EA019804B1

EA019804B1 - Полимеризованная мицелла

Info

Publication number: EA019804B1
Application number: EA201001692A
Authority: EA
Inventors: Жульен Ожье; Эрик Дори; Франсуа Лефулон; Томас Арно
Original assignee: Ле Лаборатуар Сервье; Коммиссариат А Л'Энержи Атомик
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2014-06-30
Also published as: AU2009241887A1; PT2282727E; HRP20120150T1; ES2378283T3; FR2930444A1; CY1112266T1; ME01991B; EP2282727B1; RS52170B; DK2282727T3; EP2282727A2; JP2011518868A; US8663660B2; WO2009133325A3; US20110105516A1; AU2009241887B2; ATE534376T1; WO2009133325A2; CA2722050A1; FR2930444B1

Abstract

Изобретение относится к полимеризованной мицелле, включающей полимеризованные амфифильные молекулы, полученные из амфифильных молекул общей формулы A-X-B-L-Z, имеющих одну или две липоидные цепи, каждая из которых содержит один или два полимеризуемых фрагмента, и связанных с нейтральной гидрофильной полярной головой сахарида или полисахарида.

Description

Изобретение относится к полимеризованной мицелле, к способу её получения и её применению.

Большое число молекул, имеющих терапевтическую активность, и особенно противораковые молекулы, имеют низкую растворимость в воде, благодаря присущим им гидрофобным свойствам молекулы. Определенная степень гидрофобности фактически необходима для этих молекул для того, чтобы они могли усваиваться клетками. Векторизация терапевтических молекул направлена на то, чтобы обойти проблемы, связанные в особенности с растворимостью, стабильностью, фармакокинетикой и биораспределением упомянутых молекул и, в частности, их нацеливание.

Различные системы векторизации для гидрофобных соединений были описаны в литературе как являющиеся способными транспортировать достаточные количества молекул, имеющих терапевтическую активность, через различные биологические барьеры, чтобы эффективно достигнуть их участка действия.

Один из таких способов векторизации заключается в инкапсулировании активного компонента в микросферу, образованную матрицей полимеров, таких как поли(алкилцианоакрилаты), поли(ангидриды) и поли(молочная кислота). Такие микросферы имеют размеры от 20 до 100 мкм, что исключает их использование внутривенным путем и позволяет относительно низкие степени включения гидрофобных соединений между 0,2 и 3,5%.

Полимеризованная мицелла, другой способ векторизации, обозначает коллоидную дисперсию, составленную из амфифильных полимеров, имеющих отдельные гидрофильные и гидрофобные области. Эта полимеризованная мицелла представляет собой надмолекулярные ядро/оболочка структуры. Полимеризованная мицелла составлена из полиэфиров, применяемых в комбинации с поли(этиленгликолем) для образования амфифильных полимеров в форме диблок-сополимеров (плюроники: ППО-со-ПЭГ) или триблок-сополимеров (полоксамеры: РЕО-со-ППО-со-ПЭГ). Такая полимеризованная мицелла имеет размер между 50 и 100 нм. Степени включения соединений в полимерные мицеллы находятся между 0,1 и 40% включительно в зависимости от используемого метода включения: включение испарением, включение диализом или включение наноосаждением. Полимеризованной мицеллой является, таким образом, вектор, который позволяет вводить большие количества гидрофобных соединений, но который требует трудного промышленного и технического способа формирования (синтез и включение).

Системы векторизации, использующие липосомы и пузырьки полимеров, являются объектом интенсивного исследования, и в настоящее время подвергаются клиническим испытаниям многие препараты лекарств, использующие эти системы, некоторые из них даже одобрены для клинического использования. Липосомы и пузырьки полимеров могут включать гидрофильные активные компоненты в водном ядре пузырька или гидрофобные молекул в двойном слое полимера. Липосомы и пузырьки полимеров имеют очень различные структуры (мультипластинчатые пузырьки МИИ, маленькие унипластинчатые пузырьки МУП, большие унипластинчатые пузырьки БУП, гигантские пузырьки ГУП) и очень различные размеры между 100 и 1000 нм включительно. Липосомы и пузырьки полимеров - важные переносчики активных компонентов в векторизации гидрофильных молекул.

В 2003 году был открыт новый тип организации на поверхности углеродных нанотрубок: нанокольца, т.е. структурирование амфифильных частиц в кольца по всей длине нанотрубок. Нанокольца представляют собой кольца полимеризированных сурфактантов, сформированных на поверхности нанотрубок и затем отделенных от их углеродной основы, чтобы использоваться в качестве агентов солюбилизации для гидрофобных активных компонентов (νθ 2004/092231). Нанокольца, тем не менее, представляют собой нановекторы, которые трудно индустриализировать.

Вышеописанные векторы передачи решают проблему векторизации более или менее хорошо, что эффективным способом и с низкой токсичностью разрешает транспортировать достаточное количество активного компонента для лечения патологии. Эти векторы решают проблему растворимости гидрофобных активных компонентов, но не решая при этом проблемы векторного размера, формирования и индустриализации. Настоящее изобретение соответственно нацелено на предложение новой стратегии, чтобы получить нановекторы, имеющие способность к включению гидрофобных активных компонентов, которая больше, чем у общепринятых векторов, описанных в литературе, и которые являются простыми для формирования, облегчающего их будущую индустриализацию.

Настоящее изобретение относится к полимеризованной мицелле, отличающейся тем, что она содержит полимеризованные амфифильные молекулы, полученные из амфифильных молекул, имеющих одну или две липоидные цепи, каждая из которых содержит один или два полимеризуемых фрагмента диацетиленового, винилового, акрилатного или стирольного типа и связана с полярной головой.

В соответствии с настоящим изобретением мицеллы, как понимают, являются самоагрегированными сферическими объектами, имеющими гидрофильную поверхность и липофильное ядро и чей размер составляет меньше чем 100 нм.

Амфифильные частицы или сурфактанты, как понимают, являются органическими молекулами, имеющими особенность быть одновременно гидрофильными и гидрофобными. Амфифильные молекулы, характеризуемые их антагонистическими свойствами, имеют особые свойства в растворении и спонтанно ведут себя в водных средах в различные микроструктуры.

Изобретение предпочтительно относится к полимеризованной мицелле, включающей полимеризованные амфифильные молекулы, полученные из амфифильных молекул общей формулы

- 1 019804

СН₂=СН-С₆Н₄в которой А представляет собой ^снг(^снг)>;;^_с—^с_с=с_(^Ή, или СН₂=СН—, _илиη и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

X представляет собой СО-ΝΗ, или νη-со, или связь, X означает связь, если В означает связь и Ь означает связь;

В представляет собой <^СН2>т ^с~^{с с}—^{с (СН}2к , или СН=СН-С₅Н₄-, или связь, η и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

Ь представляет собой (^сн?)| СН[Г4Н СО А] или связь, г является целым числом от 1 до 16 и А' представляет собой А;

_ХСН,-К, .СН,-Щ —ΟΟΝΗ-(ΟΗ₂),-ΟΗ-Ν₄ — МНСО-(СН₂)-СН-\

Т с- « р СН,-К, О 'сн,-к,

Ζ представляет собой ι ^{2 2} или Ή ^{2 2}, 8 является целым числом от 1 до 16, В₂ представляет собой СООН, или 8О₃Н, или, О8О₃Н, или ОРО₃Н₂, или ОРО₂Н₂, В! представляет собой Н, или радикал СООН, или 8О₃Н, или О8О₃Н, или ОРО₃Н₂, или ОРО₂Н₂, или группу -СО-МН-(СН₂)(-СНз, [ является целым числом от 1 до 16; или

Ζ может также быть нейтральной гидрофильной полярной головой сахарного или полисахаридного типа, а также их соли присоединения с фармацевтически приемлемыми кислотами или основаниями.

Среди фармацевтически приемлемых кислот здесь могут быть упомянуты, не подразумевая какоелибо ограничение, соляная, бромисто-водородная, серная, метафосфорная, уксусная, трифторуксусная, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, глутаровая, фумаровая, винная, малеиновая, лимонная, аскорбиновая, щавелевая, метансульфоновая, бензолсульфоновая и камфорная кислоты.

Среди фармацевтически приемлемых оснований здесь могут быть упомянуты, не подразумевая какое-либо ограничение, гидроксид натрия, гидроксид калия, триэтиламин, трет-бутиламин.

А—X—В—1_—Ζ „ . , „ СН₃-(СН,)—С=с-с=с—(СН₂)- в которой А представляет собой ^{3 2 т} , η и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

X представляет собой СО-ИН или ИН-СО или связь, X означает связь, если В означает связь и Ь означает связь;

В представляет собой (^СН ₂)~С—^с_С=С~(^СН2)— или связь, η и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

Ь представляет собой ^_(сн₂)г-сн[мн—со—А’]— или связь, г является целым числом от 1 до 16 и А' представляет собой А, или СН₂=СН—, или СН₂=СН-С₆Н₄ ;

_хсн,-соон _.сн₂-соон —ΝΗΟΟ—(СН₂)—<рн~Ν_χ — СОЫН—(СН₂)~СН^—

Ζ представляет собой сн₂-соон или к, сн₂-соон, _§ является целым числом от 1 до 16, В! представляет собой Н, или радикал СООН, или группу -СО-ИН-(СН₂)₁СН₃, 1 является целым числом от 1 до 16; или

Ζ может также быть нейтральной гидрофильной полярной головой сахарного или полисахаридного типа, и также их соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием.

Изобретение также относится к полимеризованной мицелле, состоящей из амфифильных молекул, чьи нейтральные гидрофильные полярные головки являются краунэфирного типа.

Изобретение выгодно относится к полимеризованной мицелле, чья полярная голова Ζ является функционализированной.

Функционализированные полимеризованные мицеллы, как понимают, являются полимеризованными мицеллами, модифицированными молекулярными лигандами обнаружения, чтобы сделать их разумными и выбранными векторами, чтобы определенно идентифицировать антигены или рецепторы, сверхэксперессированные на поверхности целевых клеток, таких как раковые или инфекционные клетки. С этой целью полимеризованные мицеллы должны быть функционализированными определенными ли гандами, прикрепление которых на поверхность вектора достигается химическим сцеплением.

Преимущественно лигандами, прикрепленными к поверхности полимеризованных мицелл, являются флуорофоры или агенты радионуклидной визуализации (⁹⁹Тс, 'ίη. ¹²⁵1, ¹⁸Р, ⁶⁴Си) или оптического формирования изображений (цианин, флуоресцеин, люцифераза, квантовые примеси) или магнитного формирования изображений (частицы оксида железа), фолиевая кислота, манноза, галактоза, антитела, лиганды ВСИ-типа.

Предпочтительно полимеризованная мицелла согласно изобретению является функционализированной при полярной голове Ζ фолиевой кислотой.

- 2 019804

В предпочтительном варианте осуществления полимеризованная мицелла является функционализированной в соответствии со способом, как описано в примере 5.

Поверхностную функционализацию полимеризованной мицеллы соответственно обеспечивает упомянутая полимеризованная мицелла со свойствами способности к скрытным действиям и позволяет нацеливание определенных клеток.

Изобретение также относится к полимеризованной мицелле, включающей одно или несколько гидрофобных соединений в середине полимеризованных амфифильных молекул согласно изобретению.

Гидрофобные соединения, как понимают, представляют собой молекулы небольшого размера, имеющие низкую растворимость в воде менее чем 1 г на 1 л всего или части диапазона рН, или белки, или нуклеиновые кислоты, имеющие проблемы растворимости или стабильности в водной среде.

Предпочтительно полимеризованная мицелла согласно изобретению составлена из полимеризованных амфифильных молекул, полученных из амфифильной молекулы формулы

Также предпочтительно полимеризованная мицелла составлена из полимеризованных амфифильных молекул, полученных из амфифильной молекулы формулы

Преимущественно полимеризованная мицелла согласно изобретению составлена из полимеризованных амфифильных молекул, полученных из амфифильной молекулы формулы

Полимеризованная мицелла также образуется, начиная с полимеризованных амфифильных молекул, полученных из амфифильной молекулы формулы

к,

Предпочтительно полимеризованная мицелла образована, начиная с полимеризованных амфифиль- 3 019804 ных молекул, полученных из амфифильной молекулы формулы

Настоящее изобретение также относится к способу получения соединений согласно изобретению, при этом способ отличается тем, что:

РЛ° — он	О —* + ЕГ-МН. -----» р· ¹ Вазе	- кЛ° Ν-Κ н	= А-Х-В-Ь-Ζ
	ч
		К= А-Х-В-Ь	ΐΛίήΗ К = ро!аг Меас1
	К = С1. Вг, ОСОСН₃, Ο-Ν Ί	ОГ
	А О	Р = А—Х-В—ί	№КЬ ц = ро!аг Квас!

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полимеризованную мицеллу согласно изобретению.

Преимущественно эти фармацевтические композиции содержат один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей, т.е. один или несколько подходящих, инертных, нетоксичных носителей или наполнителей.

Что касается фармацевтически приемлемых наполнителей, здесь могут быть упомянуты, не подразумевая какое-либо ограничение, связующие вещества, разбавители, распушивающие агенты, стабилизаторы, консерванты, смазывающие вещества, ароматизирующие вещества, придающие запах, или подслащивающие вещества.

Среди фармацевтических композиций согласно изобретению здесь будут более особенно выбраны те, которые являются подходящими для введения пероральным, парентеральным и особенно внутривенным, под - или чрескожным, назальным, ректальным, околоногтевым, офтальмологическим или респираторным путями, более конкретно, таблетки или драже, сублингвальные таблетки, твердые желатиновые капсулы, глоссеты, капсулы, таблетки для рассасывания, инъецируемые препараты, аэрозоли, глазные капли, капли для носа, суппозитории, крема, мази или кожные гели.

Предпочтительным путем введения является внутривенный путь, и соответственно фармацевтические композиции могут позволять моментное или отсроченное высвобождение активных компонентов.

Настоящее изобретение также относится к применению полимеризованной мицелле согласно изобретению в качестве векторов гидрофобных молекул. Изобретение также относится к применению полимеризованной мицелле в качестве векторов гидрофобных активных компонентов.

Вектор, как понимают, является любой молекулой или объединением молекул, способных к транспортировке активного компонента, белка или нуклеиновой кислоты к ее участку действия путем нацеливания определенных лигандов или пассивным способом, солюбилизацией или стабилизацией рассматриваемых частиц.

Активный компонент, как понимают, является любой молекулой, белком или нуклеиновой кислотой, владеющей терапевтическим эффектом.

Различные методы включения активных компонентов были разработаны для оптимизации степени включения или объединения в полимеризованной мицелле. Методами включения согласно изобретению являются способ перемешивания на вортексе, который заключается во включении путем перемешивания на вортексе водного раствора полимеризованной мицеллы и активного компонента в виде порошка приблизительно на протяжении 30 мин;

способ перемешивания на вортексе/разрушение ультразвуком, который заключается во включении путем перемешивания на вортексе, комбинированного с циклами разрушения ультразвуком водного раствора полимеризованной мицеллы и активного компонента в виде порошка приблизительно на про

- 4 019804 тяжении 2 ч;

способ перемешивание при 20°С, который заключается во включении при помощи магнитного перемешивания при температуре окружающей среды, приблизительно на протяжении 12 ч, водного раствора полимеризованной мицеллы и активного компонента в виде порошка;

способ перемешивание при 50°С, который заключается во включении при помощи магнитного перемешивания приблизительно при 50°С, приблизительно на протяжении 12 ч, водного раствора полимеризованной мицеллы и активного компонента в виде порошка;

способ ДХМ выпаривание, который заключается во включении путем добавления активного компонента, солюбилизированного в дихлорметане (ДХМ), к водному раствору полимеризованной мицеллы, который нагревают приблизительно до 50°С.

В конце последовательности включения раствор фильтруют, чтобы удалить избыток не включённого активного компонента.

Изобретение предпочтительно относится к способу включения при помощи магнитного перемешивания на протяжении 12 ч, при 50°С раствора полимеризованной мицеллы и активного компонента. Включение активного компонента в полимеризованную мицеллу контролируется мощностью перемешивания и температурой. Степень объединения улучшается более энергичным перемешиванием, путем более долгого контакта и при более высокой температуре.

Предпочтительно мицеллярные растворы, полученные в конце стадии включения, стерилизуют фильтрацией через фильтр 0,22-мкм в целях применения для внутривенной инъекции без потери концентрации активного компонента.

Исследование включения, выполненное на мицеллах, продемонстрировало действие полимеризации мицеллы на способность объединения активного компонента. Мицеллы должны полимеризироваться, чтобы такой нановектор имел способность включения очень большого количества активного компонента. Степень объединения 48% 839625, полученного для этого транспортера, в 5 раз выше, чем полученного нанокольцевым образованием.

Исследование включения, проводимое на различных активных компонентах, подтвердило способность такого нановектора солюбилизировать различные типы гидрофобных молекул с высокими степенями включения. Работа, проводимая с эталонной молекулой, паклитаксел позволила сравнить степени объединения с данными из литературы. Полимеризованная мицелла амфифильной молекулы позволяет включить паклитаксел при степени включения 33%. В литературе степени включения паклитаксел, составляющие между 6,7 и 14,3% включительно, были достигнуты с различными типами пузырьков, степенями объединения между 0,2 и 27% включительно, с наночастицами и степенями включения между 0,2 и 25% включительно, с мицеллами полимера. Полимеризованная мицелла, таким образом,. представляет собой как нановектор, имеющий замечательную силу солюбилизации, что позволяет делать растворимым активные компоненты различных структур и молекулярных масс.

Настоящее изобретение в заключение относится к способу получения полимеризованной мицеллы согласно изобретению. Этот способ получения включает следующие стадии:

липоидные соединения, которые должны полимеризоваться в соответствии с изобретением, самоагрегируют в сферические мицеллы;

самоагрегированные сферические мицеллы полимеризуют.

Самоагрегация амфифильных молекул, как понимают, является спонтанной организацией в сферические мицеллы амфифильных молекул в водной среде при концентрации больше, чем критическая мицеллярная концентрация или КМК.

Критическая мицеллярная концентрация амфифильной молекулы, как описано выше, была определена экспериментально и составляет 0,082 мг/мл.

Изобретение также относится к способу получения полимеризованной мицеллы, в котором стадия полимеризации является светоизлучающего или фотополимеризационного типа.

Фотополимеризация - это способ полимеризации, особенно хорошо подходящий для полимеризации диацетиленовых фрагментов. Фотополимеризация - чистый способ, использующий излучение света с длиной волны 254 нм и отсутствие внешних химических агентов. Фотополимеризация диацетиленовых фрагментов включает формирование дирадикальных промежуточных звеньев: первый шаг заключается в формировании дирадикальных видов возбуждением фотона; второй шаг - реакция роста радикала с новым полимеризованным фрагментом, расположенным вблизи, таким образом приводя к росту цепи полимера; последний шаг - шаг завершения сцеплением двух радикалов.

Изобретение также относится к способу получения полимеризованной мицеллы, в котором стадия полимеризации является свободнорадикального полимеризационного типа.

В основном свободнорадикальной полимеризацией полимеризуются виниловые и акрилатные фрагменты. Этот путь полимеризации известный и широкоприменимый. Инициирование свободнорадикальной полимеризации может быть вызвано при помощи инициатора свободного радикала, генерированного тепловой и гомолитической диссоциацией, окислительно-восстановительной реакцией или излучением.

- 5 019804

Наконец, изобретение также относится к способу получения полимеризованной мицеллы, в котором стадия полимеризации включает множество типов поочерёдных полимеризаций, например фотополимеризацию и затем полимеризацию при помощи инициатора свободных радикалов.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими фигурами и примерами, не будучи ограниченным таким образом.

Фиг. 1. Химическая структура §39625.

Фиг. 2. Способ включения §39625 в полимеризованную и неполимеризованную мицеллу.

Фиг. 3:

(1) хроматограмма §39625 в ацетонитриле, (2) хроматограмма неполимеризованной/полимеризованной мицеллы, (3) хроматограмма §39625, включенного в неполимеризованную мицеллу, (4) хроматограмма §39625, включенного в полимеризованную мицеллу.

Фиг. 4:

(1) хроматограмма §39625, солюбилизированного в ацетонитриле, (2) хроматограмма §39625, включенного в полимеризованную мицеллу.

Фиг. 5. Структуры гидрофобных активных компонентов:

(1) §44563, (2) 42909, (3) паклитаксел, (4) пирен.

Фиг. 6. Химическая структура 4-амино-3-гидроксинафталин-1-сульфоната.

Фиг. 7. Спектр флуоресценции 4-амино-3-гидроксинафталин-1-сульфоната, наноколец и полимеризованной мицеллы, функционализированной флуорофором, и контрольного образца (возбуждение длиной волны 345 нм).

Фиг. 8А. Спектр поглощения амина ΙΙΙ-9, полимеризованной мицеллы и полимеризованной мицеллы, функционализированной амином ΙΙΙ-9.

Фиг. 8В. Спектр флуоресценции амина ΙΙΙ-9, полимеризованной мицеллы, функционализированной амином ΙΙΙ-9, и контрольного образца (возбуждение длиной волны 280 нм).

Пример 1. Синтез амфифильных молекул.

1.1. Синтез амфифильной молекулы ΙΙ-4.

Первая стадия этого синтеза в соответствии со схемой 1 состоит в получении гидрофильной части амфифильной молекулы (производное нитрилотриуксусной кислоты (ΝΤΑ)), начиная с Ν-бензилоксикарбонил-Ь-лизин (Ζ-Ь-лизин).

Схема 1

11-1 >-2

Вторая стадия синтеза в соответствии со схемой 2 заключается в сцеплении гидрофильной головы ΙΙ-2 с предварительно активированной 10,12-пентакозадииновая кислота.

Схема 2

Пентакозадииновую кислоту активируют Ν-гидроксисукцинимидом в присутствии №(3-диметиламинопропил)-Л'-этилкарбодиимида для получения активированной кислоты ΙΙ-3. Поверхностно-активный агент ΙΙ-4 получают путем пептидного сцепления между ΝΤΑ гидрофильной головой ΙΙ-2 и активированной кислотой ΙΙ-3. Чистый продукт получают осаждением из воды путем добавления соляной кислоты.

1.2. Синтез амфифильной молекулы ΙΙ-23.

Амфифильная молекула ΙΙ-23 представляет собой сурфактант, имеющий два типа полимеризованных фрагментов: диацетиленовый фрагмент, полимеризуемый излучением светом с длиной волны 254 нм, и акрилатный фрагмент, сшиваемый бомбардировкой электронами.

Первая стадия синтеза состоит в получении гидрофильной части амфифильной молекулы (ΝΤΑ голова), начиная с Ν-бензилоксикарбонил-Ь-лизина (Ζ-Ь-лизин), в соответствии со схемой 1 и затем защи

- 6 019804 та карбоновых кислот в форме трет-бутиловых эфиров. Так получают защищенную гидрофильную голову ΐΒιι-ΝΤΛ. обозначенного 11-14.

Вторая стадия синтеза получена в итоге следующей схемы реакции 3.

Схема 3

Пример 2. Получение и характеристика полимеризованной мицеллы.

2.1. Получение полимеризованной мицеллы.

Сферические мицеллы - компоновки амфифильных молекул, полученных в и вне критической мицеллярной концентрации (КМК). У этих организованных структур сферической формы есть гидрофильная поверхность и липофильное или гидрофобное ядро.

Поверхностно-активный агент ΙΙ-4 компонует себя в форме сферических мицелл, когда рН водного раствора больше чем 10. Выше рН 10 одиночная пара третичного амина гидрофильной части сурфактанта освобождается, приводя к увеличению объема полярной головы, а ниже того значения рН водородные связи могут образовывать между карбоксилатами и водородом протонированного третичного амина, приводя к уменьшению в объеме НТА головы амфифильного ΙΙ-4.

Самоагрегированную и полимеризованную мицеллу амфифильного ΙΙ-4 готовят в соответствии со схемой 4 излучением светом с длиной волны 254 нм водного раствора ΙΙ-4 при рН 12 на протяжении 5 ч и

- 7 019804 затем рН регулируют до нормального рН диализом раствора с рН между 7 и 8 включительно. Схема 4

Замечено, что полимеризация светоизлучением амфифильного П-4, структурированного в форму мицелл, является относительно медленным процессом, и преобразование целых амфифильных молекул П-4 в полидиацетилен должно достигаться в течение времени полимеризации больше 5 ч.

2.2. Характеристика полимеризованной мицеллы.

Анализ полимеризованной мицеллы амфифильных молекул П-4 осуществлялся путем гранулометрического анализа на лазерном анализаторе. Этот способ, который основывается на квазиупругом рассеянии света и спектроскопии взаимной корреляции фотонов, позволяет определить распределение по размерам частиц образца.

Анализ интенсивности образца полимеризованной мицеллы при 50 мг/мл прибором Ναηορίιοχ показывает главный популяционный пик около 4,9 нм. Числовой анализ образца полимеризованной мицеллы при 1 мг/мл прибором Ма1уетп ΖοΙηδίζοΓ продемонстрировал присутствие единственной популяции при 5,1 нм.

Полимеризация мицелл вызывает явление сжатия мицелл, которое может быть объяснено фактом, что полимеризация фиксирует агрегацию амфифильных молекул и ограничивает явление набухания.

Пример 3. Включение 839625 в полимеризованную мицеллу и в неполимеризованную мицеллу.

3.1. Способ включения 839625.

839625 был инкапсулирован в раствор 10 мг/мл неполимеризованную мицеллу и полимеризованную мицеллу способом перемешивания и нагревания при 50°С, как детализировано в описании и показано на фиг. 2.

3.2. Определение степени включения 839625, ВЭЖХ.

Степень включения 839625 определяли способом ВЭЖХ с обращенной фазой. Способ основывается на разнице во взаимодействии молекул между подвижной фазой и стационарной фазой. Эта разница влияет на время удерживания для этих молекул. Для данных ВЭЖХ условий одна и та же молекула всегда имеет тоже время удерживания. Условиями ВЭЖХ с обращенной фазой для определения степени включения 839625 являются колонка с силикагелем с привитыми КР-18^с для стационарной фазы и градиент воды и ацетонитрила от 5 до 100% для подвижной фазы. Детектирование 839625 при выходе из колонки осуществляли УФ-детектором при длине волны 385 нм. Калибровочная кривая для 839625 в ацетонитриле была получена обращенной ВЭЖХ. При таких условиях ВЭЖХ активный компонент 839625 имел время удерживания 25,8 мин.

Время удерживания для 839625, инкапсулированного в полимеризованную мицеллу, также было определено ВЭЖХ с обращенной фазой, для которой градиент растворителя заменили изократическим режимом чистого ацетонитрила. Ацетонитрил - один из лучших растворителей 839625, и его использование как элюента обеспечивает возможность очень быстрого выхода активного компонента и его элюирование как свободного объекта.

3.3. Результаты для степени включения 839625.

Результаты для включения 839625 вычислены, исходя из фиг. 3.

Хроматограмма 839625, включенного в неполимеризованную мицеллу, показывает три пика при

3,2, 25,8 и 31,9 мин. На основании площади пика при 25,8 мин включение активного компонента в неполимеризованную мицеллу является между 1,7 и 3,3% включительно.

Хроматограмма 839625, включенного в полимеризованную мицеллу, показывает широкий пик при очень коротком времени удерживания. Это выраженное уменьшение во времени удерживания показывает, с одной стороны, что гидрофобность 839625 в большей степени маскируется очень гидрофильной поверхностью полимеризованной мицеллы и, с другой стороны, что объединение 839625/полимеризованная мицелла является чрезвычайно крепким.

Хроматограмма 839625, растворенного в ацетонитриле, имеет пик при 5,2 мин, тогда как 839625, включенный в полимеризованную мицеллу, имеет два пика при 4,0 и 4,9 мин. Степень включения 839625 и продукты его разложения в полимеризованную мицеллу оцениваются объединением двух пиков. Уровень включения этих молекул в полимеризованную мицеллу составляет, таким образом, 48%. Для такой же концентрации амфифильной молекулы (10 мг/мл) растворимость и, таким образом, способность инкапсуляции полимеризованной мицеллы улучшаются фактором 5 взаимосвязанных наноколец и фактором 13 взаимосвязанных полимеризованных мицелл.

Пример 4. Включение гидрофобных активных компонентов в полимеризованную мицеллу.

Тесты на включение осуществлялись на гидрофобных активных компонентах 842909 и 844563, на паклитакселе, сравнительной гидрофобной активной молекуле, и на пирене, очень гидрофобной молеку

- 8 019804 ле. Химическая формула этих гидрофобных активных компонентов показана на фиг. 5.

Включение этих активных компонентов было осуществлено, используя растворы полимеризованной мицеллы при 10 мг/мл способом нагревания при 50°С на протяжении 12 ч.

Все результаты в табл. 1 показывают значительное включение гидрофобных молекул в полимеризованной мицелле, со степенями включения больше чем 24% и увеличением растворимости активных компонентов в воде 30000-500000.

Таблица 1

Молекула активного компонента	Молекулярная масса (г/моль)	Растворимость молекулы в воде (в мкг/мл)	Степень включения по массе’ . . (в%>	Молярная степень включения⁵(в %)	Число молекул на мицеллу	Растворимость в воде (в мг/мл)
5 39625	430	0.09	48	56	125	9.00
5 44563	912	2.00	45	36	56	8.30
3 42909	462	0.20	24	29	42	3.15
Паклитаксел	853	0.40	31	25	33	4.55
Пирен	202	0.01	34	63	167	5.25

^г Массовое соотношение (в %) между лекарственным средством и лекарственным средством + носитель х

100 в препарате после лечения.

^д Молярное соотношение (в %) между лекарственным средством и лекарственным средством + амфифильная молекула ΙΙ-4 х 100 в препарате после лечения.

¹¹ Молярное соотношение между лекарственным средством и лекарственным средством + амфифильная молекула ΙΙ-4 х число амфифильных молекул/мицелла (100 молекул).

Пример 5. Функционализация полимеризованной мицеллы.

5.1. Функционализация 4-амино-3-гидроксинафталинсульфонатом.

Полимеризованная мицелла функционализирована гидрофильным флуорофором, 4-амино-3-гидроксинафталинсульфонатом, изображенным на фиг. 6. Этот флуорофор имеет длину волны возбуждения 340 нм и длину волны эмиссии 455 нм.

Присоединение флуорофора осуществляется пептидным связыванием в воде при основном рН (рН 12), используя дициклогексилкарбодиимид (ДЦК) как связывающий агент. Это привитие было осуществлено в большем избытке флуорофора (50 экв.) и связывающего агента (100 экв.), и образцы были очищены посредством эксклюзионной колонки.

Функционализация полимеризованной мицеллы сопровождалась флуоресцентной спектроскопией для того, чтобы обнаружить привитие флуорофора на поверхность нановектора. Флуоресцентный спектр функционализированной полимеризованной мицеллы показывает изменение флуоресцентного пика 4-амино-3-гидроксинафталинсульфоната с батохромным флуоресцентным смещением при 492 нм (фиг. 7). Контроль демонстрирует, что флуоресцентное смещение полимеризованной мицеллы в действительности происходит в связи с ковалентным привитием флуорофора на поверхность нановектора.

5.2. Функционализация фолиевой кислотой.

Поскольку рецептор фолата резко выражен на поверхности раковых клеток, фолиевая кислота очень широко используется для особого направления канцерогенных клеток мозга, почек, груди, яичников, легких.

Для того чтобы осуществить этап связывания фолиевой кислоты с полимеризованной мицеллой, фолиевая кислота была модифицирована для того, чтобы ввести функцию амина, позволяющую прививание. Связывание аминопроизводой фолиевой кислоты ΙΙΙ-9 с поверхностью полимеризованной мицеллы осуществляется пептидным связыванием в воде при щелочном рН (рН 12), используя ДЦК как связывающего агента. Это привитие осуществляли в большем избытке аминопроизводной фолиевой кислоты (50 экв.) и связывающего агента (100 экв.). Образец был очищен фильтрацией и потом посредством эксклюзионной колонки.

Абсорбционный спектр на фиг. 8 показывает, что аминопроизводное фолиевой кислоты ΙΙΙ-9 действительно присутствует на поверхности полимеризованной мицеллы посредством факта присутствия пика при 285 нм. Флуоресцентный спектр функционализированной полимеризованной мицеллы показывает изменение флуоресцентных пиков аминопроизводной фолиевой кислоты при 360 и 450 нм.

5.3. Функционализация ПЕГ.

Скрытый фагоцитоз мицелл нанометрического размера соответственно изобретению макрофагами может быть избегнут привитием цепей ПЕГ, или полиэтиленгликоля, на эти мицеллы. Присутствие ПЕГ на поверхности мицелл создает инертный внешний слой, предупреждающий адгезию опсонинов, вследствие этого обеспечивая вышесказанным мицеллам свойства малозаметности в отношении макрофагов и, таким образом, увеличение скорость их циркуляции в кровяном депо.

Связывание метоксиПЕГ-амина 5000 поверхностью полимеризованной мицеллы осуществляется при рН 12, используя ДЦК как связывающего агента. Это привитие осуществляли в большем избытке ПЕГ производной (25 экв.) и связывающего агента (100 экв.). Мицеллы, образующие производные, очищали фильтрацией посредством эксклюзионной колонки.

- 9 019804

Пример 6. Токсикологическое исследование полимеризованной мицеллы.

Распределение полимеризованной мицеллы внутри тела является очень важным параметром тестирования для того, чтобы определить способ экскреции и способ накопления вышесказанных мицелл.

Для того чтобы осуществить это исследование, амфифильные молекулы П-4 помечали радиоизотопом углерода 14, таким образом, как синтезируют меченную радиоизотопом полимеризованную мицеллу для последующего авторадиографического исследования на крысе. Амфифильную молекулу, меченную радиоизотопом углерод 14, получали с удельной активностью 7,6 мкКи/мг.

Введение полимеризованной мицеллы крысе осуществляли при дозе 4 МБк/кг и 100 мг/кг для объема введения 2,5 мл/кг. Для этого необходимо 40 мг/мл раствора с удельной активностью 7,6 мкКи/мг.

Исследование накопления/выведения полимеризованной мицеллы меченных радиоизотопом углерода 14 было осуществлено на 3 самцах крысы типа ^181аг. Единичная доза 100 мг/кг полимеризованной мицеллы [¹⁴С] была введена внутривенным путем (болюс) каждой из крыс, и животные были умерщвлены через 10 мин, 24 и 48 ч. Моча 24- и 48-часовой крыс была собрана, для того, чтобы измерять её активность жидкостной сцинтилляцией. Количественное определение уровней радиоактивности в мягких тканях было осуществлено радиолюминографией определенных частей крыс, полученных криомикротомией.

Анализ радиолюминограмм 10-минутной крысы, т.е. крысы, умерщвленной через 10 мин, показывает обобщенное распределение радиоактивности в теле крысы из-за высокой концентрации полимеризованной мицеллы в крови. Высокие уровни радиоактивности были обнаружены в определенных тканях, таких как легкие, почки и их медулярное вещество, печень, надпочечники или селезенка.

Анализ радиолюминограмм 24- и 48-часовых крыс, т.е. крыс, умерщвленных через 24 и 48 ч соответственно, показывает высокую концентрацию радиоактивности в печени, стенке кишечника, селезенке, надпочечниках, почках и костном мозге.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полимеризованная мицелла, отличающаяся тем, что содержит полимеризованные амфифильные молекулы, полученные из амфифильных молекул общей формулы

А—X—В—Ь—Ζ в которой А представляет собой ^СНГ<^СН2>~^С=^С_С=С—(Си₂)—, или СН₂=СН-, или СН₂=СН-С₆Н₄-, η и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

X представляет собой СО-ИН, или ИН-СО, или связь, X означает связь, если В означает связь и Ь означает связь;

В представляет собой (^сн2>;г^с~^с_с—(Сн₂)—, или СН=СН-С₆Н₄-, или связь, η и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

Ь представляет собой -(СН₂)_Г-СН[ИН-СО-А']- или связь, г является целым числом от 1 до 16 и А' представляет собой А;

_хсн,-к, _хсн,-к, —СОЫН-(СН₂)₅-СН-Ы_ч —МНСО-(СН_г)—сн-\ ό СН -К о сн к

Ζ представляет собой ^К1 ²' ² или “ι ^{2_ 2}, 8 является целым числом от 1 до 16, К₂ представляет собой СООН, или 8О₃Н, или О8О₃Н, или ОРО₃Н₂, или ОРО₂Н₂, Κι представляет собой Н, или радикал СООН, или 8О₃Н. или О8О₃Н, или ОРО₃Н₂, или ОРО₂Н₂, или группу -СО-МН-(СН2)гСИ₃, ₍ является целым числом от 1 до 16; или

Ζ может также быть нейтральной гидрофильной полярной головой сахарного или полисахаридного типа, а также их соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием.
2. Полимеризованная мицелла по п.1, отличающаяся тем, что содержит полимеризованные амфифильные молекулы, полученные из амфифильных молекул общей формулы

А—X—В—Ι_—Ζ в которой А представляет собой ^снг(^снг)~^с=с_ С=С—(СН₂)„— η и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

X представляет собой СО-ИН, или ИН-СО, или связь, X означает связь, если В означает связь и Ь означает связь;

В представляет собой (^СН ₂)~^{С=:С—с=с_}(^снг)~ или связь, η и т, которые могут быть одинаковыми или разными, являются целыми числами от 1 до 16;

Ь представляет собой -(СН₂)_Г-СН[ИН-СО-А']- или связь, г является целым числом от 1 до 16 и А' представляет собой А, или СН₂=СН-, или СН₂=СН-С₆Н₄-;

.СН,-СООН _хсн₂-к₂ —ΝΗΟΟ-(ΟΗ₂)₅-ΟΗ-Ν_λ —νηοο-(Θη₂)—сн-\

1*4-4 Д СН К

Ζ представляет собой ^Р1 или ^κι ^г’ ², 5 является целым числом от 1 до 16, Κ| представляет собой Н, или радикал СООН, или группу -СО-ИН-(СН₂)₁-СН₃, ΐ является целым числом от 1 до 16; или

- 10 019804

Ζ может также быть нейтральной гидрофильной полярной головой сахарного или полисахаридного типа, и также их соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием.
3. Полимеризованная мицелла по одному из пп.1, 2, отличающаяся тем, что полярная голова Ζ является функционализированной.
4. Полимеризованная мицелла по п.3, отличающаяся тем, что полярная голова Ζ является функционализированной фолиевой кислотой.
5. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что включает одно или несколько гидрофобных соединений.
6. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полимеризованные фифильные молекулы получены из амфифильных молекул формулы ам-
7. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полимеризованные фифильные молекулы получены из амфифильных молекул формулы ам- ам
8. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полимеризованные фифильные молекулы получены из амфифильных молекул формулы
9. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полимеризованные фифильные молекулы получены из амфифильных молекул формулы ам-
10. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полимеризованные амфифильные молекулы получены из амфифильных молекул формулы
11. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полимеризованные амфифильные молекулы получены из амфифильных молекул формулы

- 11 019804
12. Полимеризованная мицелла по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полимеризованные амфифильные молекулы получены из амфифильных молекул формулы
13. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит полимеризованную мицеллу по любому из пп.1-12.
14. Композиция по п.13, отличающаяся тем, что она содержит один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.
15. Применение полимеризованной мицеллы по любому из пп.1-12 в качестве вектора гидрофобных молекул.
16. Применение полимеризованной мицеллы по п.15, отличающееся тем, что гидрофобными молекулами являются гидрофобные активные компоненты.
17. Способ получения полимеризованной мицеллы по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что включает следующие стадии:

самоагрегирование амфифильных молекул, которые полимеризуют в сферические мицеллы и которые определены в любом из пп.1-12;

полимеризация самоагрегированных сферических мицелл.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что самоагрегированные сферические мицеллы фотополимеризуют.
19. Способ по п.17, отличающийся тем, что самоагрегированные сферические мицеллы полимеризуют свободнорадикальной полимеризацией.