PT2215265E

PT2215265E - Método para ajustamento de resultados de um instrumento de reacção em cadeia de polimerase (pcr)

Info

Publication number: PT2215265E
Application number: PT88489331T
Authority: PT
Inventors: Justin M Paul; Burton D Beames
Original assignee: Grifols Therapeutics Inc
Priority date: 2007-11-14
Filing date: 2008-11-11
Publication date: 2013-08-05
Also published as: PL2215265T3; WO2009064717A3; ES2424759T3; WO2009064717A2; US8560246B2; EP2215265A4; HK1147287A1; US20110004411A1; EP2215265B1; EP2215265A2

Description

ΡΕ2215265 1

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA AJUSTAMENTO DE RESULTADOS DE UM INSTRUMENTO DE REACÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)"

ÁREA TÉCNICA A presente invenção relaciona-se, na generalidade, com instrumentos para reacção em cadeia de polimerase (PCR). Mais particularmente, a invenção relaciona-se com métodos de verificação ou ajustamento de resultados de aplicações de detecção de sequências (SDS) utilizados em instrumentos de PCR.

ANTECEDENTES

Os sistemas em tempo real de reacção em cadeia de polimerase (PCR) são utilizados para amplificar uma amostra, como um filamento de DNA, de modo a tornar mais fácil detectar ou identificar a sequência da amostra. Os dispositivos de PCR em tempo real utilizam uma aplicação de detecção de sequências (SDS) para analisar e processar os resultados dos testes de PCR. Contudo, em alguns casos, a SDS não é capaz de detectar as amostras com exactidão, o que pode resultar numa identificação inexacta da existência ou concentração de algumas sequências. Por exemplo, quando é analisada uma amostra de plasma sanguíneo, utilizando 2 ΡΕ2215265 alguns sistemas Applied Biosystems PCR, ou outros sistemas utilizandos SDS relacionados, o sistema pode por vezes falhar na detecção de uma concentração elevada de um virus, como, por exemplo, o parvovirus B19. Consequentemente, os sistemas actuais podem não reconhecer uma amostra de plasma contendo um elevado titulo desses vírus, que contaminariam um lote de plasma, provocando uma perda significativa de plasma.

Assim, existe uma necessidade, com a técnica actual, de resolução desta e outras deficiências nos sistemas e métodos convencionais. Os melhoramentos nos sistemas e métodos convencionais, como aqui descrito, são capazes de ultrapassar estas e outras limitações da técnica anterior. A EP1518935 revela a utilização de correcção da linha de base para melhorar a quantificação de ácidos nucleicos numa amostra.

SUMÁRIO 0 presente texto descreve métodos para gestão dos resultados de intrumentos de reacção em cadeia de polime-rase (PCR) em tempo real. De acordo com uma realização entre muitas, o método aqui revelado compreende o cálculo, apartir dos resultados do instrumento de PCR em tempo real, de um sinal de fluorecência de uma amostra durante o período de linha de base do instrumento de PCR em tempo 3 ΡΕ2215265 real. 0 método também inclui a determinação se o sinal de fluorescência durante o período de linha de base aumenta ou não, pelo menos numa certa percentagem. 0 método também inclui a marcação da amostra como uma amostra de potencial título elevado, quando o sinal de fluorescência aumenta pelo menos numa certa percentagem.

De acordo com outra realização, é descrito um método para testar uma amostra de sangue, compreendendo a quantificação de ácido nucleico virai numa amostra de sangue, utilizando um instrimento de reacção em cadeia de polimerase em tempo real (rtPCR), por modificação da interpretação dos dados, de modo a que as amostras com títulos mais elevados não sejam mal interpretadas. É calculado um sinal de fluorescência a partir dos resultados de PCR, proporcionados durante o período de linha de base. Também é determinado se o sinal de fluorescência aumenta por, pelo menos, uma percentagem prederterminada, durante o período de linha de base. 0 método também inclui a marcação da amostra de sangue como amostra de titulo potencialmente elevado, quando o sinal de fluorescência aumenta em, pelo menos, a percentagem predeterminada. A presente revelação também descreve software ou firmware de computador, programas de computador, aplicações de códigos de sequenciação e outros do mesmo tipo, incorporados num meio legível por computadores e executáveis por um mecanismo de processamento. De acordo com uma realização, uma aplicação de código de sequenciação inclui 4 ΡΕ2215265 uma configuração lógica para calcular um sinal de fluorescência de uma amostra durante o período de linha de base dos ciclos de teste de um instrumento de reacção em cadeia de polimerase (PCR). A aplicação de código de se-quenciação também inclui configuração lógica para determinar se o sinal de fluorescência durante a linha de base, não aumenta ou aumenta, pelo menos, numa certa percentagem. A aplicação de código de sequenciação inclui configuração lógica para marcar a amostra como amostra com título elevado potencial, quando o sinal de fluorexcência aumenta, pelo menos, numa certa percentagem.

Outras características, vantagens e implementos da presente revelação, não expressamente revelados aqui, torner-se-ão aparentes para os técnicos da matéria, pelo exame da descrição detalhada que se segue e dos desenhos que a acompanham. Pretende-se que tais melhorias implicadas na presente descrição sejam nela incluídas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é um diagrama de fluxo descrevendo um processo para ajustamento de dados procedentes de um dispositivo de PCR, de acordo com uma das realizações. A FIG. 2 1 é um diagrama de fluxo descrevendo um processo para cálculo do início do ciclo, de acordo com uma das realizações. 5 ΡΕ2215265

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os dispositivos/sistemas correntemente utilizados para processar e interpretar dados de reacções em cadeia de polimerase (PCR), podem identificar incorrectamente as concentrações de alguns ácidos nucleicos em amostras. Este problema pode ser causado pelo modo como os resultados dos testes PCR são processados pela aplicação de detecção de sequências (SDS) associado à análise por PCR. Por exemplo, alguns sistemas de PCR, tais como muitos dos sistemas Applied Biosystems Real-Time PCR, utilizam SDS que pode falhar na detecção axacta de amostras de plasma sanguíneo contendo elevadas concentrações de vírus, e.g., parvovirus B19. Devido ao modo como a fluorescência é detectada, é possível que uma amostra de plasma sanguíneo contendo títulos elevados de vírus possam ser classificados como estando limpas. Foi, particularmente, observado que os níveis de fluorescência durante um período de linha de base são elevados, de modo que quando os níveis de fluorescência da amostra são comparados com os da linha de base, parece não existir aumento significativo acima de um valor limite que indica a concentração de um virus. Consequentemente, é necessária uma modificação para ultrapassar as deficiências do software e afastar os resultados erráticos de identificação correcta de um virus, se existir algum, numa amostra de plasma. 0 presente texto descreve métodos para detecção de elevadas concentrações de ácido nucleico, que são 6 ΡΕ2215265 amplificadas utilizando instrumentos convencionais de PCR. Os ácidos nucleicos podem ser detectados utilizando, por exemplo, uma sonda fluorogénica, como uma sonda TaqMan®. Em presença da sequência alvo de ácido nucleico, a sonda é hidrolisada durante cada ciclo de PCR, e é medido um aumento de fluorescência. 0 SDS pode utilizar um algoritmo para separar a fluorescência em diversos comprimentos de onda específicos dos corantes fluorescentes. Os primeiros ciclos de PCR, e.g., ciclos 3 a 15, podem ser especi-ficamente regulados por um utilizados para estabelecer valores a partir dos quais é determinado um nível de base de fluorescência. 0 utilizador também define um valor limiar atribuído a cada ciclo, que reflete um certo nível de fluorescência, superior ao valor de base calculado. 0 ciclo de base (CT) indica o número do ciclo de PCR durante o qual a fluorescência gerada numa reacção, excede o valor o limiar e também indica a detecção de ácido nucleico. Contudo, deve notar-se que as amostras com elevada concentração de ácido nucleico tendem a amplificar durante o período de linha de base. Assim, o SDS de alguns sistemas convencionais de PCR lêm esta fluorescência como fundo e interpretam incorrectamente estas amostras com elevada concentração como amostras negativas para o ácido nucleico visado quando, na realidade, pode existir uma elevada concentração da sequência alvo. Os métodos da presente revelação compensam estes resultados inexactos, proporcionando mais exactidão, se necessário, ou para verificação da precisão de resultados anteriores. 7 ΡΕ2215265

Esta descrição lógica resolve pelo menos duas das limitações no SDS dos sistemas convencionais. Primeiro, o SDS defeituoso é incapaz de detectar adequadamente amostras contendo um titulo elevado de ácidos nucleicos, que são tipicamente amplificadas durante o período de linha de base. Dado que uma grande percentagem de amplificação ocorre durante o período de linha de base, um aumento na fluorescência de uma amostra é comparado com um valor limite que foi inadequadamente elevado acima do nível elevado de linha de base. Como resultado, o SDS defeituoso identifica incorrectamente a amostra como negativa. A segunda imperfeição nos sistemas SDS convencionais consiste em os ficheiros de dados, que contêm os dados de fluorescência para detecção de um aumento, não conterem informação de identificação embebida. Como resultado, um ficheiro de dados pode ser incorrectamente emparelhado com uma amostra diferente. Assim, quaisquer comparações utilizando o ficheiro de dados não corresponderiam ao conjunto de resultados correcto.

Num aspecto da presente invenção, os dados de fluorescência são analisados para se verificar se ocorreu pelo menos uma certa percentagem de aumento na fluorescência normalizada, ao longo da linha de base. Os resultados possuindo um aumento que não exceda esta certa percentagem podem ser considerados como sendo aceitáveis. Como exemplo, a percentagem pode ser regulada para cerca de 2 0%, de modo que qualquer amostra que exiba um aumento de 20% ou superior é marcada como uma amostra potencialmente ΡΕ2215265 com título elevado. Além disso, os valores de CT são calculados a partir dos resultados e comparados com os valores originalmente calculados pelo SDS. Uma discrepância entre os cálculos indica um erro potencial no emparelhamento dos dados do ficheiro com os seus resultados ou pode indicar um erro instrumental. 0 sistema de PCR tipicamente obtém leituras de fluorescência em cada ciclo PCR, para cada amostra de teste. Um ficheiro do conjunto armazena as leituras de fluorescência separadas pelos seus corantes fluorescentes componentes - FAM, JOE e ROX - em cada ciclo de PCR, onde FAM e JOE são corantes indicados e ROX é um corante passivo de referência. Neste exemplo, o alvo virai é o parvovirus B19. FAM representaria o alvo virai e JOE representaria o alvo de controlo interno (IC).

Um algoritmo, de acordo com uma implementação, envolve o cálculo de um sinal normalizado de informação (Rn) . 0 Rn, em cada ciclo, c, é calculado como a fluorescência indicada do corante dividida pela referência passida da fluorescência do corante. Para o alvo virai:

-ϋϋ. eq. 1 ROX, e para o alvo de controlo interno (IC): eq. 2

JOEc ROX/ 9 ΡΕ2215265

Qualquer amostra gerando um aumento de pelo menos 20% no alvo virai Rn(V), a partir do ciclo 3 de PCR e até ao ciclo 15, é marcado como amostra potencialmente com titulo elevado. Se for este o caso, então o algoritmo utiliza as equações que se seguem para calcular os valores de CT. Contudo, primeira é calculada a fluorescência de base utilizando a regressão linear de Rn sobre a linha de base, que é definido como de 3 a 15 para o alvo virai e de 3 a 27 para o alvo IC. Para o alvo virai: o declive m tm

eq. 3 e a intercepção eq. 4 eq. 5 bPAM=RÍÍvX-(mFA„«)

Para o alvo IC: o declive xVcSMicx -¾¾) ç=u. ............

e a intercepção 10 ΡΕ2215265 biOE =Rnftc)0~(ffiJOgXo) eq.6 em que x representa a média de x ao longo do intervalo da linha de base.

Calcula-se depois delta Rn (dRn) como a diferença entre o Rn e a fluorecência da linha de base em cada ciclo. Para o alvo virai: dMvX-RntVk-K^xcPb™ eq· 1 e para o IC alvo: <ma(lCl=Rn(lC)t-(mJ0Exc)-b10E eq· 8 O algoritmo calcula depois o declive e segmento linear de dRn entre cada ciclo, iniciando no ciclo 2. Para o ciclo anterior de alvo virai, o declive

eq. 9 <JRn(v)c -dRn(V)e., c-(c-l) e a intercepçao b(v)c = dRa(v), -(ra(v)c xc). eq. 10

Para o ciclo anterior de alvo IC, o declive 11 ΡΕ2215265 r% dRn(lC)c - dRn(lC)e„t eq. 11 m(IC)e» c ~ (c ~ i) e a intercepção b{ic)c = dRn(lC)c -(m(ic)t xe). eq.12 0 ciclo inicial CT é calculado como o ciclo fraccional a que o dRn cruza um valor limiar. Por exemplo, o valor limiar para o alvo virai pode ser 0,1 e o valor limiar para o alvo IC pode ser 0,02. Para o alvo virai, se dRn(V)c>0,l e dRn (V) c_i<0,1: então c,(v) 0.1-b(V), m(v) eq. 13

Para o alvo IC, se dRn (IC) c>0, 02 e dRn(IC)ci<0,02, então CT(IC)- 0.02 - b(lC)c m(l€)c eq. 14

Os valores calculados para CT são arredondados para duas casas decimais e depois comparados com os valoress dos resultados de PCR. A comparação é utilizada para determinar se o ficheiro componente está ou não 12 ΡΕ2215265 emparelhado com o ficheiro de resultados e assim, originário da mesma sequência de ensaio. A FIG. 1 é um diagrama de fluxo ilustrando uma realização de um método para gestão de resultados de SDS convencional. 0 método da FIG. 1 é capaz de ultapassar as deficiências dos resultados faltosos de SDS. 0 método inclui a recepção dos ficheiros de dados, como indicado no bloco 10. Os ficheiros de dados podem ser recebidos, por exemplo, a partir de um SDS ou sistema de PCR ou a partir de outros sistemas de processamento e/ou armazenamento de dados associado com análise PCR. No bloco 12 é calculado um sinal fluorescente Rn durante um período de linha de base, que pode, por exemplo, incluir os ciclos 3 a 15 do teste de PCR. Em algumas realizações, o sinal de fluorescência Rn pode ser um sinal indicativo normalizado de cada ciclo, calculado por divisão da fluorescência de um corante indicativo pela fluorescência de um corante passivo de referência.

No bloco 14 são calculados os valores do ciclo inicial (CT) , a partir dos ficheiros de dados. Como descrito abaixo com maior detalhe, a FIG. 2 inclui um processo para implementar este cálculo de CT de acordo com uma realização. No bloco 16, os valores de CT calculados no bloco 14 são comparados com os valores de CT recebidos directamente do SDS. No bloco de decisão 18, é determinado se os valores comparados no bloco 16 coincidem ou não, assegurando assim a correcta identificação dos conjuntos de 13 ΡΕ2215265 resultados. Se os valores coincidem, o fluxo dirige-se para o bloco 20. No bloco 20 é dada uma indicação que os valores de Ct foram corrigidos e os novos valores calculados do CT são verificados como sendo fiáveis. Se os valores não coincidem, então o fluxo é dirigido para o bloco 22, onde é apresentada ao utilizador uma indicação de ocorrência de erro. O erro pode ser o resultado de emparelhamento impróprio dos novos valores calculados para CT com os valores de CT calculados pelo SDS. O erro pode também ser o resultado de um erro na instrumentação. Após indicação de um erro, no bloco 24, o diagrama de fluxo termina.

No bloco de decisão 24, é determinado se a fluorescência durante o período de linha de base aumenta ou não, pelo menos por uma certa percentagem, e.g., 20%, em comparação com ciclos for a do período de linha de base. Se não, é então determinado que a amostra não contém um título elevado de ácido nucleico. Neste caso, o processo inclui a verificação se os valores originais dos resultados do teste de PCR são substancialmente exactos, como indicado no bloco 26, dado que os valores originais não foram comparados para valores elevados. Quando os valores elevados são verificados no bloco 26, a rotina termina. Contudo, se for determinado no bloco de decisão 24 que o aumento de fluorescência é de, pelo menos, o valor estabelecido, então a amostra pode ser marcada como contendo um elevado título de ácido nucleico, como indicado no bloco 28. 14 ΡΕ2215265 A FIG. 2 é um diagrama de fluxo ilustrando uma realização de um método para cálculo de CT. Neste método, o bloco 30 indica que foi calculado um sinal Rn de fluorescência. Em algumas realizações, Rn é calculado por FAM/ROX. No bloco 32 é calculada uma linha de base de fluorescência, utilizando um método de regressão linear. Em realizações alternativas, podem ser utilizados outros métodos estatísticos para calcular a linha de base de fluorescência. No bloco 34 é calculada uma diferença de sinal, dRn, em gue dRn é a diferença entre o sinal de fluorescência Rn e a fluorescência da linha de base, para cada ciclo. No bloco 36 é efectuado um cálculo do declive e da intersecção da diferença de sinal dRn entre cada ciclo e o ciclo anterior. No bloco 38 é calculado o ciclo limiar CT como ciclo fraccional, ao qual a diferença de sinal dRn cruza um limiar. No bloco 40, CT é aredondado para duas casas decimais.

As operações dos métodos e processos aqui descritos podem ser incorporados em um ou mais programas de software e utilizados para processar as correcções e/ou ajustamentos aqui descritos e para gerar uma saíde de resultados mais exactos, em comparação com os valores originalmente calculados a partir de SDS tradicional. Tal programa de software pode ser utilizado para substituir uma secção de código em qualquer SDS relacionado ou desenvolvino no próprio SDS. Os programas de software podem ser utilizados nos SDS que existem actualmente ou que 15 ΡΕ2215265 possam vir a ser desenvolvidos no futuro. 0 programa de software também pode ser incorporado em qualquer sistema de análise de PCR que utilize um formato de processamento semelhante para análise de uma amostra. Em algumas realizações o programa de software pode ser incorporado em dispositivos autónomos e ligados a uma saida de um sistema convencional de PCR que proporcione os resultados potencialmente errados como descrito acima.

Além dos métodos presentemente revelados serem utilizados para correcção das saídas do SDS, o método também pode proporcionar uma indicação de quaisquer correcções efectuadas. Deste modo, os métodos podem ser utilizados para proporcionar resultados mais exactos, após processamento dos sinais como revelado. 0 software lógico para correcção ou ajustamento dos sinais pode ser armazenada num meio legível por um computador. Em algumas realizações, os métodos e operações podem ser implementadas em hardware ou software e incorporados num sistema de gestão de dados, tal como num sistema de gestão de dados laboratoriais (LIMS) e/ou incorporado num espectrómetro, tal como um espectró-metro interferómetro de infravermelhos (IRIS).

Deve tomar-se em consideração que os passos, processos ou operações dos métodos aqui descritos poem representar qualquer módulo ou sequência de código que pode ser implementada em hardware, software, firmware ou numa combinação destes. Quando implementado em software ou 16 ΡΕ2215265 firmware, os métodos podem ser armazenados em memória e executados por um dispositivo de processamento. Quando implementado em hardware, os métodos podem ser implementados utilizando, por exemplo, circuitos lógicos discretos, um circuito integrado especifico de aplicação (ASIC), um arranjo de portas programável (PGA), um arranjo de portas programável em campo (FPGA), etc., ou qualquer combinação destes. Estes módulos e sequências de códigos podem incluir comandos ou instruções para execução de passos lógicos específicos, processos ou operações nos componentes físicos.

Deve ainda ser tomado em consideração que um ou mais passos, processos e/ou operações aqui descritas podem ser executadas substancialmente em simultâneo ou numa ordem diferente da explicitamente descrita, como será comprrensível para qualquer técnico da matéria. Os programas ou código de software que incluem instruções lógicas executáveis, como aqui descrito, podem ser incorporadas em qualquer meio adequado, legível por um computador, para execução por qualquer dispositivo adequado de processamento. 0 meio legível por computador pode incluir qualquer meio físico que possa armazenar os programas ou software durante um período de tempo mensurável.

As realizações aqui descritas representam apenas implementações de exemplo e não se destinam a limitar 17 ΡΕ2215265 necessáriamente a presente revelação a quaisquer exemplos específicos. Ao invés, podem ser efectuadas diversas modificações a estas realizações, como será óbvio para um técnico da matéria.Pretende-se que quaisquer tais modificações sejam incluídas no espírito e âmbito da presente revelação e protegidas pelas reivindicações que se seguem.

Lisboa, 29 de julho de 2013

Claims

ΡΕ2215265 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para gestão de resultados em tempo real de um instrumento de reacção em cadeia de polimerase (PCR), compreendendo o método: o cálculo, em tempo real, a partir de um instrumento de PCR de um sinal de fluorescência de uma amostra, durante o período de linha de base, em tempo real, do instrumento de PCR; a determinação se o sinal de fluorescência, durante o período de linha de base, aumenta ou não em, pelo menos uma certa pergentagem; e a marcação da amostra como amostra com título potencialmente elevado quando o sinal de fluorescência aumenta pelo menos numa certa percentagem.
2. Método da reivindicação 1, em que a certa percentagem é 20%.
3. Método da reivindicação 1, compreendendo ainda: a verificação de que os valores originais de fluorescência detectados pelo software de detecção de sequências (SDS) associado com o PCR são substancialmente precisos, quando é determinado que o sinal de fluorescência durante o período de linha de base não aumenta em, pelo menos, uma certa percentagem. ΡΕ2215265 2
4. Método da reivindicação 1, compreendendo ainda: o cálculo do ciclo inicial (CT) a partir dos valores da fluorescência original, detectados pelo software de detecção de sequências (SDS) associado com o PCR; e comparação do CT com os valores do ciclo inicial pelo SDS para determinar se existe coincidência.
5. Método da reivindicação 4, compreendendo ainda a indicação do CT calculado a partir dos valores de fluorescência originais, como os valores correctos, quando existe correspondência; e a indicação da ocorrência de um erro quando não existe correspondência.
6. Método da reivindicação 4, em que o cálculo de CT compreende também: o cálculo de um sinal de fluorescência como uma relação entre FAM/ROX; o cálculo da linha de base da fluorescência utilizando um método de regressão linear; o cálculo de um sinal de diferença entre o sinal da fluorescência e a linha de base da fluorescência, em cada ciclo; o cálculo do declive e intersecção e a diferença de sinal entre cada ciclo e o ciclo anterior; e 3 ΡΕ2215265 cálculo de CT como ciclo fraccional em que a diferença de sinal ultrapassa um limiar.
7. Método para testar uma amostra de sangue, compreendendo o método: a quantificação de uma amostra de sangue em tempo real a partir de um instrumento de reacção em cadeia de polimerase(PCR), para proporcionar resultados de PCR; o cálculo de um sinal de fluorescência a partir dos resultados de PCR proporcionados durante um período de linha de base; a determinação se o sinal de fluorescência aumenta ou não por pelo menos uma percentagem predeterminada, durante o período de linha de base; e a marcação da amostra de sangue como amostra potencialmente com título elevado quando o sinal de fluorescência aumenta pelo menos pelo valor predeterminado.
8. Método da reivindicação 7, compreendendo ainda: a verificação que os resultados de PCR são substancialmente exactos, quando se determina que o sinal de fluorescência durante o período de linha de base não aumenta em, pelo menos, a percentagem predeterminada.
9. Método da reivindicação 7, compreendendo ainda: 4 ΡΕ2215265 o cálculo do ciclo de base (CT) a partir dos resultados de PCR; e a comparação do CT com os valores do ciclo de base, detectados pelo software de detecção de sequência (SDS) associado ao PCR, para determinar se existe coincidência .
10. Método da reivindicação 9, compreendendo ainda a indicação do valor CT calculado a partir dos resultados de PCR como os valores correctos, quando existe coincidência; e a indicação de ocorrência de um erro quando não existe coincidência.
11. Método da reivindicação 9, em que o cálculo de CT compreende também: o cálculo de uma fluorescência de linha de base utilizando um método de regressão linear; o cálculo de uma diferença de sinal entre o sinal de fluorescência e a fluorescência da linha de base, em cada ciclo; o cálculo do declive e intercepção da diferença de sinal entre cada ciclo e o ciclo anterior; e o cálculo de CT como o ciclo fraccional em que o sinal da diferença cruza um limiar. 5 ΡΕ2215265
12. Meio legível por computador, incorporando uma sequência de código de software que é executável por um dispositivo de processamento, compreendendo a sequência de código de software: a configuração lógica para cálculo de um sinal de fluorescência de uma amostra, durante um período de linha de base de ciclos de testes de um instrumento de reacção em cadeia de polimerase (PCR); a configuração lógica para determinar se o sinal de fluorescência durante o período de linha de base, aumenta ou não, pelo menos numa determinada percentagem; e a configuração lógica para marcar a amostra como amostra potencialmente com título elevado, quando o sinal de fluorescência aumenta, pelo menos numa determinada percentagem.
13. Meio legível por computador da reivindicação 12, em que a certa percentagem é 20%.
14. Meio legível por computador da reivindicação 12, em que a sequência de código de software inclui também: a configuração lógica para verificar que os valores de fluorescência originais, detectados pelo software de detecção de sequências (SDS) associado ao PCR, são substancialmente precisos quando é determinado que o 6 ΡΕ2215265 sinal de fluorescência durante o período de linha de base não aumenta em, pelo menos, uma certa percentagem.
15. Meio legível por computador da reivindicação 12, em que a sequência de código de detecção também compreende : a configuração lógica para cálculo do ciclo base (CT) a partir dos valores originais de fluorescência detec-tados pelo software de detecção de seuências (SDS) associado ao PCR; e a configuração lógica para comparação do CT com os valores do ciclo básico detectados pelo SDS para determinar se existe uma coincidência.
16. Meio legível por computador da reivindicação 15, em que a sequência de código de detecção também compreende : a configuração lógica para indicar o valor de CT calculado a partir dos valores originais de fluorescência como os valores correctos, quando existe coincidência; e a configuração lógica para indicar a ocorrência de um erro quando não existe coincidência.
17. Meio legível por computador da reivindicação 15, em que a configuração lógica para cálculo do CT, é também configurada para: 7 ΡΕ2215265 calcular um sinal de fluorescência; calcular a linha de base da fluorescência, utilizando um método de regressão linear; calcular uma diferença de sinal entre o sinal de fluorescência e o sinal de fluorescência da linha de base, em cada ciclo; calcular o declive e intersecção da diferença de sinal entre cada ciclo e o ciclo anterior; e calcular o CT como ciclo fraccional em que o sinal de diferença ultrapassa um limiar.
18. Meio legível por computador da reivindicação 12, em que a sequência de código de software está incorporada no software de detecção de sequências.
19. Meio legível por computador da reivindicação 12, em que a sequência de código de software está incorporada num dispositivo autónomo configurado para receber os resultados de PCR a partir de um software de detecção de sequências associado com o PCR. Lisboa, 29 de julho de 2013