CN114550826A - 一种实时荧光定量pcr的数据分析系统及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实时荧光定量PCR的数据分析系统及其方法，包括：管理服务器，预约系统，运维系统，多个实时荧光定量PCR设备；多个实时荧光定量PCR设备、预约系统、运维系统分别与管理服务器通信连接；实时荧光定量PCR设备包括中央处理模块，荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块；其中中央处理模块分别与荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块通过数据总线进行通信连接。本发明能够实现实时荧光定量PCR设备的高效预约、维护管理，还能够对荧光强度数据进行自检测，自动判断是否需要校正荧光数据，从而获取更加准确的荧光数据，提高了试验的效率和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及实时荧光定量PCR检测技术领域，尤其涉及一种实时荧光定量PCR的数据分析系统及其方法。
背景技术
实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR)检测技术是在聚合酶链式反应检测技术(PCR)的基础上发展而来的核酸定量技术，其在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号来反应PCR的过程，从而获取扩增曲线。区别于普通PCR技术只能在试验终点才获取数据，实时荧光定量PCR能够在整个核酸扩增过程中实时采集数据，通过对扩增曲线进行处理分析获取Ct值等参数，能够准确且高效地进行数据分析。实时荧光定量PCR技术的常用方法有Taqman探针法和Sybrgreen染料法。
实时荧光定量PCR设备的主要部件包括温度控制系统和荧光检测系统，其中温度控制系统实现温度循环的精准控制，提供不同反应阶段所需的温度环境。荧光检测系统实时采集试验过程中的荧光数据，通过荧光强度表征核酸复制的情况。而在设备的实际使用过程中，时长会出现设备异常导致荧光数据误差，而无法获取正确的扩增曲线，无法生成可信的分析结果，从而导致必须重新试验。但是通常PCR试验耗时很长，这样就浪费了宝贵的科研时间。
目前在设备的实际使用过程中，为了保证实时荧光定量PCR设备的准确性，需要定期进行人工校正和运维，但是定期人工校正具有其局限性。首先，定时校正的周期难以确定，若周期设置太短，则校正过于频繁，费时费力，且校正所需要的校正器件通常价格不菲。若周期设置太长，则难以保证实时荧光定量PCR设备的试验准确性，很可能在两次校正期间，设备的准确度已经大大降低，若试验人员仍然进行试验，则可能得到无效的数据，甚至错误的结果。
现有专利文献中也提出了对试验中的荧光数据进行校正的方法，例如文献CN111593098B提出一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，消除反应、加温、信号采集等对原始数据的影响，计算出待测样品的Ct值和浓度。但是该文献对所采集的全部荧光数据均进行校准处理，不具备差异性。因为正常情况下的正常数据无需校正，而在设备严重异常情况下的数据即使校正也无法得到可信的分析结果。对全部数据都进行校正也会大大增加运算负荷。例如文献CN111707646B提出一种PCR仪的光路校准方法、装置及PCR仪，可以对PCR仪的多个孔位进行校准，以减小不同孔位对应的光路间的差异，提高检测结果的精准性。但是，该文献是基于样品板进行校准的，需要获取不掺杂染料的多连管的本底信号和掺杂染料的多连管的染料信号来计算校准系数，需要借助额外的硬件设备，且需要人工操作的步骤比较复杂，并不能实现自动检测和数据自校正。
同时，实时荧光定量PCR设备价格昂贵，通常实验室中的设备数量有限，但是PCR试验的试验耗时较长、试验需求量大，所以带来了设备使用冲突、难以管理的问题。因此，需要一种能够方便管理实时荧光定量PCR设备、方便试验人员高效安排试验时间的系统和方法。
并且，如果出现实时荧光定量PCR设备的异常情况，目前通常都需要通知运维人员达到现场进行处理，但是运维人员通常不能快速及时地达到现场，如果每次出现异常情况都等待运维人员，则会浪费时间，延误进度。而实际上有些实时荧光定量PCR设备异常情况，试验人员就可以处理，而无需专业运维人员。因此，亟需一种高效可靠的荧光定量PCR设备维护管理系统和方法。
发明内容
发明目的：针对以上问题，本发明提出一种实时荧光定量PCR的数据分析系统及其方法。
技术方案：
第一方面，本发明提出一种实时荧光定量PCR的数据分析系统，包括：
管理服务器，预约系统，运维系统，多个实时荧光定量PCR设备；
其中，多个实时荧光定量PCR设备均与管理服务器通信连接；预约系统、运维系统分别与管理服务器通信连接；
优选地，实时荧光定量PCR设备包括中央处理模块，荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块；
其中中央处理模块分别与荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块通过数据总线进行通信连接；
所述荧光检测模块用于实时采集荧光信号；
所述温度循环模块用于控制扩增试验过程中的温度循环；
所述数据校正模块用于对实时采集到的荧光信号进行校正处理；
所述报警显示模块用于指示人员进行设备校正和维护。
优选地，所述预约系统包括多个第一客户端；
试验人员通过第一客户端登录管理服务器，进入预约操作系统，查询未被预约的实时荧光定量PCR设备，选择设备、选定试验时间段；
管理服务器将已被预约的实时荧光定量PCR设备进行标记。
优选地，所述运维系统包括多个第二客户端，
其中第二客户端为运维人员携带的便携式移动终端；
当实时荧光定量PCR设备出现异常时，通过实时荧光定量PCR设备中的报警显示模块发送报警信息至管理服务器，管理服务器根据报警信息解析设备异常类型，根据设备异常类型的不同发送运维指令至第二客户端，或者发送校正指令至第一客户端；
运维人员根据运维指令对实时荧光定量PCR设备进行设备维护；
试验人员根据校正指令对实时荧光定量PCR设备进行校正。
优选地，所述试验人员根据校正指令对实时荧光定量PCR设备进行校正，包括：ROI校正、背景校正、荧光校正和/或温度校正。
优选地，所述管理服务器为云服务器；管理服务器还包括趋势预测模块，用于根据实时荧光定量PCR设备的连续多次试验数据预测设备异常。
第二方面，本发明还提供了一种实时荧光定量PCR的数据分析方法，包括：
步骤(1)、试验准备，包括：
对样品进行预处理；对实时荧光定量PCR设备进行初始化；将样品置入实时荧光定量PCR设备的M×N个孔槽中；
步骤(2)、开启荧光检测模块检测初始荧光强度，包括：
采集并获取预处理后的第一荧光数据集合A＝{a1，a2，…，aM×N}，其中a1，a2，…，aM×N为每个孔槽的第一荧光数据；中央处理模块对第一荧光数据集合A进行分析计算，获取标准差参数σ与均值参数μ，其中
步骤(3)、判断第一荧光数据的标准差参数σ的数值范围，包括：
若标准差参数σ处于第一区间，则进入步骤(4)；
若标准差参数σ处于第二区间，则进入步骤(5)；
步骤(4)、判断第一荧光数据的均值参数μ的数值范围，包括：
若均值参数μ处于第一范围，则判定无需对试验数据进行校正，令校正系数K＝0，进入步骤(7)；
若均值参数μ处于第二范围，则判定需要对扩增试验中实时采集的荧光数据进行自校正处理，进入步骤(6)计算校正系数K的值；
若均值参数μ处于第三范围，则判定试验异常，发出警报信号通知人员实施设备维护措施，结束此次试验；
步骤(5)、标记并排除异常孔槽，进行参数的二次判断，包括：
计算第一荧光数据的偏差参数δi＝|ai-μ|/(M×N)，其中ai为第i个孔槽的第一荧光数据；按照从大到小的顺序对偏差参数进行排序，将前p个偏差参数对应的孔槽标记为异常孔槽；
排除p个异常孔槽，对剩余的(M×N-p)个孔槽的第一荧光数据重新进行分析计算，获取新的标准差参数σ’与均值参数μ’，二次判断新的标准差参数σ’的数值范围，若标准差参数σ处于第一区间，则进入步骤(4)；
若标准差参数σ处于第二区间，则判定试验异常，发出警报信号通知人员进行设备维护，结束此次试验；
步骤(6)分区计算校正系数；
将M×N个孔槽所在的平面平均划分为m×n个分区，其中m＜M，n＜N，使M×N个孔槽均匀落置于m×n个分区中，每个分区内的孔槽总数目相同；
针对每个分区，计算该分区所包含的全部非异常孔槽的第一荧光数据的均值，作为该分区的校正系数K；进入步骤(7)；
步骤(7)、进入扩增试验阶段，实时采集扩增过程中的荧光强度数据并获取校正后的数据，包括：
在任一采集时刻，实时采集获取第j个孔槽的荧光强度数据bj(1≤j≤M×N-p)，计算第j个孔槽所在的分区内的所有实时测量值的均值μb，
计算校正后的荧光强度数据：
若μb＞K，则令
若μb＜K，则令
b′j＝bj-aj
步骤(8)、基于步骤(7)的数据绘制PCR扩增曲线，对曲线进行分析处理，包括：
将数据和曲线储存在实时荧光定量PCR设备的数据存储模块，并发送至管理服务器；管理服务器进行数据分析处理，将分析处理的结果和原始数据和曲线转发至第一客户端。
优选地，所述步骤(1)中对样品进行预处理包括：采用生理盐水清洗，研磨成匀浆，加入生理盐水进行振荡混匀、离心，提取核酸。
优选地，所述步骤(4)中的试验异常的原因包括染料泄露或荧光污染；
所述步骤(4)中的维护措施包括：运维人员使用酒精清洗孔槽。
优选地，所述步骤(3)中的第一区间与第二区间的设置包括：
通过设置第一阈值σ0来确定第一区间与第二区间，令第一区间为(0，σ0]，令第二区间为(σ0，+∞)；
所述步骤(4)中的第一范围、第二范围与第三范围的设置包括：
通过设置预设值μ1与μ2来确定第一范围、第二范围、第三范围；令第一范围为(0，μ1]，第二范围为(μ1，μ2]，第三范围为(μ2，+∞)。
优选地，所述步骤(8)中对曲线进行分析处理具体包括：
分析并标注扩增曲线的基线、背景、指数增长期、线性增长期、平台期；
获取扩增曲线的阈值Threshold和阈值循环Ct；
获取熔解曲线并分析熔解温度的特征峰的峰值高度。
本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
1、本发明基于初始荧光强度判断实时荧光定量PCR设备的数据是否需要校正，在试验前期即可自动检测。无需使用额外设置的硬件校正器件，无需繁琐复杂的人工操作步骤，能够实现自动检测和数据自校正，大幅提高试验效率。
2、本发明根据初始荧光强度对各个孔槽进行差异化处理，而非简单地对所有情况下采集数据都进行校正处理。根据初始荧光强度做出不同的处理措施，对正常数据无需校正，对明显异常的孔槽进行数据剔除，而对数据偏离正常情况一定程度的数据才进行校正处理。本发明的这种设置能够避免中央处理模块的运算负荷过大，也能够保证试验数据的准确性，提高试验效率，降低试验次数和时间。并且，本发明在剔除异常孔槽后，进行二次检测判断，进一步保证了数据的准确性和分析结果的可信度。
3、本发明在进行数据校正时，考虑到光路与温度控制引起的区域差异性，通过分区域计算的方式对荧光实时测量值进行校正，校正系数的设置更加合理，校正后的数据更加准确。并且，在数据校正的过程中考虑到数据的可用性，根据实测值与校正系数的大小关系，分情况采用不同的校正措施，保证了校正后的数值的非负性。
4、本发明通过预约系统能够实现试验人员通过线上预约试验设备，有助于试验人员高效安排试验时间，避免设备使用冲突，便于设备管理。
5、本发明通过运维系统，采集实时荧光定量PCR设备的异常报警信息，通过管理服务器对报警信息进行解析获取设备异常类型，本发明能够根据异常的类型的不同而选择发送运维指令或校正指令，选择不同的措施，能够避免长时间等待运维人员造成的效率低下，提高了设备维护的时效性。
并且，本发明还能根据连续多次试验的校正系数的数值变化情况，进行异常预测，提前进行人工校正，比常规的定期校正方式更具前瞻性。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR的数据分析系统结构框图；
图2为实时荧光定量PCR设备结构框图；
图3为实时荧光定量PCR的数据分析方法流程图；
图4为孔槽分区示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例一：
如图1所示，本发明提供一种实时荧光定量PCR的数据分析系统，包括：
管理服务器，预约系统，运维系统，多个实时荧光定量PCR设备；
其中，多个实时荧光定量PCR设备均与管理服务器通信连接；
预约系统、运维系统分别与管理服务器通信连接。
优选地，如图2所示，实时荧光定量PCR设备包括中央处理模块，荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块；
其中中央处理模块分别与荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块通过数据总线进行通信连接；
所述荧光检测模块用于实时采集荧光信号；
所述温度循环模块用于控制扩增试验过程中的温度循环；
所述数据校正模块用于对实时采集到的荧光信号进行校正处理；
所述报警显示模块用于指示人员进行设备校正和维护。
优选地，所述预约系统包括多个第一客户端；
试验人员通过第一客户端登录管理服务器，进入预约操作系统，查询未被预约的实时荧光定量PCR设备，选择设备、选定试验时间段；
管理服务器将已被预约的实时荧光定量PCR设备进行标记。
由于实时荧光定量PCR设备价格昂贵，但是PCR试验的试验耗时较长、试验需求量大，所以带来了设备使用冲突、难以管理的问题。
本发明通过预约系统能够实现线上预约实时荧光定量PCR设备，有助于试验人员高效安排试验时间，便于设备管理。
优选地，所述运维系统包括多个第二客户端；
其中第二客户端为运维人员携带的便携式移动终端；
当实时荧光定量PCR设备出现异常时，通过实时荧光定量PCR设备中的报警显示模块发送报警信息至管理服务器，管理服务器根据报警信息解析设备异常类型，根据设备异常类型的不同发送运维指令至第二客户端，或者发送校正指令至第一客户端；
运维人员根据运维指令对实时荧光定量PCR设备进行设备维护；
试验人员根据校正指令对实时荧光定量PCR设备进行校正。
通常情况下，运维人员通常不能及时达到异常设备的现场，如果每次出现异常情况都等待运维人员，则会浪费时间，耽误试验进度；
针对实时荧光定量PCR设备的有些异常情况，试验人员就可以处理，而无需浪费专业运维人员的人力资源；
因此，服务器对报警信息进行解析，分析异常类型，从而进行差异化处理；对于通过校正就能够恢复的异常，试验人员通常就能够完成；而对于严重的设备故障，才需要专业运维人员到场处理。
优选地，所述试验人员根据校正指令对实时荧光定量PCR设备进行校正，包括：ROI校正、背景校正、荧光校正和/或温度校正。
优选地，所述管理服务器为云服务器；管理服务器还包括趋势预测模块，用于根据实时荧光定量PCR设备的连续多次试验数据预测设备异常。
实施例二：
如图3所示，本发明还提供了一种实时荧光定量PCR的数据分析方法，包括：
步骤(1)、试验准备，包括：
对样品进行预处理；对实时荧光定量PCR设备进行初始化；将样品置入实时荧光定量PCR设备的M×N个孔槽中；
步骤(2)、开启荧光检测模块检测初始荧光强度，包括：
采集并获取预处理后的第一荧光数据集合A＝{a1，a2，…，aM×N}，其中a1，a2，…，aM×N为每个孔槽的第一荧光数据；中央处理模块对第一荧光数据集合A进行分析计算，获取标准差参数σ与均值参数μ，其中
步骤(3)、判断第一荧光数据的标准差参数σ的数值范围，包括：
若标准差参数σ处于第一区间，则进入步骤(4)；
若标准差参数σ处于第二区间，则进入步骤(5)；
其中，可以通过设置第一阈值σ0来确定第一区间与第二区间，例如，可令第一区间为(0，σ0]，令第二区间为(σ0，+∞)；通常在设备正常的情况下，各个孔槽的初始数据相差不大，若检测到σ的数值较低，说明各个孔槽的数据较为平均，这符合一般的试验要求；
若检测到σ的数值较高，则说明存在部分孔槽的数据明显突出于整体情况，有可能是染料泄露、荧光污染等原因导致的，而如果对这种情况置之不理，会致使荧光强度数据的严重误差，并最终产生的扩增曲线和相应的分析结果不可信，因此，需要排除σ数值较高的孔槽的影响，剔除异常孔槽的数据。
步骤(4)、判断第一荧光数据的均值参数μ的数值范围，包括：
若均值参数μ处于第一范围，则判定无需对试验数据进行校正，令校正系数K＝0，进入步骤(7)；
若均值参数μ处于第二范围，则判定需要对扩增试验中实时采集的荧光数据进行自校正处理，进入步骤(6)计算校正系数K的值；
若均值参数μ处于第三范围，则判定试验异常，发出警报信号通知人员实施设备维护措施，结束此次试验；
其中，可通过设置预设值μ1与μ2来确定第一范围、第二范围、第三范围；
第一范围为(0，μ1]，第二范围为(μ1，μ2]，第三范围为(μ2，+∞)；
正常情况下，所有孔槽的数据的均值处于较低水平。若检测到均值较高则需要进行一定的校正处理。若检测到均值严重过高，则表明设备的荧光检测模块或中央处理模块整体存在问题，这种情况下的问题较为严重，得到的荧光数据和扩增曲线可信度低，没有校正的必要，应当做出警示提醒，通知人员进行设备校正或设备维修，排除异常问题，等解决问题后再重新进行试验。
步骤(5)、标记并排除异常孔槽，进行参数的二次判断，包括：
计算第一荧光数据的偏差参数δi＝|ai-μ|/(M×N)，其中ai为第i个孔槽的第一荧光数据；按照从大到小的顺序对偏差参数进行排序，将前p个偏差参数对应的孔槽标记为异常孔槽；
排除p个异常孔槽，对剩余的(M×N-p)个孔槽的第一荧光数据重新进行分析计算，获取新的标准差参数σ’与均值参数μ’，二次判断新的标准差参数σ’的数值范围，若标准差参数σ处于第一区间，则进入步骤(4)；若标准差参数σ处于第二区间，则判定试验异常，发出警报信号通知人员进行设备维护，结束此次试验；
其中，若标准差参数较大，说明有个别孔槽的数据较为突出，其背后的原因可能是这些孔槽有问题，也有可能是试剂的问题，也有可能是光检测模块的问题，总之，这些异常导致了这些孔槽的试验数据不可信，所以需要剔除；
通常情况下，如果检测到异常就会重新处理试剂重新开始试验，但是实际上，异常的孔槽只是少量的，其他大部分孔槽的数据都是正常的，这种情况下，为了提高试验效率，本发明并未直接放弃此次试验；而是在排除异常孔槽数据后，对剩下的孔槽进行二次检测判断，若通过检测，则可继续试验；以此，提高了试验效率，节省了科研时间；
并且，排除异常孔槽数据后，并不能说明剩下的孔槽数据就是正常的，因为，如果是荧光检测模块或中央处理模块整体有问题，那么所有的数据可能都产生相同方向的偏移，这样虽然产生的标准差参数符合要求，但是均值仍产生了较大的偏移，仍然会影响试验的最终结果；二次检测的目的正是用于进一步检测剩下孔槽数据是否符合要求，从而保证试验数据可用性；在二次检测判断之后，若排除异常孔槽之后，数据符合要求，则可以继续试验；若数据仍然不符合要求，则会判断异常，放弃本次试验，避免无效试验，节省时间；
可选地，本发明记录所有标记孔槽的编号，以及其对应的试剂；在多次试验结束后，统计每次产生的标记孔槽，并采集其对应的试剂，重新放入实时荧光定量PCR设备中，再次进行试验。
步骤(6)分区计算校正系数；
将M×N个孔槽所在的平面平均划分为m×n个分区，其中m＜M，n＜N，使M×N个孔槽均匀落置于m×n个分区中，每个分区内的孔槽总数目相同；
优选地，如图4所示，可将12×8个孔槽平均划分为3×4个分区；每个分区内均包含8个孔槽；
针对每个分区，计算该分区所包含的全部非异常孔槽的第一荧光数据的均值，作为该分区的校正系数K；进入步骤(7)；
步骤(7)、进入扩增试验阶段，实时采集扩增过程中的荧光强度数据并获取校正后的数据，包括：
在任一采集时刻，实时采集获取第j个孔槽的荧光强度数据bj(1≤j≤M×N-p)，计算第j个孔槽所在的分区内的所有实时测量值的均值μb，
计算校正后的荧光强度数据：
若μb＞K，则令
若μb＜K，则令
b′j＝bj-aj
其中，本发明考虑到光路与温度控制的差异性，通过分区域计算的方式对荧光实时测量值进行校正；
此外，由于对扩增曲线的分析主要涉及阈值、Ct值等参数的分析，通常只需要重点关注循环数较高时的数据，而循环数较高时各个孔槽的荧光数据均大于初始强度的分区均值，则必然有μb＞K，所以能够保证校正后数据值为正值；
而对于循环数较低时的荧光数据，若仍按照分区均值进行校正，则存在一定的可能性出现校正后的计算值为负值的情况，为了避免这种情况，此时采用每个孔槽的初始强度进行校正。
步骤(8)、基于步骤(7)的数据绘制PCR扩增曲线，对曲线进行分析处理，包括：
将数据和曲线储存在实时荧光定量PCR设备的数据存储模块，并发送至管理服务器；管理服务器进行数据分析处理，将分析处理的结果和原始数据和曲线转发至第一客户端。
优选地，管理服务器还通过趋势预测模块分析进行设备异常的趋势分析；包括，通过趋势预测模块计算每次试验中所有分区的校正系数的均值；连续多次试验后，若连续T次产生的校正系数的均值都增大，即均值呈逐渐增大的趋势，则判断需要进行人工校正。
优选地，所述步骤(1)中对样品进行预处理包括：采用生理盐水清洗，研磨成匀浆，加入生理盐水进行振荡混匀、离心，提取核酸。
优选地，所述步骤(4)中的试验异常的原因包括染料泄露或荧光污染；
所述步骤(4)中的维护措施包括：运维人员使用酒精清洗孔槽。
优选地，所述步骤(3)中的第一区间与第二区间的设置包括：
通过设置第一阈值σ0来确定第一区间与第二区间，令第一区间为(0，σ0]，令第二区间为(σ0，+∞)；
所述步骤(4)中的第一范围、第二范围与第三范围的设置包括：
通过设置预设值μ1与μ2来确定第一范围、第二范围、第三范围；令第一范围为(0，μ1]，第二范围为(μ1，μ2]，第三范围为(μ2，+∞)。
优选地，所述步骤(8)中对曲线进行分析处理具体包括：
分析并标注扩增曲线的基线、背景、指数增长期、线性增长期、平台期；
获取扩增曲线的阈值Threshold和阈值循环Ct；
获取熔解曲线并分析熔解温度的特征峰的峰值高度。
实施例三：
本发明还提供一种实时荧光定量PCR设备，包括：
实时荧光定量PCR设备包括中央处理模块，荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块。
其中中央处理模块分别与荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块通过数据总线进行通信连接。
通过该实时荧光定量PCR设备实施上述实时荧光定量PCR的数据分析方法。
实施例四：
本发明还提供了一种存储有计算机程序的计算机可读介质，所述计算机程序包括程序代码模块，当所述计算机程序在处理器上运行时，所述程序代码模块令所述处理器执行上述实时荧光定量PCR的数据分析方法。
Claims (10)
1.一种实时荧光定量PCR的数据分析系统，包括：管理服务器，预约系统，运维系统，多个实时荧光定量PCR设备；其中，多个实时荧光定量PCR设备均与管理服务器通信连接；预约系统、运维系统分别与管理服务器通信连接；
其特征在于，实时荧光定量PCR设备包括中央处理模块，荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块；其中中央处理模块分别与荧光检测模块，温度循环模块，数据存储模块，报警显示模块，数据校正模块通过数据总线进行通信连接；
所述荧光检测模块用于实时采集荧光信号；
所述温度循环模块用于控制扩增试验过程中的温度循环；
所述数据校正模块用于对实时采集到的荧光信号进行校正处理；
所述报警显示模块用于指示人员进行设备校正和维护。
2.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR的数据分析系统，其特征在于，所述预约系统包括多个第一客户端；试验人员通过第一客户端登录管理服务器，进入预约操作系统，查询未被预约的实时荧光定量PCR设备，选择设备、选定试验时间段；
管理服务器将已被预约的实时荧光定量PCR设备进行标记。
3.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR的数据分析系统，其特征在于，所述运维系统包括多个第二客户端，
其中第二客户端为运维人员携带的便携式移动终端；
当实时荧光定量PCR设备出现异常时，通过实时荧光定量PCR设备中的报警显示模块发送报警信息至管理服务器，管理服务器根据报警信息解析设备异常类型，根据设备异常类型的不同发送运维指令至第二客户端，或者发送校正指令至第一客户端；
运维人员根据运维指令对实时荧光定量PCR设备进行设备维护；
试验人员根据校正指令对实时荧光定量PCR设备进行校正。
4.根据权利要求3所述的一种实时荧光定量PCR的数据分析系统，其特征在于，所述试验人员根据校正指令对实时荧光定量PCR设备进行校正，包括：ROI校正、背景校正、荧光校正和/或温度校正。
5.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR的数据分析系统，其特征在于，所述管理服务器为云服务器；
管理服务器还包括趋势预测模块，用于根据实时荧光定量PCR设备的连续多次试验数据预测设备异常。
6.一种应用于权利要求1-5所述的实时荧光定量PCR的数据分析系统的分析方法，其特征在于，该方法包括：
步骤(1)、试验准备，包括：
对样品进行预处理；对实时荧光定量PCR设备进行初始化；将样品置入实时荧光定量PCR设备的M×N个孔槽中；
步骤(2)、开启荧光检测模块检测初始荧光强度，包括：
采集并获取预处理后的第一荧光数据集合A＝{a1，a2，…，aM×N}，其中a1，a2，…，aM×N为每个孔槽的第一荧光数据；中央处理模块对第一荧光数据集合A进行分析计算，获取标准差参数σ与均值参数μ，其中
步骤(3)、判断第一荧光数据的标准差参数σ的数值范围，包括：
若标准差参数σ处于第一区间，则进入步骤(4)；
若标准差参数σ处于第二区间，则进入步骤(5)；
步骤(4)、判断第一荧光数据的均值参数μ的数值范围，包括：
若均值参数μ处于第一范围，则判定无需对试验数据进行校正，令校正系数K＝0，进入步骤(7)；
若均值参数μ处于第二范围，则判定需要对扩增试验中实时采集的荧光数据进行自校正处理，进入步骤(6)计算校正系数K的值；
若均值参数μ处于第三范围，则判定试验异常，发出警报信号通知人员实施设备维护措施，结束此次试验；
步骤(5)、标记并排除异常孔槽，进行参数的二次判断，包括：
计算第一荧光数据的偏差参数δi＝|ai-μ|/(M×N)，其中ai为第i个孔槽的第一荧光数据；按照从大到小的顺序对偏差参数进行排序，将前p个偏差参数对应的孔槽标记为异常孔槽；
排除p个异常孔槽，对剩余的(M×N-p)个孔槽的第一荧光数据重新进行分析计算，获取新的标准差参数σ’与均值参数μ’，二次判断新的标准差参数σ’的数值范围，若标准差参数σ处于第一区间，则进入步骤(4)；若标准差参数σ处于第二区间，则判定试验异常，发出警报信号通知人员进行设备维护，结束此次试验；
步骤(6)分区计算校正系数；
将M×N个孔槽所在的平面平均划分为m×n个分区，其中m＜M，n＜N，使M×N个孔槽均匀落置于m×n个分区中，每个分区内的孔槽总数目相同；
针对每个分区，计算该分区所包含的全部非异常孔槽的第一荧光数据的均值，作为该分区的校正系数K；进入步骤(7)；
步骤(7)、进入扩增试验阶段，实时采集扩增过程中的荧光强度数据并获取校正后的数据，包括：
在任一采集时刻，实时采集获取第j个孔槽的荧光强度数据bj(1≤j≤M×N-p)，计算第j个孔槽所在的分区内的所有实时测量值的均值μb，
计算校正后的荧光强度数据：
若μb＞K，则令
若μb＜K，则令
b′j＝bj-aj
步骤(8)、基于步骤(7)的数据绘制PCR扩增曲线，对曲线进行分析处理，包括：
将数据和曲线储存在实时荧光定量PCR设备的数据存储模块，并发送至管理服务器；管理服务器进行数据分析处理，将分析处理的结果和原始数据和曲线转发至第一客户端。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中对样品进行预处理包括：采用生理盐水清洗，研磨成匀浆，加入生理盐水进行振荡混匀、离心，提取核酸。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(4)中的试验异常的原因包括染料泄露或荧光污染；
所述步骤(4)中的维护措施包括：运维人员使用酒精清洗孔槽。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中的第一区间与第二区间的设置包括：
通过设置第一阈值σ0来确定第一区间与第二区间，令第一区间为(0，σ0]，令第二区间为(σ0，+∞)；
所述步骤(4)中的第一范围、第二范围与第三范围的设置包括：
通过设置预设值μ1与μ2来确定第一范围、第二范围、第三范围；令第一范围为(0，μ1]，第二范围为(μ1，μ2]，第三范围为(μ2，+∞)。
10.根据权利要求9所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(8)中对曲线进行分析处理具体包括：
分析并标注扩增曲线的基线、背景、指数增长期、线性增长期、平台期；
获取扩增曲线的阈值Threshold和阈值循环Ct；
获取熔解曲线并分析熔解温度的特征峰的峰值高度。
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|---|---|---|---|
| CN202210288951.8A CN114550826A (zh) | 2022-03-23 | 2022-03-23 | 一种实时荧光定量pcr的数据分析系统及其方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN115197835A (zh) * | 2022-09-15 | 2022-10-18 | 浙江正合谷生物科技有限公司 | 一种基于自学习的核酸扩增荧光定量温控系统 |
| CN116705163A (zh) * | 2023-05-31 | 2023-09-05 | 扬州市疾病预防控制中心 | 一种实时荧光pcr数据管理系统 |
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- 2022-03-23 CN CN202210288951.8A patent/CN114550826A/zh not_active Withdrawn
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