PT2185198E - Lox and l0xl2 inhibitors and uses thereof - Google Patents

Lox and l0xl2 inhibitors and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
PT2185198E
PT2185198E PT8830207T PT08830207T PT2185198E PT 2185198 E PT2185198 E PT 2185198E PT 8830207 T PT8830207 T PT 8830207T PT 08830207 T PT08830207 T PT 08830207T PT 2185198 E PT2185198 E PT 2185198E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
antibody
amp
quot
amino acid
antibodies
Prior art date
Application number
PT8830207T
Other languages
Portuguese (pt)
Inventor
Victoria Smith
Scott Ogg
Peter Van Vlasselaer
Vivian E Barry
Derek Marshall
Alison Kay Holzer
Hector Rodriguez
Miho Oyasu
Scott Alan Mccauley
Carlos Aurelio Garcia
Donna Hiroko Tokuoka Biermann
Original Assignee
Gilead Biologics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US96324807P priority Critical
Priority to US96324907P priority
Priority to US96324607P priority
Priority to US96328207P priority
Priority to US96321407P priority
Application filed by Gilead Biologics Inc filed Critical Gilead Biologics Inc
Publication of PT2185198E publication Critical patent/PT2185198E/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K45/00Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407Specifically defined cancers
    • G01N33/57423Specifically defined cancers of lung
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407Specifically defined cancers
    • G01N33/57438Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77Internalization into the cell
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
    • G01N2333/90605Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • G01N2333/90633Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3) in general

Description

DESCRIÇÃO DESCRIPTION

INIBIDORES LOX E L0XL2 E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro é um problema de saúde pública sério nos Estados Unidos e noutros países desenvolvidos. INHIBITORS AND LOX L0XL2 AND USES THEREOF BACKGROUND OF THE INVENTION 0 cancer is a serious public health problem in the United States and other developed countries. Atualmente, uma em quarto mortes nos Estados Unidos é devida a cancro. Currently, one in four deaths in the United States is due to cancer. A terapêutica cancerígena envolve tratar pacientes com fármacos quimioterapêuticos para matar as células tumorais. The treatment involves treating cancer patients with chemotherapeutic drugs to kill tumor cells. Contudo, subconjuntos de células tumorais são frequentemente resistentes à terapêutica com fármacos e sobrevivem para repovoarem nos locais de origem e em locais metastáticos distantes, conduzindo à reincidência e morbidez da doença detetável. However, tumor cell subsets are often resistant to drug therapy to survive and repopulate the source local and distant metastatic sites, leading to morbidity and recurrence of detectable disease. Pensa-se que muitas células tumorais de carcinoma que têm as propriedades de capacidade mestastática e invasiva aumentadas, e resistência aos fármacos alterada, sofreram uma transformação morfológica que abrange ou semelhante a EMT (transição epitelial-mesenquimatosa). It is believed that many tumor cell carcinoma that has the properties of invasiveness and mestastática increased, and resistance to altered drug, underwent a morphological transformation or the like which covers the EMT (epithelial-mesenchymal transition). Células submetidas a EMT perdem as propriedades adesivas normais das células epiteliais e passam por um espetro de alterações, incluindo perda de expressão de E-caderina e expressão de marcadores mesenquimatosos, motilidade aumentada, capacidade de invasão aumentada e resistência à morte celular aumentada. Cells undergoing EMT lose their adhesive properties of normal epithelial cells and undergo a spectrum changes, including loss of E-cadherin expression and expression of mesenchymal markers, increased motility, increased invasiveness and increased resistance to cell death.

As terapêuticas líder para cancro são atualmente a cirurgia, radiação e quimioterapêutica. Therapeutic leading to cancer are currently surgery, radiation and chemotherapy. As abordagens quimioterapêuticas, tais como antibióticos anti-tumorais, agentes alquilantes, compostos de nitrosoureia, vinca alcaloides, hormonas esteróides e anti-metabolitos formam a maioria das terapêuticas disponíveis aos oncologistas. The chemotherapeutic approaches, such as antitumor antibiotics, alkylating agents, nitrosourea compounds, vinca alkaloids, steroids, hormones and anti-metabolites form the majority of therapies available to oncologists. Apesar dos avanços no campo do tratamento de cancro, o cancro continua a ser um grande problema de saúde. Despite advances in cancer treatment field, cancer remains a major health problem.

Angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos fora dos capilares pré-existentes, é uma sequência de acontecimentos que é de uma importância crucial na ampla gama de processos fisiológicos e patológicos. Angiogenesis, the formation of new blood vessels out of pre- existing capillaries, is a sequence of events that is critical in the broad range of physiological and pathological processes. 0 crescimento normal de tecido, tal como no desenvolvimento embrionário, na cicatrização e no ciclo menstrual, é caracterizado pela dependência na formação de novos vasos para o fornecimento de oxigénio e nutrients, bem como remoção de produtos de desperdício. 0 normal tissue growth, such as in embryonic development, wound healing and in the menstrual cycle is characterized by reliance on formation of new vessels to supply oxygen and nutrients as well as removing waste products. Um grande número de doenças diferentes e não relacionadas também está associado com a formação de nova vasculatura. A large number of different and unrelated diseases are also associated with the formation of new vasculature. Entre certas patologias encontram-se condições patológicas nas quais a angiogénese é baixa e deveria ser potenciada para melhorar as condições da doença. Among certain pathologies are pathological conditions in which angiogenesis is low and should be enhanced to improve disease conditions. Mais frequentemente, contudo, a angiogénese excessiva é uma característica importante de várias patologias, incluindo patologias caracterizadas ou associadas com uma proliferação anormal ou descontrolada de células. More frequently, however, excessive angiogenesis is an important feature of various pathologies including pathologies characterized or associated with an abnormal or uncontrolled cell proliferation. Patologias que envolvem angiogénese excessiva incluem, por exemplo, cancro (tanto tumores sólidos como hematológicos), doenças cardiovasculares (tais como aterosclerose e restenose), inflamação crónica (artrite reumatóide, doença de Crohn), diabetes (retinopatia diabética), psoríase, endometriose, glaucoma neovascular e adiposidade (3). Disorders involving excessive angiogenesis include, for example, cancer (both solid and hematologic tumors), cardiovascular diseases (such as atherosclerosis and restenosis), chronic inflammation (rheumatoid arthritis, Crohn's disease), diabetes (diabetic retinopathy), psoriasis, endometriosis, neovascular glaucoma and adiposity (3). Estas condições patológicas podem beneficiar de inibição quimioterapêutica da angiogénese. These pathological conditions may benefit from chemotherapeutic inhibition of angiogenesis.

Falando em geral, o processo angiogénico requer a proliferação e migração de um endotélio normalmente quiescente, a proteólise controlada da matriz pericelular e a síntese de novos componentes da matriz extracelular desenvolvendo capilares. Generally speaking, the process requires angiogenic proliferation and migration of a normally quiescent endothelium, the controlled proteolysis of the pericellular matrix and synthesis of new extracellular matrix components developing capillaries. 0 estabelecimento de novos contactos intra e intercelulares e a diferenciação morfológica de células endoteliais em redes tubulares tipos capilares providenciam suporte para a sua maturação, ramificação, remodelação e regressão seletiva subsequentes para formar uma rede microvascular altamente organizada, funcional. 0 establishment of new intra- and intercellular contacts and the morphological differentiation of endothelial cells into tubular capillary networks types provide support for their maturation, branching, remodeling and selective regression subsequent to form a highly organized, functional microvascular network. As interações autócrinas, parácrinas e anfícrinas do endotélio vascular com os seus componentes circundantes do estroma, bem como com as citocinas pró-angiogénicas e angiostáticas e fatores de crescimento orquestrando a angiogénese fisiológica, são normalmente reguladas firmemente tanto espacialmente como temporalmente. The interactions autocrine, paracrine and anfícrinas the vascular endothelium with its surrounding stromal components, as well as the pro-angiogenic and angiostatic cytokines and growth factors orchestrating physiological angiogenesis is normally tightly regulated both spatially and temporally. A angiogénese é crucial para o crescimento de tecidos neoplásicos. Angiogenesis is critical for the growth of neoplastic tissues. Durante mais de 100 anos, os tumores foram observados como sendo tecidos mais vasculares do que normais. For over 100 years, tumors were observed to be more vascular than normal tissues. Vários estudos experimentais sugeriram que ambos crescimento tumoral primário e metástase requerem neovascularização. Several experimental studies have suggested that both primary tumor growth and metastasis require neovascularization. Em contraste com o processo bem orquestrado descrito anteriormente para o crescimento de tecidos normal, a angiogénese patológica necessária para o crescimento tumoral ativo é, em geral, prolongada e persistente, sendo a aquisição inicial do fenótipo angiogénico um mecanismo comum para o desenvolvimento de uma variedade de tipos de tumores sólidos e hematopoiéticos. In contrast to the well-orchestrated process described above for growth of normal tissues, the pathological angiogenesis necessary for active tumor growth is generally sustained and persistent, with an initial acquisition of the angiogenic phenotype a common mechanism for the development of a variety types of solid and hematopoietic tumors. Tumores que são incapazes de recrutar e suster uma rede vascular permanecem tipicamente dormentes como lesões assintomáticas in situ. Tumors that are unable to recruit and sustain a vascular network typically remain dormant as asymptomatic lesions in situ. A metástase também é dependente da angiogénese: para uma célula tumoral metastizar com êxito, em geral tem de ganhar acesso à vasculatura no tumor primário, sobreviver à circulação, deter a microvasculatura do orgão alvo, sair desta vasculatura, crescer no orgão alvo e induzir a angiogénese no local alvo. Metastasis is also dependent on angiogenesis: For a tumor cell to metastasize successfully generally must gain access to the vasculature in the primary tumor survive the circulation, stop the microvasculature of the target organ, leaving this vasculature growing in the target organ, and induce angiogenesis at the target site. Assim, a angiogénese parece ser necessária no inicio, bem como a conclusão da cascata metastática. Thus, angiogenesis appears to be necessary at the beginning and completion of the metastatic cascade. A criticalidade da angiogénese para o crescimento e metástase de neoplasmas providencia assim um ótimo alvo potencial para esforços quimioterapêuticos. The criticality of angiogenesis for the growth and metastasis of neoplasms thus provides a great potential target for chemotherapeutic efforts. Agentes anti-angiogénicos apropriados podem atuar diretamente ou indiretamente para influenciar a angiogénese associada a tumor atrasando o seu despoletar (isto é, bloqueando um "interrutor angiogénico") ou bloqueando a neovascularização prolongada e focal que é caracteristica de muitos tipos de tumor. Suitable anti-angiogenic agents may act directly or indirectly to influence angiogenesis associated with tumor delaying their onset (i.e., blocking one & quot; interrutor angiogenic & quot;) or blocking the extended focal neovascularization that is characteristic of many tumor types. Terapêuticas anti-angiogénese dirigidas contra o endotélio associado a tumor e os múltiplos processos moleculares e celulares e alvos implicados na angiogénese patológica prolongada estão a ser avaliados ativamente em relação à sua segurança e eficácia em múltiplos ensaios clínicos. Therapeutic anti-angiogenesis directed against tumor associated endothelium and the multiple molecular and cellular processes and targets implicated in sustained pathologic angiogenesis are being actively evaluated for safety and efficacy in multiple clinical trials. Contudo, tem havido sucesso limitado, até à data, com a descoberta e/ou identificação de agentes anti-angiogénicos seguros e/ou eficazes. However, there has been limited success to date, with the discovery and / or identification of anti-angiogenic agents safe and / or effective.

Fibrose é a acumulação anormal de tecido fibroso que pode ocorrer como uma parte do processo de cicatrização no tecido danificado. Fibrosis is the abnormal accumulation of fibrous tissue that can occur as part of the healing process in damaged tissue. Tal dano tecidular pode resultar de lesão física, inflamação, infeção, exposição a toxinas e a outras causas. This tissue damage can result from injury, inflammation, infection, exposure to toxins and other causes. A fibrose do fígado (hepática), por exemplo, ocorre como uma parte da resposta de cicatrização à lesão hepática crónica. Fibrosis of the liver (hepatic), for example, occurs as a part of the healing response to chronic liver injury. A fibrose ocorre como uma complicação de hemocromatose, doença de Wilson, alcoolismo, esquistosomíase, hepatite virai, obstrução do duto biliar, exposição a toxinas e distúrbios metabólicos. Fibrosis occurs as a complication of hemochromatosis, Wilson's disease, alcoholism, schistosomiasis, viral hepatitis, bile duct obstruction, exposure to toxins and metabolic disorders. Pensa-se que esta formação de tecido cicatrizante representa uma tentativa pelo corpo de encapsular o tecido lesado. It is thought that this scar tissue formation is an attempt by the body to encapsulate the injured tissue. A fibrose hepática é caracterizada pela acumulação de matriz extracelular que pode ser distinguida qualitativamente da do fígado normal. Liver fibrosis is characterized by the accumulation of extracellular matrix can be qualitatively distinguished from the normal liver. Se não for tratada, a fibrose hepática progressa para cirrose (definida pela presença de nódulos encapsulados), falha hepática e morte. If left untreated, liver fibrosis progresses to cirrhosis (defined by the presence of encapsulated nodules), liver failure and death.

Conforme sumarizado por Li e Friedman (Gastroenterol. Hepatol. 14:618-633, 1999), estratégias terapêuticas propostas e reais para a fibrose hepática incluem a remoção da causa subjacente (por exemplo, toxina ou agente infecioso), supressão da inflamação (utilizando, por exemplo, corticosteróides, antagonistas do recetor IL-1 ou outros agentes), regulação para baixo da ativação de células estreladas utilizando, por exemplo, gama interferão ou antioxidantes), promoção da degradação da matriz ou promoção da apoptose das células estreladas. As summarized by Li and Friedman (Gastroenterol Hepatol. 14:. 618-633, 1999), therapeutic strategies proposed for the real and liver fibrosis include removing underlying cause (e.g., toxin or infectious agent), suppression of inflammation (using for example, corticosteroids, antagonists of the IL-1 receptor or other agents), down-regulation of stellate cell activation using, e.g., gamma interferon or antioxidants), promotion of matrix degradation or promoting apoptosis of stellate cells. Apesar do progresso recente, muitas destas estratégias ainda estão na fase experimental e as terapêuticas existentes têm como objetivo suprimir a inflamação em vez de se dirigirem aos processos bioquímicos subjacentes. Despite recent progress, many of these strategies are still in the experimental stage and existing therapies are aimed at suppressing inflammation instead of addressing the underlying biochemical processes. Assim, continua a haver uma necessidade na arte de materiais e métodos para tratar fibrose, incluindo fibrose pulmonar e hepática. Thus, there remains a need in the art for materials and methods for treating fibrosis, including pulmonary and hepatic fibrosis.

Os tecidos fibróticos acumulam-se no coração e vasos sanguíneos como um resultado de hipertensão, cardiopatia hipertensiva, aterosclerose e infarto agudo do miocárdio. The fibrotic tissue accumulate in the heart and blood vessels as a result of hypertension, hypertensive heart disease, atherosclerosis and myocardial infarction. A pressão sanguínea elevada, ou hipertensão, pode ser causada por uma variedade de fatores e conduz, com frequência, ao desenvolvimento de cardiopatia hipertensiva (HHD) com progressão para paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. High blood pressure or hypertension can be caused by a variety of factors and leads, frequently, the development of hypertensive heart disease (HHD) with progression to heart failure and acute myocardial infarction. Da mesma forma, aterosclerose e outras doenças cardíacas isquémicas também resultam, com frequência, em paragem cardíaca. Likewise, arteriosclerosis and other ischemic heart diseases also result frequently in cardiac arrest. Estas doenças cardiovasculares todas exibem uma acumulação de matriz extracelular ou deposição fibrótica que resulta no enrijecimento da vasculatura e enrijecimento do próprio tecido cardíaco. These cardiovascular diseases all exhibit an accumulation of extracellular matrix or fibrotic deposition which results in the stiffening and hardening of the vasculature of the heart tissue. Esta deposição de material fibrótico é uma resposta ao dano induzido pelo estado hipertenso e/ou esclerótico, mas os efeitos desta resposta também resultam nos efeitos negativos do enrijecimento vascular e cardíaco, bem como no aumento do ventrículo. This deposition of fibrous material is a response to injury induced by hypertensive status and / or sclerotic, but the effects of this response also results in negative effects of vascular stiffness and heart, as well as increasing the ventricle. Adicionalmente, pensa-se que a fibrose cardíaca aumentada observada na doença cardiovascular interrompe ou altera os sinais transmitidos aos cardiomiócitos através de andaime de tecido cardíaco, conduzindo ainda à interrupção da função cardíaca eficiente e promovendo paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. Additionally, it is believed that the enhanced cardiac fibrosis observed in cardiovascular disease disrupts or alters the signals transmitted to cardiomyocytes via cardiac tissue scaffold, yet leading to disruption of efficient cardiac function and promoting cardiac arrest and myocardial infarction. 0 documento WO 00/44910 descreve polipeptideos proteínas e anticorpos Lor-2. WO 00/44910 discloses 0 proteins and polypeptides Lor-2 antibodies. Peinado et al, EMBO Journal, volume 24, N.° 19, 2005, páginas 3446-3458; Peinado et al, EMBO Journal, Volume 24, No. 19, 2005, pages 3446-3458; e Peinado et al, Cancer Research 2008, volume 68, N.° 12, 15 páginas 4541-4550, relaciona-se com LOXL2 e a sua utilização como um marcador prognóstico de carcinomas de células escamosas. and Peinado et al, Cancer Research, 2008, Volume 68, No. 12, pages 15 4541-4550, relates to LOXL2 and its use as a prognostic marker of squamous cell carcinomas. 0 documento US 2007/021365 refere-se a métodos de identificar inibidores LOX e a utilização de tais inibidores para prevenir ou tratar tumores. 0 Document US 2007/021365 relates to methods to identify LOX inhibitors and the use of such inhibitors to prevent or treat tumors.

SUMMARY DA INVENÇÃO SUMMARY OF THE INVENTION

Transição Epitelial-para-Mesenquimatosa (EMT) refere-se ao processo pelo qual uma célula com uma expressão/fenótipo génico caracteristico de células epiteliais (isto é, que expressa proteínas, fatores e moléculas especificas) muda ou altera os genes ou os seus níveis de expressão que resulta numa alteração no fenótipo da célula conforme exibido pela alteração ou mudança nos genes expressos. Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) refers to the process by which a cell with an expression / characteristic gene phenotype of epithelial cells (i.e., expressing proteins, factors and specific molecules) changes or alters the genes or their levels expression that results in a change in cell phenotype as shown by the change or changes in expressed genes. São necessárias composições que previnem EMT e que são eficazes no bloqueio da atividade de LOXL2. Compositions are needed that prevent EMT and that are effective in blocking the activity of LOXL2. Tais inibidores são úteis no tratamento de doenças e distúrbios associados com níveis aberrantes de LOXL2. Such inhibitors are useful in treating diseases and disorders associated with aberrant levels of LOXL2. A presente invenção providencia um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína lisil oxidase-tipo 2 (LOXL2), em que dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à sequência de aminoácidos da SEQ. The present invention provides an isolated antibody or binding fragment antigen thereof which binds to a lysyl protein oxidase-like 2 (LOXL2), wherein said antibody or binding fragment antigen binds specifically to SEQ amino acid sequence. ID N.° 6 e inibe a atividade enzimática da proteína LOXL2, em que a inibição é não competitiva. ID NO: 6 and inhibits the enzymatic activity of LOXL2 protein, wherein the inhibition is uncompetitive. Estas e outras modalidades da invenção são apresentadas na descrição e nas reivindicações em anexo. These and other embodiments of the invention are presented in the description and in the appended claims. A referência aqui a anticorpos LOXL2 significa anticorpos da invenção, conforme definidos anteriormente. Reference herein to mean antibodies LOXL2 antibodies of the invention as defined above.

Anticorpos que se ligam a enzimas podem ser inibidores competitivos, inibidores acompetitivos ou inibidores não competitivos. Antibodies that bind to enzymes may be competitive inhibitors, inhibitors acompetitivos or noncompetitive inhibitors. Em relação à inibição competitiva, um inibidor normalmente tem semelhança estrutural com o substrato. With respect to competitive inhibition, an inhibitor usually has structural similarity with the substrate. A inibição será evidente a baixas concentrações do substrato, mas pode ser ultrapassada a concentrações do substrato elevadas. Inhibition will be evident at low substrate concentrations, but can be overcome by the higher substrate concentrations. Em relação à inibição acompetitiva, um inibidor liga-se a um local que se torna disponível depois do substrato se ligar no local ativo. Regarding acompetitiva inhibition, an inhibitor binds to a site that becomes available after substrate binding in the active site. A inibição será mais evidente a concentrações do substrato elevadas. Inhibition will be more apparent from the higher substrate concentrations. Em relação à inibição não competitiva, um inibidor liga-se a um local longe do local de ligação do substrato e a inibição relativa será, em geral, a mesma para todas as concentrações do substrato. Regarding the non-competitive inhibition, an inhibitor binds to a site away from the substrate binding site and relative inhibition is generally the same for all concentrations of the substrate. Numa modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descritos aqui, liga-se especificamente tanto a L0XL.2 de comprimento inteiro como processado. In one embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein specifically binds both the full length and L0XL.2 processed. Num aspeto, tanto a L0XL2 de comprimento inteiro como processado são formas ativas da enzima. In one aspect, both the full length and L0XL2 are processed active forms of the enzyme.

Num aspeto, o anticorpo L0XL2 da invenção que se liga ao aminoácido da SEQ. In one aspect, the invention L0XL2 antibody which binds to the amino acid of SEQ. ID N.° 6 compreende uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID No. 6 comprises a variable heavy chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 1 e uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID NO: 1 and a variable light chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 2. ID No. 2.

Numa modalidade, um anticorpo L0XL2 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. In one embodiment, an isolated L0XL2 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a variable heavy chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 1. Noutra modalidade, um anticorpo L0XL2 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID No. 1. In another embodiment, an isolated L0XL2 antibody or antigen binding fragment thereof comprises a variable light chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 2. Ainda noutra modalidade, um anticorpo L0XL2 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compete com, ou liga-se especificamente a, qualquer um dos anticorpos anti-L0XL2 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos aqui para ligação ao L0XL2. ID No. 2. In yet another embodiment, an isolated L0XL2 antibody or antigen binding fragment thereof, competes with or binds specifically to, any of the anti-L0XL2 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein for connection to L0XL2. Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ligar-se especificamente a L0XL2 com uma afinidade de ligação de pelo menos 2, 5, 10, 50, 100, 500 ou 1000 vezes superior a pelo menos um de LOX, LOXL1, LOXL3 ou LOXL4. Antibodies or binding fragments antigen thereof can bind specifically to L0XL2 with a binding affinity of at least 2, 5, 10, 50, 100, 500 or 1000 times greater than at least one of LOX, LOXL1, LOXL3 or LOXL4. São providenciados aqui anticorpos anti-LOXL2 humanizados. Provided herein are anti-LOXL2 humanized antibodies. Numa modalidade, o anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. In one embodiment, the humanized LOXL2 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a variable heavy chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 25, 26, 27 ou 28 e uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID No. 25, 26, 27 or 28 and a variable light chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 30, 31 ou 32. ID No. 30, 31 or 32.

Um anticorpo LOXL2 humanizado isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. A humanized antibody isolated LOXL2 or antigen-binding fragment thereof can comprise a heavy chain variable with at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 25, 26, 27 ou 28 e uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. ID No. 25, 26, 27 or 28 and a variable light chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 30, 31 ou 32. ID No. 30, 31 or 32.

Um anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma cadeia pesada variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. LOXL2 A humanized antibody or antigen binding fragment thereof can comprise a heavy chain variable with at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 25, 26, 27 ou 28. ID No. 25, 26, 27 or 28.

Um anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode compreender uma cadeia leve variável com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. LOXL2 A humanized antibody or antigen binding fragment thereof, may comprise a variable light chain having at least 75% amino acid sequence identity to an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 30, 31 ou 32. Podem ser feitas combinações de cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis para avaliar a afinidade de ligação. ID No. 30, 31 or 32 combinations can be made of variable heavy chains and variable light chains for evaluating the binding affinity. É providenciado aqui um anticorpo LOXL2 humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compete com, ou que se liga especificamente a, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui para ligação a L0XL2. Provided herein is a humanized LOXL2 antibody or antigen binding fragment thereof that competes with, or specifically binds to, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein for binding to L0XL2. É providenciado aqui um anticorpo L0XL2 humanizado, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga a L0XL2, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que dita região variável da cadeia pesada compreende: (i) uma cadeia pesada FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. It is provided here a humanized L0XL2 antibody or binding fragment antigen thereof, which binds to L0XL2 comprising a variable region of the heavy chain and a variable region of the light chain, wherein said variable region of the heavy chain comprises: (i ) a heavy chain FR1 with SEQ amino acid sequence. ID N.° 33 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 33 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 33, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 24; ID No. 33, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of glutamine (Q) for valine (V) or a conservative substitution thereof at position 24; (b) uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 30; (B) a substitution of leucine (L) for valine (V) or a conservative substitution thereof at position 30; (c) uma substituição de valina (V) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (C) a substitution of valine (V) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 31; (d) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 32; (D) a substitution of arginine (R) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 32; e (e) uma substituição de treonina (T) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 35; and (e) substitution of a threonine (T) to alanine (A) or a conservative substitution thereof at position 35; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-19; and a deletion of 1-19 amino acid residues; (ii) uma cadeia pesada FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (Ii) a heavy chain FR2 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 34 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 34 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 34, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 3; ID No. 34, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of lysine (K) to arginine (R) or a conservative substitution thereof at position 3; (b) uma substituição de arginina (R) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5, and (iii) uma cadeia pesada FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (B) a substitution of arginine (R) for alanine (A) or a conservative substitution thereof at position 5, and (iii) a heavy chain FR3 with SEQ amino acid sequence. ID N.° 35 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 35 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 35, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 1; ID No. 35, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of lysine (K) to arginine (R) or a conservative substitution thereof at position 1; (b) uma substituição de alanina (A) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; (B) substitution of an alanine (A) to valine (V) or a conservative substitution thereof at position 2; (c) uma substituição de leucina (L) por isoleucina (I) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 4; (C) a substitution of leucine (L) for isoleucine (I) or a conservative substitution thereof at position 4; (d) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 10; (D) a substitution of serine (S) for threonine (T) or a conservative substitution thereof at position 10; (e) uma substituição de glutamina (Q) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 16; (E) a substitution of glutamine (Q) for glutamic acid (E) or a conservative substitution thereof at position 16; (f) uma substituição de treonina (T) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 21; (F) substitution of a threonine (T) with arginine (R) or a conservative substitution thereof at position 21; (g) uma substituição de ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 23; (G) a substitution of aspartic acid (D) for glutamic acid (E) or a conservative substitution thereof at position 23; (h) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 25; (H) a substitution of serine (S) for threonine (T) or a conservative substitution thereof at position 25; e (i) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; and (i) a substitution of phenylalanine (F) for tyrosine (Y) or a conservative substitution thereof at position 29; e (iv) uma cadeia pesada FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. and (iv) a heavy chain FR4 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 36 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 36 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 36, mas por uma substituição de lisina (K) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7, e em que dita região variável da cadeia leve compreende: (i) uma cadeia leve FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 36, but for a substitution of lysine (K) to valine (V) or a conservative substitution thereof at position 7, and wherein said light chain variable region comprising: (i) a light chain FR1 with amino acid sequence of SEQ. ID N.° 49 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 49 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 49, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 27; ID No. 49, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) substitution of an alanine (A) to threonine (T) or a conservative substitution thereof at position 27; (b) uma substituição de alanina (A) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 28; (B) substitution of an alanine (A) with proline (P) or a conservative substitution thereof at position 28; (c) uma substituição de prolina (P) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; (C) substitution of a proline (P) with leucine (L) or a conservative substitution thereof at position 29; (d) uma substituição de valina (V) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (D) a substitution of valine (V) for leucine (L) or a conservative substitution thereof at position 31; (e) uma substituição de ácido glutâmico (E) por glutamina (Q) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 37; (E) a substitution of glutamic acid (E) for glutamine (Q) or a conservative substitution thereof at position 37; (d) uma substituição de serina (S) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 38; (D) a substitution of serine (S) with proline (P) or a conservative substitution thereof at position 38; (f) uma substituição de valina (V) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 39; (F) a substitution of valine (V) to alanine (A) or a conservative substitution thereof at position 39; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-20; and a deletion of 1-20 amino acid residues; (ii) uma cadeia leve FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (Ii) a light chain FR2 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 50 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 50 or the amino acid sequence SEQ. ID N. 0 50, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; 0 ID NO: 50, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of phenylalanine (F) for tyrosine (Y) or a conservative substitution thereof at position 2; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5; and (b) a substitution of arginine (R) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 5; (iii) uma cadeia leve FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (Iii) a light chain FR3 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 51 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 51 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 51, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por ácido aspártico (D) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 14; ID No. 51, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) substitution of an alanine (A) with aspartic acid (D) or a conservative substitution thereof at position 14; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 18; and (b) a substitution of arginine (R) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 18; e (iv) uma cadeia leve FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. and (iv) a light chain FR4 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 52 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 52 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 52, mas por uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7; ID No. 52, but replacing by a leucine (L) for valine (V) or a conservative substitution thereof at position 7;

Numa modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, compreende uma região variável da cadeia pesada FR1 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof, comprises a heavy chain variable region of FR1 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 33, 37 ou 44; ID No. 33, 37 or 44; uma região variável da cadeia pesada FR2 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. a variable region of the heavy chain FR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 34, 38 ou ID No. 34, or 38

45; 45; uma região variável da cadeia pesada FR3 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. a variable heavy chain FR3 region having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 35, 39, 46, 47 ou 48; ID No. 35, 39, 46, 47 or 48; uma região variável da cadeia pesada FR4 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. a variable region of the heavy chain FR4 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 36 ou 40; ID NO: 36 or 40; uma região variável da cadeia leve FR1 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. a variable region of the light chain FR1 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 49 ou 53; ID NO: 49 or 53; uma região variável da cadeia leve FR2 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. a variable region of the light chain FR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 50, 54 ou 60; ID No. 50, 54 or 60; uma região variável da cadeia leve FR3 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. a variable light chain FR3 region having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 51, 55 ou ID No. 51, or 55

61; 61; e uma região variável da cadeia leve FR4 com uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ. and a light chain variable region FR4 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.0 52 ou 5 6 . ID N.0 5 or 52 6.

Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo pode ser rotulado com um rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos. An isolated antibody or antigen binding fragment thereof can be labeled with a detectable label, a therapeutic label or both.

Numa modalidade, um fragmento de ligação ao antigeno é, por exemplo, uma cadeia pesada variável, uma cadeia leve variável, um Fv, um scFv, um Fab, um F(ab')2, um anticorpo fabricado por engenharia genética, um anticorpo monoclonal ou em anticorpo humanizado. In one embodiment, an antigen-binding fragment is, for example, a variable heavy chain, a light chain variable, an Fv, an scFv, a Fab, an F (ab ') 2, an antibody produced by genetic engineering, antibody or humanized monoclonal antibody. É providenciado aqui um kit para tratar uma condição patológica associada com LOXL2, que compreende uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo de qualquer uma das modalidades precedentes e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Provided herein is a kit for treating a pathological condition associated with LOXL2, a composition comprising an antibody or antigen binding fragment thereof of any one of the preceding embodiments and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Uma condição patológica associada com L0XL2 pode ser, por exemplo, um tumor, uma metástase, angiogénese ou fibrose. A pathological condition associated with L0XL2 may be, for example, a tumor, a metastasis, angiogenesis and fibrosis. Um kit pode ainda compreender um rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos. A kit may further comprise a detectable label, a therapeutic label or both. Kits podem ainda compreender instruções escritas que descrevem como conjugar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo com o rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos. Kits may further comprise written instructions describing how to combine the antibody or antigen binding fragment thereof with a detectable label, a therapeutic label or both. Além disso, as instruções escritas podem descrever como administrar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. Furthermore, the written instructions may describe how to administer the antibody or antigen binding fragment thereof. Numa modalidade, as composições no kit são livres de pirogénios e podem, nalgumas ocasiões, ser liofilizadas. In one embodiment, the compositions in the kit are pyrogen-free and may, on occasions, be lyophilized. É providenciado aqui um método de diagnosticar uma condição patológica associada com L0XL2 que compreende avaliar um nível de L0XL2 numa amostra de um sujeito contactando dita amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo descrito aqui, em que uma alteração no nível de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença ou aumento de um tumor ou metástase. It is provided herein a method of diagnosing a pathological condition associated with L0XL2 comprising assessing a level of L0XL2 a sample from a subject by contacting said sample with an antibody or binding fragment antigen thereof described herein, wherein a change in level of L0XL2 in the sample compared to a reference sample indicates the presence or increase of a tumor or metastasis. Uma condição patológica associada com L0XL2 pode ser, por exemplo, um tumor, uma metástase, angiogénese ou uma condição patológica fibrótica. A pathological condition associated with L0XL2 may be, for example, a tumor, a metastasis, angiogenesis or pathological fibrotic condition. Numa modalidade, um aumento nos níveis de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença de um tumor ou metástase ou um aumento no crescimento do tumor ou metastático. In one embodiment, an increase in the levels of L0XL2 in the sample compared to a reference sample indicates the presence of a tumor or metastasis, or an increase in tumor or metastatic growth. Uma amostra referência é uma amostra colhida do sujeito num ponto temporal anterior ou uma amostra de outro indivíduo. A reference sample is a sample taken from the subject at an earlier time point or a sample from another individual. Os níveis de níveis L0XL2 na amostra são detetados contactando a amostra com qualquer um dos anticorpos or fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos descritos aqui. The levels L0XL2 levels in the sample are detected by contacting the sample with any of the antibodies or antigen binding fragments thereof described herein. Para fins de deteção, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é rotulado de forma detetável conforme necessário, dependendo do método utilizado para avaliar a ligação. For detection purposes, an antibody or antigen binding fragment thereof is detectably labeled form as required, depending on the method used to assess binding. É providenciado aqui um método de inibir L0XL2 contactando uma amostra ou um tecido celular com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Provided herein is a method of inhibiting L0XL2 contacting a sample a cell or tissue with an antibody or antigen binding fragment thereof, described herein. Numa modalidade, a ligação de dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo a L0XL2 inibe a atividade enzimática de L0XL2. In one embodiment, binding of said antibody or antigen binding fragment thereof inhibits the L0XL2 L0XL2 enzymatic activity.

Inibir LOX ou L0XL2 pode reduzir o crescimento tumoral num sujeito seja parcialmente ou completamente. Inhibiting LOX or L0XL2 can reduce tumor growth in a subject is partially or completely. Inibir L0XL2 pode reduzir a angiogénese num sujeito, de tal modo que ocorre um beneficio terapêutico. Inhibiting L0XL2 can reduce angiogenesis in a subject, such that there is a therapeutic benefit. Inibir L0XL2 pode reduzir a fibrose num sujeito, de tal modo que ocorre um beneficio terapêutico. Inhibiting L0XL2 can reduce fibrosis in a subject, such that there is a therapeutic benefit. E providenciado aqui um método de reduzir o crescimento de um tumor num sujeito, compreendendo administrar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Is provided herein is a method of reducing growth of a tumor in a subject, comprising administering an antibody or antigen binding fragment thereof, described herein. Um tumor pode ser um tumor primário ou um tumor metastático. A tumor may be a primary tumor or a metastatic tumor. Num aspeto, um tumor é, por exemplo, cancro do pulmão (incluindo adenocarcinoma pulmonar, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células grandes, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma das células não pequenas, carcinoma das células pequenas, mesotelioma); In one aspect, a tumor is for example cancer, lung cancer (including lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, bronchioloalveolar carcinoma, non-small cell, small cell carcinoma, mesothelioma); cancro da mama (incluindo carcinoma dutal, carcinoma lobular, cancro da mama inflamatório, cancro da mama claro, carcinoma mucinoso); breast cancer (including ductal carcinoma, lobular carcinoma, inflammatory breast cancer, clear breast cancer, mucinous carcinoma); cancro colo-retal (cancro do cólon, cancro retal); colorectal cancer (colon cancer, rectal cancer); cancro anal; Anal Cancer; cancro pancreático (incluindo adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células dos ilhéus, tumores neuroendócrinos); pancreatic cancer (including pancreatic adenocarcinoma, islet cell carcinoma, neuroendocrine tumors); cancro da próstata; prostate cancer; carcinoma ovárico (carcinoma epitelial ovárico ou tumor da superfície epitelial-estroma incluindo tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso, tumor dos cordões sexuais-estroma); ovarian carcinoma (epithelial ovarian carcinoma or tumors of epithelial-stromal surface including serous tumors, mucinous cystadenocarcinoma and endometrioid tumors, tumor-stroma of sexual strands); carcinoma hepático e do duto biliar (incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hemangioma); liver carcinoma and biliary duct (including hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, haemangioma); carcinoma esofágico (incluindo adenocarcinoma esofágico e carcinoma das células escamosas); esophageal carcinoma (including esophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma); linfoma de não Hodgkin; non-Hodgkin's lymphoma; carcinoma da bexiga; bladder carcinoma; carcinoma do útero (incluindo adenocarcinoma do endométrio, carcinoma seroso papilar uterino, carcinoma das células claras uterino, sarcomas uterinos e leiomiossarcomas, tumores mulerianos mistos); carcinoma of the uterine (including endometrial adenocarcinoma, uterine serous papillary carcinoma, clear cell carcinoma, uterus, uterine sarcomas and leiomyosarcomas, mixed mulerianos tumors); glioma, glioblastoma, medulablastoma e outros tumores cerebrais; glioma, glioblastoma and other brain tumors medulablastoma; cancros renais (incluindo carcinoma das células renais, cancro da mama claro, tumor de Wilm); kidney cancers (including renal cell carcinoma, clear of breast cancer, Wilm's tumor); cancro da cabeça e do pescoço (incluindo carcinomas das células escamosas); cancer of the head and neck (including squamous cell carcinoma); cancro do estômago (adenocarcinoma estomacal, tumor estromal gastrointestinal); stomach cancer (stomach adenocarcinoma, gastrointestinal stromal tumor); mieloma múltiplo; multiple myeloma; cancro testicular; testicular cancer; tumor das células germinativas; germ cell tumors; tumor neuroendócrino; neuroendocrine tumor; cancro cervical; cervical cancer; carcinóides do trato gastrointestinal, mama e outros orgãos; carcinoids of the gastrointestinal tract, breast and other organs; carcinoma de células em anel de sinete; signet ring cell carcinoma; tumores mesenquimatosos incluindo sarcomas, fibrossarcomas, hemangioma, angiomatose, hemangiopericitoma, hiperplasia estromal pseudoangiomatosa, miofibroblastoma, fibromatose, tumor miofibroblástico inflamatório, lipoma, angiolipoma, tumor das células granulares, neurofibroma, schwanoma, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomiossarcoma, osteossarcoma, leiomioma ou um leiomirssarcoma. mesenchymal tumors including sarcomas, fibrosarcomas, haemangioma, angiomatosis, hemangiopericytoma, hyperplasia stromal pseudoangiomatosa, myofibroblastoma, fibromatosis, inflammatory myofibroblastic tumor, lipoma, angiolipoma, tumor of granular cells, neurofibroma, schwannoma, angiosarcoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, osteosarcoma, leiomyoma or leiomirssarcoma . Numa modalidade, um tumor é, por exemplo, um tumor do cólon, um tumor ovárico, um tumor pulmonar, um tumor esofágico, um tumor mamário, um tumor da próstata, um carcinoma. In one embodiment, a tumor is, for example, colon tumor, an ovarian tumor, a lung tumor, esophageal tumor, a breast tumor, a prostate tumor, a carcinoma. 0 tamanho do tumor no sujeito pode ser reduzido em pelo menos 10%, 25%, 50%, 70%, 90%, 95% ou mais após tratamento quando comparado com o tumor no sujeito antes do tratamento. 0 tumor size can be reduced in the subject by at least 10%, 25%, 50%, 70%, 90%, 95% or more after treatment compared with the tumor in the subject prior to treatment. Num aspeto, a sobrevivência de um sujeito com um tumor é aumentada em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos, 10 anos ou mais comparada com a de um sujeito ao qual não é administrado o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. In one aspect, the survival of a subject having a tumor is increased by at least 10 days, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 2 years, 5 years, 10 years or more compared to a subject which does not it is administered the antibody or antigen binding fragment thereof. A carga de tumores metastáticos de um sujeito pode ser estabilizada após a administração de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. The metastatic tumor burden of a subject can be stabilized after administration of an antibody or antigen binding fragment thereof, described herein. Por exemplo, a carga de tumores metastáticos pode ser estabilizada durante pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 5 anos, 10 anos ou mais. For example, metastatic tumor burden can be stabilized for at least 10 days, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 2 years, 5 years, 10 years or more. É providenciado aqui um método de inibir a angiogénese num sujeito por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Provided herein is a method of inhibiting angiogenesis in a subject by an antibody or antigen binding fragment thereof, described herein. É providenciado aqui um método de inibir uma doença fibrótica num sujeito administrando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Provided herein is a method of inhibiting a fibrotic disease in a subject by administering an antibody or antigen binding fragment thereof, described herein. Doenças fibróticas incluem, mas não se limitam a, fibrose hepática, fibrose pulmonar, fibrose renal, fibrose cardíaca e escleroderma. fibrotic diseases include, but are not limited to, liver fibrosis, pulmonary fibrosis, kidney fibrosis, cardiac fibrosis and scleroderma. Numa modalidade, a fibrose renal inclui, mas não se limita a, nefropatia diabética, refluxo vesicoureteral, fibrose renal tubulointersticial; In one embodiment, renal fibrosis includes, but is not limited to, diabetic nephropathy, vesicoureteral reflux, tubulointerstitial renal fibrosis; glomerulonefrite ou nefrite glomerular, incluindo glomerulosclerose segmentar focal e glomerulonefrite membranosa e nefrite glomerular mesangiocapilar. glomerulonephritis or glomerular nephritis, including focal segmental glomerulosclerosis and membranous glomerulonephritis and glomerular nephritis mesangiocapillary. Numa modalidade, a fibrose hepática resulta em cirrose, e em condições patológicas associadas, tais como hepatite virai crónica, doença hepática gorda não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite alcoólica (ASH), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose biliar primária (PBC), cirrose biliar e hepatite autoimune. In one embodiment, liver fibrosis results in cirrhosis and in pathological conditions such as chronic viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), alcoholic steatohepatitis (ASH), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), biliary cirrhosis Elementary (PBC), biliary cirrhosis and autoimmune hepatitis. É providenciado aqui um método de diminuir a formação de matriz extracelular contactando uma amostra ou tecido celular com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Provided herein is a method of reducing extracellular matrix formation by contacting a sample or tissue with an antibody or antigen binding fragment thereof, described herein. Administração ou contacto pode ocorrer, num exemplo, por administração parentérica. Administration or contacting may occur, in one example, for parenteral administration. É providenciado aqui um método de monitorizar a resposta de um sujeito à administração de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui detetando os níveis e/ou atividade de LOXI2. Provided herein is a method of monitoring the response of a subject to administration of an antibody or antigen binding fragment thereof, described herein for detecting levels and / or activity LOXI2.

Numa modalidade, dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, é rotulado com um rótulo terapêutico . In one embodiment, said antibody or antigen binding fragment thereof, is labeled with a therapeutic label. É contemplada aqui a terapêutica de combinação na qual os métodos compreendem ainda co-administrar um segundo agente terapêutico. It is here contemplated combination therapy in which the methods further comprise coadministering a second therapeutic agent. Numa modalidade, o segundo agente terapêutico é um anticorpo ou um agente quimioterapêutico. In one embodiment, the second therapeutic agent is an antibody or a chemotherapeutic agent. E providenciada aqui uma utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui na preparação de uma formulação para inibir L0XL2, reduzir o crescimento tumoral, inibir a angiogénese, inibir uma doença fibrótica ou diminuir a formação de matriz extracelular num sujeito. Provided herein is a use of an antibody or binding fragment antigen thereof, described herein in the preparation of a composition for inhibiting L0XL2, reducing tumor growth, inhibiting angiogenesis, inhibiting a fibrotic disease or reduce the formation of extracellular matrix in a subject . Numa modalidade, dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é rotulado com um rótulo terapêutico e, opcionalmente, um rótulo diagnóstico. In one embodiment, said antibody or antigen binding fragment thereof is labeled with a therapeutic label, and optionally a diagnostic label. É providenciada aqui uma utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui na preparação de uma formulação para diagnosticar um tumor ou metástase que compreende avaliar os níveis de L0XL2 numa amostra de um paciente, em que uma alteração nos níveis de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença de um tumor ou metástase ou um aumento no crescimento do tumor ou metastático. Provided herein is a use of an antibody or binding fragment antigen thereof, described herein in the preparation of a formulation for diagnosing a tumor or metastasis which comprises measuring the levels of L0XL2 a sample from a patient, wherein a change in levels of L0XL2 in the sample compared to a reference sample indicates the presence of a tumor or metastasis, or an increase in tumor or metastatic growth. Numa modalidade, dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo é rotulado com um rótulo diagnóstico. In one embodiment, said antibody or antigen binding fragment thereof is labeled with a diagnostic label.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

Características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações em anexo. Features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. Um melhor entendimento das caracteristicas e vantagens da presente invenção será obtido por referência à seguinte descrição detalhada que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados e os desenhos acompanhantes. A better understanding of the features and advantages of the invention will be obtained by reference to the following detailed description presents illustrative embodiments, in which principles of the invention are utilized, and the accompanying drawings. A Figura 1 ilustra a Enzimologia da Lisil Oxidase. Figure 1 illustrates Enzymology lysyl oxidase. Enzimas LOX/L atuam através de um mecanismo ping-pong que pode ser descrito pela cinética de Michaelis-Menten. Enzymes LOX / L act via a ping-pong mechanism which can be described by Michaelis-Menten kinetics. A Figura 2 ilustra modos comuns de inibição enzimática. Figure 2 illustrates common mode of enzyme inhibition. A Figura 3 ilustra βΑΡΝ é um inibidor competitivo de L0XL2. Figure 3 illustrates βΑΡΝ is a competitive inhibitor L0XL2. A Figura 4 ilustra modos de inibição enzimática: L0XL2. Figure 4 illustrates modes of enzymatic inhibition: L0XL2. A Figura 5 ilustra localização de L0XL2 extracelular e função de L0XL2 extracelular. Figure 5 illustrates L0XL2 extracellular localization and extracellular L0XL2 function.

A Figura 6A providencia as sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada e a Figura 6B providencia as sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de um anticorpo que se liga à região SRCR3-4 de L0XL2. Figure 6A provides a variable region of the amino acid sequences of the heavy chain, and Figure 6B provides a variable region of the amino acid sequences of the light chain of an antibody which binds to the region of SRCR3-4 L0XL2. Para cada região variável, são mostrados péptidos sinais em itálico, CDRs são sublinhadas e o inicio da estrutura constante é mostrada a negrito. For each variable region, signal peptides are shown in italic, the CDRs are underlined and the start of the continuous structure is shown in bold. A Figura 7A providencia as sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada e as Figuras 7B e 7C providenciam sequências de aminoácidos de duas regiões variáveis da cadeia leve de anticorpos que se ligam a LOX. Figure 7A provides the amino acid sequences of a heavy chain variable region and Figures 7B and 7C provide amino acid sequences of two light chain variable regions of antibodies that bind to LOX. Para cada região variável, são mostrados péptidos sinais em itálico e CDRs são sublinhadas. For each variable region, signal peptide are shown in italics and the CDRs are underlined. A Figura 8 providencia uma atualização do rastreio B de proteínas utilizando anticorpos anti-L0XL2. Figure 8 provides a screening refresh B L0XL2 proteins using anti-antibodies. A atividade enzimática de L0XL2 foi avaliada. The enzymatic activity was evaluated L0XL2. A Figura 9 ilustra a atividade enzimática do anticorpo antÍ-L0XL2 AB0023. Figure 9 illustrates the enzymatic activity of anti-L0XL2 AB0023 antibody. A Figura 10 demonstra que o anticorpo anti-LOXL2 AB0023 é um inibidor não competitivo. Figure 10 demonstrates that anti-LOXL2 AB0023 antibody is a noncompetitive inhibitor. A Figura 11 ilustra a afinidade de ligação e a taxa de dissociação do anticorpo anti-LOXL2 AB0023. Figure 11 illustrates the binding affinity and dissociation rate of the anti-LOXL2 antibody AB0023. A Figura 12 ilustra o mapeamento do domínio do anticorpo anti-LOXL2 AB0023; Figure 12 illustrates the mapping of the field of anti-LOXL2 antibody AB0023; ο AB0023 liga-se ao domínio SRCR 3-4 de LOXL2. ο AB0023 binds to SRCR domain 3-4 LOXL2. A Figura 13 mostra que o anticorpo anti-LOXL2 AB0023 demonstra inibição de migração/invasão consistente no colagénio I e colagénio IV, de sobrenadantes através de 10 ml de material de preparação e 100 ml de preparação ampliado e material ascites. Figure 13 shows that anti-LOXL2 antibody AB0023 demonstrates inhibition of migration / invasion consisting in collagen I and IV collagen, supernatants through 10 ml of preparation material and 100 ml of material expanded and ascites preparation. A inibição parcial também foi observada em ensaios de adesão celular. Partial inhibition was also observed in cell adhesion assays. Em amostras teste, as células no ensaio migram em direção ao soro e a fluorescência é medida para determinar a contagem e migração das células. In the test samples, the test cells migrating towards the serum, and the fluorescence is measured to determine the count and cell migration. A barra mais à esquerda é uma amostra controlo na qual o anticorpo está presente e a camada de baixo contém soro (controlo positivo para invasão celular). The left most bar is a control sample in which the antibody is present and the bottom layer contains serum (positive control for cell invasion). A segundo barra da esquerda é um controlo negativo no qual o anticorpo está presente e a camada de baixo não contém soro. The second bar is left in a negative control where the antibody is present and the bottom layer does not contain serum. A Figura 14 providencia sequências de aminoácidos das cadeias pesada variável (VH) e leve variável (VL) de anticorpo monoclonal murino AB0023 (anti-hLOXL2). Figure 14 provides amino acid sequences of variable heavy chains (VH) and variable light (VL) of murine monoclonal antibody AB0023 (anti-hLOXL2). Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são mostradas a sublinhado negrito. complementarity determining regions (CDRs) are shown in bold underline. A Figura 14 também providencia quatro variantes humanizadas do anticorpo monoclonal murino. Figure 14 also provides four humanized variants of the murine monoclonal antibody. Resíduos nas regiões estrutura (FR) das cadeias leve e pesada variáveis humanizadas que diferem do anticorpo monoclonal murino são mostradas por traços interrompidos (---) ou por sublinhado em itálico. Residues in the framework regions (FR) of humanized light and heavy chain variable which differ from the murine monoclonal antibody are shown by interrupted lines (---) in italics or underlining. A Figura 15 demonstra que M64 se liga a LOX numa forma dependente da dose. Figure 15 demonstrates that M64 binds LOX in a dose dependent manner. O Lote 3 tem uma KD de 6,6 nM, o Lote 4 tem uma KD de 5,0 nM e o Lote 5 tem uma KD de 5,7 nM. Lot 3 has a KD of 6.6 nM, Lot 4 has a KD of 5.0 nM and the Batch 5 has a KD of 5.7 nM. A Figura 16 ilustra a afinidade de ligação do anticorpo anti-LOX M64. Figure 16 illustrates binding affinity of anti-LOX antibody M64. A Figura 17 demonstra que os anticorpos anti-LOXL2 inibiram o crescimento celular de quatro linhas celulares derivadas de cancro. Figure 17 shows that anti-LOXL2 antibodies inhibited cell growth of four cell lines derived from cancer.

As Figuras 18 demonstra um efeito sinérgico de um anticorpo anti-LOX em combinação com cisplatina. Figures 18 shows a synergistic effect of an anti-LOX antibody in combination with Cisplatin. Os valores IC50 de M64 também foram determinados em quatro linhas celulares. The M64 IC50 values ​​were determined in four cell lines.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da medicina, incluindo diagnóstico e tratamento de cancro. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to the field of medicine, including diagnosis and treatment of cancer. Um aspeto da invenção refere-se a L0XL2 como indicadores da progressão da doença e um alvo para agentes terapêuticos. One aspect of the invention relates to L0XL2 as indicators of the progression of the disease and a target for therapeutic agents. A presente invenção providencia metodologia inovadora e composição relacionada e kits para diagnosticar ou monitorizar várias doenças associadas com a proliferação celular anormal, angiogénese e fibrose, utilizando agentes gue reconhecem especificamente formas ativas ou maduras de proteínas tipo lisil oxidase (L0XL2). The present invention provides innovative methodology and related composition and kits for diagnosing or monitoring various diseases associated with abnormal cell proliferation, angiogenesis and fibrosis using gue agents specifically recognize active or mature form of lysyl oxidase like proteins (L0XL2). São providenciados métodos para diagnosticar ou monitorizar metástase cancerígena num sujeito, compreendendo: avaliar os níveis de L0XL2 ativo ou atividade no sangue ou num tumor, pelos guais uma alteração nos níveis de L0XL2 ativo ou atividade no sangue ou no tumor em comparação com uma amostra referência, indica a presença de crescimento tumoral metastático. methods are provided to diagnose or monitor cancer metastasis in a subject, comprising: evaluating the active L0XL2 levels or activity in blood or a tumor, by guais a change in active L0XL2 levels or activity in the blood or in the tumor compared to a reference sample indicates the presence of metastatic tumor growth.

Conforme descrito com mais detalhe a seguir, os níveis de L0XL2 ativo podem ser avaliados por vários métodos incluindo, mas não limitados a, imunohistoquímica utilizando anticorpos que se ligam especificamente à forma ativa ou madura de L0XL2. As described in more detail below, the active L0XL2 levels can be assessed by various methods including, but not limited to, immunohistochemistry using antibodies which specifically bind to the active or mature form of L0XL2. A atividade enzimática do L0XL2 ativo pode ser medida utilizando vários métodos incluindo, mas não limitados a, ensaios fluorométricos e cromogénicos. The enzymatic activity of the active L0XL2 can be measured using various methods including, but not limited to, chromogenic and fluorometric assays.

Também são providenciados aqui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que reconhecem especificamente formas ativas de L0XL2, métodos para gerar anticorpos contra formas ativas de L0XL2 e método de utilizer os anticorpos para tratar a proliferação celular anormal, angiogénese e fibrose. Also provided herein are antigen-binding fragments thereof or antibodies that specifically recognize the active forms L0XL2, methods for generating antibodies against active forms of L0XL2 method and utilizer antibodies to treat abnormal cell proliferation, angiogenesis and fibrosis. I. Definições gerais A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como vulgarmente entendidos por alguém com habilitação comum na arte à qual esta invenção pertence. I. General Definitions Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Se uma definição apresentada nesta secção é contrária a, ou de outra forma inconsistente com uma definição apresentada nas patentes, pedidos, pedidos publicados e noutras publicações, a definição apresentada nesta secção prevalece. If a definition in this section is contrary to or otherwise inconsistent with a definition set forth in the patents, applications, published applications and other publications, the definition in this section shall prevail. Os cabeçalhos são providenciados aqui por conveniência apenas. The headers are provided here for convenience only.

Conforme utilizado aqui, "um" As used herein, & quot; one & quot; ou "uma" or & quot; one & quot; significa "pelo menos um" means & quot; at least one & quot; ou "um ou mais." or & quot; one or more. & quot; A frase "substituição de aminoácidos conservadora" The phrase & quot; conservative substitution & quot amino acids; refere-se ao agrupamento de aminoácidos com base em certas propriedades comuns. refers to grouping of amino acids on the basis of certain common properties. Uma forma funcional de definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácidos entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz, GE e RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). A functional way to define common properties between individual amino acids is to analyze the normalized frequencies of amino acid changes between corresponding proteins of homologous organisms (Schulz, GE, and RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com tais analyses, grupos de aminoácidos podem ser definidos onde aminoácidos dentro de um grupo se trocam preferencialmente uns com os outros e, portanto, são parecidos um com o outro mais no seu impacto na estrutura global da proteína (Schulz, GE e RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). According to such analyzes, groups of amino acids may be defined where amino acids within a group exchange preferentially with each other and therefore are similar to each other most in their impact on the overall protein structure (Schulz, GE, and RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Exemplos de grupos de aminoácidos definidos desta forma incluem: (i) um grupo carregado, consistindo em Glu e Asp, Lys, Arg e His, (ii) um grupo carregado positivamente, consistindo em Lys, Arg e His, (iii) um grupo carregado negativamente, consistindo em Glu e Asp, (iv) um grupo aromático, consistindo em Phe, Tyr e Trp, (v) um anel de nitrogénio, consistindo em His e Trp, (vi) um grande grupo não polar alifático, consistindo em Vai, Leu e Ile, (vii) um grupo ligeiramente polar, consistindo em Met e Examples of amino acid groups defined in this manner include: (i) a charged group, consisting of Glu and Asp, Lys, Arg and His, (ii) a positively charged group, consisting of Lys, Arg and His, (iii) a group negatively charged, consisting of Glu and Asp, (iv) an aromatic group, consisting of Phe, Tyr and Trp, (v) a nitrogen ring consisting of His and Trp, (vi) a large non-polar aliphatic group, consisting of Val, Leu and Ile, (vii) a slightly-polar group, consisting of Met and

Cys, (viii) um grupo pequeno de resíduos, consistindo em Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gin e Pro, (ix) um grupo alifático consistindo em Vai, Leu, lie, Met e Cys, e (x) um grupo hidroxilo pequeno consistindo em Ser e Thr. Cys, (viii) a small residue group, consisting of Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gin and Pro, (ix) an aliphatic group consisting of Val, Leu, Ile, Met and Cys, and (x) a small hydroxyl group consisting of Ser and Thr.

Além dos grupos apresentados anteriormente, cada resíduo de aminoácidos pode formar o seu grupo e o grupo formado por um aminoácido individual pode ser referido por uma abreviatura com simplesmente uma e/ou três letras para aquele aminoácido vulgarmente utilizada na arte, conforme descrito anteriormente. In addition to the groups presented above, each amino acid residue may form its group and the group formed by an individual amino acid may be referred to by the abbreviation with just one and / or three letters for that amino acid commonly used in the art, as described above.

Um "resíduo conservado" A & quot; conserved residue & quot; é um aminoácido que é relativamente invariante ao longo de uma gama de proteínas semelhantes. is an amino acid that is relatively invariant across a range of similar proteins. Com frequência, os resíduos conservados variarão apenas ao serem substituídos com um aminoácido semelhante, conforme descrito anteriormente para "substituição de aminoácidos conservadora". Often conserved residues will vary only by being replaced with a similar amino acid, as described above for & quot; conservative substitution & quot ;. amino acids

Pretende-se que a letra "x" It is intended that the letter & quot; x & quot; ou "xaa", conforme utilizada nas sequências de aminoácidos aqui, indique que qualquer um dos vinte aminoácidos padrão pode ser colocado nesta posição, a menos que especificamente indicado o contrário. or & quot; Xaa & quot ;, as used herein in the amino acid sequences indicate that any of the twenty standard amino acids may be placed in this position, unless specifically stated otherwise. Para os fins do desnho péptido-mimético, um "x" For the purposes of desnho peptide-mimetic, a & quot; x & quot; ou um "xaa" or a & quot; Xaa & quot; numa sequência de aminoácidos pode ser substituído por uma mímica do aminoácido presente na sequência alvo ou o aminoácido pode ser substituído por um espaçador de essencialmente qualquer forma que não interfira com a atividade do péptido-mimético. an amino acid sequence may be replaced by a mimic of the amino acid present in the target sequence or the amino acid can be replaced by a spacer of essentially any form that does not interfere with activity of the peptide mimetic. "Homologia" & Quot; Homology & quot; ou "identidade" or & quot; identity & quot; ou "semelhança" or & quot; like & quot; refere-se à semelhança de sequências enre dois péptidos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. refers to sequence similarity ENRE two peptides or between two nucleic acid molecules. Homologia e identidade podem cada ser determinadas comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Homology and identity can each be determined by comparing a position in each sequence which may be aligned for purposes of comparison. Quando uma posição equivalente nas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são idênticas nessa posição; When an equivalent position in the compared sequences is occupied by the same base or amino acid, then the molecules are identical at that position; quando o local equivalente ocupado pelo mesmo ou por um resíduo de aminoácido semelhante (por exemplo, semelhante na natureza estérica e/ou eletrónica), então as moléculas podem ser referidas homólogas (semelhantes) nessa posição. when the equivalent site occupied by the same or a similar amino acid residue (e.g., similar in steric nature and / or electronic), then the molecules can be refered homologous (similar) at that position. Expressão como uma percentagem de homologia/semelhança ou identidade refere-se a uma função do número de aminoácidos idênticos ou semelhantes nas posições partilhadas pelas sequências comparadas. Expression as a percentage of homology / similarity or identity refers to a function of the number of identical or similar amino acids at positions shared by the compared sequences. Uma sequência que é "não relacionada" A sequence that is & quot; unrelated & quot; ou "não homóloga" or & quot; non-homologous & quot; partilha menos de 40% de identidade, apesar de preferencialmente menos de 25% de identidade com uma sequência da presente invenção. shares less than 40% identity, though preferably less than 25% identity to a sequence of the present invention. Ao comparar duas sequências, a ausência de resíduos (aminoácidos ou ácidos nucleicos) ou presença de resíduos extra também diminui a identidade e homologia/semelhança. When comparing two sequences, the absence of residues (amino acids or nucleic acids) or presence of extra residues also decreases the identity and homology / similarity. O termo "homologia" The term & quot; homology & quot; descreve uma comparação abseada matematicamente de semelhanças de sequência que é utilizada para identificar genes ou proteínas com funções ou motivos semelhantes. abseada mathematically describes a comparison of sequence similarities which is used to identify genes or proteins with similar functions or motifs. As sequências de ácidos nucleicos (nucleotídeo, oligonucleotídeo) e aminoácidos (proteína) da presente invenção podem ser utilizadas como uma "sequência de consulta" The nucleic acid sequences (nucleotide, oligonucleotide) and amino acids (protein) of the present invention can be used as a & quot; query sequence & quot; para realizer uma pesquisa contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membros da família, sequências relacionadas ou homólogas. realizer for a search against public databases to, for example, identify other family members, related or homologous sequences. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. Such searches can be performed using the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) of Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. 215: 403-10. Pesquisas do nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, classificação=l00, comprimento da palavra=12 para obter sequências nucleotídicas homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. BLAST nucleotide searches can be the performed with the NBLAST program, score = L00, wordlength = 12 to obtain nucleotide sequences homologous to nucleic acid molecules of the invention. Pesquisas dos aminoácidos BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, classificação=50, comprimento da palavra=3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas proteína da invenção. BLAST searches of the amino acids can be performed with the XBLAST program, score = 50, wordlength = 3 to obtain amino acid sequences homologous to protein molecules of the invention. Para obter alinhamentos com intervalos para fins comparativos, pode ser utilizado BLAST com intervalos, conforme descrito em Altschul et al. To obtain gapped alignments for comparison purposes, it can be used at intervals BLAST as described in Altschul et al. , (1997) Nucleic Acid Res. 25(17):3389-3402. (1997) Nucleic Acids Res 25 (17):. 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e BLAST com intervalos, podem ser utilizados os parâmetros por defeito dos respetivos programas (por exemplo, XBLAST e BLAST) (ver, www.ncbi.nlm.nih.gov). When using BLAST and BLAST programs intervals may be used the default parameters of the respective programs (e.g., XBLAST and BLAST) (see, www.ncbi.nlm.nih.gov).

Conforme utilizado aqui, "identidade" As used herein, & quot; identity & quot; significa a percentagem de nucleotideos ou resíduos de aminoácidos idênticos nas posições correspondentes em duas ou mais sequências quando as sequências estão alinhadas para maximizar a correspondência da sequência, isto é, tendo em consideração intervalos e inserções. It means the percentage of nucleotides or amino acid residues identical to the corresponding positions in two or more sequences when the sequences are aligned to maximize sequence matching, i.e., taking into account gaps and insertions. A identidade pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados, aos descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, AM, editor, Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Identity can be readily calculated by known methods, including but not limited to, those described in Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, editor, Academic Press, Nova Iorque, 1993; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, editor, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, AM, e Griffin, HG, editores, Humana Press, New Jersey, 1994; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, AM, and Griffin, HG, publishers, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., editores, M Stockton Press, Nova Iorque, 1991; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., editors, M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos para determinar a identidade são desenhados para originar a maior correspondência entre as sequências testadas. Methods to determine identity are designed to give the largest match between the sequences tested. Além disso, métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Moreover, methods to determine identity are codified in publicly available computer programs. Métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não se limitam a, o pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acid Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, SF et al. , J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) e Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Computer program methods to determine identity between two sequences include, but are not limited to, the GCG program package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12 (1):. 387 (1984)), BLASTP , BLASTN, and FASTA (Altschul, SF et al, J Molec Biol 215:... 403-410 (1990) and Altschul et al, Nuc Acids res 25:... 3389-3402 (1997)). O programa BLAST X está publicamente disponível a partir do NCBI e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al. , J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) . O algoritmo Smith Waterman bem conhecido também pode ser utilizado para determinar identidade. O termo "substancialmente idêntica" significa identidade entre uma primeira sequência de aminoácidos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos que são i) idênticos a ou ii) substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos alinhados numa segunda sequência de aminoácidos, de modo que a primeira e segunda sequências de aminoácidos podem ter um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. The BLAST X program is publicly available from NCBI and other sources (BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;.. Altschul, S., et al, J. Mol.. . Biol. 215: 403-410 (1990) The well-known Smith Waterman algorithm may also be used to determine identity The term & quot; substantially identical & quot; means identity between a first amino acid sequence that contains a sufficient or minimum number of residues. amino acids that are i) identical to, or ii) conservative substitutions of aligned amino acid residues in a second amino acid sequence such that the first and second amino acid sequences can have a common structural domain and / or common functional activity. Por exemplo, sequências de aminoácidos substancialmente idênticas a LOX contêm um domínio estrutural comum com pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade, provavelmente 75% de identidade, mais provavelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com LOX. For example, amino acid sequences substantially identical LOX contain a common structural domain having at least about 60% or 65% identity, likely 75% identity, more likely 85%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with LOX. Por exemplo, sequências de aminoácidos que contêm um domínio estrutural comum com pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade, provavelmente 75% de identidade, mais provavelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com LOXL2 são designadas suficientemente ou substancialmente idênticas. For example, amino acid sequences that contain a common structural domain having at least about 60% or 65% identity, likely 75% identity, more likely 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity to LOXL2 are termed sufficiently or substantially identical. No contexto de sequências nucleotídicas, o termo "substancialmente idêntica" In the context of nucleotide sequence, the term & quot; substantially identical & quot; é utilizado aqui para referir-se a uma primeira sequência de ácidos nucleicos que contém um número suficiente ou mínimo de nucleotideos que são idênticos aos nucleotídeos alinhados numa segunda sequência de ácidos nucleicos, de modo que a primeira e a segunda sequências nucleotídicas codificam um polipeptídeo com atividade funcional comum ou codificam um domínio polipeptídico estrutural comum ou uma atividade polipeptídica funcional comum. It is used herein to refer to a first nucleic acid sequence that contains a sufficient or minimum number of nucleotides that are identical to nucleotides aligned in a second nucleic acid sequence so that the first and second nucleotide sequences encode a polypeptide with common functional activity, or encode a common structural polypeptide domain or a common functional polypeptide activity. Por exemplo, sequências nucleotídicas com pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade, provavelmente 75% de identidade, mais provavelmente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com sequências de ácidos nucleicos providenciadas aqui são designadas substancialmente idênticas. For example, nucleotide sequences having at least about 60% or 65% identity, likely 75% identity, more likely 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with the nucleic acid sequences provided herein are termed substantially identical. II. II. Proteínas Lisil Oxidase (LOX) e tipo Lisil Oxidase (LOXL) Proteins Lysyl oxidase (LOX) and type Lysyl oxidase (LOXL)

Tipicamente, os tumores sólidos contêm áreas de baixa tensão de oxigénio (hipoxia). Typically, solid tumors contain areas of low oxygen tension (hypoxia). Células hipóxicas colocam um grande problema no tratamento de cancro, porque estas células são altamente agressivas, metastáticas e resistentes à terapêutica. hypoxic cells pose a big problem in cancer treatment because these cells are highly aggressive, metastatic and resistant to therapy. Os mecanismos subjacentes que contribuem para estas caracteristicas são mal compreendidos. The underlying mechanisms that contribute to these features are poorly understood. A metástase coloca um problema particular no cancro da mama, porque não existe tratamento eficaz para a maioria dos pacientes com cancro da mama metastático detetável (Steeg, PS. Br. Can. Res. 2(6): 396-9 (2000)). Metastasis poses a particular problem in breast cancer because there is no effective treatment for most patients with detectable metastatic breast cancer (Steeg, PS Br Can Res 2 (6):.... 396-9 (2000)) . A matriz extracelular (ECM) pode ter uma influência curcial nas células tumorais (Chang e Werb. Trends Cell. Biol. 11: S37-43 (2001); e Radisky et al. Semin. Cancer Bio. 11: 87-95 (2001)). The extracellular matrix (ECM) may have an influence on curcial tumor cells (Chang and Werb Trends Cell Biol 11: S37-43 (2001); and Radisky et al Semin Cancer Bio. 11:..... 87-95 (2001 )). Ratinhos expostos a hipoxia exibem aumentos específicos de tecido na atividade da lisil oxidase (LOX), uma amina oxidase que desempenha um papel essencial na formação e manutenção do ECM (Brody et al. Am. Rev. Respir. Dis. 120: 1289-95 (2001)). Mice exposed to hypoxia exhibit tissue-specific increases in the activity of lysyl oxidase (LOX), one amine oxidase that plays an essential role in the formation and maintenance of the ECM (Brody et al Am Rev Respir Dis 120:.... 1289-95 (2001)). Um estudo recente de microarray confirmou o LOX como um gene induzido por hipoxia numa variedade de linhas celulares (Denko, NC. Oncogene 22: 5907-14 (2003)). A recent study confirmed the microarray LOX as a gene induced by hypoxia in a variety of cell lines (Denko, NC Oncogene. 22: 5907-14 (2003)). Contudo, não foi identificado um papel biológico de LOX em condições hipóxicas. However, a biological role of LOX in hypoxic conditions was not identified. LOX inicia a reticulação covalente de colagénios e elastina no ECM, aumentando a deposição da matriz insolúvel e força tênsil (Kagan e Li. J. Cell. Biochem. 88: 660-72 (2003)). LOX initiates the covalent crosslinking of collagen and elastin in the ECM, increasing insoluble matrix deposition and tensile strength (Kagan and Li, J. Cell Biochem 88:... 660-72 (2003)). A expressão de LOX é essencial para a cicatrização e função do tecido conjuntivo normal e os ratinhos knock-out morrem pouco depois do parto devido à instabilidade cardiovascular (Homstra et al. J. Biol. Chem. 278: 14387-93 (2003)). LOX expression is essential for wound healing and normal function of the tissue and knock-out mice die shortly after birth due to cardiovascular instability (Homstra et al J Biol Chem 278:... 14387-93 (2003)) .

Atividade de LOX diminuída está associada com doenças, tais como síndrome de Ehler-Danlos (Pinnell, SR. J. Invest. Dermatol. 79(Supp 1): 90S-92S (1982); Royce et al. Biochem. J. 192: 579-86 (1980); e Khakoo et al. Clin. Genet. 51: 109-14 (1997)). reduced LOX activity is associated with diseases such as Ehlers-Danlos syndrome (Pinnell, SR J. Invest Dermatol 79 (Supp 1): 90S-92S (1982); Royce et al Biochem J. 192.....: 579-86 (1980); and Khakoo et al Clin Genet 51: 109-14 (1997)).... Atividade de LOX aumentada contribui para doenças fibróticas e de remodelação do tecido, tais como cirrose hepática (Kagan, HM. Pathol. Res. Pract. 190: 910-0 (1994); Chanki et al. Br. J. Dermatol. 133: 710-5 (1995); e Ooshima e Midorikawa. Jpn. Circ. J. 41: 1337-40 (1977)). LOX activity contributes to enhanced fibrotic diseases and tissue remodeling, such as cirrhosis of the liver (Kagan HM Pathol Res Pract 190: 910-0 (1994); Chanki et al Br J Dermatol 133.......: . 710-5 (1995); and Ooshima and Midorikawa Jpn Circ J. 41: 1337-40 (1977))...

Expressão elevada de LOX correlaciona-se com preparação aumentada no cancro das células renais (Stassar et al. Br. J. Cancer, 85: 1372-82 (2001)) e é observada expressão aumentada de LOX em linhas celulares de cancro da mama altamente metastáticas e/ou invasivas (Kirschmann et al. Breast Cancer Res. Treat. 55: 127-36 (1999); e Kirschmann et al. Cancer Res. 62: 4478-83 (2002)). High expression of LOX correlates with increased preparation on renal cell cancer (Stassar et al Br J Cancer, 85:.. 1372-82 (2001)) and is observed increased expression of LOX in breast cancer cell lines highly metastatic and / or invasive (Kirschmann et al Breast Cancer res Treat 55: 127-36 (1999); and Kirschmann et al Cancer res 62:... 4478-83 (2002)..). Em contraste, LOX atua como um supressor de tumor em reversores não tumorgénicos de fibroblastos ras-transformados (Smith-Mungo e Kagan. Matrix Biol. 16: 387-98 (1998)) . In contrast, LOX acts as a tumor suppressor in non tumorgénicos reversers ras-transformed fibroblasts (Smith and mung Kagan Matrix Biol. 16:. 387-98 (1998)). A perda de LOX está associada com tumorgénese em vários tipos de cancro, tais como cancro gástrico, do cólon e da próstata (Ren et al. Cancer Res. 58: 1285-90 (1998); Cxiszar et al. Int. J. Cancer 97: 636-42 (2002); e Kaneda et al. Cancer Res. 64: 6410-5 (2004)). The loss of LOX is associated with tumorgénese in various types of cancer such as gastric cancer, colon and prostate cancer (Ren et al Cancer Res. 58:.. 1285-90 (1998); Cxiszar et al Int J Cancer. 97: 636-42 (2002); and Kaneda et al Cancer res 64: 6410-5 (2004))... Pareceria, assim, que o papel supressor de tumor de LOX depende do tipo de célula e estado de transformação. It would seem, therefore, that the role of LOX tumor suppressor depends on the cell type and status processing. Demonstrou-se recentemente que o domínio pró-péptido (e não a enzima ativa) é responsável pelas atividades de supressão de tumor. It has been shown recently that the propeptide domain (and not the active enzyme) is responsible for tumor suppression activity. No cancro da mama, a expressão aumentada de LOX está associada com a reação stromal inicial (Decitre et al. Lab. Invest. 78: 143-51 (1998)) e o tratamento com LOX anti-senso neste tipo de célula cancerígena previne a invasão in vitro (Kirschmann et al. Cancer Res. 62: 4478-83 (2002)). In breast cancer, overexpression of LOX is associated with the initial stromal reaction (Decitre et al Lab Invest 78:... 143-51 (1998)) and treatment with antisense LOX in this cancer cell type prevents invasion in vitro (Kirschmann et al Cancer res. 62:. 4478-83 (2002)). A sequência de aminoácidos de LOXL2 partilha uma vasta homologia de sequência com a ligação ao cobre conservada e domínios catalíticos de ambos LOX e LOXL. The amino acid sequence of LOXL2 sharing extensive sequence homology with the conserved copper binding and catalytic domains of both LOX and LOXL. Estes domínios conservados são codificados por cinco exões consecutivos dentro dos genes LOX, LOXL e L0XL2 que também mantêm conservação da estrutura exão-intrão. These conserved domains are encoded by five consecutive exons within the LOX genes LOXL L0XL2 and also maintain conservation of the exon-intron structure. A conservação do nucleotídeo e sequência de aminoácidos deduzida dentro da extremidade carboxilo-terminal de L0XL2, LOX e LOXL incluem o domínio da ligação ao cobre (WEWHSCHQHYH) em LOX e LOXL e WIWHDCHRHYH em L0XL2 com as quatro histidinas que fornecem os ligandos de nitrogénio para o complexo de coordenação de cobre específico para proteínas lisil oxidase (Krebs e Krawetz, Biochim. Biophys. Acta 1202: 7-12 (1993)). The conservation of the nucleotide and deduced amino acid sequence in the carboxyl-terminus of L0XL2, LOX and LOXL include the domain binding to copper (WEWHSCHQHYH) LOX and LOXL and WIWHDCHRHYH in L0XL2 to the four histidines which provide nitrogen ligands to the specific copper coordination complex for lysyl oxidase proteins (Krebs and Krawetz, Biochim Biophys Acta 1202:.. 7-12 (1993)). O local ativo em LOX (DIDCQWWIDITDVXPGNY) e em LOXL2 (DIDC-QWVDITDVPPPGDY) contém, em cada, um resíduo Tyr (Y) na extremidade COOH-terminal, que participa juntamente com um resíduo Lys na formação do co-fator quinona que está presente nestas proteínas. The active site LOX (DIDCQWWIDITDVXPGNY) and LOXL2 (IRHD-QWVDITDVPPPGDY) contains in each, Tyr (Y) residue at the COOH-terminus, which participates together with a Lys residue in the formation of quinone co-factor is present these proteins. Dez cisteínas características de LOX e LOXL são, da mesma forma, conservadas em LOXL2 (Kagan et al., (1994) em Molecular Biology and Pathology of Elastic Tissue (Mecham, RP e Roberts, L., editores), Ciba Foundation Symposium Series, Wiley, Chichester, Reino Unido). Ten cysteines characteristic of LOX and LOXL are similarly stored in LOXL2 (Kagan et al., (1994) Molecular Biology and Pathology of Elastic Tissue (Mecham, RP and Roberts, L., editors), Ciba Foundation Symposium Series Wiley, Chichester, UK). Um fator de crescimento e domínio recetor de citocina presentes nas proteínas LOX e LOXL também foi identificado dentro da sequência de aminoácidos derivada de LOXL2. A growth factor and cytokine receptor domain present in LOX and LOXL proteins was also identified within the amino acid sequence derived from LOXL2. Quatro repetições do domínio rico em cisteína recetor captador também estão presentes de LOXL2 (Saito et al. , J. Biol. Chem 272: 8157-8160 (1997), Resnick et al. , Trends Biochem Sei. 19: 5-8 (1994)). Four replicates the rich domain scavenger receptor cysteine ​​are present LOXL2 (Saito et al, J Biol Chem 272:.. 8157-8160 (1997), Resnick et al, Trends Biochem Sci. 19: 5-8. (1994 )).

Três locais de terminação de transcrição principais foram notados dentro dos domínios 3'-UTR de ADNc de LOXL2. Three major transcription termination sites were noted within the 3'-UTR domains of LOXL2 cDNA. O primeiro local de terminação tem 690 bp 3' do codão de terminação, o segundo local tem 740 bp e o local de terminação de transcrição final tem 900 bp 3' do codão de terminação. The first termination site is 690 bp 3 'of the stop codon, the second site is 740 bp and end transcription termination site is 900 bp 3' of the stop codon. Estes ARNm todos têm 3'-UTRs que diferem ligeiramente em tamanho. These mRNAs all have 3'-UTRs differing slightly in size. A maioria das fronteiras exão-intrão do gene LOXL2 mostra a sequência consenso (C/T)AG- exão-GT(A/G). Most of the exon-intron borders of the gene LOXL2 shows the consensus sequence (C / T) AG-exon-GT (A / G). Os tamanhos dos 11 exões do gene L0XL2 oscilam entre 112 e 940 bp. The sizes of the 11 exons of the gene L0XL2 range between 112 and 940 bp. Apesar do gene LOXL2 ter 11 exões, cinco exões consecutivos (exões 6-10), que codificam a ligação ao cobre e domínios catalíticos, exibem 84% de semelhança de sequência e os tamanhos dos exões são muito semelhantes aos exões correspondentes dos genes LOX e LOXL. Despite the LOXL2 gene has 11 exons five consecutive exons (exons 6-10) encoding the binding copper and catalytic domains exhibit 84% sequence similarity and sizes of the exons are very similar to the corresponding exons of genes and LOX LOXL. Todos os outros exões no gene LOXL2 são divergentes em ambos sequência e tamanho. All other exons in the gene LOXL2 are divergent in both sequence and length. LOXL2 foi identificado em todos os tecidos com a exceção de leucócitos sanguíneos. LOXL2 was identified in all tissues except blood leukocytes. O ARNm de LOXL2 foi detetado no coração, fígado e pâncreas; The LOXL2 mRNA was detected in the heart, liver and pancreas; a expressão é significativamente superior na placenta, próstata, útero e pâncreas (razões entre 2 e 3) comparada com a expressão inferior no cérebro, pulmão, músculo esquelético, timo e rim (razões abaixo de 0,5). expression is significantly higher in placenta, prostate, pancreas and uterus (ratios between 2 and 3) compared with lower expression in brain, lung, skeletal muscle, thymus and kidney (ratios below 0.5). (Jourdan-Le Saux, et al. J. Biol. Chem., 274(18): 12939-12944 (1999)). (Jourdan Le-Saux et al J Biol Chem, 274 (18):... 12939-12944 (1999)). A expressão de LOX e as diferentes proteínas LOXL varia em doenças diferentes. The expression of LOX and the different LOXL proteins varies in different diseases. Isto pode ser devido a um número de razões, tais como a diferença na distribuição do tecido, processamento, domínios, regulação da atividade, bem como outras diferenças entre as proteínas. This may be due to a number of reasons, such as differences in tissue distribution, processing, domains, regulation activity, as well as other differences between the proteins. Por exemplo, LOX e LOXL estão implicadas em doenças fibróticas, tais como ambas LOX e LOXL são altamente expressas em miofibroblastos à volta de áreas fibróticas (Kagen, Pathol. Res. Pract. 190:910-919 (1994); Murawaki et al., Hepatology 14:1167-1173 (1991); Siegel et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2945-2949 (1978); Jourdan Le-Saux et al. , Biochem. For example, LOX and LOXL are implicated in fibrotic diseases, such as both LOX and LOXL are highly expressed in myofibroblasts around fibrotic areas (Kagen, Pathol Res Pract 190: 910-919 (1994); Murawaki et al.... Hepatology 14: 1167-1173 (1991); Siegel et al, Proc Natl Acad Sci USA 75:..... 2945-2949 (1978); Le-Saux Jourdan et al., Biochem.

Biophys. Biophys. Res. Comm. Res. Comm. 199:587-592 (1994); 199: 587-592 (1994); Kim et al. Kim et al. , J. Cell J. Cell

Biochem. Biochem. 72:181-188 (1999)) . 72: 181-188 (1999)). LOX e os vários LOXL também estão implicados num número de cancros. LOX and various LOXL are also implicated in a number of cancers. Por exemplo, demonstrou-se que LOXL e LOXL4 são silenciados epigeneticamente e podem inibir a via sinalizadora da quinase regulada pelo sinal ras/extracelular no cancro da bexiga humano (Wu et al. , Cancer Res. 67:4123-4129 (2007)). For example, it was demonstrated that LOXL and epigenetically silenced are LOXL4 and may inhibit kinase signaling pathway regulated by Ras / extracellular signal in human bladder cancer (Wu et al, Cancer Res. 67:. 4123-4129 (2007)) .

Outros mostraram a regulação para cima seletiva e amplificação do gene LOXL4 no carcinoma das células escamosas da cabeça e do pescoço (Gorough et al., J. Pathol. 212:74-82 (2007)). Others have shown regulation for selective amplification and up LOXL4 gene in squamous cell carcinoma of the head and neck (Gorough et al, J. Pathol 212:.. 74-82 (2007)). LOX e LOXL2 também foram implicados num número de tumores, tais como cancros do cólon e esofágico (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)) . LOX and LOXL2 have also been implicated in a number of tumors, such as colon and esophageal (Csiszar, Prog Nucl Acid Res 70:... 1-32 (2001)). No cancro da mama, os membros da família LOX e LOXL foram ligados ao cancro (Kirschmann et al., Cancer Res . 62:448-4483 (2002)) . In breast cancer, members of LOX and LOXL family have been linked to cancer (Kirschmann et al, Cancer Res. 62:. 448-4483 (2002)).

Lisil oxidase catalisa a desaminação oxidativa de resíduos de peptidil lisina e hidroxilisina nos colagénios, e resíduos de peptidil lisina na elastina. Lysyl oxidase catalyzes the oxidative deamination of peptidyl lysine residues and hydroxylysine in collagens, and peptidyl lysine residues in elastin. Os peptidil aldeídos resultantes condensam espontâneamente e passam por reações de oxidação para formar as reticulações covalentes derivadas de lisina necessárias para a integridade estrutural normal da matriz extracelular. The resulting peptidyl aldehydes spontaneously condense and undergo oxidation reactions to form covalent crosslinks derived from lysine required for normal structural integrity of the extracellular matrix. Na reação da lisil oxidase com os seus substratos, peróxido de hidrogénio (H202) e amónia são libertados em quantidades estoiquiométricas com o produto peptidil aldeído. In the reaction of lysyl oxidase with its substrates, hydrogen peroxide (H202) and ammonia are released in stoichiometric amounts with the peptidyl aldehyde product. Ver, por exemplo, Kagan et al., J. Cell. See, for example, Kagan et al., J. Cell. Biochem. Biochem. 88:660-72 (2003) . 88: 660-72 (2003).

Lisil oxidase é segregada para o ambiente extracelular onde é depois processada por clivagem proteolítica para uma enzima funcional com 30 kDa e um pró-péptido com 18 kDa. Lysyl oxidase is secreted into the extracellular environment where it is then processed by proteolytic cleavage to a functional 30 kDa enzyme and a pro-peptide of 18 kDa. A lisil oxidase com 30 kDa está enzimaticamente ativa, ao passo que a pró-enzima com 50 kDa não. The lysyl oxidase with 30 kDa enzyme is active, while the pro-enzyme of 50 kDa no. Pró-colagénio C-proteinases processam pró-lisil oxidase para a sua forma ativa e são produtos dos genes Bmpl, Till e T112. Procollagen C-proteinase process pro-lysyl oxidase to its active form and are products of genes Bmpl, Till and T112. A localização da enzima é principalmente extracelular, apesar de lisil oxidase processada também estar localizada intracelularmente e nuclearmente. The location of the enzyme is mainly extracellular, although lysyl oxidase also be processed and nuclear localized intracellularly. A codificação de sequência para o pró-péptido é moderadamente (60-70%) conservada entre as proteínas LOX e LOXL, ao passo que a codificação de sequência para a região C-terminal com 30 kDa da pró-enzima na qual o local ativo está localizado é altamente conservada (aproximadamente 95%) . The coding sequence for the propeptide is moderately (60-70%) conserved between the LOX and LOXL proteins, whereas the coding sequence for the C-terminal region of the 30 kDa pro-enzyme wherein the active site is located is highly conserved (approximately 95%). Ver Kagan et al. See Kagan et al. , J. Cell Biochem. J. Cell Biochem. 59:329-38 (1995) . 59: 329-38 (1995). LOX é induzida por um número de fatores de crescimento e esteróides, tais como TGF-β, TNF-α e interferão (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)) . LOX is induced by a number of growth factors and steroids such as TGF-β, TNF-α and interferon (Csiszar, Prog Nucl Acid Res 70:... 1-32 (2001)).

Sabes-se que existem cinco lisil oxidases diferentes tanto em humanos como em ratinhos, LOX e quatro LOX relacionadas ou proteínas tipo LOX (LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4) . You know that there are five different lysyl oxidases in both humans and mice, and four LOX or LOX-type LOX-related proteins (LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4). LOX e as proteínas tipo LOX são referidas coletivamente como "LOX/LOXL" LOX and LOX-like proteins are collectively referred to as & quot; LOX / LOXL & quot; para os fins da presente revelação. for the purposes of the present disclosure. As cinco formas de lisil oxidases residem em cinco cromossomas diferentes. The five forms of lysyl oxidases reside on five different chromosomes. Estes membros da família mostram alguma sobreposição na estrutura e função, mas parecem ter funções distintas também. These family members show some overlap in structure and function, but appear to have distinct functions as well. Por exemplo, apesar da atividade principal de LOX ser a oxidação de resíduos de lisina específicos no colagénio e elastina fora da célula, também pode atuar intracelularmente, onde pode regular a expressão génica. For example, although the main activity of LOX is the oxidation of specific lysine residues in collagen and elastin outside of the cell, can also act intracellularly, which can regulate gene expression. Além disso, LOX induz a quimiotaxia de monócitos, fibroblastos e células do músculo liso. In addition, LOX induces monocyte chemotaxis, fibroblast and smooth muscle cells. Além disso, uma deleção de LOX em ratinhos knockout parece ser letal no parto (Hornstra et al. , J. Biol. Chem. 278:14387-14393 (2003)), ao passo que a deficiência em LOXL não causa fenótipo de desenvolvimento severo (Bronson et al., Neurosci. Lett. 390:118-122 (2005)). In addition, a deletion in LOX knockout mice seems to be lethal in childbirth (Hornstra et al, J Biol Chem 278:... 14387-14393 (2003)), whereas LOXL deficiency causes no severe phenotype development (Bronson et al, Neurosci Lett 390:... 118-122 (2005)). A atividade principal de LOX é a oxidação de resíduos de lisina específicos no colagénio e elastina fora da célula, contudo, também pode atuar intracelularmente, onde pode regular a expressão génica (Li et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:12817-12822 (1997), Giampuzzi et al., J. Biol. Chem. 275:36341-36349 (2000)) Além disso, LOX induz a quimiotaxia de monócitos, fibroblastos e células do músculo liso (Lazarus et al., Matrix Biol. 14:727-731 (1995) Nelson et al. , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 188:346-352 (1988)). The main activity of LOX is the oxidation of specific lysine residues in collagen and elastin outside of the cell, however, it can also act intracellularly, which can regulate gene expression (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 12817-12822 (1997), Giampuzzi et al, J Biol Chem 275:... 36341-36349 (2000)) in addition, LOX induces monocyte chemotaxis, fibroblasts and smooth muscle cells (Lazarus et al. Matrix Biol. 14: 727-731 (1995) Nelson et al, Proc Soc Exp Biol Med 188:...... 346-352 (1988)). O próprio LOX é induzido por um número de fatores de crescimento e esteróides, tais como TGF-β, TNF-α e interferão (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)). The LOX itself is induced by a number of growth factors and steroids such as TGF-β, TNF-α and interferon (Csiszar, Prog Nucl Acid Res 70:... 1-32 (2001)). Estudos recentes atribuíram outros papéis ao LOX em diversas funções biológicas, tais como regulação do desenvolvimento, supressão do tumor, motilidade celular e senescênca celular. Recent studies have attributed other roles to LOX in various biological functions such as developmental regulation, tumor suppression, cell motility and cellular senescênca. 0 papel diverso de LOX, e da sua família amino oxidase recentemente descoberta, tipo LOX (LOXL), pode desempenhar papéis importantes com as suas localizações intracelular e extracelular. 0 diverse role of LOX, and its amino oxidase family recently discovered, LOX (LOXL) type, may play important roles with their intracellular and extracellular locations.

Conforme utilizado aqui, o termo "lisil oxidase" As used herein, the term & quot; lysyl oxidase & quot; refere-se a uma enzima que catalisa a seguinte reação: peptidil-L-lisil-péptido + 02 + H20 -> It refers to an enzyme that catalyzes the following reaction: peptidyl-L-lysyl-peptide + 02 + H20 - & gt; peptidil-alisil- péptido + NH3 + H202. alisil- peptidyl-peptide + NH3 + H202. Outros sinónimos para lisil oxidase (EC 1.4.3.13) incluem proteína-lisina 6-oxidase e proteína-L-lisina:oxigénio 6-oxidoredutase (desaminante). Other synonyms for lysyl oxidase (EC 1.4.3.13) include Protein-lysine 6-oxidase and protein L-lysine: oxygen 6-oxidoreductase (desaminante). Ver, por exemplo, Harris et al. See, e.g., Harris et al. , Biochim. Biochim. Biophys. Biophys. Acta 341:332-44 (1974); Acta 341: 332-44 (1974); Rayton et al. Rayton et al. , J. Biol. J. Biol. Chem. Chem. 254:621-26 (1979); 254: 621-26 (1979);

Stassen, Biophys. Stassen, Biophys. Acta 438:49-60 (1976). Acta 438: 49-60 (1976). Uma quinoproteína que contém cobre com um aduto lisil da tirosilquinona no seu centro ativo, LOX catalisa a oxidação de peptidil lisina para resultar na formação de peptidil alfa-aminoadípico-delta-semialdeído. A copper-containing quinoproteína with a lysyl adduct of tirosilquinona in their active center, LOX catalyzes the oxidation of peptidyl lysine to result in the formation of peptidyl alpha-aminoadipic-delta-semialdehyde. Uma vez formado, este semialdeído pode condensar espontâneamente com aldeídos vizinhos ou com outros grupos lisil para formar reticulações intra e intercadeias. Once formed, this semialdehyde can spontaneously condense with neighboring aldehydes or with other lysyl groups to form intra- and interstrand crosslinks. Ver, por exemplo, Rucker et al., Am. J. Clin. See, for example, Rucker et al., Am. J. Clin. Nutr. Nutr. 67:996S-1002S (1998). 67: 996S-1002S (1998). O termo "LOX" The term & quot; LOX & quot; refere-se a uma enzima com uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a um polipeptídeo expresso ou traduzido de uma das seguintes sequências: EMBL/N. It refers to an enzyme with an amino acid sequence substantially identical to a polypeptide expressed or translated from one of the following sequences: EMBL / N. 0s de acesso do Genbank: M94054 (SEQ. ID N.° 10); 0s Genbank accession: M94054 (. SEQ ID NO: 10); AAA5 952 5.1 (SEQ. ID N.° 11) - ARNm; AAA5 952 5.1 (. SEQ ID NO 11) - mRNA; S45875 (SEQ. ID N.° S45875 (SEQ. ID No.

12); 12); AAB2 354 9.1 (SEQ. ID N.° 13) - ARNm; 9.1 AAB2 354 (SEQ ID NO. 13) - mRNA; S78694 (SEQ. ID N.° 14); S78694 (SEQ ID NO. 14); AAB21243.1 (SEQ. ID N.° 15) - ARNm; AAB21243.1 (SEQ ID NO. 15) - mRNA; AF039291 (SEQ. ID N.° 16); AF039291 (SEQ ID NO. 16); AAD0 2130.1 (SEQ. ID N.° 17) - ARNm; AAD0 2130.1 (. SEQ ID NO 17) - mRNA; BC074820 (SEQ. ID N.° 18); BC074820 (SEQ ID NO. 18); AAH74820.1 (SEQ. ID N.° 19) - ARNm; AAH74820.1 (SEQ ID NO. 19) - mRNA; BC074872 (SEQ. ID N.° 20); BC074872 (SEQ ID NO. 20); M84150 (SEQ. ID N.° 22); M84150 (SEQ ID NO. 22); AAA59541.1 (SEQ. ID N.° 23) - ADN genómico. AAA59541.1 (SEQ ID NO. 23) - genomic DNA. Uma modalidade a mode

de LOX é prépróproteína lisil oxidase humana (hLOX) com uma sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 7), uma hLOX segregada após clivagem do péptido sinal, tal como a SEQ. LOX is human lysyl oxidase preproprotein (hLOX) having an amino acid sequence (SEQ. ID No. 7), a hLOX secreted after cleavage of the signal peptide, such as SEQ. ID N.° 8 ou uma hLOX Madura após processamento proteolítico, tal como a SEQ. ID No. 8 or a mature hLOX after proteolytic processing such as SEQ. ID N.° 9. O LOX tem dominios de proteína altamente conservados, conservados em várias espécies incluindo humanos, ratinho, ratazana, galinha, peixes e Drosophila. ID No. 9. The LOX has highly conserved protein domains, conserved in several species including human, mouse, rat, chicken, fish, and Drosophila. A família de LOX humano tem uma região C-terminal altamente conservada contendo os 205 aminoácidos do domínio catalítico de LOX. The human LOX family has a C-terminal highly conserved region containing the catalytic domain of 205 amino acids of LOX. A região conservada contém a ligação ao cobre (Cu), domínio tipo recetor de citocina conservado (CRL) e o local do co-fator lisil-tirosilquinona (LTQ). The conserved region contains the connection to copper (Cu), domain conserved cytokine receptor type (CRL) and the location of lysyl tirosilquinona cofactor (QTL). Doze resíduos de cisteína são também, da mesma forma, conservados, em que dois deles reside dentro da região pré-pró-péptido e dez estão na forma processada cataliticamente ativa de LOX (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)). Twelve cysteine ​​residues are also similarly conserved in two of them lies within the pre-pro-peptide region and ten are processed in the form catalytically active LOX (Csiszar, Prog Nucl Acid Res 70:... 1- 32 (2001)). A região conservada também inclui um domínio de ligação à fibronectina. The conserved region also includes a fibronectin binding domain. A região pré-pró-péptido de LOX contém o péptido sinal e é dividida, prevê-se que o local de clivagem esteja entre Cys21-Ala22, para gerar um péptido sequência sinal e uma forma pró-péptido aminoácido com 48kDa de LOX, que ainda está inativa. The LOX pre-pro-peptide region contains a signal peptide and is divided, it is expected that the cleavage site is between Cys21-Ala22, to generate a signal sequence peptide and an amino acid propeptide way 48kDa LOX which it is still inactive. O pró-péptido é N-glicosilado durante a passagem através do aparelho de Golgi que é segregado para o ambiente extracelular onde a pró-enzima, ou pró-péptido, é dividido entre Glyl68-Aspl69 por uma metaloendoprotease, um pró-colagénio C-proteinase, que são produtos dos genes Bmpl, Tllll e T112. The pro-peptide is N-glycosylated during passage through the Golgi apparatus which is secreted into the extracellular environment where the pro-enzyme or pro-peptide is partitioned between Aspl69, Glyl68 metaloendoprotease by a procollagen C proteinase, which are products of genes Bmpl, Tllll and T112. BMP I (proteína morfogenética do osso I) é um pró-colagénio C-proteinase que processa o pró-péptido para produzir uma enzima funcional com 30 kDa e um pró-péptido com 18 kDa. I BMP (bone morphogenetic protein I) is a procollagen C-proteinase that processes the propeptide to produce a functional enzyme of 30 kDa and a pro-peptide of 18 kDa. A codificação de sequência para o pró-péptido é moderadamente (60-70%) conservada, ao passo que a codificação de sequência para a região C-terminal com 30 kDa da pró-enzima na qual o local ativo está localizado é altamente conservada (aproximadamente 95%). The coding sequence for the propeptide is moderately (60-70%) conserved, whereas the coding sequence for the C-terminal region of the 30 kDa pro-enzyme wherein the active site is located is highly conserved ( approximately 95%). (Kagan e Li, J. Cell. Biochem. 88:660-672 (2003); Kagan et al., J. Cell Biochem. 59:329-38 (1995)). (Kagan and Li, J. Cell Biochem 88: 660-672 (2003); Kagan et al, J. Cell Biochem. 59:. 329-38 (1995)..). As unidades N-glicosil também são subsequentemente removidas. The N-glycosyl units are also subsequently removed. LOX ocorre nas formas não processadas e/ou processadas (maduras). LOX occurs in unprocessed forms and / or processed (mature). A forma madura de LOX está tipicamente ativa apesar de, nalgumas modalidades, LOX não processada também estar ativa. The mature form of LOX is typically active although, in some embodiments, also be processed LOX not active.

Exemplos particulares de uma enzima ou proteína LOXL são descritos em Moinar et al., Biochim Biophys Acta. Particular examples of an enzyme or protein LOXL are described in Molnar et al., Biochim Biophys Acta. 1647:220-24 (2003); 1647: 220-24 (2003); Csiszar, Prog. Csiszar, Prog. Nucl. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001); Acids Res 70: 1-32 (2001);. e no documento WO 01/83702 publicado a 8 de novembro de 2001. (de notar que nestas 3 publicações, "LOXL1" foi referido como "LOXL", ao passo que na presente invenção "LOXL" é utilizado para se referir a proteínas tipo lisil oxidase em geral, não só LOXL1.) Estas enzimas incluem LOXL1, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL BC015090; and WO 01/83702 published document 8 November 2001 (note that these three publications & quot; LOXL1 & quot; is referred to as & quot; LOXL & quot ;, whereas in the present invention & quot; LOXL & quot; is used to refer . lysyl oxidase like proteins in general, not only LOXL1) LOXL1 These include enzymes encoded by mRNA deposited at GenBank / EMBL BC015090; AAH15090.1; AAH15090.1; LOXL2, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL U89942; LOXL2, encoded by mRNA deposited at GenBank / EMBL U89942; LOXL3, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL AF282619; LOXL3 encoded by mRNA deposited at GenBank / EMBL AF282619; AAK51671.1; AAK51671.1; e LOXL4, codificado por ARNm depositado no GenBank/EMBL AF 33 8 4 41; and LOXL4 encoded by mRNA deposited at GenBank / EMBL AF 33 8 4 41; AAK71934.1. AAK71934.1. Péptidos sinal potenciais semelhantes aos descritos anteriormente para LOX foram previstos no terminal amino de LOXL, LOXL2, LOXL3 e LOXL4. Potential signal peptides similar to those described above for LOX were predicted at the amino terminus of LOXL, LOXL2, and LOXL3 LOXL4. Os locais de clivagem do sinal previstos estão entre Gly25-Gln26 para LOXL, entre Ala25-Gln26, para LOXL2 e entre Gly25-Ser26 para LOXL3. The predicted signal cleavage sites are between Gly25-Gln26 for LOXL, between Ala25-Gln26, for LOXL2, and between Gly25-Ser26 to LOXL3. O consenso para a clivagem de BUMP-1 em pró-colagénios e pró-LOX está entre Ala/Gly-Asp e é seguido, com frequência, por um resíduo acídico ou carregado. The consensus for the bump-1 cleavage site in pro-collagens and pro-LOX is between Ala / Gly-Asp and is followed often by an acidic or charged residue. Um local de clivagem potencial para gerar LOXL ativo é Gly303-Asp304, contudo, é depois seguido por um Pró atípico. A potential cleavage site to generate active LOXL is Gly303-Asp304, however, it is then followed by an atypical Pro. LOXL3 também tem um local de clivagem potencial em Gly447-Asp448, que é seguido por um Asp, o processamento neste local pode produzir um péptido ativo de tamanho semelhante para ativar LOX. LOXL3 also has a potential cleavage site for Asp448-Gly447, which is followed by an Asp, processing this location can produce an active peptide similar size to enable LOX. Um local de clivagem potencial de BMP-1 também foi identificado dentro de LOXL4, nos resíduos Ala569-Asp570 (Kim et al. , J. Biol. Chem. 278:52071-52074 (2003)). A potential cleavage site of BMP-1 was also identified within LOXL4 in residues Ala569-Asp570 (Kim et al, J Biol Chem 278:... 52071-52074 (2003)). LOXL2 também pode ser clivado proteoliticamente de forma análoga aos outros membros da família LOXL e segregado (Akiri et al., Cancer Res. 63:1657-1666 (2003)). LOXL2 may also be proteolytically cleaved analogously to other members of the family and secreted LOXL (Akiri et al, Cancer Res. 63:. 1657-1666 (2003)).

As enzimas LOX e LOXL atuam através de um mecanismo ping-pong que pode ser descrito pela cinética de Michaelis-Menten (ver Figura 1). The LOXL and LOX enzymes act via a ping-pong mechanism which can be described by Michaelis-Menten kinetics (see Figure 1).

Um exemplo de proteína LOX ou LOXL incluem a enzima com uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a um polipeptídeo expresso ou traduzido de uma das seguintes sequências: EMBL/acessos a Genbank N.°s: M94054; An example of LOX or LOXL protein include enzyme with an amino acid sequence substantially identical to a polypeptide expressed or translated from one of the following sequences: EMBL / GenBank accessions Nos: M94054; AAA59525.1-ARNm; AAA59525.1-mRNA; S45875; S45875; AAB2 354 9.1-ARNm; AAB2 354 9.1-mRNA; S78694; S78694; AAB21243.1-ARNm; AAB21243.1-mRNA; AF039291; AF039291; AAD02130.1-ARNm; AAD02130.1-mRNA; BC074820; BC074820; AAH74820.1-ARNm; AAH74820.1-mRNA; BC074872; BC074872; AAH74872.1-ARNm; AAH74872.1-mRNA; M84150; M84150; AAA59541.1-ADN genómico. AAA59541.1-genomic DNA.

Os termos "LOX" The terms & quot; LOX & quot; e "LOXL" and & quot; LOXL & quot; também abrangem fragmentos ou derivados funcionais que retêm substancialmente a atividade enzimática que catalisa a desaminação dos resíduos lisil. also include functional fragments or derivatives which substantially retains the enzymatic activity that catalyzes the deamination of lysyl residues. Tipicamente, um fragmento ou derivado funcional retém pelo menos 50% of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% da sua atividade de oxidação de lisil. Typically, a functional fragment or derivative retains at least 50% of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% or 100% of its lysyl oxidation activity. Também se pretende que uma proteína LOX ou uma LOXL2 possam incluir substituições de aminoácidos conservadoras que não alteram substancialmente a sua atividade. It is also intended that a LOX or LOXL2 protein can include conservative amino acid substitutions that do not substantially alter its activity. Substituições de aminoácidos conservadoras adequadas são conhecidas daqueles habilitados nesta arte e podem ser realizadas, em geral, sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Suitable conservative substitutions of amino acids are known to those skilled in the art and may be made generally without altering the biological activity of the resulting molecule. Aqueles habilitados nesta arte reconhecerão que, em geral, substituições de aminoácidos simples em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica. Those skilled in the art will recognize that, in general, single amino acid substitutions in non-essential regions of a polypeptide do not substantially alter biological activity. Ver, por exemplo, Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224. Substituições de aminoácidos conservadoras e não conservadoras foram descritas anteriormente. See, e.g., Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin / Cummings Pub. Co., page 224. conservative substitutions and non-conservative amino acids have been previously described.

Uma característica não conhecida como sendo comum entre as proteínas LOX e LOXL é os domínios ricos em cisteína recetor de captura (SRCR) . A feature not known to be common between the LOX and LOXL proteins and domains rich in cysteine ​​receptor capture (SRCR). LOX e LOXL carecem de domínios SRCR, ao passo que LOXL2, LOXL3 e LOXL4 cada têm quatro domínios SRCR no terminal N. Os domínios SRCR são encontrados em proteínas segregadas, transmembranares ou da matriz extracelular. LOX and LOXL lack SRCR domains, whereas LOXL2, and LOXL3 LOXL4 each have four domains SRCR the terminal N. The SRCR domains are found in secreted, transmembrane, or extracellular matrix proteins. Os domínios SRCR também são conhecidos por mediarem a ligação ao ligando num número de proteínas segregadas e recetoras (Hoheneste et al., Nat. Struct. Biol. 6:228-232 (1999); Sasaki et al., EMBO J. 17:1606-1613 (1998)) . The SRCR domains are also known to mediate ligand binding in a number of secreted proteins and recetoras (Hoheneste et al, Nat Struct Biol 6:..... 228-232 (1999); Sasaki et al, EMBO J. 17: 1606-1613 (1998)). Outro domínio único de LOXL é a presença de um domínio rico em prolina (Moinar et al. , Biochimica Biophsyica Acta 1647:220-224 (2003)). Another unique domain LOXL is the presence of a proline rich domain (Molnar et al, Biochimica Acta 1647 Biophsyica:. 220-224 (2003)). A distribuição do tecido também pode diferir entre LOX e os vários LOXL. The tissue distribution may also differ between LOX and various LOXL. LOX é altamente expressa no coração, placenta, testículos, pulmão, rim e útero, mas marginalmente no cérebro e no fígado. LOX is highly expressed in the heart, placenta, testis, lung, kidney and uterus, but marginally in the brain and liver. LOXL1 é expressa na placenta, rim, músculo, coração, pulmão e pâncreas, e tal como com a LOX, tem muito menor expressão no cérebro e no fígado (Kim et al., J. Biol. Chem. 270:7176-7182 (1995)). LOXL1 is expressed in placenta, kidney, muscle, heart, lung and pancreas, and as with LOX, has much lower expression in the brain and in the liver (Kim et al, J Biol Chem 270:... 7176-7182 ( 1995)). LOXL2 é altamente expressa no útero, placenta e noutros orgãos, mas à semelhança de LOX e LOXL, com menor expressão no cérebro e no fígado (Jourdan Le-Saux et al. , J. Biol. Chem. 274:12939:12944 (1999)). LOXL2 is highly expressed in uterus, placenta and other organs, but similar to LOX and LOXL, to a lesser extent in brain and liver (Jourdan Le-Saux et al, J Biol Chem 274:... 12939: 12944 (1999 )). LOXL3 é altamente expressa nos testículos, baço e próstata, moderadamente na placenta, e não no fígado, ao passo que LOXL4 é altamente expressa no fígado (Huang et al. , Matrix Biol. 20:153-157 (2001); Maki e Kivirikko, Biochem. J. 355:381-387 (2001); Jourdan Le-Saux et al. , Genomics 74:211-218 (2001); Asuncion et al. , Matrix Biol. 20:487-491 (2001)). LOXL3 is highly expressed in testis, spleen and prostate, moderately in the placenta, not the liver, while LOXL4 is highly expressed in the liver (Huang et al, Matrix Biol 20: 153-157 (2001); Maki and Kivirikko.. Biochem J. 355. 381-387 (2001); Le-Saux Jourdan et al, Genomics 74: 211-218 (2001); Asuncion et al, Matrix Biol. 20: 487-491 (2001))... A expressão, ou implicação de LOX e as diferentes proteínas LOXL, em doenças também pode variar. The expression, or implication of LOX and the different LOXL proteins, in diseases may also vary. Isto pode sr devido a um número de razões, tais como a diferença na distribuição do tecido, processamento, domínios, regulação da atividade, bem como a outras diferenças entre as proteínas. This can SR due to a number of reasons, such as differences in tissue distribution, processing, domains, regulation activity, as well as other differences between the proteins. Por exemplo, LOX e LOXL estão implicadas em doenças fibróticas, já que ambas LOX e LOXL são altamente expressas nos miofibroblastos à volta de áreas fibróticas (Kagen, Pathol. Res. Pract. 190:910-919 (1994); Murawaki et al. , Hepatology 14:1167-1173 (1991); Siegel et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2945-2949 (1978); Jourdan Le-Saux et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 199:587-592 (1994); For example, LOX and LOXL are implicated in fibrotic diseases as both LOX and LOXL are highly expressed in myofibroblasts around fibrotic areas (Kagen, Pathol Res Pract 190: 910-919 (1994); Murawaki et al.... Hepatology 14: 1167-1173 (1991); Siegel et al, Proc Natl Acad Sci USA 75:..... 2945-2949 (1978); Le-Saux Jourdan et al, Biochem Biophys res Comm..... 199: 587-592 (1994);

Kim et al., J. Cell Biochem. Kim et al., J. Cell Biochem. 72:181-188 (1999)). 72: 181-188 (1999)). LOX e as várias LOXL também estão implicadas num número de cancros. LOX and various LOXL are also implicated in a number of cancers. Por exemplo, demonstrou-se que LOXL e LOXL4 são silenciadas epigeneticamente e podem inibir a via de sinalização da quinase regulada pelo sinal ras/extracelular no cancro da bexiga humano (Wu et al., Cancer Res. 67:4123-4129 (2007)). For example, it was demonstrated that LOXL and epigenetically silenced are LOXL4 and may inhibit kinase signaling pathway regulated by Ras / extracellular signal in human bladder cancer (Wu et al, Cancer Res. 67:. 4123-4129 (2007) ).

Outros mostraram a regulação para cima seletiva e amplificação do gene LOXL4 no carcinoma das células escamosas da cabeça e do pescoço (Gorough et al., J. Pathol. 212:74-82 (2007)). Others have shown regulation for selective amplification and up LOXL4 gene in squamous cell carcinoma of the head and neck (Gorough et al, J. Pathol 212:.. 74-82 (2007)). LOX e LOXL2 também foram implicados num número de tumores, tais como cancros do cólon e esofágico (Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32 (2001)) . LOX and LOXL2 have also been implicated in a number of tumors, such as colon and esophageal (Csiszar, Prog Nucl Acid Res 70:... 1-32 (2001)). No cancro da mama, LOX e os membros da família LOXL foram ligados ao cancro (Kirschmann et al. , Cancer Res . 62:448-4483 (2002)) . In breast cancer, LOX and LOXL family members have been linked to cancer (Kirschmann et al, Cancer Res. 62:. 448-4483 (2002)). III. III. Transição epitelial-mesenquimatosa A transição epitelial-para-mesenquimatosa (EMT) refere-se ao processo pelo qual uma célula com uma expressão génica/característica de fenótipo de célula epithelial (isto é, que expressa proteínas, fatores e moléculas específicas) muda ou altera os genes ou os seus níveis de expressão que resulta numa alteração no fenótipo da célula conforme exibido pela alteração ou mudança nos genes expressos. Epithelial-mesenchymal transition epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) refers to the process by which a cell with a gene expression / phenotype characteristic of epithelial cell (i.e., expressing proteins specific factors and molecules) changes or changes genes or their expression levels resulting in a change in cell phenotype as shown by the change or changes in expressed genes.

As células epiteliais e mesenquimatosas representam linhagens distintas, cada com um perfil de expressão génica único que partilha atributos específicos de cada tipo de célula. The epithelial and mesenchymal cells represent distinct lineages, each with a unique gene expression profile that share attributes of each specific cell type. A conversão de uma célula epithelial numa célula mesenquimatosa requer alterações na morfologia, arquitetura celular, adesão e/ou capacidade de migração. The conversion of an epithelial cell in a mesenchymal stem cell requires changes in morphology, cellular architecture, adhesion and / or migration capability. Células tumorais avançadas exibem, com frequência, uma regulação para baixo conspícua de marcadores epiteliais e uma perda de junções intercelulares, resultando numa perda de polaridade epitelial e adesão intercelular reduzida. Tumor cells exhibit enhanced, often a conspicuous down regulation of epithelial markers and a loss of intercellular junctions, resulting in a loss of epithelial polarity and reduced intercellular adhesion. A perda de características epiteliais é, com frequência, acompanhada de motilidade celular e expressão de genes do mesênquima aumentada. The loss of epithelial characteristics is often accompanied by cell motility and expression of the genes increased mesenchyme. EMT pode incluir perda de inibição de contacto, control do crescimento alterado e/ou capacidade de invasão potenciada (Christiansen e Rajasekaran, Cancer Res., 66(17): 8319-8326 (2006); e Thiery et al. , Curr. Opin. Cell. Biol., 15: 740-6 (2003)). TMS may include loss of contact inhibition, control of the altered growth and / or enhanced invasiveness (Christiansen and Rajasekaran, Cancer Res, 66 (17): 8319-8326 (2006); and Thiery et al, Curr Opin... . Cell Biol., 15:. 740-6 (2003)). Características moleculares e morfológicas indicadoras de EMT correlacionam-se com fraca diferenciação histológica, destruição da integridade do tecido e metástase. molecular and morphological features indicative of EMT are correlated with poor histological differentiation, tissue destruction and integrity of metastasis. EMT providencia mecanismos para as células epiteliais ultrapassarem as limitações físicas impostas sobre elas pelas junções intercelulares e adotarem um fenótipo móbil (Burdsal et al. Development, 118:829-44 (1993); e Nieto et al., Mech, Dev., 105:27-35 (2001)). EMT provides mechanisms for epithelial cells overcome the physical limitations imposed on them by intercellular junctions and adopt a mobile phenotype (Burdsal et al Development, 118:... 829-44 (1993) and Nieto et al, Mech Dev, 105 : 27-35 (2001)).

Marcadores moleculares vulgarmente utilizados para EMT incluem expressão aumentada de N-caderina e vimentina, localização nuclear de β-catenina e produção aumentada de fatores de transcrição, tais como Snaill (caracol), Snail2 (lesma), Twist, EF1/ZEB1, SIP1/ZEB2 e/ou E47 que inibem a produção de E-caderina. Molecular markers commonly used for EMT include increased expression of N-cadherin and vimentin, nuclear localization of β-catenin and increased production of transcription factors such as Snaill (snail), Snail2 (slug) Twist EF1 / ZEB1, SIP1 / ZEB2 and / or E47 which inhibit the production of E-cadherin. Marcadores fenotípicos para um EMT incluem, mas não se limitam a, uma capacidade aumentada para migração e invasão tridimensional, bem como resistência à apoptose. an EMT phenotypic markers include, but are not limited to, an increased capacity for migration and invasion dimensional and resistance to apoptosis. Estes marcadores foram ainda correlacionados com a indução de EMT e uma associação com fenótipos cancerígenos. These markers were also correlated with the induction of EMT and an association with cancerous phenotypes. A ocorrência de EMT durante a progressão do tumor permite às células tumorais adquirirem a capacidade de se infiltrarem no tecido circundante e, em última análise, metastizarem em locais distantes. The occurrence of EMT during tumor progression allows tumor cells to acquire the capacity to infiltrate the surrounding tissue and ultimately metastasize to distant sites. Alterações na expressão génica dentro das células tumorais pode indicar uma progressão do padrão de expressão génica de epitelial ou tipo epithelial para um padrão de expressão génica mesenquimatoso ou tipo mesenquimatoso. Changes in gene expression within tumor cells may indicate a progression of the pattern of gene expression of epithelial or epithelial type for a pattern of gene expression mesenchymal or mesenchymal-type. A titulo de exemplo, a identificação da perda de E-caderina está correlacionada com carcinoma metastático, bem como com resistência a terapêuticas cancerígenas, tais como inibidores EGFR e inibidores IGF-R1. By way of example, the identification of loss of E-cadherin is correlated with metastatic carcinoma as well as with resistance to cancer therapies, such as EGFR and IGF-R1 inhibitors inhibitors. A análise de muitos tipos diferentes de cancro revela que as células tumorais circulantes, ou aquelas encontradas como micrometástases, evidenciam a conversão do mesênquima com base em alterações na expressão num conjunto de marcadores. The analysis of many different cancers reveals that the circulating tumor cells, or micrometastases as those found, show the conversion of mesenchymal based on changes in the expression of a set of markers. Estes marcadores incluem, mas não se limitam a, EGFR, E-caderina, ErbB3, RAB25, integrina beta 6, caderina-2, proteína de ligação ao fator de crescimento de fibroblasto 1, distal-less homeo box 1, ZEBl (fator de transcrição 8), SIP1 e vimentina. These markers include, but are not limited to, EGFR, E-cadherin, ErbB3, RAB25, integrin beta 6, cadherin-2 binding protein growth factor fibroblast 1, distal-less homeo box 1, ZEBl (factor transcription 8), SIP1 and vimentin. A título de exemplo, um perfil de expressão génica tipo epitelial inclui expressão ou expressão aumentada de genes, tais como E-caderina, ErbB3 ou EGFR. For example, one type epithelial gene expression profile comprises overexpression or gene expression such as E-cadherin, ErbB3 or EGFR. Um perfil de expressão génica tipo epitelial pode incluir a expressão de um ou mais destes genes, pelo menos dois, ou pelo menos três destes genes. A profile of epithelial-like gene expression can include expression of one or more of these genes, at least two or at least three of these genes.

Como com os cancros resistentes a terapêutica previamente descritos, os níveis de expressão de E-caderina, ErbB3, RAB25, integrina beta 6, caderina-2, proteína de ligação ao fator de crescimento de fibroblasto 1, distal-less homeo box 1, ZEBl (fator de transcrição 8), SIP1, TGF-β, F0XC2, GSK-3B, Smad-3, Pez, Snaill, Snail2 e ILK, e vimentina representam genes que são comuns a características de EMT, bem como com aquelas células tumorais/cancros baseados no epitélio que desenvolvem resistência às suas respetivas terapêuticas. As with cancers resistant to treatment previously described, the levels of E-cadherin expression, ErbB3, RAB25, integrin beta 6, cadherin-2 binding protein growth factor fibroblast 1, distal-less homeo box 1, ZEBl (transcription factor 8), SIP1, TGF-β, F0XC2, GSK-3B, Smad-3, Pez, Snaill, Snail2 and ILK, and vimentin represent genes that are common to EMT characteristics, as well as those tumor cells / cancers based on the epithelium that develop resistance to their respective therapies. A presente invenção também se relaciona, em geral, com um método para tratar um paciente com cancro e particularmente um cancro que experimentou EMT. The present invention also relates generally to a method for treating a patient with cancer, and particularly a cancer that has experienced EMT. Os inventores descobriram que cancros que experimentaram EMT ou que passaram de um padrão de expressão génica tipo epitelial para um padrão de expressão génica tipo mesenquimatoso são recetivos a inibidores LOX/LOXL. The inventors have found that experienced EMT or cancers that passed a standard type of epithelial gene expression for gene expression pattern of mesenchymal type are amenable LOX / LOXL inhibitors.

Para avaliação da expressão de célula epitelial tumoral ou de biomarcador mesenquimatoso, podem ser utilizadas amostras de pacientes que contêm células tumorais, ou proteínas ou ácidos nucleicos produzidas por estas células tumorais, nos métodos descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente USN° 20070065858. Em suma, o nível de expressão do biomarcador pode ser avaliado avaliando a quantidade (por exemplo, quantidade absoluta ou concentração) do marcador numa amostra da célula tumoral, por exemplo, uma biópsia do tumor obtida de um paciente ou outra amostra de paciente que contém material derivado do tumor (por exemplo, sangue, soro, urina ou outros fluídos corporais ou excreções, conforme descritos aqui anteriormente) . For assessment of tumor epithelial cell expression or mesenchymal biomarker samples can be used in patients containing tumor cells, or proteins or nucleic acids produced by these tumor cells, the methods described, for example, in U.S. Patent Application Publication USN ° 20070065858. in short, the expression level of the biomarker can be assessed by assessing the amount (e.g. absolute amount or concentration) of the marker in a sample of the tumor cell, for example, a tumor biopsy obtained from a patient or other patient sample containing material derived from the tumor (e.g., blood, serum, urine or other bodily fluids or excretions as described herein above). A amostra celular pode, obviamente, ser sujeita a uma variedade de técnicas preparativas e de armazenamento pós-colheita bem conhecidas (por exemplo, extração de ácido nucleico e/ou proteína, fixação, armazenamento, congelamento, ultrafiltração, concentração, evaporação, centrifugação, etc.) antes de avaliar a quantidade do marcador na amostra. The cell sample can, of course, be subjected to a variety of preparative techniques and well known post-harvest storage (e.g., nucleic acid extraction and / or protein, fixation, storage, freezing, ultrafiltration, concentration, evaporation, centrifugation, etc.) prior to assessing the amount of marker in the sample. Da mesma forma, as biópsias do tumor também podem ser sujeitas a técnicas preparativas e de armazenamento pós-colheita, por exemplo, fixação. Likewise, tumor biopsies may also be subjected to preparative techniques and post-harvest storage, e.g., fixation. É possível detetar a expressão de proteínas biomarcadoras com pelo menos uma porção que é exibida na superfície das células tumorais que a expressam. It is possible to detect the expression of biomarkers proteins with at least one portion which is displayed on the surface of tumor cells that express. Trata-se de uma questão simples para o artesão habilitado a de determinar se uma proteína marcadora, ou uma porção da mesma, está exposta na superfície celular. It is a simple matter for the artisan enabled to determine whether a marker protein, or a portion thereof, is exposed on the cell surface. Por exemplo, métodos imunológicos podem se rutilizados para detetar tais proteínas em células inteiras, ou podem ser utilizados métodos computadorizados de análise de sequências bem conhecidos para prever a presença de pelo menos um domínio extracelular (isto é, incluindo ambas proteínas segregadas e proteínas com pelo menos um domínio de superfície celular). For example, immunological methods may be rutilizados to detect such proteins on whole cells, or can be used computerized analysis methods well known sequences for predicting the presence of at least one extracellular domain (i.e. including both secreted proteins and proteins having at least one cell-surface domain). A expressão de uma proteína marcadora com pelo menos uma porção que é exibida na superfície de uma célula que a expressa pode ser detetada sem necessariamente lisar a célula tumoral (por exemplo, utilizando um anticorpo rotulado que se liga especif icamente com um domínio de superfície celular da proteína). Expression of a marker protein having at least one portion which is displayed on the surface of a cell that expresses may be detected without necessarily lysing the tumor cell (e.g., using a labeled antibody which binds specificities sterically with a cell surface domain protein). A expressão de biomarcadores pode ser avaliada por qualquer um de uma ampla variedade de métodos bem conhecidos para detetar a expressão de um ácido nucleico ou proteína transcrito. The expression of biomarkers can be assessed by any of a variety of well known methods for detecting expression of a transcribed nucleic acid or protein. Exemplos não limitantes de tais métodos incluem, por exemplo, métodos imunológicos para deteção de proteínas segregadas, de superfície celular, citoplasmáticas ou nucleares, métodos de purificação de proteínas, ensaios de atividade ou função proteica, métodos de hibridização de ácidos nucleicos, métodos de transcrição reversa de ácidos nucleicos e métodos de amplificação de ácidos nucleicos. Non-limiting examples of such methods include, for example, immunological methods for detection of secreted proteins, cell surface, cytoplasmic or nuclear, protein purification methods, activity assays or protein function, hybridization methods of nucleic acid transcription methods reverse nucleic acid amplification methods and nucleic acids. A expressão de um biomarcador pode ser avaliada utilizando um anticorpo (por exemplo, um anticorpo radio-rotulado, rotulado com cromóforo, rotulado com fluoróforo ou rotulado com enzima), um derivado de anticorpo (por exemplo, um anticorpo conjugado com um substrato ou com a proteína ou ligando de um par proteína-ligando (por exemplo, biotina-estreptavidina) ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de cadeia simples, um domínio hipervariável de anticorpo isolado, etc.) que se liga especificamente com uma proteína biomarcadora ou fragmento da mesma, incluindo uma proteína biomarcadora que foi submetida a todas ou a uma porção de modificações pós-translacionais às quais é normalmente sujeita na célula tumoral (por exemplo, glicosilação, fosforilação, metilação etc.). A expressão de um biomarcador também pode ser avaliada preparing ARNm/ADNc (isto é, um polinucleotídeo transcrito) a partir de células numa amostra de paciente e hibridizando o ARNm The expression of a biomarker can be assessed using an antibody (e.g. a radio-labeled antibody, labeled with chromophore-labeled fluorophore or labeled with enzyme), an antibody derivative (e.g. an antibody conjugated with a substrate or the protein or ligand of a protein-ligand pair (e.g. biotin-streptavidin) or an antibody fragment (e.g., a single chain antibody, an isolated antibody hypervariable domain, etc.) which binds specifically with a protein biomarker or fragment thereof, including a biomarker protein which has undergone all or a portion of post-translational modifications to which it is normally subjected in the tumor cell (e.g. glycosylation, phosphorylation, methylation etc.). the expression of a biomarker can also be assessed preparing mRNA / cDNA (i.e. a transcribed polynucleotide) from cells in a patient sample, and by hybridizing the mRNA /ADNc com um polinucleotídeo referência que é um complemento de um ácido nucleico biomarcador, ou de um fragmento do mesmo. / CDNA with a reference polynucleotide which is a complement of a biomarker nucleic acid or fragment thereof. 0 ADNc pode, opcionalmente, ser amplificado utilizando qualquer um de uma variedade de métodos de reação em cadeia da polimerase antes da hibridização com o polinucleotídeo referência. 0 cDNA can, optionally, be amplified using any of a variety of polymerase chain reaction methods prior to hybridization with the reference polynucleotide. A expressão de um ou mais biomarcadores pode, da mesma forma, ser detetada utilizando PCR quantitativa para avaliar o nível de expressão do(s) biomarcador(es). The expression of one or more biomarkers can likewise be detected using quantitative PCR to assess the expression level (s) of biomarker (s). Em alternativa, pode ser utilizado qualquer um de muitos métodos conhecidos de detetar mutações ou variantes (por exemplo, polimorfismos de nucleotídeos únicos, deleções, etc.) de um biomarcador para detetar a ocorrência num paciente. Alternatively, it may be used any of many known methods of detecting mutations or variants (e.g. single nucleotide polymorphisms, deletions, etc.) of a biomarker to detect the occurrence in a patient.

Uma mistura de polinucleotideos transcritos obtida da amostra pode ser contactada com um substrato tendo fixo ao mesmo um polinucleotídeo complementar à ou homólogo com pelo menos uma porção (por exemplo, pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500 ou mais resíduos de nucleotídeos) de um ácido nucleico biomarcador. A sample transcribed polynucleotides obtained mixture can be contacted with a substrate having fixed thereto a complementary polynucleotide to or homologous with at least a portion (e.g., at least 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 , 100, 500, or more nucleotide residues) of a biomarker nucleic acid. Se os polinucleotideos complementares a, ou homólogos com, são detetáveis diferencialmente no substrato (por exemplo, detetáveis utilizando diferentes cromóforos ou fluoróforos ou fixos em posições selecionadas diferentes), então os níveis de expressão de uma pluralidade de biomarcadores podem ser avaliados simultâneamente utilizando um único substrato (por exemplo, um microarray "chip gene" dos polinucleotideos fixos em posições selecionadas). If the complementary polynucleotides to or homologous with are detectable differentially on the substrate (e.g. detectable using different chromophores or fluorophores, or fixed to different selected positions), then the levels of expression of a plurality of biomarkers can be assessed simultaneously using a single substrate (e.g., a microarray & quot; gene chip & quot; of polynucleotides fixed at selected positions). Quando um método de avaliar a expressão do biomarcador é utilizado que envolve hibridização de um ácido nucleico com outro, a hibridização pode ser realizada em condições de hibridização estritas. When a method of assessing biomarker expression is used which involves hybridization of one nucleic acid with another, hybridization can be performed under stringent hybridization conditions.

Quando uma pluralidade de biomarcadores da invenção são utilizados nos métodos da invenção, o nível de expressão de cada biomarcador numa amostra de paciente pode ser comparado com o nível de expressão normal de cada um da pluralidade de biomarcadores em amostras não cancerígenas do mesmo tipo, seja numa mistura de reação única (isto é, utilizando reagentes, tais como diferentes sondas fluorescentes, para cada biomarcador) ou em misturas de reação individuais correspondentes a um ou mais dos biomarcadores. When a plurality of biomarkers of the invention are used in the methods of the invention, the level of expression of each biomarker in a patient sample can be compared with the normal level of expression of each of a plurality of biomarkers in non-cancerous samples of the same type, or in a single reaction mixture (i.e. using reagents, such as different fluorescent probes, for each biomarker) or in individual reaction mixtures corresponding to one or more of the biomarkers. 0 nível de expressão de um biomarcador em tecido humano normal (isto é, não cancerígeno) pode ser avaliado numa variedade de maneiras. 0 expression level of a biomarker in normal human tissue (i.e. non-cancerous) can be evaluated in a variety of ways. Este nível de expressão normal pode ser avaliado avaliando o nível de expressão do biomarcador numa porção de células que parecem ser não cancerígenas e depois comparando o nível de expressão normal com o nível de expressão numa porção das células tumorais. This normal level of expression can be assessed by assessing the level of expression of the biomarker in a portion of cells appear to be non-cancerous, and then comparing the normal level of expression with the level of expression in a portion of the tumor cells. À medida que se torna disponível mais informação como um resultado do desempenho rotineiro dos métodos descritos aqui, podem ser utilizados valores de médias populacionais para expressão normal dos biomarcadores. As more information becomes available as a result of routine performance of the methods described herein, population-average values ​​for normal expression of the biomarkers may be used. Em alternativa, o nível de expressão normal de um biomarcador pode ser determinado avaliando a expressão do biomarcador numa amostra do paciente obtida de um paciente que não padece de cancro, de uma amostra do paciente obtida de um paciente antes do despoletar suspeito do cancro no paciente, de amostras de paciente arquivadas e afins. Alternatively, the normal level of expression of a biomarker can be determined by assessing expression of the biomarker in a patient sample obtained from a patient who is not suffering from cancer, a patient sample obtained from a patient before the onset cancer suspect the patient from archived patient samples and the like.

Um método exemplar para detetar a presença ou ausência de uma proteína ou ácido nucleico biomarcador numa amostra biológica envolve obter uma amostra biológica (por exemplo, um fluido corporal associado a tumor) de um sujeito teste e contactar a amostra biológica com um compost ou um agente capaz de detetar o polipeptídeo ou ácido nucleico (por exemplo, ARNm, ADN genómico ou ADNc). An exemplary method for detecting the presence or absence of a protein or biomarker nucleic acid in a biological sample involves obtaining a biological sample (e.g., a body fluid tumor associated) from a test subject and contacting the biological sample with a compost or agent capable of detecting the polypeptide or nucleic acid (e.g., mRNA, genomic DNA or cDNA). Os métodos de deteção podem, assim, ser utilizados para detetar ARNm, proteína, ADNc ou ADN genómico, por exemplo, numa amostra biológica in vitro bem como in vivo. The detection methods can thus be used to detect mRNA, protein, cDNA, or genomic DNA, for example, a biological sample in vitro as well as in vivo. Técnicas in vitro para deteção de ARNm incluem, por exemplo, hibridações Northern e hibridações in situ. In vitro techniques for detection of mRNA include, for example, Northern hybridizations and in situ hybridizations. Técnicas in vitro para deteção de uma proteína biomarcadora incluem, mas não se limitam a, ensaios imunossorbentes ligados a enzima (ELISAs), Western blots, imunoprecipitação e imunofluorescência. In vitro techniques for detection of a biomarker protein include, but are not limited to, enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), Western blots, immunoprecipitation and immunofluorescence. Técnicas in vitro para deteção de ADN genómico incluem, por exemplo, hibridações Southern. In vitro techniques for detection of genomic DNA include, for example, Southern hybridizations. Técnicas in vivo para deteção de ARNm incluem, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), hibridações Northern e hibridações in situ. In vivo techniques for detection of mRNA include, for example, polymerase chain reaction (PCR), Northern hybridizations and in situ hybridizations. Além disso, técnicas in vivo para deteção de uma proteína biomarcadora incluem introduzir num sujeito um anticorpo rotulado dirigido contra a proteína ou fragmento da mesma. Furthermore, in vivo techniques for detection of a biomarker protein include introducing into a subject a labeled antibody directed against the protein or fragment thereof. Por exemplo, o anticorpo pode ser rotulado com um marcador radioativo cuja presença e localização num sujeito pode ser detetada por técnicas de tomografia convencionais. For example, the antibody can be labeled with a radioactive marker whose presence and location in a subject can be detected by conventional tomography techniques.

Um princípio geral de tais ensaios diagnósticos e prognósticos envolve preparar uma amostra ou mistura de reação que pode conter um biomarcador, e uma sonda, em condições apropriadas e durante um tempo suficiente para permitir que o biomarcador e a sonda interajam e se liguem, formando, assim, um complexo que pode ser removido e/ou detetado na mistura de reação. A general principle of such diagnostic tests, and prognostic involves preparing a sample or reaction mixture that may contain a biomarker, and a probe, under appropriate conditions and for a time sufficient to allow the biomarker and probe to interact and bind, forming, thus, a complex that can be removed and / or detected in the reaction mixture. Estes ensaios podem ser conduzidos numa variedade de maneiras. These assays can be conducted in a variety of ways.

Por exemplo, um método de conduzir tal ensaio envolve ancorar o biomarcador ou sonda num suporte de fase sólida, também referido como um substrato, e detetar complexos biomarcador/sonda alvo ancorados na fase sólida no final da reação. For example, one method to conduct such an assay involves anchoring the biomarker or probe on a solid phase support, also referred to as a substrate, and detecting complexes biomarker / probe target anchored on the solid phase at the end of the reaction. Numa modalidade de tal método, uma amostra de um sujeito, que é para ser ensaiada para a presença e/ou concentração do biomarcador, pode ser ancorada num veículo ou suporte de fase sólida. In one embodiment of such method, a sample from a subject, which is to be assayed for the presence and / or concentration of biomarker, can be anchored to a solid phase carrier or support. Noutra modalidade, a situação contrária é possível, na qual a sonda pode ser ancorada a uma fase sólida e uma amostra de um sujeito pode ser permitida reagir como um componente não ancorado do ensaio. In another embodiment, the reverse situation is possible, in which the probe can be anchored to a solid phase and a sample from a subject can be allowed to react as a component unanchored assay.

Existem vários métodos estabelecidos para ancorar componentes do ensaio a uma fase sólida. There are several established methods for anchoring assay components to a solid phase. Estes incluem, sem limitação, moléculas de biomarcador ou sonda que são imobilizadas através da conjugação de biotina e estreptavidina. These include, without limitation, biomarker or probe molecules which are immobilized through conjugation of biotin and streptavidin. Tais componentes biotinilados do ensaio podem ser preparados a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-sucinimida) utilizando técnicas conhecidas na arte (por exemplo, kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, 111.) e imobilizados nos poços de placas com 96 poços revestidos com estreptavidina (Pierce Chemical). Such biotinylated assay components can be prepared from biotin-NHS (N-hydroxy-succinimide) using techniques known in the art (e.g., biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford, 111.), and immobilized in the wells plates with 96 wells coated with streptavidin (Pierce Chemical). Em certas modalidades, as superficies com componentes do ensaio imobilizados podem ser preparadas atempadamente e armazenadas. In certain embodiments, the surfaces with immobilized assay components can be prepared on time and stored. Outros veículos ou suportes de fase sólida adequados para tais ensaios incluem qualquer material capaz de ligar a classe de moléculas à qual o biomarcador ou sonda pertence. Other carriers or solid phase supports suitable for such assays include any material capable of binding the class of molecule to which the biomarker or probe belongs. Suportes ou veículos bem conhecidos incluem, mas não se limitam a, vidro, polistireno, náilon, polipropileno, náilon, polietileno, dextrano, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetite. Well known supports or carriers include, but are not limited to, glass, polystyrene, nylon, polypropylene, nylon, polyethylene, dextran, amylases, natural and modified celluloses, polyacrylamides, gabbros and magnetite. Para conduzir ensaios com as abordagens previamente mencionadas, o componente não imobilizado é adicionado à fase sólida na qual o segundo componente é ancorado. In order to conduct assays with the previously mentioned approaches, the non-immobilized component is added to the solid phase in which the second component is anchored. Depois da reação estar completa, os componentes não complexados podem ser removidos (por exemplo, por lavagem) em condições tais que quaisquer complexos formados permanecerão imobilizados na fase sólida. After the reaction is complete, uncomplexed components may be removed (e.g., by washing) under conditions such that any complexes formed will remain immobilized on the solid phase. A deteção de complexos biomarcador/sonda ancorados à fase sólida pode ser conseguida através de um número de métodos resumidos aqui. The detection of complexes biomarker / probe anchored on the solid phase can be accomplished by a number of methods summarized here. Numa modalidade, a sonda, quando é o componente do ensaio não ancorado, pode ser rotulada para o fim de deteção e leitura do ensaio, seja diretamente ou indiretamente, com rótulos detetáveis discutidos aqui e que são bem conhecidos de alguém habilitado na arte. In one embodiment, the probe, when the component is not anchored assay can be labeled for the purpose of detection and readout of the assay, either directly or indirectly, with detectable labels discussed herein and which are well known to one skilled in the art.

Também é possível detetar diretamente a formação de complexos biomarcador/sonda sem manipulação ou rotulagem adicional de qualquer componente (biomarcador ou sonda), por exemplo utilizando a técnica de transferência de energia de fluorescência (isto é, FET, ver, por exemplo, Lakowicz et al., Patente USN° 5 631 169; Stavrianopoulos, et al. , Patente USN° 4 868 103) . It is also possible to directly detect the formation of complexes biomarker / probe without additional manipulation or labeling of either component (biomarker or probe), for example using fluorescence energy transfer technique (i.e. FET, see for example, Lakowicz et al, US Patent No. 5,631,169;. Stavrianopoulos, et al, US Patent No. 4,868,103).. Um rótulo com fluoróforo na primeira molécula, dadora, é selecionado de tal maneira que, no momento da excitação com luz incidente de comprimento de onda adequado, a sua energia fluorescente emitida será absorvida por um rótulo fluorescente numa segunda molécula aceitadora, que, por sua vez, é capaz de fluorescer devido à energia absorvida. A labeled with the fluorophore on the first molecule, the donor is selected such that, upon excitation with an appropriate wavelength of incident light, its fluorescent energy emitted is absorbed by a fluorescent label on a second acceptor molecule, which in turn is able to fluoresce due to the absorbed energy. Alternadamente, a molécula proteína dadora pode simplesmente utilizer a energia fluorescente natural dos resíduos de triptofano. Alternately, the protein donor molecule can simply utilizer the natural fluorescent energy of tryptophan residues. São escolhidos rótulos que emitem diferentes comprimentos de onda de luz, para que o rótulo da molécula aceitadora possa ser diferenciado do da dadora. Labels are chosen that emit different wavelengths of light to which the acceptor molecule label can be differentiated from the donor. Uma vez que a eficiência da transferência de energia entre os rótulos está relacionada com a distância que separa as moléculas, as relações espaciais entre as moléculas podem ser avaliadas. Once the energy transfer efficiency between the labels is related to the distance separating the molecules, spatial relationships between the molecules can be assessed. Numa situação na qual ocorre ligação entre as moléculas, a emissão fluorescente do rótulo da molécula aceitadora no ensaio deveria ser máxima. In a situation in which binding occurs between the molecules, the fluorescent emission of the acceptor molecule label in the assay should be maximal. Um evento de ligação FET pode ser medido de forma conveniente através de meios de deteção fluorométrica convencionais bem conhecidos na arte (por exemplo, utilizando um fluorímetro). An FET binding event can be conveniently measured through standard fluorometric detection means well known in the art (e.g., using a fluorimeter).

Noutra modalidade, a determinação da capacidade de uma sonda de reconhecer um biomarcador pode ser conseguida sem rotular qualquer um componente do ensaio (sonda ou biomarcador) utilizando uma tecnologia, tal como Análise de Interação Biomolecular em tempo real (BIA) (ver, por exemplo, Sjolander, S. e Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 e Szabo et al. , 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705) . In another embodiment, determining the ability of a probe to recognize a biomarker can be accomplished without labeling either assay component (probe or biomarker) by using a technology such as Biomolecular Interaction Analysis in real time (BIA) (see, e.g. ., Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal Chem. 63: 2338-2345 and Szabo et al, 1995, Curr Opin Struct Biol 5:..... 699-705). Conforme utilizado aqui, "BIA" As used herein, & quot; BIA & quot; ou "ressonância de plasma de superfície" or & quot; surface plasmon resonance & quot; é uma tecnologia para estudar interações biospecíficas em tempo real, sem rotular qualquer um dos interatuantes (por exemplo, BIAcore). It is a technology for studying biospecíficas interactions in real time, without labeling any of the interactants (eg, BIAcore). Alterações na massa à superfície da ligação (indicador de um evento de ligação) resultam em alterações do índice refrativo da luz próximo da superfície (o fenómeno ótico de ressonância de plasma de superfície (SPR)), resultando num sinal detetável que pode ser utilizado como uma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas. Changes in mass on the surface of the binding (indicative of a binding event) result in alterations of the refractive index of the near-surface light (the optical phenomenon surface plasmon resonance (SPR)), resulting in a detectable signal that can be used as an indication of real-time reactions between biological molecules.

Em alternativa, noutra modalidade, podem ser conduzidos ensaios análogos diagnósticos e prognósticos com biomarcador e sonda como solutos numa fase líquida. Alternatively, in another embodiment, may be performed analogous diagnostic and prognostic assays biomarker and probe as solutes in a liquid phase. Em tal ensaio, o biomarcador e sonda complexados são separados dos componentes não complexados por qualquer uma de um número de técnicas convencionais, incluindo, mas não limitadas a: centrifugação diferencial, cromatografia, eletroforese e imunoprecipitação. In such an assay, the complexed biomarker and probe are separated from uncomplexed components by any of a number of conventional techniques, including but not limited to: differential centrifugation, chromatography, electrophoresis and immunoprecipitation. Na centrifugação diferencial, os complexos biomarcador/sonda podem ser separados dos componentes não complexados do ensaio através de uma série de etapas de centrifugação, devido aos diferentes equilíbrios de sedimentação dos complexos com base nos seus diferentes tamanhos e densidades (ver, por exemplo, Rivas, G., e Minton, AP, 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7). In differential centrifugation, complexes biomarker / probe may be separated from uncomplexed assay components through a series of centrifugal steps, due to different complexes sedimentation equilibrium based on their different sizes and densities (see, for example, Rivas G., and Minton, AP, 1993, Trends Biochem Sci 18 (8):. 284-7). Técnicas cromatográficas convencionais também podem ser utilizadas para separar moléculas complexadas de moléculas não complexadas. Conventional chromatographic techniques may also be utilized to separate complexed molecules from uncomplexed molecules. Por exemplo, a cromatografia por filtração de gel separa moléculas com base no tamanho e através da utilização de uma resina de filtração de gel apropriada num formato de coluna; For example, gel filtration chromatography separates molecules based on size, and through the use of an appropriate gel filtration resin in a column format; por exemplo, o complexo relativamente maior pode ser separado dos componentes não complexados relativamente mais pequenos. for example, the relatively larger complex may be separated from the relatively smaller uncomplexed components. Da mesma forma, as propriedades de carga relativamente diferentes do complexo biomarcador/sonda quando comparadas com os componentes não complexados podem ser exploradas para diferenciar os componentes complexados dos não complexados, por exemplo através da utilização de resinas de cromatografia de troca de iões. Similarly, the relatively different charge properties of the biomarker complex / probe compared to the uncomplexed components may be exploited to differentiate the complexed from uncomplexed components, for example by using ion-exchange chromatography resins. Tais resinas e técnicas cromatográficas são bem conhecidas daqueles habilitados na arte (ver, por exemplo, Heegaard, NH, 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6) :141-8; Hage, DS, e Tweed, SAJ Chromatogr B Biomed Sei Appl Oct. 10, 1997; 699(1-2) :499-525) . Such resins and chromatographic techniques are well known to those skilled in the art (see, e.g., Heegaard, NH, 1998, J. Mol Recognit Winter 11 (1-6):.. 141-8; Hage, DS, and Tweed, SAJ Chromatogr B Biomed Sci Appl Oct. 10, 1997; 699 (1-2): 499-525). A eletroforese por gel também pode ser empregue para separar componentes do ensaio complexados de componentes não ligados (ver, por exemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1987-1999) . Gel electrophoresis may also be employed to separate complexed assay components from unbound components (see, e.g., Ausubel et al, eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & amp;.. Sons, New York, 1987-1999 ). Nesta técnica, complexos de proteínas ou ácidos nucleicos são separados com base no tamanho ou carga, por exemplo. In this technique, protein or nucleic acid complexes are separated based on size or charge, for example. Para manter a interação da ligação durante o processo eletroforético, são tipicamente utilizados materiais de matriz de gel e condições não desnaturantes na ausência de agente redutor. To maintain the binding interaction during the electrophoretic process, they are typically used gel matrix materials and non-denaturing conditions in the absence of reducing agent. As condições apropriadas para o ensaio particular e componentes do mesmo serão bem conhecidas de alguém habilitado na arte. The conditions appropriate for the particular test and the same components will be well known to one skilled in the art.

Noutra modalidade, o nível do biomarcador ARNm pode ser determinado tanto in situ e pelos formatos in vitro numa amostra biológica utilizando métodos conhecidos na arte. In another embodiment, the level of biomarker mRNA can be determined both in situ and by in vitro formats in a biological sample using methods known in the art. O termo "amostra biológica" The term & quot; biological sample & quot; pretende-se que inclua tecidos, células, fluidos biológicos e isolados dos mesmos, isolados de um sujeito, bem como tecidos, células e fluidos presentes dentro de um sujeito. It is intended to include tissues, cells, biological fluids and isolates thereof, isolated from a subject, as well as tissues, cells and fluids present within a subject. Muitos métodos de deteção de expressão utilizam ARN isolado. Many methods of expression detection using isolated RNA. Para métodos in vitro, qualquer técnica de isolamento de ARN que não selecione contra o isolamento de ARNm pode ser utilizada paraa purificação de ARN das células tumorais (ver, por exemplo, Ausubel et al. , ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque 1987-1999). For in vitro methods, any RNA isolation technique that does not select against the mRNA isolation can be used Paraa purification of RNA from tumor cells (see, e.g., Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). Adicionalmente, grandes números de amostras de tecido podem prontamente ser processados utilizando técnicas bem conhecidas daqueles habilitados na arte, tais como, por exemplo, o processo de isolamento de ARN de etapa única de Additionally, large numbers of tissue samples can readily be processed using techniques well known to those skilled in the art, such as, for example, the single-step RNA isolation process of

Chomczynski (1989, Patente USN° 4 843 155) . Chomczynski (1989, US Patent No. 4,843,155). O ARNm isolado pode ser utilziado em ensaios de hibridização ou amplificação que incluem, mas não se limitam a, análises Southern ou Northern, análises de reação em cadeia da polimerase e enaios com sondas. The isolated mRNA can be utilziado in hybridization or amplification assays that include, but are not limited to, Southern or Northern analyzes, polymerase chain reaction analyzes and probe with enaios. Um método diagnóstico para a deteção de níveis de ARNm envolve contactar o ARNm isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridizar com o ARNm codificado pelo gene a ser detetado. A diagnostic method for the detection of mRNA levels involves contacting the isolated mRNA with a nucleic acid molecule (probe) that can hybridize to the mRNA encoded by the gene being detected. A sonda de ácido nucleico pode ser, por exemplo, um ADNc de cadeia inteira, ou uma porção do mesmo, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos de comprimento e suficiente para hibridizar especificamente em condições estritas a um ARNm ou ADN genómico que codifica um biomarcador da presente invenção. The nucleic acid probe can be, for example, an entire strand cDNA, or a portion thereof, such as an oligonucleotide of at least 7, 15, 30, 50, 100, 250 or 500 nucleotides in length and sufficient to hybridize specifically stringent conditions to a mRNA or genomic DNA encoding a biomarker of the invention. Outras sondas adequadas para utilização nos ensaios diagnósticos da invenção são descritas aqui. Other suitable probes for use in diagnostic assays of the invention are described herein. A hibridização deum ARNm com a sonda indica que o biomarcador em questão está a ser expresso. Hybridization ofa mRNA with the probe indicates that the biomarker in question is being expressed.

Num formato, o ARNm é imobilizado numa superfície sólida e contactado com uma sonda, por exemplo, correndo o ARNm isolado num gel de agarose e transferindo o ARNm do gel para uma membrana, tal como nitrocelulose. In one format, the mRNA is immobilized on a solid surface and contacted with a probe, for example by running the isolated mRNA on an agarose gel and transferring the mRNA from the gel to a membrane, such as nitrocellulose. Num formato alternativo, a(s) sonda(s) são imobilizadas numa superfície sólida e o ARNm é contactado com a(s) sonda(s), por exemplo, num array chip gene Affymetrix. In an alternative format, the (s) probe (s) are immobilized on a solid surface and the mRNA is contacted with (S) probe (s), for example, an Affymetrix gene chip array. Um artesão ahbilitado pode rapidamente adaptar métodos de deteção de ARNm conhecidos para utilização na deteção do nível de ARNm codificado pelos biomarcadores da presente invenção. An artisan can readily adapt ahbilitado mRNA detection methods known for use in detecting the level of mRNA encoded by the biomarkers of the present invention.

Um método alternativo para determinar o nível de biomarcador ARNm numa amostra envolve o processo de amplificação de ácidos nucleicos, por exemplo, por RT-PCR (a modalidade experimental apresentada em Mullis, 1987, Patente USN° 4 683 202), reação em cadeia de ligase (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:189-193), replicação de sequência auto-sustentada (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al. , 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. , 1988, Bio/Technology 6:1197), replicação por circulo rolante (Lizardi et al. , Patente USN° 5 854 033) ou qualquer outro método de amplificação de ácidos nucleicos, seguido da deteção das moléculas amplificadas utilizando técnicas bem conhecidas daqueles habilitados na arte. An alternative method for determining the biomarker level of mRNA in a sample involves the process of nucleic acid amplification, e.g., by RT-PCR (the experimental embodiment set forth in Mullis, 1987, US Patent No. 4,683,202), chain reaction ligase (... Barany, 1991, Proc Natl Acad Sci USA., 88: 189-193), self sustained sequence replication (Guatelli et al, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:..... 1874- 1878), transcriptional amplification system (Kwoh et al, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86:..... 1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al, 1988, Bio / Technology 6:. 1197) , by rolling circle replication (Lizardi et al., US Patent No. 5,854,033) or any other method of amplification of nucleic acids, followed by detection of the amplified molecules using techniques well known to those skilled in the art. Estes esquemas de deteção são especialmente úteis para a deteção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estão presentes em vários números baixos. These detection schemes are especially useful for the detection of nucleic acid molecules if such molecules are present in several low numbers. Conforme utilizado aqui, os iniciadores de amplificação são definidos como sendo um par de moléculas de ácido nucleico que podem emparelhar com regiões 5' ou 3' de um gene (mais ou menos cadeias, respetivamente, ou vice-versa) e contêm uma região curta entre elas. As used herein, amplification primers are defined as being a pair of nucleic acid molecules that can anneal to 5 'or 3' of a gene (plus and minus strands, respectively, or vice-versa) and contain a short region between them. Em geral, os iniciadores de amplificação têm cerca de 10 a 30 nucleotideos de comprimento e flanqueiam uma região com cerca de 50 a 200 nucleotideos de comprimento. In general, amplification primers are about 10 to 30 nucleotides in length and flank a region with about 50 to 200 nucleotides in length. Em condições apropriadas e com os reagentes apropriados, tais iniciadores permitem a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência nucleotidica flanqueada pelos iniciadores. In appropriate reagents and appropriate conditions, such primers permit the amplification of a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence flanked by the primers.

Para os métodos in situ, o ARNm não precisa de ser isolado das células tumorais antes da deteção. For in situ methods, mRNA does not need to be isolated from the tumor cells prior to detection. Em tais métodos, uma amostra de célula ou tecido é preparada e/ou processada utilizando métodos histológicos conhecidos. In such methods, a cell or tissue sample is prepared and / or processed using known histological methods. A amostra é depois imobilizada num suporte, tipicamente uma lâmina de vidro, e depois contactada com uma sonda que pode hibridizar com o ARNm que codifica o biomarcador. The sample is then immobilized on a support, typically a glass slide, and then contacted with a probe that can hybridize to mRNA that encodes the biomarker.

Como uma alternativa a fazer determinações com base no nível de expressão absoluto do biomarcador, as determinações podem ser baseadas no nível de expressão normalizado do biomarcador. As an alternative to making determinations based on the absolute expression level of the biomarker, determinations may be based on the normalized expression level of the biomarker. Os níveis de expressão são normalizados corrigindo o nível de expressão absoluto de um biomarcador comparando a sua expressão com a expressão de um gene que não é um biomarcador, por exemplo, um gene de housekeeping que é expresso constitutivamente. Expression levels are normalized by correcting the absolute expression level of a biomarker by comparing its expression with the expression of a gene that is not a biomarker, e.g., a housekeeping gene that is constitutively expressed. Genes adequados para normalização incluem genes de housekeeping, tais como o gene da actina ou genes específicos das células epiteliais. Suitable genes for normalization include housekeeping genes such as the actin gene or epithelial cell-specific genes. Esta normalização permite a comparação do nível de expressão numa amostra, por exemplo, numa amostra de paciente, com outra amostra, por exemplo, uma amostra de não tumor ou entre amostras de diferentes fontes. This normalization allows the comparison of the expression level in one sample, e.g., a patient sample, to another sample, e.g., a non-tumor sample, or between samples from different sources.

Em alternativa, o nível de expressão pode ser providenciado cmo um nível de expressão relativo. Alternatively, the expression level can be provided cmo on an expression level. Para determinar um nível de expressão relativo de um biomarcador (por exemplo, um biomarcador mesenquimatoso), o nível de expressão do biomarcador é determinado para 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais ou 50 ou mais amostras dos isolados de célula normal versus cancerígena antes da determinção do nível de expressão para a amostra em questão. To determine an expression level for a biomarker (e.g. a mesenchymal biomarker), the biomarker expression level is determined for 10 or more 20 or more 30 or more 40 or more or 50 or more samples of the isolated normal cell versus cancer before determinção the expression level for the sample in question. O nível de expressão médio de cada um dos genes ensaiado no número maior de amostras é determinado e é utilizado como um nível de expressão padrão de valor para o biomarcador. The average level of expression of each of the genes assayed in the larger number of samples is determined and is used as a standard expression level for the biomarker value. O nível de expressão do biomarcador determinado para a amostra teste (nível de expressão absoluto) é depois dividido pelo valor de expressão médio obtido para aquele biomarcador. The particular level of biomarker expression for the test sample (absolute level of expression) is then divided by the mean expression value obtained for that biomarker. Isto providencia um nível de expressão relativo. This provides a relative expression level.

Noutra modalidade da presente invenção, uma proteína biomarcadora é detetada. In another embodiment of the present invention, a biomarker protein is detected. Um tipo de agente para detetar uma proteína biomarcadora da invenção é um anticorpo capaz de ligar-se a tal proteína ou a um fragmento da mesma, tal como, por exemplo, um anticorpo detetavelmente rotulado. One type of agent for detecting a biomarker protein of the invention is an antibody capable of binding to such a protein or a fragment thereof, such as, for example, a detectably-labeled antibody. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. The antibodies may be polyclonal or monoclonal. Pode sr utilizado um anticorpo intacto, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, polipeptídeo de cadeia de ligação única). Sr may use an intact antibody or an antigen binding fragment thereof (e.g., Fab, F (ab ') 2, Fv, scFv, single binding polypeptide chain). O termo "rotulado," The term & quot; labeled, & quot; em relação à sonda ou anticorpo, pretende-se que abranja a rotulagem direta da sonda ou anticorpo por acoplamento (isto é, ligação física) uma substância detetável à sonda ou anticorpo, bem como rotulagem indireta da sonda ou anticorpo por reatividade com outro reagente que é rotulado diretamente. with regard to the probe or antibody, is intended to encompass direct labeling of the probe or antibody by coupling (i.e., physically bond) one detectable substance to the probe or antibody, as well as indirect labeling of the probe or antibody by reactivity with another reagent that it is labeled directly. Exemplos de rotulagem indireta incluem deteção de um anticorpo primário utilizando um anticorpo secundário rotulado de forma fluorescente e rotulagem final de uma sonda de ADN com biotina, de tal modo que pode ser detetada com estreptavidina rotulada de forma fluorescente. Examples of indirect labeling include detection of a primary antibody using a labeled secondary antibody and end fluorescently labeling of a DNA probe with biotin such that it can be detected with fluorescently labeled streptavidin.

Podem ser isoladas proteínas de células tumorais utilizando técnicas que são bem conhecidas daqueles habilitados na arte. proteins of tumor cells using techniques which are well known to those skilled in the art may be isolated. Os métodos de isolamento de proteínas empregues podem, por exemplo, ser tais como aqueles descritos em Harlow e Lane (Harlow e Lane, 1988, Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). The employed protein isolation methods can, for example, be such as those described in Harlow and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Pode ser empregue uma variedade de formatos para determinar se uma amostra contém uma proteína que se liga a um dado anticorpo. It may be employed a variety of formats to determine if a sample contains a protein that binds to a given antibody. Exemplos de tais formatos incluem, mas não se limitam a, imunoensaio enzimático (EIA), radioimmunoassay (RIA), análise Western blot e ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA). Examples of such formats include, but are not limited to, enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), Western blot analysis and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Um artesão habilitado pode rapidamente adaptar métodos de deteção de proteína/anticorpo conhecidos para utilização na determinação de se as células tumorais expressam um biomarcador da presente invenção. A skilled artisan can readily adapt methods for detecting protein / antibody known for use in determining whether tumor cells express a biomarker of the invention.

Num formato, podem ser utilizados anticorpos, ou fragmentos ou derivados de anticorpo, em métodos tais como Western blots ou técnicas de imunofluorescência para detetar as proteínas expressas. In one format, antibodies may be used, or antibody fragments or derivatives in methods such as Western blots or immunofluorescence techniques to detect the expressed proteins. Em tais utilizações, tanto os anticorpos como as proteínas podem ser imobilizados num suporte sólido. In such uses, both antibodies as proteins can be immobilized on a solid support. Suportes de fase sólida ou veículos adeqaudos incluem qualquer suporte capaz de ligar-se a um antígeno ou a um anticorpo. solid phase supports or carriers include any support adeqaudos capable of binding to an antigen or an antibody. Suportes ou veículos bem conhecidos incluem vidro, polistireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetite. Well known supports or carriers include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amylases, natural and modified celluloses, polyacrylamides, gabbros and magnetite. Alguém habilitado na arte conhecerá muitos outros veículos adequados para ligar o anticorpo ou antígeno e será capaz de adaptar tal suporte para utilização com a presente invenção. One skilled in the art will know many other suitable carriers for binding antibody or antigen, and will be able to adapt such support for use with the present invention. Por exemplo, proteínas isoladas de células tumorais podem ser corridas em eletroforese em gel de poliacrilamida e imobilizadas num suporte de fase sólida, tal como nitrocelulose. For example, protein isolated from tumor cells can be run in polyacrylamide gel electrophoresis and immobilized on a solid phase support such as nitrocellulose. 0 suporte pode depois ser lavado com tampões adequados seguido de tratamento com o anticorpo detetavelmente rotulado. 0 support may then be washed with suitable buffers followed by treatment with the detectably labeled antibody. 0 suporte de fase sólida pode depois ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo não ligado. 0 solid phase support may then be washed with the buffer a second time to remove unbound antibody. A quantidade de rótulo ligado no suporte sólido pode depois ser detetada por meios convencionais. The amount of bound label on solid support may then be detected by conventional means.

Para ensaios ELISA, os pares de ligação específicos podem ser do tipo imune ou não imune. For ELISA assays, specific binding pairs can be of the immune or non-immune type. Os pares de ligação específicos imunes são exemplificados por sistemas antígeno-anticorpo ou sistemas hapteno/anti-hapteno. Immune specific binding pairs are exemplified by antigen-antibody systems or hapten / anti-hapten systems. Podem ser mencionados fluoresceina/anti-fluoresceina, dinitrofenil/anti-dinitrofenil, biotina/anti-biotina, péptido/anti-péptido e afins. There may be mentioned fluorescein / anti-fluorescein, dinitrophenyl / anti-dinitrophenyl, biotin / anti-biotin, peptide / anti-peptide and the like. 0 membro anticorpo do par de ligação específico pode ser produzido pelos métodos habituais familiares daqueles habilitados na arte. 0 even antibody specific binding member can be produced by customary methods familiar to those skilled in the art. Tais métodos envolvem imunizar um animal com o membro antígeno do par de ligação específico. Such methods involve immunizing an animal with the antigen member of the pair of specific binding. Se o membro antígeno do par de ligação específico não for imunogénico, por exemplo, um hapteno, pode ser acoplado de forma covalente a uma proteína veículo para se tornar imunogénico. If the antigen member of the specific binding pair is not immunogenic, e.g., a hapten, it can be covalently coupled to a carrier protein to become immunogenic. Os pares de ligação não imunes incluem sistemas em que os dois componentes partilham uma afinidade natural um pelo outro, mas não são anticorpos. Non-immune binding pairs include systems wherein the two components share a natural affinity for each other but are not antibodies. Pares não imunes exemplares são biotina-estreptavidina, fator-vitamina B 12 intrínseco, proteína de ligação do ácido fólico-folato e afins. Exemplary non-immune pairs are biotin-streptavidin, factor-vitamin B12 intrinsic, binding protein folic acid-folate and the like.

Uma variedade de métodos estão disponíveis para rotular de forma covalente anticorpos com membros de pares de ligação específicos. A variety of methods are available to covalently label antibodies with the specific binding pair members. Os métodos são selecionados com base na natureza do membro do par de ligação específico, do tipo de ligação desejado e da tolerância do anticorpo a várias químicas de conjugação. Methods are selected based on the nature of the specific binding pair member, the type of connection desired and the tolerance of the antibody to various conjugation chemistries. A biotina pode ser acoplada de forma covalente a anticorpos utilizando derivados ativos comercialmente disponíveis. Biotin can be covalently coupled to antibodies by utilizing commercially available active derivatives. Alguns destes são biotina-N-hidroxi-sucinimida que se liga a grupos amina em proteínas; Some of these are biotin-N-hydroxy-succinimide which binds to amine groups on proteins; biotina hidrazida que se liga a frações de carbohidrato, aldeídos e grupos carboxilo através de ma união carbodiimida; biotin hydrazide which binds to carbohydrate fractions, aldehydes and carboxyl groups via a carbodiimide coupling ma; e biotina maleimida e iodoacetil biotin que se liga a grupos sulfidrilo. and biotin maleimide and iodoacetyl biotin which bind to sulfhydryl groups. A fluoresceína pode ser acoplada a grupos amina de proteína utilizando isotiocianato de fluoresceína. Fluorescein can be coupled to protein amine groups using fluorescein isothiocyanate. Os grupos de dinitrofenilo podem ser acoplados a grupos amina de proteína utilizando sulfato de 2,4-dinitrobenzeno ou 2,4-dinitrofluorobenzeno. The dinitrophenyl group can be coupled to protein amine groups using 2,4-dinitrobenzene sulfate or 2,4-dinitrofluorobenzene. Podem ser empregues outros métodos de conjugação convencionais para unir anticorpos monoclonais a um membro de um par de ligação especifico incluindo dialdeido, união por carbodiimida, reticulação homofuncional e reticulação heterobifuncional. There may be employed other conventional conjugation methods for attaching monoclonal antibodies to a member of a specific binding pair including dialdehyde, carbodiimide coupling, crosslinking, and heterobifunctional crosslinking homofuncional. A união por carbodiimida é um método eficaz de unir grupos carboxilo numa substância a grupos amina de outra. The carbodiimide coupling is an effective method to attach a carboxyl group of another substance to amine groups. A união por carbodiimida é facilitada utilizando o reagente comercialmente disponível l-etil-3-(dimetil-aminopropil)-carbodiimida (EDAC). The carbodiimide coupling is facilitated by using the commercially available reagent l-ethyl-3- (dimethyl-aminopropyl) -carbodiimide (EDAC).

Reticulantes homobifuncionais, incluindo os imidoésteres bifuncionais e N-hidroxisucinimida ésteres bifuncionais, estão comercialmente disponíveis e são empregues para unir grupos amina numa substância a grupos amina de outra. Homobifunctional crosslinkers, including the bifunctional and N-hydroxysuccinimide esters bifunctional imidoesters, are commercially available and are employed for attaching a substance to amine groups of other amino groups. Reticulantes heterobifuncionais são reagentes que possuem diferentes grupos funcionais. Heterobifunctional crosslinkers are reagents which possess different functional groups. Os reticulantes heterobifuncionais comercialmente disponíveis mais comuns têm um N-hidroxisucinimida éster reativo a amina como um grupo funcional e um grupo sulfidrilo reativo como o segundo grupo funcional. The most common commercially available heterobifunctional crosslinkers have an N-hydroxysuccinimide ester reactive amine as a functional group and a sulfhydryl reactive group as the second functional group. Os grupos sulfidrilo reativos mais comuns são as maleimidas, piridil dissulfidos e halogénios ativos. The most common reactive sulfhydryl groups are maleimides, pyridyl disulfides and active halogens. Um dos grupos funcionais pode ser um arilnitreno fotoativo, que quando irradiado reage com uma variedade de grupos. One of the functional groups can be a photoactive arilnitreno which reacts when irradiated with a variety of groups. 0 anticorpo detetavelmente rotulado ou membro detetavelmente rotulado do par de ligação especifico é preparado unindo a um repórter, que pode ser um material isótopo radioativo, enzima, fluorogénico, quimioluminescente ou eletroquimico. 0 detectably labeled and detectably-labeled member of the specific binding pair is prepared by combining antibody a reporter which can be a radioactive isotope material, enzyme, fluorogenic, chemiluminescent or electrochemical. Dois isótopos radioativos vulgarmente utilizados são 1251 e 3H. Two commonly used radioactive isotopes are 1251 and 3H. Procedimentos convencionais de rotulagem isotópica radioativa incluem os métodos de cloramina T, lactoperoxidase e de Bolton-Hunter para 1251 e metilação redutora para 3H. Conventional procedures radioactive isotope labeling methods include the chloramine T, lactoperoxidase and Bolton-Hunter 1251 and reductive methylation for 3H. 0 termo "detetavelmente rotulado" 0 term & quot; detectably labeled & quot; refere-se a uma molécula rotulada de tal maneira que pode ser rapidamente detetada pela atividade enzimática intrínseca do rótulo ou pela ligação ao rótulo de outro componente, que pode ele próprio ser rapidamente detetado. It refers to a molecule labeled in such a way that can be readily detected by the intrinsic enzymatic activity of the label or by binding to the label of another component, which can itself be readily detected.

Enzimas adequadas para utilização nesta invenção incluem, mas não se limitam a, peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose oxidase, luciferases, incluindo pirilampo e renila, β-lactamase, ureiase, proteína fluorescente verde (GFP) e lisozima. Suitable enzymes for use herein include, but are not limited to, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose oxidase, luciferases, including firefly and renilla, β-lactamase, urease, green fluorescent protein (GFP) and lysozyme. A rotulagem com enzimas é facilitada utilizando dialdeído, união por carbodiimida, reticulantes homobifuncionais ev reticulantes heterobifuncionais, conforme descrito anteriormente, para unir um anticorpo com um membro de um par de ligação específico. Labeling with enzymes is facilitated using dialdehyde, carbodiimide coupling, homobifunctional crosslinkers v heterobifunctional crosslinkers as described above, to attach an antibody with a member of a specific binding pair. 0 método de rotulagem escolhido depende dos grupos funcionais disponíveis na enzima e do material a ser rotulado e da tolerância de ambas condições de conjugação. 0 labeling method chosen depends on the functional groups available on the enzyme and the material to be labeled, and the tolerance of both conjugation conditions. 0 método de rotulagem utilizado na presente invenção pode ser um de, mas não limitado a, quaisquer dos métodos convencionais empregues incluindo aqueles descritos por 0 labeling method used in the present invention may be one of, but not limited to, any of the conventional methods employed including those described by

Engvall e Pearlmann, Immunochemistry 8, 871 (1971), Avrameas e Temynck, Immunochemistry 8, 1175 (1975), Ishikawa et al. Engvall and Pearlmann, Immunochemistry 8, 871 (1971), and Temynck Avrameas, Immunochemistry 8, 1175 (1975), Ishikawa et al. , J. Immunoassay 4(3):209-327 (1983) e Jablonski, Anal. J. Immunoassay 4 (3): 209-327 (1983) and Jablonski, Anal. Biochem. Biochem. 148:199 (1985). 148: 199 (1985). A rotulagem pode ser conseguida por métodos indiretos, tais como utilizando espaçadores ou outros membros de pares de ligação específicos. Labeling can be accomplished by indirect methods such as using spacers or other members of specific binding pairs. Um exemplo disto é a deteção de um anticorpo biotinilado com estreptavidina não rotulada e enzima biotinilada, com estreptavidina e enzima biotinilada a ser adicionada sequencial ou simultâneamente. An example is the detection of a biotinylated antibody with unlabeled streptavidin and biotinylated enzyme, with streptavidin and biotinylated enzyme being added either sequentially or simultaneously. Assim, de acordo com a presente invenção, o anticorpo utilizado para detetar pode ser detetavelmente rotulado diretamente com um repórter ou indiretamente com um primeiro membro de um par de ligação específico. Thus, according to the present invention, the antibody used to detect can be detectably-labeled directly with a reporter or indirectly with a first member of a specific binding pair. Quando o anticorpo é unido a um primeiro membro de um par de ligação específico, então a deteção é efetuada reagindo o anticorpo-primeiro membro de um complexo de ligação especifico com o segundo membro do par de ligação que é rotulado ou não rotulado, conforme mencionado anteriormente. When the antibody is coupled to a first member of a specific binding pair, then detection is effected by reacting the antibody-first member of a specific binding complex with the second member of the pair of link that is labeled or unlabeled as mentioned previously.

Além disso, o anticorpo detetor não rotulado pode ser detetado reagindo o anticorpo não rotulado com um anticorpo rotulado específico para o anticorpo não rotulado. Moreover, the unlabeled detector antibody can be detected by reacting the unlabeled antibody with a labeled antibody specific for the unlabeled antibody. Nesta ocasião, "detetavelmente rotulado", conforme utilizado anteriormente, é interpretado como contendo um epítopo pelo qual um anticorpo específico para o anticorpo não rotulado se pode ligar. On this occasion, & quot; detectably labeled & quot ;, as used above, is interpreted as containing an epitope by which an antibody specific for the unlabeled antibody can bind. Tal anti-anticorpo pode ser rotulado diretamente ou indiretamente utilizando qualquer uma das abordagens discutidas anteriormente. Such an anti-antibody can be labeled directly or indirectly using any of the approaches discussed above. Por exemplo, o anti-anticorpo pode ser unido a biotina que é detetada reagindo com o sistema estreptavidina-peroxidase de raiz-forte discutido anteriormente. For example, the anti-antibody can be coupled to biotin which is detected by reacting with streptavidin horseradish peroxidase system discussed above. Assim, numa modalidade, é utilizada biotina. Thus, in one embodiment, biotin is used. O anticorpo biotinilado é, por sua vez, reagido com o complexo estreptavidina-peroxidase de raiz-forte. The biotinylated antibody is in turn reacted with streptavidin-horseradish peroxidase complex. Ortofenilenodiamina, 4-cloro-naftol, tetrametilbenzidina (TMB), ABTS, BTS ou ASA podem ser utilizados para deteção cromogénica. Orthophenylenediamine, 4-chloro-naphthol, tetramethylbenzidine (TMB), ABTS, BTS or ASA can be used for chromogenic detection.

Num formato de imunoensaio para praticar esta invenção, um ensaio do tipo forward sandwich é utilizado no qual o reagente de captura foi imobilizado, utilizando técnicas convencionais, na superfície de um suporte. In one immunoassay format for practicing this invention, a forward sandwich type assay is used in which the capture reagent has been immobilized, using conventional techniques, on the surface of a support. Suportes adequados utilizados nos ensaios incluem suportes de polímeros sintéticos, tais como polipropileno, polistireno, polistireno substituído, por exemplo, polistireno aminado ou carboxilado, poliacrilamidas, poliamidas, cloreto de polivinilo, contas de vidro, agarose ou nitrocelulose. Suitable supports used in assays include synthetic polymer supports, such as polypropylene, polystyrene, substituted polystyrene, e.g., aminated or carboxylated polystyrene, polyacrylamides, polyamides, polyvinylchloride, glass beads, agarose, or nitrocellulose. IV. IV. Anticorpos Anti-LOXL2 São providenciados aqui anticorpos que podem ser utilizados para diagnosticar angiogénese e doenças associadas, fibrose e doenças associadas, tumores ou metástase. LOXL2 antibodies are anti-antibodies provided herein can be used to diagnose and angiogenesis related diseases, fibrosis and related diseases, tumors or metastasis. São providenciados aqui anticorpos que inibem a angiogénese e doenças associadas, inibem fibrose e doenças associadas e tratam tumores ou metástase. here they are provided antibodies which inhibit angiogenesis and related diseases, fibrosis, and inhibit and treat diseases associated with tumors or metastasis. São providenciados aqui anticorpos que podem ser utilizados para monitorizar a eficácia de regimes e protocolos de tratamento e afins, conforme descrito ao longo do presente pedido e conhecidos na arte. here they are provided antibodies that can be used to monitor the effectiveness of treatment regimens and protocols, and the like, as described throughout the present application and known in the art. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno úteis em tais métodos são aqueles, por exemplo, que se ligam especificamente a L0XL2. Antibodies and binding fragments antigen useful in such methods are those, for example, that bind specifically to L0XL2. A revelação também descreve linhas celulares que produzem anticorpos ou fragmentos funcionais dos mesmos, métodos para produzir as linhas celulares e métodos para produzir os anticorpos ou os fragmentos funcionais dos mesmos. The disclosure also describes cell lines which produce antibodies or functional fragments thereof, methods for producing the cell lines, and methods for producing the antibodies or functional fragments thereof. 0 termo "anticorpo" 0 term & quot; antibody & quot; ou "molécula de anticorpo" or & quot; antibody molecule & quot; nas várias formas gramáticas é utilizado aqui como um nome coletivo que se refere a uma população de moléculas de imunoglobulina e/ou porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de combinação ao anticorpo ou parátopo. in the various grammatical forms is used herein as a collective noun that refers to a population of immunoglobulin molecules and / or immunologically active portions of immunoglobulin molecules, i.e., molecules that contain an antibody combining site or paratope. Assim, a referência a um "anticorpo" Thus, reference to an & quot; antibody & quot; também inclui referência a qualquer um dos fragmentos de ligação ao antigeno dos anticorpos . also includes reference to any one of the antigen binding fragments of antibodies.

Conforme utilizado aqui, "imunorreativo" As used herein, & quot; immunoreactive & quot; refere-se a anticorpos ou fragmentos dos mesmos que são específicos de uma sequência de resíduos de aminoácidos ("local de ligação" ou "epítopo"), no entanto se são reativos de forma cruzada com outros péptidos/proteínas, são não tóxicos nos níveis para os quais eles são formmulados para administração a utilização humana. refers to antibodies or fragments thereof which are specific for an amino acid residue sequence (& quot; binding site & quot; or & quot; epitope & quot;), however if they are reactive cross-reactive with other peptides / proteins, is non-toxic the levels to which they are formmulados for administration to human use. "Epítopo" & Quot; Epitope & quot; refere-se àquela porção de um antigeno capaz de formar uma interação de ligação com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. It refers to that portion of an antigen capable of forming a binding interaction with an antibody or antigen binding fragment thereof. Tal interação de ligação pode ser manifestada como um contacto intermolecular com um ou mais resíduos de aminoácidos de uma CDR. Such binding interaction can be manifested as an intermolecular contact with one or more amino acid residues of a CDR. A ligação ao antigeno poe envolver uma CDR3 ou um par CDR3. The connection to the poe antigen involve a CDR3 or a pair CDR3. Um epítopo pode ser uma sequência peptidica linear (isto é, "continua") ou pode ser composto de sequências de aminoácidos não contíguas (isto é, "conformacional" ou "descontínua") . An epitope can be a linear peptide sequence (i.e., & quot; continue & quot;) or may be composed of noncontiguous amino acid sequences (i.e., & quot; conformation & quot; or & quot; discontinuous & quot;). 0 termo "preferencialmente liga-se" 0 term & quot; preferentially binds & quot; significa que o agente de ligação liga-se ao local de ligação com maior afinidade do que se liga a sequências de aminoácidos não relacionadas. It means that the binding agent binds to the binding site with greater affinity than it binds unrelated amino acid sequences.

Conforme utilizado aqui, o termo "afinidade" As used herein, the term & quot; affinity & quot; refere-se à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes e é expressa como uma constante de dissociação (Kd) . It refers to the equilibrium constant for the reversible binding of two agents and is expressed as a dissociation constant (Kd). A afinidade pode ser pelo menos 1 vez superior, pelo menos 2 vezes superior, pelo menos 3 vezes superior, pelo menos 4 vezes superior, pelo menos 5 vezes superior, pelo menos 6 vezes superior, pelo menos 7 vezes superior, pelo menos 8 vezes superior, pelo menos 9 vezes superior, pelo menos 10 vezes superior, pelo menos 20 vezes superior, pelo menos 30 vezes superior, pelo menos 40 vezes superior, pelo menos 50 vezes superior, pelo menos 60 vezes superior, pelo menos 70 vezes superior, pelo menos 80 vezes superior, pelo menos 90 vezes superior, pelo menos 100 vezes superior ou pelo menos 1000 vezes superior, ou mais, do que a afinidade de um anticorpo por sequências de aminoácidos não relacionadas. The affinity can be at least 1 time higher, at least 2 fold, at least 3 fold, at least 4 fold, at least 5 fold, at least 6 times, at least 7 fold, at least 8 times greater, at least 9 fold, at least 10 fold, at least 20 fold, at least 30 fold, at least 40 fold, at least 50 fold, at least 60 fold, at least 70 times higher, at least 80 fold, at least 90 fold, at least 100 times or at least 1000 times higher, or more, than the affinity of an antibody of unrelated amino acid sequences. A afinidade de um anticorpo por uma proteína alvo pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nanomolar (nM) a cerca de 0,1 nM, de cerca de 100 nM a cerca de 1 picomolar (pM) ou de cerca de 100 nM a cerca de 1 femtomolar (fM) ou mais. The affinity of an antibody for a target protein may be, for example, about 100 nanomolar (nM) to about 0.1 nM, about 100 nM to about 1 picomolar (pM), or about 100 nM about 1 femtomolar (fM) or more. Conforme utilizado aqui, o termo "avidez" As used herein, the term & quot; avidity & quot; refere-se à resistência de um complexo de dois ou mais agentes à dissociação após diluição. It refers to the resistance of a complex of two or more agents to dissociation upon dilution. Os termos "imunorreativo" The terms & quot; immunoreactive & quot; e "preferencialmente liga-se" and & quot; preferentially binds & quot; são utilizados alternadamente aqui em relação a anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno. They are used interchangeably herein with respect to antibodies and / or antigen binding fragments. O termo "anticorpo" The term & quot; antibody & quot; também inclui moléculas que foram fabricadas por engenharia genética através da utilização de técnicas biológicas moleculares para incluir apenas porções da molécula nativa desde que aquelas moléculas têm a capacidade de se ligar a um antígeno particular ou sequências de aminoácidos com a especificidade necessária. also includes molecules that have been manufactured by genetic engineering by use of molecular biological techniques to include only portions of the native molecule from which those molecules have the ability to bind a particular antigen or amino acid sequence with the requisite specificity. Tais moléculas anticorpo alternativas incluem porções classicamente conecidas das moléculas de anticorpo, anticorpos de cadeia simples e moléculas de ligação de cadeia única. Such alternatives include antibody molecules classically conecidas portions of antibody molecules, single chain antibodies and single chain binding molecules.

Um "local de combinação ao anticorpo" An & quot; antibody combining site & quot; é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo que compreende regiões variáveis e hipervariáveis da cadeia leve e pesada que se ligam especificamente ao antígeno. is that structural portion of an antibody molecule comprising variable and hypervariable regions of heavy and light chain specifically binding to the antigen.

Conforme utilizado aqui, o termo "CDR" As used herein, the term & quot; CDR & quot; ou "região determinante de complementaridade" or & quot; complementarity determining region & quot; pretende-se que signifique os locais de combinação ao antígeno não contíguos encontrados dentro da região variável de ambos polipeptideos da cadeia leve e pesada. It is intended to mean the combination of the non-contiguous antigen sites found within the variable region of both light and heavy polypeptide chain. Estas regiões particulares foram descritas por Rabat et al., J. Biol. These particular regions have been described by Rabat et al., J. Biol. Chem. Chem. 252:6609-6616 (1977); 252: 6609-6616 (1977); Rabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos US, "Sequences of proteins of immunological interest" Rabat et al, Department of Health and Human Services US,. & Quot; Sequences of proteins of immunological interest & quot; (1991); (1991); por Chothia et al., J. Mol. by Chothia et al., J. Mol.

Biol. Biol. 196:901-917 (1987); 196: 901-917 (1987); e MacCallum et al., J. Mol. Biol. and MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), onde as definições incluem sobreposições ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados uns com os outros. 262: 732-745 (1996) where the definitions include overlapping or subsets of amino acid residues compared with each other. No entanto, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou anticorpos enxertados ou variantes dos mesmos pretende-se que esteja dentro do âmbito do termo, conforme definido e utilizado aqui. However, the application of any one of the definitions to refer to a CDR of an antibody or grafted antibodies or variants thereof are intended to be within the scope of the term as defined and used herein. Os resíduos de aminoácidos que abrangem as CDRs, conforme definido por cada uma das referências supracitadas, são apresentados no Quadro 1 a seguir como uma comparação. Amino acid residues which comprise the CDRs as defined by each of the above references are shown in Table 1 below as a comparison.

Conforme utilizado aqui, o termo "estrutura" As used herein, the term & quot; structure & quot; quando utilizado em referência a uma região variável de anticorpo pretende-se que signifique todos os resíduos de aminoácidos fora das regiões CDR dentro da região variável de um anticorpo. when used in reference to an antibody variable region is intended to mean all amino acid residues outside the CDR regions within the variable region of an antibody. Uma estrutura da região variável é, em geral, uma sequência de aminoácidos descontínua entre cerca de 100-120 aminoácidos de comprimento, mas que se pretende que se referencie apenas àqueles aminoácidos fora das CDRs. A structure of the variable region is generally a discontinuous amino acid sequence of about 100-120 amino acids in length but is intended to reference only those that amino acids outside of the CDRs. Conforme utilizado aqui, o termo "região estrutura" As used herein, the term & quot; framework region & quot; pretende-se que signifique cada domínio da estrutura que é separado pelas CDRs. It is intended to mean each domain of the framework that is separated by the CDRs. "Um inibidor da atividade de L0XL2" & Quot; An inhibitor of L0XL2 activity & quot; pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo que direta ou indiretamente inibe a atividade da lisil oxidase, incluindo, mas não limitada a, expressão génica, modificação pós-translaciona, processamento enzimático ou clivagem, ligação a um modulador de L0XL2, atividade enzimática de L0XL2 ou qualquer outra atividade descrita aqui . It can be an antibody or binding fragment antigen thereof which directly or indirectly inhibits the activity of lysyl oxidase including, but not limited to, gene expression, post-translaciona modification, enzymatic processing or cleavage, linkage to a modulator L0XL2 , L0XL2 enzymatic activity or any other activity described herein.

Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpo" As used herein, the term & quot; antibody & quot; refere-se a um agente de ligação isolado ou recombinante que compreende as sequências da região variável necessárias para se ligar especificamente a um epítopo antigénico. It refers to an isolated or recombinant binding agent that comprises the necessary variable region sequences to specifically bind to an antigenic epitope. Portanto, um anticorpo é qualquer forma de anticorpo ou fragmento do mesmo que exibe a atividade biológica desejada, por exemplo, ligação ao antigeno alvo especifico. Therefore, an antibody is any form of antibody or fragment thereof that exhibits the desired biological activity, e.g., binding to specific target antigen. Assim, é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento inteiro), anticorpos policlonais, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, diacorpos, anticorpos multispecificos (por exemplo, anticorpos bispecificos) e fragmentos de anticorpo incluindo, mas não limitados a, polipeptideos de ligação de cadeia simples, VH, VL, Fv, scFv, Fab e Fab2, etc., desde que exibam a atividade biológica desejada. Thus, it is used in the broadest sense and specifically covers monoclonal antibodies (including monoclonal antibodies entire length), polyclonal antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, diabodies, multispecificos antibodies (e.g., bispecific antibodies), and antibody fragments including but not limited to, single chain binding polypeptides, VH, VL, Fv, scFv, Fab and Fab2, etc., since they exhibit the desired biological activity. 0 termo "anticorpo humano" 0 term & quot; human antibody & quot; portanto refere-se a anticorpos que contêm sequências de origem humana, exceto por possíveis regiões CDR não humanas, e não implica que a estrutura completa de uma molécula de Ig esteja presente, apenas que o anticorpo tenha a imunogenecidade mínima num humano. therefore refers to antibodies which contain sequences of human origin, except for possible non-human CDR regions and does not imply that a complete Ig molecule structure is present, just that the antibody has minimal immunogenicity in a human. 0 termo "ligação" 0 term & quot; binding & quot; refere-se a uma associação direta entre duas moléculas, devido a, por exemplo, interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas e iónicas e/ou de ligação a hidrogénio, incluindo interações tais como pontes de sal e pontes de água. It refers to a direct association between two molecules due to, for example, covalent interactions, electrostatic, hydrophobic and ionic and / or hydrogen bonding, including interactions such as salt bridges and water bridges. 0 termo "ligação específica" 0 term & quot; specific binding & quot; é aplicável a uma situação na qual um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não mostra qualquer ligação significativa a outras moléculas que não o seu epítopo. It is applicable to a situation in which an antibody or antigen-binding fragment does not show any significant binding to molecules other than its epitope. Numa modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo liga-se especificamente a um LOX humano ou a um L0XL2 humano com uma constante de dissociação Kd igual a ou inferior a cerca de 100 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 0,5 nM, inferior a cerca de 0,1 nM, inferior a cerca de 0,01 nM ou inferior a cerca de 0,005 nM medido a uma temperatura de cerca de 4°C, 25°C, 37°C ou 42 °C. In one embodiment, an antibody or binding fragment antigen thereof specifically binds to a human LOX or a human L0XL2 with a Kd dissociation constant equal to or less than about 100 nM, less than about 10 nM, less about 1 nM, less than about 0.5 nM, less than about 0.1 nM, less than about 0.01 nM or less than about 0.005 nM measured at a temperature of about 4 ° C, 25 ° C, 37 ° C or 42 ° C.

Podem ser utilizados métodos convencionais para preparar anticorpos. Conventional methods for preparing antibodies may be used. Por exemplo, utilizando um péptido ou proteína lisil oxidase de compirmento inteiro, anti-soros policlonais ou anticorpos monoclonais podem ser feitos utilizando métodos padrão. For example, using a peptide or protein lysyl oxidase integer compirmento, polyclonal antisera or monoclonal antibodies can be made using standard methods. Um mamífero, (por exemplo, um ratinho, hamster ou coelho) podem ser imunizados com uma forma imunogénica do péptido que despoleta uma resposta de anticorpo no mamífero. A mammal, (e.g., a mouse, hamster, or rabbit) can be immunized with an immunogenic form of the peptide which elicits an antibody response in the mammal. Técnicas para conferir imunogenicidade potenciada num péptido incluem conjugação com veículos ou outras técnicas bem conhecidas na arte. Techniques for conferring immunogenicity on a peptide include conjugation enhanced with carriers or other techniques well known in the art. Por exemplo, a proteína ou péptido pode ser administrado na presença de adjuvante. For example, the protein or peptide may be administered in the presence of adjuvant. O progresso de imunização pode ser monitorizado pela deteção dos títulos de anticorpo no plasma ou soro. The progress of immunization can be monitored by detection of antibody titers in plasma or serum. Procedimentos de ELISA ou outros imunoensaios convencionais podem ser utilizados com o imunogene como antígeno para avaliar os níveis dos anticorpos. ELISA immunoassays or other conventional procedures can be used with the immunogen as antigen to assess the levels of antibodies. Após imunização, os anti-soros podem ser obtidos e, se desejado, anticorpos policlonais isolados dos soros. Following immunization, antisera can be obtained and, if desired, polyclonal antibodies isolated from the sera.

Os anticorpos podem ser gerados em cultivos celulares, em fagos ou em vários animais, incluindo, mas não limitados a, vacas, coelhos, cabras, ratinhos, ratazanas, hamsters, cobaias, ovelhas, cães, gatos, macacos, chimpanzés, primatas. Antibodies can be generated in cell culture, in phage, or in various animals, including but not limited to, cows, rabbits, goats, mice, rats, hamsters, guinea pigs, sheep, dogs, cats, monkeys, chimpanzees, apes. Portanto, um anticorpo útil nos métodos presentes é tipicamente um anticorpo de mamífero. Therefore, an antibody useful in the present methods is typically a mammalian antibody. Técnicas de fago podem ser utilizadas para isolar um anticorpo inicial ou para gerar variantes com características de especificidade ou avidez alteradas. Phage techniques can be used to isolate an initial antibody or to generate variants with altered specificity or avidity characteristics. Tais técnicas são de rotina e bem conhecidas na arte. Such techniques are routine and well known in the art. Numa modalidade, o anticorpo é produzido por meios recombinantes conhecidos na arte. In one embodiment, the antibody is produced by recombinant means known in the art. Por exemplo, um anticorpo recombinante pode ser produzido transfetando uma célula hospedeira com um vetor que compreende uma sequência de ADN que codifica o anticorpo. For example, a recombinant antibody can be produced by transfecting a host cell with a vector comprising a DNA sequence encoding the antibody. Um ou mais vetores podem ser utilizados para transfetar a sequência de ADN que expressa pelo menos um região VL e uma VH na célula hospedeira. One or more vectors can be used to transfect the DNA sequence expressing at least one VL and one VH region in the host cell. Descrições exemplares de meios recombinanets de geração e produção do anticorpo incluem Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Descriptions of exemplary recombinanets generating means and antibody production include Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal antibodies (Oxford University Press, 2000); Shephard, et al, Monoclonal antibodies (Oxford University Press, 2000).; e Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice (Academic Press, 1993). and Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press, 1993).

Os anticorpos também podem ser feitos de acordo com o protocolo descrito em Kenney, et al. The antibodies may also be made according to the protocol described in Kenney, et al. ("Production of monoclonal antibodies using a secretion capture report web." Biotechnology 13:787-790, 1995). (& Quot; Production of monoclonal antibodies using the secretion capture report web & quot; Biotechnology. 13: 787-790, 1995). Em suma, ratinhos são injetados por via subcutânea (sc) com antígeno numa formulação adjuvante. In brief, mice are injected subcutaneously (sc) with antigen in an adjuvant formulation. Para antigenos peptidicos, são conjugados péptidos com albumina do soro bovina e formulados em Adjuvante de Freund (FA) antes da imunização. For peptide antigens, peptides are conjugated to bovine serum albumin and formulated in Freund's adjuvant (FA) before immunization. Para antigenos proteicos, a proteína é formulada em adjuvante de alhidrogel-Muramil Dipéptido (ALD/MDP). For protein antigens, the protein is formulated in adjuvant Alhydrogel-Muramyl dipeptide (ALD / MDP). Células do baço e nódulos linfáticos dos ratinhos são isoladas e fundidas com células apropriadas e cultivadas. Spleen cells and lymph nodes from the mice are isolated and fused with appropriate cells and cultured. Uma biblioteca de hibridomas de células selecionadas HAT é isolada e é clonada. A library of hybridoma cells selected HAT is isolated and cloned. As células são ordenadas e os soros e sobrenadantes são revistos para a presença de anticorpos. The cells are sorted and supernatants and sera are reviewed for the presence of antibodies. "Fragmentos de anticorpo" & Quot; Antibody fragments & quot; compreendem uma porção de um anticorpo intacto e podem incluir a ligação ao antígeno ou região variável de um anticorpo intacto. They comprise a portion of an intact antibody and can include antigen binding or variable region of an intact antibody. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos scFv, diacorpos, anticorpos lineares (Zapata et al. , Protein Eng. 8(10) : 1057-1062 (1995)), moléculas de anticorpo de cadeia simples, polipeptideos de ligação de cadeia simples e anticorpos multispecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, scFv fragments, diabodies, linear antibodies (Zapata et al, Protein Eng 8 (10):.. 1057-1062 (1995)), single-chain antibody molecules, single chain binding polypeptides and multispecificos antibodies formed from antibody fragments. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigeno idênticos, designados fragmentos "Fab", cada com um local de ligação ao antigeno único e um fragmento "Fc" Papain digestion of antibodies produces two identical binding fragments antigen, fragments designated & quot; Fab & quot ;, each with a single binding site and the antigen fragment & quot; Fc & quot; residual, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar rapidamente. residual, a designation reflecting the ability to crystallize quickly. O tratamento com pepsina produz um fragmento F (ab')2 que tem dois locais de combinação ao antigeno e é ainda capaz de reticular o antigeno. Pepsin treatment yields an F (ab ') 2 fragment that has two antigen-combining sites and is still capable of crosslinking antigen.

Um "polipeptideo de ligação de cadeia simples" A & quot; binding & quot single polypeptide chain; refere-se a um polipeptideo com uma região variável da cadeia pesada, uma região variável da cadeia leve e, opcionalmente, uma região Fc da imunoglobulina. It refers to a polypeptide having a variable region of the heavy chain, a light chain variable region and optionally an Fc region of the immunoglobulin. Tal molécula é um fragmento variável de cadeia simples opcionalmente com uma função efetora através da presença da região Fc da imunoglobulina. This molecule is a single chain variable fragment optionally with an effector function by the presence of the Fc region of the immunoglobulin. Métodos de preparar polipeptideos de ligação de cadeia simples são conhecidos na arte (por exemplo, Pedido de patente US. N.° 2005/0238646). Methods to prepare single chain binding polypeptides are known in the art (e.g., U.S. Patent Application. No. 2005/0238646). "Fv" & Quot; Fv & quot; refere-se a um fragmento de anticorpo que contém um local de ligação e de reconhecimento do antigeno completo. It refers to an antibody fragment that contains a binding site and the complete antigen recognition. Esta região consiste num dimero de um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada em estreita associação não covalente. This region consists of a dimer of a light chain variable domain and a heavy chain variable domain in noncovalent association narrow. É nesta configuração que as três CDRS de cada domínio variável interagem para definer um local de ligação ao antigeno na superfície do dimero VH-VL. It is in this configuration that the three CDRs each variable domain interact to definer one antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Coletivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antigeno. Collectively, the six CDRs confer specificity to the antibody binding to antigen. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar ao antigeno, apesar de numa afinidade menor do que o local completo de ligação. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) has the ability to recognize and bind antigen, although at a lower affinity than the entire binding site.

Um fragmento "Fab" A fragment & quot; Fab & quot; contém um "Fv" It contains a & quot; Fv & quot; e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. and also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CHI) of the heavy chain. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de uns poucos resíduos no terminal carboxi do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteinas da região dobradiça do anticorpo. Fab fragments differ from Fab 'fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the CHI domain of the heavy chain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fab'-SH is the designation herein for Fab 'in which (s) residue (s) of the constant domains bear cysteine ​​free thiol group. Os fragmentos F (ab')2 de anticorpo foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteinas dobradiça entre eles. The F (ab ') 2 antibody originally were produced as pairs of Fab' fragments which have hinge cysteines between them. Outras uniões químicas de fragmentos de anticorpo também são conhecidas. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

As "cadeias leves" The & quot; light chains & quot; dos anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chamadas kapa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species can be assigned to one of two clearly distinct types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequences of their constant domains.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be assigned to different classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ainda ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these may be further divided into subclasses (isotypes), e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 2 and IGAL. Os domínios constantes da cadeia pesada (Fc) que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados α, δ, □, □ e μ, respetivamente. The heavy chain constant domains (Fc) that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, □, □ and μ, respectively. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. The subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known.

As "cadeias leves" The & quot; light chains & quot; dos anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chamados kapa ou ("k") e lambda ou ("λ"), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species can be assigned to one of two clearly distinct types, called kappa or (& quot; k & quot;) and lambda or (& quot; λ & quot;) based on the amino acid sequences of their constant domains .

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" Antibody fragments & quot; Fv single chain & quot; ou "sFv" or & quot; sFv & quot; compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes num cadeia única de polipeptídeo. comprise the VH and VL domains of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Um polipeptídeo Fv pode ainda incluir, se necessário, um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, que permite o sFv de formar uma estrutura desejada para ligação ao antigeno. An Fv polypeptide may further comprise, if necessary, a polypeptide linker between the VH and VL domains which enables the sFv to form a desired structure for antigen binding. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of monoclonal antibodies, volume 113, Rosenburg e Moore editores, Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 269-315 (1994). For a review sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of monoclonal antibodies, volume 113, Rosenburg and Moore publishers, Springer-Verlag, New York, pages 269-315 (1994). 0 termo "diacorpos" 0 term & quot; diabodies & quot; refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigeno, cujos fragmentos contêm um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). It refers to small antibody fragments with two antigen-binding sites, which fragments contain a variable heavy chain domain (VH) connected to a light-chain variable domain (VL) in the same polypeptide chain (VH-VL). Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigeno. By using a linker that is too short to allow pairing between the two domains on the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of another chain and create two antigen-binding sites. Os diacorpos são descritos com mais detalhe, por exemplo, no documento EP 404 097; Diabodies are described in greater detail, for example, in EP 404 097; documento WO 93/11161; WO 93/11161; e Hollinger et al. and Hollinger et al. , Proc. Proc. Nat1. NAT1. Acad. Acad. Sei. Know. USA, 90:6444-6448 (1993). USA, 90: 6444-6448 (1993).

Um anticorpo também pode ser um anticorpo bispecífico. An antibody may also be a bispecífico antibody. Anticorpos bispecíficos são anticorpos monoclonais, quiméricos, humanos ou humanizados que têm especificidades de ligação por pelo menos dois antigenos diferentes. bispecific antibodies are monoclonal, chimeric, human or humanized antibodies that have binding specificities for at least two different antigens. No presente caso, uma das especificidades de ligação é, por exemplo, por LOX ou LOXL2, a outra é por qualquer outro antigeno, tal como, por exemplo, um proteína da superfície celular ou recetor ou subunidade de recetor. In the present case, one of the binding specificities is for example, LOX or LOXL2, the other one is for any other antigen, such as, for example, a cell-surface protein or receptor or receptor subunit. Em modalidades adicionais, um anticorpo bispecífico é específico por LOX e LOXL2. In further embodiments, one bispecífico antibody is specific for LOX and LOXL2. Métodos para fazer anticorpos bispecíficos são conhecidos na arte. Methods for making bispecific antibodies are known in the art. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos bispecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature, 305:537 539 (1983)). Traditionally, the recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two heavy chain pairs / immunoglobulin light chain, where the two heavy chains have different specificities (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 539 (1983)). Por causa do sortido aleatório de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura bispecífica correta. Because of the random assortment of heavy and light immunoglobulin chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of ten different antibody molecules, of which only one has the correct bispecífica structure. A purificação da molécula correta é normalmente conseguida por etapas de cromatografia por afinidade. The purification of the correct molecule is usually accomplished by affinity chromatography steps. Procedimentos semelhantes são revelados no documento WO 93/08829, publicado a 13 de maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). Similar procedures are disclosed in WO 93/08829, published 13 May 1993, and in Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antígeno) podem ser fundidos com sequências do domínio constante de imunoglobulina utilizando métodos convencionais conhecidos na arte. Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused with sequences from the immunoglobulin constant domain using standard methods known in the art. A fusão é, em geral, com um domínio constanteda cadeia pesada da imunoglobulina contendo pelo menos parte das regiões dobradiça, CH2 e CH3. The fusion is in general with a field CONSTANT immunoglobulin heavy chain comprising at least part of the hinge region, CH2 and CH3. Numa modalidade, a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) que contém o local necessário para a ligação da cadeia leve está presente em pelo menos uma das fusões. In one embodiment, the first heavy-chain constant region (CHI) containing the site necessary for light-chain binding present in at least one of the fusions. Os ADN que codificam as fusões das cadeias pesadas da imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, podem ser inseridos em vetores de expressão separados e podem ser co-transfetados num organismo hospedeiro adequado. The DNA encoding the fusions of immunoglobulin heavy chains and, if desired, the immunoglobulin light chain, can be inserted into separate expression vectors and may be co-transfected into a suitable host organism. Para obter mais detalhes sobre a geração de anticorpos bispecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) . For more details about generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al, Methods in Enzymology. 121: 210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita no documento WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser fabricada para maximizer a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinante. According to another approach described in WO 96/27011, the interface between a pair of antibody molecules can be engineered to maximizer the percentage of heterodimers which are recovered from recombinant cell culture. A interface pode compreender pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante do anticorpo. The interface may comprise at least part of the CH3 region of an antibody constant domain. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano) . In this method, one or more small amino acid side chains from the interface first antibody molecule are replaced with larger side chains (e.g. tyrosine or tryptophan). "Cavidades" & Quot; cavities & quot; compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da cadeia(s) laterais grandes são criadas na interface da segundo molécula de anticorpo substituindo as cadeias laterais grande dos aminoácidos por umas mais pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). identical or similar size to the compensation of the chain (s) are created on the large side of the second antibody molecule by replacing large interface side chains of amino acids by a smaller ones (e.g. alanine or threonine). Isto providencia um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros. This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers.

Anticorpos bispecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento inteiro ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos bispecíficos F(ab')2). bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments (e.g., bispecific antibody F (ab ') 2). Técnicas para gerar anticorpos bispecíficos a partir de fragmentos de anticorpo foram descritas na literatura. Techniques for generating bispecific antibodies from antibody fragments have been described in the literature. Por exemplo, anticorpos bispecíficos podem ser preparados utilizando ligação química. For example, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Brennan et al, Science 229:. 81 (1985) describe a procedure wherein intact antibodies are proteolytically divided to generate F (ab ') 2. Estes fragmentos são reduzidos na presença de agente de complexo ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfido intermolecular. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. Os fragmentos Fab' gerados são depois convertido em derivados de tionitrobenzoato (TNB). The Fab 'fragments generated are then converted to thionitrobenzoate derivatives (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é depois reconvertido para Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo bispecífico. One of the Fab'-TNB derivatives is then reconverted to the Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and is mixed with an equimolar amount of the other Fab'-TNB derivative to form the bispecífico antibody. Os anticorpos bispecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. The bispecific antibodies produced can be used as agents for the selective immobilization of enzymes.

Os fragmentos Fab' podem ser recuperados diretamente de E. coli e unidos quimicamente para formar anticorpos bispecificos. Fab 'fragments may be directly recovered from E. coli and chemically joined to form bispecific antibodies. Shalaby et al. Shalaby et al. , J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo bispecifico completamente humanizada. Med 175:.. 217-225 (1992) describe the production of a molecule F (ab ') 2 bispecifico fully humanized antibody. Cada fragmento Fab' foi segregado separademente de E. coli e sujeito a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo bispecífico. Each Fab 'fragment was separademente secreted from E. coli and subjected to directed chemical coupling in vitro to form the bispecífico antibody. 0 anticorpo bispecífico assim formado foi capaz de ligar-se a células que sobre-expressam o recetor ErbB2 e células T humanas normais, bem como despoletar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor mamário humano. 0 bispecífico antibody thus formed was able to bind to cells overexpressing the ErbB2 receptor and normal human T cells, as well as trigger the lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets. Várias técnicas para fabricar e isolar fragmentos de anticorpo bispecificos diretamente a partir de cultivos celulares recombinantes também foram descritas. Various techniques for making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. Por exemplo, anticorpos bispecificos foram produzidos utilizando ziperes de leucina. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Kostelny et al., J. Immunol. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5) :1547-1553 (1992) . 148 (5): 1547-1553 (1992). Os péptidos zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. The leucine zipper peptides from the Fos and Jun proteins were linked to the Fab 'portions of two different antibodies by gene fusion. Os homodimeros do anticorpo foram reduzidos na região dobradiça para formar monómeros e depois re-oxidados para formar os heterodímeros do anticorpo. The antibody homodimers were reduced at the hinge region to form monomers and then re-oxidized to form the antibody heterodimers. Este método também pode ser utilizado para a produção dos homodimeros do anticorpo. This method can also be used for the production of antibody homodimers. A tecnologia "diacorpo" Technology & quot; diabody & quot; descrito por Hollinger et al., Proc. described by Hollinger et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sei. Know. USA 90:6444-6448 (1993) providenciou um mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpo bispecificos. USA 90: 6444-6448 (1993) has provided an alternative mechanism for making bispecific antibody fragments. Os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligados a um domínio variável da cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. The fragments comprise a heavy chain variable domain (VH) connected to a light chain variable domain (VL) by a linker which is too short to allow pairing between the two domains on the same chain. Em conformidade, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antígeno. Accordingly, the VH and VL domains of one fragment are forced to pair with the complementary VL and VH domains of another fragment, thereby forming two antigen-binding sites. Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo bispecíficos pela utilização de dimeros Fv (sFv) de cadeia simples também foi reportada. Another strategy for making bispecific antibody fragments by the use of dimeric Fv (sFv) single chain was also reported. Ver, Gruber et al. See, Gruber et al. , J. Immunol. J. Immunol. 152:5368 (1994) . 152: 5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Antibodies with more than two valences are contemplated. Por exemplo, anticorpos trispecificos podem ser preparados. For example, antibodies can be prepared trispecificos. Tutt et al., J. Immunol. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991) . 147: 60 (1991).

Anticorpos bispecíficos exemplares podem ligar a dois epítopos diferentes num dado polipeptídeo LOXL2 aqui. Bispecific antibodies copies can bind to two different epitopes on a given polypeptide LOXL2 here. Em alternativa, um polipeptídeo braço anti-LOXL2 pode ser combined com um braço que se liga a uma molécula que despoleta num leucócito tal como uma molécula recetora de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7), ou recetores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16) de modo a focar mecanismos de defesa celular para a célula que expressa um polipeptídeo alvo particular. Alternatively, a polypeptide anti-LOXL2 arm may be combined with an arm which binds to a molecule that elicits a leukocyte such as a receptor molecule for T cells (e.g., CD2, CD3, CD28, or B7), or Fc receptors for IgG (FcyR), such as FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) and FcyRIII (CD 16) so as to focus cellular defense mechanisms to the cell expressing a particular polypeptide target. Anticorpos bispecíficos também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam um polipeptídeo alvo particular. bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic agents to cells which express a particular polypeptide target. Estes anticorpos possuam um braço de ligação ao alvo e um braço que se liga a um agente citotóxico ou um quelante radionuclídeo, tais como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. These antibodies possess one arm binding to the target and an arm which binds a cytotoxic agent or a radionuclide chelator, such as EOTUBE, DPTA, DOTA, or TETA. Outro anticorpo bispecífico de interesse liga o polipeptídeo alvo e liga ainda fator tecidular (TF). Another bispecífico antibody of interest binds the target polypeptide and further binds tissue factor (TF). O anticorpo anti-LOXL2 também pode ser um anticorpo heteroconjugado. The anti-LOXL2 antibody may also be a heteroconjugate antibody. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos unidos de forma covalente. Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently joined antibodies. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para dirigirem células do sistema imune para células indesejadas (Patente USN° 4 676 980) e para tratamento de infeção por HIV (documentos WO 91/00360 e WO 92/200373). Such antibodies have, for example, been proposed to direct immune system cells to unwanted cells (US Patent No. 4,676,980), and for treatment of HIV infection (WO 91/00360 and WO 92/200373 documents). Anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de síntese proteica, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Antibodies may be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reação de troca de dissulfido ou formando uma ligação tioéter. For example, immunotoxins may be constructed using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem, mas não se limitam a, iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles revelados, por exemplo, na Patente USN° 4 676 980 . Examples of suitable reagents for this purpose include, but are not limited to, iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate and those disclosed, for example, in US Patent No. 4,676,980.

Pode ser desejável modificar um anticorpo anti-LOXL2 em relação à função efetora, de modo a potenciar, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento ou prevenção de metástase cancerígena. It may be desirable to modify an anti-LOXL2 antibody with respect to effector function, so as to enhance, e.g., the effectiveness of the antibody in treating or preventing cancer metastasis. Por exemplo, podem ser introduzidos resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo, assim, formação de ligação dissulfido intercadeia nesta região. For example, they can be inserted residue (s) of cysteine ​​in the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada pelo complement melhorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). The homodimeric antibody thus generated may have improved internalization capability and / or cell death mediated by enhanced complement and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Ver Caron et al. See Caron et al. , J. Exp Me d., 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) . J. Exp I d., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral potenciada também podem ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais conforme descrito em Wolff et al. Homodimeric antibodies with enhanced antitumor activity may also be prepared using heterobifunctional cross-linkers as described in Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993) . Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Em alternativa, um anticorpo poe ser fabricado por engenharia genética que tem regiões Fc duais e pode, assim, ter capacidade de lise de complemento e ADCC potenciadas. Alternatively, an antibody puts be manufactured by genetic engineering which has dual Fc regions and may thereby have enhanced complement lysis and enhanced ADCC capabilities. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989). See Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design., 3: 219-230 (1989).

Um "anticorpo isolado" An & quot; isolated antibody & quot; é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. It is one which has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Componentes do contaminante do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o anticorpo, e pode incluir, por exemplo, enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. dopant components of its natural environment are materials which would interfere with diagnostic or therapeutic uses for the antibody, and may include, for example, enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. Numa modalidade, um anticorpo será purificado (1) para maior de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% por peso de anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácidos interna através da utilização de um sequenciador de copo rotativo e/ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou coloração de prata. In one embodiment, an antibody is purified (1) to greater than 80%, 85%, 90%, 95% or 99% by weight of antibody as determined by the Lowry method, (2) to a degree sufficient to obtain at least 15 residues of N-terminal or internal amino acid sequence by use of a spinning cup sequenator, and / or (3) to homogeneity by SDS-PAGE under reducing or nonreducing conditions using Coomassie blue or silver staining. 0 termo "anticorpo isolado" 0 term & quot; isolated antibody & quot; inclui dentro do seu âmbito um anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. It includes within its scope one antibody in situ within recombinant cells since at least one the antibody's natural environment will not be present component. Em geral, o isolamento de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo incluirá pelo menos uma etapa de purificação. In general, the isolation of an antibody or the same antigen-binding fragment thereof comprise at least one purification step.

Um anticorpo pode ser um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. An antibody may be a humanized antibody or a human antibody. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) incluem, por exemplo, imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, polipeptideo de ligação de cadeia simples, VH, VL ou outras subsequências de ligação ao antigeno dos anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Humanized forms of non-human (e.g., murine) include, for example, chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (such as Fv, scFv, Fab, Fab ', F (ab') 2 binding polypeptide single chain, VH, VL or other antigen-binding subsequences of antibodies) which contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. Anticorpos quiméricos incluem aqueles nos quais as regiões variáveis das cadeias leve e pesada são combinadas com regiões constantes humanas (Fc) . Chimeric antibodies include those in which the variable regions of heavy and light chains are combined with human constant regions (Fc). Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recetor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tais como ratinho, ratazana ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Humanized antibodies include human immunoglobulins (recipient antibody) in which residues from a complementarity determining region (CDR) of the recipient are replaced by residues from a CDR of a nonhuman species (donor antibody) such as mouse, rat or rabbit having the desired specificity, desired affinity and capacity. Nalgumas ocasiões, resíduos da estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. On some occasions, residues of the human immunoglobulin Fv framework are replaced by corresponding non-human residues. Anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recetor nem na CDR importada ou sequências estrutura. Humanized antibodies may also comprise residues which are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequences. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma sequência consenso da imunoglobulina humana. In general, the humanized antibody will comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the CDR regions correspond to those of a nonhuman immunoglobulin and all or substantially all of the FR regions are those of a sequence consensus human immunoglobulin.

Um anticorpo humanizado também pode conter pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). A humanized antibody may also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature,.. 332:. 323-329 (1988); and Presta, Curr Op Struct Biol 2: 593-596 (1992)).... Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que é não humana. In general, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced into it from a source that is non-human. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são, com frequência, referidos como resíduos "importado" These non-human amino acid residues are often referred to as residues & quot; import & quot; ou "dadores", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado" or & quot; donor & quot ;, which are typically taken from a variable domain & quot; import & quot; ou "dador". or & quot; donor & quot ;. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. , Nature, 321:522 525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323 327 (1988)); Humanization can be essentially performed following the method of Winter and co-workers (Jones et al, Nature, 321: 522 525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:.. 323 327 (1988)); Verhoeyen et al. Verhoeyen et al. Science, 239:1534 1536 (1988)), substituindo CDRs de roedor ou sequências CDR para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Science, 239: 1534 1536 (1988)), by substituting rodent CDRs or CDR sequences for the corresponding sequences of a human antibody. Em conformidade, tais anticorpos "humanizados" Accordingly, such antibodies & quot; humanized & quot; incluem anticorpos quiméricos (Patente USN° 4 816 567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. They include chimeric antibodies (US Patent No. 4,816,567), wherein substantially less than an intact human variable domain has been substituted by the corresponding sequence from a non-human species. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are substituted by residues from analogous sites in rodent antibodies.

Anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na arte, incluindo bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom e Winter, J. Human antibodies can also be produced using various techniques known in the art, including phage display libraries (Hoogenboom and Winter, J.

Mol. Biol., 227:381 (1991); Biol., 227:. 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) ) . Marks et al, J Mol Biol 222:... 581 (1991)). As técnicas de Cole et al. The techniques of Cole et al. e Boemer et al. and Boemer et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos humanos monoclonais (Cole et al., Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). They are also available for preparing human monoclonal antibodies (Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p 77 (1985) and Boerner et al, J. Immunol, 147 (1):.... 86 -95 (1991)). Da mesma forma, podem ser feitos anticorpos humanos introduzindo loci de imunoglobulina humana em animais transgénicos, por exemplo, ratinhos nos quais genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados. Similarly, human antibodies can be made by introducing of human immunoglobulin loci into transgenic animals, e.g., mice in which the endogenous immunoglobulin genes have been partially or completely inactivated. No momento do desafio, é observada produção de anticorpo humano, que se parece muito com a observada em humanos em todos os aspetos, incluindo rearranjo de genes, montagem e repertório de anticorpo. Upon challenge is observed human antibody production which closely resembles that seen in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes USN°s 5 545 807; This approach is described, for example, in U.S. USN paragraphs 5,545,807; 5 545 806; 5,545,806; 5 569 825; 5,569,825; 5 625 126; 5,625,126; 5 633 425; 5,633,425; 5 661 016 e nas publicações cientificas seguintes: Marks et al., Bio/Technology 10,779-783 (1992); 5,661,016 and in the following scientific publications: Marks et al, Bio / Technology 10.779 to 783 (1992);. Lonberg et al. Lonberg et al. , Nature 368 856-859 (1994); , Nature 368856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812 13 (1994); Morrison, Nature 368, 13 812 (1994); Fishwald et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Fishwald et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996).; Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) . 13: 65-93 (1995).

Anticorpos monoclonais murinos foram desenvolvidos que ligam LOX ou LOXL2 e bloqueiam a atividade enzimática dos mesmos. Murine monoclonal antibodies have been developed that bind LOX or LOXL2 and block the enzymatic activity thereof. Anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos aqui são criados por humanização das sequências VL e VH dos anticorpos monoclonais murinos anti-LOX e anti-LOXL2. Humanized antibodies and antigen-binding fragments thereof described herein are created by humanization of the VL and VH sequences of murine monoclonal anti-LOX and anti-LOXL2.

Imunoglobulinas humanizadas, incluindo anticorpos humanizados, foram construídas por meios de engenharia genética. Humanized immunoglobulins, including humanized antibodies, have been constructed by genetic engineering means. A maioria das imunoglobulinas humanizadas que foram descritas previamente compreenderam uma estrutura que é idêntica à estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humana particular (isto é, um aceitador ou recetor) e três CDRs de uma cadeia de imunoglobulina não humana (dador). Most humanized immunoglobulins that have been previously described comprised a structure which is identical to the structure of a particular human immunoglobulin chain (i.e., an acceptor or receptor) and three CDRs from a nonhuman immunoglobulin chain (donor).

Conforme descrito aqui, a humanização também pode incluir critérios pelos quais um número limitado de aminoácidos na estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humanizada são identificados e escolhidos como sendo os mesmos que os aminoácidos nessas posições no dador em vez do que no aceitador, de modo a aumentar a afinidade de um anticorpo que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizada. As described herein, humanization may also include criteria by which a limited number of amino acids in the framework of a humanized immunoglobulin chain are identified and selected as being the same as the amino acids at those positions in the donor rather than in the acceptor, to increasing the affinity of an antibody comprising the humanized immunoglobulin chain. A presente invenção é baseada em parte no modelo que duas causas contribuintes da perda de afinidade em meios anteriores de produzir anticorpos humanizados (utilizando como exemplos anticorpos de ratinhos como a fonte de CDRs) são: (1) quando as CDRs de ratinho são combinadas com uma estrutura humana, os aminoácidos nas estruturas próximos das CDRs tornam-se humanas em vez de ratinho. The present invention is based in part on the model that two contributing causes of the loss of affinity in prior means of producing humanized antibodies (using as examples mouse antibodies as the source of CDR's) are: (1) When the mouse CDR's are combined with a human framework, the amino acids in the CDRs nearby structures become human instead of mouse. Sem pretender estar ligado pela teoria, estes aminoácidos alterado podem distorcer ligeiramente as CDRs (por exemplo, eles podem criar diferentes forças eletrostáticas ou hidrofóbicas do que no anticorpo de ratinho dador e as CDRs distorcidas podem não fazer contactos tão eficazes com o antigeno quanto as CDRs fizeram no anticorpo dador); Without being bound by theory, these amino acid changes may slightly distort the CDR (e.g., they can create different electrostatic forces or hydrophobic than in the donor mouse antibody, and the distorted CDR's may not make as effective contacts with the antigen as the CDR they did in the donor antibody); (2) além disso, os aminoácidos no anticorpo de ratinho original que estão próximos, mas não parte de, as CDRs (isto é, ainda parte da estrutura), podem fazer contactos com o antigeno que contribuem para a afinidade. (2) Additionally, the amino acids in the original mouse antibody that are close to, but not part of, the CDR's (i.e., still part of the framework), may make contacts with the antigen that contribute to affinity. Estes aminoácidos são perdidos quando o anticorpo é humanizado porque, em geral, todos os aminoácidos estrutura são feitos humanos. These amino acids are lost when the antibody is humanized because, in general, all amino acids are made human framework. Para contornar estes problemas, e para produzir anticorpos humanizados que têm uma afinidade muito forte por um antigeno desejado, anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos podem ser construídos utilizando um ou mais dos seguintes princípios. To circumvent these problems, and to produce humanized antibodies that have a very strong affinity for a desired antigen, humanized antibodies and antigen binding fragments thereof can be constructed using one or more of the following principles.

Um princípio é que como aceitador, uma estrutura é utilizada de uma imunoglobulina humana particular que é invulgarmente homóloga com a imunoglobulina dadora a ser humanizada ou utilizar uma estrutura consenso de muitos anticorpos humanos é utilizada como um aceitador. A principle is that as acceptor, a framework is used from a particular human immunoglobulin that is unusually homologous to the donor immunoglobulin to be humanized, or use a consensus framework from many human antibodies is used as an acceptor. Por exemplo, comparação da sequência de uma região variável da cadeia pesada (ou leve) de ratinho contra regiões variáveis de cadeia pesada (ou leve) humana numa base de dados (por exemplo, no Recurso de Identificação de Proteínas da Fundação de Investigação Biomédica Nacional ou a base de dados de sequências de proteínas do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia - NCBI) mostra que a extensão de homologia com regiões humanas diferentes podem variar grandemente, por exemplo de cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou superior. For example, comparison of the sequence of a variable region of the heavy chain (or light) mouse against regions heavy chain variable (or light) human in a database (e.g., the Protein Identification Resource of the National Biomedical Research Foundation or protein sequence database of the National Center for Biotechnology Information - NCBI) shows that the homology extension with different human regions can vary widely, for example from about 40% to about 60%, about 70% about 80% or greater. Ao escolher como aceitador imunoglobulina uma das regiões variáveis de cadeia pesada humana que é mais homóloga com a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina dadora, menos aminoácidos serão alterados ao passarem da imunoglobulina dadora para a imunoglobulina humanizada. By choosing as the acceptor immunoglobulin one of the variable regions of human heavy chain that is most homologous to the variable region of the heavy chain of the donor immunoglobulin, fewer amino acids will be changed to pass the donor immunoglobulin to the humanized immunoglobulin. Ao escolher como o aceitador imunoglobulina uma das regiões variáveis de cadeia leve humana que é mais homóloga com a região variável da cadeia leve da imunoglobulina dadora, menos aminoácidos serão alterados ao passarem da imunoglobulina dadora para a imunoglobulina humanizada. By choosing as the acceptor immunoglobulin one of the variable regions of the human light chain that is most homologous to the variable region of immunoglobulin light chain donor, fewer amino acids will be changed to pass the donor immunoglobulin to the humanized immunoglobulin. Em geral, utilizando tais técnicas, existe uma possibilidade reduzida de alterar um aminoácidos próximo de uma ou mais das CDRs que distorce a sua conformação. Typically, using such techniques, there is a reduced possibility of changing an amino acid near one or more CDRs that distorts their conformation. Além disso, a forma global precise de um anticorpo humanizado que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizado pode parecer mais estreitamente a forma do anticorpo dador, reduzindo, assim, também a possibilidade de distorcer as CDRS. Moreover, the need overall shape of a humanized antibody comprising the humanized immunoglobulin chain may more closely look like the shape of the donor antibody, thereby reducing also the possibility of distorting the CDRs.

Alguém também pode utilizer as cadeias leve e pesada do mesmo anticorpo humano como sequências aceitadoras, para melhorar a probabilidade que as cadeias leve e pesada humanizadas tornarão favoráveis os contactos umas com as outras. One can also utilizer the light and heavy chains from the same human antibody as acceptor sequences, to enhance the likelihood that the humanized light and heavy chains will make favorable contacts with the other one. Em alternativa, alguém também pode utilizer cadeias leve e pesada de diferentes sequências de linhas germinativas de anticorpo humano como sequências aceitadoras; Alternatively, one can also utilizer heavy and light chain sequences of different germline human antibody as acceptor sequences; quando tais combinações são utilizadas, alguém pode prontamente determinar se a VH e VL ligam um epitopo de interesse utilizando ensaios convencionais (por exemplo, uma ELISA). when such combinations are used, one can readily determine whether the VH and VL bind an epitope of interest using standard assays (e.g., an ELISA). Num exemplo, o anticorpo humano será escolhido no qual as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e leve, em conjunto, são globalmente mais homologas com as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e leve dadoras. In one example, the human antibody will be chosen in which the sequences of the variable regions of heavy and light chain together, are overall most homologous to the sequences of the variable regions of the heavy and light chain donor. Por vezes será dado peso superior à sequência da cadeia pesada. Sometimes it will be given greater weight to the heavy chain sequence. Independentemente de como a imunoglobulina aceitadora é escolhida, pode ser conseguida afinidade superior, nalguns casos, selecionando um pequeno número de aminoácidos na estrutura da cadeia de imunoglobulina humanizada para serem os mesmo que os aminoácidos nessas posições no dador em vez de no aceitador. Regardless of how the acceptor immunoglobulin is chosen, higher affinity may be achieved in some cases by selecting a small number of amino acids in the humanized immunoglobulin chain to be the same structure that the amino acids at those positions in the donor rather than in the acceptor. Métodos de maturação de afinidade são conhecidos na arte. affinity maturation methods are known in the art.

Anticorpos humanizados, em geral, têm pelo menos três vantagens potenciais sobre os anticorpos quiméricos ou de ratinho para utilização na terapêutica humana. Humanized antibodies generally have at least three potential advantages over mouse or chimeric antibodies for use in human therapy. Porque a porção efetora de um anticorpo é humana, pensa-se que interage melhor com as outras partes do sistema immune humano (por exemplo, destruir as células alvo mais eficientemente por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)). Because the effector portion of the antibody is human, it is believed that interact better with the other parts of the human immune system (e.g., destroy the target cells more efficiently by complement dependent cytotoxicity (CDC) and cellular cytotoxicity antibody dependent (ADCC )). Adicionalmente, o sistema immune humano não deveria reconhecer a estrutura ou região constante do anticorpo humanizado como estranho e, portanto, a resposta do anticorpo contra tal anticorpo injetado deveria ser menor do que contra um anticorpo de ratinho totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente estranho. Additionally, the human immune system should not recognize the framework or constant region of the humanized antibody as foreign and therefore the antibody response against such an injected antibody should be less than against a totally foreign mouse antibody or a chimeric antibody partially odd. Finalmente, anticorpos de ratinho são conhecidos por terem uma meia-vida na circulação humana que é muito mais curta do que a meia-vida dos anticorpos humanos. Finally, mouse antibodies are known to have a half-life in human circulation is much shorter than the half-life of human antibodies. Anticorpos humanizados podem, presumidamente, ter uma meia-vida mais semelhante aos anticorpos humanos que ocorrem naturalmente, permitindo a administração de doses mais pequenas e menos frequentes. Humanized antibodies can presumably be more similar to naturally occurring human antibody half-life, allowing administration of smaller and less frequent doses. A humanização dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos, pode ser conseguida através de uma variedade de métodos conhecidos na arte e descritos aqui. The humanization of antibodies and antigen-binding fragments thereof, can be accomplished by a variety of methods known in the art and described herein. Da mesma forma, a produção de anticorpos humanizados também pode ser conseguida através de métodos conhecidos na arte e descritos aqui. Likewise, the production of humanized antibodies can also be accomplished by methods known in the art and described herein. Métodos para modificações de regiões estrutura são conhecidos na arte e são contemplados aqui. Methods for structure regions modifications are known in the art and are contemplated herein. A seleção de uma ou mais posições de aminoácidos estrutura relevantes a serem alteradas depende de uma variedade de critérios. The selection of one or more amino acid positions relevant structure to be changed depends on a variety of criteria. Um critério para selecionar a alteração de aminoácidos estrutura relevantes podem ser as diferenças relativas nos resíduos estrutura dos aminoácidos entre as moléculas dadora e aceitadora. One criterion for selecting the relevant framework amino acid alteration may be the relative differences in the structure of amino acids residues between the donor and acceptor molecules. A seleção de posições de estrutura relevantes a alterar utilizando esta abordagem tem a vantagem de evitar qualquer viés subjetivo na determinação dos resíduos ou qualquer viés na contribuição da afinidade de ligação da CDR pelo resíduo. The selection of relevant positions to alter the structure using this approach has the advantage of avoiding any subjective bias in the determination of residues or any bias in the binding affinity contribution of the CDR residue.

Outro critério que pode ser utilizado para determinar as posições de aminoácidos relevantes a alterar podem ser, por exemplo, seleção de resíduos estrutura que são conhecidos por serem importantes ou por contribuírem para a conformação de CDR. Another criterion that can be used to determine the relevant amino acid positions to change can be, for example, selection structure residues that are known to be important or to contribute to CDR conformation. Por exemplo, resíduos de estrutura canónica são importantes para conformação e/ou estrutura de CDR. For example, canonical framework residues are important for conformation and / or CDR structure. A direção de um resíduo de estrutura canónica como uma posição relevante a alterar pode ser utilizada para identificar um resíduo de aminoácido mais compatível no contexto com a sua sequência CDR dadora associada. The direction of a canonical framework residue as a significant position change can be used to identify a most compatible amino acid residue in context with its associated donor CDR sequence. A frequência de um resíduo de aminoácido numa posição estrutura particular é outro critério que pode ser utilizado para selecionar posições de aminoácidos estrutura relevantes a alterar. The frequency of an amino acid residue at a particular framework position is another criterion that may be used to select relevant framework amino acid positions to be varied. Por exemplo, a comparação da estrutura selecionada com outras sequências estrutura dentro da sua subfamília pode revelar resíduos que ocorrem em frequências inferiores numa particular posição ou posições. For example, comparison of the selected framework with other framework sequences within its subfamily can reveal residues that occur at lower frequencies in a particular position or positions. As posições que albergam resíduos menos abundantes são, da mesma forma, aplicáveis para seleção como uma posição a alterar na estrutura da região variável aceitadora. The positions that are home to waste less abundant are likewise applicable to selection as a position change in the structure of the variable region acceptor.

As posições dos aminoácidos relevantes a alterar também podem ser selecionadas, por exemplo, com base na proximidade a uma CDR. The positions of the relevant amino acid change can also be selected, e.g., based on proximity to a CDR. Em determinados contextos, os resíduos FR podem participar na conformação e/ou ligação ao antígeno da CDR. In certain contexts, FR residues can participate in conformation and / or binding to antigen CDR. Além disso, este critério pode, da mesma forma, ser utilizado para dar prioridade posições relevantes selecionadas por outros critérios descritos aqui. Furthermore, this method may likewise be used to give priority relevant positions selected by other criteria described herein. Portanto, diferenciar entre resíduos próximos e distais de uma ou mais CDRs representa uma maneira de reduzir o número de posições relevantes a alterar. Therefore differentiate between close and distal residues of one or more CDRs is a way to reduce the number of relevant positions to change.

Outros critérios para selecionar posições de aminoácidos estrutura relevantes a alterar incluem, por exemplo, resíduos que são conhecidos por ou previstos residir num espaço tridimensional próximo da interface antígeno-CDR ou previstos modular a atividade de CDR. Other criteria for selecting relevant amino acid framework positions to alter include, for example, residues that are known or expected to reside in three-dimensional space near the antigen-CDR interface or predicted to modulate CDR activity. Da mesma forma, podem ser selecionados resíduos estrutura que são conhecidos por, ou previstos, formar contactos entre a interface da região variável da cadeia pesada (VH) e leve (VL). Similarly, framework residues can be selected which are known to, or expected, forming contacts between the variable region of the interface of the heavy chain (VH) and light (VL). Tais posições de estrutura podem afetar a conformação e/ou afinidade de uma CDR modulando o bolso de ligação a CDR, interação de antígeno (epítopo) ou a interação VH e VL. Such framework positions can affect the conformation and / or affinity of a CDR modulating the CDR binding pocket, interaction of antigen (epitope) or VH and VL interaction. Portanto, a seleção destas posições de aminoácidos para construir uma população diversa para classificar a atividade de ligação pode ser utilizada para identificar alterações de estrutura que substituem resíduos com efeitos prejudiciais na conformação da CDR ou compensam efeitos prejudiciais dos resíduos que ocorrem noutro local na estrutura. Therefore, the selection of these amino acid positions for constructing a diverse population to classify binding activity can be used to identify structural changes that replace residues which have adverse effects on the conformation of the CDRs or compensate adverse effects of residues which occur elsewhere in the structure.

Outros resíduos estrutura que podem ser selecionados para alteração incluem posições de aminoácidos que são inacessíveis ao solvente. Other framework residues that may be selected for modification include amino acid positions that are inaccessible to solvent. Tais resíduos estão, em geral, enterrados na região variável e são, portanto, capazes de influenciar a conformação da CDR ou das interações VH e VL interactions. These residues are generally buried in the variable region and are therefore able to influence the conformation of CDRs or VH and VL interactions interactions. A acessibilidade ao solvente pode ser prevista, por exemplo, a partir da hidrofobicidade relativa do ambiente criado pelas cadeias laterais dos aminoácidos do polipeptideo e/ou pelos dados estruturais tridimensionais conhecidos. The solvent accessibility may be provided, for example, from the relative hydrophobicity of the environment created by the side chains of the amino acids of the polypeptide and / or the three-dimensional structural data known.

Após seleção de posições de aminoácidos relevantes nas CDRs dadoras, bem como quaisquer posições de aminoácidos relevantes nas regiões estrutura desejadas a serem variadas, podem ser incorporadas alterações de aminoácidos em algumas ou em todas as posições selecionadas em ácidos nucleicos codificantes para a estrutura da região variável aceitadora e CDRs dadoras. After selection of relevant amino acid positions in the donor CDRs and any relevant amino acid positions in the framework regions desired to be varied, amino acid changes may be incorporated in some or all selected positions encoding nucleic acids to the structure of the variable region acceptor and donor CDRs. A estrutura ou sequências de CDR alteradas podem ser individualmente feitas e testadas ou podem ser sequencialmente ou simultâneamente combinadas e testadas. The framework or CDR sequences can be changed individually made and tested, or may be sequentially or simultaneously combined and tested. A variabilidade a qualquer ou todas as posições alteradas pode oscilar de um poucos a uma pluridade de resíduos de aminoácidos diferentes, incluindo todos os vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente ou equivalentes funcionais e análogos dos mesmos. The variability at any or all of the altered positions can range from a few pluridade a different amino acid residues, including all twenty naturally occurring amino acids or functional equivalents and analogues thereof. Nalguns casos, aminoácidos que não ocorrem naturalmente também podem ser considerados e são conhecidos na arte. In some cases, non-naturally occurring amino acids can also be considered and are known in the art. A seleção do número e localização das posições dos aminoácidos a variar é flexível e pode depender da utilização pretendida e eficiência desejada para identificação da região variável alterada com uma atividade desejável, tal como substancialmente a mesma afinidade de ligação ou superior comparada com a região variável dadora. The selection of the number and location of amino acid positions to vary is flexible and can depend on the intended use and desired efficiency for identification of the variable region altered with a desired activity, such as substantially the same binding affinity or greater compared with the variable region of the donor . A este respeito, quanto maior o número de alterações que são incorporadas numa população de regiões variáveis alteradas, mais eficiente é identificar pelo menos uma espécie que exibe uma atividade desejável, por exemplo, uma afinidade de ligação substancialmente a mesma ou superior à da dadora. In this regard, the greater the number of changes that are incorporated in a population of altered variable regions, the more efficient is to identify at least one species that exhibits a desired activity, e.g., binding affinity substantially the same or greater than that of the donor. Em alternativa, onde o utilizador tem dados empíricos ou reais relativos ao efeito que certos resíduos de aminoácidos ou posições contribuem desproporcionalmente para a afinidade de ligação, então pode ser desejável produzir uma população limitada de regiões variáveis alteradas que foca nas alterações dentro ou em redor desses resíduos ou posições identificados. Alternatively, where the user has empirical or actual data on the effect of certain amino acid residues or positions contribute disproportionately to the binding affinity, then it may be desirable to produce a limited population of altered variable regions which focuses on changes in or around these or residue positions identified.

Por exemplo, se regiões variáveis enxertadas de CDR são desejadas, uma população grande, diversa de regiões variáveis alteradas pode incluir todas as posições de região estrutura não idênticas entre a estrutura dadora e aceitadora e todas as alterações de posição dos aminoácidos CDR únicos. For example, if CDR grafted variable regions are desired a large, diverse population of altered variable regions may include all non-identical framework region positions between the donor and acceptor framework and all the position changes of only CDR amino acids. Em alternativa, uma população de diversidade intermerdiária pode incluir subconjuntos, por exemplo, de apenas as posições estrutura não idênticas próximas a serem incorporadas juntas com todas as alterações de posição dos aminoácidos CDR únicos para, por exemplo, aumentar a afinidade dos anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno. Alternatively, a population of intermerdiária diversity may include subsets, e.g., only non-identical structure close positions to be incorporated together with all of the CDR amino acid position changes only, for example, increase the affinity of the humanized antibodies or fragments antigen-binding. A diversidade das populações anteriores pode ainda ser aumentada incluindo, por exemplo, adicionalmente todas as alterações de posição dos aminoácidos CDR emparelhados. The diversity of the preceding populations can be further increased by including, for example, all the further position changes of the CDR amino acid paired. Em contraste, as populações que se focam em resíduos ou posições pré-determinados que incorporam resíduos variantes a tão poucos quanto uma estrutura e/ou uma posição de aminoácidos CDR podem, da mesma forma, serem construídas para classificar e identificar uma região variável de anticorpo alterada. In contrast, people who focus on residues or predetermined incorporating waste variants positions as few as a framework and / or CDR amino acid position can likewise be constructed to classify and identify an antibody variable region changed. Tal como com as populações anteriores, a diversidade de tais populações focadas pode ser ainda aumentada expandindo adicionalmente as posições selecionadas para alteração para incluir outras posições relevantes numa das ou em ambas as regiões estrutura e CDR. As with the above populations, the diversity of such focused populations can be increased still further by expanding the positions selected for alteration to include other relevant positions in one or in both regions and CDR structure. Existem numerosas outras combinações que oscilam de poucas alterações a muitas alterações numa das ou em ambas das regiões estrutura e CDRs que podem ser, adicionalmente, empregues, todas as quais resultarão numa população de regiões variáveis alteradas que podem ser classificadas para a identificação de pelo menos uma região variável alterada de CDR enxertada com atividade desejada, por exemplo, atividade de ligação a L0X/L0XL2. There are numerous other combinations ranging from a few changes to many changes in one or both of the regions structure and CDRs can be additionally employed, all of which result in a population of altered variable regions can be classified to identify at least a variable region altered CDR-grafted desired activity, for example binding activity L0X / L0XL2. Aqueles habilitados na arte saberão, ou podem determinar, que posições de resíduo selecionadas na estrutura ou CDRs dadoras, ou subconjuntos das mesmas, podem ser variadas para produzir uma população para classificação e identificação de um anticorpo da invenção alterado, dados os ensinamentos e orientação providenciados aqui. Those skilled in the art will know or can determine which residue positions selected in structure or donor CDRs, or subsets thereof, may be varied to produce a population for classification and identification of an antibody of altered invention, given the teachings and guidance provided on here. Os codões que codificam os aminoácidos são conhecidos na arte. The codons encoding amino acids are known in the art.

Anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno podem ser feitos utilizando técnicas convencionais conhecidas na arte. Humanized antibodies and antigen-binding fragments can be made using conventional techniques known in the art. Além disso, anticorpos preparados de forma recombinante podem ser produzidos, com frequência, em grandes quantidades, particularmente quando utilizando vetores de expressão de nível elevado. In addition, recombinantly prepared antibodies can be produced, often in large quantities, particularly when using vectors for high level expression.

Os anticorpos podem ser sequenciados utilizando técnicas convencionais conhecidas na arte e as sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) determinadas. The antibodies can be sequenced using standard techniques known in the art and amino acid sequences of complementarity determining regions (CDRs) determined. Num aspeto, as sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs é inserida numa sequência sintética de, por exemplo, uma estrutura de anticorpo humano (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) para criar um anticorpo humano que poderia limitar reações secundárias adversas de tratar um paciente humano com um anticorpo não humano. In one aspect, the amino acid sequences of one or more of the CDRs is inserted in a synthetic sequence, e.g., a human antibody structure (or binding fragment antigen thereof) to create a human antibody which could limit adverse side reactions treating a human patient with a non-human antibody. As sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs também podem ser inseridas numa sequência sintética de, por exemplo, numa proteína de ligaçao, tal como uma Avimer para criar uma construção para administração a uma paciente humano. The amino acid sequences of one or more of the CDRs may also be inserted in a synthetic sequence, e.g., a binding protein, such as a Avimer to create a construct for administration to a human patient. Tais técnicas podem ser modificadas dependendo da espécie de animal a ser tratado. Such techniques may be modified depending on the species of animal to be treated. Por exemplo, para utilizações veterinárias, um anticorpo, um fragmento de ligação ao antigeno ou proteína de ligação podem ser sintetizados para administração de um primata, uma vaca, um cavalo, etc. For example, for veterinary uses, an antibody, antigen binding fragment or binding protein can be synthesized for administration to a primate, a cow, a horse, etc.

Num outro aspeto, utilizando técnicas reconhecidas na arte, tais como aquelas providenciadas e incorporadas aqui, nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs podem ser inseridos, por exemplo, por técnicas recombinantes em locais de endonuclease de restrição de um polinucleotídeo existente que codifica um anticorpo, um fragmento de ligação ao antigeno ou proteína de ligação. In another aspect, using art recognized techniques, such as those provided and incorporated herein, nucleotides encoding amino acid sequences of one or more of the CDRs may be inserted, for example, by recombinant techniques from locations of an existing polynucleotide restriction endonuclease encoding an antibody, antigen binding fragment or binding protein.

Para produção de alto nível, o sistema de expressão de mamífero mais amplamente utilizado é um que utiliza o procedimento de amplificação génica oferecido pelas células de ovário de hamster Chinês deficientes em dihidrofolato redutase ("dhfr - ") . For high level production, the mammalian expression system is widely used which utilizes the gene amplification procedure offered by the ovary cells deficient Chinese hamster dihydrofolate reductase (& quot; dhfr - & quot;). 0 sistema é bem conhecido do artesão habilitado. 0 system is well known to the artisan enabled. 0 sistema é baseado no gene dihidrofolato redutase "dhfr", que codifica a enzima DHFR, que catalisa a conversão de dihidrofolato em tetrahidrofolato. 0 system is based on gene dihydrofolate reductase & quot; dhfr & quot ;, which encodes the DHFR enzyme, which catalyzes the conversion of dihydrofolate to tetrahydrofolate. Para atingir produção elevada, as células dhfr-CHO são transfetadas com um vetor de expressão que contém um gene dhfr funcional, juntamente com um gene que codifica uma proteína desejada. To achieve high production, dhfr- CHO cells are transfected with an expression vector containing a functional DHFR gene along with a gene encoding a desired protein. Neste caso, a proteína desejada é cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo recombinante. In this case, the desired protein is heavy and / or light chain of the recombinant antibody.

Aumentando a quantidade do inibidor competitivo DHFR metotrexato (MTX), as células recombinantes desenvolvem resistência amplificando o gene dhfr. Increasing the amount of the competitive DHFR inhibitor methotrexate (MTX), the recombinant cells develop resistance by amplifying the dhfr gene. Em casos convencionais, a unidade de amplificação empregue é muito maior do que o tamanho do gene dhfr e, como resultado, a cadeia pesada do anticorpo é co-amplifiçada. In standard cases, the amplification unit employed is much larger than the size of the dhfr gene, and as a result the antibody heavy chain is co-amplified.

Quando é desejada produção em grande escala da proteína, tal como a cadeia do anticorpo, ambos o nível de expressão e a estabilidade das células a serem empregues são tidos em consideração. When it is desired large scale production of the protein, such as antibody chain, both the expression level and stability of cells to be employed are taken into consideration. No cultivo a longo prazo, populações de células CHO recombinantes perdem a homogeneidade em relação à sua produtividade de anticorpo especifica durante a amplificação, mesmo apesar de derivarem de um único clone parental. In long term culture, recombinant CHO cell populations lose homogeneity with respect to their specific antibody productivity during amplification, even though derive from a single parental clone. 0 presente pedido providencia um polinucleotideo (ácido nucleico) isolado que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, conforme descrito aqui, vetores contendo tais polinucleotídeos e células hospedeiras e sistemas de expressão para transcrever e traduzir tais polinucleotídeos em polipeptídeos. 0 present application provides an isolated polynucleotide (nucleic acid) encoding an antibody or antigen binding fragment as disclosed herein, vectors comprising such polynucleotides and host cells and expression systems for transcribing and translating such polynucleotides into polypeptides. 0 presente pedido também providencia construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo, conforme anteriormente. 0 present application also provides constructs in the form of plasmids, vectors, transcription or expression cassettes which comprise least one polynucleotide as above. 0 presente pedido também providencia uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções, conforme anteriormente. 0 present application also provides a recombinant host cell which comprises one or more constructs as above. Um ácido nucleico que codifica qualquer anticorpo ou fragmentos de ligação ao antigeno do mesmo descritos aqui conforme providenciado, ele próprio forma um aspeto do presente pedido, tal como o forma um método de produção do anticorpo ou fragmentos de ligação ao antigeno do mesmo descritos aqui cujo método compreende expressão da codificação do ácido nucleico a partir dele. A nucleic acid encoding any antibody or binding fragments antigen thereof described herein as provided itself forms an aspect of the present application, such as form an antibody production method or binding fragments antigen thereof described herein which expression of the coding method comprises the nucleic acid from it. A expressão pode ser conseguida de forma conveniente cultivando em condições apropriadas células hospedeiras recombinantes que contêm o ácido nucleico. Expression may be achieved conveniently by culturing under appropriate conditions recombinant host cells containing the nucleic acid. Após produção pela expressão, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno pode ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada, depois utilizado conforme apropriado. Following production by expression, an antibody or antigen binding fragment may be isolated and / or purified using any suitable technique, then used as appropriate.

Anticorpos, fragmentos de ligação ao antigeno e moléculas de ácido nucleico codificantes e vetores específicos descritos aqui podem ser providenciados isolados e/ou purificados, por exemplo, a partir do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogénea ou, no caso do ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de origem de ácido nucleico ou genes além da sequência que codifica um polipeptideo com a função necessária. Antibodies, binding fragments antigen and encoding nucleic acid molecules and specific vectors described herein may be provided isolated and / or purified, eg from their natural environment, in substantially pure or homogeneous form, or, in the case of nucleic acid , free or substantially free of nucleic acid or genes origin additional to the sequence encoding a polypeptide with the required function. Ácido nucleico pode compreender ADN ou ARN e pode ser totalmente ou parcialmente sintético. The nucleic acid may comprise DNA or RNA and may be wholly or partially synthetic.

Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptideo numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Systems for cloning and expression of a polypeptide in a variety of different host cells are well known. Células hospedeiras adequadas incluem células de bactérias, mamíferos, sistemas de leveduras e baculovírus. Suitable host cells include bacteria cells, mammalian, yeast and baculovirus systems. Linhas celulares de mamíferos disponíveis na arte para expressão de um polipeptideo heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebé, células de melanoma de ratinho NSO e muitas outras. Mammalian cell lines available in the art for expression of a heterologous polypeptide include Chinese ovary hamster cells, HeLa cells, kidney cells, baby hamster, mouse NSO melanoma cells and many others. Um hospedeiro bacteriano comum é E. coli. A common bacterial host is E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo em células procariontes, tais como E. coli, está bem estabelecida na arte. The expression of antibodies and antibody fragments in prokaryotic cells such as E. coli is well established in the art. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pliickthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991) . For a review, see, for example, Pliickthun, A. Bio / Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucariontes em cultura também está disponível àqueles habilitados na arte como uma opção para produção dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritos aqui, ver para revisões recentes, por exemplo Raff, ME (1993) Curr. Expression in eukaryotic cells in culture is also available to those skilled in the art as an option for production of antibodies and antigen-binding fragments described herein, see for recent reviews, for example Raff, ME (1993) Curr. Opinion Biotech. Opinion Biotech. 4: 573-576; 4: 573-576; Trill JJ et al. Trill JJ et al. (1995) Curr. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560. Opinion Biotech 6: 553-560.

Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado. Suitable vectors can be chosen or constructed, containing appropriate regulatory sequences, including promoter sequences, terminator sequences, polyadenylation sequences, enhancer sequences, marker genes and other sequences as appropriate. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo 'fago ou faguemídeo, conforme apropriado. Vectors may be plasmids, viral eg 'phage, or faguemídeo as appropriate. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. For further details see, e.g., Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão génica e análise de proteínas, são descritos com detalhe em Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. Many known techniques and protocols for manipulation of nucleic acid, for example in preparation of nucleic acid constructs, mutagenesis, sequencing, introduction of DNA into cells and gene expression, and analysis of proteins, are described in detail in Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. editores, John Wiley & editors, John Wiley & amp; Sons, 1992. Sons, 1992.

Assim, um aspeto adicional providencia uma célula hospedeira contendo ácido nucleico conforme revelado aqui. Thus, a further aspect provides a host cell containing nucleic acid as disclosed herein. Ainda um outro aspeto adicional providencia um método que compreende introduzir tal ácido nucleico numa célula hospedeira. A still further aspect provides a method comprising introducing such nucleic acid into a host cell. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. The introduction may employ any available technique. Para células eucariontes, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfeção com fosfato de cálcio, DEAE Dextrano, eletroporação, biolística, transfeção mediada por lipossoma e transdução utilizando retrovirus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de insetos, baculovirus. For eukaryotic cells, suitable techniques may include, for example, transfection with calcium phosphate, DEAE dextran, electroporation, biolistics, transfection mediated by liposome and transduction using retrovirus or other virus, eg vaccinia or, for insect cells, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfeção utilizando bacteriofago. For bacterial cells, suitable techniques may include, for example, calcium chloride transformation, electroporation and transfection using bacteriophage. A introdução pode ser seguida causando ou permitindo a expressão a partir do ácido nucleico, por exemplo, cultivando células hospedeiras em condições para expressão do gene. The introduction may be followed by causing or allowing expression from the nucleic acid, eg by culturing host cells under conditions for expression of the gene.

Numa modalidade, o ácido nucleico é integrado no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. In one embodiment, the nucleic acid is integrated into the genome (e.g. chromosome) of the host cell. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com as técnicas padrão. Integration may be promoted by inclusion of sequences which promote recombination with the genome, in accordance with standard techniques. 0 presente pedido também providencia um método que compreende utilizar uma construção, conforme indicado anteriormente, num sistema de expressão para expressar os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, conforme anteriormente. 0 present application also provides a method that comprises using a construct as stated above in an expression system to express the antibodies or antigen binding fragments thereof, as above. 0 presente pedido também se relaciona com ácidos nucleicos isolados, tais como moléculas de ADN recombinantes ou genes clonados, ou variantes degeneradas dos mesmos, mutantes, análogos ou fragmentos dos mesmos, que codificam um anticorpo ou sequência de ligação ao antigeno que se liga a LOX ou L0XL2 descritos aqui. 0 This application also relates to isolated nucleic acids, such as recombinant DNA molecules or cloned genes, or degenerate variants thereof, mutants, analogs or fragments thereof, encoding an antibody or antigen binding sequence which binds LOX L0XL2 or described herein.

Num aspeto, o presente pedido providencia um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo que se liga a LOX ou L0XL2, conforme descrito aqui. In one aspect, the present application provides a nucleic acid encoding an antibody or antigen binding fragment thereof that binds LOX or L0XL2 as described herein.

Numa modalidade adicional, a sequência de ADN inteira da molécula de ADN recombinante ou gene clonado de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno descritos aqui pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de controlo da expressão que pode ser introduzida num hospedeiro apropriado. In a further embodiment, the entire DNA sequence of the recombinant DNA molecule or cloned gene of an antibody or antigen binding fragment described herein may be operably linked to an expression control sequence which may be introduced into an appropriate host. 0 pedido estende-se, em conformidade, a hospedeiros unicelulares transformados com o gene clonado ou molécula de ADN recombinante que compreende uma sequência de ADN que codifica VH e/ou VL, ou porções das mesmas, do anticorpo. 0 request extends, accordingly, to unicellular hosts transformed with the cloned gene or recombinant DNA molecule comprising a DNA sequence encoding the VH and / or VL, or portions thereof, of the antibody.

Outra caracteristica é a expressão das sequências de ADN reveladas aqui. Another feature is the expression of the DNA sequences disclosed herein. Como é bem conhecido na arte, as sequências de ADN podem ser expressas ligando-as operacionalmente a uma sequência de controlo da expressão num vetor de expressão apropriado e empregando aquele vetor de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado. As is well known in the art, DNA sequences may be expressed by operatively linking them to an expression control sequence in an appropriate expression vector and employing that expression vector to transform an appropriate unicellular host.

Tal ligação operacional de uma sequência de ADN a uma sequência de controlo da expressão, obviamente, inclui, se não for já parte da sequência de ADN, a provisão de um codão de iniciação, ATG, no quadro de leitura correto a montante da sequência de ADN. This operably linking a DNA sequence to a control sequence expression, of course, includes, if not already part of the DNA sequence, the provision of an initiation codon, ATG, in the correct reading frame upstream the sequence DNA.

Podem ser providenciados polinucleotideos e vetores numa forma isolada e/ou a purificada (por exemplo, livre ou substancialmente livre de polinucleotideos de origem que não o polinucleotídeo que codifica um polipeptideo com a função necessária). polynucleotides and vectors may be provided in isolated and / or purified form (ie, free or substantially free of polynucleotides source other than the polynucleotide encodes a polypeptide with the required function). Conforme utilizado aqui, "substancialmente puro" As used herein, & quot; substantially pure & quot; e "substancialmente livre," and & quot; substantially free, & quot; referem-se a uma solução ou suspensão que contém menos de, por exemplo, 20% ou menos de material extrínseco, 10% ou menos de material extrínseco, 5% ou menos de material extrínseco, 4% ou menos de material extrínseco, 3% ou menos de material extrínseco, 2% ou menos de material extrínseco ou 1% ou menos de material extrínseco. refers to a solution or suspension that contains less than for example 20% or less extraneous material, 10% or less extraneous material, 5% or less extraneous material, 4% or less extraneous material, 3% extrinsic material or less, 2% or less extraneous material, or 1% or less extraneous material.

Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregue na expressão de sequências de ADN desta invenção. A wide variety of combinations of host / expression vector may be employed in expressing the DNA sequences of this invention. Vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir de segmentos de sequências de ADN cromossómicas, não cromossómicas e sintéticas- Vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli col El, Perl, Pbr322, Pmb9 e seus derivados, plasmídeos tais como RP4; Useful expression vectors, for example, may consist of segments of chromosomal DNA sequences, non-chromosomal and sintéticas- Suitable vectors include derivatives of SV40 and known bacterial plasmids, e.g., plasmids col El E. coli, Perl, pBR322, pMB9 and their derivatives, plasmids such as RP4; ADNs de fago, por exemplo, os numerosos derivados de fago λ, por exemplo, NM989 e outros ADN de fago, por exemplo, M13 e ADN de fago de cadeia simples filamentosa; Phage DNAs, e.g., the numerous derivatives of phage λ, e.g., NM989, and other phage DNA, e.g., M13 phage DNA and filamentous single-stranded; plasmídeos de levedura, tais como o plasmídeo 2u ou derivados do mesmo; yeast plasmids such as the 2u plasmid or derivatives thereof; vetores úteis em células eucariontes, tais como vetores úteis em células de insetos ou mamíferos; vectors useful in eukaryotic cells such as vectors useful in insect or mammalian cells; vetores derivados de combinações de plasmídeos e ADNs de fago, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar ADN de fago ou outras sequências de controlo da expressão; vectors derived from combinations of plasmids and phage DNAs, such as plasmids that have been modified to employ phage DNA or other expression control sequences; e afins. and others.

Também é providenciada aqui uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções de polinucleotídeo. Also provided herein is a recombinant host cell which comprises one or more polynucleotide constructs. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, conforme providenciado aqui, forma um aspeto do presente pedido, tal como o forma um método de produção do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antigeno cujo método compreende expressão a partir do polinucleotídeo. A polynucleotide encoding an antibody or binding fragment of the antigen as provided herein forms an aspect of the present application, such as form an antibody production method or antigen binding fragment thereof which method comprises expression from the polynucleotide. A expressão pode ser atingida, por exemplo, cultivando em condições apropriadas células hospedeiras recombinantes que contêm o polinucleotideo. Expression may be achieved, for example, by culturing under appropriate conditions recombinant host cells containing the polynucleotide. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno pode depois ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada e utilizado conforme apropriado. An antibody or antigen-binding fragment can then be isolated and / or purified using any suitable technique and used as appropriate.

Qualquer uma de uma ampla variedade de sequências de controlo de expressão - sequências que controlam a expressão de uma sequência de ADN ligada operacionalmente a ela - pode ser utilizada nestes vetores para expressar as sequências de ADN. Any of a wide variety of expression control sequences - sequences that control the expression of a DNA sequence operatively linked to it - may be used in these vectors to express the DNA sequences. Tais sequências de controlo de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores iniciais ou tardios de SV40, CMV, vaccinia, polioma ou adenovirus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, as regiões operadora principal e promotora do fago λ, as regiões controlo da proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores da fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores de cruzamento de leveduras e outras sequências conhecidas por controlarem a expressão de genes de células procariontes ou eucariontes ou o seus vírus e várias combinações dos mesmos. Such useful expression control sequences include, for example, the early or late promoters of SV40, CMV, vaccinia, polyoma or adenovirus, the lac system, the trp system, the TAC system, the TRC system, the LTR system, the regions major operator and promoter of λ phage, the control regions of fd coat protein, the promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, the promoters of acid phosphatase (e.g., Pho5), the promoters of the yeast mating factors, and other sequences known to control the expression of genes of prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses, and various combinations thereof.

Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Systems for cloning and expression of a polypeptide in a variety of different host cells are well known. Células hospedeiras adequadas incluem células de bactérias, mamíferos, sistemas de leveduras e baculovírus. Suitable host cells include bacteria cells, mammalian, yeast and baculovirus systems. Linhas celulares de mamíferos disponíveis na arte para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé, células de melanoma de ratinho NSO e muitas outras. Mammalian cell lines available in the art for expression of a heterologous polypeptide include Chinese ovary hamster cell (CHO) cells, HeLa cells, kidney cells, baby hamster, mouse NSO melanoma cells and many others. Um hospedeiro bacteriano comum pode ser, por exemplo, E. coli. A common bacterial host may be, for example, E. coli.

A expressão de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigeno em células procariontes, tais como E. coli, está bem estabelecida na arte. The expression of antibodies or antigen binding fragments in prokaryotic cells such as E. coli is well established in the art. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991) . For a review, see, eg, Pluckthun, A. Bio / Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucariontes em cultivo também está disponível àqueles habilitados na arte (Raff, ME (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill JJ et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560) . Expression in eukaryotic cells in culture is also available to those skilled in the art (Raff, ME (1993) Curr Opinion Biotech. 4:.. 573-576; Trill JJ et al (1995) Curr Opinion Biotech 6: 553-560.) .

Uma ampla variedade de células hospedeiras unicelulares também são úteis na expressão de sequências de ADN. A wide variety of unicellular host cells are also useful in expressing the DNA sequences. Estes hospedeiros incluem hospedeiros eucariontes e procariontes bem conhecidos, tais como estirpes de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos, tais como leveduras e células animais, tais como células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.l, BW e LM, células do rim do macaco verde Africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9) e células humanas e células de plantas em cultura de tecido. These hosts include prokaryotic and eukaryotic hosts are well known, such as strains of E.coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi such as yeasts, and animal cells such as CHO, YB / 20, NSO, SP2 / 0, Rl. l, BW and LM cells of the African green monkey kidney (e.g., COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, and BMT10), insect cells (e.g., Sf9), and human cells and plant cells in tissue culture .

Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros funcionarão igualmente bem para expresser as sequências de ADN. It will be understood that not all vectors, expression control sequences and hosts will function equally well to the DNA sequences expresser. Nem todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Not all hosts function equally well with the same expression system. Contudo, alguém habilitado na arte será capaz de selecionar os vetores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros apropriados sem experimentação indevida para conseguir a expressão desejada sem partir do âmbito deste pedido. However, one skilled in the art will be able to select vectors, expression control sequences and hosts without undue experimentation appropriate to achieve the desired expression without departing from the scope of this application. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro tem de ser considerado, porque o vetor tem de funcionar nele. For example, when selecting a vector, the host must be considered because the vector must function in it. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores antibióticos, também serão considerados. The number of vector copies, the ability to control that copy number and the expression of any other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, will also be considered. Alguém de habilitação comum na arte pode selecionar os vetores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros apropriados para cnseguir a expressão desejada sem partir do âmbito deste pedido. One of ordinary skill in the art can select vectors, expression control sequences and hosts for appropriate cnseguir the desired expression without departing from the scope of this application. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro é considerado, porque o vetor funciona nele. For example, when selecting a vector, the host is considered because the vector running it. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores antibióticos, também podem ser considerados. The number of vector copies, the ability to control that copy number and the expression of any other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, may also be considered. 0 presente pedido também providencia construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão, conforme descritas noutro local aqui, que compreendem pelo menos um polinucleotídeo, conforme anteriormente. 0 present application also provides constructs in the form of plasmids, vectors, transcription or expression cassettes as described elsewhere herein, comprising at least one polynucleotide as above. Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, marcadores selecionáveis e outras sequências conforme apropriado. Suitable vectors can be chosen or constructed, containing appropriate regulatory sequences, including promoter sequences, terminator sequences, polyadenylation sequences, enhancer sequences, selectable markers and other sequences as appropriate. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago, faguemídeo, etc., conforme apropriado. Vectors can be plasmid, viral, e.g., phage, faguemídeo, etc., as appropriate. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. For further details see, e.g., Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão génica e análise de proteínas, são descritos com detalhe em Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. Many known techniques and protocols for manipulation of nucleic acid, for example in preparation of nucleic acid constructs, mutagenesis, sequencing, introduction of DNA into cells and gene expression, and analysis of proteins, are described in detail in Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & eds, John Wiley & amp.; Sons, 1992. Sons, 1992.

Ao selecionar uma sequência de controlo de expressão, uma variedade de fatores serão normalmente considerados. When selecting an expression control sequence, a variety of factors will normally be considered. Estes incluem, por exemplo, a força relativa do sistema, a sua controlabilidade e sua compatibilidade com a sequência de ADN particular ou gene a ser expresso, particularmente no que respeita a potenciais estruturas secundárias. These include, for example, the relative strength of the system, its controllability, and its compatibility with the particular DNA sequence or gene to be expressed, particularly as regards potential secondary structures. Hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados por consideração de, por exemplo, sua compatibilidade com o vetor escolhido, as suas características de secreção, a sua capacidade de dobrar proteínas corretamente e os seus requisitos de fermentação, bem como a toxicidade ao hospedeiro do produto codificado pelas sequências de ADN a serem expressas e a facilidade de purificação dos produtos de expressão. Suitable unicellular hosts will be selected by consideration of, e.g., their compatibility with the chosen vector, their secretion characteristics, their ability to fold proteins correctly, and their fermentation requirements, as well as the toxicity to the host of the product encoded by the sequences DNA to be expressed, and the ease of purification of the expression products.

Um aspeto adicional providencia uma célula hospedeira que contém um ou mais polinucleotideos conforme revelado aqui. A further aspect provides a host cell containing one or more polynucleotides as disclosed herein. Um outro aspeto adicional providencia um método de introduzir tal um ou mais polinucleotídeos numa célula hospedeira, qualquer técnica disponível. A still further aspect provides a method of introducing such one or more polynucleotides into a host cell, any available technique. Para células eucariontes, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfeção com fosfato de cálcio, DEAE Dextrano, eletroporação, transfeção mediada por lipossoma e transdução utilizando retrovirus ou outros vírus (por exemplo vaccinia) ou, para células de insetos, baculovírus. For eukaryotic cells, suitable techniques may include, for example, calcium phosphate transfection, DEAE-Dextran, electroporation, liposome-mediated transfection and transduction using retrovirus or other virus (eg vaccinia) or, for insect cells, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfeção utilizando bacteriofagos. For bacterial cells, suitable techniques may include, for example, calcium chloride transformation, electroporation and transfection using bacteriophage. A introdução pode ser seguida causando ou permitindo a expressão de um ou mais polinucleotídeos, por exemplo, cultivando células hospedeiras em condições para expressão de um ou mais polipeptideos de um ou mais polinucleotídeos. The introduction may be followed by causing or allowing expression of one or more polynucleotides, e.g., by culturing host cells under conditions for expression of one or more polypeptides of one or more polynucleotides. Sistemas indutíveis podem ser utilizados e a expressão induzida pela adição de um ativador. Inducible systems may be used, and expression induced by addition of an activator.

Numa modalidade, os polinucleotídeos podem ser integrados no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. In one embodiment, the polynucleotides can be integrated into the genome (e.g. chromosome) of the host cell. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. Integration may be promoted by inclusion of sequences which promote recombination with the genome, in accordance with standard techniques. Noutra modalidade, o ácido nucleico é mantido num vetor epissomal na célula hospedeira. In another embodiment, the nucleic acid is maintained on an episomal vector in the host cell. São providenciados métodos aqui que incluem utilizar uma construção, conforme indicado anteriormente, num sistema de expressão para expressar um polipeptideo específico. Methods are provided herein that include using a construct as stated above in an expression system to express a specific polypeptide.

Considerando estes e outros fatores, alguém habilitado na arte será capaz de construer uma variedade de combinações de vetor/sequência de controlo de expressão/hospedeiro que expressarão as sequências de ADN em fermentação ou em culturas animais em grande escala. Considering these and other factors, one skilled in the art will be able to construer a variety of combinations of vector / expression control sequence / host which will express the DNA sequences on fermentation or in animals on a large scale cultures.

Um polinucleotideo que codifica um anticorpo, fragmento de ligação ao antigeno ou uma proteína de ligação podem ser preparados de forma recombinante/sinteticamente além de, ou em vez de, clonados. A polynucleotide encoding an antibody, antigen binding fragment or binding protein can be prepared recombinantly / synthetically addition to or rather than cloned. 0 polinucleotideo pode ser desenhado com os codões apropriados para o anticorpo, fragmento de ligação ao antigeno ou uma proteína de ligação. 0 polynucleotide can be designed with the appropriate codons for the antibody, antigen binding fragment or binding protein. Em geral, alguém selecionará codões preferidos por um hospedeiro pretendido se a sequência for utilizada para expressão. In general, one will select preferred codons for the intended host if the sequence will be used for expression. 0 polinucleotideo completo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sobrepostos preparados por métodos padrão e montados numa sequência codificante completa. 0 complete polynucleotide can be assembled from overlapping oligonucleotides prepared by standard methods and assembled into a complete coding sequence. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); See, for example, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al. Nambair et al. , Science, 223:1299 (1984); , Science, 223: 1299 (1984); Jay et al. Jay et al. , J. Biol. J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). Chem., 259: 6311 (1984).

Um método geral para incorporação específica do local em aminoácidos não naturais em proteínas é descrito em Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (abril de 1989) . A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins is described in Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244: 182-188 (April 1989 ). Este método pode ser utilizado para criar análogos com aminoácidos não naturais. This method can be used to create analogs with unnatural amino acids.

Conforme mencionado anteriormente, uma sequência de ADN que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo pode ser preparada sinteticamente em vez de ser clonada. As mentioned above, a DNA sequence encoding an antibody or antigen binding fragment thereof can be prepared synthetically rather than cloned. A sequência de ADN pode ser desenhada com os codões apropriados para a sequência de aminoácidos do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno. The DNA sequence can be designed with the appropriate codons for the amino acid sequence of the antibody or antigen binding fragment thereof. Em geral, alguém selecionará codões preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência for utilizada para expressão. In general, one will select preferred codons for the intended host if the sequence will be used for expression. A sequência completa é montada a partir de oligonucleotídeos sobrepostos por métodos convencionais e montada numa sequência codificante completa. The complete sequence is assembled from overlapping oligonucleotides by standard methods and assembled into a complete coding sequence. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); See, for example, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al. Nambair et al. , Science, 223:1299 (1984); , Science, 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984). Chem., 259: 6311 (1984). 0 termo "adjuvante" 0 term & quot; adjuvant & quot; refere-se a um composto ou mistura que potência a resposta imune, particularmente a um antigeno. It refers to a compound or mixture that enhances the immune response, particularly an antigen. Um adjuvante pode servir como um depósito de tecido que liberta lentamente o antigeno e também como um ativador do sistema linfóide que potência de forma não especifica a resposta imune (Hood et al., Immunology, Segunda Edição, 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, página 384) . An adjuvant can serve as a tissue depot that slowly releases the antigen and also as an activator of the lymphoid system power in a non-specific immune response (Hood et al, Immunology, Second Edition, 1984, Benjamin / Cummings:. Menlo Park , California, page 384). Com frequência, um desafio primário com apenas um antigeno, na ausência de um adjuvante, falhará em despoletar uma resposta imune humoral ou celular. Often, a primary challenge with an antigen alone, in the absence of an adjuvant, will fail to elicit a humoral or cellular immune response. Adjuvantes previamente conhecidos e utilizados incluem, mas não se limitam a, adjuvante completo de Freund (CFA), adjuvante incompleto de Freund (IFA), saponina, géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas ou de hidrocarbono, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol e adjuvante humano potencialmente útil, tal como BCG (Bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Adjuvants previously known and used include, but are not limited to, complete Freund's adjuvant (CFA), incomplete Freund's adjuvant (IFA), saponin, mineral gels such as aluminum hydroxide, active surface substances such as lysolecithin, polyols pluronic, polyanions, peptides, oil or hydrocarbon emulsions, limpet hemocyanins of California, dinitrophenol, and potentially useful human adjuvant such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum. Adjuvantes de sais minerais incluem, mas não se limitam a: hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de cálcio, hidróxido de zinco e hidróxido de cálcio. Mineral adjuvants include, but are not limited to: aluminum hydroxide, aluminum phosphate, calcium phosphate, zinc hydroxide and calcium hydroxide. Preferencialmente, uma composição adjuvante ainda compreende um lípido de emulsão gorda que compreende cerca de 10% (por peso) óleo vegetal e cerca de 1-2% (por peso) fosfolípidos. Preferably, an adjuvant composition further comprises a lipid emulsion fat comprising about 10% (by weight) of vegetable oil and about 1-2% (by weight) phospholipids. Preferencialmente, uma composição adjuvante compreende ainda opcionalmente uma forma de emulsão com partículas oleosas dispersas numa fase aquosa continua com uma emulsão a formar poliól numa quantidade de cerca de 0,2% (por peso) a cerca de 49% (por peso), opcionalmente um óleo metabolizável numa quantidade formadora de emulsão de até 15% (por peso) e opcionalmente um tensoativo baseado em éter glicol numa quantidade estabilizadora de emulsão até cerca de 5% (por peso). Preferably, an adjuvant composition further comprises optionally an emulsion form with oily particles dispersed in a continuous aqueous phase emulsion form with a polyol in an amount of about 0.2% (by weight) to about 49% (by weight), optionally one metabolizable oil in an emulsion-forming amount of up to 15% (by weight), and optionally a glycol ether-based surfactant in an emulsion stabilizing amount up to about 5% (by weight).

Anticorpos também podem ser amadurecidos para afinidade utilizando métodos de seleção e/ou mutagénese conhecidos, conforme descrito anteriormente. Antibodies may also be affinity matured using methods for selection and / or mutagenesis known as described above. Os anticorpos amadurecidos por afinidade podem ter uma afinidade que é duas vezes, cinco vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes ou mais superior ao anticorpo de partida (em geral, murino, coelho, galinha, humanizado ou humano) a partir do qual o anticorpo amadurecido é preparado. The affinity matured antibody may have an affinity which is twice, five times, 10 times, 20 times, 30 times or more higher than the starting antibody (generally murine, rabbit, chicken, humanized or human) from which the matured antibody is prepared. Afinidades aparentes podem ser determinadas por métodos, tais como um ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA) ou qualquer outra técnica familiar a alguém habilitado na arte. Apparent affinities can be determined by methods such as enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or any other technique familiar to one skilled in the art. As avidezes podem ser determinadas por métodos, tais como uma análise Scatchard ou qualquer outra técnica familiar a alguém habilitado na arte. The avidities can be determined by methods such as Scatchard analysis or any other technique familiar to one skilled in the art. Outra técnica para medir a afinidade aparente de ligação familiar a alguém habilitado na arte é uma técnica de ressonância de plasma de superfície (analisado num sistema BIACORE 2000) (Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329) . Another technique for measuring the apparent binding affinity familiar to one skilled in the art is a surface plasmon resonance technique (analyzed on a BIACORE 2000 system) (Liljeblad, et al Glyco J. 2000, 17:.. 323-329) . Medições padrão e ensaios de ligação tradicional são descritos por Heeley, RP, Endocr. Standard measurements and traditional binding assays are described by Heeley, RP, Endocr. Res. 2002, 28:217-229. 2002 Res., 28: 217-229.

Ainda noutra modalidade, um anticorpo liga-se especificamente e seletivamente a LOXL2 com uma afinidade de ligação superior (por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 1000 vezes superior) do que a afinidade de ligação a pelo menos um de: LOX humana, a LOX humana ativa ou madura, a forma segregada de LOX ou outras proteínas tipo lisil oxidase (LOL) ou relacionadas com lisil oxidase (por exemplo, LOXL1, LOXL3 e LOXL4) em produtos não processados, maduros, ativos e/ou segregados. In yet another embodiment, an antibody binds specifically and selectively LOXL2 with a higher binding affinity (e.g., at least about 5-fold, at least about 10 fold, at least about 50 fold, at least about 100 fold, at least about 500 fold, or at least about 1000 times higher) than the binding affinity to at least one of: human LOX, the active or mature human LOX, the secreted form of LOX or other type lysyl oxidase proteins (LOL) or lysyl oxidase-related (e.g., LOXL1, and LOXL3 LOXL4) in unprocessed products, mature, active and / or secreted. Numa modalidade, o anticorpo liga-se especificamente e seletivamente a LOXL2 em formas não processadas e/ou processadas (maduras). In one embodiment, the antibody binds specifically and selectively LOXL2 in unprocessed forms and / or processed (mature). A forma madura de LOXL2 está tipicamente ativa apesar de, nalgumas modalidades, LOXL2 não processada também estar ativa. The mature form of LOXL2 is typically active although, in some embodiments, also be processed LOXL2 not active.

Um anticorpo pode-se ligar a ambas LOX humana ou L0XL2 humana, com uma afinidade de ligação superior (por exemplo, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 1000 vezes superior) do que a afinidade de ligação a pelo menos uma de: outras proteínas tipo lisil oxidase ou relacionadas com lisil oxidase (por exemplo, LOXL1, LOXL3 e LOXL4). An antibody may bind to both human LOX or human L0XL2 with a higher binding affinity (e.g., at least about 5-fold, at least about 10 fold, at least about 50 fold, at least about 100 fold, at least about 500 fold, or at least about 1000 times higher) than the binding affinity to at least one of: other proteins lysyl oxidase type or related lysyl oxidase (e.g., LOXL1, LOXL3 and LOXL4).

Anticorpos que se ligam a enzimas podem ser inibidores competitivos, inibidores acompetitivos ou inibidores não competitivos. Antibodies that bind to enzymes may be competitive inhibitors, inhibitors acompetitivos or noncompetitive inhibitors. Em relação à inibição competitiva, um inibidor normalmente carrega semelhança estrutural com o substrato. With respect to competitive inhibition, an inhibitor usually bears structural similarity to the substrate. A inibição será evidente a baixas concentrações do substrato, mas pode ser ultrapassada a concentrações do substrato elevadas. Inhibition will be evident at low substrate concentrations, but can be overcome by the higher substrate concentrations. Em relação à inibição acompetitiva, um inibidor liga-se no local que se torna disponível após o sustrato ser ligado no local ativo. Regarding acompetitiva inhibition, an inhibitor binds at the site which becomes available after the substrate is bound in the active site. A inibição será mais evidente a concentrações do substrato elevadas. Inhibition will be more apparent from the higher substrate concentrations. Em relação à inibição não competitiva, um inibidor liga-se num local longe do local de ligação do substrato. Regarding the non-competitive inhibition, an inhibitor binds at a site away from the substrate binding site. A inibição relativa será, em geral, a mesma para todas as concentrações do substrato. The relative inhibition will generally be the same for all concentrations of the substrate. O mecanismo de ação anticorpos que atuam como inibidores competitivos, inibidores acompetitivos e inibidores não competitivos é ilustrado na Figura 4. Anticorpos descritos aqui podem ser inibidores competitivos, inibidores acompetitivos ou inibidores não competitivos. The mechanism of action antibodies that act as competitive inhibitors, inhibitors acompetitivos and non-competitive inhibitors is illustrated in Figure 4. Antibodies described herein may be competitive inhibitors, inhibitors acompetitivos or noncompetitive inhibitors. Num aspeto, anticorpos descritos aqui podem ser inibidores não competitivos. In one aspect, antibodies described herein can be noncompetitive inhibitors.

Anticorpos descritos aqui são inibidores não competitivos; Antibodies described herein are noncompetitive inhibitors; ou seja, os anticorpos bloqueiam a atividade enzimática de LOXL2 independentemente de se as enzimas estão ou não ligadas ao substrato (colagénio). that is, the antibodies block the enzymatic activity of LOXL2 regardless of whether or not the enzymes are attached to the substrate (collagen). A ligação de um anticorpo a L0XL2 pode (1) reduzir ou inibir a captação ou internalização de L0XL2 (por exemplo, através da integrina beta 1 ou outros recetores celulares ou proteínas) e/ou (2) reduzir ou inibir a atividade enzimática de L0XL2. The binding of an antibody to L0XL2 can (1) reduce or inhibit uptake or internalization L0XL2 (e.g., via the integrin beta 1 or other cellular receptors or proteins) and / or (2) reducing or inhibiting the enzymatic activity L0XL2 . Pensa-se que tal anticorpo poderia reduzir EMT e é, assim, útil para as aplicações reveladas aqui. It is believed that such an antibody could reduce EMT and is thus useful for the applications disclosed herein. Um anticorpo descrito aqui pode ligar-se ao local de clivagem proteolítica de L0XL2, bloqueando, assim, eficazmente (inibindo) o processamento da L0XL2 para reduzir o nível de LOX ou L0XL2 ativo. An antibody described herein can bind the proteolytic cleavage site of L0XL2, thereby blocking effectively (inhibiting) L0XL2 processing to reduce the level of active LOX or L0XL2. Tal inibição pode ocorrer através de ligação direta a L0XL2 ou através de interferência indireta incluindo impedimento estérico, alteração enzimática de L0XL2, inibição da transcrição ou tradução, destabilização de transcritos de ARNm, exportação debilitada, processamento ou localização de L0XL2 e afins. Such inhibition may occur through direct binding or through indirect L0XL2 interference including steric hindrance, enzymatic alteration of L0XL2, inhibition of transcription or translation, destabilization of mRNA transcripts, impaired export processing or localization of L0XL2 and the like. A ligação de L0XL2 com outras proteínas, tais como recetores celulares (por exemplo, recetor de captação integrina beta 1), BTK (tirosina quinase agamaglobulinémia de Burton) ou outras integrinas também é realizada utilizando o ensaio previamente mencionado, em que em vez de proteínas ECM, são utilizados recetores celulares (por exemplo recetor de captação integrina beta 1) , BTK (tirosina quinase agamaglobulinémia de Burton) ou outras integrinas. The binding L0XL2 with other proteins such as cell receptor (e.g., uptake receptor integrin beta 1), BTK (tyrosine kinase agammaglobulinemia Burton) or other integrins is also performed using the previously mentioned test, in which instead of proteins ECM are used cellular receptor (e.g. integrin receptor beta pickup 1), BTK (Burton agammaglobulinemia tyrosine kinase) or other integrins.

Aqueles anticorpos anti-L0XL2 que inibem a ligação de L0XL2 a proteínas ECM, recetores celulares e integrinas, são selecionados como candidatos para desenvolvimento posterior. L0XL2 Those anti-antibodies which inhibit the binding of L0XL2 ECM proteins, cellular receptors and integrins, are selected as candidates for further development. Numa modalidade, os anticorpos anti-L0XL2 que inibem a ligação de L0XL2 a proteínas ECM, recetores celulares e integrinas são inibidores não competitivos. In one embodiment, the anti-L0XL2 antibodies that inhibit the binding of L0XL2 ECM proteins, cellular receptors and integrins are noncompetitive inhibitors.

Numa modalidade, um anticorpo descrito aqui liga-se especificamente ao domínio catalítico de LOX. In one embodiment, an antibody described herein binds specifically to the catalytic domain of LOX. Este domínio, na região C-terminal, contém os elementos necessários para atividade catalítica (o local de ligação ao cobre, resíduos tirosil e lisil que contribuem para o co-fator carbonilo e 10 resíduos de cisteína. Ver, Thomassin et al. "The Pro-regions of lysyl oxidase and lysyl oxidase-like 1 are required for deposition onto elastic fibers," J Biol. Chem. 2005 Dec 30; 280(52) :42848-55 para mais detalhes. This domain, the C-terminal region contains the elements necessary for catalytic activity (the binding site to copper, tyrosyl and lysyl residues that contribute to the carbonyl cofactor, and 10 cysteine ​​residues See, Thomassin et al. & Quot.; The pro-regions of lysyl oxidase and lysyl oxidase-like 1 are required for deposition onto elastic fibers, & quot; J Biol Chem 2005 Dec 30; 280 (52):.. 42848-55 for details.

Os anticorpos podem ligar ambas LOXL2 de comprimento inteiro e/ou processada. Antibodies can bind both LOXL2 entire length and / or processed. São providenciados aqui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a LOXL2, conforme definido nas reivindicações. here they are provided antigen binding antibodies or fragments thereof that bind to LOXL2, as defined in the claims. Anticorpos anti-LOXL2 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ae/ou inibem LOXL2 têm utilização nos métodos de purificação, diagnóstico e terapêuticos descritos aqui. anti-LOXL2 Antibodies and antigen binding fragments thereof that bind to and / or inhibit LOXL2 have use in methods for treating, diagnosis and therapy described herein. São ainda providenciados aqui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que compete com, ou se ligam especificamente a, qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos precedentes para ligação a LOXL2. Further provided herein are antibodies or antigen-binding fragments that compete with or bind specifically to, any of the antibodies or antigen binding fragments thereof for binding preceding LOXL2.

Qualquer um de tais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno pode ligar-se especificamente a LOXL2 com uma afinidade de ligação de pelo menos 2,5, 10, 50, 100, 500 ou 1000 vezes superior a pelo menos uma de LOX, LOXL1, LOXL3 ou LOXL4. Any of these antibodies or antigen binding fragments can specifically bind LOXL2 with a binding affinity of at least 2,5, 10, 50, 100, 500 or 1000 times greater than at least one of LOX, LOXL1, LOXL3 or LOXL4.

Numa modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descritos aqui liga-se especificamente à região SRCR3-4 de L0XL2 e liga, assim, ambas L0XL2 de comprimento inteiro e processada. In one embodiment, an antibody or antigen fragment binding thereof, disclosed herein specifically binds to the region of SRCR3-4 L0XL2 alloy and thus L0XL2 both full-length and processed. Num aspeto, ambas L0XL2 de comprimento inteiro e processada são formas ativas da enzima. In one aspect, both full length and L0XL2 are processed active forms of the enzyme. Um anticorpo pode, por exemplo, ligar-se especificamente a um epítopo com uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ. An antibody can, for example, bind specifically to an epitope having an amino acid sequence shown as SEQ. ID N.° 6. Tais anticorpos podem servir como um inibidor parcial acompetitivo da atividade enzimática in vitro, inibindo aproximadamente metade da atividade enzimática contra um substrato 1,5-diaminopentano com um IC50 aparente de 20 - 30 nM. ID No. 6. Such antibodies may serve as an inhibitor acompetitivo partial enzymatic activity in vitro, inhibiting approximately half of the enzyme activity against 1,5-diaminopentane substrate with an apparent IC 50 20 - 30 nM. Tais anticorpos podem servir como inibidores não competitivos. Such antibodies can serve as non-competitive inhibitors.

Quando anticorpos humanizantes, pode ser conseguida incorporação simultânea de todos os ácidos nucleicos codificantes FR e/ou CDR e de todos as alterações de posição de aminoácidos selecionadas por uma variedade de métodos conhecidos daqueles habilitados na arte, incluindo por exemplo, síntese recombinante e química. When humanizing antibodies, it can be achieved by simultaneous incorporation of all encoding nucleic acids FR and / or CDR and all the amino acid position changes selected by a variety of methods known to those skilled in the art, including for example, recombinant synthesis and chemistry. Por exemplo, a incorporação simultânea pode ser conseguida, por exemplo, sintetizando quimicamente a sequência nucleotídica para a região variável aceitadora, fundida juntamente com os ácidos nucleicos codificantes CDR dadores e incorporando nas posições selecionadas para albergarem resíduos de aminoácidos variáveis uma pluralidade de codões de aminoácidos correspondentes. For example, simultaneous incorporation can be achieved, for example, by chemically synthesizing the nucleotide sequence for the variable region acceptor fused with the coding CDR nucleic acid donors and incorporating the selected positions for harboring amino acid residues variables a plurality of amino acid codons correspondents. São providenciados aqui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a L0XL2. here they are provided antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to L0XL2. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a L0XL2 podem inibir (parcialmente ou completamente) ou gerir/tratar (parcialmente ou completamente) sintomas associados com e/ou causados pela expressão aberrante de L0XL2. Antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to L0XL2 may inhibit (partially or completely) or managing / treated (partially or fully) the symptoms associated with and / or caused by aberrant expression of L0XL2. 0 pedido também providencia linhas celulares que podem ser utilizadas para produzir os anticorpos, métodos para produzir as linhas celulares, métodos para expressar os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno e de purificar os mesmos. 0 application also provides cell lines which can be used to produce the antibodies, methods for producing the cell lines, methods for expressing the antibodies or antigen binding fragments and purify them.

Uma pessoa reconhecerá que os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a L0XL2 gerados utilizando os métodos descritos aqui podem ser testados utilizando os ensaios providenciados aqui ou conhecidos na arte para a capacidade de se ligar a L0XL2 (por exemplo, ELISA) bem como para a afinidade (por exemplo, Biacore ou Ressonância de plasma de superfície). A person will recognize that the antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to L0XL2 generated using the methods described herein can be tested using the assays provided herein or known in the art for the ability to bind to L0XL2 (e.g. ELISA) as well as affinity (e.g., Biacore and surface plasmon resonance).

Versões humanizadas de anticorpos anti-L0XL2 têm uma ou mais das seguintes características: retenção da função inibidora dos anticorpos monoclonais murinos, afinidade de ligação equivalente ou aumentada com uma taxa de dissociação lenta (por exemplo, Kd 0,1-1 nM) , ligação a LOXL2 de comprimento inteiro e/ou processada, inibição não competitiva parcial da atividade enzimática, Ic50 equivalente ou superior (por exemplo, cerca de 30 nM) , atividade inibidora em ensaios de migração/invasão baseados em células, inibição de uma alteração tipo EMT induzida pela LOXL2 segregada em meios condicionados de células tumorais, ligação a LOXL2 associada a matriz gerada pelas células tumorais humanas vivas, reatividade cruzada da ligação de LOXL2 humana com LOXL2 murina, eficácia terapêutica (por exemplo, parcial ou redução no tamanho e/ou sintomas do tumor), toxicidade reduzida e imunogenicidade reduzida. humanized versions of anti-L0XL2 antibodies have one or more of the following: retention of the inhibitory function of murine monoclonal antibodies, equivalent or enhanced binding affinity with a slow dissociation rate (e.g. 0.1-1 nM Kd) binding the entire length LOXL2 and / or processed, uncompetitive partial inhibition of enzymatic activity, equivalent or IC50 (for example, about 30 nM), inhibitory activity on the migration tests / invasion-based cells, inhibiting a change type EMT induced LOXL2 secreted in conditioned medium of tumor cells, binding to LOXL2 associated with matrix generated by live human tumor cell cross-reactivity of human LOXL2 binding with murine LOXL2, therapeutic efficacy (e.g., partially or reduction in the size and / or symptoms tumor), reduced toxicity, and reduced immunogenicity. São providenciados aqui anticorpos humanizados que se ligam a hLOXL2 e anticorpos humanizados que se ligam a hLOXL2 e LOXL2 (LOXL2 murina). here they are provided humanized antibodies that bind to hLOXL2 and humanized antibodies that bind to and hLOXL2 LOXL2 (murine LOXL2). Num aspeto, os anticorpos humanizados são inibidores não competitivos. In one aspect, the humanized antibodies are noncompetitive inhibitors.

Numa modalidade, um anticorpo anti-LOXL2 humanizado tem cadeia VH com uma sequência de aminoácidos da SEQ. In one embodiment, a humanized anti-LOXL2 antibody with a VH chain has the amino acid sequence SEQ. ID N.° 25, SEQ. ID No. 25, SEQ. ID N.° 26, SEQ. ID No. 26, SEQ. ID N.° 27 ou SEQ. ID No. 27 or SEQ. ID N.° 28. Alguém compreenderia que podem ser feitas modificações de aminoácidos conservadoras utilizando os métodos descritos aqui numa ou mais regiões CDR ou estrutura para maturação da afinidade do anticorpo. ID No. 28. One would understand that conservative amino acids may be made using modifications of methods described herein one or more CDR regions or framework for antibody affinity maturation. Anticorpos modificados por tais métodos podem ser testados em relação à função utilizando qualquer um dos ensaios descritos aqui ou conhecidos na arte. Antibodies modified in such methods can be tested for function using any of the assays described herein or known in the art.

Noutra modalidade, um anticorpo anti-LOXL2 humanizado tem cadeia VL com uma sequência de aminoácidos da SEQ. In another embodiment, a humanized anti-LOXL2 antibody with a VL chain has the amino acid sequence SEQ. ID N.° 30, SEQ. ID No. 30, SEQ. ID N.° 31 ou SEQ. ID No. 31 or SEQ. ID N.° 32. Alguém compreenderia que podem ser feitas modificações de aminoácidos conservadoras utilizando os métodos descritos aqui numa ou mais regiões CDR ou estrutura para maturação da afinidade do anticorpo. ID No. 32. One would understand that conservative amino acids may be made using modifications of methods described herein one or more CDR regions or framework for antibody affinity maturation. Anticorpos modificados por tais métodos podem ser testados em relação à função utilizando qualquer um dos ensaios descritos aqui ou conhecidos na arte. Antibodies modified in such methods can be tested for function using any of the assays described herein or known in the art. É providenciado aqui um anticorpo humanizado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a L0XL2, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que dita região variável da cadeia pesada compreende: (i) uma cadeia pesada FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. It is provided herein is a humanized antibody or binding fragment antigen thereof, which binds to L0XL2 comprising a variable region of the heavy chain and a variable region of the light chain, wherein said variable region of the heavy chain comprises: (i) a heavy chain FR1 with SEQ amino acid sequence. ID N.° 33 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 33 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 33, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de glutamina (Q) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 24; ID No. 33, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of glutamine (Q) for valine (V) or a conservative substitution thereof at position 24; (b) uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 30; (B) a substitution of leucine (L) for valine (V) or a conservative substitution thereof at position 30; (c) uma substituição de valina (V) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (C) a substitution of valine (V) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 31; (d) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 32; (D) a substitution of arginine (R) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 32; e (e) uma substituição de treonina (T) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 35; and (e) substitution of a threonine (T) to alanine (A) or a conservative substitution thereof at position 35; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-19; and a deletion of 1-19 amino acid residues; (ii) uma cadeia pesada FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (Ii) a heavy chain FR2 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 34 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 34 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 34, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 3; ID No. 34, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of lysine (K) to arginine (R) or a conservative substitution thereof at position 3; (b) uma substituição de arginina (R) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5, e (iii) uma cadeia pesada FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (B) a substitution of arginine (R) for alanine (A) or a conservative substitution thereof at position 5, and (iii) a heavy chain FR3 with SEQ amino acid sequence. ID N.° 35 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 35 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 35, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de lisina (K) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 1; ID No. 35, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of lysine (K) to arginine (R) or a conservative substitution thereof at position 1; (b) uma substituição de alanina (A) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; (B) substitution of an alanine (A) to valine (V) or a conservative substitution thereof at position 2; (c) uma substituição de leucina (L) por isoleucina (I) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 4; (C) a substitution of leucine (L) for isoleucine (I) or a conservative substitution thereof at position 4; (d) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 10; (D) a substitution of serine (S) for threonine (T) or a conservative substitution thereof at position 10; (e) uma substituição de glutamina (Q) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 16; (E) a substitution of glutamine (Q) for glutamic acid (E) or a conservative substitution thereof at position 16; (f) uma substituição de treonina (T) por arginina (R) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 21; (F) substitution of a threonine (T) with arginine (R) or a conservative substitution thereof at position 21; (g) uma substituição de ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 23; (G) a substitution of aspartic acid (D) for glutamic acid (E) or a conservative substitution thereof at position 23; (h) uma substituição de serina (S) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 25; (H) a substitution of serine (S) for threonine (T) or a conservative substitution thereof at position 25; e (i) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; and (i) a substitution of phenylalanine (F) for tyrosine (Y) or a conservative substitution thereof at position 29; e (iv) uma cadeia pesada FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. and (iv) a heavy chain FR4 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 36 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 36 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 36, mas por uma substituição de lisina (K) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7, e em que dita região variável da cadeia leve compreende: (i) uma cadeia leve FR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 36, but for a substitution of lysine (K) to valine (V) or a conservative substitution thereof at position 7, and wherein said light chain variable region comprising: (i) a light chain FR1 with amino acid sequence of SEQ. ID N.° 49 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 49 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 49, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por treonina (T) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 27; ID No. 49, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) substitution of an alanine (A) to threonine (T) or a conservative substitution thereof at position 27; (b) uma substituição de alanina (A) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 28; (B) substitution of an alanine (A) with proline (P) or a conservative substitution thereof at position 28; (c) uma substituição de prolina (P) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 29; (C) substitution of a proline (P) with leucine (L) or a conservative substitution thereof at position 29; (d) uma substituição de valina (V) por leucina (L) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 31; (D) a substitution of valine (V) for leucine (L) or a conservative substitution thereof at position 31; (e) uma substituição de ácido glutâmico (E) por glutamina (Q) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 37; (E) a substitution of glutamic acid (E) for glutamine (Q) or a conservative substitution thereof at position 37; (d) uma substituição de serina (S) por prolina (P) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 38; (D) a substitution of serine (S) with proline (P) or a conservative substitution thereof at position 38; (f) uma substituição de valina (V) por alanina (A) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 39; (F) a substitution of valine (V) to alanine (A) or a conservative substitution thereof at position 39; e uma deleção dos resíduos de aminoácidos 1-20; and a deletion of 1-20 amino acid residues; (ii) uma cadeia leve FR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (Ii) a light chain FR2 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 50 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 50 or the amino acid sequence SEQ. ID N. 0 50, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de fenilalanina (F) por tirosina (Y) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 2; 0 ID NO: 50, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) a substitution of phenylalanine (F) for tyrosine (Y) or a conservative substitution thereof at position 2; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 5; and (b) a substitution of arginine (R) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 5; (iii) uma cadeia leve FR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ. (Iii) a light chain FR3 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 51 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 51 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 51, mas por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma substituição de alanina (A) por ácido aspártico (D) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 14; ID No. 51, but by one or more substitutions selected from the group consisting of: (a) substitution of an alanine (A) with aspartic acid (D) or a conservative substitution thereof at position 14; e (b) uma substituição de arginina (R) por lisina (K) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 18; and (b) a substitution of arginine (R) for lysine (K) or a conservative substitution thereof at position 18; e (iv) uma cadeia leve FR4 com a sequência de aminoácidos da SEQ. and (iv) a light chain FR4 with the amino acid sequence of SEQ. ID N.° 52 ou a sequência de aminoácidos da SEQ. ID No. 52 or the amino acid sequence SEQ. ID N.° 52, mas por uma substituição de leucina (L) por valina (V) ou uma substituição conservadora da mesma na posição 7; ID No. 52, but replacing by a leucine (L) for valine (V) or a conservative substitution thereof at position 7;

Numa modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, compreende uma região variável da cadeia pesada FR1 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. In one embodiment, the antibody or antigen binding fragment thereof, comprises a heavy chain variable region of FR1 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 33, 37 ou 44; ID No. 33, 37 or 44; uma região variável da cadeia pesada FR2 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. a variable region of the heavy chain FR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 34, 38 ou 45; ID No. 34, 38 or 45; uma região variável da cadeia pesada FR3 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. a variable heavy chain FR3 region having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 35, 39, 46, 47 ou 48; ID No. 35, 39, 46, 47 or 48; uma região variável da cadeia pesada FR4 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. a variable region of the heavy chain FR4 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 36 ou 40; ID NO: 36 or 40; uma região variável da cadeia leve FR1 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. a variable region of the light chain FR1 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 49 ou 53; ID NO: 49 or 53; uma região variável da cadeia leve FR2 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. a variable region of the light chain FR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 50, 54 ou 60; ID No. 50, 54 or 60; uma região variável da cadeia leve FR3 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. a variable light chain FR3 region having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.° 51, 55 ou 61; ID No. 51, 55 or 61; e uma região variável da cadeia leve FR4 com uma sequência de aminoácidos, conforme apresentada na SEQ. and a light chain variable region FR4 having an amino acid sequence as shown in SEQ. ID N.0 52 ou 5 6 . ID N.0 5 or 52 6.

Abrangidas no âmbito do presente pedido estão as cadeias variáveis pesadas e cadeias variáveis leves que são pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 95% ou até 100% idênticas às cadeias variáveis pesadas e cadeias variáveis leves descritas aqui. Within the scope of the present application are those variable heavy chains and chains variable light that are at least 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100% identical to the variable chains heavy and variable light chains described herein.

Substituições conservadoras são modificações menores destas sequências nucleotidicas e/ou pretende-se que aminoácidos sejam incluídos como cadeias pesada e leve que codificam ácidos nucleicos e os seus fragmentos funcionais. Conservative substitutions are minor modifications of these nucleotide sequences and / or amino acids intended to be included as heavy and light chain encoding nucleic acids and their functional fragments.

Tais modificações menores incluem, por exemplo, aquelas que não alteram a sequência de aminoácidos codificada devido à degeneração do código genético, bem como aquelas que resultam em apenas uma substituição conservadora da sequência de aminoácidos codificada ou aquelas que não alteram substancialmente a capacidade de ligação do anticorpo. Such minor modifications include, for example, those which do not change the encoded amino acid sequence due to the degeneracy of the genetic code, as well as those that result in only a conservative substitution of the encoded amino acid sequence and those that do not substantially alter the binding capacity antibody. Substituições conservadoras de aminoácidos codificados incluem, por exemplo, aminoácidos que pertencem aos grupos seguintes: (1) aminoácidos não polares (Gly, Ala, Vai, Leu e Ile) ; Conservative substitutions of encoded amino acids include, for example, amino acids belonging to the following groups: (1) non-polar amino acids (Gly, Ala, Val, Leu and Ile); (2) aminoácidos polares neutrais (Cys, Met, Ser, Thr, Asn e Gin) ; (2) neutral polar amino acids (Cys, Met, Ser, Thr, Asn and Gin); (3) aminoácidos polares acidicos (Asp e Glu); (3) polar acidic amino acids (Asp and Glu); (4) aminoácidos polares básicos (Lys, Arg e His); (4) polar basic amino acids (Lys, Arg and His); e (5) aminoácidos aromáticos (Phe, Trp, Tyr e His). and (5) aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr, and His). Outras modificações menores estão incluídas nos ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos das cadeias pesada e leve da invenção desde que os ácidos nucleicos ou polipeptídeos codificados retenham alguma, ou toda, da sua função, conforme descrito aqui, e que têm utilização nos métodos descritos aqui. Other minor modifications are included in the nucleic acids encoding the polypeptides of the heavy and light chains of the invention so long as the nucleic acids or encoded polypeptides retain some or all of its functions, as described herein, and have use in the methods described herein. Substituições não conservadoras são aquelas que não são identificads como substituições conservadoras. non-conservative substitutions are those that are not identificads as conservative substitutions. Utilizando os métodos descritos aqui, uma pessoa pode verificar se seria possível substituir um aminoácido não conservador por um resíduo de aminoácidos estrutura residue e testar a função do anticorpo modificado utilizando os ensaios descritos aqui noutro local. Using the methods described herein, a person can check whether it would be possible to replace a non-conservative amino acid residue by an amino acid residue test the function and structure of the modified antibody using the assays described elsewhere herein.

Cadeias variáveis pesadas e cadeias variáveis leve modificadas podem ser classificadas em relação à ligação e atividade utilizando métodos conhecidos na arte e descritos aqui. Variable heavy chains and variable light chains may be classified modified for binding and activity using methods known in the art and described herein.

Uma porção substancial de um domínio variável incluirá três regiões CDR, juntamente com as suas regiões estrutura intervenientes. A substantial portion of a variable domain will include three CDR regions, together with their intervening framework regions. A porção também pode incluir pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou ambas a primeira e quarta regiões estrutura, sendo 50% correspondente a 50% do C-terminal da primeira região estrutura e 50% do N-terminal da quarta região estrutura. The portion may also include at least about 50% of either or both of the first and fourth regions structure, with 50% corresponding to 50% of the C-terminal region first structure and 50% N-terminal of the fourth region structure. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados com regiões do domínio variável que ocorrem naturalmente. Additional residues at the N-terminus or C-terminal end of the substantial part of the variable domain may be those not normally associated with regions of the naturally occurring variable domain. Por exemplo, a construção de anticorpos anti-L0XL2 humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno descritos aqui feitos por técnicas de ADN recombinante podem resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminal codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. For example, the construction of humanized anti-antigen antibodies and L0XL2 described herein made by recombinant DNA techniques binding fragments may result in the introduction of N- or C-terminal residues encoded by linkers introduced to facilitate cloning or other manipulation steps . Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para juntar domínios variáveis a sequências proteicas adicionais incluindo cadeias pesadas da imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou rótulos proteicos, conforme discutido com mais detalhes a seguir. Other manipulation steps include the introduction of linkers to join variable domains to further protein sequences including immunoglobulin heavy chains, other variable domains (for example in the production of diabodies) or protein labels as discussed in more detail below.

Anticorpos abrangidos pelo presente pedido, incluindo, por exemplo, aqueles com cadeias variáveis pesadas ou leves que têm pelo menos 50% de identidade com aqueles descritos aqui podem ser avaliados em relação à atividade anti-LOX ou anti-LOXL2. Antibodies covered by this application, including, for example, those with heavy or variable light chains have at least 50% identity to those described herein can be evaluated for anti-LOX or anti-LOXL2 activity. É providenciado aqui um método para identificar um anticorpo que inibe o crescimento celular do tumor metastático, compreendendo contactar L0XL2 ou uma célula que expressa L0XL2 com um anticorpo candidato; Provided herein is a method for identifying an antibody that inhibits cell growth of metastatic tumors, or L0XL2 comprising contacting a cell expressing L0XL2 with a candidate antibody; e determinar a expressão ou atividade da L0XL2, pela qual o anticorpo candidato que reduz a expressão ou atividade da L0XL2 comparado com a expressão ou atividade da detetada na ausência do anticorpo é identificado como o composto que inibe o crescimento celular do tumor metastático. and determining the expression or activity of L0XL2, whereby the candidate antibody that reduces the expression or activity of L0XL2 compared to the expression or activity detected in absence of the antibody is identified as a compound that inhibits metastatic tumor cell growth. Em modalidades particulares, o anticorpo é contactado com L0XL2 ou uma célula que expressa L0XL2 em condições hipóxicas. In particular embodiments, the antibody is contacted with L0XL2 or a cell expressing L0XL2 hypoxic conditions. Num aspeto, os anticorpos descritos aqui podem ser inibidores não competitivos. In one aspect, the antibodies described herein can be noncompetitive inhibitors.

Também é providenciado aqui um método para identificar um anticorpo que aumenta a eficácia de agentes quimioterapêuticos, compreendendo contactar L0XL2 ou uma célula que expressa L0XL2 com um anticorpo candidato; Also provided herein is a method for identifying an antibody that increases the effectiveness of chemotherapeutic agents, or L0XL2 comprising contacting a cell expressing L0XL2 with a candidate antibody; pela qual o anticorpo candidato que reduz a expressão ou atividade da L0XL2 comparado com a expressão ou atividade da detetada na ausência do anticorpo é identificado como o anticorpo que aumenta a eficácia dos agentes quimioterapêuticos na inibição ou redução do crescimento tumoral metastático. whereby the candidate antibody that reduces the expression or activity L0XL2 compared to the expression or activity detected in absence of the antibody is identified as an antibody that enhances the effectiveness of chemotherapeutic agents in the inhibition or reduction of metastatic tumor growth.

Qualquer fonte adequada de L0XL2 pode ser empregue como um alvo de anticorpo no presente método. Any suitable source of L0XL2 may be employed as an antibody target in the present method. A enzima pode ser derivada, isolada ou produzida de forma recombinante a partir de qualquer fonte conhecida na arte, incluindo levedura, microbiana e de mamífero, que permitirá a geração de um produto adequado que pode gerar um reagente detetável ou será biologicamente ativo num ensaio adequado. The enzyme may be derived, isolated or recombinantly produced from any source known in the art, including yeast, microbial and mammalian, allowing the generation of a suitable product that can generate a detectable reactant or is biologically active in a suitable assay . A atividade enzimática de L0XL2 pode ser avaliada por qualquer método adequado descrito aqui ou conhecido na arte. The enzymatic activity L0XL2 can be assessed by any suitable method described herein or known in the art. Métodos exemplares de avaliar a atividade de L0XL2 incluem os de Trackman et al. Exemplary methods for assessing activity include L0XL2 of Trackman et al. , Anal. Anal. Biochem. Biochem. 113:336-342 (1981); 113: 336-342 (1981); Kagan, et al., Methods Enzymol. Kagan et al., Methods Enzymol. 82A:637-49 (1982); 82A: 637-49 (1982); Palamakumbura et al. Palamakumbura et al. , Anal. Anal. Biochem. Biochem. 300:245-51 (2002); 300: 245-51 (2002); Albini et al. Albini et al. , Cancer Res. 47: 3239-45 (1987); Cancer Res 47: 3239-45 (1987);. Kamath et al, Cancer Res. 61:5933-40 (2001); Kamath et al, Cancer Res 61: 5933-40 (2001);. Patente USN° 4 997 854; US Patent No. 4,997,854; e Pedido de Patente USN° 2004/0248871. and U.S. Patent Application 2004/0248871 USN °. Por exemplo, a atividade enzimática pode ser avaliada detetando e/ou quantificando "biprodutos da lisil oxidase," For example, enzyme activity can be assessed by detecting and / or quantifying & quot; byproducts of lysyl oxidase & quot; tais como produção de H2O2; such as production of H2O2; resíduos de piridinio colagénio, produção de amónia; waste pyridinium collagen, ammonia production; produção de produto aldeído; producing aldehyde product; oxidação de lisil, deoxipiridinolina (Dpd)-discutida anteriormente. lysyl oxidation, deoxypyridinoline (DPD) -discutida above. Também é possível detetar e quantificar a capacidade de invasão celular in vitro·, adesão e crescimento celular in vitro·, e crescimento metastático in vivo. It is also possible to detect and quantify the ability of cell invasion in vitro ·, adhesion and cell growth in vitro · and metastatic growth in vivo. Modelos in vivo incluem, mas não se limitam a, modelos singénicos adequados, modelos de xeno-enxerto de tumor humano, modelos ortotópicos, modelos metastáticos, modelos transgénicos e modelos de gene knockout (ver, por exemplo, Teicher, Tumors Models in Cancer Research (Humana Press 2001)). In vivo models include, but are not limited to, appropriate syngeneic models, models xenograft human tumor orthotopic models, metastatic models, transgenic models and knockout gene models (see, for example, Teicher, tumors Models in Cancer Research (Humana Press 2001)).

As condições hipóxicas podem ser induzidas ou ocorrer naturalmente. Hypoxic conditions may occur naturally or be induced. As áreas hipóxicas ocorrem, com frequência, no interior do tumor sólido. Hypoxic areas occur frequently within the solid tumor. A hipoxia também pode ser induzida in vivo, particularmente em modelos animais experimentais, utilizando diminuição ou cessação do fluxo sanguíneo arterial para o tumor ou a administração de compostos vasoconstritores. Hypoxia can also be induced in vivo, particularly in experimental animal models, using reduction or cessation of blood flow to the arterial tumor or the administration of vasoconstrictive compounds. Ver, por exemplo, Patente USN° 5 646 185. Compostos vasoconstritores exemplares incluem agonistas adrenérgicos diretos e indiretos, tais como norepinefrina, epinefrina, fenilefrina e cocaína. See, e.g., US Patent No. 5 646 185. Exemplary compounds include vasoconstrictors direct and indirect adrenergic agonists such as norepinephrine, epinephrine, phenylephrine and cocaine. A presença de uma região hipóxica num tumor sólido presente num sujeito pode ser observada por um número de métodos atualmente conhecidos na arte, incluindo ressonância magnética nuclear (NMR) e histografia de elétrodo de oxigénio p02. The presence of hypoxic region in a solid tumor in a subject This can be observed by a number of methods currently known in the art, including nuclear magnetic resonance (NMR) and histografia oxygen electrode p02. Tais métodos podem ser utilizados no contexto da presente invenção (conforme descrito a seguir) para identificar regiões alvo de tratamento hipóxico e para guiar a adminitração de composições de tratamento a tais regiões. Such methods may be used in the context of the present invention (as described below) to identify regions of hypoxic treatment target and for guiding the routine administration of such compositions to treat regions. Condições hipóxicas, in vitro, podem ser induzidas utilizando qualquer método adequado. hypoxic conditions in vitro can be induced using any suitable method. Por exemplo, as células podem ser mantidas em condições anóxicas (<0,1% O2) a 37°C numa câmara anaeróbica ou em condições hipóxicas (1 a 2% O2) a 37°C numa câmara incubadora modular preenchida com 5% CO2 e 1 a 2% O2 balançado com N2. For example, cells can be maintained in anoxic conditions (& lt; 0.1% O2) at 37 ° C in an anaerobic chamber or hypoxic conditions (1 to 2% O2) at 37 ° C in a modular incubator chamber filled with 5% CO2 and 1 to 2% O 2 balanced with N 2. Ver, por exemplo, Erler et al., Mol. Cell. See, for example, Erler et al., Mol. Cell. Biol. Biol. 24:2875-89 (2004). 24: 2875-89 (2004).

As enzimas LOXL2 ou células que expressam LOXL2 podem ser contactadas com um composto (por exemplo, um inibidor de LOX/LOXL, tal como um anticorpo) de qualquer maneira adequada durante qualquer quantidade de tempo adequada. The LOXL2 enzymes or cells expressing LOXL2 may be contacted with a compound (e.g., an inhibitor of LOX / LOXL, such as an antibody) in any suitable manner for any suitable amount of time. Para regiões do tumor que estão acessíveis para entrega hipodérmica do agente, pode ser desejável injetar o composto diretamente na região hipóxica. For tumor regions that are accessible to hypodermic delivery of the agent may be desirable to inject the compound directly into the hypoxic region. As células podem ser contactadas com o composto mais do que uma vez durante a incubação ou tratamento. The cells may be contacted with the compound more than once during incubation or treatment. Tipicamente, a dose necessária para um anticorpo está no intervalo de cerca de 1 micro-g/ml a 1000 micro-g/ml, mais tipicamente no intervalo de cerca de 100 pg/ml a cerca de 800 pg/ml. Typically, the required dose for an antibody is in the range of about 1 micro-g / ml to 1000 micro-g / ml, more typically in the range of about 100 pg / ml to about 800 pg / ml. A dose exata pode ser prontamente determinada a partir de culturas in vitro das células e exposição da célula a várias dosagens do composto. The exact dose can be readily determined from in vitro cultures of cells and exposing the cell to various dosages of the compound. Tipicamente, a quantidade de tempo em que a célula é contactada com o composto é cerca de 5 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 4 horas, cerca de 12 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas a cerca de 3 dias ou mais, mesmo indefinidamente, mais tipicamente durante cerca de 24 horas. Typically, the amount of time that the cell is contacted with the compound is about 5 minutes, about 15 minutes, about 30 minutes, about 1 hour, about 4 hours, about 12 hours, about 36 hours , about 48 hours to about 3 days or longer, even indefinitely, more typically for about 24 hours. Para ensaios de invasão in vitro, pode ser utilizada qualquer matriz adequada. For in vitro invasion assays may be used any suitable matrix. Numa modalidade, a matriz é matriz Matrigel™ de membrana basal reconstituída (BD Sciences). In one embodiment, the matrix is ​​reconstituted Matrigel ™ basement membrane matrix (BD Sciences). Métodos de classificação também podem incluir uma etapa de medição dos níveis de FAK. Classification methods may also include a step of measuring FAK levels. Conforme descrito a seguir, FAK (quinase de adesão focal [pl25FAK]) é ativada como parte do processo de motilidade celular. As described below, FAK (focal adhesion kinase [pl25FAK]) is activated as part of the process of cell motility. Quando LOX é inibida, a fosforilação de FAK não é aumentada em condições hipóxicas. When LOX is inhibited, the phosphorylation of FAK is not increased in hypoxic conditions. Num ensaio de classificação de composto, uma etapa secundária pode incluir a deteção dos níveis de fosfo-FAK ambos com e sem a adição do anticorpo teste. In a classification test compound, a secondary step can include the detection of phospho-FAK levels both with and without the addition of test antibody. Um anticorpo inibidor teste também reduzirá os níveis de fosfo-FAK. A test inhibitor antibody also reduce the levels of phospho-FAK.

Um anticorpo é um inibidor da expressão ou atividade biológica de LOXL2 quando o anticorpo reduz a expressão ou atividade de LOXL2 relativa à observada na ausência do anticorpo. An antibody is an inhibitor of the expression or biological activity of LOXL2 when the antibody reduces the expression or activity of LOXL2 relative to that observed in the absence of antibody. Numa modalidade, um anticorpo é um inibidor de LOXL2 quando reduz a incidência de metástases em relação à observada na ausência do anticorpo e, em testes adicionais, inibe o crescimento tumoral metastático. In one embodiment, an antibody is an inhibitor of LOXL2 when reduces the incidence of metastases relative to that observed in the absence of the antibody and additional tests, inhibits metastatic tumor growth. Num aspeto, os anticorpos descritos aqui são inibidores não competitivos. In one aspect, the antibodies described herein are non-competitive inhibitors. A inibição do tumor pode ser quantificada utilizando qualquer método de medição conveniente. Inhibition of tumor can be measured using any suitable measurement method. A incidência de metástases pode ser avaliada examinando a disseminação relativa (por exemplo, número de sistemas de orgãos envolvidos) e carga de tumor relativa nestes locais. The incidence of metastasis may be evaluated by examining the relative spread (e.g., number of organ systems involved) and tumor load on these sites. 0 crescimento metastático pode ser verificado por analise microscópica ou macroscópica, conforme apropriado. 0 metastatic growth can be verified by macroscopic or microscopic analysis, as appropriate. As metastases de tumor podem ser reduzidas em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais. Tumor metastasis may be reduced by about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or more. Nalgumas modalidades, o anticorpo pode ser avaliado em relação a outros anticorpos ou compostos que não têm impacto sobre a expressão ou atividade biológica de LOX ou LOXL2. In some embodiments, the antibody can be evaluated in relation to antibodies or other compounds that have no impact on the expression or biological activity of LOX or LOXL2. Os anticorpos teste podem ser administrados no momento da inoculação do tumor, depois do estabelecimento do crescimento tumoral primário, ou após o estabelecimento de metástases locais e/ou distantes. The test antibody may be administered at the time of tumor inoculation, after the establishment of primary tumor growth or after the establishment of local and / or distant metastases. A administração única ou múltipla do anticorpo teste pode ser feita utilizando qualquer modo de administração conveniente incluindo, mas não limitado a, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, subcutânea e intradérmica. The single or multiple administration of the test antibody may be made using any convenient mode of administration including, but not limited to, intravenous, intraperitoneal, intratumor, intradermal, and subcutaneous.

Qualquer célula adequada que expressa LOXL2 pode ser empregue com os presentes métodos. Any suitable cell expressing LOXL2 can be employed with the present methods. Conforme utilizado aqui, o termo "célula" As used herein, the term & quot; cell & quot; inclui uma célula biológica (por exemplo, CHO, HeLa, etc.). includes a biological cell (e.g., CHO, HeLa, etc.). A célula pode ser humana ou não humana. The cell may be human or non-human. A célula pode ser isolada de fresco (isto é, primária) ou derivada a partir de uma linha celular estabelecida a curto prazo ou a longo prazo. The cell may be isolated from fresh (i.e., primary) or derived from an established cell line short term or long term. Linhas celulares biológicas exemplares incluem células cancerígenas mamárias humanas MDA-MB 231, células cancerígenas mamárias humanas MDA-MB 435, glioma U-87 MG, células SCL1 do carcinoma das células escamosas, CEM, carcinoma epitelial HeLa e células de ovário de hamster Chinês (CHO). Exemplary biological cell lines include human breast cancer cells MDA-MB 231 human breast cancer cells MDA-MB 435, glioma, U-87 MG, SCL1 cells of the squamous cells, CEM, epithelial carcinoma HeLa cells and ovarian cells of Chinese hamster ( CHO). Tais linhas celulares são descritas, por exemplo, no Catálogo de Linhas celulares da Coleção Americana de Culturas Tipo (ATCC, Rockville, MD). Such cell lines are described, for example, in the American collection of cell lines Catalog Type Culture (ATCC, Rockville, MD).

Uma célula pode expressar a L0XL2 ou o seu promotor endogenamente ou exogenamente (por exemplo, como um resultado da transferência estável de genes) . A cell can express L0XL2 or its promoter endogenously or exogenously (e.g., as a result of stable gene transfer). A expressão endógena por uma célula, conforme providenciada aqui, pode resultar da expressão constitutiva ou induzida de genes endógenos. The endogenous expression of a cell as provided herein can result in constitutive or induced expression of endogenous genes. A expressão endógena por uma célula, conforme providenciada aqui, pode resultar da introdução das sequências de ácidos nucleicos que codificam ou L0XL2 ou um fragment biologicamente ativo do mesmo, ou sequência de ácido nucleico do promotor de LOXL2 promoter. The endogenous expression of a cell as provided herein can result from the introduction of nucleic acid sequences encoding one or L0XL2 or biologically active fragment thereof, or nucleic acid sequence LOXL2 promoter promoter. A transformação pode ser conseguida utilizando vetores virais, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação, biolística, reagentes lipídicos catiónicos ou qualquer outra técnica conveniente conhecida na arte. The transformation may be achieved using viral vectors, calcium phosphate, DEAE-dextran, electroporation, biolistics, cationic lipid reagents or any other convenient technique known in the art. A maneira de transformer de forma útil na presente invenção é convencional e é exemplificada em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, et ai., editores 2000) . The way to transformer usefully in the invention is conventional and is exemplified in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, et al., Editors, 2000). A expressão exógena da lisil oxidase ou do seu promotor pode ser passageira, estável ou alguma combinação das mesmas. Exogenous expression of lysyl oxidase or its promoter can be transient, stable, or some combination thereof. A expressão exógena da enzima pode ser conseguida utilizando promotores constitutivos, por exemplo, SV40, CMV e afins, e promotores indutíveis conhecidos na arte. Exogenous expression of the enzyme can be achieved using constitutive promoters such as SV40, CMV, and the like, and inducible promoters known in the art. Promotores adequados são aqueles que funcionarão na célula de interesse. Suitable promoters are those that work in the cell of interest.

Os métodos descritos aqui não são limitantes e quaisquer outros métodos conhecidos na arte também podem ser utilizados para testar a atividade de anticorpos anti-LOXL2. The methods described herein are not limiting and other methods known in the art may also be used to test the activity of anti-LOXL2 antibodies. Ensaios adicionais são descritos a seguir nos Exemplos. Additional assays are described hereinafter in the Examples.

Pode ser necessário nalgumas ocasiões introduzir uma região ligante de polipeptídeo não estruturada entre um rótulo da presente invenção e porções dos anticorpos. It may be necessary on occasions to introduce a polypeptide linker region between an unstructured label of the present invention and portions of the antibodies. O ligante pode facilitar flexibilidade potenciada e/ou reduzir impedimento estérico entre quaisquer dois fragmentos. The linker can facilitate enhanced flexibility and / or reduce steric hindrance between any two fragments. 0 ligante também pode facilitar a ocorrência da dobragem apropriada de cada fragmento. 0 linker can also facilitate the occurrence of proper folding of each fragment. 0 ligante pode ser de origem natural, tal como uma sequência determinada para existir em espiral aleatória entre dois domínios de uma proteína. 0 linker can be of natural origin, such as a sequence determined to exist in random coil between two domains of a protein. Uma sequência ligante exemplar é o ligante encontrado entre os domínios C-terminal e N-terminal da subunidade a da ARN polimerase. An exemplary linker sequence is the linker found between the C-terminal domain and C-terminus of a subunit of RNA polymerase. Outros exemplos de ligantes que ocorrem naturalmente incluem os ligantes encontrados nas proteínas 1CI e LexA. Further examples of binders include naturally occurring binders found in 1CI and LexA proteins.

Dentro do ligante, a sequência de aminoácidos pode ser variada com base nas características do ligante preferidas, conforme determinado empiricamente ou conforme revelado por modelação. Within the linker, the amino acid sequence may be varied based on the preferred binding characteristics, as determined empirically or as revealed by modeling. Considerações na escolha de um ligante incluem a flexibilidade do ligante, carga do ligante e presença de alguns aminoácidoss do ligante nas subunidades que ocorrem naturalmente. Considerations in choosing a linker include flexibility of the binder, the binder charge and the presence of some of the binder aminoácidoss the naturally occurring subunits. 0 ligante também pode ser desenhado de tal modo que os resíduos do ligante contactam o ADN, influenciando, assim, a afinidade de ligação ou especificidade, ou para interagir com outras proteínas. 0 linker can also be designed such that the linker residues contact DNA, thus influencing the binding affinity or specificity, or to interact with other proteins. Nalguns casos, particularmente quando é necessário abranger uma distância mais longa entre subunidades ou quando os domínios têm de ser mantidos numa configuração particular, o ligante pode opcionalmente conter um domínio dobrado adicional. In some cases, particularly when it is necessary to cover a longer distance between subunits or when the domains must be held in a particular configuration, the linker may optionally contain an additional folded domain.

Nalgumas modalidades, é preferível que o desenho de um ligante envolva um arranjo de domínios que requer que o ligante abranja uma distância relativamente curta, preferencialmente menos de cerca de 10 Angstroms (A). In some embodiments, it is preferred that the design of a linker involve an arrangement of domains which requires the linker covers a relatively short distance, preferably less than about 10 Angstroms (A). Contudo, em certas modalidades, os ligantes abrangem uma distância de até cerca de 50 A. However, in certain embodiments, linkers include a distance of about 50 A.

Os anticorpos são providenciados aqui de modo que são conjugados ou ligados a frações terapêuticas e/ou de tomografia/detetáveis. The antibodies are provided herein so that they are conjugated or linked to therapeutic and / or CT / detectable fractions. Métodos para conjugar ou ligar anticorpos são bem conhecidos na arte. Methods for conjugating or linking antibodies are well known in the art. As associações entre anticorpos e rótulos incluem quaisquer meios conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a, interações covalentes e não covalentes. The associations between antibodies and labels include any means known in the art including, but not limited to, covalent and non-covalent interactions.

Numa modalidade não limitante, os anticorpos podem estar associados com uma toxina, um radionuclideo, um composto relacionado com ferro, um corante, um reagente de tomografia, um rótulo fluorescente ou um agente quimioterapêutico que seria tóxico quando entregue a uma célula cancerígena. In one non-limiting embodiment, antibodies may be associated with a toxin, a radionuclide, a compound related to iron, a colorant, a tomography reagent, a fluorescent label or a chemotherapeutic agent that would be toxic when delivered to a cancer cell.

Em alternativa, os anticorpos podem ser associados com rótulo detetável, tal como um radionuclideo, composto relacionado com ferro, um corante, um reagente de tomografia, ou um agente fluorescente para imunodeteção de antígenos alvo. Alternatively, antibodies may be associated with detectable label such as a radionuclide, iron-related compound, a dye, a tomography reagent or a fluorescent agent for immunodetection target antigens.

Exemplos não limitantes de radio-rótulos incluem, por exemplo, 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 97MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 411Ag, 411In, 113ln, 119Sb, 121Sn, 1231 1251, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 1311 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 1910s 193Pt, 194 Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb 211At, 212Pb, 1212BÍ e 213Bi. Examples radio-labels nonlimiting include, for example, 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64 Cu, 67 Ga, 67 Cu, 68 Ga, 71Ge, 75 Br, 76 Br, 77 Br, 77As, 77 Br, 81Rb / 81MKr, 97MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 411Ag, 411In, 113ln, 119Sb, 121Sn, 1231 1251, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 1311, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161 Tb, 166 Ho, 169Eu, 177 Lu, 186 Re, 188Re, 189Re, 1910s 193Pt, 194 Go, 197Hg, 199Au, 203Pb 211 At, 212 Pb, 213 Bi and 1212BÍ.

Exemplos não limitantes de toxinas incluem, por exemplo, cadeia A da difteria, fragmentos de ligação não ativa da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, fosfolipase C de Clostridium perfringens (PLC), ribonuclease pancreática bovina (BPR), proteína antiviral (PAP), abrina, fator de veneno de cobra (CVF), gelonina (GEL), saporina (SAP) viscumina. Non-limiting examples of toxins include, for example, diphtheria A chain, non-active binding fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, A chain from abrin A chain of modeccin, alpha-sarcin, proteins Aleurites fordii, dianthin proteins, proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) inhibitor, Momordica charantia, curcin, crotin, the sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin,, trichothecenes, Clostridium perfringens phospholipase C (PLC), bovine pancreatic ribonuclease (BPR), antiviral protein (PAP), abrin a chain, cobra venom factor (CVF), gelonin (GEL), saporin (SAP) viscumin.

Exemplos não limitantes de compostos relacionados com ferro incluem, por exemplo, partículas de óxido de ferro magnéticas, partículas férricas ou ferrosas, Fe203 e Fe304 . Non-limiting examples of iron-related compounds include, for example, magnetic iron oxide particles, ferric or ferrous particles, Fe203 and Fe304. Compostos relacionados com ferro e métodos de rotular polipeptídeos, proteínas e péptidos podem ser encontrados, por exemplo, nas Patentes USN°s 4 101 435 e 4 452 773 e Pedidos publicados US 20020064502 e 20020136693. Related compounds with iron and methods of labeling polypeptides, proteins and peptides may be found, for example, in U.S. USN paragraphs 4,101,435 and 4,452,773 and published applications US 20020064502 and 20020136693.

Em certas modalidades, os anticorpos sujeitos podem ser unidos de forma covalente ou não covalente a uma citotoxina ou outro composto de inibição da proliferação celular, de modo a localizer a entrega daquele agente a uma célula tumoral. In certain embodiments, the subject antibodies can be attached covalently or non-covalently to a cytotoxin or other compound inhibition of cell proliferation, so that the localizer delivery agent to a tumor cell. Por exemplo, o agente pode ser selecionado do grupo que consiste em agentes, inibidores de enzima, inibidores da proliferação, agentes líticos, inibidores da síntese de ADN ou ARN, modificadores da permeabilidade da membrana, metabolitos de ADN, derivados de dicloroetilssulfido, inibidores da produção de proteínas, inibidores de ribossomas, indutores da apoptose e neurotoxinas. For example, the agent may be selected from the group consisting of agents, enzyme inhibitors, proliferation inhibitors, lytic agents, DNA synthesis inhibitors or RNA, membrane permeability modifiers, DNA metabolites dicloroetilssulfido derivatives, inhibitors production of proteins, ribosome inhibitors and inducers of apoptosis neurotoxins.

Em certas modalidades, os anticorpos sujeitos podem sr unidos a um agente útil na tomografia de tumores. In certain embodiments, the subject antibodies can M. joined to a useful agent in tumor tomography. Tais agentes incluem: metais; Such agents include: metal; quelantes de metal; metal chelators; lantanidos; lanthanides; quelantes de lantanidos; chelating lanthanides; radiometais; radiometal; quelantes de radiometais; radiometal chelators; núcleos emissores de positrões; emitting cores positron; microbolhas (para ultra-som); microbubbles (for ultrasound); lipossomas; liposomes; moléculas microencapsuladas en lipossomas ou nanosferas; en molecules microencapsulated liposomes or nanospheres; nanocompostos de óxido de ferro monocristalino; nanocomposites monocrystalline iron oxide; agentes de constraste de tomografia de ressonância magnética; Contrast agents for magnetic resonance tomography; agentes de absorção, refletores e/ou de dispersão da luz; agents for absorption, reflective and / or scattering of light; partículas coloidais; colloidal particles; fluoróforos, tais como fluoróforos quase-infravermelhos. fluorophores such as near-infrared fluorophores. Em muitas modalidades, tal fração/funcionalidade secundária será relativamente grande, por exemplo, pelo menos 25 amu de tamanho e em muitas ocasiões podem ser pelo menos 50, 100 ou 250 amu de tamanho. In many embodiments, this fraction / secondary functionality will be relatively large, for example, at least 25 amu in size and in many instances can be at least 50, 100 or 250 amu in size.

Em certas modalidades, a funcionalidade secundária é uma fração quelada para quelar um metal, por exemplo, um quelante para um radiometal ou ião paramagnético. In certain embodiments, the secondary functionality is a chelated moiety for chelating a metal, e.g., a chelator for radiometal or paramagnetic ion. Em modalidades adicionais, é um quelante para um radionuclídeo útil para radioterapêutica ou procedimentos de tomografia. In further embodiments, it is a chelator for a radionuclide useful for tomography or radiotherapeutic procedures.

Radionuclídeos úteis na presente invenção incluem emissores de gama, emissores de positrão, emissores de eletrões de Auger, emissores de raios X e emissores de fluorescência, com emissores de beta ou alfa preferidos para utilização terapêutica. Radionuclides useful in the present invention include gamma emitters, positron emitters, Auger electron emitters, X-ray emitters and fluorescence emitters, beta emitters and alpha preferred for therapeutic use. Exemplos de radionuclídeos úteis como toxinas na terapêutica de radiação incluem: 32P, 33P, 43K 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 411Ag, 411In, 113In, 119Sb, 121Sn, 1231, 1251, 127Cs, 12 8Ba, 129Cs, 1311, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169EU, 177Lu 186Re, 188Re, 189Re, 1910s, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi e 213Bi. Examples of useful radionuclides as toxins in radiation therapy include: 32 P, 33P, 43K 52Fe, 57Co, 64 Cu, 67 Ga, 67 Cu, 68 Ga, 71Ge, 75 Br, 76 Br, 77 Br, 77As, 77 Br, 81Rb / 81MKr, 87MSr, 90Y, 97Ru , 99 Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 411Ag, 411In, 113In, 119Sb, 121Sn, 1231, 1251, 127Cs, 12 8BA, 129Cs, 1311, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161 Tb, 166 Ho, 169EU, 177Lu 186Re , 188Re, 189Re, 1910s, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211 At, 212 Pb, 212 Bi and 213 Bi.

Radionuclídeos terapêuticos preferidos incluem 188Re, 186Re, 203Pb, 212Pb, 212Bi, 109Pd, 64Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 77Br, 211At, 97Ru, 105Rh, 198Au e 199Ag, 166Ho ou 177Lu. Preferred therapeutic radionuclides include 188Re, 186Re, 203Pb, 212 Pb, 212 Bi, 109Pd, 64 Cu, 67 Cu, 90 Y, 125 I, 131 I, 77 Br, 211 At, 97Ru, 105Rh, 199Ag, and 198 Au, 166 Ho or 177 Lu. Condições sob as quais um quelante coordenará um metal são descritas, por exemplo, por Gasnow et ai. Conditions under which a chelator will coordinate a metal are described, for example, by Gasnow et al. Patentes USN°s 4 831 175, 4 454 106 e 4 472 509. Na presente invenção, "radionuclídeo" USN paragraphs Patent 4,831,175, 4,454,106 and 4 472 509. In this invention, & quot; radionuclide & quot; e "radio-rótulo" and & quot; radio-labeled & quot; são intercambiáveis. They are interchangeable. 99Tc é um radioisótopo particularmente atrativo para aplicações diagnósticas, já que está prontamente disponível a todos os departamentos de medicina nuclear, é barato, proporciona doses de radiação mínimas ao paciente e tem propriedades de tomografia nuclear ideais. 99 Tc is a particularly attractive radioisotope for diagnostic applications, since it is readily available to all nuclear medicine departments, is inexpensive, gives minimal patient radiation doses, and has ideal nuclear tomography properties. Tem uma meia-vida de seis horas o que significa que é desejável alvejar rapidamente um anticorpo rotulado com tecnécio. It has a half-life of six hours which means that it is desirable to rapidly targeting an antibody labeled with technetium. Em conformidade, em certas modalidades preferidas, os anticorpos modificados incluem um agente quelante para tecnécio. Accordingly, in certain preferred embodiments, the modified antibodies include a chelating agent for technetium.

Ainda noutras modalidades, a funcionalidade secundária pode ser um agente radiossensibilizador, por exemplo, uma fração que aumenta a sensibilidade das células à radiação. In still other embodiments, the secondary functionality may be a radiosensitizer agent, for example, a fraction that increases the sensitivity of cells to radiation. Exemplos de agentes radiossensibilizadores incluem nitroimidazóis, metronidazol e misonidazol (ver: DeVita, VT em Harrison's Principles of Internal Medicine, página 68, McGraw-Hill Book Co., Nova Iorque, 1983). Examples of radiosensitizers agents include nitroimidazoles, metronidazole and misonidazole (see: DeVita, VT in Harrison's Principles of Internal Medicine, page 68, McGraw-Hill Book Co., New York, 1983). Os anticorpos modificados que compreendem um agente radiossensibilizador como a fração ativa são administrados para localizar na célula alvo. The modified antibodies which comprise a radiosensitizing agent as the active fraction administered to locate in the target cell. No momento da exposição do indivíduo à radiação, o agente radiossensibilizador é "excitado" At the time of exposure of the individual to radiation, the radiosensitizing agent is & quot; excited & quot; e causa a morte da célula. and causes cell death.

Existe uma ampla gama de frações que podem servir como quelantes e que podem ser derivadas nos anticorpos da presente invenção. A wide range of fractions that can serve as chelators that can be derived from the antibodies of the present invention. Por exemplo, o quelante pode ser um derivado de ácido 1,4,7,10- tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) e ácido 1-p-Isotiocianato-benzil-metil-dietilenotriaminapentaacético (ITC-MX). For example, the chelating acid may be a derivative of 1,4,7,10 tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) acid and 1-p-isothiocyanato-benzyl-diethylene-methyl (ITC -mx). Estes quelantes têm tipicamente grupos na cadeia lateral pelos quais o quelante pode ser utilizado para anexação a antagonistas sujeitos. These chelators typically have groups on the side chain by which the chelator can be used to attach the subject antagonists. Tais grupos incluem, por exemplo, benzilisotiocianato, pelo qual o DOTA, DTPA ou EDTA pode ser unido a, por exemplo, um grupo amina. Such groups include, e.g., benzylisothiocyanate, by which the DOTA, DTPA or EDTA can be coupled to, for example, an amine group.

Numa modalidade, a fração quelada é uma fração quelada "NxSy". In one embodiment, the chelated fraction is a fraction chelated & quot; NxSy & quot ;. Conforme definido aqui, os "quelados NxSy" As defined herein, & quot; NxSy chelates & quot; incluem quelantes bifuncionais que são capazes de ligar de forma coordenada um metal ou radiometal e, preferencialmente, têm núcleos N2S2 ou N3S. They include bifunctional chelators that are capable of binding in a coordinated manner a metal or radiometal and, preferably, have N2S2 or N3S cores. Quelados NxSy exemplares são descritos, por exemplo, em Fritzberg et al. Exemplary NxSy chelates are described, e.g., in Fritzberg et al. (1998) PNAS 85: 4024-29; (1998) PNAS 85: 4024-29; e Weber et al. and Weber et al. (1990) Chem. (1990) Chem. 1: 431-37; 1: 431-37; e nas referências citadas neles. and references cited therein.

Jacobsen et al. Jacobsen et al. (pedido PCT WO 98/12156) providenciam métodos e composições, isto é, bibliotecas sintéticas de frações de ligação, para identificar compostos que se ligam a átomo metal. (PCT application WO 98/12156) provide methods and compositions, i.e. synthetic libraries of binding fractions to identify compounds that bind to the metal atom. A abordagem descrita nessa publicação pode ser utilizada para identificar frações de ligação que podem subsequentemente ser adicionadas aos anticorpos para derivar os anticorpos modificados. The approach described in that publication can be used to identify binding fractions which can subsequently be added to the antibody to derive the modified antibodies.

Um problema encontrado com frequência com a utilização de proteínas conjugadas em aplicações radiodiagnósticas é uma acumulação potencialmente perigosa dos fragmentos da fração radio-rotulada no rim. One problem often with the use of conjugated proteins in radiodiagnósticas applications is a potentially dangerous accumulation of the radio-labeled fraction kidney fragments. Quando o conjugado é formado utilizando um ligante lábil ácido ou básico, pode ocorrer com vantagem a clivagem do quelado radioativo da proteína. When the conjugate is formed using acid or base labile linker, cleavage can occur with radioactive chelate protein advantage. Se o quelado tiver um peso molecular relativamente baixo, como se espera que a maioria dos anticorpos modificados sujeitos, fragmentos de ligação ao antígeno e péptidos sejam, não é retido no rim e é excretado na urina, reduzindo, assim, a exposição do rim à radioatividade. If the chelate has a relatively low molecular weight, as expected that the majority of modified antibodies subjects, antigen-binding fragments thereof and peptides may be, it is not retained in the kidney and is excreted in the urine, thereby reducing kidney exposure radioactivity. Contudo, em certas ocasiões, pode ser vantajoso utilizer ligandos sujeitos lábeis ácidos ou básicos pelas mesmas razões que foram utilizados nas proteínas rotuladas. However, on occasion it may be advantageous utilizer subject labile ligands acidic or basic for the same reasons that have been used in labeled proteins.

Em conformidade, certos dos anticorpos rotulados/modifiçados sujeitos podem ser sintetizados, por métodos convencionais na arte, para providenciarem grupos funcionais reativos que podem formar ligações lábeis ácidas com, por exemplo, um grupo carbonilo do ligando. Accordingly, certain of labeled / modified subject antibodies may be synthesized by conventional methods in the art to providenciarem reactive functional groups which can form acid-labile linkages with, for example, a carbonyl group of the ligand. Exemplos de ligações lábeis ácidas adequadas incluem funções hidrazona e tiosemicarbazona. Examples of suitable acid-labile linkages include hydrazone and thiosemicarbazone functions. Estas são formadas reagindo o carbihidrato oxidado com quelados com hidrazida, tiosemicarbazida e funções, respetivamente. These are formed by reacting the oxidized with chelated carbihidrato hydrazide, thiosemicarbazide and functions, respectively.

Em alternativa, pode ser utilizada clivagem básica que foi utilizada para a eliminação potenciada do radio-rótulo dos rins. Alternatively, basic cleavage may be used which was used for the disposal of radio-enhanced label kidney. Ver, por exemplo, Weber et al. See, e.g., Weber et al. 1990 Bioconjg. 1990 Bioconjg. Chem. Chem. 1:431. 1: 431. A união de um quelado bifuncional a um anticorpo através de uma ligação hidrazida pode incorporar frações éster sensíveis a base num braço espaçador do ligante. The coupling of a bifunctional chelate to an antibody via a hydrazide link may incorporate fractions base sensitive ester a linker spacer arm. Tal unidade de ligante contendo éster é exemplificada pelo etileno glicolbis (sucinimidil sucinato), (EGS, disponível de Pierce Chemical Co. , Rockford, 111.), que tem dois derivados éster N-hidroxisuccinimida (NHS) terminal de duas unidades de ácido 1,4-dibutírico, cada uma das quais estão liqadas a uma única fração de etilenoqlicol por dois ésteres de alquilo. Such ester-containing linker unit is exemplified by ethylene glicolbis (succinimidyl succinate), (EGS, available from Pierce Chemical Co., Rockford, 111.), two derivatives having N-hydroxysuccinimide ester (NHS) of two terminal acid units 1 , 4-dibutyric, each of which are liqadas a single fraction etilenoqlicol by two alkyl esters. Um éster NHS pode ser substituído com um BFC contendo amina adequado (por exemplo, 2-aminobenzil DTPA), enquanto que o outro éster NHS é reaqido com uma quantidade limitante de hidrazina. One NHS ester may be replaced with a suitable amine-containing BFC (for example 2-aminobenzyl DTPA), while the other NHS ester is reaqido with a limiting amount of hydrazine. A hidrazida resultante é utilizada para unir aos antagonistas, formando uma ligação ligando-BFC que contém duas funções de éster de alquilo. The resulting hydrazide is used to join the antagonists, forming an ligand-BFC connection containing two alkyl ester functions. Tal conjugado é estável a pH fisiológico, mas rapidamente dividido a pH básico. Such a conjugate is stable at physiological pH, but readily split at basic pH.

Os anticorpos rotulados por quelação de radioisótopos são sujeitos a cisão induzida por radiação do quelante e à perda de radioisótopo por dissociação do complexo de coordenação. Antibodies labeled by chelation are subject to radioisotopes radiation-induced scission of the chelator and to loss of radioisotope by dissociation of the coordination complex. Nalgumas ocasiões, o metal dissociado do complexo pode ser re-complexado, providenciando eliminação mais rápida de isótopos localizados de forma não específica e, portanto, toxicidade inferior para os tecidos não alvo. In some instances, the dissociated metal complex can be re-complexed, providing more rapid clearance of localized non-specifically isotope and therefore less toxicity to non-target tissues. Por exemplo, os compostos quelantes, tais como EDTA ou DTPA, podem ser infundidos em pacientes para providenciar um grupo de quelantes para ligar o radiometal libertado e facilitar a excreção de radioisótopos livres na urina. For example, the chelating compound such as EDTA or DTPA can be infused into patients to provide a chelating group to bind the released radiometal and facilitate excretion of free radioisotope in the urine.

Ainda noutras modalidades, os anticorpos são unidos a um adendo de Boron, tal como um carborano. In still other embodiments, the antibodies are attached to a Boron addend, such as a carborane. Por exemplo, podem ser preparados carboranos com funções carboxilo ou cadeias laterais pendentes, como é bem conhecido na arte. For example, carboranes can be prepared with carboxyl functions or pendant side chains, as is well known in the art. A anexação de tais carboranos a péptidos amina pode ser conseguida por ativação dos grupos carboxilo dos carboranos e condensação com o grupo amina para produzir o conjugado. The attachment of such carboranes to amine peptides may be accomplished by activation of carboxyl groups of the carboranes and condensation with the amine group to produce the conjugate. Tais anticorpos modificados podem ser utilizados para terapêutica de captura de neutrões. Such modified antibodies can be used for neutron capture therapy. A presente invenção também contempla a modificação de antagonistas sujeitos com corantes, por exemplo, úteis na terapêutica e utilizados em conjunto com radiação não ionizante apropriada. The present invention also contemplates modifying subject antagonists with dyes, for example, useful in therapy and used in conjunction with appropriate non-ionizing radiation. A utilização de luz e porfirinas nos métodos da presente invenção também está contemplada e a sua utilização na terapêutica de cancro foi revista por van den Bergh, Chemistry in Britain, 22: 430-437 (1986). The use of light and porphyrins in methods of the present invention is also contemplated and their use in cancer therapy has been reviewed by van den Bergh, Chemistry in Britain, 22: 430-437 (1986).

Uma modalidade da presente invenção inclui antagonistas rotulados com um rótulo fluorescente. An embodiment of the present invention includes antagonists labeled with a fluorescent label. Rótulos fluorescentes comuns incluem, por exemplo, FITC, PE, Texas Red, citocromo c, etc. Common fluorescent labels include, for example, FITC, PE, Texas Red, cytochrome c, etc. Técnicas para rotular polipeptideos e fragmentos dos mesmos, tais como aquelas providenciadas aqui, são bem conhecidas na arte. Techniques for labeling polypeptides and fragments thereof such as those provided herein, are well known in the art. O termo "agente anticancerígeno" The term & quot; anticancer agent & quot; também inclui os agentes quimioterapêuticos descritos a seguir. also includes those chemotherapeutic agents described below. O termo agente anticancerígeno também inclui tratamento com uma substância que reduz a hipoxia numa célula, quando tal agente é combinado com inibição de LOX. The term anticancer agent also includes treatment with a substance that reduces hypoxia in a cell, when this agent is combined with inhibition of LOX. Tal substância pode incluir, por exemplo, p53. Such a substance may include, for example, p53. Ver, por exemplo, Matoba et al., "p53 Regulates Mitochondrial Respiration," See, for example, Matoba et al. & Quot; p53 Regulates Mitochondrial Respiration, & quot; Science 16 de junho de 2006 312: 1650-1653; Science June 16, 2006 312: 1650-1653; publicado online em 24 de maio de 2006, e referências citadas nele. published online on May 24, 2006, and references cited therein. Uma substância que conduz células cancerígenas para a via respiratória e para longe da via glicolítica seria utilizada com vantagem com um inibidor de LOX na medida em que LOX não seria regulada para cima neste caso. A substance that leads to cancer cells respiratory tract and away from the glycolytic pathway would be used advantageously with a LOX inhibitor insofar as LOX would be upregulated in this case.

Quimioterapêuticos úteis como frações ativas que quando conjugados com antagonistas dos mesmos da presente invenção são entregues especificamente a células são tipicamente, entidades químicas pequenas produzidas por síntese química. Chemotherapeutics useful as active fractions which when combined with antagonists thereof of the present invention are specifically delivered to cells are typically, small chemical entities produced by chemical synthesis. Quimioterapêuticos incluem fármacos citotóxicos e citostáticos. Chemotherapeutics include cytotoxic and cytostatic drugs. Quimioterapêuticos podem incluir aqueles que têm outros efeitos nas células, tais como reversão do estado transformado para um estado diferenciado, ou aquelas que inibem a replicação celular. Chemotherapeutics may include those which have other effects on cells such as reversal of the transformed state to a differentiated state or those which inhibit cell replication. Exemplos de agentes citotóxicos conhecidos úteis na presente invenção são listados, por exemplo, em Goodman et al., "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Examples of known cytotoxic agents useful in the present invention are listed, for example, in Goodman et al. & Quot; The Pharmacological Basis of Therapeutics, & quot; Sexta Edição, A. B . Sixth Edition, A. B. Gilman et al., eds./Macmillan Publishing Co. Nova Iorque, 1980. Estes incluem taxanos, tais como paclitaxel e docetaxel; . Gilman et al eds./Macmillan Publishing Co., New York, 1980. These include taxanes such as paclitaxel and docetaxel; nitrogénio tais como mecloretamina, melfalano, mostarda de uracilo e clorambucilo; nitrogen such as mechlorethamine, melphalan, uracil mustard and chlorambucil; derivados de etilenimina, tais como tiotepa; ethylenimine derivatives such as thiotepa; sulfonates de alquilo, tais como busulfano; alkyl sulfonates such as busulfan; nitrosoureias, tais como lomustina, semustina e estreptozocina; nitrosoureas such as lomustine, semustine and streptozocin; triazenos, tais como dacarbazina; triazenes such as dacarbazine; análogos do ácido fólico, tais como metotrexato; folic acid analogs such as methotrexate; análogos da pirimidina, tais como fluorouracilo, citarabina e azaribina; pyrimidine analogs such as fluorouracil, cytarabine and azaribine; análogos da purina, tais como mercaptopurina e tioguanina; purine analogs such as mercaptopurine and thioguanine; vinca alcaloides, tais como vinblastina e vincristina; vinca alkaloids such as vinblastine and vincristine; antibióticos, tais como dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina e mitomicina; antibiotics such as dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, and mitomycin; enzimas, tais como complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina; enzymes such as platinum coordination complexes such as cisplatin; ureia substituída, tais como hidroxiureia; substituted urea such as hydroxyurea; derivados de metil hidrazina, tais como procarbazina; methyl hydrazine derivative such as procarbazine; supressores adrenocorticais, tais como mitotano; adrenocortical suppressants such as mitotane; hormonas e antagonistas, tais como adrenocortisteróides (prednisona), a (caproato de hidroxiprogesterona, acetato e acetate de megestrol), estrogénios (dietilstilbestrol e etinil estradiol) e androgénios (propionato de testosterona e fluoximesterona). hormones and antagonists such as adrenocortisteróides (prednisone) to (hydroxyprogesterone caproate, megestrol acetate and acetate), estrogens (diethylstilbestrol and ethinyl estradiol) and androgens (testosterone propionate and fluoxymesterone). Fármacos que interferem com a síntese proteica também podem ser utilizados; Drugs that interfere with protein synthesis can also be used; tais fármacos são conhecidos daqueles habilitados na arte e incluem puromicina, cicloheximida e ribonuclease. such drugs are known to those skilled in the art and include puromycin, cycloheximide, and ribonuclease. A maioria dos agentes quimioterapêuticos atualmente em utilização no tratamento de cancro possuem grupos funcionais que são passíveis de reticulação química diretamente com um grupo amina ou carboxilo de um agente da presente invenção. Most chemotherapeutic agents currently in use in treating cancer possess functional groups that are amenable to chemical crosslinking directly with an amine or carboxyl group of an agent of the present invention. Por exemplo, grupos amino livres estão disponíveis em metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinosida, bleomicina, fludarabina e cladribina enquanto que grupos do ácido carboxílico livres estão disponíveis em metotrexato, melfalano e clorambucilo. For example, free amino groups are available on methotrexate, doxorubicin, daunorubicin, Cytosinarabinoside, bleomycin, fludarabine and cladribine while free carboxylic acid groups are available on methotrexate, melphalan, and chlorambucil.

Estes grupos funcionais, que são ácidos carboxílicos e amino livres, são alvos para uma variedade de agentes de reticulação química homobifuncionais e heterobifuncionais que podem reticular estes fármacos diretamente para um grupo amino livre de um antagonista. These functional groups, that is free amino and carboxylic acids, are targets for a variety of homobifunctional chemical crosslinkers and heterobifunctional which can crosslink these drugs directly to a free amino group of an antagonist.

Agentes quimioterapêuticos contemplados pela presente invenção também incluem outros fármacos quimioterapêuticos que estão comercialmente disponíveis. Chemotherapeutic agents contemplated by the present invention also include other chemotherapeutic drugs that are commercially available. Apenas para ilustrar, o quimioterapêutico pode ser um inibidor da função da cromatina, um inibidor, um fármaco inibidor, um agente que danifica o ADN, um antimetabolito (tal como antagonistas de folato, análogos da pirimidina, análogos da purina e análogos modificados de açúcar), um inibidor da síntese de ADN, um agente interativo de ADN (tal como um agente intercalante), um inibidor da reparação do ADN. To illustrate, the chemotherapeutic can be an inhibitor of chromatin function, an inhibitor, a drug, an agent which damages DNA, an antimetabolite (such as folate antagonists, pyrimidine analogs, purine analogs and analogs modified sugar ), an inhibitor of DNA synthesis, DNA interactive agent (such as an intercalating agent), an inhibitor of DNA repair.

Os agentes quimioterapêuticos podem ser categorizados pelo seu mecanismo de ação, por exemplo, nos seguintes grupos: anti-metabolitos/agentes anti-cancerígenos, tais como análogos da pirimidina floxuridina, capecitabina e citarabina) e análogos da purina, antagonistas de folato e inibidores antiproliferativos/ agentes antimitóticos relacionados incluindo produtos naturais, tais como vinca alcaloides (vinblastina, vincristina e microtúbulo, tais como taxano (paclitaxel, docetaxel), vinblastina, nocodazol, epotilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposido, teniposido), agentes que danificam o ADN (actinomicina, amsacrina, busulfano, carboplatina, clorambucilo, cisplatina, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, ifosfamida, melfalano, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, procarbazina, taxol, taxotero, teniposido, trietilenotiofosforamida e etoposido; antibióticos, tais como dactinomicina (actinomicina D) , dau Chemotherapeutic agents may be categorized by their mechanism of action, for example, the following groups: anti-metabolites / anti-cancer agents, such as analogs floxuridine pyrimidine, capecitabine, and cytarabine) and purine analogs, folate antagonists, and antiproliferative inhibitors / antimitotic related agents including natural products such as vinca alkaloids (vinblastine, vincristine, and microtubule such as taxane (paclitaxel, docetaxel), vinblastine, nocodazole, epothilones and navelbine, epidipodophyllotoxins (etoposide, teniposide), agents that damage DNA (actinomycin , amsacrine, busulfan, carboplatin, chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide, cytoxan, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, ifosfamide, melphalan, mercloretamina, mitomycin, mitoxantrone, nitrosourea, procarbazine, taxol, taxotere, teniposide, triethylenethiophosphoramide and etoposide: antibiotics such as dactinomycin (actinomycin D), DAU norrubicina, doxorrubicina (adriamicina) , idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; norrubicina, doxorubicin (adriamycin), idarubicin, anthracyclines, mitoxantrone, bleomycins, plicamycin (mithramycin) and mitomycin; enzimas (L-asparaginase que metaboliza sistematicamente L-asparagina e priva as células que não têm a capacidade de sintetizar a sua própria asparagina); enzymes (L-asparaginase which systematically metabolizes L-asparagine and deprives cells which do not have the capacity to synthesize their own asparagine); agentes anti-plaquetas; antiplatelet agents; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos, tais como mostardas de nitrogénio ciclofosfamida e análogos, melfalano, clorambucilo) e (hexametilmelamina e tiotepa), alquilo nitrosoureias (BCNU) e análogos, estreptozocina), trazenos-dacarbazinina (DTIC); alkylating agents antiproliferative / antimitotic, nitrogen mustards such as cyclophosphamide and analogs, melphalan, chlorambucil) and (hexamethylmelamine and thiotepa), alkyl nitrosoureas (BCNU) and analogs, streptozocin), trazenes-dacarbazinine (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos, tais como análogos do ácido fólico (metotrexato); antimetabolites antiproliferative / antimitotic such as folic acid analogs (methotrexate); complexos de coordenação de platina (cisplatina, oxiloplatinima, carboplatina) , procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; platinum coordination complexes (cisplatin, oxiloplatinima, carboplatin), procarbazine, hydroxyurea, mitotane, aminoglutethimide; hormonas, análogos de hormonas (estrogénio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores da aromatase (letrozol, anastrozol); hormones, hormone analogs (estrogen, tamoxifen, goserelin, bicalutamide, nilutamide) and aromatase inhibitors (letrozole, anastrozole); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintéticos e outros inibidores de trombina); anticoagulants (heparin, synthetic heparin salts and other inhibitors of thrombin); agentes fibrinoliticos (tais como ativador do plasminogénio de tecido, estreptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel; fibrinolytic agents (such as tissue plasminogen activator to, streptokinase and urokinase), aspirin, dipyridamole, ticlopidine, clopidogrel; agentes antimigratórios; antimigratórios agents; agentes antisecretores (breveldina); antisecretory agents (breveldina); imunossupressores tacrolimus sirolimus azatioprina, micofenolato; immunosuppressant tacrolimus sirolimus azathioprine, mycophenolate; compostos (TNP-470, genisteina) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular, inibidores do fator de crescimento de fibroblasto); compounds (TNP-470, genistein) and growth factor inhibitors (vascular endothelial growth factor vascular inhibitors, fibroblast growth factor inhibitors); bloqueador do recetor de angiotensina, dadores de óxido nítrico; angiotensin receptor blocker, nitric oxide donors; oligonucleotídeos anti-senso; antisense oligonucleotides; anticorpos (trastuzumab, rituximab); antibodies (trastuzumab, rituximab); inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação (tretinoina); cell cycle inhibitors and differentiation inducers (tretinoin); inibidores, inibidores da topoisomerase (doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, dactinomicina, eniposido, epirrubicina, etoposido, idarrubicina, irinotecano e mitoxantrona, topotecano, irinotecano), corticosteróides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona e prenisolona); inhibitors, topoisomerase inhibitors (doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, dactinomycin, eniposido, epirubicin, etoposide, idarubicin, and mitoxantrone irinotecan, topotecan, irinotecan), corticosteroids (cortisone, dexamethasone, hydrocortisone, metilpednisolona, ​​prednisone and prenisolona); inibidores da quinase de transdução do sinal do fator de crescimento; transduction kinase inhibitors of growth factor signal; indutores de disfunção, toxinas tais como tozia da cólera, ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina adenilato ciclase da Bordetella pertussis ou toxina da difteria e ativadores da caspase; dysfunction inducers, toxins such as cholera tozia, ricin, Pseudomonas exotoxin, adenylate cyclase of Bordetella pertussis toxin or diphtheria toxin, and caspase activators; e cromatina. and chromatin. Dosagens preferidas dos agentes quimioterapêuticos são consistentes com as dosagens atualmente prescritas. Preferred dosages of the chemotherapeutic agents are consistent with currently prescribed dosages.

Adicionalmente, outros rótulos, tais como biotina seguida de estreptavidina-fosfatase alcalina (AP) , peroxidase de raiz-forte estão contempladas pela presente invenção. Additionally, other labels such as biotin followed by streptavidin-alkaline phosphatase (AP), horseradish peroxidase are contemplated by the present invention.

Conforme utilizado aqui, os termos "tratamento do dano a ácido nucleico" As used herein, the terms & quot; treatment of damage to nucleic acid & quot; e "agente que danifica ácido nucleico" and & quot; agent damages nucleic acid & quot; referem-se a qualquer regime de tratamento que danifica diretamente ou indiretamente ácido nucleico (por exemplo, ADN, ADNc, ADN genómico, ARNm, ARNt ou ARNr). refer to any treatment regimen that directly damage nucleic acid or indirectly (e.g., DNA, cDNA, genomic DNA, mRNA, tRNA or rRNA). Exemplos de tais agentes incluem agentes alquilantes, nitrosoureias, anti-metabolitos, alcaloides vegetais, extratos vegetais e radioisótopos. Examples of such agents include alkylating agents, nitrosoureas, anti-metabolites, plant alkaloids, plant extracts and radioisotopes. Exemplos de agentes também incluem fármacos que danificam ácidos nucleicos, por exemplo, 5-fluorouracil (5-FU), capecitabina, Sl (Tegafur, 5-cloro-2,4-dihidroxipiridina e ácido oxónico), 5-etiniluracilo, arabinosil citosina (ara-C), 5-azacitidina (5-AC), 2',2'-difluoro-2'-deoxicitidina (dFdC), antimetabolitos da purina (mercaptopurina, azatiopurina, tioguanina), cloridrato de gemcitabina (Gemzar), pentostatina, alopurinol, 2-fluoro-arabinosil-adenina (2F-ara-A), hidroxiureia, mostarda de enxofre (biscloroetihilsulfido) , mecloretamina, melfalano, clorambucilo, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, AZQ, mitomicina C, dianhidrogalactitol, dibromoducitol, sulfonato de alquilo (busulfano), nitrosoureias (BCNU, CCNU, 4-metil CCNU ou ACNU), procarbazina, decarbazina, rebecamicina, antraciclinas, tais como doxorrubicina (adri-amicina; ADR), daunorrubicina (Cerubicina) , idarrubicina (Idamicina) e epirrubicina (Ellence), análogos de antraciclina, tais como mitoxantrona, actinomicina D, in Examples of agents also include nucleic acid damaging drugs, e.g., 5-fluorouracil (5-FU), capecitabine, Ps (Tegafur, 5-chloro-2,4-dihydroxypyridine and oxónico acid), 5-ethynyluracil, arabinosyl cytosine ( ara-C), 5-azacytidine (5-AC), 2 ', 2'-difluoro-2'-deoxycytidine (dFdC), purine antimetabolites of (mercaptopurine, azathiopurine, thioguanine), gemcitabine hydrochloride (Gemzar), pentostatin, allopurinol, 2-fluoro-arabinosyl-adenine (2F-ara-a), hydroxyurea, sulfur mustard (biscloroetihilsulfido), mechlorethamine, melphalan, chlorambucil, cyclophosphamide, ifosfamide, thiotepa, AZQ, mitomycin C, dianhidrogalactitol, dibromoducitol, alkyl sulfonate (busulfan), nitrosoureas (BCNU, CCNU, 4-methyl CCNU or ACNU), procarbazine, decarbazine, rebeccamycin, anthracyclines such as doxorubicin (adri-rifamycin; ADR), daunorubicin (Cerubicina), idarubicin (Idamycin) and epirubicin (Ellence ), anthracycline analogues such as mitoxantrone, actinomycin D, in ibidores da topoisomerase não intercalantes, tais como epipodofilotoxinas (etoposido=VP16, teniposido=VM-26), podopfilotoxina, bleomicina (Bleo), pepleomicina, compostos que formam adutos com ácido nucleico incluindo derivados da platina (por exemplo, cisplatina (CDDP), transanálogo da cisplatina, carboplatina, iproplatina, tetraplatina e oxaliplatina), camptotecina, topotecano, irinotecano (CPT-11) e SN-38. ibidores non intercalating topoisomerase such as epipodophyllotoxins (etoposide = VP16, teniposide = VM-26), podopfilotoxina, bleomycin (Bleo), pepleomicina, compounds that form adducts with nucleic acid including platinum derivatives (for example cisplatin (CDDP), transanálogo cisplatin, carboplatin, iproplatin, tetraplatin and oxaliplatin), camptothecin, topotecan, irinotecan (CPT-11) and SN-38. Exemplos específicos de tratamentos que danificam ácidos nucleicos incluem radiação (por exemplo, microondas focados, radiação ultravioleta (UV), infravermelho (IR) ou alfa, beta ou gama) e choque ambiental (por exemplo, hipertermia) . Specific examples of nucleic acid damaging treatments include radiation (e.g., focused microwaves, ultraviolet (UV), infrared (IR) or alpha, beta or gamma) and environmental shock (e.g., hyperthermia).

Conforme utilizado aqui, os termos "tratamento anti-proliferativo" As used herein, the terms & quot; anti-proliferative treatment & quot; e "agente anti-proliferativo" and & quot; anti-proliferative agent & quot; significa qualquer regime de tratamento que diretamente ou indiretamente inibe a proliferação de uma célula, vírus, bactéria ou outro organismo unicelular ou multicelular independentemente de se o tratamento ou agente danifica ou não o ácido nucleico. It means any treatment regimen that directly or indirectly inhibits proliferation of a cell, virus, bacteria or other unicellular or multicellular organism regardless of whether the treatment or agent damages nucleic acid or not. Exemplos particulares de agentes anti-proliferativos são fármacos anti-tumorais e anti-virais que inibem a proliferação celular ou proliferação ou replicação do vírus. Particular anti-proliferative agents are anti-tumor Examples and antiviral drugs which inhibit cell proliferation or virus proliferation or replication of. Exemplos incluem, entre outros, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A, prednisolona, melfalano, clorambucilo, mecloretamina, busulfano, metotrexato, 6-mercaptopurina, tioguanina, citosina arabinosida, taxol, vinblastina, vincristina, doxorrubicina, actinomicina D, mitramicina, carmustina, lomustina, semustina, estreptozotocina, hidroxiureia, cisplatina, mitotano, procarbazina, dacarbazina e dibromomanitol. Examples include, inter alia, cyclophosphamide, azathioprine, cyclosporin A, prednisolone, melphalan, chlorambucil, mechlorethamine, busulphan, methotrexate, 6-mercaptopurine, thioguanine, cytosine arabinoside, taxol, vinblastine, vincristine, doxorubicin, actinomycin D, mithramycin, carmustine, lomustine , semustine, streptozotocin, hydroxyurea, cisplatin, mitotane, procarbazine, dacarbazine and dibromomannitol. Agentes anti-proliferativos que causam erros de replicação de ácidos nucleicos ou inibem a replicação do ácido nucleico são aqueles como análogos de nucleosídeo e nucleotídeo (por exemplo, AZT ou 5-AZC). anti-proliferative agents that cause nucleic acid replication errors or inhibit nucleic acid replication are those as nucleoside and nucleotide analogues (e.g., AZT or 5-AZC).

Noutra modalidade, o anticorpo anti-LOX pode ser conjugado com um "recetor" In another embodiment, the anti-LOX antibody may be conjugated to a & quot; receptor & quot; (tal como estreptavidina) para utilização na pré-direção de tumor em que o conjugado anticorpo-recetor é administrado ao paciente, seguido da remoção de conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de eliminação e depois administração de um "ligando" (Such streptavidin) for utilization in tumor pre-direction wherein the antibody-receptor conjugate is administered to the patient, followed by unbound circulating conjugate removal using a clearing agent and then administration of a & quot; ligand & quot; (por exemplo, avidina) que é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionuclídeo). (E.g., avidin) which is conjugated to a cytotoxic agent (e.g., a radionuclide).

Metodologia para rotular polipeptídeos e fragmentos dos mesmos incluindo, mas não limitados a, é aquela providenciada aqui bem conhecida na arte. Methods for labeling polypeptides and fragments thereof including, but not limited to, those provided herein is well known in the art. Quando os anticorpos da presente invenção são rotulados com um radio-rótulo ou toxina, os anticorpos podem ser preparados como composições farmacêuticas que são úteis para tratamento terapêutico de pacientes onde as composições farmacêuticas são administradas ao paciente numa quantidade eficaz. When the antibodies of the present invention are labeled with a radio-label or toxin, antibodies can be prepared as pharmaceutical compositions which are useful for therapeutic treatment of patients where the pharmaceutical compositions are administered to the patient in an effective amount. Quando os anticorpos da presente invenção são rotulados com um rótulo que pode ser visualizado, os anticorpos podem ser preparados como composições farmacêuticas que são úteis para diagnóstico de pacientes onde as composições farmacêuticas são administradas ao paciente numa quantidade eficaz para tomografia in vivo ou onde as composições farmacêuticas são testadas num ensaio in vitro. When the antibodies of the present invention are labeled with a label that can be visualized, the antibodies may be prepared as pharmaceutical compositions that are useful for diagnosis of patients where the pharmaceutical compositions are administered to the patient in an amount effective to scan in vivo or in which compositions drug are tested in an in vitro assay. V. Composições V. compositions

Cada um dos anticorpos da presente invenção pode ser utilizado como uma composição quando combinado com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Each of the antibodies of the present invention can be used as a composition when combined with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Tais composições farmacêuticas são úteis para administração a um sujeito in vivo ou ex vivo e para diagnosticar e/ou tratar um sujeito com os anticorpos revelados, por exemplo. Such pharmaceutical compositions are useful for administration to a subject in vivo or ex vivo, and for diagnosing and / or treating a subject with the disclosed antibodies, for example.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis são fisiologicamente aceitáveis ao paciente administrado e retêm as propriedades terapêuticas dos anticorpos ou péptidos com os quais é administrado. Pharmaceutically acceptable carriers are physiologically acceptable to the administered patient and retain the therapeutic properties of peptides or antibodies to which it is administered. Veículos farmaceuticamente aceitáveis e suas formulações são e, em geral, descritos em, por exemplo, Pharmaceutical Sciences de Remington (18a Edição, editor A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990) . and pharmaceutically acceptable carriers and their formulations are generally described in, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990). Um veículo farmacêutico exemplar é solução salina fisiológica. An exemplary pharmaceutical carrier is physiological saline. A frase "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme utilizada aqui, significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um preenchidor líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material encapsulante, envolvido no transporte ou carregamento de anticorpos sujeitos ou péptidos do local de administração de um orgão, ou porção do corpo, para outro orgão, ou porção do corpo. The phrase & quot; pharmaceutically acceptable & quot carrier ;, as used herein, means a material, composition or pharmaceutically acceptable carrier, such as a liquid or solid preenchidor, diluent, excipient, solvent or encapsulating material, involved in transport or loading subject antibodies or peptides the site of administration of an organ, or portion of the body, to another organ, or portion of the body. Cada veículo tem de ser "aceitável" Each carrier must be & quot; acceptable & quot; no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente. in the sense of being compatible with the other ingredients of the formulation and not harmful to the patient. Nem o veículo farmaceuticamente aceitável deveria alterar a atividade específica dos antagonistas. Neither should the pharmaceutically acceptable carrier alter the specific activity of the antagonists. Veículos e excipientes exemplares foram providenciado noutro local aqui. Vehicles and excipients specimens were arranged elsewhere herein.

Num aspeto, a presente invenção providencia composições farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis incluindo solventes (aquosos ou não aquosos), soluções, emulsões, meios de dispersão, revestimentos, agentes de retardamento ou promoção da absorção e isotónicos, compatíveis com administração farmacêutica. In one aspect, the present invention provides pharmaceutically acceptable compositions including solvents or physiologically acceptable (aqueous or non-aqueous), solutions, emulsions, dispersion media, coatings, delaying or promoting agents isotonic and absorption, compatible with pharmaceutical administration. Composições farmacêuticas ou formulações farmacêuticas referem-se, portanto, a uma composição adequada para utilização farmacêutica num sujeito. Pharmaceutical compositions or pharmaceutical formulations refers therefore to a composition suitable for pharmaceutical use in a subject. As composições e formulações farmacêuticas incluem uma quantidade de um composto da invenção, por exemplo, uma quantidade eficaz de um antagonista da invenção e um veiculo farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável. The pharmaceutical compositions and formulations include an amount of a compound of the invention, e.g., an effective amount of an antagonist of the invention and a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier.

Composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem compatíveis com uma via de administração particular, sistémica ou local. Pharmaceutical compositions may be formulated to be compatible with a particular route of administration, systemic or local. Assim, composições farmacêuticas incluem veículos, diluentes ou excipientes adequados para administração por várias vias. Thus, pharmaceutical compositions include carriers, diluents or excipients suitable for administration by various routes.

Numa invenção adicional, as composições da presente invenção compreendem ainda um aditivo farmaceuticamente aceitável de modo a melhorar a estabilidade do antagonista na composição e/ou para controlar a taxa de libertação da composição. In a further invention, the compositions of the present invention further comprise a pharmaceutically acceptable additive to improve the stability of the antagonist in the composition and / or to control the release rate of the composition. Aditivos farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção não alteram a atividade especifica do antagonista sujeito. Pharmaceutically acceptable additives of the present invention do not change the specific activity of the subject antagonist. Um aditivo farmaceuticamente aceitável preferível é um açúcar, tal como manitol, sorbitol, glicose, xilitol, trehalose, sorbose, sacarose, galactose, dextrano, dextrose, frutose, lactose e misturas dos mesmos. A preferable pharmaceutically acceptable additive is a sugar such as mannitol, sorbitol, glucose, xylitol, trehalose, sorbose, sucrose, galactose, dextran, dextrose, fructose, lactose, and mixtures thereof. Aditivos farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser combinados com veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como dextrose. Pharmaceutically acceptable additives of the present invention may be combined with carriers and / or excipients such as dextrose. Em alternativa, aditivo farmaceuticamente aceitável preferível é um tensoativo, tal como polissorbato 20 ou polissorbato 80 para aumentar a estabilidade do péptido e diminuir a gelificação da solução farmacêutica. Alternatively, preferred pharmaceutically acceptable additive is a surfactant, such as polysorbate 20 or polysorbate 80 to increase stability of the peptide and decrease gelling of the pharmaceutical solution. O tensoativo pode ser adicionado à composição numa quantidade de 0,01 % a 5% da solução. The surfactant can be added to the composition in an amount of 0.01% to 5% of the solution. A adição de tais aditivos farmaceuticamente aceitáveis aumenta a estabilidade e meia-vida da composição no armazenamento. The addition of such pharmaceutically acceptable additives increases the stability and half-life of the composition in storage. Métodos de formulação e entrega serão, em geral, adaptados de acordo com o local e a doença a ser tratada. formulation and delivery methods are generally adapted according to the location and the disease being treated. Formulações exemplares incluem, mas não se limitam, aquelas adequadas para administração parentérica, por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, intramuscular ou subcutânea, incluindo formulações encapsuladas em micelas, lipossomas ou cápsulas libertadoras de fármaco (agentes ativos incorporados num revestimento biocompatível desenhado para libertação lenta); Exemplary formulations include, but are not limited to, those suitable for parenteral administration, e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular or subcutaneous injection, including formulations encapsulated in micelles, liposomes or drug releasing capsules (active agent incorporated in a biocompatible coating designed for slow release); formulações ingeriveis; ingestible formulations; formulações para utilização tópica, tais como cremes, unguentos e géis; Formulations for topical use, such as creams, ointments and gels; e outras formulações, tais como inaladores, aerossóis e vaporizadores. and other formulations such as inhalants, aerosols and sprays. A dosagem dos compostos da invenção variarão de acordo com a extensão e severidade da necessidade para tratamento, da atividade da composição administrada, do estado geral de saúde do sujeito e de outras considerações bem conhecidas do artesão habilitado. The dosage of the compounds of the invention will vary according to the extent and severity of the need for treatment, the activity of the administered composition, the general health of the subject, and other considerations well known to the artisan enabled.

Formulações ou administração entérica (oral) podem sr contidas num comprimido (revestido ou não revestido), cápsula (dura ou mole), microsfera, emulsão, pó, grânulo, cristal, suspensão, xarope ou elixir. Formulations or enteral (oral) may SR contained in a tablet (coated or uncoated), capsule (hard or soft), microsphere, emulsion, powder, granule, crystal, suspension, syrup or elixir. Veículos sólidos não tóxicos convencionais que incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio, podem ser utilizados para preparar formulações sólidas. conventional nontoxic solid carriers which include, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talcum, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate, may be used for preparing solid formulations. Compostos ativos suplementares (por exemplo, agentes conservantes, antibacterianos, antivirais e antifúngicos) também podem ser incorporados nas formulações. Supplementary active compounds (e.g., preservatives, antibacterial, antiviral and antifungal agents) can also be incorporated into the formulations. Uma formulação liquida também pode ser utilizada para administração entérica. A liquid formulation can also be used for enteral administration. 0 veículo pode ser selecionado de vários óleos incluindo petróleo, animal, vegetal ou sintético, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo. 0 carrier can be selected from various oils including petroleum, animal, vegetable or synthetic, for example, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil. Excipientes farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, amido, celulose, talco, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de magnésio, estearato de sódio, monostearato de glicerol, cloreto de sódio, leite magro seco, glicerol, propilenoglicol, água, etanol. Suitable pharmaceutical excipients include e.g., starch, cellulose, talc, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, magnesium stearate, sodium stearate, glycerol monostearate, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene glycol, water, ethanol.

Composições farmacêuticas para entrega entérica, parentérica ou transmucosal incluem, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução de Hank, solução de Ringer, dextrose/solução salina e soluções de glicose. Pharmaceutical compositions for enteral delivery, parenteral or transmucosal include, for example, water, saline, buffered saline, Hank's solution, Ringer's solution, dextrose / saline, and glucose solutions. As formulações podem conter substâncias auxiliares para aproximar condições fisiológicas, tais como agentes tamponantes, agentes de ajuste de tonicidade, agentes humidificantes, detergentes e afins. The formulations can contain auxiliary substances to approximate physiological conditions, such as buffering agents, tonicity adjusting agents, wetting agents, detergents and the like. Aditivos também podem incluir ingredientes ativos adicionais, tais como agentes bactericidas ou estabilizadores. Additives can also include additional active ingredients such as bactericidal agents, or stabilizers. Por exemplo, a solução pode conter acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano ou oleato de trietanolamina. For example, the solution can contain sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolaurate or triethanolamine oleate. Formulações e métodos parentéricos adicionais são descritos em Bai (1997) J. Neuroimmunol. Additional parenteral formulations and methods are described in Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65 75; 80:65 75; Warren (1997) J. Neurol. Warren (1997) J. Neurol. Sei. Know. 152:31 38; 152: 31 38; e Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507 515. A preparação parentérica pode ser encerrada em âmpolas, seringas descartáveis ou frascos de vidro ou plástico de doses múltiplas. and Tonegawa (1997) J Exp Med 186:.. 507 515. The parenteral preparation can be enclosed in ampules, disposable syringes or glass or plastic bottles in multiple doses.

Composições farmacêuticas para administração intradérmica ou subcutânea podem incluir um diluente estéril, tal como água, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; Pharmaceutical compositions for intradermal or subcutaneous administration can include a sterile diluent, such as water, saline solution, fixed oils, polyethylene glycols, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents; agentes antibacterianos, tais como álcool benzilico ou metil parabenos; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; antioxidants, tais como ácido ascórbico, glutationa ou bissulfito de sódio; antioxidants such as ascorbic acid, glutathione or sodium bisulfite; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminatetraacético; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose. buffers such as acetates, citrates or phosphates and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose.

Composições farmacêuticas para injeção incluem soluções ou dispersões aquosas (onde solúvel em água) e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Pharmaceutical compositions for injection include aqueous dispersions or solutions (where water soluble) and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, bacteriostatic water, Cremophor EL ™ (BASF, Parsippany, NJ) or phosphate buffered saline (PBS). O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e afins) e misturas adequadas dos mesmos. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof. A fluidez pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pela utilização de tensoativos. The fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Agentes antibacterianos e antifúngicos incluem, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e timerosal. antibacterial agents and antifungal agents include, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid and thimerosal. Agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol e cloreto de sódio podem ser incluídos na composição. isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, and sodium chloride can be included in the composition. As soluções resultants podem ser embaladas para utilização como tal ou liofilizadas; The resultants solutions may be packaged for use as is, or lyophilized; a preparação liofilizada pode ser combinada posteriormente com uma solução estéril antes da administração. The lyophilized preparation can later be combined with a sterile solution prior to administration.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem conter um composto que estabiliza, aumenta ou retarda a absorção ou eliminação. Pharmaceutically acceptable carriers can contain a compound that stabilizes, increases or delays absorption or elimination. Tais compostos incluem, por exemplo, carbohidratos, tais como glicose, sacarose ou dextranos; Such compounds include, for example, carbohydrates, such as glucose, sucrose or dextrans; proteínas de baixo peso molecular; low molecular weight proteins; composições que reduzem a eliminação ou hidrólise de péptidos; compositions that reduce the elimination or hydrolysis of peptides; ou excipientes ou outros estabilizadores e/ou tampões. or excipients or other stabilizers and / or buffers. Agentes que retardam a absorção incluem, por exemplo, monostearato de alumínio e gelatina. Agents that delay absorption include, for example, aluminum monostearate and gelatin. Também podem ser utilizados detergentes para estabilizar ou para aumentar ou diminuir a absorção da composição farmacêutica, incluindo veículos lipossómicos. Also detergents can be used to stabilize or to increase or decrease the absorption of the pharmaceutical composition, including liposomal carriers. Para proteger da digestão o composto pode ser complexado com uma composição para o tornar resistente à hidrólise enzimática e acídica ou o composto pode ser complexado num veículo apropriadamente resistente, tal como um lipossoma. To protect from digestion the compound can be complexed with a composition to render it resistant to acidic and enzymatic hydrolysis, or the compound can be complexed in an appropriately resistant carrier such as a liposome. Meios de proteger compostos da digestão são conhecidos na arte (ver, por exemplo, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; e Patente USN° 5 391 377 que descrevem composições lipídicas para entrega oral de agentes terapêuticos). Means of protecting compounds from digestion are known in the art (see, e.g., Fix (1996) Pharm Res 13: 1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm Pharmacol 48:... 119 135; and US Patent No. 5,391,377 describing lipid compositions for oral delivery of therapeutic agents).

Para administração transmucosal ou transdérmica, são utilizados na formulação penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada. For transmucosal or transdermal administration, penetrants are used in the formulation appropriate to the barrier to be permeated. Tais penetrantes são, em geral, conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. Such penetrants are generally known in the art, and include, for example, for transmucosal administration, detergents, bile salts, and fusidic acid derivatives. A administração transmucosal pode ser através de vaporizadores nasais ou supositórios (ver, por exemplo, Sayani (1996) "Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae" Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85 184) . Transmucosal administration may be through nasal sprays or suppositories (see, e.g., Sayani (1996) & quot; Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae & quot;... Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 13:85 184). Para administração transdérmica, o composto ativo pode ser formulado em unguentos, salvas, géis ou cremes como, em geral, conhecidos na arte. For transdermal administration, the active compound may be formulated into ointments, salves, gels, or creams as generally known in the art. Sistemas de entrega transdérmica também podem ser conseguidos utilizando emplastros. Transdermal delivery systems can also be achieved using patches.

Para entrega de inalação, a formulação farmacêutica pode ser administrada na forma de um aerossol ou borrifo. For inhalation delivery, the pharmaceutical formulation may be administered as an aerosol or spray. Para administração de aerossol, a formulação pode ser fornecida numa forma finamente dividida juntamente com um tensoativo e propulsor. For aerosol administration, the formulation can be supplied in finely divided form along with a surfactant and propellant. Noutra modalidade, o dispositivo para entregar a formulação ao tecido respiratório é no qual a formulação vaporiza. In another embodiment, the device for delivering the formulation to respiratory tissue is in which the formulation vaporizes. Outros sistemas de entrega conhecidos na arte incluem aerossóis de pó seco, sistemas de entrega líquidos, inaladores, nebulizadores de ar a jato e sistemas propulsores (ver, por exemplo, Patton (1998) Biotechniques 16:141 143; Dura Pharmaceuticals, San Diego, Calif.; Aradigm, Hayward, Calif.; Aerogen, Santa Clara, Calif.; e Inhale Therapeutic Systems, San Carlos, Calif.). Other delivery systems known in the art include dry powder aerosols, liquid delivery systems, inhalers, nebulizers air jet and propellant systems (see, e.g., Patton (1998) Biotechniques 16: 141 143; Dura Pharmaceuticals, San Diego, Calif .; Aradigm, Hayward, Calif .; Aerogen, Santa Clara, Calif .; and Inhale Therapeutic Systems, San Carlos, Calif.).

Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tais como etileno vinilo acetato, polianidretos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polianidretos, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Métodos de preparação de tais formulações são conhecidos daqueles habilitados na arte. Preparation methods of such formulations are known to those skilled in the art. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossómicas (incluindo lipossomas dirigidos a células ou tecidos utilizando anticorpos ou proteínas de revestimento virai) também podem ser utilizadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. The materials can also be obtained commercially from Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomal suspensions (including liposomes targeted to cells or tissues using antibodies or viral coat proteins) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Estas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na arte, por exemplo, conforme descrito nas Patentes USN°s 4 235 871; These can be prepared according to methods known in the art, for example as described in U.S. USN paragraphs 4,235,871; 4 501 728; 4,501,728; 4 522 811; 4,522,811; 4 837 028; 4,837,028; 6 110 490; 6,110,490; 6 096 716; 6,096,716; 5 283 185; 5,283,185; 5 279 833; 5,279,833; Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. 1:197 210; 1: 197 210; Alving (1995) Immunol. Alving (1995) Immunol. Rev. 145: 5 31; Rev. 145: 5 31; e Szoka (1980) Ann. and Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Rev. Biophys. Bioeng. Bioeng. 9:467). 9: 467). Microsferas ou cápsulas biodegradáveis ou outras configurações biodegradáveis de polímero capazes de entrega prolongada de pequenas moléculas, incluindo péptidos, são conhecidas na arte (ver, por exemplo, Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16:153 157) . Biodegradable microspheres or capsules or other biodegradable polymer configurations capable of sustained delivery of small molecules including peptides are known in the art (see, e.g., Putney (1998) Nat Biotechnol 16:.. 153 157). Compostos da invenção podem ser incorporados em micelas (ver, por exemplo, Suntres (1994) J. Pharm. Pharmacol. 46 :23 28; Woodle (1992) Pharm. Res. 9:260 265) . Compounds of the invention may be incorporated into micelles (see, e.g., Suntres (1994) J. Pharm Pharmacol 46: 23 28; Woodle (1992) Pharm Res. 9:. 260 265..). Antagonistas podem ser anexados à superfície da monocamada ou bicamada lipídica. Antagonists can be attached to the surface of the monolayer or bilayer lipid. Por exemplo, os antagonistas podem ser anexados a lipossomas contendo hidrazida-PEG-(distearoil-fosfatidi-1) etanolamina (ver, por exemplo, Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6: 705 708) . For example, antagonists can be attached to hydrazide-containing PEG-liposomes (fosfatidi-distearoyl-1) Ethanolamine (see, e.g., Zalipsky (1995) Bioconjug Chem 6:.. 705 708). Em alternativa, pode ser utilizada qualquer forma de membrana lipídica, tal como uma membrana lipídica planar ou a membrana celular de uma célula intacta, por exemplo, uma célula vermelha sanguínea. Alternatively, it may be used any form of lipid membrane, such as a planar lipid membrane or the cell membrane of an intact cell, e.g., a red blood cell. As formulações que contêm lipossomas e lípidos podem ser entregues por qualquer meio, incluindo, por exemplo, administração intravenosa, transdérmica (ver, por exemplo, Vutla (1996) J. Pharm. Sei. 85:5 8), transmucosal ou oral. Formulations containing liposomes and lipid can be delivered by any means, including, for example, intravenous, transdermal (see, e.g., Vutla (1996) J. Pharm Sci. 85:. 5 8), transmucosally, or orally.

As composições da presente invenção podem ser combinadas com outras frações terapêuticas ou frações de tomografia/diagnósticas, conforme providenciadas aqui. The compositions of this invention may be combined with other therapeutic fractions or fractions tomography / diagnostic, as provided herein. As frações terapêuticas e/ou frações de tomografia podem ser providenciadas como composições separadas ou como uma fração conjugada. Therapeutic fractions and / or fractions tomography may be provided as separate compositions or as a conjugate fraction. Podem ser incluídos ligantes para frações conjugadas conforme necessário e foram descritas noutro local aqui. Binders may be included to fractions combined as required and are described elsewhere herein.

Os anticorpos revelados aqui também podem ser formulados como imunolipossomas. The antibodies disclosed herein may also be formulated as immunoliposomes. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados pelos métodos conhecidos na arte, tais como descritos em Epstein et ai., Proc. Liposomes containing the antibody are prepared by methods known in the art, such as described in Epstein et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sei. Know. USA, 82: 3688 (1985); USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Hwang et al., Proc. Natl Acad. Natl Acad. Sei. Know. USA, 77: 4030 (1980); USA, 77: 4030 (1980); e Patentes USN°s 4 485 045 e 4 544 545. Lipossomas com tempo de circulação potenciado são revelados na Patente USN° 5 013 556. Patent and paragraphs USN 4485045 and 4 544 545. Liposomes with enhanced circulation time are disclosed in US Patent No. 5,013,556.

Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica que compreende fosfatidileolina, cholesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Particularly useful liposomes can be generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Lipossomas são expulsos através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Liposomes are expelled through the pore size filter set to yield liposomes with the desired diameter. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados com os lipossomas, conforme descrito em Martin et al. Fab 'fragments of the antibody of the present invention can be conjugated to the liposomes as described in Martin et al. , J. Biol. J. Biol. Chem., 257: 286 288 (1982) através de uma reação de intercâmbio dissulfido. Chem., 257: 286 288 (1982) via a disulfide interchange reaction. Um agente quimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) está opcionalmente contido no lipossoma. A chemotherapeutic agent (such as Doxorubicin) is optionally contained within the liposome. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989). See Gabizon et al J. National Cancer Inst, 81 (19):.. 1484 (1989).

Também podem ser utilizados lipofeções ou lipossomas para entregar o anticorpo anti-LOX ou um fragmento de anticorpo nas células. Lipofeções or liposomes can also be used to deliver anti-LOX antibody or an antibody fragment, into cells. Onde são utilizados fragmentos de anticorpo, pode ser utilizado o fragmento inibitório mais pequeno que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Where antibody fragments are used, it may be used the smallest inhibitory fragment that specifically binds to the target protein binding domain. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, podem ser desenhadas moléculas peptídicas que retêm a capacidade de ligar a sequência proteica alvo. For example, based on the variable region sequences of an antibody, peptide molecules can be designed that retain the ability to bind the target protein sequence. Tais péptidos podem ser sintetizados quimicamnete e/ou produzidos por tecnologia de ADN recombinante. Such peptides can be synthesized quimicamnete and / or produced by recombinant DNA technology. Ver, por exemplo, Marasco et al., Proc. See, e.g., Marasco et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sei. Know. USA, 90: 7889 7893 (1993) . USA, 90: 7889 7893 (1993). A formulação aqui também pode conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, incluindo, por exemplo, aqueles com atividades complementares que não afetam de forma adversa um ao outro. The formulation herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, including, for example, those with complementary activities that do not affect each other adversely. Em alternativa, ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente que potência a sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor do crescimento. Alternatively, or additionally, the composition may comprise an agent that enhances its function, such as, for example, a cytotoxic agent, cytokine, chemotherapeutic agent, or growth-inhibitory agent. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido. Such molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended. Os ingredientes ativos também podem ser presos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respetivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. The active ingredients may also be trapped in microcapsules prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methylmethacylate) microcapsules, respectively, in colloidal delivery systems for drugs ( for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or in macroemulsions. Tais técnicas são reveladas em Pharmaceutical Sciences de Remington, supra. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Formulações para administração in vivo são estéreis. Formulations for in vivo administration are sterile. A esterilização pode ser conseguida rapidamente através de filtração por membranas de filtração estéreis. Sterilization can be accomplished quickly by filtration through sterile filtration membranes.

Podem ser preparadas preparações de libertação prolongada. sustained release preparations may be prepared. Exemplos adequados de preparações de libertação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are in the form of shaped articles, e.g., films, or microcapsules. Exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactidos (Patente USN° 3 773 919), copolímeros de L-ácido glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradável, tais como os LUPRON DEPOT® (microsferas injetáveis compostas de copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolido) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Examples of sustained-release matrices include polyesters, hydrogels (e.g., poly (2-hydroxyethyl-methacrylate), or poly (vinylalcohol)), polylactides (US Patent No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and γ ethyl- L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate copolymers, degradable lactic acid-glycolic acid, such as Lupron Depot (injectable microspheres composed of lactic acid-glycolic copolymer acid and leuprolide acetate) and poly-D - (- ) -3-hydroxybutyric acid. Ao passo que polímeros tais como etileno vinil acetato e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas por períodos de tempo mais curtos. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid enable release of molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter time periods. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante muito tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda da atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. When encapsulated antibodies remain in the body for a long time, they may denature or aggregate as a result of exposure to moisture at 37 ° C, resulting in a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Estratégias racionais podem ser planificadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Rational strategies can be planned for stabilization depending on the mechanism involved. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser formação de ligação SS intermolecular através de intercâmbio tio-dissulfido, a estabilização pode ser conseguida modificando resíduos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluções acídicas, controlando o conteúdo em humidade, utilizando aditivos apropriados e desenvolvendo composições de matriz de polímero específicas. For example, if the aggregation mechanism is discovered to be intermolecular SS bond formation through thio-disulfide interchange, stabilization may be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilizing from acidic solutions, controlling moisture content, using appropriate additives, and developing specific polymer matrix compositions. Várias outras composições farmacêuticas e técnicas para a sua preparação e utilização serão conhecidas daqueles habilitados na arte à luz da presente revelação. Several other pharmaceutical compositions and techniques for their preparation and use would be known to those skilled in the art in light of the present disclosure. Para uma listagem detalhada de composições farmacológicas adequadas e técnicas administrativas associadas é possível referenciar os ensinamento detalhados aqui, que podem ser ainda suplementados por textos, tais como Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a Edição (Lippincott, Williams & Wilkins 2003) . For a detailed listing of suitable pharmacological compositions and associated administrative techniques can reference the teaching detailed here, which may be further supplemented by texts such as Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition (Lippincott, Williams & Wilkins 2003).

Composições farmacêuticas contempladas pela presente invenção foram descritas anteriormente. Pharmaceutical compositions contemplated by the present invention have been described above. Numa modalidade da presente invenção, as composições farmacêuticas são formuladas para serem livres de pirogénios de modo que são aceitáveis para administração a pacientes humanos. In one embodiment of the present invention, the pharmaceutical compositions are formulated to be free of pyrogens such that they are acceptable for administration to human patients. Testar composições farmacêuticas para pirogénios e preparar composições farmacêuticas livres de pirogénios são bem compreendidos de alguém com habilitação comum na arte. Testing pharmaceutical compositions for pyrogens and preparing pharmaceutical compositions free of pyrogens are well understood to one of ordinary skill in the art.

Uma modalidade da presente invenção contempla a utilização de qualquer uma das composições farmacêuticas da presente invenção para fazer um medicamento para tratar um distúrbio da presente invenção. An embodiment of the present invention contemplates the use of any of the pharmaceutical compositions of the present invention to make a medicament for treating a disorder of the present invention. Medicamentos podem ser formulados com base nas caracteristicas físicas do paciente/sujeito em necessidade do tratamento e podem ser formulados em formulações únicas ou múltiplas com base no estádio do tecido cancerígeno. Drugs may be formulated based on the physical characteristics of the patient / subject in need of treatment and can be formulated in single or multiple formulations based on the stage of the cancer tissue. Medicamentos da presente invenção podem ser embalados num pacote farmacêutico adequado com rótulos apropriados para a distribuição a hospitais e clínicas em que o rótulo é para a indicação de tratar um distúrbio conforme descrito aqui num sujeito. Medicines of the present invention may be packaged in a suitable pharmaceutical package suitable labels for distribution to hospitals and clinics where the label is for the indication of treating a disorder in a subject as described herein. Medicamentos podem ser embalados como unidades únicas ou múltiplas. Drugs may be packaged as single or multiple units. Instruções para a dosagem e administração das composições farmacêuticas da presente invenção podem ser incluídas com os pacotes farmacêuticos e kits descritos a seguir. Instructions for dosage and administration of the pharmaceutical compositions of the present invention may be incorporated with pharmaceutical packs and kits described below. VI. SAW. Purificação da afinidade Affinity Purification

Os anticorpos anti-L0XL2 descritos aqui são úteis para purificação da afinidade de L0XL2 a partir de cultura de células recombinantes, fontes naturais ou amostras de biópsia de tecido (tecido e/ou soro). The anti-L0XL2 antibodies described herein are useful for affinity purification of L0XL2 from recombinant cell culture, from natural sources or tissue biopsy samples (tissue and / or serum). Neste processo, anticorpos contra L0XL2 são imobilizados num suporte adequado, tal como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na arte. In this process, L0XL2 antibodies are immobilized on a suitable support, such a Sephadex resin or filter paper, using methods well known in the art. 0 anticorpo imobilizado é depois contactado com uma amostra que contém a L0XL2 a ser purificada e, depois disso, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto a L0XL2, que é ligada ao anticorpo imobilizado. 0 immobilized antibody then is contacted with a sample containing the L0XL2 to be purified, and thereafter the support is washed with a suitable solvent that will remove substantially all the material in the sample except the L0XL2, which is bound to the immobilized antibody. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado que libertará a L0XL2 do anticorpo. Finally, the support is washed with another suitable solvent that will release the L0XL2 antibody. VII. VII. Pacotes e Kits Packages and Kits

Uma modalidade do presente pedido inclui um pacote ou kit farmacêutico útil para os métodos providenciados aqui. One embodiment of the present application includes a pharmaceutical pack or kit useful for the methods provided herein. Uma modalidade de tais pacotes ou kits farmacêuticos inclui preparações (composições) dos antagonistas, conforme providenciados aqui. One embodiment of such pharmaceutical kits or packages include preparations (compositions) antagonists as provided herein.

Um aspeto da presente invenção relaciona-se com kits para realizarem a administração de um inibidor de L0XL2. One aspect of the invention relates to kits for carrying out the administration of an inhibitor L0XL2. Outro aspeto da presente invenção relaciona-se com kits para realizarem a administração combinada do inibidor de L0XL2 com um ou mais outros agentes terapêuticos. Another aspect of the invention relates to kits for carrying out the combined administration of L0XL2 inhibitor with one or more other therapeutic agents. Numa modalidade, o kit compreende um inibidor de L0XL2 formulado num veiculo ou excipiente farmacêutico e pelo menos um agente terapêutico que não é dito inibidor de L0XL2, formulado conforme apropriado, numa ou mais preparações farmacêuticas separadas. In one embodiment, the kit comprises a L0XL2 inhibitor formulated in a pharmaceutical carrier or excipient and at least one therapeutic agent that is not said L0XL2 inhibitor, formulated as appropriate in one or more separate pharmaceutical preparations.

Pacotes e kits farmacêuticos podem adicionalmente incluir um excipiente, um veiculo, um agente tamponante, um conservante ou um agente estabilizante numa formulação farmacêutica. Pharmaceutical Packages and kits can additionally include an excipient, a carrier, a buffering agent, a preservative or a stabilizing agent in a pharmaceutical formulation. Cada componente do kit pode ser encerrado num recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de um único pacote. Each component of the kit can be enclosed within an individual container and all of the various containers can be within a single package. Os kits da invenção podem ser desenhados para armazenamento à temperatura ambiente ou no frio. The kits of the invention can be designed for storage at room temperature or in the cold.

Adicionalmente, as preparações pode conter estabilizadores para aumentar o prazo de validade dos kits e incluir, por exemplo, albumina do soro bovina (BSA) ou outros estabilizadores convencionais conhecidos. In addition, the preparations may contain stabilizers to enhance the shelf life of the kits and include, for example, bovine serum albumin (BSA) or other known conventional stabilizers. Onde as composições são liofilizadas, o kit pode ainda conter preparações de soluções para reconstituir as preparações. Where the compositions are lyophilized, the kit may further contain preparations of solutions to reconstitute the preparations. Soluções aceitáveis são bem conhecidas na arte e incluem, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato farmaceuticamente aceitável (PBS). Acceptable solutions are well known in the art and include, for example, phosphate buffered saline pharmaceutically acceptable phosphate (PBS).

Adicionalmente, os pacotes ou kits farmacêuticos providenciados aqui podem ainda incluir qualquer uma das outras frações providenciadas aquim tais como, por exemplo, um agente quimioterapêutico conforme descrito noutro local com mais detalhe. Additionally, the package or pharmaceutical kits provided herein may further include any of the other fractions provided Achim such as, for example, a chemotherapeutic agent as described in more detail elsewhere.

Os pacotes e kits farmacêuticos da presente invenção podem ainda incluir os componentes para um ensaio providenciado aqui, tal como, por exemplo, um ensaio ELISA. The pharmaceutical packs and kits of the present invention may further include components for an assay provided herein, such as, for example, an ELISA assay. Em alternativa, preparações dos kits são utilizadas em imunoensaios, tais como imunohistoquímica para testar as secções de biópsia de tecido do paciente. Alternatively, kits of the preparations are used in immunoassays, such as immunohistochemical sections to test the patient's tissue biopsy. Os pacotes e kits farmacêuticos da presente invenção podem ainda incluir os componentes para colheita de uma amostra. The pharmaceutical packs and kits of the present invention may further include components to collect a sample.

Os pacotes e kits farmacêuticos da presente invenção podem ainda incluir um rótulo especificando, por exemplo, uma descrição do produto, modo de administração e indicação do tratamento. The pharmaceutical packs and kits of the present invention may further include a label specifying, for example, a product description, mode of administration and the treatment indication. Pacotes farmacêuticos providenciados aqui podem incluir qualquer uma das composições conforme descritas aqui. Pharmaceutical Packages provided herein can include any of the compositions as described herein. 0 pacote farmacêutico pode ainda incluir um rótulo para prevenir, reduzir o risco de ou tratar qualquer uma das indicações de doença descritas aqui. 0 pharmaceutical package may further include a label for preventing, reducing the risk of or treating any of the disease indications described herein. 0 termo "material de embalamento" 0 term & quot; packaging material & quot; refere-se a uma estrutura física que alberga os componentes do kit. It refers to a physical structure that houses the components of the kit. 0 material de embalamento pode manter os componentes esterilmente e pode ser feito de material vulgarmente utilizado para tais fins (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, lâmina, âmpolas, etc.). 0 packaging material can maintain the components sterilely, and can be made of material commonly used for such purposes (e.g., paper, corrugated fiber, glass, plastic, foil, ampules, etc.). 0 rótulo ou inserção de embalamento pode incluir instruções escritas apropriadas. 0 label or packaging insert can include appropriate written instructions. Kits da invenção podem, portanto, incluir adicionalmente rótulos ou instruções para utilizar os componentes do kit em qualquer método da invenção. Kits of the invention may therefore additionally include labels or instructions for using the kit components in any method of the invention. Um kit pode incluir um composto da invenção num pacote, ou dispensar juntamente com instruções para administrar o composto num método da invenção. A kit can include an invention compound in a pack or dispense along with instructions to administer the compound in a method of the invention.

Instruções podem incluir instruções para praticar qualquer um dos métodos da invenção descritos aqui incluindo métodos de tratamento, deteção, monitorização ou diagnósticos. Instructions can include instructions for practicing any of the methods of the invention described herein including treatment methods, detection, monitoring or diagnostic. Instruções podem adicionalmente incluir indicações de um ponto final clínico satisfatório ou quaisquer sintomas adversos que podem ocorrer ou informação adicional requerida pelas agências reguladoras, tais como a Administração de Fármacos e Alimentos para utilização num sujeito humano. Instructions may additionally include indications of a satisfactory clinical endpoint or any adverse symptoms that may occur, or additional information required by regulatory agencies such as the Food and Drug Administration for use in a human subject.

As instruções podem ser numa "maneira impressa," Instructions may be in a & quot; hard way, & quot; por exemplo, em papel ou cartão dentro ou afixado ao kit ou num rótulo afixado ao kit ou material de embalamento ou anexado a um frasco de vidro ou tubo que contém um componente do kit. for example, paper or cardboard within or affixed to the kit or on a label affixed to the kit or packaging material, or attached to a glass tube or vial containing a kit component. Instruções podem adicionalmente ser incluídas num meio lido por computador, tal como um disco (disquete ou disco duro) , CD ótico tal como CD- or DVD-ROM/RAM, fita magnética, meios de armazenamento elétrico tais como RAM e ROM, 1C tip e híbridos destes tais como meios de armazenamento magnéticos/óticos. Instructions may additionally be included in a medium readable by computer, such as a disk (floppy or hard disk), optical CD such as CD- or DVD-ROM / RAM, magnetic tape, electrical storage media such as RAM and ROM, 1C tip and hybrids of these such as magnetic / optical storage media.

As composições do kit da presente invenção podem ser formuladas em unidades únicas ou múltiplas para um único teste ou para testes múltiplos. Kit compositions of the present invention may be formulated for single or multiple units for a single test or for multiple tests.

Em modalidades preferidas, as preparações do kit estão livres de pirogénios. In preferred embodiments, the kit preparations are free from pyrogens. Métodos para testar a presença de, e/ou níveis específicos de, pirogénios são rotineiros na arte e estão comercialmente disponíveis kits para tal fim. Methods for testing the presence of, and / or specific levels of pyrogens are routine in the art and are commercially available kits for this purpose. É providenciado aqui um kit para tratar uma condição patológica associada com L0XL2, contendo uma composição de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descritos aqui e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Provided herein is a kit for treating a pathological condition associated with L0XL2, a composition containing an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. A condição patológica associada com L0XL2 pode ser, por exemplo, um tumor, uma metástase, angiogénese ou fibrose. The pathological condition associated with L0XL2 may be, for example, a tumor, a metastasis, angiogenesis and fibrosis. Numa modalidade, anticorpos em tais kits podem compreender um rótulo detetável, um rótulo terapêutico ou ambos. In one embodiment, antibodies in such kits may comprise a detectable label, a therapeutic label or both. Noutra modalidade, anticorpos em tais kits podem ser liofilizados. In another embodiment, antibodies in such kits may be lyophilized.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a kits para realizarem a administração combinada do inibidor de L0XL2 com outros compostos terapêuticos. Another aspect of the invention relates to kits for carrying out the combined administration of L0XL2 inhibitor with other therapeutic compounds. Numa modalidade, o kit compreende um inibidor de LOXL2 formulado num veiculo farmacêutico, e pelo menos um agente citotóxico, formulado conforme apropriado, numa ou mais preparações farmacêuticas separadas. In one embodiment, the kit comprises a LOXL2 inhibitor formulated in a pharmaceutical carrier, and at least one cytotoxic agent, formulated as appropriate in one or more separate pharmaceutical preparations. VIII. VIII. Métodos diagnósticos A presente invenção também providencia métodos para diagnosticar, monitorizar, encenar ou detetar as doenças descritas anteriormente utilizando agentes que reconhecem diferentes formas de L0XL2. Diagnostic Methods The present invention also provides methods for diagnosing, monitoring, staging or detecting the diseases described above using agents that recognize different forms of L0XL2. Por exemplo, conforme descrito anteriormente, anticorpos contra formas diferentes de L0XL2, a forma de pré-pró-proteína, segregada, madura ou ativa podem ser utilizados para estes fins. For example, as described above, antibodies against different forms of L0XL2 the form of pre-pro-protein, secreted, mature or active can be used for these purposes. Métodos de diagnosticar, monitorizar, encenar ou detetar as doenças descritas anteriormente utilizando agentes que reconhecem diferentes formas de L0XL2 pretende-se que abranjam todas as doenças e indicações descritas aqui. Methods of diagnosing, monitoring, staging or detecting the diseases described above using agents that recognize different forms of L0XL2 intended to cover all diseases and indications disclosed herein.

Conforme descrito anteriormente, a L0XL2 ativa é dividida e pode ser detetada em virtude da sua alteração no peso molecular (imunoblot) ou por utilização de anticorpos que detetam a forma não dividida vs. As described above, the active L0XL2 is divided and can be detected by virtue of its change in molecular weight (immunoblot) or by using antibodies which detect the form undivided vs. dividida da L0XL2 juntamente com a localização celular utilizando vários métodos de deteção, tais como imunohistoquímica (IHC). L0XL2 together with the divided cell using various location detection methods such as immunohistochemistry (IHC).

Pensa-se que a matriz extracelular e meio condicionado deveriam conter L0XL2 ativa proteoliticamente processada, ao passo que L0XI2 inativa, não dividida deveria ser localizada intracelularmente. It is believed that the extracellular matrix and conditioned medium should contain active L0XL2 proteolytically processed, whereas inactive L0XI2, undivided should be located intracellularly. Alguma L0XI2 ativa, dividida pode também ser detetada dentro da célula como uma consequência da captação do espaço extracelular. Some active L0XI2 divided can also be detected within the cell as a result of the uptake of extracellular space.

Amostras de indivíduos podem ser colhidas e analisadas determinando os níveis de LOX ativa ou inativa. Samples from individuals can be collected and analyzed by determining the levels of LOX active or inactive. Esta análise pode ser realizada antes da iniciação do tratamento utilizando terapêutica específica de lisil oxidase para identificar tumores com expressão ou atividade de L0XL2 ativa elevadas. This analysis can be performed prior to initiation of treatment using lysyl oxidase specific therapy to identify tumors with elevated expression or activity L0XL2 active. Tal análise diagnóstica pode ser realizada utilizando qualquer amostra, incluindo, mas não limitada a, células, proteínas ou extratos de membranas celulares, fluidos biológicos tais como cuspe, sangue, soro, plasma ou urina, ou amostras biológicas, tais como amostras de tecido, fixas em formalina ou secções de tecido congeladas. Such diagnostic analysis can be performed using any sample, including, but not limited to, cells, proteins or cell membrane extracts, biological fluids such as sputum, blood, serum, plasma or urine, or biological samples such as tissue samples, fixed in formalin or frozen tissue sections.

Qualquer método adequado para deteção e análise de L0XL2 inativa e/ou ativa pode ser empregue. Any suitable method for detection and analysis L0XL2 inactive and / or active can be employed. Conforme utilizado aqui, o termo "amostra" As used herein, the term & quot; sample & quot; refere-se a uma amostra de um humano, animal ou a uma amostra de investigação, por exemplo, uma célula, tecido, orgão, fluido, gás, aerossol, pasta fluida, colóide ou material coagulado. refers to a sample from a human, animal, or to a research sample, e.g., a cell, tissue, organ, fluid, gas, aerosol, slurry, colloid, or coagulated material. As amostras também incluem, mas não se limitam a, proteína ou extratos de membranas celulares, fluidos biológicos, tais como cuspe, sangue, soro, plasma ou urina ou amostras biológicas, tais como secções fixas em formalina ou de tecido congeladas empregando os anticorpos descritos aqui. Samples include, but are not limited to, protein or cell membrane extracts, biological fluids such as sputum, blood, serum, plasma or urine, or biological samples, such as frozen sections of formalin or tissue frozen using the antibodies described on here. 0 termo "amostra" 0 term & quot; sample & quot; também se pode referir a uma célula, tecido, orgão ou fluido que é colhido de fresco de um humano ou animal, ou a uma célula, tecido, orgão ou fluido que é processado ou armazenado. It can also refer to a cell, tissue, organ, or fluid that is freshly taken from a human or animal or a cell, tissue, organ, or fluid that is processed or stored. A amostra pode ser testada in vivo, por exemplo, sem remoção do humano ou animal ou pode ser testada in vitro. The sample can be tested in vivo, e.g., without removal from the human or animal can be tested in vitro. A amostra pode ser testada após processamento, por exemplo, por métodos histológicos. The sample may be tested after processing, e.g., by histological methods.

Podem ser utilizadas várias técnicas de ensaio diagnóstico conhecidas na arte, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios sandwich diretos ou indiretos e ensaios de imunoprecipitação conduzidos em fases heterogéneas ou homogéneas (Zola, Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) páginas 147-158) . They may be used various diagnostic assay techniques known in the art, such as competitive binding assays, direct or indirect sandwich assays and immunoprecipitation assays conducted in heterogeneous or homogeneous phases (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pages 147-158). Os anticorpos utilizados nos ensaios diagnósticos podem ser rotulados com uma fração detetável. The antibodies used in the diagnostic assays can be labeled with a detectable fraction. A fração detetável produz direta ou indiretamente um sinal detetável. The detectable fraction directly or indirectly produces a detectable signal. Por exemplo, a fração detetável pode ser qualquer uma das descritas aqui tais como, por exemplo, um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 355 ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescentes, tal como isotiocianato de fluoresceina (FITC), vermelho de Texas, cianina, fotociano, rodamina ou luciferina, ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de raíz-forte. For example, the detectable fraction may be any of those described herein such as, for example, a radioisotope, such as 3H, 14C, 32P, 355, or 125 I, a fluorescent or chemiluminescent compound, such as fluorescein isothiocyanate (FITC), Red Texas, cyanine, fotociano, rhodamine, or luciferin, or an enzyme, such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, or horseradish peroxidase. Qualquer método conhecido na arte para conjugar o anticorpo com a fração detetável pode ser empregue, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al. Any method known in the art for conjugating the antibody to the detectable fraction may be employed, including those methods described by Hunter et al. , Nature, 144:945 (1962); , Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); David et al, Biochemistry., 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); Meth, 40: 219 (1981);. e Nygren, J. Histochem. and Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982) . and Cytochem., 30: 407 (1982). É providenciado aqui um método de diagnosticar uma condição patológica associada com LOX ou LOXL2 que compreende avaliar um nível de LOXL2 numa amostra de um sujeito, em que uma Iteração no nível de L0XL2 na amostra em comparação com uma amostra referência indica a presença ou aumento de um tumor ou metástase. It is provided herein a method of diagnosing a pathological condition associated with LOX or LOXL2 comprising evaluating a level of LOXL2 a sample from a subject, wherein an Iteration in L0XL2 level in the sample compared to a reference sample indicates the presence or increase of a tumor or metastasis. Num aspeto, a condição patológica associada com LOXL2 é um tumor, uma metástase, angiogénese ou fibrose. In one aspect, the pathological condition associated with LOXL2 is a tumor, a metastasis, angiogenesis and fibrosis. Um aumento nos níveis de LOXL2 na amostra em comparação com uma amostra referência pode indicar a presença de um tumor ou metástase ou um aumento no crescimento do tumor ou metastático. An increase in the levels of LOXL2 in the sample compared to a reference sample may indicate the presence of a tumor or metastasis, or an increase in tumor or metastatic growth. A amostra referência pode ser uma amostra colhida do sujeito a um ponto temporal inicial ou uma amostra de outro indivíduo. The reference sample can be a sample taken from the subject at a starting time point or a sample from another individual. O nível dos níveis de LOXL2 na amostra pode ser detetada contactando a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito aqui. The level of LOXL2 levels in the sample can be detected by contacting the sample with an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein. Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é detetavelmente rotulado. In one embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof is detectably labeled.

Numa modalidade, é providenciado um método para diagnosticar metástase cancerígena num sujeito, compreendendo: avaliar os níveis de LOXL2 ativa ou atividade no sangue, pelos quais uma alteração nos níveis de L0XL2 ativa ou atividade (por exemplo, na expressão génica, atividade enzimática, etc.) no sangue em comparação com uma amostra referência, indica a presença de crescimento tumoral metastático. In one embodiment, a method is provided for diagnosing cancer metastasis in a subject, comprising: assessing the level of active LOXL2 or activity in the blood, by which a change in levels of active L0XL2 or activity (e.g., in gene expression, enzymatic activity, etc. .) in blood compared to a reference sample indicates the presence of metastatic tumor growth. Algumas ocasiões, os níveis de LOXL2 ativa ou atividades no sangue podem ser inferiores aos quando medidos inicialmente, o que pode indicar que o sujeito corre um risco maior de metástase cancerígena; Occasionally, active LOXL2 levels or activity in the blood may be lower than when first measured, which may indicate that the subject runs a greater risk of cancer metastasis; que o cancro metastasizou; metastasizou the cancer; ou que a metástase cancerígena aumentou. or that cancer metastasis has increased. A amostra referência pode ser derivada do mesmo sujeito, colhida do mesmo tumor num ponto temporal diferente ou de outro local do corpo ou de outro indivíduo. The reference sample can be derived from the same subject taken from the same tumor at a different time point or from another location of the body or another individual.

Noutra modalidade, é providenciado um método para diagnosticar metástase cancerígena num sujeito com um tumor, compreendendo: avaliar os níveis de L0XL2 ativo ou atividade no tumor, pelos quais uma alteração nos níveis de L0XL2 ativo ou atividade no tumor em comparação com uma amostra referência indica a presença de crescimento tumoral metastático. In another embodiment, a method is provided for diagnosing cancer metastasis in a subject having a tumor, comprising: assessing the active L0XL2 levels or activity in the tumor, by which a change in active L0XL2 levels or activity in the tumor compared to a reference sample indicates the presence of metastatic tumor growth. Nalgumas ocasiões, os níveis de L0XL2 ativo ou atividades no tumor podem ser superiores aos quando medidos inicialmente, o que pode indicar que o sujeito corre um risco maior de metástase cancerígena; In some occasions, L0XL2 levels active or activities in the tumor may be higher than when first measured, which may indicate that the subject runs a greater risk of cancer metastasis; que o cancro metastasizou; metastasizou the cancer; ou que a metástase cancerígena aumentou. or that cancer metastasis has increased. A amostra referência pode ser derivada do mesmo sujeito, colhida do mesmo tumor num ponto temporal diferente ou de outro local do corpo ou de outro indivíduo. The reference sample can be derived from the same subject taken from the same tumor at a different time point or from another location of the body or another individual.

Também é providenciado aqui um método para encenar o crescimento tumoral ou metástase num sujeito, compreendendo avaliar os níveis de L0XL2 (por exemplo, hL0XL2) num tumor do sujeito, pelos quais uma alteração no nível de L0XL2 (por exemplo, na expressão génica ou atividade enzimática) no tumor em comparação com uma amostra referência, indica a presença de crescimento tumoral metastático. Also provided herein is a method for staging tumor growth or metastasis in a subject comprising evaluating the levels of L0XL2 (e.g., hL0XL2) in a subject's tumor, by which a change in the level of L0XL2 (e.g., in gene expression or activity enzyme) in the tumor as compared to a reference sample indicates the presence of metastatic tumor growth. Nalgumas ocasiões, os níveis de L0XL2 ou atividades no tumor podem ser superiores aos quando medidos inicialmente para o mesmo sujeito ou superiores aos numa amostra referência colhida de um tecido normal, o que pode indicar que o paciente corre um risco maior de metástase do tumor; On some occasions, L0XL2 levels or activity in the tumor can be higher than when initially measured for the same subject or higher than a reference sample collected from a normal tissue which may indicate that the patient at greater risk of tumor metastasis; que o tumor metastasizou; metastasizou the tumor; que a metástase do tumor aumentou. that increased tumor metastasis. A encenação de cancros de tumores sólidos é bem conhecida. The staging of cancer of solid tumors is well known. 0 sistema TNM é um dos sistemas de encenação mais vulgarmente utilizados. 0 TNM system is the most commonly used staging system. Este sistema foi aceite pela União Internacional Contra Cancro (UICC) e pelo Comité This system has been accepted by the International Union Against Cancer (UICC) and the Committee

Conjunto Americano sobre Cancro (AJCC). American set on Cancer (AJCC). A maioria das instalações médicas utilizam o sistema TNM como o seu método principal de reportagem de cancro. Most medical facilities use the TNM system as their primary method of cancer reporting. PDQ®, a base de dados de cancro exaustiva do NCI, também utiliza o sistema TNM. PDQ®, the comprehensive cancer NCI database also uses the TNM system. 0 sistema TNM, referido aqui como "encenação," 0 TNM system, referred to herein as & quot; staged, & quot; é baseado na extensão do tumor, na extensão da propagação para os nódulos linfáticos e na presença de metástase. It is based on the extent of the tumor, the extent of spread to the lymph nodes and presence of metastasis.

Também é providenciado aqui um método para monitorizar uma resposta de um sujeito a uma terapêutica, incluindo um modulador de L0XL2, tal como o tratamento de cancro, tumores e doenças fibróticas. Also provided herein is a method for monitoring a response of a subject to a therapy including a modulator L0XL2, such as the treatment of cancer, tumors and fibrotic diseases. 0 método compreende: detetar uma alteração no nível de proteína reativa C no sujeito após administração de um modulador de L0XL2 ao sujeito, em que a alteração indica que o modulador de LOX ou LOXL2 tem um efeito terapêutico no sujeito. 0 method comprising: detecting a change in C-reactive protein level in the subject after administration of a modulator L0XL2 the subject, wherein the change indicates that the LOX or LOXL2 modulator has a therapeutic effect on the subject. Uma proteína reativa C é um marcador farmacodinâmico importante para a inflamação sistémica. A C-reactive protein is an important pharmacodynamic marker for systemic inflammation. Pensa-se que um nível reduzido de proteína reativa C (por exemplo, na amostra de sangue do sujeito) conforme comparado com o anterior à administração do inibidor de L0XL2 é indicativo da resposta do sujeito à terapêutica utilizando um inibidor de L0XL2. It is believed that a reduced level of C-reactive protein (e.g., the subject's blood sample) as compared to prior to administration of L0XL2 inhibitor is indicative of the subject's response to therapy using an inhibitor L0XL2. A medição dos níveis de L0XL2 ativa pode tomar a forma de um ensaio imunológico, que deteta a presença de uma proteína L0XL2 ativa com um anticorpo para a proteína, preferencialmente um anticorpo que se liga especificamente à L0XL2 ativa. The measurement of L0XL2 active levels may take the form of an immunoassay that detects the presence of an active L0XL2 protein with an antibody to the protein, preferably an antibody that specifically binds to the active L0XL2. Fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos anti-L0XL2 também podem ser utilizados. antigen-binding fragments of anti-L0XL2 antibodies may also be used.

Também podem ser utilizados imunoensaios juntamente com fluorescência induzida por laser (ver, por exemplo, Schmalzing e Nashabeh, Electrophoresis 18:2184-93 (1997); e Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. 699:463-80 (1997). Imunoensaios lipossómicos, tais como imunoensaios lipossómicos de jeção por fluxo e imunossensores lipossómicos também podem ser utilizados para determinar os níveis de LOX ou LOXL ativa, de acordo com um método da invenção (Rongen et al., J. Immunol. Methods 204:105-133 (1997) . Os imunoensaios, tais como ensaios imunossorbentes ligados a enzima (ELISAs), podem ser particularmente úteis num método da invenção. Um radioimunoensaio também pode ser útil para determinar se uma amostra é positiva para LOXL2 ativa ou para determinar o nível de LOXL2 ativa. Um radioimunoensaio gue utiliza, por exemplo, um anticorpo secundário rotulado com iodina-125 pode ser utilizado. Immunoassays also can be used with laser induced fluorescence (see, for example, and Schmalzing Nashabeh, Electrophoresis 18:.. 2184-93 (1997), and Bao, J. Chromatogr B Biomed Sci 699: 463-80 (. 1997). liposomal immunoassays, such as liposome liposome immunoassay by jeção flow and immunosensors can also be used to determine levels of active LOX or LOXL, a method according to the invention (Rongen et al., J. Immunol. Methods 204 :. 105-133 (1997) immunoassays such as enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs), may be particularly useful in a method of the invention a radioimmunoassay also can be useful for determining whether a sample is positive for active LOXL2 or determined. the level of active LOXL2. gue a radioimmunoassay using, for example, a secondary antibody labeled with iodine-125 can be used.

Além disso, é possível medir a atividade de LOXL2 ativa, ignorando, assim, a guantidade de enzima inativa. Moreover, it is possible to measure the active LOXL2 activity, ignoring thus guantidade inactive enzyme. A atividade enzimática da LOXL2 ativa pode ser medida num número de maneiras, utilizando uma elastina solúvel ou colagénio solúvel com lisina rotulada como um substrato. The enzymatic activity of the active LOXL2 can be measured in a number of ways, using a soluble elastin or soluble collagen with labeled lysine as a substrate. Detalhes de um ensaio de atividade são dados em Royce et al., "Copper metabolism in mottled mouse mutants. Details of an activity test are given in Royce et al. & Quot; Copper metabolism in mottled mouse mutants. The effect of copper therapy on lysyl oxidase activity in brindled (Mobr) mice," The effect of therapy on copper in lysyl oxidase activity brindled (Mobr) mice, & quot; Biochem J. 15 de fevereiro del982; J. Biochem February 15 del982; 202(2): 369-371. 202 (2): 369-371. Um ensaio exemplar é um ensaio cromogénico, tal como aguele descrito por Palamakumbura, et al. An exemplary assay is a chromogenic assay as described by aguele Palamakumbura, et al. "A fluorometric assay for detection of lysyl oxidase enzyme activity in biological samples," & Quot; A fluorometric assay for detection of lysyl oxidase enzyme activity in biological samples, & quot; Anal Biochem. Anal Biochem. 15 de janeiro de 2002; January 15, 2002; 300(2):245-51. 300 (2): 245-51.

Além de medir o nível de LOXL2 no sangue (ou urina), é possível medir produtos secundários da atividade de LOXL2. In addition to measuring the LOXL2 level in the blood (or urine), you can measure secondary products of LOXL2 activity. Por exemplo, deoxipiridinolina (Dpd) é formada pela ação enzimática da lisil oxidase em resíduos de lisina. For example, deoxypyridinoline (Dpd) is formed by the enzymatic action of lysyl oxidase on lysine residues. Dpd é libertada para a circulação como um resultado da degradação osteoclástica do osso. Dpd is released into the circulation as a result of osteoclastic degradation of bone. Não pode ser reutilizada, é eliminada pelo rim e é excretada inalterada na urina. can not be reused, it is eliminated by the kidneys and is excreted unchanged in the urine. Assim, pode ser utilizado um teste baseado no ensaio Gama BCT Dpd dos Sistemas Imunodiagnósticos (IDS), utilizando um tubo revestido RIA utilizando um anticorpo monoclonal anti-Dpd para medir a atividade enzimática. Thus, a test can be used based on Dpd BCT test range of immunoassay systems (IDS) using a coated tube RIA using a monoclonal anti-DPD antibody to measure the enzyme activity.

Os anticorpos anti-LOXL2 descritos agui também podem ser utilizados no diagnóstico de doenças ou condições patológicas associadas com metabolismo aberrante de colagénio, tal como várias condições patológicas fibróticas, por exemplo, fibrose pulmonar, bem como na retinopatia vítrea proliferativa, cicatrização cirúrgica, esclerose sistémica, escleroderma, contração de feridas, cicatrizes hipertróficas, fibromatose (especialmente doença de Dupuytren) e quelóides. The anti-LOXL2 antibodies described agui may also be used in the diagnosis of pathological diseases or conditions associated with aberrant metabolism of collagen, such as various fibrotic disease conditions, for example, pulmonary fibrosis, as well as the vitreous proliferative retinopathy, surgical scarring, systemic sclerosis , scleroderma, wound contraction, hypertrophic scars, fibromatosis (especially Dupuytren's disease) and keloids. IX. IX. Métodos terapêuticos therapeutic methods

As formulações farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para tratar uma ampla variedade de doenças e distúrbios, tais como, por exemplo, cancro, metástase, fibrose e angiogénese aberrante. The pharmaceutical formulations according to the present invention can be used to treat a wide variety of diseases and disorders such as, for example, cancer, metastasis, fibrosis and aberrant angiogenesis. É providenciado aqui um método de inibir a L0XL2 contactando uma amostra ou um tecido celular com qualquer um dos anticorpos anti-L0XL2 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos aqui. Provided herein is a method of inhibiting a taste L0XL2 contacting a cell or tissue with either anti-L0XL2 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein. A ligação de dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a L0XL2 inibe a atividade enzimática de L0XL2. Binding of said antibody or antigen-binding fragment thereof to L0XL2 inhibits enzyme activity L0XL2.

Em qualquer um de tais métodos, o contacto pode ocorrer in vitro, in vivo ou ex vivo. In any of these methods, the contacting may occur in vitro, in vivo or ex vivo. A inibição de L0XL2 pode ter um ou mais efeitos num sujeito tais como, por exemplo, redução no crescimento tumoral, redução na angiogénese, redução numa doença fibrótica e/ou diminuição da formação de matriz extracelular. The inhibition L0XL2 may have one or more effects in a subject such as, for example, reduction in tumor growth, reduction of angiogenesis, reduction in fibrotic disease and / or decrease in extracellular matrix formation. Doenças fibróticas incluem, mas não se limitam a, fibrose hepática, fibrose pulmonar, fibrose renal, fibrose cardíaca e escleroderma. fibrotic diseases include, but are not limited to, liver fibrosis, pulmonary fibrosis, kidney fibrosis, cardiac fibrosis and scleroderma. São providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização em métodos para tratar doenças e distúrbios associados com a expressão aberrante de ou L0XL2. L0XL2 antibodies are provided herein for use in methods for treating diseases and disorders associated with aberrant expression or L0XL2. Doenças e distúrbios incluem, mas não se limitam a, tumores (por exemplo, primário ou metastático), condições patológicas relacionadas com angiogénese e condições patológicas fibróticas. Diseases and disorders include, but are not limited to, tumors (e.g., primary or metastatic), pathological angiogenesis-related conditions and pathological fibrotic conditions.

Conforme utilizado aqui, "prevenção" As used herein, & quot; prevention & quot; refere-se à profilaxia, prevenção do despoletar de sintomas, prevenção da progressão de uma doença ou distúrbio associado com fibrose ou correlacionado com a atividade de L0XL2. refers to prophylaxis, prevention of onset of symptoms, prevention of progression of a disease or disorder associated with fibrosis or correlated with L0XL2 activity. Conforme utilizado aqui, "tratar" As used herein, & quot; treating & quot; ou "tratamento" or & quot; treatment & quot; significa estase ou um adiar do desenvolvimento dos sintomas associados com uma doença ou distúrbio descritos aqui. It means stasis or postpone the development of symptoms associated with a disease or disorder described herein. Os termos incluem ainda melhorar sintomas descontrolados ou indesejados existentes, prevenindo sintomas adicionais e melhorando ou prevenindo as causas metabólicas subjacentes dos sintomas. The terms include improving existing uncontrolled or unwanted symptoms, preventing additional symptoms and improving or preventing the underlying metabolic causes of symptoms. Assim, os termos indicam que um resultado benéfico foi conferido num sujeito mamífero com uma doença ou sintomas ou com o potencial de desenvolver tal doenças ou sintoma. Thus, the terms indicate that a beneficial result has been conferred in a mammalian subject with a disease or symptoms or with the potential to develop such a disease or symptom. É conseguida uma resposta quando o paciente experimenta alívio parcial ou total ou redução dos sinais ou sintomas de doença e inclui especificamente, sem limitação, prolongamento da sobrevivência. Response is achieved when the patient experiences partial or total alleviation or reduction of signs or symptoms of illness, and specifically includes, without limitation, prolongation of survival. Os tempos de sobrevivência livres de progressão esperados podem ser medidos em meses a anos, dependendo dos fatores prognósticos incluindo o número de reincidências, estádio da doença e outros fatores. The free survival time expected of progression can be measured in months to years, depending on prognostic factors including the number of relapses, the disease stage and other factors. 0 prolongamento da sobrevivência inclui, sem limitação, tempos de pelo menos 1 mês (mo), cerca de pelo menos 2 meses (meses), cerca de pelo menos 3 meses, cerca de pelo menos 4 meses, cerca de pelo menos 6 meses, cerca de pelo menos 1 ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos ou mais. 0 prolonging survival includes without limitation times of at least 1 month (mo), about at least 2 months (months) about at least 3 months, about at least 4 months, about at least 6 months about at least one year, about at least two years, about at least three years or more. A sobrevivência global também pode ser medida em meses a anos. Overall survival can also be measured in months to years. Os sintomas do paciente podem permanecer estáticos ou podem diminuir. The patient's symptoms may remain static or may decrease.

As composições farmacêuticas da presente invenção são administradas em quantidades terapeuticamente eficazes que são eficazes para produzir algum efeito terapêutico desejado a uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. The pharmaceutical compositions of this invention are administered in therapeutically effective amounts which are effective for producing some desired therapeutic effect at a reasonable benefit / risk ratio applicable to any medical treatment. Para a administração das presentes composições farmacêuticas a pacientes humanos, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas pela metodologia conhecida de alguém com habilitação comum na arte para serem substancialmente livres de pirogénios, de tal modo que não induzem uma resposta inflamatória. For the administration of these pharmaceutical compositions to human patients, the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated by methods known to one of ordinary skill in the art to be substantially free of pyrogens, such that they do not induce an inflammatory response.

Conforme utilizado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" As used herein, the term & quot; therapeutically effective amount & quot; ou "quantidade eficaz" or & quot; effective amount & quot; refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico que quando administrado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico a uma célula, tecido ou sujeito é eficaz na prevenção ou melhoria da condição de doença ou na progressão da doença. It refers to an amount of a therapeutic agent that when administered alone or in combination with another therapeutic agent to a cell, tissue, or subject is effective in preventing or ameliorating the disease condition or the progression of the disease. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se ainda àquela quantidade do composto suficiente para resultar na melhoria dos sintomas, por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhoria da condição médica relevante ou em aumento na taxa de tratamento, cura, prevenção ou melhoria de tais condições patológicas. A therapeutically effective dose further refers to that amount of the compound sufficient to result in amelioration of symptoms, e.g., treatment, healing, prevention or amelioration of the relevant medical condition, or an increase in rate of treatment, healing, prevention or amelioration of such conditions pathological. Quando aplicada a um ingrediente ativo individual administrado sozinho, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquele ingrediente apenas. When applied to an individual active ingredient administered alone, a therapeutically effective dose refers to that ingredient alone. Quando aplicada a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrada em combinação, em série ou simultâneamente. When applied to a combination, a therapeutically effective dose refers to combined amounts of the active ingredients that result in the therapeutic effect, whether administered in combination, serially or simultaneously. Por exemplo, quando é empregue a administração in vivo de um anticorpo anti-L0XL2, as quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10 ng/kg a 100 mg/kg do peso corporal do mamífero ou mais por dia, preferencialmente cerca de 1 yg/kg/dia a 50 mg/kg/dia, opcionalmente cerca de 100 yg/kg/dia a 20 mg/kg/dia, 500 yg/kg/dia a 10 mg/kg/dia ou 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. For example, when employed in vivo administration of an anti-L0XL2 antibody, normal dosage amounts may vary from about 10 ng / kg to 100 mg / kg of mammal body weight or more per day, preferably about 1 ug / kg / day to 50 mg / kg / day, optionally about 100 ug / kg / day to 20 mg / kg / day, 500 ug / kg / day to 10 mg / kg / day or 1 mg / kg / day 10 mg / kg / day depending on the route of administration.

Uma resposta eficaz da presente invenção é conseguida quando o paciente experimenta alívio parcial ou total ou redução dos sinais ou sintomas da doença e inclui especificamente, sem limitação, prolongamento da sobrevivência. An effective response of the present invention is achieved when the patient experiences partial or total alleviation or reduction of signs or symptoms of illness, and specifically includes, without limitation, prolongation of survival. Os tempos de sobrevivência livres de progressão esperados podem ser medidos em meses a anos, dependendo dos fatores prognósticos incluindo o número de reincidências, estádio da doença e outros fatores. The free survival time expected of progression can be measured in months to years, depending on prognostic factors including the number of relapses, the disease stage and other factors. 0 prolongamento da sobrevivência inclui, sem limitação, tempos de pelo menos 1 mês (mo) , cerca de pelo menos 2 meses, cerca de pelo menos 3 meses, cerca de pelo menos 4 meses, cerca de pelo menos 6 meses, cerca de pelo menos 1 ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos ou mais. 0 prolonging survival includes without limitation times of at least 1 month (mo), about at least 2 months, at least about 3 months, about at least 4 months, about at least 6 months, about the least one year, about at least two years, about at least three years or more. A sobrevivência global também pode ser medida em meses a anos. Overall survival can also be measured in months to years. Os sintomas do paciente podem permanecer estáticos e a carga do tumor pode não aumentar. The patient's symptoms may remain static and tumor load can not increase.

Um médico ou veterinário com habilitação comum na arte pode rapidamente determinar e prescrever a quantidade eficaz (ED50) da composição farmacêutica necessária. A physician or veterinarian of ordinary skill in the art can readily determine and prescribe the effective amount (ED50) of the pharmaceutical composition required. Por exemplo, o médico ou veterinário pode começar por doses dos compostos da invenção empregues na composição farmacêutica a níveis inferiores às necessárias para conseguir atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até o efeito desejado ser atingido. For example, the physician or veterinarian could start doses of the compounds of the invention employed in the pharmaceutical composition at levels lower than required to achieve achieve the desired therapeutic effect and to gradually increase the dosage until the desired effect is achieved.

Conforme utilizado aqui, o termo "sujeito" As used herein, the term & quot; subject & quot; significa sujeitos mamíferos. It means mammalian subjects. Sujeitos exemplares incluem, mas não se limitam a, humanos, macacos, cães, gatos, ratinhos, ratazanas, vacas, cavalos, cabras e ovelhas. Copies subject include, but are not limited to, humans, monkeys, dogs, cats, mice, rats, cows, horses, goats and sheep. Nalgumas modalidades, o sujeito tem cancro e pode ser tratado com o agente da presente invenção conforme descrito a seguir. In some embodiments, the subject has cancer and can be treated with the agent of the present invention as described below.

Independentemente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que são utilizados numa forma adequadamente hidratada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, tais como descritas a seguir ou por outros métodos convencionais conhecidos daqueles habilitados na arte. Regardless of the selected route of administration, the compounds of the present invention are used in a properly hydrated and / or the pharmaceutical compositions of the present invention are formulated into pharmaceutically acceptable dosage forms such as described below or by other conventional methods known to those skilled in the art.

Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxico para o paciente. Actual dosage levels of active ingredients in the pharmaceutical compositions of this invention may be varied so as to obtain an amount of active ingredient that is effective to achieve the desired therapeutic response for a particular patient, composition, and particular mode of administration, without being toxic to the patient. 0 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto particular da presente invenção empregue, a via de administração, de tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular a ser empregue, da duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com a composição particular empregue, com a idade, sexo, peso, condição física, estado de saúde geral e historial médico do paciente a ser tratado e fatores afins bem conhecidos das artes médicas. 0 selected dosage level will depend upon a variety of factors including the activity of the particular compound of the invention employed, the route of administration, administration time, of the particular compound excretion rate being employed, the duration of the treatment, other drugs, compounds and / or materials used in combination with the particular composition employed, the age, sex, weight, physical condition, general health and medical history of the patient being treated, and like factors well known in the medical arts.

Num aspeto providenciado aqui, a administração dos anticorpos resulta numa melhoria da condição do sujeito. In one aspect provided herein, administration of the antibody results in an improvement of the subject's condition. Noutro aspeto, a administração dos anticorpos previne a condição do sujeito de piorar e/ou prolonga a sobrevivência do paciente. In another aspect, administration of the antibodies prevents the subject's condition worsen and / or prolonged survival of the patient. 0 paciente pode ser um mamífero, tal como um humano ou um não humano. 0 patient may be a mammal such as a human or nonhuman. Tal paciente pode ser sintomático ou assintomático. Such a patient may be symptomatic or asymptomatic.

As composições podem ser administradas localmente, regionalmente ou sistemicamente por qualquer via adequada providenciada aqui. The compositions may be administered locally, regionally or systemically by any suitable route provided herein.

Num aspeto, os sintomas do paciente são melhorados. In one aspect, the patient's symptoms are ameliorated. A melhoria pode ser manifestada como, por exemplo, redução da dor, tamanho do tumor reduzido, eliminação de tumores, prevenção de aumentos no tamanho do tumor ou progressão ou de doença, prevenção da formação de metástase ou inibição de crescimento metastático, inibição de fibrose, inibição de angiogénese ou uma combinação dos mesmos. The improvement can be manifested as, for example, reduction of pain, reduced tumor size, elimination of tumors, prevent increases in tumor size or progression or disease, prevention of metastasis or inhibition of metastatic growth, inhibition of fibrosis , inhibition of angiogenesis or a combination thereof.

Se necessário, para tratamentos cancerígenos, os métodos podem anda incluir remoção cirúrgica do cancro e/ou administração de um agente ou tratamento anti-cancerígeno. If necessary, treatments for cancer, the methods may include walking surgical removal of cancer and / or administration of an anticancer agent or treatment. A administração de tal agente ou tratamento anti-cancerígeno pode ser coincidente com a administração das composições reveladas aqui. The administration of such agent or anti-cancer treatment can be coincident with the administration of the compositions disclosed herein. Agentes anti-cancerigenos foram providenciados noutro local aqui. anticancer agents have been provided elsewhere herein.

Num aspeto, a administração de qualquer um dos anticorpos providenciados aqui reduz ou elimina a necessidade do paciente se submeter a cirurgia ou tratamento com um ou mais agentes ou tratamentos anti-cancerígenos. In one aspect, administration of any of the antibodies provided herein reduces or eliminates the need for the patient to undergo surgery or treatment with one or more anti-cancer agents or treatments.

Indicações que podem ser tratadas utilizando as formulações farmacêuticas da presente invenção incluem aquelas envolvendo proliferação celular indesejável ou descontrolada. Indications that can be treated using the pharmaceutical formulations of the present invention include those involving undesirable or uncontrolled cell proliferation. Tais indicações incluem tumores benignos, vários tipos de cancros, tais como tumores primários e metástase de tumor, restenose (por exemplo, coronária, carótida e lesões cerebrais), distúrbios hematológicos, estimulação anormal de células endoteliais (aterosclerose), estragos ao tecido corporal devido a cirurgia, cicatrização anormal, angiogénese anormal, doenças que produzem fibrose de tecido, degeneração macular, glaucoma; Such indications include benign tumors, various types of cancers such as primary tumors and tumor metastasis, restenosis (e.g. coronary, carotid, and cerebral lesions), hematological disorders, abnormal stimulation of endothelial cells (atherosclerosis) damage to body tissue due surgery, abnormal wound healing, abnormal angiogenesis, diseases that produce fibrosis of tissue, macular degeneration, glaucoma; degeneração macular relacionada com a idade (AMD húmida e AMD seca), aterosclerose, artrite reumatóide, esclerose múltipla, fibrose hepática, fibrose renal, fibrose pulmonar, escleroderma, aterosclerose e doença de Alzheimer, distúrbios motores repetitivos, distúrbios de tecidos que não são altamente vascularizados e respostas proliferativas associadas com transplantes de orgãos. Macular degeneration associated with age (wet AMD and dry AMD), atherosclerosis, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, hepatic fibrosis, renal fibrosis, pulmonary fibrosis, scleroderma, atherosclerosis and Alzheimer's disease, repetitive motion disorders, tissue disorders which are not highly vascularized and proliferative responses associated with organ transplants. A fibrose hepática inclui, mas não se limita a, cirrose e condições patológicas associadas tais como hepatite virai crónica, doença hepática gorda não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite alcoólica (ASH), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose biliar primária (PBC), cirrose biliar e hepatite autoimune. Liver fibrosis includes, but is not limited to, cirrhosis and pathological conditions such as chronic viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), alcoholic steatohepatitis (ASH), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), biliary cirrhosis Elementary (PBC), biliary cirrhosis and autoimmune hepatitis. A fibrose pulmonar inclui, mas não se limita a, fibrose pulmonar idiopática (IPF) ou alveolite fibrosante criptogénica, pneumonia intersticial fibrosante crónica, doença pulmonar intersticial (ILD), doença difusa do parênquima pulmonar (DPLD), enfisema e doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD) e asma crónica. Lung fibrosis includes, but is not limited to, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) or cryptogenic fibrosing alveolitis, chronic fibrosing interstitial pneumonia, interstitial lung disease (ILD), diffuse disease of the lung parenchyma (DPLD), emphysema and chronic obstructive pulmonary disease ( COPD) and chronic asthma. A fibrose cardíaca inclui, mas não se limita a, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia e pós-infarto agudo do miocárdio defeitos na função cardíaca. Cardiac Fibrosis includes, but is not limited to, congestive heart failure, cardiomyopathy and post-acute myocardial infarction defects in cardiac function. A fibrose renal inclui, mas não se limita a, nefropatia diabética, refluxo vesicoureteral, fibrose renal tubulointersticial; Renal fibrosis includes, but is not limited to, diabetic nephropathy, vesicoureteral reflux, tubulointerstitial renal fibrosis; glomerulonefrite ou nefrite glomerular, incluindo glomerulosclerose segmentar focal e glomerulonefrite membranosa e nefrite glomerular mesangiocapilar. glomerulonephritis or glomerular nephritis, including focal segmental glomerulosclerosis and membranous glomerulonephritis and glomerular nephritis mesangiocapillary.

Em geral, as células num tumor benigno retêm as suas características diferenciadas e não se dividem de uma maneira completamente descontrolada. In general, cells in a benign tumor retain their differentiated features and do not divide in a completely uncontrolled manner. Um tumor benigno está normalmente localizado e é não metastático. A benign tumor is usually localized and nonmetastatic is. Tipos específicos de tumores benignos que podem ser tratados utilizando a presente invenção incluem hemangiomas, adenoma hepatocelular, hemangioma cavernoso, hiperplasia nodular focal, neuromas acústicos, neurofibroma, adenoma do duto biliar, cistanoma do duto biliar, fibroma, lipomas, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, hiperplasia regenerativa nodular, tracomas, granulomas piogénicos, verrugas, fibróides uterinos, adenomas da tiróide, adenomas adrenocorticais e adenomas pituitários. Specific types of benign tumors that can be treated using the present invention include hemangiomas, hepatocellular adenoma, cavernous haemangioma, focal nodular hyperplasia, acoustic neuromas, neurofibroma, bile duct adenoma, bile duct cistanoma, fibroma, lipomas, leiomyomas, mesotheliomas, teratomas , myxomas, nodular regenerative hyperplasia, trachoma, pyogenic granulomas, warts, uterine fibroids, thyroid adenomas, adrenocortical adenomas and pituitary adenomas.

Num tumor maligno, as células tornam-se indiferenciadas, não respondem aos sinais de controlo de crescimento do corpo e multiplicam-se de uma maneira descontrolada. In a malignant tumor cells become undifferentiated, do not respond to the body's growth control signals, and multiply in an uncontrolled manner. 0 tumor maligno é invasivo e capaz de espalhar para locais distantes (entrar em metástase). 0 malignant tumor is invasive and capable of spreading to distant sites (metastasis enter). Os tumores malignos são, em geral, divididos em duas categorias: primários e secundários. Malignant tumors are generally divided into two categories: primary and secondary. Os tumores primários surgem diretamente do tecido no qual são encontrados. Primary tumors arise directly from the tissue in which they are found. Um tumor secundário, ou metástase, é um tumor que é originado noutro lado no corpo, mas espalhou-se agora para um orgão distante. A secondary tumor, or metastasis, is a tumor which is originated elsewhere in the body but has now spread to a distant organ. As vias comuns para metástase são o crescimento direto para estruturas adjacentes, espalhado para os sistemas vascular ou linfático e seguimento ao longo dos planos do tecido e espaços corporais (fluido peritoneal, fluido cerebrospinal, etc.) The common routes for metastasis are direct growth into adjacent structures, spread to the vascular or lymphatic systems, and tracking along tissue planes and body spaces (peritoneal fluid, cerebrospinal fluid, etc.)

Tipos específicos de cancros ou tumores malignos, sejam primários ou secundários, que podem ser tratados utilizando esta invenção incluem, mas não se limitam a, cancro do pulmão (incluindo adenocarcinoma pulmonar, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células grandes, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma das células não pequenas, carcinoma das células pequenas, mesotelioma); Specific types of cancers or malignant tumors, either primary or secondary, that can be treated using this invention include, but are not limited to, lung cancer (including lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell, bronchioloalveolar carcinoma, non-small cell, small cell carcinoma, mesothelioma); cancro da mama (incluindo carcinoma dutal, carcinoma lobular, cancro da mama inflamatório, cancro da mama claro, carcinoma mucinoso); breast cancer (including ductal carcinoma, lobular carcinoma, inflammatory breast cancer, clear breast cancer, mucinous carcinoma); cancro colo-retal (cancro do cólon, cancro retal); colorectal cancer (colon cancer, rectal cancer); cancro anal; Anal Cancer; cancro pancreático (incluindo adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células dos ilhéus, tumores neuroendócrinos); pancreatic cancer (including pancreatic adenocarcinoma, islet cell carcinoma, neuroendocrine tumors); cancro da próstata; prostate cancer; carcinoma ovárico (carcinoma epitelial ovárico ou tumor da superfície epitelial-estroma incluindo tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso, tumor dos cordões sexuais-estroma); ovarian carcinoma (epithelial ovarian carcinoma or tumors of epithelial-stromal surface including serous tumors, mucinous cystadenocarcinoma and endometrioid tumors, tumor-stroma of sexual strands); carcinoma hepático e do duto biliar (incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hemangioma); liver carcinoma and biliary duct (including hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, haemangioma); carcinoma esofágico (incluindo adenocarcinoma esofágico e carcinoma das células escamosas); esophageal carcinoma (including esophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma); linfoma de não Hodgkin; non-Hodgkin's lymphoma; carcinoma da bexiga; bladder carcinoma; carcinoma do útero (incluindo adenocarcinoma do endométrio, carcinoma seroso papilar uterino, carcinoma das células claras uterino, sarcomas uterinos e leiomiossarcomas, tumores mulerianos mistos); carcinoma of the uterine (including endometrial adenocarcinoma, uterine serous papillary carcinoma, clear cell carcinoma, uterus, uterine sarcomas and leiomyosarcomas, mixed mulerianos tumors); glioma, glioblastoma, medulablastoma e outros tumores cerebrais; glioma, glioblastoma and other brain tumors medulablastoma; cancros renais (incluindo carcinoma das células renais, cancro da mama claro, tumor de Wilm); kidney cancers (including renal cell carcinoma, clear of breast cancer, Wilm's tumor); cancro da cabeça e do pescoço (incluindo carcinomas das células escamosas); cancer of the head and neck (including squamous cell carcinoma); cancro do estômago (adenocarcinoma estomacal, tumor estromal gastrointestinal); stomach cancer (stomach adenocarcinoma, gastrointestinal stromal tumor); mieloma múltiplo; multiple myeloma; cancro testicular; testicular cancer; tumor das células germinativas; germ cell tumors; tumor neuroendócrino; neuroendocrine tumor; cancro cervical; cervical cancer; carcinóides do trato gastrointestinal, mama e outros orgãos; carcinoids of the gastrointestinal tract, breast and other organs; carcinoma de células em anel de sinete; signet ring cell carcinoma; tumores mesenquimatosos incluindo sarcomas, fibrossarcomas, hemangioma, angiomatose, haeman- giopericytoma, hiperplasia estromal pseudoangiomatosa, miofibroblastoma, fibromatose, tumor miofibroblástico inflamatório, lipoma, angiolipoma, tumor das células granulares, neurofibroma, schwanoma, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomiossarcom , osteossarcoma, leiomioma ou leiomissarcoma. mesenchymal tumors including sarcomas, fibrosarcomas, haemangioma, angiomatosis, haeman- giopericytoma, stromal hyperplasia pseudoangiomatosa, myofibroblastoma, fibromatosis, inflammatory myofibroblastic tumor, lipoma, angiolipoma, granular cell tumor, neurofibroma, schwannoma, angiosarcoma, liposarcoma, rabdomiossarcom, osteosarcoma, leiomyoma, or leiomissarcoma. 0 termo "metástase" 0 term & quot; metastasis & quot; significa a capacidade das células tumorais de invadirem os tecidos do hospedeiro e metastizarem para locais de orgãos distantes, com frequência, específicos. It means the ability of tumor cells to invade host tissues and metastasize to distant organ sites often specific. Como é sabido, esta é a característica saliente dos crescimentos tumorais letais. As is known, this is the salient characteristic of lethal tumor growth. A formação de metástase ocorre através de uma série complexa de interações únicas entre células tumorais e tecidos e células do hospedeiro normais. Metastasis formation occurs via a complex series of unique interactions between tumor cells and normal tissues and host cells. No contexto da presente invenção, a atividade da lisil oxidase é crítica no crescimento metastático de tumores, isto é, no crescimento de metástases, particularmente em condições hipóxicas. In the context of the present invention, the lysyl oxidase activity is critical in metastatic tumor growth, i.e., growth of metastases, particularly in hypoxic conditions. Como os tumores hipóxicos também são os mais agressivos e resistentes à quimioterapêutica tradicional, agentes que modulam a expressão e/ou função da lisil oxidase providenciam uma terapêutica nova contra tumores metastáticos, particularmente tumores quimio-resistentes. As hypoxic tumors are also more aggressive and resistant to traditional chemotherapeutic agents that modulate expression and / or function of lysyl oxidase provide a new therapy against metastatic tumors, particularly chemotherapy-resistant tumors. "Metástase" & Quot; metastasis & quot; é distinguida de invasão. It is distinguished from invasion. Conforme descrito em "Understanding Cancer Series: Cancer," As described in & quot; Understanding Cancer Series: Cancer, & quot; na página de internet: cancer . on the website: cancer. gov/cancertopics/understandingcancer/cancer; gov / cancertopics / understandingcancer / cancer; invasion refere-se à migração direta e penetração pelas células cancerígenas em tecidos vizinhos. Invasion refers to the direct migration and penetration by cancer cells into surrounding tissues.

Distúrbios hematológicos incluem crescimento anormal de células sanguíneas que conduz a alterações displásticas nas células sanguíneas e a malignidades hematológicas, tais como várias leucemias. Hematologic disorders include abnormal growth of blood cells leading to dysplastic changes in blood cells and hematologic malignancies such as various leukemias. Exemplos de distúrbios hematológicos incluem, mas não se limitam a, leucemia mielóide aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa crónica, as síndromes mielodisplásticas e anemia das células falciformes. Examples of hematologic disorders include but are not limited to, acute myeloid leukemia, acute promyelocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic myelogenous leukemia, the myelodysplastic syndromes, and sickle cell anemia.

Leucemia mielóide aguda (AML) é o tipo mais comum de leucemia aguda que ocorre em adultos. Acute myeloid leukemia (AML) is the most common type of acute leukemia that occurs in adults. Vários distúrbios genéticos herdados e estados de imunodeficiência estão associados com um risco aumentado de AML. Several inherited genetic disorders and immunodeficiency states are associated with an increased risk of AML. Estes incluem distúrbios com defeitos na estabilidade do ADN, conduzindo a quebra cromossómica aleatória, tais como síndrome de Bloom, anemia de Fanconi, síndrome de parentesco de Li-Fraumeni, ataxia-telangiectasia e agamaglobulinémia ligado ao X. A leucemia promielocítica aguda (APML) representa um subgrupo distinto de AML. These include disorders with defects in DNA stability, leading to random chromosomal breakage, such as Bloom's syndrome, Fanconi anemia, kinship Li-Fraumeni syndrome, ataxia telangiectasia and agammaglobulinemia linked to X. The acute promyelocytic leukemia (APML) It represents a distinct subgroup of AML. Este subtipo caracteriza-se por blastos promielocíticos que contêm a translocação cromossómica 15;17. This subtype is characterized by blasts promielocíticos containing chromosomal translocation 15; 17. Esta translocação conduz à geração do transcrito de fusão compreendido do recetor ácido retinóico e de uma sequência PML. This translocation leads to the generation of the fusion transcript comprised of the retinoic acid receptor and a sequence PML. A leucemia linfoblástica aguda (ALL) é uma doença heterogénea com características clínicas distintas exibidas por vários subtipos. Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous disease with distinct clinical features displayed by various subtypes. Anomalias citogenéticas recorrentes foram demonstradas em ALL. Recurrent cytogenetic abnormalities have been demonstrated in ALL. A anomalia citogenética mais comum é a translocação 9;22. The most common cytogenetic abnormality is the translocation 9; 22. 0 cromossoma Philadelphia resultante representa um fraco prognóstico do paciente. 0 resultant Philadelphia chromosome represents poor prognosis of the patient. A leucemia mielogenosa crónica (CML) é um distúrbio mieloproliferativo clonal de uma célula estaminal pluripotente. Chronic myelogenous leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disorder of a pluripotent stem cell. CML caracteriza-se por uma anomalia cromossómica específica que envolve a translocação dos cromossomas 9 e 22, criando o cromossoma Philadelphia. CML is characterized by a specific chromosomal abnormality involving the translocation of chromosomes 9:22, creating the Philadelphia chromosome. Radiação ionizante está associada com o desenvolvimento de CML . Ionizing radiation is associated with the development of CML.

As síndromes mielodisplásticas (MDS) são distúrbios de células estaminais hematopoiéticas clonais heterogéneas agrupadas juntas, por causa da presença de alterações displásticas numa ou mais das linhagens hematopoiéticas incluindo alterações displásticas nas séries mielóide, eritróide e megacariocitica. The myelodysplastic syndromes (MDS) are heterogeneous clonal hematopoietic stem cell disorders grouped together because of the presence of dysplastic changes in one or more of the hematopoietic lineages including dysplastic changes in the myeloid series, erythroid and megakaryocytic. Estas alterações resultam em citopenias numa ou mais das três linhagens. These changes result in cytopenias in one or more of the three lineages. Pacientes que padecem de MDS tipicamente desenvolvem complicações relacionadas com anemia, neutropenia (infeções) ou trombocitopenia (sangramento). Patients suffering from MDS typically develop complications related to anemia, neutropenia (infections) or thrombocytopenia (bleeding). Em geral, de cerca de 10% a cerca de 70% dos pacientes com MDS desenvolvem leucemia aguda. In general, from about 10% to about 70% of patients with MDS develop acute leukemia.

Verificou-se que a administração de inibidores de LOX2 reduz o tamanho dos tumores existentes, previne metastases e reduz o tamanho de (ou elimina mesmo) metástases existentes (ver, por exemplo, Moinar et ai. (2003) Biochim Biophys. Acta. 1647:220-224). It was found that administration of LOX2 inhibitors reduce the size of existing tumors, prevent metastases and reduces the size (or even eliminates) existing metastases (see, e.g., Molnar et al. (2003) Biochim Biophys. Acta. 1647 : 220-224). É providenciado aqui um método de reduzir o crescimento tumoral num sujeito, administrando qualquer um dos anticorpos anti-LOX ou anti-LOXL2 ou fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos descritos aqui. Provided herein is a method of reducing tumor growth in a subject by administering any of the anti-LOX or anti-LOXL2 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein. Numa modalidade, um tumor é um tumor primário. In one embodiment, a tumor is a primary tumor. Noutra modalidade, um tumor é um tumor metastático. In another embodiment, a tumor is a metastatic tumor. A carga de tumor metastático de um sujeito pode ser estabilizada administrando anticorpos, conforme descrito aqui. The metastatic tumor burden of a subject can be stabilized by administering antibodies as described herein. O tumor no sujeito pode ser reduzido em pelo menos 10%, 25%, 50%, 70%, 90%, 95%, ou mais conforme comparado com o tumor no sujeito antes do tratamento. The tumor in the subject can be reduced by at least 10%, 25%, 50%, 70%, 90%, 95% or more as compared to the tumor in the subject prior to treatment.

Quando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo se liga especificamente a LOXL2, exemplos de tumores incluem, mas não se limitam a, um tumor do cólon, um tumor esofágico, um tumor mamário, um tumor da próstata, um carcinoma escamoso ou um carcinoma fusocelular. When an antibody or binding fragment antigen thereof specifically binds LOXL2, tumor examples include, but are not limited to, a colon tumor, esophageal tumor, a breast tumor, a prostate tumor, squamous carcinoma or one spindle cell carcinoma.

Quando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo se liga especificamente a LOX, exemplos de tumores incluem, mas não se limitam a, um tumor mamário, um tumor pulmonar, um tumor renal, um tumor uterino, um tumor hepático ou um tumor da cabeça e do pescoço. When an antibody or binding fragment antigen thereof specifically binds LOX, tumor examples include, but are not limited to, a breast tumor, a lung tumor, a kidney tumor, a uterine tumor, a liver tumor, or a tumor head and neck. E providenciado aqui um método para prevenir ou reduzir crescimento tumoral, crescimento tumoral metastático, num sujeito in vivo, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um inibidor da atividade de LOX ou L0XL2; Is provided herein is a method for preventing or reducing tumor growth, metastatic tumor growth, in a subject in vivo, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an inhibitor of LOX activity or L0XL2; opcionalmente, um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, crescimento tumoral, por exemplo, em pelo menos 25%, 50%, 75%, 90% ou 95%, no sujeito tratado. optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, or preventing thus reducing tumor growth, e.g., at least 25%, 50%, 75%, 90% or 95% in the treated subject. Uma descrição detalhada de composições adequadas para utilização nos presente métodos de tratamento é dada a seguir. A detailed description of compositions suitable for use in the present treatment methods is given below. Tais métodos são úteis, por exemplo, quando o tumor é hipóxico. Such methods are useful, for example, when the tumor is hypoxic. Tumores hipóxicos podem ser rapidamente identificados utilizando métodos de rotina na arte. Hypoxic tumors can be quickly identified using routine methods in the art. Ver, por exemplo, Patente USN° 5 674 693. See, e.g., US Patent No. 5,674,693.

Além disso, é providenciado aqui um método de tratar metástase num sujeito com cancro in vivo, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um inibidor de LOXL2, inibindo, assim, a metástase, por exemplo, em pelo menos 25%, 50%, 75%, 90% ou 95% no sujeito tratado. Furthermore, there is provided herein a method of treating metastasis in a subject with cancer in vivo, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a LOXL2 inhibitor, thereby inhibiting the metastasis, for example, at least 25 %, 50%, 75%, 90% or 95% in the treated subject. Numa modalidade, inibidores inibem especificamente LOXL2 humana. In one embodiment, inhibitors specifically inhibit human LOXL2. Anticorpos a serem utilizados nestes métodos foram descritos anteriormente. Antibodies for use in these methods have been described previously. Pode ser desejável que o anticorpo minimize reações cruzadas com outros membros das famílias de LOXL2 e, assim, reduzam os efeitos secundários adversos potenciais devido a complicações e toxicidade de tecido normais. It may be desirable to minimize antibody cross-reactivity with other members of the family LOXL2 and thus reduce potential adverse side effects and complications due to normal tissue toxicity.

Também é providenciado aqui um método de aumentar ou potenciar as probabilidades de sobrevivência de um sujeito com tumor metastático, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2, aumentando ou potenciando, assim, as probabilidades de sobrevivência do sujeito tratado por certo período de tempo, por exemplo, em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 8 anos, 10 anos ou mais. It is also provided herein a method of enhancing or potentiating the survival probability of a subject having metastatic tumor, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-L0XL2 antibody, increasing or enhancing thus the chances of survival the treated subject for a period of time, e.g., at least 10 days, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 1.5 years, 2 years, 3 years, 4 years, 5, 8, 10 years or more. O aumento na sobrevivência de um sujeito pode ser definido, por exemplo, como o aumento na sobrevivência de um modelo animal pré-clínico de metástases cancerígenas (por exemplo, um ratinho com cancro metastático), por um certo período de tempo, por exemplo, em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, ou 1 ano, ou pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 8 vezes ou 10 vezes, mais do que um modelo animal controlo (que tem o mesmo tipo de cancro metastático) sem o tratamento com o método inventivo. The increase in survival of a subject may be defined, for example, as an increase in survival of a preclinical animal model of tumor metastasis (e.g., a mouse with metastatic cancer) for a certain period of time, e.g. at least 10 days, 1 month, 3 months, 6 months, or 1 year, or at least 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 8 times or 10 times more than an animal model control (which has the same type of metastatic cancer) without treatment with the inventive method. Em alternativa, o aumento na sobrevivência de um mamífero também pode ser definido, por exemplo, como o aumento na sobrevivência de um paciente com metástases cancerígenas por um certo período de tempo, por exemplo, em pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 8 anos, 10 anos ou mais do que um paciente com o mesmo tipo de cancro metastático, mas sem o tratamento com o método inventivo. Alternatively, increasing the survival of a mammal it may also be set, for example, as an increase in survival of a patient with cancer metastases for a certain period of time, e.g., at least 10 days, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 1.5 years, 2 years, 3 years, 4 years, 5 years, 8 years, 10 years or longer than a patient with the same type of metastatic cancer, but without treatment with the method inventive. O paciente controlo pode estar num placebo ou tratado com cuidados padrão de suporte, tais como terapêutica química, biológica e/ou radiação que não incluem o método inventivo como uma parte da terapêutica. The patient control may be treated with a placebo or standard care support, such as a chemical treatment, biological and / or radiation that do not include the inventive method as a part of therapy.

Também é providenciado aqui um método de estabilizar a carga do tumor metastático de um sujeito, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOX ou de um anticorpo anti-LOXL2, estabilizando, assim, a carga de tumor metastático de um sujeito durante um certo período de tempo, por exemplo, durante pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 8 anos, 10 anos ou mais. Also provided herein is a method of stabilizing the charge of metastatic tumor of a subject, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-LOX antibody or an anti-LOXL2 antibody, thereby stabilizing the load metastatic tumor from a subject over a period of time, e.g., for at least 10 days, 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 1.5 years, 2 years, 3 years, 4 years, 5, 8 years, 10 years or more. A estabilização da carga de tumor metastático de um sujeito pode ser definida como estabilização da carga de tumor metastático de um modelo animal pré-clínico com carga de tumor metastático (por exemplo, um ratinho com tumor metastático) durante um certo período de tempo, por exemplo, durante pelo menos 10 dias, 1 mês, 3 meses, 6 meses ou 1 ano mais do que um modelo animal controlo (que tem o mesmo tipo de tumor metastático) sem o tratamento com o método inventivo. The stabilization of metastatic tumor burden of a subject can be defined as stabilization of metastatic tumor burden of a preclinical animal model with metastatic tumor burden (e.g., a mouse with metastatic tumor) for a certain period of time, example, for at least 10 days, 1 month, 3 months, 6 months or 1 year more than a control animal model (which has the same type of metastatic tumor) without treatment with the inventive method.

Os presentes métodos de tratamento também incluem um método para aumentar a eficácia dos agentes quimioterapêuticos, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOXL2; The present treatment methods include a method for enhancing the efficacy of chemotherapeutic agents comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-LOXL2 antibody; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, aumentando, assim, a eficácia dos agentes quimioterapêuticos (que são descritos com mais detalhe acima). and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, thus enhancing the efficacy of chemotherapeutic agents (which are described in more detail above). Também são contemplados métodos que envolvem a entrega de formulações inibidoras de LOX em combinação com terapêutica de radiação. Also contemplated are methods involving delivery of LOX inhibitory formulations in combination with radiation therapy. Terapêutica de radiação pode ser utilizada para tratar quase todos os tipos de tumores sólidos, incluindo cancros do cérebro, mama, colo do útero, laringe, pulmão, pâncreas, próstata, pele, espinha, estômago, útero ou sarcomas de tecido mole. Radiation therapy can be used to treat almost every type of solid tumor, including cancers of the brain, breast, cervix, larynx, lung, pancreas, prostate, skin, spine, stomach, uterus, or soft tissue sarcomas. A radiação também pode ser utilizada para tratar leucemia e linfoma (cancros das células formadoras de sangue e sistema linfático, respetivamente) . Radiation can also be used to treat leukemia and lymphoma (cancers of the blood-forming cells and lymphatic system, respectively). A dose de radiação para cada local depende de um número de fatores, incluindo o tipo de cancro e se existem tecidos e orgãos próximos que podem ser danificados por radiação. Radiation dose to each site depends on a number of factors, including the type of cancer and whether there are tissues and organs nearby that may be damaged by radiation. A radiação será tipicamente entregue como raios X, onde a dosagem é dependente do tecido a ser tratado. The radiation is typically delivered as X-rays, where the dosage is dependent on the tissue to be treated. Radiofarmacêuticos, também conhecidos como radionucleotideos, também podem ser utilizados para tratar cancro, incluindo cancro da tiróide, cancro que reincide na parede do peito e a dor causada pela disseminação do cancro para o osso (metastases ósseas). Radiopharmaceuticals, also known as radionucleotideos may also be used to treat cancer, including thyroid cancer, which recurs in the chest wall and pain caused by cancer spreading to the bone (bone metastasis). Radionuclídeos foram descritos com mais detalhe a seguir. Radionuclides are described in more detail below. 0 sujeito a ser tratado ou diagnosticado pelos presentes métodos inclui um sujeito com ou correndo o risco de ter crescimento tumoral metastático. 0 subject to be treated or diagnosed by the present methods includes a subject having or at risk of having metastatic tumor growth. Tais tumores podem estar um Num aspeto, um tumor é, por exemplo, cancro do pulmão (incluindo adenocarcinoma pulmonar, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células grandes, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma das células não pequenas, carcinoma das células pequenas, mesotelioma) ; Such tumors may be one In one aspect, a tumor is for example cancer, lung cancer (including lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell, bronchioloalveolar carcinoma, small cell carcinoma, small cell mesothelioma); cancro da mama (incluindo carcinoma dutal, carcinoma lobular, cancro da mama inflamatório, cancro da mama claro, carcinoma mucinoso,); breast cancer (including ductal carcinoma, lobular carcinoma, inflammatory breast cancer, clear breast cancer, mucinous carcinoma); cancro colo-retal (cancro do cólon, cancro retal); colorectal cancer (colon cancer, rectal cancer); cancro anal; Anal Cancer; cancro pancreático (incluindo adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células dos ilhéus, tumores neuroendócrinos); pancreatic cancer (including pancreatic adenocarcinoma, islet cell carcinoma, neuroendocrine tumors); cancro da próstata; prostate cancer; carcinoma ovárico (carcinoma epitelial ovárico ou tumor da superfície epitelial-estroma incluindo tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso, tumor dos cordões sexuais-estroma); ovarian carcinoma (epithelial ovarian carcinoma or tumors of epithelial-stromal surface including serous tumors, mucinous cystadenocarcinoma and endometrioid tumors, tumor-stroma of sexual strands); carcinoma hepático e do duto biliar (incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hemangioma) ; liver carcinoma and biliary duct (including hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, haemangioma); carcinoma esofágico (incluindo adenocarcinoma esofágico e carcinoma das células escamosas); esophageal carcinoma (including esophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma); linfoma de não Hodgkin; non-Hodgkin's lymphoma; carcinoma da bexiga; bladder carcinoma; carcinoma do útero (incluindo adenocarcinoma do endométrio, carcinoma seroso papilar uterino, carcinoma das células claras uterino, sarcomas uterinos e leiomiossarcomas, tumores mulerianos mistos); carcinoma of the uterine (including endometrial adenocarcinoma, uterine serous papillary carcinoma, clear cell carcinoma, uterus, uterine sarcomas and leiomyosarcomas, mixed mulerianos tumors); glioma, glioblastoma, medulablastoma e outros tumores cerebrais; glioma, glioblastoma and other brain tumors medulablastoma; cancros renais (incluindo carcinoma das células renais, cancro da mama claro, tumor de Wilm); kidney cancers (including renal cell carcinoma, clear of breast cancer, Wilm's tumor); cancro da cabeça e do pescoço (incluindo carcinomas das células escamosas); cancer of the head and neck (including squamous cell carcinoma); cancro do estômago (adenocarcinoma estomacal, tumor estromal gastrointestinal); stomach cancer (stomach adenocarcinoma, gastrointestinal stromal tumor); mieloma múltiplo; multiple myeloma; cancro testicular; testicular cancer; tumor das células germinativas; germ cell tumors; tumor neuroendócrino; neuroendocrine tumor; cancro cervical; cervical cancer; carcinóides do trato gastrointestinal, mama e outros orgãos; carcinoids of the gastrointestinal tract, breast and other organs; carcinoma de células em anel de sinete; signet ring cell carcinoma; tumores mesenquimatosos incluindo sarcomas, fibrossarcomas, hemangioma, angiomatose, hemangiopericitoma, hiperplasia estromal pseudoangiomatosa, miofibroblastoma, fibromatose, tumor miofibroblástico inflamatório, lipoma, angiolipoma, tumor das células granulares, neurofibroma, schwanoma, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomiossarcoma, osteossarcoma, leiomioma ou um leiomirssarcoma. mesenchymal tumors including sarcomas, fibrosarcomas, haemangioma, angiomatosis, hemangiopericytoma, hyperplasia stromal pseudoangiomatosa, myofibroblastoma, fibromatosis, inflammatory myofibroblastic tumor, lipoma, angiolipoma, tumor of granular cells, neurofibroma, schwannoma, angiosarcoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, osteosarcoma, leiomyoma or leiomirssarcoma . Numa modalidade não limitante, o tumor é um tumor mamário, um tumor do pâncreas, um tumor pulmonar, um tumor cervical, um tumor do cólon ou um tumor da cabeça e do pescoço. In one non-limiting embodiment, the tumor is a breast tumor, a pancreatic tumor, a lung tumor, a cervical tumor, a colon tumor or a tumor of the head and neck. A presente invenção também providencia anticorpos L0XL2 para utilização num método para prevenir ou reduzir o risco de metástase de tumor num sujeito, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; The present invention also provides antibodies L0XL2 for use in a method for preventing or reducing the risk of tumor metastasis in a subject, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-L0XL2 antibody; e opcionalmente, um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, o risco de metástase de tumor. and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, preventing or reducing thus the risk of tumor metastasis. 0 inibidor pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. 0 inhibitor may be an antibody or an antigen binding fragment thereof. 0 sujeito em necessidade de tal profilático pode ser um indivíduo que está geneticamente predisposto a cancro a corre um elevado risco de desenvolver cancro devido a várias razões, tais como historial familiar de cancro e ambiente carcinogénico. 0 subject in need of such prophylaxis may be an individual who is genetically predisposed to cancer at high risk of developing cancer due to various reasons, such as family history of cancer and carcinogenic environment.

Exemplos dos genes humanos que estão envolvidos no despoletar do desenvolvimento de cancro incluem, mas não se limitam a, VHL (o gene Von Hippon Landau envolvido no carcinoma das células renais); Examples of human genes that are involved in cancer development of the trigger include, but are not limited to, VHL (Von Hippon Landau gene involved in renal cell carcinoma); P16/INK4A (envolvido em linfoma); P16 / INK4A (involved in lymphoma); E-caderina (envolvido na metástase de cancro da mama, tiróide, gástrico); E-cadherin (involved in metastasis of breast, thyroid, gastric); hMLHl (envolvido na reparação de ADN no cancro do cólon, gástrico e endometrial); hMLHl (involved in DNA repair in colon, gastric and endometrial cancer); BRCA1 (do na reparação de ADN no cancro da mama e ovárico) ; BRCA1 (in the DNA repair in breast and ovarian cancer); LKB1 (envolvido no cancro do cólon e da mama); LKB1 (involved in colon cancer and breast); P15/INK4B (envolvido em leucemia tal como AML e ALL); P15 / INK4B (involved in leukemia such as AML and ALL); ER (recetor de estrogénio, envolvido no cancro do cólon, mama e leucemia); ER (estrogen receptor, involved in colon cancer, breast cancer and leukemia); 06-MGMT (envolvido na reparação de ADN no cancro do cérebro, cólon, do pulmão e linfoma); 06-MGMT (involved in DNA repair in brain cancer, colon, lung and lymphoma); GST-pi (envolvido no cancro da mama, próstata e renal); GST-pi (involved in breast, prostate and kidney); TIMP-3 (metalloprotease de tecido, envolvido na metástase de cancro do cólon, renal e cerebral); TIMP-3 (tissue metalloprotease, involved in colon cancer metastases, kidney and brain); DAPK1 (DAP quinase, envolvido na apoptose das células de linfoma das células B); DAPK1 (DAP kinase, involved in apoptosis of lymphoma cells from B cells); P73 (envolvido na apoptose de células de linfoma); P73 (involved in lymphoma cell apoptosis); AR (recetor de androgénio, involved in cancro da próstata); AR (androgen receptor, Involved in prostate cancer); RAR-beta (retinoic acid receptor-beta, envolvido no cancro da próstata); RAR-beta (retinoic acid receptor-beta, involved in prostate cancer); recetor da endotelina-B (envolvido no cancro da próstata); Endothelin-B receptor (involved in prostate cancer); Rb (envolvido na regulação do ciclo celular do retinoblastoma); Rb (involved in cell cycle regulation of retinoblastoma); p53 (um importante gene supressor de tumor); p53 (which is an important tumor suppressor gene); P14ARF (envolvido na regulação do ciclo celular); P14ARF (involved in cell cycle regulation); RASSFl (envolvido na transdução do sinal); RASSFl (involved in signal transduction); APC (envolvido na transdução do sinal); APC (involved in signal transduction); Caspase-8 (envolvido na apoptose); Caspase-8 (involved in apoptosis); TERT (envolvido na senescência); TERT (involved in senescence); TERC (envolvido na senescência); TERC (involved in senescence); TMS-1 (envolvido na apoptose); TMS-1 (involved in apoptosis); SOCS-1 (envolvido na resposta do fator de crescimento de hepatocarcinoma); SOCS-1 (involved in the response of hepatocellular carcinoma growth factor); PITX2 (hepatocarcinoma cancro da mama); PITX2 (hepatocarcinoma breast cancer); MINT1; MINT1; MINT2; MINT2; GPR37; GPR37; SDC4; SDC4; MY0D1; MY0D1; MDR1; MDR1; THBS1; THBS1; PTC1; CPT1; e pMDRl, conforme descrito em Santini et al. and pMDRl, as described in Santini et al. (2001) Ann. (2001) Ann. of Intern. of Intern. Med. 134:573-586. Med 134:. 573-586. Sequências nucleotídicas destes genes podem ser recuperadas do sítio de internet do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (NCBI). nucleotide sequences of these genes can be retrieved from the internet site of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Deveria ser notado que, apesar da leucemia ser um cancro do sangue, pode afetar outros orgãos, ou, efetivamente, metastasizar. It should be noted that despite the leukemia is a cancer of the blood, it can affect other organs, or effectively metastasizar. Em leucemias agudas, as células anormais podem colher no sistema nervoso central, nos testículos, na pele e em qualquer outro orgão no corpo. In acute leukemia, the abnormal cells may collect in the central nervous system, testes, skin and any other organ in the body. Porque a leucemia já envolve toda a medula óssea no corpo e, em muitos casos, espalhou para outros orgãos tais como fígado, baço e nódulos linfáticos, a encenação da leucemia depende de outra informação que reflete a perspetiva do paciente em relação à sobrevivência. Because leukemia already involves all the bone marrow in the body and, in many cases, spread to other organs such as liver, spleen and lymph nodes, the staging of leukemia depends on other information that reflects the patient's perspective on survival. As leucemias incluem, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielogenosa aguda (AML), leucemia mielogenosa crónica (CML) e leucemia das células peludas (HCL). Leukemias include, for example, acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), acute myelogenous leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia (CML) and hairy cell leukemia (HCL). Diferentes sistemas de encenação são utilizados para diferentes tipos de leucemia crónica. Different staging systems are used for different types of chronic leukemia. Alguns tipos não têm qualquer sistema de encenação. Some types have no staging system. Métodos de encenação são descritos com mais detalhe a seguir. staging methods are described in more detail below. 0 tratamento da proliferação celular anormal devido a estragos ao tecido corporal durante a cirurgia pode ser possível para uma variedade de procedimentos cirúrgicos, incluindo cirurgia às articulações, cirurgia do intestino e cicatrização quelóide. 0 treat abnormal cell proliferation due to damage to body tissue during surgery may be possible for a variety of surgical procedures, including joint surgery to, bowel surgery, and cheloid scarring. Doenças que produzem tecido fibrótico incluem enfisema. Diseases that produce fibrotic tissue include emphysema. Distúrbios motores repetitivos que podem ser tratados utilizando a presente invenção incluem síndrome do túnel carpal. Repetitive motion disorders that may be treated using the present invention include carpal tunnel syndrome. Um exemplo de distúrbios proliferativos celulares que podem ser tratados utilizando a invenção é um tumor ósseo. An example of cell proliferative disorders that may be treated using the invention is a bone tumor. São providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método para prevenir ou reduzir o risco de proliferação celular anormal devido aos estragos ao tecido corporal durante a cirurgia ou uma doença que produz tecido fibrótico num sujeito, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOX ou de um anticorpo anti-L0XL2; They are provided herein L0XL2 antibodies for use in a method for preventing or reducing the risk of abnormal cell proliferation due to damage to body tissue during surgery or disease that produces fibrotic tissue in a subject, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount an anti-LOX antibody or an anti-antibody L0XL2; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, a proliferação celular anormal devido aos estragos ao tecido corporal durante a cirurgia. and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, or preventing, thereby reducing abnormal cell proliferation due to damage to body tissue during surgery. 0 inibidor pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigeno do mesmo. 0 inhibitor may be an antibody or an antigen binding fragment thereof. 0 sujeito em necessidade de tal profilático pode ser um indivíduo que está geneticamente predisposto para cancro ou com elevado risco de desenvolver cancro devido a várias razões tais como historial familiar de cancro e ambiente carcinogénico. 0 subject in need of such prophylaxis may be an individual who is genetically predisposed to cancer or at increased risk of developing cancer due to various reasons such as family history of cancer and carcinogenic environment. Numa modalidade, a doença pode ser, por exemplo, cirurgia às articulações, cirurgia do intestine, cicatrização quelóide, uma doença que produz tecido fibrótico, distúrbios motores repetitivos de um tumor ósseo. In one embodiment, the disease can be, for example, the joint surgery, surgery intestine, keloid scarring, a disease that produces fibrotic tissue, repetitive motion disorders of a bone tumor.

As respostas proliferativas associadas com transplante de orgãos que podem ser tratadas utilizando esta invenção incluem aquelas respostas proliferativas contribuindo para rejeições de orgão potenciais ou complicações associadas. The proliferative responses associated with organ transplantation that may be treated using this invention include those proliferative responses contributing to potential organ rejections or associated complications. Especificamente, estas respostas proliferativas podem ocorrer durante o transplante do coração, pulmão, fígado, rim e outros orgãos corporais ou sistemas de orgãos. Specifically, these proliferative responses may occur during transplantation of the heart, lung, liver, kidney and other body organs or organ systems. São providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método de tratar uma resposta proliferativa anormal associada com transplante de orgãos, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; L0XL2 antibodies are provided herein for use in a method of treating an abnormal proliferative response associated with organ transplantation, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-L0XL2 antibody; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, prevenindo ou reduzindo, assim, a proliferação celular anormal devido a transplante de orgãos. and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, or preventing, thereby reducing abnormal cell proliferation due to organ transplantation. 0 transplante pode incluir, por exemplo, transplante do coração, pulmão, fígado, rim e outros orgãos corporais ou sistemas de orgãos. 0 transplantation may include, for example, heart transplantation, lung, liver, kidney and other body organs or organ systems. A indicação para a composição inventiva também inclui fibrose. The indication for the inventive composition also includes fibrosis. A fibrose resulta da acumulação anormal de tecido fibroso que pode ocorrer como uma parte do porcesso de cicatrização em tecido danificado. The fibrosis results from abnormal accumulation of fibrous tissue that can occur as part of the healing process of implementing in damaged tissue. Tal dano tecidular pode resultar de lesão física, inflamação, infeção, exposição a toxinas e outras causas. This tissue damage can result from injury, inflammation, infection, exposure to toxins and other causes. Exemplos de fibrose incluem fibrose hepática, fibrose pulmonar, fibrose renal, fibrose cardíaca e escleroderma. Examples of fibrosis include liver fibrosis, lung fibrosis, renal fibrosis, cardiac fibrosis and scleroderma. Os compostos e agentes da invenção descrita também são contemplados para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de condições fibróticas. The compounds and agents of the invention described are also contemplated for the treatment, prevention and / or amelioration of fibrotic conditions.

Tecidos fibróticos acumulam-se no coração e vasos sanguíneos como um resultado de hipertensão, cardiopatia hipertensiva, aterosclerose e infarto agudo do miocárdio. Fibrotic tissues accumulate in the heart and blood vessels as a result of hypertension, hypertensive heart disease, atherosclerosis and myocardial infarction. Pressão sanguínea elevada, ou hipertensão, pode ser causada por uma variedade de fatores e, com frequência, conduz ao desenvolvimento de cardiopatia hipertensiva (HHD) com progressão para paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. High blood pressure or hypertension can be caused by a variety of factors and often leads to the development of hypertensive heart disease (HHD) with progression to heart failure and acute myocardial infarction. Da mesma forma, aterosclerose e outras doenças cardíacas isquémicas também resultam, com frequência, em paragem cardíaca. Likewise, arteriosclerosis and other ischemic heart diseases also result frequently in cardiac arrest. Estas doenças cardiovasculares todas exibem uma acumulação da matriz extracelular ou deposição fibrótica que resulta no enrijecimento da vasculatura e enrijecimento do próprio tecido cardíaco. These cardiovascular diseases all exhibit an accumulation of extracellular matrix or fibrotic deposition which results in the stiffening and hardening the vasculature of the heart tissue. Esta deposição de material fibrótico é uma resposta ao dano induzido pelo estado hipertensivo e/ou esclerótico, mas os efeitos desta resposta também resultam nos efeitos negativos do enrijecimento vascular e cardíaco, bem como aumento do ventrículo. This deposition of fibrous material is a response to injury induced by hypertensive status and / or sclerotic, but the effects of this response also results in negative effects of vascular and cardiac stiffening and increasing the ventricle. Adicionalmente, pensa-se que a fibrose cardíaca aumentada observada na doença cardiovascular interrompe ou altera os sinais transmitidos para os cardiomiócitos através da dobragem do tecido do coração, conduzindo ainda à interrupção da função cardíaca eficiente e promoção da paragem cardíaca e infarto agudo do miocárdio. Additionally, it is believed that the enhanced cardiac fibrosis observed in cardiovascular disease disrupts or alters the signals transmitted to cardiomyocytes by folding the heart tissue, leading even to interrupt the efficient cardiac function and promotion of cardiac arrest and myocardial infarction. Dado o papel identificado da deposição aumentada da matriz extracelular nas fibroses cardíacas, os compostos da presente invenção são úteis na prevenção, tratamento e/ou melhoria das fibroses cardíacas por uma inibição de L0XL2. Given the role of the identified increased extracellular matrix deposition in cardiac fibrosis, the compounds of this invention are useful in the prevention, treatment and / or amelioration of cardiac fibrosis by inhibiting L0XL2. A presente invenção também providencia composições, métodos, sistemas, dispositivos médicos ou kits para o tratamento ou prevenção de fibrose cardíaca associada com doenças cardiovasculares, tais como cardiopatia hipertensiva (HHD), infarto agudo do miocárdio (MI), aterosclerose, restenose (por exemplo coronária, carótida e lesões cerebrais) e doença cardíaca associada com eventos isquémicos cardíacos. The present invention also provides compositions, methods, systems, medical devices or kits for the treatment or prevention of cardiac fibrosis associated with cardiovascular diseases such as hypertensive heart disease (HHD), myocardial infarction (MI), atherosclerosis, restenosis (e.g. coronary, carotid, and cerebral lesions) and cardiac disease associated with cardiac ischemic events. A resposta de cura pós-MI pode induzir a expressão de L0XL2, mas se este processo continua por verificar, a reticulação excessiva conduz à remodelação da matriz extracelular ou fibrose que resulta em disfunção cardíaca. The post-MI healing response can induce the expression of L0XL2, but if this process continues by checking, excessive crosslinking leads to remodeling of extracellular matrix resulting in fibrosis or cardiac dysfunction. As enzimas que desmantelam matrizes e colagénio ou elastina reticulada parecem funcionar mais lentamente ou menos eficientemente e são ultrapassadas pelos eventos de reticulação. Enzymes which matrices and dismantle crosslinked collagen or elastin seem to work more slowly and less efficiently or are overcome by crosslinking events. Como a L0XL2 também desempenha um papel na transição epitelial-mesenquimatosa (EMT), isto contribui ainda para a remodelação de cardiomiócitos e hipertrofia de cardiomiócitos, além da remodelação da matriz. As L0XL2 also plays a role in epithelial-mesenchymal transition (EMT), this also contributes to the remodeling of cardiomyocytes or cardiomyocyte hypertrophy, in addition to matrix remodeling.

Fibrose reparadora inicial induzida pelo MI pode ser útil (por exemplo, previne aneurisma e dano relacionado) e pode ser permitida proceder sem impedimentos. Initial reparative fibrosis induced by the MI may be useful (for example, prevents aneurysm and related damage) and may be allowed to proceed unhindered. Contudo, apesar de não desejar estar ligados a uma teoria ou mecanismo de ação em particular, os inventores acreditam que o tratamento anti-L0XL2 iniciado após esta fase de fibrose reparadora poderia atenuar a fibrose reativa (não adaptada) que conduz a disfunção cardíaca. However, while not wishing to be bound to a particular theory or mechanism of action, the inventors believe that the anti-L0XL2 treatment started after this reparative fibrosis phase could attenuate reactive fibrosis (non-adapted) leading to heart dysfunction. Por exemplo, o tratamento anti-L0XL2 pode ser iniciado 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 16, 20, 22, 24, 36 ou 48 horas após MI, inclusivé todos os números inteiros entre estes. For example, the anti-L0XL2 treatment may be initiated 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 16, 20, 22, 24, 36 or 48 hours after MI, including all integers therebetween. Adicionalmente, o tratamento anti-LOXL2 pode ser iniciado 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias após MI. Additionally, the anti-LOXL2 treatment may be initiated 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14 days after MI. Da mesma forma, aumentos na pressão sanguínea (hipertensão) resultam na deposição aumentada de colagénio e degradação de proteína reduzida no tecido cardíaco. Similarly, increases in blood pressure (hypertension) result in increased collagen deposition and reduced protein degradation in cardiac tissue. (Berk et al., J. Clin. Invest., 117(3): 568-575 (2007)). (Berk et al, J Clin Invest 117 (3):... 568-575 (2007)). O tratamento anti-LOXL2 iniciado após diagnóstico e/ou estabelecimento de cardiopatia hipertensiva ou hipertensão pode prevenir, reduzir ou melhorar a fibrose associada com hipertensão. The anti-LOXL2 treatment initiated after diagnosis and / or establishment of hypertensive heart disease or hypertension can prevent, reduce or ameliorate fibrosis associated with hypertension. Tal tratamento anti-LOXL2 é iniciado 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias após serem diagnosticados ou detetados aumentos da hipertensão ou pressão sanguínea sistémica. Such anti-LOXL2 treatment is initiated 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14 days after being diagnosed or detected increases in systemic blood pressure or hypertension.

Como outro exemplo, podem ser utilizados biomarcadores para determinar quando um nível apropriado de reticulação pode estar a ocorrer: por exemplo, demonstrou-se que níveis de LOX estão correlacionado com proteína C reativa (CRP), um biomarcador vulgarmente utilizado, e o tratamento poderia começar quando os níveis de CRP são elevados acima dos níveis apropriados normais. As another example, biomarkers can be used to determine when a suitable level of crosslinking may be occur: for example, it was demonstrated that LOX levels are correlated with C-reactive protein (CRP), a biomarker commonly used, and the treatment could start when CRP levels are elevated above normal levels appropriate. Mais diretamente, métodos e kits teste existem para medir a libertação de telopeptídeos de colagénio reticulados na urina ou sangue. More directly, there are methods and kits test to measure the release of crosslinked collagen telopeptides in urine or blood. Os níveis elevados destes fragmentos de colagénio poderiam indicar uma transição de fibrose reparadora para fibrose reativa (não adaptada). Elevated levels of these collagen fragments could indicate a transition to reparative fibrosis reactive fibrosis (non-adapted). Além disso, podem ser feitas medições da função e rendimento cardíaco, incluindo aquelas associadas com contração eficiente do ventrículo. Furthermore, measurements can be made of the function and cardiac output, including those associated with efficient ventricular contraction.

Um inibidor de L0XL2 pode ser entregue a um sujeito antes de, simultâneamente, ou após uma condição patológica ou doença cardíaca, tal como hipertensão, cardiopatia hipertensiva (HHD), infarto agudo do miocárdio (MI), aterosclerose e restenose, para prevenir o desopletar de, para reduzir o risco de ou para regredir a fibrose patológica associada com tal condição patológica ou doença cardíaca. A L0XL2 inhibitor may be delivered to a subject before, simultaneously, or after pathological or heart disease condition, such as hypertension, hypertensive heart disease (HHD), myocardial infarction (MI), atherosclerosis and restenosis, to prevent desopletar in order to reduce the risk of or reverse the pathological fibrosis associated with such a pathological condition or heart disease. Por exemplo, um inibidor de L0X/L0XL2 pode ser administrado pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas ou 10 horas ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 dias após o despoletar de tal condição patológica ou doença cardíaca. For example, an inhibitor of L0X / L0XL2 may be administered at least 1 hour, 2 hours, 3 hours, 5 hours or 10 hours or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, or 14 days after the onset of such a pathological condition or heart disease.

Adicionalmente, está prevista uma duração limitada do tratamento. Additionally, provided is a limited duration of treatment. O tratamento deveria ser prolongado apenas o tempo suficiente para prevenir ou atenuar a fibrose reativa para prevenir ou reduzir disfunção cardíaca. The treatment should be extended just enough time to prevent or attenuate reactive fibrosis to prevent or reduce cardiac dysfunction. Por exemplo, fragmentos de anticorpo FAB de vida curta são utilizados quando durações curtas do tratamento são desejadas. For example, short-lived FAB antibody fragments are used when shorter durations of treatment are desired. Em alternativa, podem ser utilizados anticorpos de comprimento inteiro que têm uma meia-vida mais longa no soro, com dosagem limitada ao longo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 semanas, inclusivé todos os dias entre eles. Alternatively, full-length antibodies may be used which have a longer half-life in serum, with limited dose over 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 weeks, inclusive every day between them. Testes padrão da função cardíaca podem ser utilizados para monitorizar o progresso e ajustar a dosagem conforme necessário, juntamente com a avaliação de biomarcadores relevantes discutidos anteriormente. Standard tests of cardiac function can be used to monitor the progress and adjust the dosage as needed, along with an evaluation of relevant biomarkers discussed above. A duração limitada do tratamento adiciona à segurança desta abordagem. The limited duration of treatment adds to the safety of this approach.

Fibrose do fígado está implicada na patologia de numerosas doenças hepáticas. Liver fibrosis is implicated in the pathology of numerous hepatic diseases. Conforme notado previamente, a fibrose ocorre como uma complicação de hemocromatose, doença de Wilson, alcoolismo, esquistosomíase, hepatite virai, obstrução do duto biliar, exposição a toxinas e distúrbios metabólicos. As noted previously, fibrosis occurs as a complication of hemochromatosis, Wilson's disease, alcoholism, schistosomiasis, viral hepatitis, bile duct obstruction, exposure to toxins and metabolic disorders. Se não for verificada, a fibrose hepática progride para cirrose (definida pela presença de nódulos encapsulados), falha hepática e morte. If left unchecked, hepatic fibrosis progresses to cirrhosis (defined by the presence of encapsulated nodules), liver failure and death. Os estragos crónicos ao figado de tais fontes como parasitas e infeção virai (por exemplo HBV, HCV, HIV, esquistosomíase) ou o stress a longo prazo pelo consume de álcool resulta inevitavelmente na remodelação do fígado, presumivelmente para encapsular a área danificada e proteger o tecido hepático restante do dano. The chronic damage to the liver from such sources as parasites and viral infection (e.g. HBV, HCV, HIV, schistosomiasis) or long-term stress by alcohol consumption inevitably results in liver remodeling, presumably to encapsulate the damaged area and protect the remaining liver tissue damage. (Li e Friedman, Gastroenterol. Hepatol. 14:618-633, 1999). (Li and Friedman, Gastroenterol Hepatol. 14:. 618-633, 1999). A fibrose hepática resulta em alterações da matriz extracelular, incluindo aumentos de 3-10 vezes no conteúdo de colagénio total e substituição da membrana basal de baixa densidade com matriz de alta densidade, que debilitam a função metabólica e síntese de hepatócitos, células de Ito e células endoteliais. Liver fibrosis results in changes of the extracellular matrix, including 3-10 fold increases in total collagen content and replacement of the low density basement membrane with high density matrix, which weaken the metabolic function and synthesis of hepatocytes, and Ito cells endothelial cells. (Girogescu, M., Non-invasive Biochemical Markers of fibrotic liver, J. Gastrointestin. Liver Dis., 15(2) : 149-159 (2006)). (Girogescu, M., Non-invasive Biochemical Markers of fibrotic liver, J. Gastrointestinal Liver Dis, 15 (2):.. 149-159 (2006)). Os compostos da invenção instante são, assim, úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria de doenças hepáticas fibróticas e tal utilização é contemplada aqui por inibição de LOXL2. The compounds of the instant invention are thus useful for the prevention, treatment and / or amelioration of fibrotic liver diseases and such use is contemplated herein for inhibiting LOXL2.

Tal como a fibrose hepática, fibrose renal pode resultar de várias doenças e estragos aos rins. As hepatic fibrosis, renal fibrosis can result from various diseases and damage to the kidneys. Exemplos de tais doenças e estragos incluem doença renal crónica, síndrome metabólica, diabetes e nefrite glomerular resultante. Examples of such diseases include damage and chronic kidney disease, metabolic syndrome, diabetes, glomerular nephritis and resultant. Tornou-se reconhecido que a síndrome metabólica é um grupo de anomalias incluindo distintivos diabéticos tais como resistência à insulina bem como obesidade central ou visceral e hipertensão. It has become recognized that metabolic syndrome is a group of abnormalities including diabetic badge such as insulin resistance and abdominal obesity or visceral and hypertension. Em quase todos os casos, a desregulação da glicose resulta na estimulação da libertação de citocina e regulação para cima da deposição de matriz extracelular. In almost all cases, dysregulation of glucose results in the stimulation of cytokine release and upregulation of extracellular matrix deposition. Fatores adicionais que contribuem para doença renal crónica, diabetes, síndrome metabólica e nefrite glomerular incluem hiperlipidemia, hipertensão e proteinúria, todos os quais resultam em dano adicional aos rins e estimulam ainda mais a deposição de matriz extracelular. Additional factors that contribute to chronic kidney disease, diabetes, metabolic syndrome and glomerular nephritis include hyperlipidemia, hypertension and proteinuria, all of which result in additional damage to the kidneys and further stimulate the deposition of extracellular matrix. Assim, independentemente da causa primária, estragos aos rins resultam em fibrose renal e na perda concomitante da função renal. Thus, regardless of the underlying cause, damage to the kidney resulting in renal fibrosis and concomitant loss of renal function. (Schena, F. e Gesualdo, L., Pathogenic Mechanisms of Diabetic Nephropathy, J. Am. Soc. Nephrol., 16: S30-33 (2005); Whaley-Connell, A., e Sower, JR, Chronic Kidney Disease and the Cardiometabolic Syndrome, J. Clin. Hypert., 8(8): 546-48 (2006)). (Schena, F. and Gesualdo, L., Pathogenic Mechanisms of Diabetic Nephropathy, J Am Soc Nephrol 16: S30-33 (2005); Whaley, Connell A., and Sower, JR, Chronic Kidney Disease... and the Cardiometabolic Syndrome, J. Clin Hypert, 8 (8):.. 546-48 (2006)). Os compostos da invenção instante são, assim, úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria de doenças renais fibróticas (doença renal crónica, nefropatia diabética, nefrite glomerular, síndrome metabólica) e tal utilização é contemplada aqui. The compounds of the instant invention are thus useful for the prevention, treatment and / or amelioration of fibrotic renal disease (chronic renal disease, diabetic nephropathy, glomerular nephritis, metabolic syndrome), and such use is contemplated herein. A fibrose pulmonar inclui muitos síndromes e doenças. Lung fibrosis includes many syndromes and diseases. Doenças exemplares incluem fibrose pulmonar idiopática (IPF), pneumonia intersticial idiopática e síndrome do desconforto respiratório do adulto (ARDS). Exemplary diseases include idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), idiopathic interstitial pneumonia and adult respiratory distress syndrome (ARDS). A patogénese da maioria das fibroses pulmonares, incluindo as doenças supracitadas não são bem entendidas, contudo todas são caracterizadas por um influxo de células inflamatórias e um aumento subsequente na síntese e deposição de matriz extracelular rica em colagénio. The pathogenesis of most pulmonary fibrosis, including the above diseases are not well understood, but all are characterized by an influx of inflammatory cells and a subsequent increase in the synthesis and deposition of collagen-rich extracellular matrix. (Chua et ai., Am J. Respir. Cell. Mol. Biol., 33:9-13 (2005); Tzortzaki et al., J. Histochem. & Cytochem., 54(6): 693-700 (2006); Armstrong et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 160: 1910-1915 (1999)). (Chua et al, Am J Respir Cell Mol Biol, 33: 9-13 (2005); Tzortzaki et al, J Histochem & amp; Cytochem, 54 (6):....... 693-700 (. 2006); Armstrong et al, Am J Respir Crit Care Med, 160: 1910-1915 (1999))...... Dado o papel identificado de deposição de colagénio e matriz extracelular aumentada nas fibroses pulmonares, os compostos da presente invenção são úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria das fibroses pulmonares por uma inibição de LOXL2. Given the role identified deposition of collagen and extracellular matrix increased in pulmonary fibrosis, the compounds of this invention are useful for the prevention, treatment and / or amelioration of pulmonary fibrosis by inhibiting LOXL2.

Escleroderma é um distúrbio autoimune, no qual existe uma sobreprodução de colagénio anormal. Scleroderma is an autoimmune disorder in which there is an abnormal collagen overproduction. Este colagénio em excesso acumula-se por todo o corpo, causando endurecimento (esclerose), cicatrização (fibrose) e outro dano. This excess collagen accumulates throughout the body, causing hardening (sclerosis), scarring (fibrosis) and other damage. 0 dano pode afetar o aparecimento de pele ou pode envolver apenas os orgãos internos. 0 damage can affect the appearance of the skin or may involve only the internal organs. Os sintomas e severidade do escleroderma variam de pessoa para pessoa. Symptoms and severity of scleroderma vary from person to person. Dado o papel identificado de colagénio aumentado no escleroderma, os compostos da presente invenção são úteis para a prevenção, tratamento e/ou melhoria de escleroderma por uma inibição de L0XL2. Given the role of increased collagen identified in scleroderma, the compounds of this invention are useful for the prevention, treatment and / or amelioration of scleroderma by inhibition L0XL2. A angiogénese anormal que pode ser tratada ou prevenida utilizando esta invenção inclui aquela angiogénese anormal que acompanha a artrite reumatóide, edema e lesão cerebral relacionado com reperfusão isquémica, isquémia cortical, hiperplasia e hipervascularidade, (sindrome do ovário policistico), endometriose, psoriase, retinopatia diabética e outras doenças angiogénicas oculares, tais como retinopatia da prematuridade (fibroplasia retrolental) , degeneração muscular, rejeição do enxerto da cornea, glaucoma neuroscular e sindrome de Oster Webber. Abnormal angiogenesis that may be treated or prevented using the invention include those abnormal angiogenesis accompanying rheumatoid arthritis, edema and brain damage associated with ischemic reperfusion injury, cortical ischemia, hyperplasia and hypervascularity, (polycystic ovary syndrome), endometriosis, psoriasis, retinopathy diabetic and other ocular angiogenic diseases such as retinopathy of prematurity (retrolental fibroplasia), macular degeneration, corneal graft rejection, neuroscular glaucoma and Oster Webber syndrome.

Doenças associadas com a angiogénese anormal requerem ou induzem crescimento vascular. Diseases associated with abnormal angiogenesis require or induce vascular growth. Por exemplo, a angiogénese córnea envolve três fases: um período latente pré-vascular, neovascularização ativa e maturação e regressão vascular. For example, corneal angiogenesis involves three phases: a pre-vascular latent period, active neovascularization, and vascular maturation and regression. A identidade e mecanismo de vários fatores angiogénicos, incluindo elementos da resposta inflamatória, tais como leucócitos, plaquetas, citocinas e eicosanoids ou constituintes do plasma não identificados ainda estão para ser revelados. The identity and mechanism of various angiogenic factors, including elements of the inflammatory response, such as leukocytes, platelets, cytokines, and eicosanoids, or plasma constituents are not identified to be revealed.

Os anticorpos anti-L0XL2 descritos aqui podem ser utilizados para tratar doenças associadas com angiogénese anormal ou indesejada. The anti-L0XL2 antibodies described herein can be used to treat diseases associated with abnormal or undesirable angiogenesis. 0 método compreende administrar a um paciente que padece de angiogénese anormal ou indesejada um inibidor de LOXL em combinação com agente anti-neoplástico ou agente anti-angiogénico que não é dito inibidor de LOXL. 0 method comprises administering to a patient suffering from undesired or abnormal angiogenesis one LOXL inhibitor in combination with anti-neoplastic or anti-angiogenic agent that is not said LOXL inhibitor. A dosagem particular destes agentes necessária para inibir (parcialmente ou completamente) a angiogénese e/ou doenças angiogénicas pode depender da severidade da condição patológica, da via de administração e fatores relacionados que podem ser decididos pelo médico em funções. The particular dosage of these agents required to inhibit (partially or completely) angiogenesis and / or angiogenic diseases may depend on the severity of the pathological condition, the route of administration and related factors which may be determined by the physician in functions. Em geral, doses diárias aceites e eficazes são a quantidade suficiente para inibir eficazmente a angiogénese e/ou doenças angiogénicas. Generally, accepted and effective daily doses are the amount sufficient to effectively inhibit angiogenesis and / or angiogenic diseases.

De acordo com esta modalidade, as formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar uma variedade de doenças associadas com angiogénese indesejada, tais como neovascularização retinal/coroidal e neovascularização da córnea. According to this embodiment, the pharmaceutical formulations of the present invention can be used to treat a variety of diseases associated with undesired angiogenesis, neovascularization including retinal / choroidal neovascularization and corneal neovascularization. Exemplos de neovascularização retinal/coroidal incluem, mas não se limitam a, doenças de Bests, miopia, poços óticos, doenças de Stargarts, doença de Pagets, oclusão venosa, oclusão arterial, anemia das células falciformes, sarcóide, sífilis, doenças obstrutivas da carótida de Pseudoxanthoma elasticum, uveíte/vitrite crónica, infeções micobacterianas, doença de Lyme, lúpus eritematoso sistémico, retinopatia de prematuridade, doença de Eales, retinopatia diabética, degeneração macular, doenças de Bechets, infeções que causam uma retinite ou croidite, suposta histoplasmose ocular, pars planite, destacamento da retina crónico, síndromes de hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós-laser, doenças associadas com rubese (neovascularização do ângulo) e doenças causadas pela proliferação anormal do tecido fibrovascular ou fibroso incluindo todas as formas de vítreo-retinopatia proliferativa. Examples of retinal / choroidal neovascularization include, but are not limited to, Bests diseases, myopia, optic pits, Stargarts diseases, Pagets disease, vein occlusion, artery occlusion, sickle cell anemia, sarcoid, syphilis, obstructive diseases of the carotid for Pseudoxanthoma elasticum, uveitis / chronic vitritis, infections mycobacterial, Lyme disease, systemic lupus erythematosis, retinopathy of prematurity, Eales disease, diabetic retinopathy, macular degeneration, Bechets diseases, infections that cause retinitis or croidite, presumed ocular histoplasmosis, pars planitis, detachment chronic retinal, hyperviscosity syndromes, toxoplasmosis, trauma and post-laser complications, diseases associated with rubese (neovascularization of the angle) and diseases caused by the abnormal proliferation of fibrovascular or fibrous tissue including all forms of proliferative vitreoretinopathy . Exemplos de neuvascularização da córnea incluem, mas não se limitam a, ceratoconjuntivite epidémica, deficiência em Vitamina A, desgaste da lente de contacto, ceratite atópica, ceratite límbica superior, ceratite pterígeo sicca, síndrome de Sjogrens, acne rosácea, filectenulose, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, rejeição do enxerto da córnea, úlcera de Mooren, degeneração marginal de Terrien, ceratólise marginal, poliartrite, sarcoidose de Wegener, esclerite, ceratotomia radial perifigóide, glaucoma neovascular e fibroplasia retrolental, sífilis, infeções por Mycobacteria, degeneração lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infeções por Herpes simplex, infeções por Herpes zóster, infeções por protozoários e sarcoma de Kaposi. Examples of corneal neuvascularização include, but are not limited to, epidemic keratoconjunctivitis, deficiency in Vitamin A, contact lens wear, atopic keratitis, keratitis superior limbic, keratitis pterygium sicca in Sjogren's syndrome, acne rosacea, phylectenulosis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal graft rejection, Mooren ulcer, marginal degeneration Terrien's marginal ceratólise, polyarteritis, Wegener's sarcoidosis, scleritis, radial keratotomy perifigóide, neovascular glaucoma and retrolental fibroplasia, syphilis infection by Mycobacteria, lipid degeneration, burns chemical, bacterial ulcers, fungal ulcers, Herpes simplex infections, Herpes zoster infections, protozoan infections and Kaposi's sarcoma.

Ainda noutra modalidade, as formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar doenças inflamatórias crónicas associadas com angiogénese anormal. In yet another embodiment, the pharmaceutical formulations of the present invention may be used to treat chronic inflammatory diseases associated with abnormal angiogenesis. 0 método compreende administrar a um paciente que padece de uma doença inflamatória crónica associada com angiogénese anormal um inibidor de L0XL2 em combinação com agente anti-neoplástico ou agente anti-angiogénico que não é dito inibidor de L0XL2. 0 method comprises administering to a patient suffering from a chronic inflammatory disease associated with abnormal angiogenesis L0XL2 one inhibitor in combination with anti-neoplastic or anti-angiogenic agent that is not said inhibitor L0XL2. A inflamação crónica depende da formação continua de brotes capilares para manter um influxo de células inflamatórias. The chronic inflammation depends on continuous formation of capillary sprouts to maintain an influx of inflammatory cells. 0 influxo e presença das células inflamatórias produz granulomas e mantém, assim, o estado de inflamação crónica. 0 influx and presence of the inflammatory cells produce granulomas and thus maintains the state of chronic inflammation. A inibição da angiogénese utilizando os compostos descritos aqui pode prevenir a formação dos granulossomas, aliviando, assim, a doença. Inhibition of angiogenesis using the compounds described herein may prevent the formation of granulossomas, thereby alleviating the disease. Exemplos de doença inflamatória crónica incluem, mas não se limitam a, doenças inflamatórias do intestino, tais como a doença de Crohn e colite ulcerativa, psoríase, sarcoidose e artrite reumatóide. Examples of chronic inflammatory disease include, but are not limited to, inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis, psoriasis, sarcoidosis and rheumatoid arthritis.

Doenças inflamatórias do intestino, tais como doença de Crohn e colite ulcerativa caracaterizam-se por inflamação crónica e angiogénese em vários locais no trato gastrointestinal. inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis caracaterizam by chronic inflammation and angiogenesis at various sites in the gastrointestinal tract. Por exemplo, a doença de Crohn ocorre como uma doença inflamatória transmural crónica que afeta de forma mais comum o íleo distai e cólon, mas também pode ocorrer em qualquer parte do trato gastrointestinal da boca ao ânus e área perianal. For example, Crohn's disease occurs as a chronic transmural inflammatory disease that affects most common forms the distal ileum and colon but may also occur in any part of the gastrointestinal tract from mouth to anus and perianal area. Os pacientes com doença de Crohn têm, em geral, diarreia crónica associada com dor abdominal, febre, anorexia, perda de peso e inchaço abdominal. Patients with Crohn's disease are, in general, chronic diarrhea associated with abdominal pain, fever, anorexia, weight loss and abdominal swelling. A colite ulcerativa também é uma doença crónica, inespecífica, inflamatória e ulcerativa que surge na mucosa colónica e se caracateriza pela presença de diarreia ensanguentada. Ulcerative colitis is also a chronic, nonspecific, inflammatory and ulcerative arising in the colonic mucosa and caracateriza by the presence of bloody diarrhea. Estas doenças inflamatórias do intestino são, em geral, causadas por inflamação granulomatosa crónica ao longo do trato gastrointestinal, envolvendo novos brotes capilares rodeados de um cilindro de células inflamatórias. These inflammatory bowel diseases are generally caused by chronic granulomatous inflammation throughout the gastrointestinal tract, involving new capillary sprouts surrounded by a cylinder of inflammatory cells. A inibição da angiogénese pelas formulações farmacêuticas da presente invenção deveria inibir a formação de brotes e prevenir a formação de granulomas. Inhibition of angiogenesis by the pharmaceutical formulations of the present invention should inhibit the formation of the sprouts and prevent the formation of granulomas. As doenças inflamatórias do intestino também exibem manifestações intestinais extra, tais como lesões da pele. The inflammatory bowel diseases also exhibit extra intestinal manifestations, such as skin injuries. Tais lesões caracterizam-se pela inflamação e angiogénese e podem ocorrer em muitos locais além do trato gastrointestinal. Such lesions are characterized by inflammation and angiogenesis and can occur at many sites beyond the gastrointestinal tract. A inibição da angiogénese pelas formulações farmacêuticas da presente invenção deveria reduzir o influxo de células inflamatórias e prevenir a formação de lesões. Inhibition of angiogenesis by the pharmaceutical formulations of the present invention should reduce the influx of inflammatory cells and prevent lesion formation. Portanto, são providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método de tratar uma doença intestinal inflamatória, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; Therefore, L0XL2 antibodies are provided herein for use in a method of treating an inflammatory bowel disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-L0XL2 antibody; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

Sarcoidose, outra doença inflamatória crónica, caracteriza-se como um distúrbio granulomatoso multi-sistema. Sarcoidosis, another chronic inflammatory disease, is characterized as a multisystem granulomatous disorder. Os granulomas desta doença podem formar-se em qualquer lado do corpo e os sintomas dependem, assim, do local dos granulomas e se a doença está ativa. The granulomas of this disease can form anywhere in the body and the symptoms thus depend on the site of the granulomas and whether the disease is active. Os granulomas são criados pelos brotes capilares angiogénicos que providenciam um fornecimento constante de células inflamatórias. The granulomas are created by the angiogenic capillary sprouts that provide a constant supply of inflammatory cells. Ao utilizar as formulações farmacêuticas da presente invenção para inibir a angiogénese, tal formação de granulomas pode ser inibida. By using the pharmaceutical formulations of the present invention to inhibit angiogenesis, such granulomas formation can be inhibited. A psoriase, também uma doença inflamatória recorrente e crónica, caracteriza-se por pápulas e placas de vários tamanhos. Psoriasis, also a recurrent inflammatory disease and chronic, characterized by papules and plaques of various sizes. 0 tratamento utilizando as formulações farmacêuticas da presente invenção deveriam prevenir a formação de novos vasos sanguíneos necessários para manter as lesões características e providenciar ao paciente alívio dos sintomas. 0 Treatment using the pharmaceutical formulations of the present invention should prevent the formation of new blood vessels necessary to maintain the characteristic lesions and provide the patient relief of the symptoms. Portanto, é providenciado aqui um método de prevenir a formação de novos vasos sanguíneos necessários para manter as lesões características e providenciar ao paciente alívio dos sintomas, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-L0XL2; Therefore, provided herein is a method of preventing the formation of new blood vessels necessary to maintain the characteristic lesions and provide the patient relief of symptoms, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-L0XL2 antibody; e opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. A artrite reumatóide (RA) também é uma doença inflamatória crónica caracterizada pela inflamação inespecífica das articulações periféricas. Rheumatoid arthritis (RA) is also a chronic inflammatory disease characterized by nonspecific inflammation of the peripheral joints. Pensa-se que os vasos sanguíneos no revestimento sinuvial das articulações passam por angiogénese. It is thought that the blood vessels in the synovial lining of the joints undergo angiogenesis. Além de formar novas redes vasculares, as células endoteliais libertam fatores e espécies de oxigénio reativos que conduzem a crescimento de pano e destruição da cartilagem. In addition to forming new vascular networks, the endothelial cells release factors and reactive oxygen species that lead to pannus growth and cartilage destruction. Os fatores envolvidos na angiogénese podem contribuir ativamente para, e ajudar a manter, o estado cronicamente inflamado de artrite reumatóide. The factors involved in angiogenesis may actively contribute to, and help maintain, the chronically inflamed state of rheumatoid arthritis. 0 tratamento utilizando as formulações farmacêuticas da presente invenção apenas ou em conjunção com outros agentes anti-RA pode prevenir a formação de novos vasos sanguíneos necessário para manter a inflamação crónica e providenciar ao paciente com RA alívio dos sintomas. 0 Treatment using the pharmaceutical formulations of the invention alone or in conjunction with other anti-RA agents may prevent the formation of new blood vessels necessary to maintain the chronic inflammation and provide the RA patient relief from the symptoms. Outros agentes anti-RA são convencionais e conhecidos na arte. Other anti-RA agents are conventional and known in the art. Portanto, são providenciados aqui anticorpos L0XL2 para utilização num método de prevenir ou tratar RA, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-LOX ou um anticorpo anti-L0XL2; Therefore, they provided herein are L0XL2 antibodies for use in a method of preventing or treating RA, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-LOX antibody or an anti-antibody L0XL2; e opcionalmente, um ou mais outros agentes anti-RA. and optionally one or more other anti-RA agents.

Além da utilização dos anticorpos anti-LOXL2 sozinhos no tratamento das indicações descritas anteriormente, também é contemplada terapêutica de combinação aqui. In addition the use of anti-LOXL2 antibodies alone in the treatment of indications described above, also contemplated is combination therapy here. Os métodos providenciados aqui podem ainda incluir administrar um agente ou tratamento anti-cancerigeno ao paciente. The methods provided herein can further include administering an agent or anti-cancer treatment to the patient. É providenciado aqui um método de tratar qualquer uma das indicações descritas anteriormente administrando um anticorpo anti-LOX e um anticorpo anti-L0XL2. Provided herein is a method of treating any of the indications described above by administering an anti-LOX antibody and an anti-L0XL2 antibody.

Num aspeto, esta invenção contém métodos para inibir a invasão e metástase de células tumorais, contactando as células com pelo menos um agente citotóxico e pelo menos um anticorpo anti-L0X2. In one aspect, this invention comprises methods for inhibiting invasion and metastasis of tumor cells by contacting the cells with at least one cytotoxic agent and at least one anti-L0X2 antibody. Em geral, o método inclui uma etapa de contactar células de tumor metastático com uma quantidade de pelo menos um agente citotóxico e pelo menos um anticorpo anti-L0X2, que, em combinação, é eficaz para reduzir ou inibir a invasão ou potencial metastático da célula. In general, the method includes a step of contacting metastatic tumor cells with an amount of at least one cytotoxic agent and at least one anti-L0X2 antibody, which in combination, is effective to reduce or inhibit the invasion or metastatic potential of the cell . Em alternativa, de acordo com a presente invenção, um anticorpo anti-L0XL2 pode ser combinado com um agente quimioterapêutico para sensibilizar as células tumorais (por exemplo, transição do estado EMT para o estado MET) para serem mortas pelo agente quimioterapêutico, assim não só prevenindo ou inibindo a invasão tumoral e metástase, mas também inibindo o crescimento tumoral primário. Alternatively, according to the present invention, an anti-L0XL2 antibody may be combined with a chemotherapeutic agent to sensitize tumor cells (e.g., state transition EMT to MET state) to be killed by the chemotherapeutic agent, thus not only by preventing or inhibiting tumor invasion and metastasis but also inhibiting primary tumor growth.

Qualquer agente anti-cancerigeno adequado pode também ser empregue nos presentes métodos. Any suitable anticancer agent can also be employed in the present methods.

Conforme utilizado aqui o termo "agente quimioterapêutico" As used herein the term & quot; chemotherapeutic agent & quot; ou "quimioterapêutico" or & quot; chemotherapeutic & quot; (ou "quimioterapêutica," no caso de tratamento com um agente quimioterapêutico) pretende-se que abranje qualquer composto químico não proteináceo (isto é, não peptídico) útil no tratamento de cancro. (Or & quot; chemotherapeutic, & quot; in the case of treatment with a chemotherapeutic agent) intended to abranje any non-proteinaceous chemical compound (i.e., no peptide) useful in the treatment of cancer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN ™); sulfonates de alquilo, tais como busulfano, improsulfano e piposulfano; alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; aziridines such as benzodopa, carboquone, meturedopa, and uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; ethylenimines and methylamelamines including altretamine, triethylenemelamine,, triethiylenethiophosphoramide and trimethylolomelamine; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); acetogenins (especially bullatacin and bullatacinone); uma camptotecina (incluindo análogo sintético topotecano); one camptothecin (including synthetic analogue topotecan); briostatina; bryostatin; calistatina; callystatin; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); CC-1065 (including its synthetic analogues adozelesin, carzelesin and bizelesin synthetic analogues); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); cryptophycins (particularly cryptophycin 1 and cryptophycin 8); dolastatina; dolastatin; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); duocarmycin (including the synthetic analogues, KW-2189 and CBI-TMI); eleuterobina; eleutherobin; pancratistatina; pancratistatin; uma sarcodictina; one sarcodictyin; espongistatina; spongistatin; mostardas de nitrogénio, tais como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlomaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracil mustard; nitrosoureias tais como carmustina, clorozotocina, foremustina, lomustina, nimustina, ranimustina; nitrosoureas such as carmustine, chlorozotocin, foremustina, lomustine, nimustine, ranimustine; antibióticos tais como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II e caliqueamicina phill, ver, por exemplo, Agnew, Chem. Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonates, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos cromoproteina enedina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adramicina™) (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina) , epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozoc antibiotics such as the enediyne antibiotics (e.g., calicheamicin, especially calicheamicin gamma II and calicheamicin phill, see, e.g., Agnew, Chem Inti Ed Engl., 33:... 183-186 (1994); dynemicin, including dynemicin A ; bisfosfonates, such as clodronate; an esperamicin; as well as neocarzinostatin chromophore and related chromophores tetrameric hemeprotein enediyne antibiotics), aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6- diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin (adriamycin ™) (including morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, 2-pyrrolino-doxorubicin and deoxidoxorrubicina), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins such as mitomycin C, mycophenolic acid , nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, estreptozoc ina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; phosphine, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); anti-metabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); análogos do ácido fólico tais como demopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; folic acid analogs such as demopterina, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; análogos da purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; anti-adrenals such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; reabastecedor de ácido fólico tais como ácido frolinico; folic acid replenisher such as frolinic acid; aceglatona; aceglatone; aldofosfamida glicosida; aldophosphamide glycoside; ácido aminolevulinico; aminolevulinic acid; eniluracilo; eniluracil; amsacrina; amsacrine; bestrabucilo; bestrabucil; bisantreno; bisantrene; edatraxato; edatraxate; defofamina; defofamine; demecolcina; demecolcine; diaziquona; diaziquone; elfornitina; elfornithine; acetato de eliptinio; elliptinium acetate; uma epotilona; an epothilone; etoglúcido; etoglucid; nitrato de gálio; gallium nitrate; hidroxiureia; hydroxyurea; lentinano; lentinan; lonidamina; lonidamine; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; maytansinoids such as maytansine and ansamitocins; mitoguazona; mitoguazone; mitoxantrona; mitoxantrone; mopidamol; mopidamol; nitracrina; nitracrine; pentostatina; pentostatin; fenameto; fenameto; pirarrubicina; pirarubicin; losoxantrona; losoxantrone; ácido podofilinico; podophyllinic acid; 2-etilhidrazida; 2-ethylhydrazide; procarbazina; procarbazine; PSK™; PSK ™; razoxano; razoxane; rizoxina; rhizoxin; sizofirano; sizofiran; espirogermânio; spirogermanium; ácido tenuazónico; tenuazonic acid; triaziquona; triaziquone; 2,2',2"-triclorotrietilamina; 2,2 ', 2 & quot; -trichlorotriethylamine; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A e anguidina); trichothecenes (especially T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidine); uretano; urethane; vindesina; vindesine; dacarbazina; dacarbazine; manomustina; mannomustine; mitobronitol; mitobronitol; mitolactol; mitolactol; pipobromano; pipobroman; gacitosina; gacytosine; arabinosida ("Ara-C"); arabinoside (& quot; Ara-C & quot;); ciclofosfamida; cyclophosphamide; tiopeta; tiopeta; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol Meyers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e docetaxel (TAXOTERE™., Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); taxoids, e.g., paclitaxel (TAXOL ™, Bristol Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and docetaxel (TAXOTERE ™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France.); clorambucilo; chlorambucil; gemcitabina (Gemzar™); gemcitabine (Gemzar ™); 6-tioguanina; 6-thioguanine; mercaptopurina; mercaptopurine; metotrexato; methotrexate; análogos da platina tais como cisplatina e carboplatina; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; vinblastina; vinblastine; platina; platinum; etoposido (VP-16); etoposide (VP-16); ifosfamida; ifosfamide; mitroxantrona; mitroxantrone; vancristina; vancristina; vinorelbina (Navelbine™) ; vinorelbine (Navelbine ™); novantrona; novantrone; teniposido; teniposide; edatrexato; edatrexate; daunomicina; daunomycin; aminopterina; aminopterin; xeoloda; xeoloda; ibandronato; ibandronate; CPT-11; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; topoisomerase inhibitor RFS 2000; diflurometilornitina (DMFO) ; diflurometilornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; retinoids such as retinoic acid; capecitabina; capecitabine; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the foregoing. Também estão incluídos na definição de "agente quimioterapêutico" Also included in the definition of & quot; chemotherapeutic agent & quot; agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal nos tumores tais como anti-estrogénios e moduladores do recetor de estrogénio seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston™); anti-hormonal agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens and modulators, selective estrogen receptor (SERMs), including, for example, tamoxifen (including Nolvadex ™), raloxifene, droloxifene, 4-hydroxytamoxifen , trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, and toremifene (Fareston ™); inibidores da enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) e anastrozol (Arimidax™) ; inhibitors of the enzyme aromatase, which regulates estrogen production in the adrenal glands, such as, for example, 4 (5) -imidazóis, aminoglutethimide, megestrol acetate (Megace ™), exemestane, formestane, fadrozole, vorozole (Rivisor ™) letrozole (Femara ™), and anastrozole (Arimidax ™); e anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuproliada e goserelina; and anti-androgens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, goserelin and leuproliada; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the foregoing.

Num exemplo não limitante, esta invenção inclui métodos para inibir sinergicamente a invasão e metástase das células tumorais, contactando as células com pelo menos cisplatina e pelo menos um anticorpo anti-LOX (ver Figura 18). In a non-limiting example, this invention includes methods synergistically to inhibit the invasion and metastasis of tumor cells by contacting the cells with at least cisplatin and at least one anti-LOX antibody (see Figure 18). Alguém que pratique os métodos descritos aqui deveria entender que um anticorpo anti-LOX2 poderia ser utilizado em tais métodos. Someone who practices the methods described herein should understand that an anti-LOX2 antibody could be used in such methods.

Numa modalidade, o agente anti-neoplástico em combinação com o modulador LOX/LOXL é um inibidor da tirosina quinase. In one embodiment, the anti-neoplastic agent in combination with the LOX / LOXL modulator is a tyrosine kinase inhibitor. Por exemplo, ZD1839 (Iressa™ de AstraZeneca KK) mostra um efeito competitivo para ATP no local de ligação de ATP de EGFR (recetor do fator de crescimento epidérmico) tirosina quinase e inibe a atividade da tirosina quinase inibindo a autofosforilação da tirosina quinase. For example, ZD1839 (Iressa ™ AstraZeneca KK) shows a competitive effect for ATP in ATP binding site of EGFR (receptor epidermal growth factor) receptor tyrosine kinase and inhibits tyrosine kinase activity by inhibiting the autophosphorylation of tyrosine kinase. Como um resultado, o efeito anti-cancerígeno é expresso bloqueando uma transdução do sinal que equipa EGFR (ligandos tais como fator de crescimento epidérmico (EGF) estão ligados ao domínio extracelular de EGFR, seguido da ativação de EGFR tirosina quinase no domínio intracelular, causando não só autofosforilação de EGFR, mas também a fosforilação de várias proteínas alvo intracelulares, transduzindo depois um sinal de proliferação da superfície celular para o núcleo, transduzindo depois os sinais de proliferação da superfície da célula cancerígena para o núcleo e resultando na proliferação, infiltração, metástase, angiogénese das células cancerígenas) em associação com proliferação, infiltração, diferenciação e metástase. As a result, the anticancer effect is expressed by blocking a signal transduction that EGFR team (ligands such as epidermal growth factor (EGF) linked to the extracellular domain of EGFR, followed EGFR activation of tyrosine kinase in the intracellular domain, causing not only autophosphorylation of EGFR but also phosphorylation of various intracellular target proteins after transducing a proliferation signal from the cell surface to the nucleus after transducing the signals proliferation of the surface of cancerous cells to the core and resulting in proliferation, infiltration, metastasis, angiogenesis of cancer cells) in association with proliferation, infiltration, differentiation and metastasis. IMC-C225 ou cetuximab (Erbitux™) que é um anticorpo monoclonal dirigido a EGFR) reconhece a parte recetora de EGFR numa superfície da membrana celular e inibe a autofosforilação de EGFR inibindo, assim, a atividade de tirosina quinase. IMC-C225 or Cetuximab (Erbitux ™) which is a monoclonal antibody directed to EGFR) receiving part recognizes the EGFR surface of a cell membrane and inhibits the autophosphorylation of EGFR, thus inhibiting tyrosine kinase activity. Herceptina é um anticorpo monoclonal contra Her2/Neu que é homóloga a EGFR e mesilato de imatinib (GLEEVEC™, anteriormente STI-571) podem inibir ambas atividades de tirosina quinase de BCR-Abl e c-kit (documento não patente N.° 2) . Herceptin is a monoclonal antibody against Her2 / neu and EGFR is homologous to imatinib mesylate (GLEEVEC ™, formerly STI-571) can both inhibit tyrosine kinase activity of the BCR-ABL and c-kit (non-patent document No. 2 ). Sorafenib (Nexavar™) é um pequeno inibidor molecular da Raf quinase, PDGF (fator de crescimento derivado de plaqueta), recetor de VEGF 2 & Sorafenib (Nexavar ™) is a small molecule inhibitor of Raf kinase, PDGF (growth factor platelet-derived) VEGF receptor 2 & amp; 3 quinases e c-Kit. 3 and c-Kit kinases.

Conforme utilizado aqui, anticorpos monoclonais contra tumores antigenos são anticorpos despoletados contra antigenos expressos por tumores e células leucémicas, preferencialmente antigenos específicos de tumor. As used herein, monoclonal antibodies against tumor antigens are triggered antibodies against antigens expressed by tumors and leukemia cells, preferably tumor-specific antigens. 0 anticorpo monoclonal também inclui anticorpo humanizado e completamente humano. 0 monoclonal antibody also includes humanized and fully human antibody.

Outros exemplos de anticorpos terapêuticos para terapêutica cancerígena incluem Trastuzumab (HERCEPTIN™; A sobre-expressão da proteína HER2 está associada com doença mais agressiva e prognóstico mais fraco na clínica); Other examples of therapeutic antibodies for cancer therapy include Trastuzumab (HERCEPTIN ™; Overexpression of HER2 protein is associated with more aggressive disease and poorer prognosis in the clinic); Rituximab (RITUXAN™) que é criado contra CD20 em células de linfoma e depleta seletivamente células CD20+ pré-B e B maduras normais e malignas; Rituximab (RITUXAN ™) that is raised against CD20 on lymphoma cells and selectively depletes CD20 + pre-B cells and mature normal and malignant B; Alemtuzumab (CAMPATH™), um anticorpo monoclonal que se dirige especificamente ao antigeno CD52 que é encontrado nos linfócitos B e T e utilizado para o tratamento de leucemia linfocítica crónica (CLL) e linfoma; Alemtuzumab (CAMPATH ™), ​​a monoclonal antibody that is specifically directed to the CD52 antigen which is found on B and T lymphocytes and used for the treatment of chronic lymphocytic leukemia (CLL) and lymphoma; e Gemtuzumab zogamicina (MYLOTARG™), um conjugado de anticorpo que combina um anticorpo específico contra CD33 com um fármaco quimioterapêutico (zogamicina) e é indicado para o tratamento de leucemia mielocítica aguda adulta reincidente. and zogamicina Gemtuzumab (MYLOTARG ™), an antibody conjugate that combines a specific antibody to CD33 with a chemotherapeutic drug (zogamicina) and is indicated for the treatment of adult acute myelocytic leukemia relapsed.

Noutra modalidade, o agente anti-angiogénico é combinado com um inibidor de L0XL2 para tratar cancro e outras doenças associadas com angiogénese anormal ou indesejável. In another embodiment, the antiangiogenic agent is combined with a L0XL2 inhibitor to treat cancer and other diseases associated with abnormal or undesirable angiogenesis. Exemplos de agentes anti-angiogénicos incluem, mas não se limitam a, ácido retinóide e derivados do mesmo, 2-metoxiestradiol, ANGIOSTATIN™, ENDOSTATIN™, suramin, esqualamina, inibidor de tecido da metaloproteinase-I, inibidor de tecido da metaloproteinase-2, inibidor do ativador de plasminogénio-1, inibidor do ativador de plasminogénio-2, inibidor derivado de cartilagem, paclitaxel, fator de plaqueta 4, sulfato de protamina (clupeína), derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de conchas de caranguejo rainha), complexo de peptidoglicano polissacarídeo sulfatado (sp-pg), estaurosporina, moduladores de metabolismo da matriz, incluindo, por exemplo, análogos da prolina ((ácido I-azetidina-2-carboxílico (LACA), cishidroxiprolina, d,1-3,4-dehidroprolina, tiaprolina, a-dipiridilo, fumarato de β-aminopropionitrilo, 4-propil-5- (4-piridinil)-2(3h)-oxazolona; metotrexato, mitoxantrona, heparina, interferões, 2 macroglobulina-soro, chimp-3, quimiostatina, tetradecassu Examples of anti-angiogenic agents include, but are not limited to, retinoid acid and derivatives thereof, 2-methoxyestradiol, Angiostatin ™, Endostatin ™, suramin, squalamine, tissue inhibitor of metalloproteinase-I, tissue inhibitor of metalloproteinase-2 plasminogen-1 activator inhibitor, plasminogen-2 activator, cartilage-derived inhibitor, paclitaxel, platelet factor 4, protamine sulfate (clupeína), chitin derivates sulfated (prepared from queen crab shells) , sulfated polysaccharide peptidoglycan complex (sp-pg), staurosporine, modulators of matrix metabolism, including for example, proline analogs ((I-azetidine-2-carboxylic acid (LACA), cishidroxiprolina, d, 1-3, 4-dehydroproline, thiaproline, a-dipyridyl, β-aminopropionitrile fumarate, 4-propyl-5- (4-pyridinyl) -2 (3h) -oxazolone; methotrexate, mitoxantrone, heparin, interferons, 2 macroglobulin-serum, chimp- 3, chymostatin, tetradecassu lfato de β-ciclodextrina, eponemicina; lfato of β-cyclodextrin, Eponemycin; fumagilina, tiomalato de sódio ouro, d-penicilamina (CDPT), beta.-1-anticolageniase-soro, alfa.2-antiplasmina, bisantreno, lobenzarito dissódico, ácido n-2-carboxifenil-4-cloroantronílico dissódico ou "CCA", talidomida; fumagillin, sodium gold thiomalate, d-penicillamine (CDPT), beta.-1-anticolageniase antiserum, alfa.2-antiplasmin, bisantrene, lobenzarito disodium, N-2-carboxyphenyl-4-chloroanthronilic acid disodium or & quot; CCA & quot; , thalidomide; esteróide angiostático, carboxinaminolmidazol; angiostatic steroid, carboxinaminolmidazol; inibidores de metalloproteinase, tais como BB94. metalloproteinase inhibitors such as BB94. Outros agentes anti-angiogénese incluem anticorpos, preferencialmente anticorpos monoclonais contra estes fatores de crescimento angiogénicos: bFGF, aFGF, FGF-5, isoformas VEGF, VEGF-C, HGF/SF e Ang-l/Ang-2. Other anti-angiogenesis agents include antibodies, preferably monoclonal antibodies against these angiogenic growth factors: bFGF, aFGF, FGF-5, VEGF isoforms, VEGF-C, HGF / SF and Ang-l / Ang-2. Ferrara N. e Alitalo, K. "Clinicai application of angiogenic growth factors and their inhibitors" Ferrara N. and Alitalo, K. & quot; Clinical application of angiogenic growth factors and Their Inhibitors & quot; (1999) Nature Medicine 5:1359-1364. (1999) Nature Medicine 5: 1359-1364.

Agentes anti-fibróticos exemplares incluem, mas não se limitam a, compostos tais como β-aminoproprionitrilo (BAPN), bem como aos compostos revelados na Patente USN° 4 965 288 para Palfreyman, et ai., emitida a 23 de outubro de 1990, intitulada "Inhibitors of lysyl oxidase, relating to inhibitors of lysyl oxidase and their use in the treatment of diseases and conditions associated with the abnormal deposition of collagen; anti-fibrotic agents examples include, but are not limited to, compounds such as β-aminoproprionitrilo (BAPN), and the compounds disclosed in US Patent No. 4,965,288 to Palfreyman et al., issued on 23 October 1990, entitled & quot; Inhibitors of lysyl oxidase Relating to inhibitors of lysyl oxidase and Their use in the treatment of diseases and conditions associated with the abnormal deposition of collagen; Patente USN° 4 997 854 para Kagan, et al. US Patent No. 4,997,854 to Kagan et al. , emitida a 5 de março de 1991, intitulada " , Issued March 5, 1991, entitled & quot; Anti-fibrotic agents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in situ using adjacently positioned diamine analogue substrate," Anti-fibrotic agents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase using in situ adjacently positioned diamine substrate analogue, & quot; em relação a compostos que inibem LOX para o tratamento de vários estados fibróticos patológicos. in relation to compounds which inhibit LOX for the treatment of various fibrotic disease states. Inibidores exemplares adicionais são descritos na Patente USN° 4 943 593 para Palfreyman, et al. Inhibitors Additional examples are described in US Patent No. 4,943,593 to Palfreyman et al. , emitida a 24 de julho de 1990, intitulada " , Issued July 24, 1990, entitled & quot; Inhibitors of lysyl oxidase," Inhibitors of lysyl oxidase, & quot; em relação a compostos tais como 2-isobutil-3-fluór-, cloro-, ou bromo-alilamina; compared to compounds such as 2-isobutyl-3-fluoro-, chloro-, or bromo-allylamine; bem como, por exemplo, Patente USN° 5 021 456; as well as, for example, US Patent No. 5,021,456; Patente USN° 5 5059 714; US Patent No. 5 5059 714; Patente USN° 5 120 764; US Patent No. 5,120,764; Patente USN° 5 182 297; US Patent No. 5,182,297; Patente USN° 5 252 608 (em relação a 2-(1-naftiloximetil)-3-fluoroalilamina) . US Patent No. 5,252,608 (relative 2- (1-naphthyloxymethyl) -3-fluoroallylamine). Agentes anti-fibróticos exemplares também incluem as aminas primárias que reagem com o grupo carbonilo do local ativo das lisil oxidases, e mais particularmente aqueles que produzem, após ligação com o carbonilo, um produto estabilizado pela ressonância, tais como as seguintes aminas primárias: etilenodiamina, hidrazina, fenilhidrazina e seus derivados, semicarbazida e derivados de ureia, aminonitrilos, tais como beta-aminopropionitrilo (BAPN) ou 2-nitroetilamina, haloaminas insaturadas ou saturadas, tais como 2-bromoetilamina, 2-cloroetilamina, 2-trifluoroetilamina, 3-bromopropilamina, p-halobenzilaminas, selenohomocisteína lactona. anti-fibrotic Exemplary agents include primary amines reacting with the carbonyl group of the active site of lysyl oxidase, and more particularly those which produce, after binding with the carbonyl, a product stabilized by resonance, such as the following primary amines: ethylenediamine , hydrazine, phenyl hydrazine and their derivatives, semicarbazide, and urea derivatives, aminonitriles, such as beta-aminopropionitrile (BAPN) or 2-nitroetilamina, unsaturated or saturated haloamines, such as 2-bromoethylamine, 2-chloroethylamine, 2-trifluoroethylamine, 3 bromopropylamine, p-halobenzilaminas, selenohomocisteína lactone. Noutra modalidade, os agentes anti-fibróticos são agentes quelantes do cobre, penetrando ou não nas células. In another embodiment, the anti-fibrotic agents are copper chelating agents, penetrating or not the cells. Compostos exemplares adicionais incluem inibidores indiretos tais como compostos que bloqueiam os derivados de aldeído que originam da desaminação oxidativa de resíduos lisil e hidroxilisil pelas lisil oxidases, tais como as tiolaminas, em particular D-penicilamina ou os seus análogos tais como ácido 2-amino-5-mercapto-5-metilhexanóico, ácido D-2-amino-3-metil-3-((2-acetamidoetil)ditio) butanóico, ácido p-2-amino-3-metil-3-((2-aminoetil)ditio) butanóico, sulfinato de sódio-4-((p-1-dimetil-2-amino-2-carboxietil)ditio)butano, sulfanato de 2-acetamidoetil-2-acetamidoetanetiol, trihidrato de sódio-4-mercaptobutanesulfinato. Additional exemplary compounds include indirect inhibitors such as compounds that block the aldehyde derivatives originating from oxidative deamination of lysyl residues and hidroxilisil by lysyl oxidase such as tiolaminas, in particular D-penicillamine or its analogues such as 2-amino- 5-mercapto-5-methylhexanoic acid, D-2-amino-3-methyl-3 - ((2-acetamidoethyl) dithio) butanoic acid, p-2-amino-3-methyl-3 - ((2-aminoethyl) dithio) butanoic acid, sodium sulfinate-4 - ((p-1-dimethyl-2-amino-2-carboxyethyl) dithio) butane, 2-sulphonate-2-acetamidoethyl acetamidoetanetiol trihydrate sodium-4-mercaptobutanesulfinato.

Os presentes métodos podem ser realizados em células em cultivo, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou podem ser realizados em células presentes num sujeito, por exemplo, como parte de um protocolo terapêutico in vivo. The present methods can be performed on cells in culture, e.g. in vitro or ex vivo, or can be performed on cells present in a subject, for example, as part of an in vivo therapeutic protocol. O regime terapêutico pode ser realizado num sujeito humano ou noutros animais. The therapeutic regimen can be carried out in a human or other animal subject. O anticorpo anti-LOX2 providenciado aqui pode ser administrado em qualquer ordem relativa ao agente quimioterapêutico. The anti-LOX2 antibody provided herein can be administered in any order relative to the chemotherapeutic agent. Por vezes, o anticorpo anti-LOX2 e o agente são administrados simultâneamente ou sequencialmente. Sometimes, the anti-LOX2 antibody and the agent are administered simultaneously or sequentially. Eles podem ser administrados em diferentes locais e em diferentes regimes de dosagem. They can be administered in different locations and at different dosing regimens. A eficácia terapêutica potenciada da terapêutica de combinação da presente invenção representa uma alternativa promissora aos regimes altamente tóxicos convencionais de agentes anti-cancerígenos. The enhanced therapeutic efficacy of the combination therapy of the present invention is a promising alternative to conventional highly toxic regimens of anti-cancer agents. Agentes quimioterapêuticos a serem empregues em tais métodos foram descritos com mais detalhe anteriormente. Chemotherapeutic agents to be employed in such methods are described in more detail above. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Métodos de gerar Anticorpos Monoclonais Murinos Anti-LOX e Anti—LOXL2 EXAMPLES EXAMPLE 1 Methods of generating antibodies Murine Monoclonal Anti-LOX and anti-LOXL2

Ratinhos (BALB/c (00467)) foram injetados por via subcutânea (sc), 5 vezes em intervalos de 2-3 semanas com 0,05 mg antigeno (Ag) numa formulação de adjuvante. Mice (BALB / c (00467)) were injected subcutaneously (sc) 5 times at 2-3 week intervals with 0.05 mg antigen (Ag) in an adjuvant formulation. Para péptidos Ags, os péptidos foram conjugados a albumina do soro bovina e formulados em Adjuvante de Freunds (FA) antes da imunização. For Ags peptides, the peptides were conjugated to bovine serum albumin and formulated in Freunds Adjuvant (FA) before immunization. Para proteínas Ags, a proteína foi formulada em adjuvante dipeptídico de Alhidrogel-Muramilo (ALD/MDP). For Ags proteins, the protein was formulated in adjuvant Alhydrogel dipeptide, muramyl (ALD / MDP).

Ratinhos foram injetados com Ag formulados em PBS, cada dia durante 3 dias através de uma combinação de vias sc, intraperitoneal (ip) e intravenosa (iv), 0,05 a 0,1 mg/via. Mice were injected with Ag formulated in PBS daily for 3 days using a combination sc, intraperitoneal (ip) or intravenous (iv) 0.05 to 0.1 mg / lane. Células do baço e nódulos linfáticos dos ratinhos foram isolados e fundidos com células de mieloma P3X63-Ag8.653 utilizando 50% polietilenoglicol. Spleen cells and lymph nodes of the mice were isolated and fused with P3X63-Ag8.653 myeloma cells using 50% polyethylene glycol. Células foram cultivadas e uma biblioteca de hibridomas de células selecionadas HAT foi isolada essencialmente conforme descrito em Kenney, et al. Cells were cultured cell and a HAT selected hybridomas library was isolated essentially as described in Kenney, et al. ("Production of monoclonal antibodies using a secretion capture report web." Biotechnology 13:787-790, 1995). (& Quot; Production of monoclonal antibodies using the secretion capture report web & quot; Biotechnology. 13: 787-790, 1995). A biblioteca de hibridomas foi clonada utilizando urn classificador de células ativadas fluorescentes com unidade de deposição de células automática. The hybridoma library was cloned using urn fluorescent activated cell sorter with automatic cell deposition unit. Células viáveis únicas foram classificadas em placas com 96 poços com base nos critérios de análise de dispersor para a frente, dispersor para o lado e fluorescência de iodeto de propídio, conforme descritos por Kenney et ai. Single viable cells were sorted in 96 well plates based on dispersing analysis criteria forward, sideways dispersing fluorescence and propidium iodide as described by Kenney et al.

Os soros e sobrenadantes foram classificados por ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA) utilizando poços de placa de microtítulo revestidos com Ag, que foram depois incubados com plasma de ratinho ou sobrenadante de hibridoma, seguido de conjugado anticorpo-HRP IgG (específico de Fc) de ratinho de cabra seguido pela solução de substrato TMB e reagente de terminação. The sera and supernatants were ranked by immunosorbent assay enzyme-linked (ELISA) using microtiter plate wells coated with Ag, which were then incubated with mouse plasma or hybridoma supernatant, followed by antibody-HRP IgG (Fc specific) goat mouse followed by TMB substrate solution and termination reagent.

Os poços da placa foram lavados para remover anticorpo ou antígeno não ligado entre todas as incubações e os resultados foram determinados. The plate wells were washed to remove unbound antigen or antibody from all incubations were determined and the results.

As sequências de aminoácidos VH e VL de um anticorpo monoclonal murino anti-L0XL2 identificado utilizando os métodos descritos são providenciadas na Figura 6A e Figura 6B, respetivamente. The amino acid sequences of VH and VL of a monoclonal murine anti-L0XL2 identified using the methods described are provided in FIG 6A and 6B, respectively. Para cada região variável, os péptidos sinal são mostrados em itálico, as CDRs são sublinhadas e o inicio da estrutura constante é mostrada a negrito. For each variable region, signal peptides are shown in italic, the CDRs are underlined and the start of the continuous structure is shown in bold.

Uma sequência de aminoácidos VH de um anticorpo monoclonal murino anti-LOX identificado utilizando os métodos descritos é providenciada na Figura 7A. A VH amino acid sequence of a murine monoclonal anti-LOX identified using the methods described is provided in Figure 7A. Duas sequências de aminoácidos VL de anticorpos monoclonais murinos anti-LOX identificados utilizando os métodos descritos são providenciadas nas Figuras 7B e 7C. Two VL amino acid sequences of anti-LOX murine monoclonal antibodies identified using the methods described are provided in Figures 7B and 7C. Para cada região variável, os péptidos sinal são mostrados em itálico, as CDRs são sublinhadas. For each variable region, signal peptides are shown in italic, the CDRs are underlined. EXEMPLO 2 EXAMPLE 2

Anticorpos anti-L0XL2 foram classificados utilizando uma atualização do rastreio B de proteínas para avaliar a atividade enzimática de L0XL2. anti-L0XL2 antibodies were ranked using a screening refresh protein B to evaluate the enzymatic activity L0XL2.

Anticorpos candidatos foram inicialmente escolhidos com base em testes de ponto ELISA. antibody candidates were initially chosen based on ELISA point tests. Foi realizada ELISA em múltiplos antígenos por Soluções de Anticorpo e anticorpos que mostram forte sinal de ELISA no antígeno de interesse foram selecionados para caracterização adicional em ensaios enzimáticos. ELISA was performed in multiple antigens by Antibody Solutions and antibodies showing strong ELISA signal in the antigen of interest were selected for further characterization in enzymatic assays. L0XL2 produz peróxido de hidrogénio quando o substrato 1,5-diaminopentano é desaminado e a enzima regenerada. L0XL2 produces hydrogen peroxide when the substrate 1,5-diaminopentane is deaminated and the enzyme regenerated.

Os anticorpos foram avaliados pela sua capacidade para inibir a atividade enzimática utilizando um ensaio bioquímico que une a produção de peróxido (libertado pela L0XL2) a HRP e medindo a conversão de vermelho amplex em produto fluorescente. The antibodies were evaluated for their ability to inhibit the enzymatic activity using a biochemical assay that combines the production of peroxide (released by L0XL2) HRP and measuring the conversion of Amplex Red fluorescent product. 0 sobrenadante hibridoma de anticorpo (10 pL) foi adicionado a 40 pL de mistura de enzima (62,5 mM borato de sódio pH 8,0, 5 unidades/ml HRP, 125 nM LOXL2, 10 ppm anti-espuma) e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora numa placa com 96 poços com área completamente negra. 0 Antibody hybridoma supernatant (10 ul) was added to 40 pL of the enzyme mix (62.5 mM sodium borate pH 8.0, 5 units / ml HRP, 125 nM LOXL2, 10 ppm antifoam) and incubated at room temperature for 1 hour in a 96 well plate with completely black area. A reação enzimática foi iniciada com a adição de 50 pL de solução de substrato (50 mM borato de sódio, 100 mM reagente vermelho amplex, 20 mM 1,5-diaminopentano (DAP), 10 ppm anti-espuma) e lido num leitor de placa Molecular Devices M5 a 37°C. The enzymatic reaction was started by adding 50 uL of substrate solution (50 mM sodium borate, 100 mM Amplex Red reagent, 20 mM 1,5-diaminopentane (DAP), 10 ppm antifoam) and read on a reader M5 Molecular Devices plate at 37 ° C. O leitor de placa foi configurado para ler fluorescência (ex=544 nm, em=590 nm) em modo cinético durante 1 hora. The card reader is configured to read fluorescence (ex = 544 nm, em = 590 nm) in kinetics mode for 1 hour. Os dados foram registados como o declive da resposta de fluorescência com o tempo. The data were reported as the slope of the fluorescence response with time. Estes declives foram comparados com um controlo no qua los meios hibridoma foram adicionados à mistura da enzima. These slopes were compared with a control in Frame them hybridoma media were added to the mixture of the enzyme. Os declives menores dos do controlo foram considerados inibidores. The smaller slope of the control were considered inhibitors.

Os anticorpos Ml (asc) , M4, Mil, Ml, M13, M22, M16, M19, M20, M20 (asc) e anticorpos teste M25 foram testados contra BAPN (um inibidor competitivo de LOXL2) como um controlo positivo eLOXL2 como um controlo negativo (ver Figura 8). The Ml antibodies (ASC), M4, Mil, Ml, M13, M22, M16, M19, M20, M20 (ASC) and M25 test antibodies were tested against BAPN (a competitive inhibitor of LOXL2) as a positive control eLOXL2 as a control negative (see Figure 8).

Um anticorpo anti-LOXL2 foi designado AB0023. An anti-LOXL2 antibody was named AB0023. Anticorpos anti-LOXL2 repetiram a atividade inibidora observada em 10 ml de materiais de preparação no ensaio enzimático. anti-LOXL2 antibodies repeated inhibitory activity observed in 10 mL of preparing materials in the enzymatic assay. A inibição também foi repetida em ensaios baseados na célula (ver a seguir). Inhibition was also repeated in the cell-based assays (see below). A análise de sequência confirmou que as sequências de aminoácidos de M01, M16, M19 e M20 são idênticas. Sequence analysis confirmed that the amino acid sequences of M01, M16, M19 and M20 are identical. EXEMPLO 3 EXAMPLE 3

Anticorpo anti-LOXL2 AB0023 e atividade enzimática A atividade enzimática dos anticorpos anti-L0XL2 pode ser avaliada e os IC50s determinados. anti-LOXL2 antibody AB0023 and enzymatic activity The enzymatic activity of the anti-L0XL2 antibodies can be evaluated and IC50 determined.

Ml, Ml (asc) , M20 e M20 (asc) foram avaliados na presença de 25 nM L0XL2 e 15 mM 1,5 DAP sobre concentrações crescentes de anticorpo. Ml, Ml (ASC), M20 and M20 (AUC) were evaluated in the presence of 25 nM and 15 mM L0XL2 about 1.5 DAP increasing concentrations of antibody.

Determinações de IC50 IC50 Determinations

Respostas de dose em anticorpos selecionados foram realizadas contra L0XL2 utilizando o ensaio enzimático unido descrito anteriormente. Dose responses in selected antibodies were made against L0XL2 attached using enzymatic assay described above. Uma série de diluições do anticorpo foi criada em PBST (0,01% tween-20) e 10 pL disto foi adicionado a 40 pL da mistura da enzima (62,5 mM borato de sódio pH 8,0, 5 unidades/ml HRP, 125 nM LOXL2, 10 ppm anti-espuma) e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora numa placa com 96 poços com área completamente negra. A series of antibody dilutions was set up in PBST (0.01% Tween-20) and 10 ul of this was added to 40 pL of the enzyme mix (62.5 mM sodium borate pH 8.0, 5 units / ml HRP 125 nM LOXL2, 10 ppm antifoam) and incubated at room temperature for 1 hour in a 96 well plate with completely black area. A reação enzimática foi iniciada com a adição de 50 pL de solução de substrato (50 mM borato de sódio, 100 mM reagente vermelho amplex, 20 mM 1,5-diaminopentano, 10 ppm anti-espuma) e lida num leitor de placa M5 utilizando as condições descritas anteriormente. The enzymatic reaction was started by adding 50 uL of substrate solution (50 mM sodium borate, 100 mM Amplex Red reagent, 20 mM 1,5-diaminopentane, 10 ppm antifoam) and read on a plate reader using M5 the conditions described above. Os declives da resposta de fluorescência como uma função do tempo foram desenhadas em gráficos contra a concentração do anticorpo e os dados foram ajustados a um ajuste de quatro parâmetros utilizando GraFit. The slopes of the fluorescence response as a function of time in graphs were drawn against antibody concentration and the data were fitted to a four parameter fit using GraFit. O ponto central deste gráfico é o IC50 aparente e é a concentração à qual cinquenta por cento da resposta total é inibida. The point of this graph is the apparent IC50 and is the concentration at which fifty percent of the total response is inhibited.

Verificou-se que o Ab0023 é um inibidor parcial da atividade enzimática de LOXL2 com um IC50 aparente de aproximadamente 30 nM (ver Figura 9). It was found that the Ab0023 is a partial inhibitor of LOXL2 enzymatic activity with an apparent IC50 of approximately 30 nM (see Figure 9).

Com base na utilização de um inibidor parcial na clínica para tratamento terapêutico (isto é, Nevirapina - conforme fármaco HIV-1 aprovado descrito por Spence et al. (1995) Science 267), um inibidor parcial de L0XL2 também pode ser utilizado em aplicações terapêuticas. Based on the use of a partial inhibitor in the clinic for therapeutic treatment (i.e., Nevirapine -. As HIV-1 drug approved described by Spence et al (1995) Science, 267), a partial inhibitor L0XL2 can also be used in therapeutic applications . EXEMPLO 4 EXAMPLE 4

Anticorpo anti-LOXL2 AB0023 é um inibidor não competitivo A atividade do anticorpo anti-L0XL2 AB0023 foi avaliada sobre concentrações crescentes de 1,5 DAP e sobre concentrações crescentes de anticorpo (1 μΜ, 0,005 μΜ, 0,050 μΜ e 0,300 μΜ). Anti-LOXL2 AB0023 is a non-competitive inhibitor activity The anti-L0XL2 antibody AB0023 was evaluated on increasing concentrations of 1,5 DAP and over increasing concentrations of antibody (1 μΜ, 0.005 μΜ, 0.050 and 0.300 μΜ μΜ).

Modo de inibição O modo de inibição de anticorpos contra LOXL2 foi conduzido utilizando o modelo descrito a seguir. The method of inhibition mode inhibiting LOXL2 antibodies was carried out using the model described below. Nestas experiências, a dependência da taxa do estado estcionário da concentração de 1,5-diaminopentano foi monitorizada em concentrações crescentes do anticorpo. In these experiments, the dependence of the rate estcionário state concentration of 1,5-diaminopentane was monitored with increasing concentrations of the antibody. O objetivo foi avaliar se a Km para o substrato, kcat ou ambos se alteram na presença de anticorpo. The objective was to assess whether the substrate Km, kcat, or both are altered in the presence of antibody. Os dados recolhidos foram analisados globalmente com Grafit utilizando o modelo mostrado na figura a seguir. The collected data were analyzed globally with Grafit using the model shown in the following figure. E representa enzima, S representa substrato, A representa anticorpo e P representa produto. E is enzyme, S is the substrate, the antibody is and P is product. O parâmetro α descreve o efeito do composto na afinidade do substrato. The α parameter describes the effect of the compound on the substrate affinity. Um valor α igual a um descreve uma situação na qual o composto liga igualmente bem a enzima livre e o complexo enzima-substrato (tipo inibição não competitiva). An α value equal to one describes a situation in which the compound binds equally well to free enzyme and enzyme-substrate complex (non-competitive inhibition type). Os valores inferiores a um descrevem uma interação na qual o composto liga o complexo enzima-substrato (tipo inibição acompetitiva). Values ​​less than one describe an interaction in which the compound binds the enzyme-substrate complex (type acompetitiva inhibition). Valores superiores a um correspondem à ligação do composto a enzima livre melhor do que ao complexo enzima-substrato (tipo inibição competitiva). Values ​​greater than one correspond to binding of the compound to free enzyme better than the enzyme-substrate complex (competitive inhibition type). O valor β descreve o efeito do modulador na taxa da enzima. The β value describes the effect of the modulator on enzyme rate. Os inibidores têm valores inferiores a um (para um inibidor completo β =0) e os ativadores têm valores superiores a um. The inhibitors have a lower value (for a complete inhibitor β = 0) and activators have values ​​greater than one. KA é a constante de dissociação do composto, Ks é a constante de Michaelis para o substrato ek é a taxa catalítica da enzima. KA is the dissociation constant of the compound, Ks is the Michaelis constant for the substrate and k is the catalytic rate of the enzyme. As taxas do estado estacionário foram determinadas a partir do declive da resposta de fluorescência como uma função do tempo, conforme descrito anteriormente (determinação de IC50). The steady-state rates were determined from the slope of the fluorescence response as a function of time, as described previously (IC50 determination). Os dados foram representados num gráfico como a dependência da taxa do estado estcionário da concentração do substrato (1,5-diaminopentano) a várias concentrações fixeas do anticorpo e analisados com GraFit. The data were plotted in a graph the dependence of state estcionário rate of substrate concentration (1,5-diaminopentane) fixeas to various concentrations of the antibody and analyzed with GraFit.

Anticorpo anti-L0XL2 AB0023 foi determinado como sendo um inibidor não competitivo com base nos seguintes resultados: a = 1, K± = 0,067 e β = 0,5 (ver Figura 10). L0XL2 anti-antibody AB0023 was determined to be a non-competitive inhibitor based on the following results: a = 1, K = ± 0.067 and β = 0.5 (see Figure 10). EXEMPLO 5 EXAMPLE 5

Medição cinética da ligação do anticorpo ΆΒ0023 a LOXL2 por ressonância de plasma de superficie A afinidade de ligação e taxa de dissociação de AB0023 foram avaliadas através de ressonância de plasma de superficie (SPR). Measuring kinetics of antibody binding ΆΒ0023 LOXL2 by surface plasmon resonance The binding affinity and dissociation rate AB0023 were evaluated by surface plasmon resonance (SPR).

As afinidades de ligação foram medidas utilizando um instrumento Bio-Rad ProteOn com termostato a 25°C. The binding affinities were measured using a Bio-Rad Proteon instrument thermostated at 25 ° C. As afinidades de ligação foram determinadas utilizando dois métodos, utilizando acoplamento de amina; The binding affinities were determined using two methods using amine coupling; um no qual o anticorpo foi imobilizado e o antigeno (LOXL2) foi adicionado e outro no qual o antigeno (LOXL2) foi imobilizado e o anticorpo foi adicionado. one in which the antibody and the antigen was immobilized (LOXL2) was added and another in which the antigen (LOXL2) was immobilized and the antibody was added. O anticorpo ou antigeno foi imobilizado num chip GLC utilizando uma razão de 1:1 de NHS para EDC providenciada com o kit d eimobilização ProteOn. The antibody or antigen is immobilized on a chip GLC using a ratio of 1: 1 NHS to EDC provided with the kit eimobilização Proteon d. O chip foi primeiro ativado com uma mistura NHS/EDC e depois o antigeno ou anticorpo a 1 pg/ml em tampão de acetato pH 4,5 foi fluido sobre a superfície ativada a unir. The chip was first activated with NHS / EDC mixture, and then the antigen or antibody at 1 pg / ml in acetate buffer pH 4.5 was eluted on the surface of activated together. Isto tipicamente produz um acoplamento de cerca de 500 RU's. This typically produces a coupling of about 500 RU's. A superfície ativada do chip foi depois tapada com a adição de 1M etanolamina. The active surface of the chip was then covered with the addition of 1M ethanolamine. Os chips unidos foram armazenados a 4 °C e regenerados com 50 mM hidróxido de sódio. The united chips were stored at 4 ° C and regenerated with 50 mM sodium hydroxide.

As constantes de dissociação foram determinadas sondando o chip acoplado com uma série de diluições do anticorpo ou antigeno em PBST (0,05% Tween-20) . Dissociation constants were determined by probing the coupled chip with a serial dilution of antibody or antigen in PBST (0.05% Tween-20). Os adados foram adquiridos em todos os seis canais disponíveis no ProteOn utilizando um canal não acoplado como referência. The aData were acquired on all six channels available on a channel using Proteon unbound by reference. Os dados recolhidos foram analisados utilizando o programa de gestão ProteOn da Bio-Rad. The collected data were analyzed using the Proteon management program of Bio-Rad.

Verificou-se que ο AB0023 se liga estreitamente a LOXL2 e se liberta lentamente. It was found that closely connects ο AB0023 and LOXL2 is released slowly. Kd foi estimada ser 0,1 -1,0 nM. Kd was estimated to be 0.1 -1.0 nM. Além disso, verificou-se que ο AB0023 tem as seguintes características: kon = 1, 68 x 106 M_1s_1, koff = 1,17 x 10_4s_1, KD = 0,69 nM e ti/2 = 98,7 minutos. Furthermore, it was found that ο AB0023 has the following characteristics: k = 1, M_1s_1 68 x 106, 1.17 x 10_4s_1 = koff, KD = 0.69 nM and ti / 2 = 98.7 minutes. Ver To see

Figura 11. EXEMPLO 6 O mapeamento do domínio foi conduzido e verificou-se que ο AB0023 se liga ao domínio SRCR3-4. Figure 11. EXAMPLE 6 domain mapping was conducted and it was found that ο AB0023 binds to SRCR3-4 domain.

Materiais e Métodos Materials and methods

Todas as placas foram obtidas de Corning. All plates were obtained from Corning. O anticorpo secundário e o substrato Pico foram obtidos de Pierce. The secondary antibody and Pico substrate were obtained from Pierce. A peroxidase de raiz-forte (HRP) foi obtida da Sigma. The horseradish peroxidase (HRP) was obtained from Sigma. Todos os reagentes ProteOn foram obtidos de Bio-Rad. Proteon All reagents were obtained from Bio-Rad. LOXL2 foi obtida de R&D Systems. LOXL2 was obtained from R & amp; D Systems. Os anticorpos utilizados neste estudo forma produzidos numa Solução de Anticorpo ou através de ascites da Aragen Biosciences. The antibodies used in this study were produced in a solution or by antibody ascites of Aragen Biosciences. Todos os outros reagentes foram fa qualidade mais elevada possível. All other reagents were fa highest possible quality.

Ligação através de ELISA A ligação do anticorpo a LOXL2 foi determinada utilizando uma ELISA baseada em Luminiscência. Binding by ELISA The binding of antibody to LOXL2 was determined using an ELISA based on luminescence. Placas plates

Corning brancas foram revestidas com 0,1 pg/ml de LOXL2 ou antigeno de interesse em 50 mM tampão borato (pH 8,0) durante a noite a 4°C. White Corning were coated with 0.1 pg / ml LOXL2 or antigen of interest in 50 mM borate buffer (pH 8.0) overnight at 4 ° C. As placas foram lavadas utilizando lavador de placa BioTek e bloqueadas com 5% leite magro em PBST (0,05% tween-20) durante 1 hora à temperatura ambiente. Plates were washed using BioTek plate washer and blocked with 5% nonfat milk in PBST (0.05% Tween-20) for 1 hour at room temperature. As placas foram lavadas com PBST (0,05% tween-20) e depois utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4°C num dissecador para utilização futura. The plates were washed with PBST (0.05% Tween-20) and then used immediately or stored at 4 ° C in a dessicator for future use. O corpo do anticorpo a ser testado foi diluído em série em PBST (0,01% tween-20) e 100 pL de cada diluição foram adicionados por poço. The antibody of the body to be tested was serially diluted in PBST (0.01% Tween-20) and 100 pL of each dilution was added per well. As placas foram incubadas com artigo teste durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavadas com PBST (0,05% Tween-20). The plates were incubated with test article for 1 hour at room temperature and then washed with PBST (0.05% Tween-20). O anticorpo de deteção (conjugado HRP anti-ratinho) foi diluído 16,000 vezes em 5% leite magro em PBST (0,05% Tween-20) e 100 pL foram aplicados por poço. The detection antibody (anti-mouse HRP conjugate) was diluted 16,000 times in 5% skimmed milk in PBST (0.05% Tween-20) and 100 ul were applied per well. As placas foram incubadas durante 1 hora com o anticorpo de deteção e depois lavadas com PBST (0,05% PBST). The plates were incubated for 1 hour with the detection antibody and then washed with PBST (0.05% PBST). O sinal foi detetado utilizando o substrato quimioluminiscente pico de SuperSignal ELISA da Pierce, de acordo com as instruções do fabricante. The signal was detected using the chemiluminescent substrate SuperSignal ELISA peak from Pierce according to the manufacturer's instructions. A luminiscência foi medida utilizando um leitor de placa Molecular Devices M5 com um tempo de integração de 500 ms que captura todos os comprimentos de onda. The luminescence was measured using a Molecular Devices M5 plate reader with a 500 ms integration time to capture all wavelengths. Os dados foram corrigidos com o fundo e a dependência do sinal de luminiscência da concentração do anticorpo foi ajustada utilizando a Equação isotérmica de Langmuir utilizando o programa GraFit. Data were corrected with the background luminescence and signal dependence on antibody concentration was fit using the Langmuir isotherm equation using the GraFit program. Nas ocasiões em que a concentração do antigeno foi semelhante à constante de dissociação, foi utilizada a equação quadrática de ligação apertada. On occasions when the concentration of the antigen was similar to the dissociation constant, we used the quadratic equation for tight connection. Os valores de dissociação reportados foram obtidos dos ajustes a estas equações; Reported values ​​were obtained dissociation of adjustments to these equations; onde PL representa o sinal do complexo ligado, Bmax é aquela ligação máxima, KD é a constante de dissociação e L é a concentração do ligando. where PL represents the signal from the bound complex, that maximum binding is Bmax, Kd is the dissociation constant and L is the ligand concentration.

Equação isotérmica de Langmuir: Langmuir isotherm equation:

Equação de ligação apertada: tight binding equation:

0 AB 0 02 3 foi testado contra MCD-LOXL2, LOXL2 (R&D), SRCR1-2 e SRCR 1-4. AB 0 02 0 3 was tested against LOXL2-MCD, LOXL2 (R & amp; D) SRCR1-2 and SRCR 1-4. Verificou-se que ο AB0023 se liga ao domínio SRCR3-4 (ver Figura 12). It was found that ο AB0023 binds to SRCR3-4 field (see Figure 12). EXEMPLO 7 EXAMPLE 7

Inibição da migração/invasão no Colagénio I e Colagénio IV e inibição do crescimento celular Inhibition of migration / invasion of Collagen I and Collagen IV and inhibition of cell growth

Ensaios baseados na célula foram conduzidos para avaliar a ligação do AB0023 para ligar substrato (isto é, colagénio). In cell based assays were conducted to evaluate the AB0023 connection substrate to connect (i.e., collagen).

Em suma, ο AB0023 foi ampliado a partir de várias amostras antes do teste. In short, ο AB0023 was amplified from various samples prior to testing.

Kits de invasão de células de colagénio I e colagénio IV com 96 poços Cultrex (Trevigen, Gaithersburg, MD) foram utilizados para classificações de sobrenadantes anti-soros / anticorpo. collagen cell invasion Kits I and collagen IV Cultrex 96 well (Trevigen, Gaithersburg, MD) were used for ratings of antisera / antibody supernatants. Células 231 MDA MB foram privadas de soro 24 horas antes do ensaio ser montado. MDA MB 231 cells were serum starved 24 hours before the assay is mounted. No dia de realização do ensaio, as placas revestidas com colagénio I e colagénio IV foram feitas pelo menos 4 horas antes do ensaio de invasão estar montado (não mais de 8 horas antes) . In performing the assay day, the plates coated with collagen I and collagen IV were done at least 4 hours before being mounted invasion assay (no more than 8 hours before). Plascas com colagénio I e colagénio IV foram revestidas, de acordo com as instruções do fabricante. Plascas collagen I and collagen IV were coated according to the manufacturer's instructions. As células foram colocadas em placas a 20,000 células por poço em 95 pis de meios livres de soro na câmara superior da placa. Cells were plated at 20,000 cells per well in 95 pis serum-free media in the top chamber plate. Cento e cinquenta (150) pis de meios contendo 10% FBS e lx L-glutamina foram aliquotados nas câmaras inferiores da placa. One hundred and fifty (150) pis media containing 10% FBS and lx L-glutamine were aliquoted into the lower chamber of the plate. Utilizando uma pipeta multicanal, 5 pis de cada anti-soros foi colocada nas câmaras superiores da placa. Using a multichannel pipette, each pencil 5 antisera was placed in the upper chambers of the plate. A mistura de anti-soros e célula foi cuidadosamente misturada para cima e para baixo uma vez com a pipeta. The mixture of cells and antisera was mixed thoroughly for up and down once with a pipette. As placas foram incubadas a 37 °C com 5% C02 durante 48 horas. The plates were incubated at 37 ° C with 5% C02 for 48 hours.

Após 48 horas, as placas estavam prontas para serem lidas. After 48 hours, the plates were ready to be read. A solução de dissociação celular contendo calceina AM foi feita, de acordo com as instruções do fabricante. The cell dissociation solution containing calcein AM was performed according to the manufacturer's instructions. As placas também foram lavadas e desmontadas, de acordo com as instruções do fabricante. The plates were also washed and removed, according to the manufacturer's instructions. 125 pis de solução de dissociação celular contendo calceina AM foi adicionado aos poços das câmaras inferiores e as placas foram colocadas a 37 °C durante 30 minutos. 125 of cell dissociation solution containing calcein AM penis was added to the lower chambers of wells and the plates were placed at 37 ° C for 30 minutes. Após 30 minutos os lados das placas foram tocados levemente para soltarem as células e as placas foram colocadas numa incubadora por mais 30 minutos a 37 °C. After 30 minutes sides of the plates were moved slightly to loosen the cells and the plates were placed in an incubator for 30 minutes at 37 ° C. As placas foram depois desmontadas e a placa inferior foi colocada num leitor de placa (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, Ca) com as definições: Fluorescência, emissão 485-520, leitura do topo, placa opaca negra, sensibilidade a 30. A inibição de migração/invasão consistente foi observada no colagénio I (Figura 13) e colagénio IV, dos supematentes através de 10 ml material de preparação e ampliado para 100 ml preparações e ascites. The plates were then disassembled and the lower plate was placed in a plate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) with settings: fluorescence, emission 485-520, the top reading black opaque plate 30. The sensitivity inhibition of migration / invasion was consistently observed in collagen I (Figure 13) and collagen IV, supematentes through 10 mL preparation material and expanded to 100ml preparations and ascites.

Ensaios de adesão celular Células MDA-MB231 foram colocadas em placas com 15 cm2 e crescidas em 4,5g/L glicose contendo DMEM (10% FBS e 2 mM L-Glutamina) para que fossem confluentes no dia do ensaio. Cell adhesion assays MDA-MB231 cells were plated in 15 cm2 and grown in 4.5g / L glucose-containing DMEM (10% FBS and 2 mM L-Glutamine) that were confluent on the day of the assay. Os meios foram aspirados e as células foram lavadas 2 vezes com 10 ml 1 mM EDTA PBS por placa. The media was aspirated and cells were washed 2 times with 10 ml 1 mM EDTA PBS per plate. As células fram removidas das placas incubando com outros 10 ml 1 mM EDTA PBS durante 5 minutos a 37 °C num armário de biossegurança e pipetando, subsequentemente, as células para for a da placa numa solução EDTA PBS. The cells fram removed from the plates by incubating with another 10 ml 1 mM EDTA PBS for 5 minutes at 37 ° C in a biosafety cabinet pipetting and subsequently the cells to the plate is EDTA in PBS. A concentração das células foi determinada e foram giradas células suficientes para o ensaio (50k/poço mais extra para pipetagem) em tubos cónicos de 15 ml. The concentration of cells was determined and cells were spun sufficient for the test (50k / well plus extra for pipetting) in 15 ml conical tubes. A bola de células foi dispersa em DMEM livre de soro pré-aquecido para 500K células/ml e foi adiiconado CuCl2 a uma concentração final de 1 μΜ. The ball of cells was dispersed in preheated serum-free DMEM to 500K cells / ml and adiiconado CuCl 2 at a final concentration of 1 μΜ. Cem (100) μΐ/poço de suspensão celular foi pipetada para uma placa de cultivo de tecidos com 96 poços com fundo estilo U contendo 10 μΐ de diluição de mAb apropriada. One hundred (100) μΐ / well of cell suspension was pipetted into a tissue culture plate with 96 wells containing 10 U bottom style appropriate mAb dilution μΐ. A mistura da suspensão celular/mAb foi deixada incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente na escuridão. The mixture of the cell suspension / mAb was allowed to incubate for 10 minutes at room temperature in the dark. Cem (100) μΐ/poço da mistura de células ressuspensas/mAb foi depois transferido para placas com 96 poços revestidas com colagénio IV (BD Biocoat, BD Biosciences) . One hundred (100) μΐ / well of the mixture of resuspended cells / mAbs were then transferred to 96 well plates coated with collagen IV (BD Biocoat, BD Biosciences). As placas foram incubadas a 37 °C num armário de biossegurança durante 1 hora. The plates were incubated at 37 ° C in a biosafety cabinet for 1 hour. Os poços foram depois aspirados e lavados gentilmente duas vezes com 200 μΐ DPBS (Mediatech) para remover as células que não aderiram. The wells were then aspirated and gently washed twice with 200 μΐ DPBS (Mediatech) to remove cells that did not adhere. Cem (100) μΐ de concentração final de 10 μΜ Calceína-AM (BD Biosciences) em DPBS foi depois adicionado a cada poço para corar as células que permaneceram. One hundred (100) μΐ final concentration of 10 μΜ Calcein-AM (BD Biosciences) in DPBS was then added to each well to stain the cells remaining. As placas foram incubadas a 37 °C num armário de biossegurança durante 1 hora. The plates were incubated at 37 ° C in a biosafety cabinet for 1 hour. As placas foram lidas num leitor de placa Molecular Devices M5 a 494/517 (excitação/emissão). Plates were read on a Molecular Devices M5 plate reader at 494/517 (excitation / emission). A percentagem (%) de adesão foi calculada normalizando para controlos PBS ou anticorpo não relacionados. The percentage (%) of adhesion was calculated by normalizing to unrelated control antibody or PBS.

Utilizando este ensaio, foi observada a inibição parcial da adesão no momento da exposição das células ao anticorpo AB0023. Using this assay, we observed the partial inhibition of the adhesion at the time of exposure of cells to the antibody AB0023.

Crescimento celular cell growth

Anticorpos anti-LOXL2 inibiram o crescimento celular de quatro linhas celulares: 231 é uma linha de células cancerígenas da mama, BT549 é uma linha de células cancerígenas da mama, HT1080 é um fibrossarcoma e BxPC3 é uma linha de células cancerígenas da próstata (Figura 17). anti-LOXL2 antibodies inhibited cell growth of four cell lines: 231 is a line of cancerous breast cells, BT549 is a line of cancerous breast cells, HT1080 is a fibrosarcoma and BxPC3 is a line of prostate cancer cells (Figure 17 ). Assim, o anticorpo é eficaz na inibição do crescimento de cancros com diferentes origens. Thus, the antibody is effective in inhibiting the growth of cancers of different origins. EXEMPLO 8 EXAMPLE 8

Inibição de ΆΒ0023 de alteração tipo EMT Inhibition ΆΒ0023 change type EMT

Alterações epiteliais a mesenquimatosas foram avaliadas utilizando imunohistoquímica. epithelial to mesenchymal changes were evaluated using immunohistochemistry.

Para detetar se uma célula está num estado EMT ou de transição mesenquimatoso-para-epitelial (MET), as células foram coradas com anticorpos específicos de marcadores proteicos celulares para estados epiteliais ou mesenquimatosos, tais como E-caderina, vimentina, fibronectina e faloidina para detetar F-actina. To detect whether a cell is in an EMT state or mesenchymal-to-epithelial transition (MET), cells were stained with antibodies specific cellular protein markers for epithelial or mesenchymal states such as E-cadherin, vimentin, fibronectin and phalloidin to detect F-actin.

Protocolo de coloração de rodamina faloidina rhodamine phalloidin staining protocol

As células foram semeadas 24 horas antes do dia da coloração; Cells were seeded 24 hours prior to staining day; as células eram aproximadamente 80% confluentes 24 horas depois numa lâmina com 8 câmaras. Cells were approximately 80% confluent after 24 hours with a blade 8 cameras. No dia seguinte, os meios foram aspirados e as câmaras foram enxaguadas com IX PBS. The following day, the media was aspirated and the chambers were rinsed with IX PBS. As células foram depois fixas com 4% Cells were then fixed with 4%

Paraformaldeido (PFA) durante 20 minutos à temperatura ambiente e depois enxaguadas uma vez com IX Solução salina tamponada com fosfato (PBS). Paraformaldehyde (PFA) for 20 minutes at room temperature and then rinsed once with IX phosphate buffered saline (PBS). Para permeabilização, as células foram tratadas com 0,5 % Saponina (JT Baker, For permeabilization, cells were treated with 0.5% Saponin (JT Baker,

Phillipsburg, NJ) em PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Phillipsburg, NJ) in PBS for 5 minutes at room temperature. As câmaras foram enxaguadas cuidadosamente uma vez com IX PBS e uma diluição de 1:100 de rodamina faloidina (Invitrogen, Carlsbad, Ca) em PBS foi adicionada às células e incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente. The chambers were carefully rinsed once with IX PBS and a dilution of 1: 100 rhodamine phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) in PBS was added to the cells and incubated for 15 minutes at room temperature. As câmaras foram enxaguadas duas vezes com IX PBS e as lâminas foram montadas com Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). The chambers were rinsed twice in IX PBS and the slides were mounted with Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Protocolo de coloração de E-Caderina Protocol of staining of E-cadherin

As células foram semeadas 24 horas antes do dia da coloração; Cells were seeded 24 hours prior to staining day; as células eram aproximadamente 80% confluentes no dia seguinte numa lâmina com 8 câmaras. Cells were approximately 80% confluent the next day with a blade 8 cameras. No dia seguinte, os meios foram aspirados e as câmaras foram enxaguadas com IX PBS. The following day, the media was aspirated and the chambers were rinsed with IX PBS. As células foram depois fixas com metanol gelado e depois incubadas durante 2 minutos a -20 °C. Cells were then fixed with cold methanol and then incubated for 2 min at -20 ° C. As células foram enxaguadas uma vez com IX PBX e 1 pg/ml de E-caderina Ab (Calbiochem, Gibbstown, NJ) foi adicionado às câmaras da lâmina. Cells were rinsed once with IX PBX and 1 pg / ml of E-cadherin Ab (Calbiochem, Gibbstown, NJ) was added to the blade chambers. As lâminas foram depois incubadas a 37 °C durante 1 hora. Slides were then incubat