ES2378283T3 - Micelas polimerizadas - Google Patents

Abstract

Micelas polimerizadas caracterizadas porque comprenden moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de moléculas anfífilas de fórmula general A-X-B-L-Z donde A representa CH3- (CH2) m-C=C-C=C- (CH2) n- o CH2=CH- o CH2=CH-C6H4-, siendo n y m números enteros de 1 a 16 identicos o diferentes; X representa CO-NH o NH-CO o un enlace, X es un enlace si B es un enlace y L es un enlace; B representa - (CH2) m-C=C-C=C- (CH2) n- o -CH=CH-C6H4- o un enlace, siendo n y m números enteros de 1 a 16 identicos o diferentes; L representa - (CH2) r-CH[NH-CO-A']- o un enlace, siendo r un numero entero de 1 a 16 y A' representa A; Z representa siendo s un numero entero de 1 a 16, con R2 COOH o SO3H u OSO3H u OPO3H2 u OPO2H2; con R1 H o un grupo COOH o SO3H u OSO3H u OPO3H2 u OPO2H2 o un grupo -CO-NH- (CH2) t-CH3, siendo t un número entero de 1 a 16, o Z puede ser tambien una cabeza polar hidrofila neutra de tipo azucar o polisacarido, así como sus sales de adición de un ácido o una base farmacéuticamente aceptables.

Description

Micelas polimerizadas.

La invención tiene por objeto micelas polimerizadas, sus procesos de preparación y sus aplicaciones.

Gran número de moléculas de actividad terapéutica, y en particular las moléculas anticancerosas, son poco solubles en agua debido a las propiedades hidrófobas intrínsecas de las moléculas. En efecto, estas moléculas deben poseer cierto grado de hidrofobicidad para poder ser internalizadas en el interior de las células. La vectorización de las moléculas terapéuticas tiene como objetivo eludir los problemas asociados en particular a la solubilidad, a la estabilidad, a la farmacocinética, a la biodistribución de tales moléculas y a su determinación específica.

En la literatura se han descrito diversos sistemas de vectorización de compuestos hidrófobos capaces de transportar cantidades suficientes de moléculas de actividad terapéutica a través de las distintas barreras biológicas hasta alcanzar eficazmente su lugar de acción.

Una de estas técnicas de vectorización consiste en encapsular un principio activo en una microesfera formada por una matriz polimérica, tales como de poli(alquilcianoacrilato), poli(anhídrido), ácido poli(láctico). Estas microesferas tienen tamaños de 20!m a 100 !m, lo que excluye su uso vía intravenosa, y permiten tasas de inclusión relativamente bajas, de entre el 0,2% y el 3,5%, de compuestos hidrófobos.

Las micelas poliméricas, otra técnica de vectorización, se refieren a dispersiones coloidales compuestas por polímeros anfífilos de dominios hidrófilos e hidrófobos distintos. Estas micelas poliméricas son estructuras supramoleculares en forma núcleo/envoltura. Las micelas poliméricas se componen de poliéteres, utilizados en combinación con poli(etilenglicoles), para formar polímeros anfífilos en forma de copolímeros dibloque (plurónicos: PPO-co-PEG) o de copolímeros tribloque (poloxámeros: PEG-co-PPO-co-PEG). Estas micelas poliméricas tienen un tamaño comprendido entre 50 nm y 100 nm. Las tasas de inclusión de compuestos en estas micelas poliméricas se situan entre el 0,1% y el 40%, según el método de inclusión utilizado (inclusión por evaporación, por diálisis o por nanoprecipitación). Así, las micelas poliméricas son vectores que permiten la incorporación de cantidades importantes de compuestos hidrófobos, pero que conllevan una aplicación (síntesis e inclusión) técnica e industrial difícil.

Se están estudiando intensivamente los sistemas de vectorización por liposomas y vesículas poliméricas y actualmente se encuentran en fase clínica diversas formulaciones de medicamentos con estos sistemas, entre ellas algunas incluso han sido aprobadas para su utilización clínica. Los liposomas y las vesículas de polímeros pueden incluir principios activos hidrófilos en el núcleo acuoso de la vesícula o moléculas hidrófobas en la bicapa polimérica. Los liposomas y las vesículas de polímeros tiene estructuras (MLV vesículas multilamelares, SUV vesículas unilamelares de pequeño tamaño, LUV vesículas unilamelares de gran tamaño, GUV vesículas gigantes) y tamaños muy diferentes, comprendidos entre 100 nm y 1000 nm. Los liposomas y las vesiculas de polimeros son vehiculos de principios activos importantes en la vectorización de moléculas hidrófilas.

En el año 2003 se puso de manifiesto un nuevo tipo de organización en la superficie de los nanotubos de carbono: nanoanillos, es decir una estructuración de anfífilos en forma de anillo en toda la longitud de los nanotubos. Los nanoanillos son anillos de agentes tensioactivos polimerizados que se forman en la superficie de los nanotubos y se separan después de su soporte carbonado para ser empleados como agentes de solubilización de principios activos hidrófobos (WO 2004/092231). Sin embargo, los nanoanillos son nanovectores difícilmente industrializables.

Los vectores de liberación descritos anteriormente responden más o menos bien al reto de la vectorización, que consiste en transportar el principio activo suficiente de forma eficaz y no tóxica, con el fin de tratar una patología. Estos vectores responden al problema de la solubilidad de principios activos hidrófobos, pero sin resolver los problemas asociados al tamaño del vector, de aplicación o de industrialización. Por tanto, la presente invención tiene por objeto proporcionar una nueva estrategia para obtener nanovectores cuya capacidad de inclusión de los principios activos hidrófobos sea superior a la de los vectores clásicos de la literatura y que tengan una formulación sencilla que facilite su futura industrialización.

La presente invención se refiere a micelas polimerizadas caracterizadas porque comprenden moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de moléculas anfífilas que presentan una o dos cadenas lipídicas, comprendiendo cada una uno o dos motivos polimerizables, de tipo diacetilénico, vinilo, acrilato o estireno, unidas a una cabeza polar.

En la presente invención, por “micelas” se entienden objetos esféricos autoensamblados con una superficie hidrófila y un núcleo lipófilo y cuyo tamano es inferior a 100 nm.

Se entiende por “anfífilas” o “tensioactivas” aquellas moléculas orgánicas que poseen la particularidad de ser a la vez hidrófilas e hidrófobas. Las anfífilas, caracterizadas por sus propiedades antagonistas, tienen propiedades particulares en solución y se organizan espontáneamente en medio acuoso bajo distintas microestructuras.

La invención se refiere a micelas polimerizadas que comprenden moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de moléculas anfífilas de fórmula general siendo s un numero entero de 1 a 16, con R2 COOH o SO3H u OSO3H u OPO3H2 u OPO2H2; con R1 H o un grupo COOH o SO3H u OSO3H u OPO3H2 u OPO2H2 o un grupo -CO-NH-(CH2)t-CH3, siendo t un número entero de 1 a 16, o

A-X-B-L-Z

donde

A

representa CH3-(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n- o CH2=CH- o CH2=CH-C6H4-, siendo n y m números enteros de 1 a 16 idénticos o diferentes;

5

X representa CO-NH o NH-CO o un enlace, X es un enlace si B es un enlace y L es un enlace;

B

representa -(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n- o -CH=CH-C6H4- o un enlace, siendo n y m números enteros de 1 a 16 idénticos o diferentes;

L

representa -(CH2)r-CH[NH-CO-A’]- o un enlace, siendo r un numero entero de 1 a 16 y A' representa A;

Z

representa

15 Z puede ser también una cabeza polar hidrófila neutra de tipo azúcar o polisacárido, así como sus sales de adición de un ácido o una base farmacéuticamente aceptables. Entre los ácidos farmacéuticamente aceptables se pueden mencionar, a título no limitativo, los ácidos clorhídrico,

bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, tártrico, maleico, cítrico, ascórbico, oxálico, metanosulfónico, bencenosulfónico, canfórico. 20 Entre las bases farmacéuticamente aceptables se pueden mencionar, a título no limitativo, hidróxido de sodio, hidróxido

de potasio, trietilamina, tert-butilamina. Preferentemente, la invención se refiere a micelas polimerizadas que comprenden moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de moléculas anfífilas de fórmula general A-X-B-L-Z donde

A representa CH3-(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n-, siendo n y m numeros enteros de 1 a 16 identicos o diferentes; 25 X representa CO-NH o NH-CO o un enlace, X es un enlace si B es un enlace y L es un enlace; B representa -(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n- o un enlace, siendo n y m numeros enteros de 1 a 16 identicos o diferentes; L representa -(CH2)r-CH[NH-CO-A'] o un enlace, siendo r un numero entero de 1 a 16 y A' representa A o CH2=CH- o CH2=CH-C6H4-; 30Z representa

siendo s un numero entero de 1 a 16, con R1 H o un grupo COOH o un grupo -CO-NH-(CH2)t-CH3, siendo t un numero entero de 1 a 16, o Z puede ser también una cabeza polar hidrófila neutra de tipo azúcar o polisacárido,

35 así como sus sales de adición de un ácido o una base farmacéuticamente aceptables. La invención abarca también micelas polimerizadas constituidas por moléculas anfífilas cuyas cabezas polares hidrófilas neutras son de tipo éter corona.

Ventajosamente, la invención se refiere a micelas polimerizadas cuya cabeza polar Z está funcionalizada.

Por micelas polimerizadas “funcionalizadas” se entienden micelas polimerizadas modificadas con ligandos de reconocimiento molecular para hacerlas evolucionar hacia vectores inteligentes y selectivos y con el fin de identificar de forma específica antígenos o receptores sobreexpresados en la superficie de células diana, tales como células

5 cancerosas o infecciosas. Para ello, las micelas polimerizadas deben funcionalizarse mediante ligandos específicos cuyo enganche a la superficie del vector se realice mediante acoplamiento químico.

Ventajosamente, los ligandos enganchados en la superficie de las micelas polimerizadas son: fluoróforos o agentes de visualización nuclear (99Tc, 11In, 125I 18F, 64Cu) u óptica (cianina, fluoresceína, luciferasa, puntos cuánticos) o magnética (partículas de óxido de hierro), ácido fólico, manosa, galactosa, anticuerpos, ligandos de tipo RGD.

10 Preferentemente, las micelas polimerizadas según la invención están funcionalizadas a la altura de la cabeza polar Z mediante un ácido fólico.

En una forma de realización preferente, las micelas polimerizadas están funcionalizadas según un procedimiento tal como el descrito en el Ejemplo 5.

Así, la funcionalización superficial de las micelas polimerizadas convierte a dichas micelas polimerizadas en furtivas y 15 permite su focalización a células específicas.

La invención abarca asimismo las micelas polimerizadas que incluyen uno o más compuestos hidrófobos en el seno de los anfífilos polimerizados según la invención.

Se entiende por “compuestos hidrófobos” moléculas de pequeño tamaño que tienen poca solubilidad en agua, inferior a 1 9 por litro, en la totalidad o parte del rango de pH o las proteínas o los ácidos nucleicos con problemas de solubilidad o

20 de estabilidad en medio acuoso.

Preferentemente, las micelas polimerizadas según la invención se componen de moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de una molécula anfífila II-4 de fórmula

25 También de forma preferente, las micelas polimerizadas se componen de moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de una molécula anfífila II-23 de fórmula

Ventajosamente, las micelas polimerizadas según la invención se componen de moléculas anfífilas polimerizadas 30 obtenidas a partir de una molécula anfífila de fórmula

Las micelas polimerizadas se forman también a partir de moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de una molécula anfífila de fórmula

Preferentemente, las micelas polimerizadas según la invención se componen de moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de una molécula anfífila de fórmula

Preferentemente, las micelas polimerizadas se forman a partir de moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de una molécula anfífila de fórmula

Ventajosamente, las micelas polimerizadas según la invención se componen de moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de una molécula anfífila de fórmula

Igualmente, la presente invención tiene por objeto el procedimiento de preparación de los compuestos según la 15 invención, caracterizado porque:

La invención se extiende también a las composiciones farmacéuticas que comprenden las micelas polimerizadas según la invención. Ventajosamente, estas composiciones farmacéuticas incluyen uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, es decir uno o más vehículos o excipientes inertes, no tóxicos y apropiados.

En lo que se refiere a los excipientes farmacéuticamente aceptables, se pueden mencionar, a título no limitativo, ligantes, diluyentes, desintegrantes, estabilizantes, conservantes, lubricantes, odorantes, aromatizantes o edulcorantes.

Entre las composiciones farmacéuticas según la invención, se seleccionarán en particular aquellas adecuadas para su administración vía oral, parenteral y especialmente intravenosa, percutánea o transcutánea, nasal, rectal, perlingual, ocular, respiratoria y específicamente comprimidos simples o en grageas, comprimidos sublinguales, cápsulas, tabletas sublinguales, tabletas, preparaciones inyectables, aerosoles, gotas oculares o nasales, supositorios, cremas, pomadas o geles dérmicos.

La vía de administración preferente es la vía intravenosa y las composiciones farmacéuticas correspondientes pueden permitir la liberación instantánea o retardada de los principios activos.

La presente invención se refiere igualmente a la utilización de las micelas polimerizadas según la invención como vectores de moléculas hidrófobas. La invención abarca también la utilización de las micelas polimerizadas como vectores de principios activos hidrófobos.

Por “vector” se entiende toda molécula o grupo de moléculas que puede transportar un principio activo, una proteína o un ácido nucleico hacia su lugar de acción mediante la focalización de ligandos específicos o, de forma pasiva, mediante solubilización o estabilización de la especie en cuestión.

Por “principio activo” se entiende toda molécula, proteína o ácido nucleico que tiene un efecto terapéutico.

Se desarrollan distintos métodos de inclusión de principios activos con el fin de optimizar la tasa de inclusión o de incorporación en las micelas polimerizadas. Los métodos de inclusión según la invención son:

método “vórtex”, que consiste en la inclusión mediante agitación en vórtice de una solución acuosa de micelas polimerizadas y principio activo en estado de polvo durante aproximadamente 30 minutos;

método “vórtex/sonicación”, que consiste en la inclusión mediante agitación en vórtice combinada con ciclos de sonicación de una solución acuosa de micelas polimerizadas y principio activo en estado de polvo durante aproximadamente 2 horas;

método “agitación a 20ºC”, que consiste en la inclusión mediante agitación magnética a temperatura ambiente durante aproximadamente 12 horas de una solucion acuosa de micelas polimerizadas y principio activo en estado de polvo;

método “agitación a 50ºC”, que consiste en la inclusión mediante agitación magnética a aproximadamente 50ºC durante aproximadamente 12 horas de una solucion acuosa de micelas polimerizadas y principio activo en estado de polvo;

método “evaporación de DCM”, que consiste en la inclusión mediante adición del principio activo solubilizado en diclorometano (DCM) a una solución acuosa de micelas polimerizadas calentada a aproximadamente 50ºC.

Al final de la secuencia de inclusión, la solución se filtra para eliminar el exceso de principio activo no incluido.

Preferentemente, la invencion se refiere a un metodo de inclusion mediante a9itacion ma9netica durante 12 horas a 50ºC de una solución de micelas polimerizadas y principio activo. La inclusión de principio activo en las micelas polimerizadas se controla mediante la energía de agitación y la temperatura. La tasa de incorporación mejora con una agitación más enérgica, una puesta en contacto más larga y una temperatura más alta.

Preferentemente, las soluciones micelares obtenidas al final de la etapa de inclusión se esterilizan mediante filtración en filtro de 0,22 !m con vistas a una inyección intravenosa, sin pérdida de concentración de principio activo.

El estudio de inclusión llevado a cabo en las micelas evidenció el efecto de la polimerización de la micela sobre la capacidad de incorporación de principio activo. Las micelas deben ser polimerizadas para que este nanovector tenga la capacidad de incluir una cantidad muy importante de principios activos. Para este transportador se obtiene una tasa de incorporacion S39625 del 48%, es decir un índice 5 veces superior al que se obtiene con una formulación en nanoanillos.

El estudio de inclusión realizado con distintos principios activos confirmó la capacidad de este nanovector para solubilizar distintos tipos de moléculas hidrófobas con altas tasas de inclusión. Los trabajos realizados sobre una molécula de referencia, paclitaxel, permitieron comparar los valores de la tasa de incorporación con los referidos en la literatura. Las micelas polimerizadas del anfífilo II-4 permitieron incluir el paclitaxel con una tasa de inclusión del 33%. En la literatura, se alcanzaron tasas de inclusión de paclitaxel entre el 6,7% y el 14,3% con distintos tipos de vesiculas, tasas de incorporación entre el 0,2% y el 27% con nanopartículas y tasas de inclusión entre el 0,2 y el 25% con las micelas poliméricas. Por tanto, las micelas polimerizadas se presentan como un nanovector con notable capacidad de solubilización, lo que permite solubilizar principios activos de estructuras y pesos moleculares diferentes.

Finalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de las micelas polimerizadas según la invención. Este procedimiento de obtención comprende las siguientes etapas:

los compuestos lipídicos a polimerizar según la invención se autoensamblan en micelas esféricas;

las micelas esféricas autoensambladas son polimerizadas.

Por “autoensamblaje” de moléculas anfífilas se entiende la organización espontánea en micelas esféricas de las moléculas anfífilas en medio acuoso a una concentración superior a la concentración micelar crítica o CMC.

La concentración micelar crítica de la molécula anfífila II-4 tal como se ha descrito más arriba se determinó experimentalmente en 0,082 m9/ml.

La invención se extiende igualmente a un procedimiento de obtención de micelas polimerizadas donde la etapa de polimerización es del tipo con irradiación luminosa o fotopolimerización.

La fotopolimerización es un método de polimerización particularmente bien adaptado a la polimerización de motivos diacetilénicos. La fotopolimerización es un método “limpio” que utiliza una irradiación luminosa a 254 nm y ningún agente químico externo. La fotopolimerización de motivos diacetilénicos implica la formación de intermedios diradicalarios: la primera etapa consiste en formar la especie diradical mediante excitación fotónica; la segunda etapa es la reacción de propagación del radical hacia un nuevo motivo polimerizable cercano, ampliando así la cadena polimérica; la última etapa es una etapa de terminación por acoplamiento de dos radicales.

La invención abarca también un procedimiento de obtención de micelas polimerizadas donde la etapa de polimerización es del tipo polimerización radical. Generalmente los motivos vinilo y acrilato se polimerizan por polimerización radical. Esta vía de polimerización es conocida y utilizada habitualmente. La iniciación de la polimerización radical puede llevarse a cabo con un iniciador radical generado por disociación térmica y homolítica, mediante reacción de óxidoreducción o mediante irradiación.

Finalmente, la invención abarca asimismo aquel procedimiento de obtención de micelas polimerizadas donde la etapa de polimerización comprende varios tipos de polimerización sucesivos, por ejemplo fotopolimerización y luego polimerización con iniciador radical.

La presente invención se ilustra, pero sin verse limitada, mediante las figuras y ejemplos siguientes:

Fi9ura 1:

Estructura química del S39625;

Figura 2:

Método de inclusión del S39625 en micelas p olimerizadas y no polimerizadas;

Figura 3:

(1) Cromato9rama del S39625 en acetonitrilo, (2) cromato9rama de micelas no

polimerizadas/polimerizadas, (3) cromatograma del S39625 incluido en las micelas no polimerizadas,

(4) cromatograma del S39625 incluido en las micelas polimerizadas; Figura 4: (1) Cromatograma del S39625 solubilizado en acetonitrilo, (2) cromatograma del S39625 incluido en

las micelas polimerizadas;

Figura 5: Estructura de los principios activos hidrofobos (1) S44563, (2) 42909, (3) Paclitaxel y (4) pireno;

Figura 6: Estructura química de 4-amino-3-hidroxi-1-sulfonatonaftaleno;

Figura 7: Espectros de fluorescencia del 4-amino-3-hidroxi-1-sulfonatonaftaleno, de los nanoanillos y de las

micelas polimerizadas funcionalizadas por fluoróforos y de la muestra de control (excitación a 345 nm);

Fi9ura 8: (A) Espectros de absorbancia de la amina III-9, de las micelas polimerizadas y de las micelas polimerizadas funcionalizadas con la amina III-9; (B), espectros de fluorescencia de la amina III-9, de las micelas polimerizadas funcionalizadas con la amina III-9 y de la muestra de control (excitación a 280 nm).

Ejemplo 1: Síntesis de las moléculas anfífilas II-4 y II-23

1.1 Síntesis de la molécula anfífila 11-4

La primera etapa de esta síntesis según el Esquema 1 es preparar la parte hidrófila de la molécula anfífila (derivado de ácido nitrilotriacético) a partir de N-benciloxicarbonil-L-lisina (Z-L-lisina).

10 Esquema 1

La segunda etapa de la síntesis según el Esquema 2 es acoplar la cabeza hidrófila II-2 con un acido 10,12pentacosadiinoico previamente activado.

Esquema 2

El ácido pentacosadiinoico es activado con N-hidroxisuccinímida en presencia de N-(3-dimetilaminopropil)-N’etilcarbodiimida para producir el ácido activado II-3. El agente tensioactivo II-4 se obtiene mediante acoplamiento peptídico entre la cabeza hidrófila NTA II-2 y el ácido activado II-3. El producto puro se obtiene por precipitación en agua con adición de ácido clorhídrico.

20 1.2 Síntesis de la molécula anfífila II-23

La molécula anfífila II-23 es un agente tensioactivo que comprende dos tipos de motivos polimerizables: un motivo diacetilénico polimerizable con radiación luminosa a 254 nm y un motivo acrilato reticulable por bombardeo electrónico.

La primera etapa de la síntesis es preparar la parte hidrófila de la molécula anfífila (cabeza NTA) a partir de Nbenciloxicarbonil-L-lisina (Z-L-lisina) de acuerdo con el Esquema 1 y despues prote9er los acidos carboxilicos en forma

25 de ésteres ter-butílicos. Se obtiene la cabeza hidrófila protegida tBu-NTA, llamada II-14.

La segunda etapa de la síntesis se resume en el siguiente Esquema reactivo 3.

Esquema 3

Ejemplo 2: Preparación y caracterización de las micelas polimerizadas

Las micelas esféricas son arreglos de anfífilos obtenidos a partir de la concentración micelar crítica (CMC). Estas organizaciones en forma esférica tienen una superficie hidrófila y un núcleo lipófilo o hidrófobo.

El agente tensioactivo II-4 se agrupa en forma de micelas esféricas cuando el pH de la solución acuosa es superior a

10. A pH superior a 10, se libera el doblete no li9ante de la amina terciaria de la parte hidrofila del a9ente tensioactivo, lo

10 que conduce a un incremento de volumen de la cabeza polar, y, por debajo de este valor pH, pueden producirse enlaces de hidrógeno entre los carboxilatos y el hidrógeno de la amina terciaria protonada, lo que conduce a una reducción del volumen de la cabeza NTA del anfífilo II-4.

Las micelas autoensambladas y polimerizadas del anfífilo II-4 se preparan según el Esquema 4 mediante radiación luminosa a 254 nm de una solucion acuosa a pH = 12 de 11-4 durante 5 horas, luego se ajusta el pH a pH fisiológico mediante diálisis contra una solución de pH comprendido entre 7 y 8.

Esquema 4

Se observa que la polimerización por irradiación luminosa del anfífilo II-4 estructurado en forma de micelas es un proceso relativamente lento y que, para tiempos de polimerización superiores a 5 horas, se debería alcanzar una conversión de la totalidad de los anfífilos II-4 en polidiacetilénico.

2.2 Caracterización de las micelas polimerizadas

10 El análisis de las micelas polimerizadas de los anfífilos II-4 se realiza mediante granulometría láser. Esta técnica, basada en la difusión quasi-elástica de la luz y la espectroscopía de correlación cruzada de fotones, permite determinar la distribución muestral de tamaños.

El análisis de la intensidad de una muestra de micelas polimerizadas a 50 mg/ml con un aparato Nanophox presenta un pico principal de población a 4,9 nm. El análisis del número en la muestra de micelas polimerizadas a 1 m9/ml con un

15 aparato Malvem Zetasizer ha evidenciado la presencia de una poblacion unica a 5,1 nm.

La polimerización de las micelas induce un fenómeno de contracción de las micelas que se puede explicar por el hecho de que la polimerización paraliza el ensamblaje de los anfífilos y limita los fenómenos de hinchamiento.

Ejemplo 3: Inclusión del S39625 en las micelas polimerizadas y en las micelas no polimerizadas

3.1 Método de inclusión del S39625

20 El S39625 se encapsula en una solucion de 10 m9/ml de micelas no polimerizadas y de micelas polimerizadas mediante el método de “agitación y calentamiento a 50ºC” tal como se detalla en la descripción y se representa en la Figura 2.

3.2 Determinación de la tasa de inclusión del S39625 mediante HPLC

La tasa de inclusión del S39625 se determina por HPLC en fase inversa. Esta técnica se basa en la diferencia de interacción de las moléculas entre la fase móvil y la fase estacionaria. Esta diferencia repercute en los tiempos de 25 retención de estas moléculas. Para determinadas condiciones HPLC, una misma molécula tiene siempre el mismo tiempo de retención. Las condiciones HPLC en fase inversa para la determinación de la tasa de inclusión del S39625 consisten en una columna de sílice injertada RP-18c para la fase estacionaria y un gradiente de agua y acetonitrilo del 5% al 100% para la fase movil. Se detecta el S39625 a la salida de la columna con un detector UV a una longitud de onda de 385 nm. Se realizo por HPLC inversa una curva de calibración del S39625 en acetonitrilo. En estas condiciones

30 de HPLC, el principio activo S39625 presenta un tiempo de retencion de 25,8 minutos.

Se determina también el tiempo de retención del S39625 encapsulado en micelas polimerizadas por HPLC en fase inversa, para la cual el gradiente de disolvente es sustituido por un sistema isocrático en acetonitrilo puro. El acetonitrilo es uno de los mejores disolventes del S39625 y su utilización como eluyente permite asegurarse de la liberación muy rápida del principio activo y de su elución en forma de entidad libre.

35 3.3 Resultados de la tasa de inclusión del S39625

Los resultados de incorporación del S39625 se calculan a partir de la Figura 3.

El cromatograma del S39625 incluido en las micelas no polimerizadas presenta tres picos a 3,2 minutos, 25,8 minutos y 31,9 minutos. A la vista del area del pico a 25,8 minutos, la incorporacion del principio activo en las micelas no polimerizadas se situa entre el 1,7 y el 3,3%.

40 El cromatograma del S39625 incluido en las micelas polimerizadas presenta un amplio pico a un tiempo de retención muy bajo. Esta fuerte disminución del tiempo de retención demuestra, por una parte, que la hidrofobicidad del S39625 está enmascarada fuertemente por la superficie altamente hidrófila de la micela polimerizada y, por otra, que la asociación S39625/micelas polimerizadas es particularmente fuerte.

El cromatograma del S39625 solubilizado en acetonitrilo presenta un pico a 5,2 minutos, mientras que el S39625 incluido en la micela polimerizada presenta dos picos a 4,0 y 4,9 minutos. La tasa de inclusión en las micelas polimerizadas del S39625 y de sus productos de degradación se evalúa por integración de ambos picos. Así, la tasa de incorporación de estas moléculas en las micelas polimerizadas es del 48%. Para una concentracion en anfifilos identica

5 (10 m9/ml), la solubilidad, y por ello la capacidad de encapsulación de las micelas polimerizadas, mejora en un factor 5 en relacion con los nanoanillos y en un factor 13 en relacion con las micelas no polimerizadas.

Ejemplo 4: Inclusión de principios activos hidrófobos en las micelas polimerizadas

Se llevan a cabo pruebas de inclusión con los principios activos hidrófobos S42909, S44563, Paclitaxel, molécula activa hidrófoba de referencia, y pireno, molécula muy hidrófoba. Las fórmulas químicas de estos principios activos hidrófobos

10 se representan en la Figura 5. La inclusión de estos principios activos se lleva a cabo con soluciones de micelas polimerizadas a 10 m9/ml mediante el método de calentamiento a 50°C durante 12 horas.

El conjunto de resultados de la Tabla 1 demuestra una fuerte incorporación de las moléculas hidrófobas en las micelas polimerizadas, con tasas de inclusión superiores al 24%, y un incremento de la solubilidad de los principios activos en agua de 30.000 a 500.000.

Tabla 1

Principio Activo Molécula

Masa molar (g/mol) Solubilidad en agua molécula (en !g/ml) Tasa inclusión másicaf (en %) Tasa inclusión molarg (en %) Nº moléc. por micelah Solubilidad en agua (en mg/ml)

S39625

430 0,09 48 56 125 9,00

S44563

912 2,00 45 36 56 8,30

S42909

462 0,20 24 29 42 3,15

Paclitaxel

853 0,40 31 25 33 4,55

Pireno

202 0,01 34 63 167 5,25

fTasa másica (en %) entre medicamento y medicamento + transportador x 100 en la formulacion despues de tratamiento. gTasa molar (en % entre medicamento y medicamento + Anfífilo II-4 x 100 en la formulacion despues de tratamiento. hTasa molar entre medicamento y Anfífilo II-4 x numero de anfifilos / micela (100 moleculas).

Ejemplo 5: Funcionalización de las micelas polimerizadas

5.1 Funcionalización con 4-amino-3-hidroxi-sulfonatonaftaleno

20 Las micelas polimerizadas son funcionalizadas con un fluoróforo hidrófilo, 4-amino-3-hidroxi-sulfonatonaftaleno, descrito en la Figura 6. Este fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación de 340 nm y una longitud de onda de emisión de 455 nm.

El enganche del fluoróforo se realiza mediante un acoplamiento peptídico en agua a pH basico (pH = 12) con diciclohexilcarbodiimida (DCC) como agente de acoplamiento. Este injerto se realiza con un alto exceso de fluoróforo

25 (50 equivalentes) y de agente de acoplamiento (100 equivalentes) y las muestras se purifican mediante columna de exclusión de tamaño.

La funcionalización de las micelas polimerizadas se sigue de una espectroscopía de fluorescencia para evidenciar el injerto del fluoróforo en la superficie del nanovector. Los espectros de fluorescencia de las micelas polimerizadas funcionalizadas muestran una evolución del pico de fluorescencia correspondiente al 4-amino-3-hidroxi

30 sulfonatonaftaleno con un desplazamiento batocrómico de fluorescencia de 492 nm (Figura 7). El control evidencia que el desplazamiento de fluorescencia de las micelas polimerizadas proviene efectivamente del injerto covalente del fluoróforo en la superficie del nanovector.

5.2 Funcionalización con ácido fólico

Encontrándose sobreexpresado el receptor de folato en la superficie de las células cancerosas, se utiliza ampliamente el ácido fólico para la focalización específica de las células cancerosas del cerebro, riñón, pecho, ovarios y pulmones.

Para realizar la etapa de acoplamiento del ácido fólico con las micelas polimerizadas, se modifica el ácido fólico con el fin de introducir una función amina que permita el injerto. El acoplamiento del derivado amino del ácido fólico III-9 en la superficie de las micelas polimerizadas se lleva a cabo por acoplamiento peptídico en agua a pH basico (pH = 12) con DDC como agente de acoplamiento. Este injerto se realiza con un alto exceso de derivado amino de ácido fólico (50 equivalentes) y de a9ente de acoplamiento (100 equivalentes). La muestra se purifica mediante filtración y luego en columna de exclusión de tamaño.

Los espectros de absorcion de la Fi9ura 8 muestran que el derivado amino del acido folico 111-9 está presente efectivamente en la superficie de las micelas polimerizadas debido a la presencia del pico a 285 nm. Los espectros de fluorescencia de las micelas polimerizadas funcionalizadas muestran una evolución de los picos de fluorescencia del derivado amino del ácido fólico a 360 nm y 450 nm.

5.3 Funcionalización con PEG

La potencial fagocitosis de las micelas de tamaño nanométrico según la invención por los macrófagos se puede evitar mediante injerto sobre estas micelas de cadenas de PEG o polietilenglicol. La presencia de PEG en la superficie de las micelas crea una capa externa inerte que impide la adherencia de las opsoninas, convirtiendo por tanto dichas micelas en furtivas con respecto a los macrófagos y aumentando así su tiempo de circulación en el torrente sanguíneo.

El acoplamiento de una metoxi-PEG-amina 5000 en la superficie de la micela polimerizada se efectua a un pH 12 con DDC como agente de acoplamiento. Este injerto se realiza con un alto exceso de derivado PEG (25 equivalentes) y de agente de acoplamiento (100 equivalentes). Las micelas derivatizadas son purificadas mediante filtración, seguida de columna por exclusión de tamaño.

Ejemplo 6: Estudio toxicológico de las micelas polimerizadas

La distribución de las micelas polimerizadas en el organismo es un parámetro primordial que se debe ensayar para determinar el modo de excreción y el modo de acumulación de dichas micelas polimerizadas.

Para realizar este estudio, el anfífilo II-4 es radiomarcado con 14C con el fin de sintetizar la micela polimerizada radiomarcada para un estudio de rastreo mediante autorradiografía en la rata. El anfífilo radiomarcado con 14C se obtiene con una actividad específica de 7,6! Ci/m9. La administración de micelas polimerizadas en la rata se realiza con una dosis de 4 MBq/k9 y 100 m9/k9 para un volumen de administracion de 2,5 ml/kg. Para ello, es necesaria una solución a 40 mg/ml con una actividad específica de 7,6 ! Ci/m9.

El estudio de acumulación/eliminación de las micelas polimerizadas radiomarcadas con 14C se lleva a cabo en 3 ratas macho tipo Wistar. Una dosis unica de 100 m9/k9 de micelas polimerizadas C14C] se administra vía intravenosa (bolo) a cada una de las ratas y los animales se sacrifican a los 10 minutos, 24 horas y 48 horas. Se reco9ió la orina de las ratas a las 24 y 48 horas para medir la actividad por escintilación líquida. La cuantificación de los niveles de radioactividad en los tejidos se llevó a cabo por radioluminografía de secciones específicas de las ratas obtenidas por criomicrotomía.

El analisis de los radiolumino9ramas de la rata a los 10 minutos, es decir sacrificada a los 10 minutos, evidencia una distribución generalizada de la radioactividad en el cuerpo de la rata debida a una elevada concentración de micelas polimerizadas en sangre. Se detectan altos niveles de radioactividad en ciertos tejidos, como los pulmones, riñones y sus sustancias medulares, el hígado, glándulas adrenales o el bazo.

El analisis de los radiolumino9ramas de las ratas de 24 y 48 horas, es decir sacrificadas respectivamente a las 24 y 48 horas, revela una concentración de radioactividad elevada en hígado, pared intestinal, bazo, glándulas adrenales, riñones y médula ósea.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Micelas polimerizadas caracterizadas porque comprenden moléculas anfífilas polimerizadas obtenidas a partir de moléculas anfífilas de fórmula general A-X-B-L-Z donde

   A representa CH3-(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n- o CH2=CH- o CH2=CH-C6H4-, siendo n y m números enteros de 1 a 16 identicos o diferentes;

   X

   representa CO-NH o NH-CO o un enlace, X es un enlace si B es un enlace y L es un enlace;

   B representa -(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n- o -CH=CH-C6H4- o un enlace, siendo n y m números enteros de 1 a 16 identicos o diferentes; L representa -(CH2)r-CH[NH-CO-A’]- o un enlace, siendo r un numero entero de 1 a 16 y A' representa A; Z representa

   siendo s un numero entero de 1 a 16, con R2 COOH o SO3H u OSO3H u OPO3H2 u OPO2H2; con R1 H o un grupo COOH o SO3H u OSO3H u OPO3H2 u OPO2H2 o un grupo -CO-NH-(CH2)t-CH3, siendo t un número entero de 1 a 16, o Z puede ser tambien una cabeza polar hidrofila neutra de tipo azucar o polisacarido,

   así como sus sales de adición de un ácido o una base farmacéuticamente aceptables.
2. 2. Micelas polimerizadas se9un la reivindicacion 1, caracterizadas porque comprenden moleculas anfifilas

   polimerizadas obtenidas a partir de moléculas anfífilas de fórmula general A-X-B-L-Z donde A representa CH3-(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n-, siendo n y m numeros enteros de 1 a 16 identicos o diferentes;

   X representa CO-NH o NH-CO o un enlace, X es un enlace si B es un enlace y L es un enlace;

   B representa -(CH2)m-C=C-C=C-(CH2)n- o un enlace, siendo n y m números enteros de 1 a 16 identicos o diferentes; L representa -(CH2)r-CH[NH-CO-A'] o un enlace, siendo r un numero entero de 1 a 16 y A' representa A

   o CH2=CH- o CH2=CH-C6H4-; Z representa

   siendo s un numero entero de 1 a 16, con R1 H o un grupo COOH o un grupo -CO-NH-(CH2)t-CH3, siendo t un numero entero de 1 a 16, o Z puede ser tambien una cabeza polar hidrofila neutra de tipo azucar o polisacárido,

   así como sus sales de adición de un ácido o una base farmacéuticamente aceptables.

3. 3.

   Micelas polimerizadas segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizadas porque la cabeza polar Z está funcionalizada.

4. 4.

   Micelas polimerizadas según la reivindicación 3, caracterizadas porque la cabeza polar Z está funcionalizada con un ácido fólico.

5. 5.

   Micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque incluyen uno o más compuestos hidrófobos.

6. 6.

   Micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las moleculas anfífilas polimerizadas se obtienen a partir de la molécula anfífila II-4 de fórmula

7. 7.

   Micelas polimerizadas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las moleculas anfífilas polimerizadas se obtienen a partir de la molécula anfífila II-23 de fórmula

8. 8.

   Micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las moleculas anfífilas polimerizadas se obtienen a partir de la molécula anfífila de fórmula

9. 9.

   Micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las moleculas anfífilas polimerizadas se obtienen a partir de la molécula anfífila de fórmula

10. 10.

    Micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las moleculas anfífilas polimerizadas se obtienen a partir de la molécula anfífila de fórmula

11. 11.

    Micelas polimerizadas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las moleculas anfífilas polimerizadas se obtienen a partir de la molécula anfífila de fórmula

12. 12.

    Micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las moleculas anfífilas polimerizadas se obtienen a partir de la molécula anfífila de fórmula

    5 13. Composición caracterizada porque comprende micelas polimerizadas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
13. 14. Composicion se9un la reivindicacion 13, caracterizada porque comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. 15. Utilizacion de las micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como vectores de 10 moléculas hidrófobas.

15. 16.

    Utilización de micelas polimerizadas se9un la reivindicacion 15, caracterizada porque las moléculas hidrófobas son principios activos hidrófobos.

16. 17.

    Proceso de obtencion de micelas polimerizadas se9un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

    15 las moléculas anfífilas a polimerizar se9un las reivindicaciones 1 a 12 son autoensambladas en micelas esféricas;

    las micelas esféricas autoensambladas son polimerizadas.
17. 18. Proceso se9un la reivindicacion 17, caracterizado porque las micelas esfericas autoensambladas son fotopolimerizadas.

    20 19. Proceso se9un la reivindicacion 17, caracterizado porque las micelas esféricas autoensambladas son polimerizadas por polimerización radical.

    Figura 1

    Agitación Filtración a 50ºC a 0 2 !m

    Figura 2

    Figura 3

    Figura 4

    Figura 5

    Figura 6

    Absorbancia

    Figura 7

    Figura 8