado. 20

Esquema 2

Activa-se o ácido pentacosadi-inóico com N-hidroxissuccinimida em presença de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodi-imida, para se obter o ácido activado II-3. Obtém-se o tensioactivo II-4 por acoplamento peptidico da cabeça hidrofilica ΝΤΑ II-2 com o ácido activado II-3. Obtém-se o produto puro por precipitação em água, adicionando ácido clorídrico. 1.2 Sintese da molécula anfifilica 11-23 A molécula anfifílica 11-23 é um tensioactivo contendo dois tipos de espécies polimerizáveis: uma espécie diacetilénica polimerizável por irradiação luminosa a 254 nm, e uma espécie acrilato que se pode recticular por bombardeamento electrónico. 0 primeiro passo da síntese consiste em preparar a parte hidrofilica da molécula anfifilica (cabeça de NTA) a partir da N-benziloxicarbonil-L-lisina (Z-L-lisina) conforme consta do esquema 1, protegendo-se em seguida os ácidos carboxílicos sob a forma de ésteres terc-butílicos. Obtém-se a cabeça hidrofilica protegida tBu-NTA, denominada 11-14 . 21 0 segundo passo da síntese é resumido no esquema reaccional 3 adiante.

Esquema 3

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EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS MI CELAS POLIMERIZADAS 2.1 Preparação das micelas polimerizadas

As micelas esféricas são disposições espaciais de espécies anfifílicas que se obtêm a concentrações superiores à concentração micelar crítica (CMC). Estas 22 organizações com forma esférica têm uma superfície hidrofilica e uma parte interior lipofilica ou hidrofóbica. 0 tensioactivo II-4 dispõe-se sob a forma de micelas esféricas quando o pH da solução aquosa é maior do que 10. A valores superiores a pH=10, o par de electrões não ligantes da amina terciária da parte hidrofilica do tensioactivo é libertado, levando ao aumento do volume da cabeça polar, e a valores de pH inferiores podem formar-se ligações em ponto de hidrogénio entre os carboxilatos e o hidrogénio da amina terciária protonada, levando à diminuição do volume da cabeça de NTA da espécie anfifilica 11-4 .

As micelas auto-montadas e polimerizadas da espécie anfifilica II-4 são preparadas de acordo com o esquema 4, por irradiação luminosa de uma solução aquosa de II-4 com pH=12 a 254 nm, durante 5 horas, ajustando-se depois o pH ao valor do pH fisiológico, por diálise contra uma solução com um pH compreendido entre 7 e 8.

Esquema 4 pH>U) § > % R_ X I „ -i ^ \ Γ » * > *> j v:B· T i | .·· S- \ o. v X ι*Λ*

Observa-se que a polimerização da espécie anfifilica II-4 estruturada sob a forma de micelas, por irradiação luminosa, é um processo relativamente lento e 23 que uma transformação da totalidade das espécies anfifilicas II-4 em material polidiacetilénico deve ser conseguida ao fim de períodos de polimerização mais longos do que 5 horas. 2.2 Caracterização das micelas polimerizadas A análise das micelas polimerizadas da espécie anfifílica II-4 é levada a cabo por granulometria a laser. Esta técnica, baseada sobre a difusão quase elástica da luz e a espectroscopia cruzada de correlação de fotão, permite determinar a distribuição de dimensões numa amostra. A análise da intensidade de uma amostra de micelas polimerizadas a 50 mg/mL, pelo aparelho Nanophox, apresenta um pico principal de população a 4,9 nm. A análise da amostra em número de micelas polimerizadas a 1 mg/ml, pelo aparelho Malvern Zetasizer, revelou a presença de uma população única a 5,1 nm. A polimerização das micelas induz um fenómeno de contracção das micelas que se pode explicar pelo facto de que a polimerização fixa a montagem das espécies anfifilicas, e limita os fenómenos de aumentos de volume.

EXEMPLO 3: INCLUSÃO DO S39625 EM MICELAS

POLIMERIZADAS E EM MICELAS NÃO POLIMERIZADAS 3.1 Método de inclusão do S39625

Encapsulou-se o S39625 numa solução a 10 mg/mL, de micelas não polimerizadas, e de micelas polimerizadas, pelo método «de agitação e aquecimento a 50°C», tal como se pormenoriza na descrição e se representa na Figura 2. 3.2 Determinação por HPLC da taxa de inclusão do S39625

Determina-se a taxa de inclusão do S39625 pelo método de HPLC em fase reversa Esta técnica baseia-se na diferença de interacção das moléculas entre a fase móvel e a fase estacionária. Esta diferença repercute-se sobre os períodos de retenção destas moléculas. Para determinadas condições de HPLC, uma mesma molécula apresenta sempre o mesmo período de retenção. As condições de HPLC em fase reversa para a determinação da taxa de inclusão do S39625 são uma coluna de sílica enxertada com RP-18C como fase estacionária e um gradiente de água e acetonitrilo de 5 % a 100 % como fase móvel. A detecção do S39625 à saída da coluna é levada a cabo por um detector de UV a um comprimento de onda de 385 nm. Prepara-se uma curva padrão do S39625 em acetonitrilo por HPLC em fase reversa. Nestas condições de HPLC, o princípio activo S39625 apresenta um período de retenção de 25,8 minutos. O período de retenção do S39625 encapsulado nas micelas polimerizadas foi de igual modo determinado por HPLC em fase reversa durante a qual o gradiente de solvente 25 foi substituído por um regime isocrático de acetonitrilo puro. 0 acetonitrilo é um dos melhores solventes do S39625 e a sua utilização a título de eluente permite assegurar uma libertação muito rápida do princípio activo e a sua eluição na qualidade de uma entidade livre. 3.3 Resultados da taxa de inclusão do S39625

Os resultados da incorporação do S39625 são calculados a partir da Figura 3. 0 cromatograma do S39625 incluído em micelas não polimerizadas apresenta três picos, a 3,2 minutos, 25,8 minutos e 31,9 minutos. Atenta a área do pico a 25,8 minutos, a incorporação do princípio activo nas micelas não polimerizadas está compreendida entre 1,7 e 3,3 %. 0 cromatograma do S39625 incluído nas micelas polimerizadas apresenta um pico largo a um período de retenção muito pequeno. Esta forte diminuição do período de retenção mostra por um lado que a hidrofobicidade do S39625 está fortemente mascarada pela superfície muito hidrofílica da micela polimerizada, e por outro lado que a associação S39625/micelas polimerizadas é especialmente robusta. 0 cromatograma do S39625 dissolvido em acetonitrilo apresenta um pico a 5,2 minutos, enquanto o S39625 incluído na micela polimerizada apresenta dois picos a 4,0 e a 4,9 minutos. A taxa de inclusão do S39625 e dos 26 seus produtos de degradação nas micelas polimerizadas é estimada integrando os dois picos. A taxa de incorporação destas moléculas nas micelas polimerizadas é portanto de 48 %. Para uma concentração em espécie anfifilica idêntica (10 mg/mL), a solubilidade e portanto a capacidade de encapsulação das micelas polimerizadas é superior em cerca de 5 vezes em relação aos nano anéis e superior em cerca de 13 vezes em relação às micelas não polimerizadas.

EXEMPLO 4: INCLUSÃO DE PRINCÍPIOS ACTIVOS

HIDROFÓBICOS EM MICELAS POLIMERIZADAS

Levam-se a cabo testes de inclusão sobre os princípios activos hidrofóbicos S42909, S44563, o paclitaxel que é uma molécula activa hidrofóbica de referência e o pireno que é uma molécula muito hidrofóbica. As fórmulas químicas destes princípios activos hidrofóbicas são representadas na Figura 5. A inclusão destes princípios activos foi levada a cabo com soluções de micelas polimerizadas a 10 mg/mL pelo método de aquecimento a 50°C durante 12 horas. O conjunto dos resultados da Tabela 1 apresenta uma forte incorporação das moléculas hidrofóbicas nas micelas polimerizadas, com taxas de inclusão maiores do que 24 % e um aumento da solubilidade dos princípios activos em água, de 30.000 para 500.000.

Tabela 1: 27

Princípio activo Molécula ! Massa ! molar !(g/mol) !Solubilidade ! da molécula em água (pg/mL) ;i Taxa de : (inclusão: i; em :j massa' ! (em %) i : Taxa de (inclusão : molar3 ! (em %) !Número dei Imoléculasj por 1 micelah 1 : Solubilidade; i em água (em ; : mg/mL) ; S 39625 1 430 0,09 l 4 8 i 56 1 12 5 ! 9,00 i S44563 1 912 2,00 ji 45 i 36 I 56 i 8,30 S42909 1 4 62 0,20 ji 24 i 29 1 42 i 3,15 Paclitaxel 1 853 ! 0,40 ji 31 i 25 1 33 i i 4,55 Pireno 1 2 02 1 0,01 i) 34 i 63 ! 5,25 * Razão em massa ( em %) entre medicamento e medicamento + transportador) jix 100 na formulação após tratamento :jg Razão molar (em % de medicamento em relação a medicamento + espécie! anfifílica II-4h x 100, na formulação aos tratamento | h Razão molar entre medicamento e espécie anfifílica II-4 x número dei:: espécies anfifílicas/micela (100 moléculas) |

EXEMPLO 5: FUNCIONALIZAÇÃO DAS MICELAS

POLIMERIZADAS 5.1 Funcionalização pelo 4-amino-3-hidroxi-sulfonato-naftaleno

As micelas polimerizadas são funcionalizadas por um fluoróforo hidrofílico, o 4-amino-3-hidroxi-sulfonato-naftaleno descrito na Figura 6. Este fluoróforo apresenta um comprimento de onda de excitação de 34 0 nm e um comprimento de onda de emissão de 455 nm. A ligação ao fluoróforo é conseguida por um acoplamento peptídico em água a um pH básico (pH=12) tendo a titulo de agente de acoplamento a diciclohexilcarbodi-imida (DCC). Este enxerto foi obtido com um grande excesso 28 de fluoróforo (50 equivalentes) e de agente de acoplamento (100 equivalentes), e purificaram-se as amostras usando uma coluna de exclusão de dimensões. à funcionalização das micelas polimerizadas seguiu-se uma espectroscopia de fluorescência para se detectar a enxertia do fluoróforo à superfície do nano vector. Os espectros de fluorescência das micelas polimerizadas funcionalizadas denotam uma evolução do pico de fluorescência do 4-amino-3-hidroxi-sulfonato-naftaleno com uma deslocação batocrómica do máximo de fluorescência a 492 nm (Figura 7). O controlo denota que a alteração batocrómica do máximo da fluorescência das micelas polimerizadas provém de facto da enxertia covalente do fluoróforo à superfície do nano vector. 5.2 Funcionalização pelo ácido fólico

Como o receptor folato se encontra sobre-expresso à superfície das células cancerosas, o ácido fólico é utilizado muitas vezes para o alvejamento específico das células cancerosas do cérebro, do rim, da mama, dos ovários e dos pulmões.

Para se levar a cabo o passo de acoplamento do ácido fólico com as micelas polimerizadas, modificou-se o ácido fólico para se introduzir uma função amina que permite a enxertia. O acoplamento do derivado aminado do ácido fólico III-9 à superfície das micelas polimerizadas 29 efectua-se por acoplamento peptídico em água a um pH básico (pH=12), com a DCC a título de agente de acoplamento. Esta enxertia é levada a cabo com um grande excesso de derivado aminado de ácido fólico (50 equivalentes) e de agente de acoplamento (100 equivalentes). A amostra foi purificada por filtração, e depois sobre uma coluna de exclusão de dimensões.

Os espectros de absorção da Figura 8 mostram que o derivado aminado do ácido fólico III-9 está realmente presenta à la superfície das micelas polimerizadas atenta a presença de um pico a 285 nm. Os espectros de fluorescência das micelas polimerizadas funcionalizadas mostram uma evolução dos picos de fluorescência do derivado aminado do ácido fólico a 360 nm e a 450 nm.

5.3 Funcionalização pelo PEG A fagocitose potencial pelos macrófagos das micelas de dimensão nanométrica de acordo com a invenção pode ser evitada enxertando sobre estas micelas cadeias de PEG ou PoliEtilenoGlicol. A presença de PEG à superfície das micelas cria uma camada externa inerte que impede a adesão das opsoninas, tornando portanto as referidas micelas furtivas em relação aos macrófagos e aumentando deste modo o seu período de circulação no compartimento sanguíneo. 30 O acoplamento de uma metoxi-PEG-amina 5.000 à superfície da micela polimerizada efectua-se a pH 12 com a DCC a título de agente de acoplamento. Esta enxertia é levada a cabo com um grande excesso de derivado PEG (25 equivalentes) e de agente de acoplamento (100 equivalentes). As micelas derivatizadas são purificadas por uma filtração, seguida por uma coluna de exclusão de dimensões.

EXEMPLO 6: ESTUDO TOXICOLOGICO DAS MICELAS POLIMERIZADAS A distribuição das micelas polimerizadas no organismo é um parâmetro primordial a testar para se determinar o modo de excreção e o modo de acumulação das referidas micelas polimerizadas.

Para se realizar este estudo, marca-se radiologicamente a espécie anfifílica II-4 com carbono 14 para se sintetizar a micela polimerizada radiologicamente marcada para um estudo de despiste por auto-radiografia no rato. Obtém-se a espécie anfifílica radiologicamente marcada com carbono 14 com uma actividade específica de 7,6 pCi/mg. A administração das micelas polimerizadas ao rato é feita a uma dose de 4 MBq/kg e de 100 mg/kg para um volume de administração de 2,5 mL/kg. Para este efeito, é necessária uma solução a 40 mg/mL com uma actividade específica de 7,6 pCi/mg. 31 0 estudo da acumulação/eliminação das micelas polimerizadas radiologicamente marcadas com carbono 14 foi levado a cabo em 3 ratos machos do tipo Wistar. Administrou-se a cada rato uma dose única de 100 mg/kg das micelas polimerizadas [14C] por via endovenosa (bolus), e sacrificaram-se os animais respectivamente após 10 minutos, 24 horas e 48 horas. Recolheram-se as urinas dos animais sacrificados às 24 horas e às 48 horas para medir a sua actividade por cintilação líquida. A quantificação dos níveis de radioactividade nos tecidos foi levada a cabo por radioluminografia de secções específicas dos ratos, obtidas por criomicrotomia. A análise dos radioluminogramas do rato de 10 minutos, isto, que se eutanizara aos 10 minutos, denota uma distribuição generalizada da radioactividade no corpo do rato, devido a uma concentração elevada de micelas polimerizadas no sangue. Detectaram-se níveis elevados de radioactividade em determinados tecidos, tais como os pulmões, os rins e as substâncias da medula, o fígado, as glândulas supra-renais ou o baço. A análise dos radioluminogramas dos ratos de 24 horas e de 48 horas, isto é, que havia sofrido eutanásia respectivamente às 24 horas e às 48 horas, revela uma concentração da radioactivitade elevada no fígado, na parede intestinal, no baço, nas glândulas supra-renais, e na medula óssea.

Lisboa, 18 de Janeiro de 2012.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Micelas polimerizadas caracterizadas por incluírem moléculas anfifílicas polimerizadas obtidas a partir de moléculas anfifílicas com a fórmula geral A-X-B-L-Z, em que A represente CH—(CH-)—C=C—C=C—(CH,)r~ 3 2m 2" ou CH2=CH- ou CH2=CH-C6H4-, nem, iguais ou diferentes, sendo inteiros de 1 a 16; em que X represente CO-NH ou NH-CO ou uma ligação, X seja uma ligação quando B for uma ligação e seja uma ligação; em que B represente 2 m 2n ou uma ligaçao, nem, iguais ou diferentes, sendo inteiros de 1 a 16 ; em que L represente -(CH2) r-CH[NH-CO-A']- ou uma ligação, sendo r um inteiro de 1 a 16 e A' represente A; em que Z represente -CONH—(CH2)-ÇH—n'CH2"R* —NHCO-(CH2)-CH-n"CHj*Rj _R, CH2-*2 ou_ R, 'cH2-R2 sendo s um inteiro de 1 a 16 e em que R2 represente COOH ou S03H ou 0S03H ou 0P03H2 ou 0P02H2, representando Rx H ou um grupo COOH ou S03H ou 0S03H ou 0P03H2 ou 0P02H2, ou um grupo -CO-NH- (CH2) t-CH3, t seja um inteiro de 1 a 16, em que Z pode ser igualmente cabeças polares hidrofílicas neutras, de tipo açúcar, ou 2 polissacárido, bem como os seus sais de adição a um ácido ou a uma base aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

2. Micelas polimerizadas consoante a reivindicação 1, caracterizadas por incluírem moléculas anfifílicas polimerizadas obtidas a partir de moléculas anfifílicas com a fórmula geral A-X-B-L-Z em que A represente CH3-(CH2)-C=c—C=C-(CH2)- nem, iguais ou diferentes, sejam inteiros de 1 a 16; em que X represente CO-NH ou NH-CO ou uma ligação, X seja uma ligação quando B for uma ligação, e L seja uma ligação; em que B represente -{CH2)-C=C-C=C-(CH2}- ou uma ligação, nem, iguais ou diferentes, sejam inteiros de 1 a 16 ; 3 em que L represente - (CH2) r-CH [NH-CO-A' ] - ou uma ligação, sendo r um inteiro de 1 a 16 e A' represente A ou CH2=CH- ou CH2=CH-C6H4-; em que Z represente ,CH,-COOH —NHCO-{CH2)—ch-nn r CHj-COOH ^CH,-COOH —CONH-(CH2)-ÇH-Ns p CH2-COOH 1 ou s seja um inteiro de 1 a 16, quando Ri seja H ou um grupo COOH ou um grupo -CO-NH- (CH2) t-CH3, t seja um inteiro de 1 a 16, ou Z possa igualmente ser cabeças polares hidrofilicas, neutras, de tipo açúcar ou polissacárido, bem como os seus sais de adição a um ácido ou a uma base aceitável do ponto de vista farmacêutico.

3. Micelas polimerizadas de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizadas por a cabeça polar Z ser funcionalizada.

4. Micelas polimerizadas de acordo com a reivindicação _3, caracterizadas por a cabeça polar Z ser funcionalizadas por um ácido fólico.

5. Micelas polimerizadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas por incluírem um ou diversos compostos hidrofóbicos. 4

6. Micelas polimerizadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas por as moléculas anfifílicas polimerizadas serem obtidas a partir da molécula anfifilica II-4 com a fórmula

7. Micelas polimerizadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas por as moléculas anfifílicas polimerizadas serem obtidas a partir da molécula anfifilica 11-23 com a fórmula

8. Micelas polimerizadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas por as moléculas anfifílicas polimerizadas serem obtidas a partir da molécula anfifilica com a fórmula 5

9. Micelas polimerizadas de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas moléculas anfifilicas polimerizadas serem obtidas da molécula anfifílica com a fórmula qualquer por as a partir

^e°OH COOH

10. Micelas polimerizadas de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas moléculas anfifilicas polimerizadas serem obtidas da molécula anfifílica com a fórmula qualquer por as a partir

11. Micelas polimerizadas de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas moléculas anfifilicas polimerizadas serem obtidas da molécula anfifílica com a fórmula qualquer por as a partir 6

12. Micelas polimerizadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas por as moléculas anfifilicas polimerizadas serem obtidas a partir da molécula anfifilica com a fórmula

13. polimerizadas Composição caracterizada por incluir micelas consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 12 .

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por incluir um ou diversos excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

15. Utilização das micelas polimerizadas consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 12, a titulo de vectores de moléculas hidrofóbicas.

16. Utilização das micelas polimerizadas de acordo com a reivindicação 15, caracterizadas por as moléculas hidrofóbicas serem princípios activos 7 hidrofóbicos .

17. Processo de obtenção das micelas polimerizadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por incluir os seguintes passos: as moléculas anfifilicas a polimerizar segundo as reivindicações 1 a 12 serem auto-montadas em micelas esféricas; as micelas esféricas auto-montadas serem polimerizadas.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as micelas esféricas auto-montadas serem fotopolimerizadas.

19. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as micelas esféricas auto-montadas serem polimerizadas por polimerização radicalar. Lisboa, 18 de Janeiro de 2012.